ES2223227A1 - Secuencia de nucleotidos de maiz codificante de una proteina con actividad transglutaminasa, y su uso. - Google Patents
Secuencia de nucleotidos de maiz codificante de una proteina con actividad transglutaminasa, y su uso.Info
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Abstract
Secuencia de nucleótidos de maíz codificante de
una proteína con actividad transglutaminasa y su uso.
La invención proporciona una molécula de ADN
proveniente de maíz y codificante de una proteína con actividad
TGasa así como un vector de expresión génica que comprende esta
molécula de ADN. Un objeto adicional de esta invención lo
constituye el empleo de dicha molécula de ADN o vector para producir
células transformadas capaces de expresar proteínas recombinantes
con actividad TGasa, o para introducir dicha secuencia codificante
de una proteína con actividad TGasa en células de plantas. Las
células de microorganismos y las plantas transgénicas resultantes
también constituyen objetos adicionales de esta invención. Además,
estas proteínas con actividad TGasa expresada a partir de dichas
secuencias de ADN pueden ser empleadas, entre otros usos, en la
manipulación, procesamiento y transformación de alimentos.
Description
Secuencia de nucleótidos de maíz codificante de
una proteína con actividad transglutaminasa, y su uso.
La invención se relaciona con la identificación
de nuevas proteínas de origen vegetal con actividad TGasa y su uso
en el campo de la manipulación, procesamiento y transformación de
alimentos y en el desarrollo de plantas transgénicas con nuevas
capacidades.
Las transglutaminasas (TGasa; EC2.3.2.13)
(R-glutaminil-peptido-aminasa-\gamma-glutamil
transferasa) catalizan uniones amidas entre un grupo amino primario
de una poliamina o de una lisina (donador amino) y un grupo
\gamma-carboxiamida de un residuo glutamil de
algunas proteínas (amino receptor), mediante una reacción intermedia
por la que el enzima se une al sustrato por reacción entre el grupo
\gamma-carboxiamida del residuo glutamil de la
proteína y un grupo sulfidrilo de un residuo de cisteína del centro
activo del enzima (Serafini-Fracassini, D., Del
Duca, S., & Beninati, S. 1995. Plant Transglutaminases.
Phytochemistry 40: 355-365). El resultado de la
actividad de la TGasa es: a) la modificación de la conformación de
la propia proteína y b) otros cambios de conformación más extensos
como resultado de uniones entre la misma proteína y entre proteínas
diferentes para formar conjugados de elevado peso molecular.
Existen estudios con TGasas en humanos, también
en animales, plantas, vertebrados inferiores, algunas bacterias,
algas y levaduras (Makarova, K.S., Aravind, L. & Koovin, E.V.
1999. A superfamily of archaeal, bacterial, and eukaryotic proteins
homologous to animal transglutaminases. Protein Science
8:1714-1719; Bergamini, C.M., Dean, M., Tanfani, F.,
Ferrari, C. & Scatturin. 1999. Conformational stability of
human erythrocyte transglutaminase: patterns of thermal unfolding at
acid and alkaline pH. Eur. J.Biochem.
266:575-582.; Cariello, L., Ristoratore, F. &
Zanitti, L. 1997. A new transglutaminase-like from
ascidian Ciona intestinalis. FEBS Lett 408:171-176;
Lorand, L. & Conrad, S.M. 1984. Transglutaminases. Mol Cell
Biochem 58:9-35;
Serafini-Fracassini, D., Del Duca S. & Beninati
S. 1995. Plant Transglutaminases. Phytochemistry
40:355-365; Tokunaga, F., Muta, T., Iwanaga, S.,
Ichinose, A., Davie, EW, Kuma, K. & Miyata, T. 1993. Limulus
hemocyte transglutaminase. cDNA cloning, amino acid sequence and
tissue localization. J Biol Chem 268:262-268).
Las TGasas más conocidas son: el factor XIII de
la coagulación de la sangre, que es una proteína del plasma, y la
TGasa K implicada en la formación de la capa córnea de la
epidermis. Por otro lado, ya han sido donados algunos de los genes
responsables de algunas de las TGasas citadas y se va conociendo la
implicación de las TGasas en importantes procesos como la
diferenciación celular, la estabilización de tejidos o la muerte
celular programada (Ichinose, A., Bottenus, R.E. & Davie E.W.
1990. Structure of transglutaminases. J. of Biol. Chemistry.
265(23): 13411-13414; Bergamini, C.M.,
Dean, M., Tanfani, F., Ferrari, C. & Scatturin. 1999.
Conformational stability of human erythrocyte transglutaminase:
patterns of thermal unfolding at acid and alkaline pH. Eur.
J.Biochem. 266: 575-582; Nemes, Z., Marekov,
L.N. & Steinert, P.M. 1999. Involucrin
cross-linking by transglutaminase 1. J. of Biol.
Chemistry. 274(16): 11013-11021). También
estas enzimas parecen estar implicadas en enfermedades
neurodegenerativas, tumores, enfermedades celíacas, etc, por ello
son un grupo de enzimas de alto interés en los estudios clínicos.
En torno a estos estudios clínicos existen diferentes patentes
relacionadas con TGasas: US5,736,132 "Method of promoting
adhesion between tissue surfaces" solicitada por Orthogene, Inc.
1998; US 5,726,051 "Transglutaminase gene" solicitada por
Oklahoma Medical Research Foundation, 1998.
La función de las TGasas vegetales es menos
conocida aunque los primeros datos sobre su existencia se
publicaron hace ya unos años (Icekson I. & Apelbaun, A. 1987.
Evidences for transglutaminase activity in plant tissue. Plant
Physiol. 84. 972-974;
Serafini-Fracassini D., Del Duca S., & D'Orazi
D. 1988. First evidence for polyamine conjugation mediated by an
enzyme activity in plants. Plant Physiol. 87:757). Los estudios en
plantas se han centrado sobre todo en aspectos bioquímicos
relacionados con la actividad, sustratos sobre los que actúa y
tejidos donde abunda, pero no se ha estudiado su papel funcional
en los muchos procesos en que se tienen datos parciales sobre su
intervención, como son: crecimiento y desarrollo, morfogénesis en
general, fotosíntesis y muerte celular (Margosiak, S.A., Drama,A.,
Bruce-Carver, M.R., González, A.P. Louie, D. &
Kuehn. 1990. Identification of the large subunit of
ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxigenase as a
substrate for transglutaminase in Medicago sativa L. (Alfalfa).
Plant Physiol. 92: 88-96; Del Ducca, S., Tidu, V.,
Bassi, R., Exposito, C., & Serafini-Fracassini,
D. 1994. Identification of chlorophyll-alb proteins
as substrates of transglutaminase activity in isolated chloroplasts
of Helianthus tuberosus L. Planta 193:
283-289; Del Ducca, S., Della Mea, M., Muñoz de
Rueda, P. & Serafini-Fracassini, D. 2000
Factors affecting transglutaminase activity catalizing polyamine
conjugation to endogenous substrates in the entire chloroplast.
Plant Physiol Biochem 38:429-439).
Además, se ha de destacar que la transglutaminasa
tiene un valor añadido para finalidades biotecnológicas. Esta nueva
faceta suplementaria como metabolito de interés, proviene de su
capacidad de crear uniones covalentes entre proteínas distintas.
Esta propiedad se ha usado por ejemplo para mantener la textura de
alimentos como pescado y carnes, reduciendo la necesidad de
utilizar sales (surimi, etc). Para la formulación de gelatinas de
distinta densidad etc. Para preparar cocinados con menos grasas
(tofú). También es capaz de mantener la consistencia, elasticidad,
humedad o viscosidad de un producto en diferentes temperaturas. Se
usa asimismo en distintos procesados lácticos: quesos, yogures,
helados, etc. Tanto es así, que actualmente se usa como
"aditivo" en muchos procesados bioalimentarios, siendo la dosis
recomendada en USA para este uso de 65 ppm.
Todas estas posibilidades de la TGasa han
generado la formulación de diferentes patentes sobre: métodos de
obtención, utilización etc. y han hecho de esta substancia un
producto comercial como por ejemplo los que viene distribuyendo la
empresa Ajinomoto, con el nombre de: Activa TG®. Las empresas que
comercializan el producto son Ajinomoto Co. Inc de Tokio (extendida
también en Norteamérica) y Rohm Enzyme de USA
(www.skidmore-sales.com/whatsnew/newsletter/summer2001.pdf).
Sin embargo, en España no se ha localizado ninguna empresa que se
dedique a la producción industrial de TGasa.
La primera TGasa que se ha sobreexpresado para
fines comerciales como los antes indicados, se realizó en bacterias
(Streptoverticillium sp.) por la empresa Ajinomoto, quién
patentó el procedimiento y las diferentes mejoras posteriores de
este protocolo inicial (US5,156,956 "Transglutaminase"
(1992)). Asimismo esta misma empresa tiene patentado, otro sistema
similar, pero mediante la transformación de Crassostrea
gigas (US5,736,356 "Transglutaminase originating from
Crassostrea gigas" (1998)) y de Bacillus subtilus
(US5,948,662 "Bacillus-derived
transglutaminase" (1999)).
En los últimos años, el grupo de investigación
autor de la presente invención ha realizado asimismo trabajos
previos a nivel bioquímico, sobre la implicación de la TGasa en la
morfogénesis de callos de maíz y su relación con la luz (Bernet, E.,
Claparols, I., Dondini, L., Santos, M.A.,
Serafini-Fracassini, D. & Torné, J.Mª. 1999.
Changes in polyamine content, arginine and ornithine decarboxylases
and transglutaminase activities during light/dark phases (of
initial differentiation) in maize) calluses and their chloroplast.
Plant Physiol Biochem. 37(12): 899-909).
Además, recientemente se ha publicado la inmunolocalización de este
enzima en distintos sistemas celulares de maíz, en relación con el
desarrollo de los cloroplastos (Villalobos, E., Torné, J.M., Ollés,
C., Claparols, I. & Santos, M.A. 2001. Subcellular localization
of a transglutaminase related to grana development in different
maize cell types. Protoplasma. 216: 155-163). Sin
embargo, no se han encontrado resultados sobre la identificación
molecular y actividad funcional con transglutaminasas vegetales,
por lo que es de alto interés comercial nuevos conocimientos sobre
dichas transglutaminasas.
La invención se enfrenta con el problema asociado
con la escasez de TGasas de origen vegetal necesarias en el campo
de la manipulación y transformación de alimentos y en el
desarrollo de plantas transgénicas con nuevas capacidades.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los inventores han identificado unas secuencias de ADN
con actividad TGasa (TGasa; EC2.3.2.13) a partir del maíz. La
actividad TGasa de las proteínas codificadas a partir de dichas
secuencias de ADN se ha puesto de manifiesto en experimentos a
partir de extractos de estas proteínas.
Por tanto, un objeto de esta invención lo
constituyen dichas moléculas de ADN.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye un vector que comprende, al menos, una de dichas
moléculas de ADN.
Un objeto adicional de esta invención lo
constituye el empleo de dichas moléculas de ADN o de dichos
vectores, para producir células transformadas capaces de expresar
proteínas recombinantes con actividad TGasa, o para introducir dicha
secuencia codificante de una proteína con actividad TGasa en
células de plantas. Las células de microorganismos y las plantas
transgénicas resultantes también constituyen objetos adicionales
de esta invención.
Un objeto adicional de la presente invención lo
constituye las proteínas con actividad TGasa expresadas a partir de
dichas secuencias de ADN y su empleo en la manipulación y
transformación de alimentos.
La invención proporciona una molécula de ADN, en
adelante molécula de ADN de la invención, proveniente de plantas y
codificante de una proteína con actividad TGasa que comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
- a)
- la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 o un fragmento de la misma; y
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a),
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de
ADN que pueda ser aislada o construida en base a la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC. ID. NO 1 o a la SEQ ID NO 3, por
ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la
secuencia.
En general, una molécula de ADN análoga es
sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos identificada
como la SEQ. ID. NO: 1 o SEQ ID NO 3. En el sentido utilizado en
esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga"
significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un
grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%,
preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al
menos, un 95%.
La molécula de ADN de la invención procede de
maíz y puede encontrarse en formas parecidas en otras especies de
plantas superiores, entre otras: arroz, trigo, Arabidopsis, etc,
donde pueden estar de forma natural o en otro caso, también podrían
estar como resultado de un proceso de transformación génica en el
que el organismo transformado reproduzca dichas moléculas de ADN.
La molécula de ADN de la invención puede ser aislada, mediante
técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier planta que
la contenga, mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos,
preparados gracias a la información de la secuencia de nucleótidos
de dicha molécula de ADN, proporcionada en esta invención.
La molécula de ADN de la invención incluye los
fragmentos de la misma que presentan dicha actividad GTasa.
En una realización particular, la molécula de ADN
de la invención es una molécula de ADN de maíz de SEQ ID NO 1 o de
SEQ ID NO 3.
La molécula de ADN de la invención puede ser
utilizada, en general, en la generación de un vector de expresión,
en adelante vector de expresión de la invención, que permite la
expresión de estas proteínas con actividad TGasa en una amplia gama
de células huésped. En general, el vector de expresión de la
presente invención comprende, al menos, una secuencia de ADN de la
invención y, al menos, un promotor que dirige la transcripción del
gen de interés, al que está operativamente enlazado, y otras
secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción del gen de
interés y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo,
señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de
poliadenilación, origen de replicación, activadores
transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados
pueden seleccionarse acuerdo con las condiciones y necesidades de
cada caso concreto entre plásmidos, cromosomas artificiales de
levadura (YACs), cromosomas artificiales de bacteria (BACs),
cromosomas artificiales basados en el bacteriófago P1 (PACs),
cósmidos o virus, que pueden contener, además, un origen bacteriano
o de levadura de replicación para que pueda ser amplificado en
bacterias o levaduras, así como un marcador utilizable para
seleccionar las células transfectadas diferente al gen o genes de
interés. Por tanto, la invención también se refiere a un vector
que comprende una molécula de ADN de la invención. La elección del
vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a
introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se
introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido que, cuando
se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de
dicha célula y se replica junto con el cromosoma de la célula
huésped.
El vector de la invención puede ser obtenido por
métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia
(Kovesdi et al. 1997. Curr Opin Biotech 8:583-589
Transgenic Res. 10:83-103; Coffin et al. 1998.
Retroviruses, CSHLP; Robbins et al. 1998. Trends Biotech.
16:35-40; Anderson. 1998. Nature
392:25-30; Schindelhauer. 1999. BioEssays
21:76-83). Un objeto particular de la presente
invención lo constituye los plásmidos pGEMT15 y el pGEMT21 que
contienen las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3, respectivamente.
La invención también proporciona una célula que
comprende una molécula de ADN o vector de expresión de la
invención. Las células hospedadoras que se pueden transformar con
dicho vector de expresión pueden ser, por ejemplo, células
bacterianas y levaduras GRAS. Estas células que contienen el vector
de expresión de la presente invención pueden ser utilizadas para
la sobreproducción de las proteínas con actividad TGasa
codificadas por la molécula de ADN de la presente invención. Un
objeto particular de la presente invención lo constituye una
proteína con actividad TGasa, entre otras, con una secuencia de
aminoácidos según se describe en la SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4.
Estos resultados permiten abrir nuevas
posibilidades de transformar un sistema bacteriano GRAS (Generally
Recognized as Safe) o una levadura que serviría, a través de la
expresión heteróloga, para producir las mencionadas nuevas proteínas
TGasas. Como se ha indicado anteriormente una proteína con
actividad TGasa puede ser utilizada en múltiples procesos de
manipulación, procesamiento y transformación de alimentos gracias
a su capacidad de crear uniones covalentes entre proteínas
distintas. Esta propiedad se ha usado por ejemplo para mantener la
textura de alimentos como pescado y carnes, reduciendo la
necesidad de utilizar sales véase patente US5928689 "Method for
treating PSE meat with transglutaminase", WO0162888 "Improved
composition of marine product"; para la formulación de gelatinas
de distinta densidad; para preparar cocinados con menos grasas
(tofú) véase US 6342256 "Tofu products excellent in freeze
resistance and process for producing the same", US6042851
"Process for producing packed tofu". También es capaz de
mantener la consistencia, elasticidad, humedad o viscosidad de un
producto en diferentes temperaturas. Se usa asimismo en distintos
procesados lácticos: quesos (US6270814 "Incorporation of whey into
process Cheese", solicitud US20010053398 "Cheese whey protein
having improved texture process for producing the same and use
thereof "), yogures, helados, mayonesas, salsas y en la
producción de fideos (EP0948905 "Enzyme preparations comprising
transglutaminase and process for producing noodles", US6106887
"Process for obtaining a modified cereal flour"), de chocolate
(US6063408 "Process for producing chocolate"), de productos
derivados a partir de patata (solicitud US20020004085 "Methods
for producing potato products"), de azúcar (JP2000354498
"Production of sugar from cereal flour material by
transglutaminase treatment"). Los distintos usos, entre otros,
descritos en las patentes anteriores para las TGasas son ejemplos
de los potenciales usos de las TGasas de la presente invención. Por
lo tanto, un objeto particular de la presente invención es la
utilización de las proteínas con actividad TGasa de la presente
invención, entre otras, las proteínas SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4, o
soluciones que las contengan, en la manipulación, preparación y
transformación de alimentos. A continuación se indica como ejemplo
de las aplicaciones de las proteínas con actividad TGasa de la
presente invención la revisión de Chiya Kuraishi et al, 2001
(Transglutaminase: Its utilization in the food industry Food Reviews
International 17 (2): 221-246).
Finalmente, existen otras aplicaciones distintas
de las comentadas anteriormente de las proteínas con actividad
TGasa de la presente invención y de las que se indican como
ilustración de dichas aplicaciones las siguientes patentes, entre
otras:
-"Method for enzymatic treatment of wool"
Patente USA. Appl. Nº 161824 (1998) MacDevitt et al, April
2000.
- "Enzymatically protein encapsulating oil
particles by complex coacervation" Appl. Nº 791953 (1997).
Soper, Jon C. Et al. March 2000.
- " Cross-linked gelatin gels
and methods of making them" Appl. Nº 641463 (1996) Bishop, P.D.
et al. ZymoGenetics, Inc.(Seattle, WA. USA).
- "Process for obtaining a modified cereal
flour" Appl. Nº 977575 Ajinomoto Co. Inc (Tokyo JP). Yamazaki et
al. August 2000.
- "Microbial transglutaminase, their production
and use" Appl. Nº 294565, (1999). NovoNordisk A/S (Bagsvaerd,
DK) Bech et al. Feb. 2001.
Además, la molécula de ADN o vector de expresión
de la invención pueden emplearse en procedimientos de
transformación genética de plantas con finalidades tanto de
investigación fundamental y en el desarrollo de plantas transgénicas
con nuevas 5 capacidades provocadas por la manipulación de las
funciones atribuidas a dicha TGasa (crecimiento y desarrollo de la
planta, morfogénesis, fotosíntesis y muerte celular) mediante la
alteración de la expresión de dichas proteínas.
Figura 1.- Actividad TGasa (medida en pmol de Put
incorporada) de un extracto proteico correspondiente a cada uno de
los productos de lisis fágica descrito en el apartado de
metodología, correspondientes a los fagos positivos f1 y f2 (que
contienen un distinto cDNA de TGasa de maíz: f1= SEQ 1D NO 1 y f2=
SEQ 1D NO 3) y al fago negativo f3 (que no contiene ningún cDNA de
TGasa). Además, se muestra el efecto de distintos factores que
influyen sobre la actividad TGasa de los extractos, descritos como
propios de dicha actividad enzimática TGasa en otros sistemas:
Calcio= el extracto proteico y en ausencia de calcio.
GTP= adición de 1 mM de GTP. MDC= adición de 1 mM de
MDC.
Figura 2.- Actividad de los dos extractos
proteicos correspondientes a los dos fagos D independientes que
contienen los dos cDNA de la TGasa (f1= SEQ 1D Nº 1; f2= SEQ 1D Nº
3), frente a un fago que no contiene ninguno de estos cDNA (f3), con
respecto a la cantidad de proteína del ensayo. La actividad se
mide en miliunidades (mU) de TGasa, por incorporación de
bibtincadaverina, como se describe en el apartado de
metodología.
a= 40 mg proteína/ml. b= 60
mg prot/ml. c= 80 mg
prot./ml.
Los cDNA de la presente invención, fueron
aislados a partir de un banco de expresión de cDNA, en
Lambda-ZAP II ®, construida con las dianas EcoRI y
XhoI, partiendo de ARN mensajero de plántulas de dos semanas de
edad de Zea mays subsp. mays, cultivar homocigoto
B73, creciendo bajo condiciones de invernadero (donada por la Dra.
Alice Barkan, de la Universidad de Oregon, USA).
Se utilizó como antígeno una transglutaminasa
vegetal de 58 kDa purificada a partir de extractos de cloroplastos
de hojas de Helianthus tuberosus. Se obtuvo un anticuerpo
policlonal en gallina (Villalobos, E., Torné, J.M., Ollés, C.,
Claparols, I. & Santos, M.A. 2001. Subcellular localization of
a transglutaminase related to grana development in different maize
cell types. Protoplasma. 216: 155-163). La
especificidad del anticuerpo se determinó por la técnica de "dot
blot", utilizando transglutaminasa comercial de hígado de
cerdo, así como por western blot con proteína purificada (Dondini,
L. 1998. Poliammine legate e transglutaminasi nelle plante. PhD
tesis. Universidad de Bolonia. Italia). La titulación se realizó
mediante la técnica de western blot. (La metodología completa se
detalla en nuestro trabajo: Villalobos, E., Torné, J.M., Ollés,
C., Claparols, I. & Santos, M.A. 2001. Subcellular localization
of a transglutaminase related to grana development in different
maize cell types. Protoplasma. 216: 155-163).
Una vez conocido el título del banco utilizado,
se inocula una colonia de la cepa XL-Blue® en medio
LB líquido conteniendo MgSO_{4} (1M) y maltosa al 20%.
Después de cultivar las bacterias hasta alcanzar
una DO de 2,0 (600 nm), se realiza la mezcla del cultivo
bacteriano con 4,5 x 10^{4} pfu de la librería, a la que se añade
IPTG 10 mM. Después de la infección e inoculación en placas con el
medio LB + 10 mM de MgSO_{4}, se coloca sobre ellas un disco de
nitrocelulosa saturado con 10 mM de IPTG. Después de incubar las
placas con el filtro durante 4 horas, se enfrían y se lava el
filtro con PBS. Finalmente, una vez bloqueada la membrana con leche
desnatada o BSA, se procede al revelado y marcado con anticuerpo.
Para detectar las lisis donde se encuentran los fagos positivos que
han de interaccionar con el anticuerpo contra la Transglutaminasa
de H. tuberosus, se realiza un análisis western blot de
dicha membrana y se revela en placa fotográfica, mediante el
reactivo ECL.
Una vez aislados y purificados los dos fagos, que
contienen los cDNAs que codifican respectivamente para una
proteína que interacciona con el anticuerpo, se procede a su
excisión mediante el sistema "ExAssist^{TM}
Interference-Resistant Helper Phage
(Stratagene)". La confección se realizó en cepas
XL1-Blue y la infección en cepas XLOLR®. El
plaqueo se realiza en un medio selectivo que determina el vector
utilizado (pBluescript). En nuestro caso, el medio de cultivo que
selecciona las colonias transformantes es LB-agar
adicionado con Ampicilina (50 \mug/ml), IPTG 1 mM y el sustrato
X-Gal (40 \mug/ml), del enzima
\beta-galactosidasa, cuyo gen es interrumpido por
el inserto o cDNA.
Para cada excisión, el aislamiento del ADN
plasmídico, que contiene el cDNA de interés, se realiza mediante la
técnica de MINIPREP a pequeña escala de la lisis bacteriana
utilizando SDS y NaOH, neutralizada con acetato de potasio, y
purificada con una mezcla de
fenol:cloroformo:isoamil-alcohol (25:24:1) y
precipitando con etanol. Posteriormente se resuspende en Tampón TE
1X adicionado con el enzima ARNasa.
En cada caso, la comprobación de la presencia del
inserto en el pBluescript se realiza mediante digestiones de una
muestra del ADN plasmídico, obtenido con las mismas enzimas
endonucleasas con las que se construyó el banco (EcoRI y XhoI). La
digestión se realiza según los requerimientos de cada enzima de
restricción (Tampón y temperatura). Una vez realizada la digestión,
el cDNA o inserto ha quedado liberado del vector. Esto se verifica
con una electroforesis convencional en gel de agarosa 0.5% en
Tampón TBE 1X o TAE 1X.
Una vez identificadas las muestras de las
minipreparaciones que contienen los cDNA de interés, que
resultaron ser dos en nuestro caso, se precipitan y purifican
mediante el uso de la mezcla de fenol, cloroformo y alcohol
isoamílico y cloroformo puro antes del proceso de secuenciación.
Las muestras a secuenciar se disolvieron en agua.
Las excisiones de los dos fagos en pBluescript
SK-, permitieron obtener dos cDNA parciales cuya secuencia
codificante completa se definió mediante la técnica de RACE. Para
ello, a partir de ARN total extraído de hoja de maíz, se obtiene el
ARN mensajero purificado por columna de polydT, el cual se emplea
como molde para la síntesis de ADN de cadena sencilla. Para ello,
se utiliza un oligonucleótido específico deducido de la secuencia
de cDNA conocida (el oligo El, 3'-5':
GATTCTCCCTGATAAG, SEQ ID NO 5) y el enzima transcriptasa inversa.
Después de añadir al ADN de cadena sencilla una cola de poliT
mediante el enzima "terminal deoxytransferase" (TdT), se
procede a obtener la segunda cadena de ADN. Esto se realiza
mediante la técnica de PCR utilizando el oligonucleótido 5' RACE
Abridged Anchor Primer (GIBCO BRL®), específico para ADN con cola
de poliT (oligo ANCHOR 5'-3':
GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG, SEQ ID NO 6) y un segundo
oligonucleótido específico del cDNA parcial de secuencia conocida,
detallado anteriormente, y que corresponde al oligo E2
3'-5': GTTCTCCAGCATCTCCAG, SEQ ID NO 7).
Con los subsiguientes ciclos de PCR se amplifica
dicho ADN. La secuencia de los ciclos fue la siguiente: primero 2
minutos a 94ºC y seguidamente 34 ciclos de: 30 segundos a 94ºC, 30
segundos a 46ºC para el oligo nº1, pero 30 segundos a 60ºC para el
oligo nº2, seguidos en ambos casos de 7 minutos a 72ºC. Finalmente
se deja unas horas a 5ºC.
El producto de PCR se clona en un vector adecuado
(como es el pGEMT), utilizando el enzima ligasa. A continuación, se
transforman cepas de E. coli del tipo
DH5-alfa y se crecen las bacterias en un medio
selectivo. Se extrae el ADN plasmídico mediante la técnica de
Miniprep, ya descrita, se purifica y se secuencia el fragmento
obtenido. En nuestro caso, para ambas secuencias parciales de cDNA,
el fragmento necesario para completar la secuencia codificante
resultó ser de solo cuatro nucleótidos. Las secuencias
codificantes completas de nucleótidos, incluyendo los cuatro
nucleotidos obtenidos con la técnica RACE, se encuentran descritas
en la SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3, respectivamente. Los vectores de
expresión conteniendo las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3 y
utilizados para la transformación de las células huésped son el
plásmido pGEMT15 y el pGEMT21, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos obtenidas a partir
de las secuencias de nucleótidos presentan homologías con los
dominios del centro activo tipo transglutaminasa de otros sistemas
descritos, no vegetales, en la zona correspondiente a los
aminoácidos: 431-474 para la proteína de SEQ ID NO 2
(60,97 kDa) y 485-528 para la proteína de SEQ ID
NO 4 (67 kDa). En estas zonas se encuentra en ambos casos una
cisteína (Cys) descrita como aminoácido esencial para la actividad
del enzima (Cys439 en SEQ ID NO 2 y Cys493 en SEQ ID NO 4). Base
de Datos consultada: www.ncbi.nlm.nih/). Además, como se indican en
las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3 se observan unas regiones
de 27 nucleótidos repetidas en tandem en ambas secuencias, SEQ ID
NO 1 y SEQ ID NO 3, aunque en número distinto, de 15 y 21
repeticiones, respectivamente y con pequeñas variaciones de
nucleotidos entre algunas de ellas. Hay que destacar que estas
mencionadas regiones repetidas no se han descrito anteriormente en
las TGasas conocidas, por lo que son características de la molécula
de ADN de la presente invención.
Con cada uno de los dos clones de los fagos
conteniendo los cDNA de interés, se infecta un cultivo de E.
coli (cepa XL-Blue), en medio de cultivo LB
líquido, al que se añade IPTG 10 mM. Después de la lisis a 37ºC,
se cuantifica por el método de Lowry la concentración de proteína
total del extracto (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr, AL& Randall
RJ. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol.
Chem. 193:265-275) y con él se realizan los
ensayos descritos a continuación, para determinar su actividad
transglutaminasa frente a un extracto de lisis con un fago que no
contiene el cDNA de interés.
Se prepara un extracto enzimático con cada uno de
los extractos de lisis obtenidos con ambos fagos (f1 que contiene
la TGasa de SEQ ID NO 2 y f2 que contiene la TGasa de SQ ID NO 4),
en una concentración de proteínas totales de 600 µg, y se realiza
un ensayo enzimático a 30ºC durante 30 minutos. La mezcla
enzimática contiene, además del extracto proteico, 0.6 mM de
putrescina, 185 kBq de putrescina tritiada (0.85 TBq/nmol), 20 mM
de tampón Tris.ClH pH 8 y 3 mM de CaCl_{2}. La reacción se
bloquea con ácido tricloracético al 10% conteniendo 2 mM de
putrescina. Las muestras se precipitan repetidamente y se mide la
radioactividad del pellet (Bernet, E., Claparols, I., Dondini, L.,
Santos, M.A., Serafini-Fracassini, D. & Torné,
J.Mª. 1999). Changes in polyamine content, arginine and ornithine
decarboxylases and transglutaminase activities during light/dark
phases (of initial differentiation) in maize calluses and their
chloroplast. Plant Physiol Biochem. 37(12):
899-909). La actividad TGasa se mide en pmols de
putrescina por miligramo de proteína y por hora y fue mayor en los
extratos proteicos obtenidos de los fagos f1 y f2 con respecto al
extracto a partir de un fago que no contiene ninguno de los cDNA de
estas TGasa.
Este ensayo consiste en un kit suministrado por
la empresa Covalab®, que determina, a partir de pequeñas cantidades
de proteína total, la actividad TGasa de la muestra, frente a la
de una TGasa comercial de hígado de cerdo. El método detecta los
glutamil-derivados formados a partir del péptido y
de la poliamina sustrato, por actividad TGasa de la nuestra,
mediante un ensayo colorimétrico. La actividad se mide en Unidades
de TGasa (U), considerando que 0.6 mU de TGasa comercial corresponde
a un valor de absorbancia a 450 nm de 1 \pm 0.05 OD.
Los dos extractos proteicos correspondientes a
los dos productos de lisis, muestran actividad tipo TGasa en los
dos métodos de detección de dicha actividad utilizados y descritos
anteriormente (f1 y f2) en comparación con el extracto proveniente
de un fago que no contiene ninguno de estos cDNA (f3). Los datos se
muestran en las Figuras 1 y 2.
Además, en la Figura 1 se muestra el efecto de
distintos factores sobre la actividad TGasa de los extractos,
descritos como propios de dicha actividad enzimática TGasa en
otros sistemas. Así, la actividad de la proteína expresada disminuye
significativamente: a] en ausencia de calcio, b] en presencia de 1
mM de GTP, c] en presencia de 1 mM denodansilcadaverina (MDC) y d]
en el extracto de lisis con un fago que no posee el cDNA de
interés (f3).
Un par cultivos de la bacteria derivada de
Escherichia coli, tipo dH5á, transformadas con un plásmido
(pBlueScript) que contiene un cDNA de maíz y portadoras de un
plásmido que contiene el gen que codifica la proteína de secuencia
SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4 de maíz respectivamente, identificados
como 15TGZMO2 y 21TGZM02, han sido depositados en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio
de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot, Valencia,
España, el 7 de Mayo de 2002, correspondiéndoles el número de
depósito CECT: 5705 para 15TGZMO2 y 5706 para 21TGZMO2,
respectivamente.
\vskip0.333000\baselineskip
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\hskip1cmTorné Cubiró, José María
\hskip1cmSantos Lozano, María Asunción
\hskip1cmTalavera Baro, David
\hskip1cmVillalobos Amador, Enrique
\hskip1cmRigau LLoveras, Juan
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS DE MAÍZ
CODIFICANTE DE UNA PROTEÍNA CON ACTIVIDAD TRANSGLUTAMINASA, Y SU
USO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<130> transglutaminasa de maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1748
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Zea mays L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> repeat_region
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (823) .. (1228)
\vskip0.333000\baselineskip
<223> rpt unit (823) .. (849) number rpt:
15 repeats
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> 3'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1606) .. (1729)
\vskip0.333000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> polyA_site
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1730) .. (1748)
\vskip0.333000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> polyA_site
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1730) .. (1748)
\vskip0.333000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1) .. (1605)
\vskip0.333000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<300>
\vskip0.333000\baselineskip
<308> AJ421525
\vskip0.333000\baselineskip
<309>
2001-12-06 confidencial hasta el
2002-12-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 534
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Zea mays L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1910
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Zea mays L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> repeat_region
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (823) .. (1389)
\vskip0.333000\baselineskip
<223> rpt unit (823) .. (849) number rpt:
21 repeats
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1) .. (1764)
\vskip0.333000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> polyA_site
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1892) .. (1910)
\vskip0.333000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> 3'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1765) .. (1891)
\vskip0.333000\baselineskip
<223>
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Zea mays L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleotido El
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattctccct gataag
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleotido ANCHOR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccaggcgt cgactagtac gggiigggii gggiig
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleotido E2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttctccagc atctccag
\hfill18
Claims (12)
1. Secuencia de nucleótidos codificante de una
proteína con actividad TGasa caracterizada porque proviene
del maíz.
2. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 1 caracterizada por la SEQ ID NO 1.
3. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 1 caracterizada por la SEQ ID NO 3.
4. Secuencia de nucleótidos caracterizada
porque presenta, con respecto a una secuencia de nucleótidos según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, un grado de
identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%,
preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al
menos, un 95%.y porque codifica una proteína con actividad
Tgasa.
5. Vector de expresión caracterizado
porque contiene una secuencia de nucleótidos según una cualquiera
de las reivinidcaciones 1 a la 4.
6. Vector de expresión según la reivindicación 5
caracterizado porque pertenece, entre otros, al siguiente
grupo: plásmido pGEMT15 y el pGEMT21.
7. Proteína con actividad TGasa
caracterizada porqué está codificada por una secuencia de
nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la
4.
8. Proteína con actividad TGasa según la
reivindicación 7 caracterizada porque pertenece, entre
otras, al siguiente grupo: SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4.
9. Célula transformada caracterizada
porque contiene un vector de expresión según una cualquiera de las
reivinidicaciones 5 y 6 y porque permite la expresión de proteínas
con actividad TGasa, entre otras, las cepas E. coli CECT
5705 y 5706.
10. Uso de la célula transformada según la
reivindicación 9 en procedimientos para la producción de proteína
recombinante con actividad TGasa según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 y 8.
11. Uso de la proteína con actividad TGasa según
una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 en la manipulación,
procesamiento y transformación de alimentos, entre otros procesos,
para mantener o mejorar la textura, consistencia, elasticidad,
humedad o viscosidad de alimentos como pescado, queso, yogures,
helados, mayonesas y carnes, para la formulación de gelatinas de
distinta densidad y para preparar cocinados con menos grasas.
12. Uso de los vectores de expresión según las
reivindicaciones 5 y 6 en el desarrollo de plantas transgénicas
con nuevas capacidades provocadas por la manipulación de las
funciones atribuidas a dicha TGasa, entre otras, crecimiento y
desarrollo de la planta, morfogénesis, fotosíntesis y muerte
celular.
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