CN1230529C

CN1230529C - 杆菌衍生的转谷氨酰胺酶

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Publication number: CN1230529C
Application number: CNB961055960A
Authority: CN
Inventors: 小林克德; 山中茂; 三轮清志; 铃木俊一; 江藤让; 谷田有子; 横关健三; 桥口贤一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-02-09
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 2005-12-07
Anticipated expiration: 2016-02-09
Also published as: CN1142536A

Abstract

本发明涉及新的杆菌衍生的转谷氨酰胺酶(TG)；通过使用TG或含有TG的组分而生产具有交联结构的蛋白质、非蛋白质氨基酸聚合物、肽或其衍生物的方法；以及编码从杆菌中得到的TG的DNA；通过将载体DNA与上述DNA相连而得到的重组DNA；用重组DNA转化的细胞和通过培养转化体而生产杆菌衍生的转谷氨酰胺酶的方法。本发明的新的TG生产成本低、不需钙，因而使用不受限制，可用于生产各种食品。

Description

杆菌衍生的转谷氨酰胺酶

本发明涉及(1)由象枯草芽孢杆菌等这样的杆菌生产的转谷氨酰胺酶(下文称为TG)，(2)具有转谷氨酰胺酶活性的组分，和(3)生产具有交联结构的蛋白质，非蛋白质氨基酸聚合体，肽或其衍生物的方法，其特征在于通过TG或有TG活性之组分的作用交联蛋白质，非蛋白质氨基酸聚合物、肽或衍生物中的Gln和Lys残基，由此在蛋白质、非蛋白质氨基酸聚合物，肽或其衍生物形成分子间或分子内交联的ε-(γ-Glu)-Lys键。

本发明还涉及(4)编码得自象枯草芽孢杆菌等这类杆菌之转谷氨酰胺酶的DNA，涉及(5)通过将载体DNA与所述DNA相连而得到的重组DNA，涉及(6)用所述重组DNA转化的细胞，和(7)通过培养所述转化体而生产杆菌衍生的转谷氨酰胺的方法。

通过TG或有TG活性之组分的作用而形成的具有交联结构的蛋白质、非蛋白质氨基酸聚合物、肽和其衍生物在本文中称为交联的聚合物。

TG是一种催化肽链中存在的Gln残基中γ-羧基酰胺底物的转酰基作用的酶。在肽链Lys残基中的ε-氨基是酰基受体的转酰基作用中，在肽分子间或内形成分子内或分子间交联的ε-(γ-Glu)-Lys键(下文称为“GL键”)。在水是酰基受体的转酰基作用中，通过Gln残基变成Glu残基。而使肽链中的Gln残基去酰胺化。

利用本发明杆菌衍生的TG可以生产交联的聚合物。将由此生产的交联聚合物用于食品，例如豆腐(Soybean curd)，布丁、酸奶、奶酪、底栖鱼肉、煮沸的鱼糊，香肠和其他鱼和内产品中以及化妆品等中。

迄今为止，已知TG存在于许多动物组织中。例如，已研究了存在于豚鼠肝中的TG(见Connellan etal.，Journal of Biological Chemistry，Vol 246，pp1093-1098，1971)。有关微生物衍生的TG，迄今只报道了得自放线菌(放射状真菌)或枯草芽孢杆菌的TG(见M.V Ramanu jam et al，FASEB J.Vol 4，A2321)和得自粘菌(有粘液的霉菌)的TG(见J.D.Klein et al，J.Bacterial，Vol 174，2599-2605)。到目前为止由放线菌生产的TG已投入实践和工业应用(见日本专利公开No.6-65280，日本特许公开No.1-27471)。

由于下列原因，特别是在生产交联聚合物时，工业化利用得自动物，如豚鼠的TG有明显的缺陷。

很难以低成本得到大量的所述动物衍生的TG。另外，由于TG有需求钙离子的特性，所以它的使用受到限制。

放线菌衍生的TG也有一些不利因素。由于放线比普通细菌生长得慢，因此它们需要一个长培养期，从而增加了生产TG的成本。

新墨西哥州立大学的Ramanu jam等人已报道了存在枯草芽孢杆菌衍生的TG。然而由其报道的TG有下列特性。

1)其适宜的pH在9.5或更高。2)由于其活性很大程度上受螯合剂(EDTA)的抑制，因此认为TG有需要金属离子的特性(3)为5mM或更高浓度的Ca²⁺抑制。4)被DTT抑制。5)由营养细胞和产生孢子细胞均可生产。

由于上述特性，特别是其适宜的pH高而且又受金属离子的影响，因此，TG的实际应用受到限制。

正如上文提到的，问题存在于1)当动物衍生的TG用于工业应用时，由于其本身需钙离子的特性，而且生产成本高而使其受到限制，2)当将放线菌衍生的TG用于工业应用时，放线菌的生长的比细菌的慢，因此提高了生产成本，和3)若将由新墨西哥州立大学的研究者报告的枯草芽孢杆菌用于工业应用，则由于其为5mMCa²⁺抑制，所以不能用于食品中。

因此，本发明的目的是从迄今已用于生产食品的杆菌，例如枯草芽孢杆菌等中分离新的TG，并提供由使用TG而生产交联聚合物的方法。

我们本发明人进行了艰苦的研究以致从已用于食品生产的微生物，例如枯草芽孢杆菌等中，得到一种新的TG，结果发现杆菌，如枯草芽孢杆菌等有一种新TG。以此发现为基础，我们完成了本发明。

具体地说，本发明包括有下列特性的杆菌衍生的TG，和通过使用TG或含有TG的组分而生产具有交联结构之蛋白质、非蛋白质氨基酸聚合物，肽或其衍生物的方法，所述方法的特征在于：通过TG或含TG之组分的作用而使在蛋白质、非蛋白质氨基酸聚合物，肽或其衍生物中的Gln和Lys残基交联，由此在蛋白质、非蛋白质氨基酸聚合物，肽或其衍生物的分子之间或之中形成分子间或分子内交联的ε-(γ-Glu)-Lys键。

(本发明之杆菌衍生的TG的特性)

1)TG适宜的pH在约7和约9之间。

2)其适宜的温度在约40℃和约65℃之间。

3)其在约60℃或以下是稳定的。

4)其活性不依赖Ca²⁺。即TG不依赖Ca²⁺，而且在存在5mMCa²⁺时，有50％或更高的活性。

5)为NEM，胱胺和(NH₄)₂SO₄中的任一种物质抑制。

6)不受EDTA，DTT和2-ME中的任一种物质抑制。

7)其分子重量(a)约18,000到约22,000(由凝胶渗透测量的)，和(b)约28,000到约30,000(由SDS-PAGE测量的)。

8)它催化肽链中Gln残基中γ-羧基酰胺的转酰基作用。

本发明还包括编码从杆菌，例如典型的枯草芽孢杆菌中得到的TG的DNA，通过将载体DNA与上述DNA相连而得到的重组DNA，用重组DNA转化的细胞，和通过培养转化体而生产杆菌衍生的转谷氨酰胺酶的方法。

已熟知杆菌，如枯草芽孢杆菌等的孢子有极高的物理、化学和生物学抗性。本发明人认为所述抗性来自于杆菌孢子中的GL键。这是因为GL键广泛存在于动物血管、头发等结缔组织中，它们增强了结缔组织的强度。

因此，GL键广泛存在于动物血管、头发等结缔组织中，另外，认识到TG也存在于组织中。因此，由组织强度被增强而认识到通过TG的作用形成了GL键。

已知情况，本发明人利用固相NMR，HPLC分析等分析了杆菌，如枯草芽孢杆菌等孢子的结构，结果发现孢子中存在GL键。以此发现为基础，本发明人认为在杆菌中也存在催化GL键形成的TG。

以上述想法为基础，本发明人重点研究了存在于自然界，特别是土壤中产生孢子的细菌，如杆菌，典型的如枯草芽孢杆菌，并对其进行了筛选，从中分离了产生TG的细菌。

我们测量了在孢子形成阶段之产孢子菌的TG活性，发现了两个有强TG活性的菌株。我们将这两个菌株称为AJ12866和AJ1307。

我们按伯杰氏系统生物学分类手册对AJ12866和AJ1307进行了一般的鉴定，表明这两个菌株是属枯草芽孢杆菌的。于1995年2月2日将枯草芽孢杆菌AJ12866寄存于the National Institute of Bioscience andHuman-Technology，the Agency of Industrial Scienceand Technology，the Ministry of International Tradeand Industry of Japan(下文称为“NIBH”)，保藏号为FERM P-14750。根据布达佩斯条约，将枯草芽孢杆菌AJ12866于1995年12月4日转移到国际保藏中心；国际保藏号为FERM BP-5325。

枯草芽孢杆菌AJ1307于1995年8月22日寄存于NIBH，保藏号为FERM P-15123。根据布达佩斯条约，于1996年1月18日将枯草芽孢杆菌AJ1307转移到国际保藏中心，保藏号为FERM BP-5367。

本发明的TG广泛存在于有孢子的杆菌中。即，TG不仅存在于枯草芽孢杆菌中，而且存在于下列杆菌中。

杆菌包括地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，短芽孢杆菌，Bacillus sphaericus多粘芽孢杆菌，Bacillus alcalo philus等。

接着，下面描述培养所述杆菌的方法和纯化培养物的方法，由此可以从培养物中得到TG。

由液体培养或固体培养的任一方法可以培养杆菌。尤其是，深层通气和搅拌培养是工业上有利的。

作为培养杆菌之营养培养基中的营养源，可以使用的有培养微生物常用的普通碳源、氮源、无机盐和其它微量营养物。可使用杆菌可利用的所有营养源。

至于通气，使用有氧条件。说到培养温度，在其可生长并生产TG的任何温度均可培养杆菌。因此，不必具体限定培养温度，但一般为10到50℃，优选的30到40℃。

然而，由于杆菌是嗜热菌，因此可在比上述范围高的温度培养它们。

培养时间随培养温度和其它培养条件而定。优选的，例如，于生产最大量TG的长时间内培养杆菌。通常，将其培养5小时到7天左右，优选的10小时到3天左右。

根据本发明，杆菌表现其TG活性的阶段仅限于孢子形成阶段。这是本发明TG基本不同于由新墨西哥州立大学所报道之枯草芽孢杆菌的最明显的地方。

在开始培养杆菌细胞到形成孢子，其TG活性逐渐增加。然后在孢子形成阶段IV到VI左右，TG活性最大，此后开始降低。在培养物中只检测到很小的TG活性，但在生长细胞中检测到的活性大得多。

在低温条件下，破碎或溶解由此生长的细胞。于20000×g将由此处理的细胞离心10分钟。然后将上清液部分和沉淀部分彼此分开，检测各部分的TG活性。用此方法，证实含有孢子的沉淀部分有活性。

由此可知TG存在于孢子的表面。

为了纯化杆菌衍生的TG，可直接处理含杆菌生长细胞的培养物以得到纯化的TG，但最好是首先破碎或溶解生长细胞的孢子囊，然后处理所得的孢子以得到纯化的TG。

通过破碎或溶解经培养杆菌而得到的孢子囊，可以得到杆菌的孢子。在破碎或溶解处理后，将TG活性收集于含孢子的不溶部分。因此，还可以浓缩不溶部分以得到所需的酶制品。

为了将已收集于不溶部分中的TG活性回复到可溶部分内(即为了溶解TG活性)，需进行下列操作。

作为一实例，将表面活性剂，如Triton X-100，烷基葡糖苷等加到不溶部分中，由此将TG活性回收在所得的可溶部分中。还可以用碱性缓冲液(例如，20mMNaHCO₃缓冲液，pH10)处理含孢子的部分，由此将TG活性回收于所得的可溶部分，还可将含孢子的部分悬于缓冲液中，然后加热所得的悬浮液，由此将TG活性回收于所得的可溶部分。例如，通过于10℃或更高的温度加热悬浮液，可将TG活性回收于可溶部分。

可用溶解的TG作为胶化剂。利用可用于纯化酶的任何常规方法，例如凝胶渗透，离子交换层析等，可进一步纯化溶解的TG。结果，可得到具有更高相对活度的TG。由此纯化的TG可以是有更高相对TG活度的胶化剂。

应用下列方法测量TG活性。用¹⁴C-标记的腐胺和二甲基酪蛋白作为底物，将含TG的样品加到这些底物上，以使其彼此反应，用10％TCA沉淀腐胺键合的二甲基酪蛋白，然后将所得的沉淀吸附剂滤纸上。由于滤纸上的放射性与样品中的TG活性成正比，因此可定量确定样品中的TG活性。用液体闪烁计数器可测量放射性。

下文将枯草芽孢杆菌AJ1307衍生的TG称为TG-1，而将枯草芽孢杆菌AJ12866衍生的TG称为TG-2。以TG-1和TG-2的资料为基础，下文描述本发明TG的酶化学特性。

适宜的pH范围：

本发明TG适宜的pH在约7和约9左右。

为了确定TG有适当活性的pH范围，于37℃将与TG的各种酶反应进行30分钟。

适宜的温度范围：

TG的适宜温度在约40℃和约65℃左右。

为了确定TG有适当活性的温度范围，在pH7.5，将与TG的各种酶反应进行30分钟。

温度稳定性：

TG在约60℃或以下是稳定的。

在pH7.5，将TG高温处理10分钟，然后检测TG的温度稳定性。即使TG经受60℃的高温处理，仍然保持约80％的TG活性。

抑制剂的影响：

NEM(N-乙基顺丁烯二酰亚胺)和胱胺很大程度抑制了本发明杆菌衍生的TG。另外，(NH₄)₂SO₄(硫酸铵)也对其有明显抑制作用。

DTT和EDTA的影响：

存在DTT(二硫苏糖醇)的条件下，可提高本发明杆菌衍生的TG的活性。然而，EDTA(乙二胺四乙酸)的存在对TG活性几乎没有影响。

本发明的TG没有需要Ca²⁺的特性。即，它是不依赖Ca²⁺的酶。存在5mMCa²⁺的条件下，TG仍保持了50％或更高的活性。

分子量：

TG的分子量为(a)约18,000到约22,000(由凝胶渗透测量的)和(b)约28,000到约30,000(经SDS-PAGE测量的)。

活性：

TG催化底物，肽链中存在Gln残基上γ-羧基酰胺的转酰基作用。在肽链Lys残基上ε-氨基为酰基受体的转酰基作用中，在肽分子内或之间形成分子内或分子间交联的ε-(γ-Glu)-Lys键。在水为酰基受体的转酰基作用中，通过将Gln残基变成Glu残基而使肽链中的Gln残基经去酰胺作用。

如上文所述，得自枯草芽孢杆菌AJ12866和枯草芽孢杆菌AJ1307之本发明TG的特性明显不同于由新墨西哥州立大学研究小组报道的枯草芽孢杆菌衍生的TG。

接着，下文将描述用本发明TG生产交联聚合物的方法。

根据本发明，用于生产交联聚合物的TG可以是(1)通过破碎或溶解培养细菌的孢子囊而得到的不溶的含孢子部分的浓缩物，(2)用各种方法溶解不溶部分而得到的有TG活性的部分，和(3)有高相对活度的纯化TG。

还可以通过培养用重组DNA转化的转化体细胞而得到的杆菌衍生的TG，用下文所述的方法将编码杆菌衍生的TG与载体DNA相连而构建所述的重组DNA。

除上述情况外，还可以用有杆菌衍生的TG活性的所有其它部分。

作为TG或TG-活性组分的底物，应用一种或多种蛋白质，非蛋白质氨基酸聚合物，肽和其衍生物。

对蛋白质的来源和特性不必特别限定，只要所用蛋白质有Lys和Gln残基并且为上述催化剂催化。例如，酪蛋白，明胶，大豆蛋白等可用作底物。另外也可以用经蛋白酶部分酶切的蛋白质。

非蛋白质氨基酸聚合物包括用化学合成法生产的氨基酸聚合物，如聚赖氨酸，等。

肽可以是用化学合成法得到的或用酸，碱、蛋白酶等降解天然蛋白而得到的那些。

所述物质的衍生物包括糖蛋白、化学修饰的蛋白质等。

任何其他物质只要其有Lys和Gln残基就可作用TG或TG-活性组分的底物。

加入本发明TG或有TG活性的组分，然后与底物中，含浓度为0.1％或更高蛋白质的溶液或悬浮液反应，从而得到交联的聚合物产物。根据其交联程度，将根据本发明得到的交联聚合物可分成胶化产物组、高粘产物组和仅聚合物的产物组。本发明包括全部所述的交联聚合物。

通常，反应溶液的pH为约4到约10，反应温度为约5℃到约80℃，反应时间为约10秒到约24小时。反应的结果是得到了交联聚合物(胶化产物，高粘产物等)。

下面将描述根据本发明用重组DNA技术生产杆菌衍生的TG的方法。

已知许多用重组DNA技术生产有用蛋白质如酶，有生理学活性的物质等的实例。用重组DNA技术的一个优点是可以大量生产在自然界仅少量存在的有用蛋白质。

为了用所述重组DNA技术生产本发明杆菌衍生的TG，就需要编码杆菌衍生的TG的DNA。将所述DNA与载体DNA相连以构建所需的重组DNA。用重组DNA转化宿主细胞。在培养基中培养已转化过的能生产杆菌衍生的TG的转化细胞，由此在培养基或细胞中使细胞生产并积累杆菌衍生的TG，其后收集TG。

下面描述得到编码杆菌衍生的TG之DNA的方法。

首先，确定纯化TG的氨基酸序列。可按Edman法(见Edman，P，Acta chem.Scand，4，227(1950))确定所需的-氨基酸序列。另外，也可以用AppliedBiosystems Co生产的测序仪确定氨基酸序列。

确定本发明杆菌衍生的TG中，从N-末端到第35个残基的氨基酸序列，它相当于序列表中Sequence Num-ber 1的序列。

以由此确定的氨基酸序列为基础，可推测编码它的DNA碱基序列。为了推测DNA碱基序列，所用的是普遍密码子或杆菌基因中最常用的密码子。

以由此推测的碱基序列为基础，合成有30到50个左右碱基对的DNA分子。在Tetrahedron Letters，22，1859(1981)中描述了合成所述DNA分子的方法。也可以用Applied Biosystems Co生产的合成仪合成所述DNA分子。若从杆菌染色体基因文库中分离编码杆菌衍生的TG的全长DNA，则可用所述的DNA分子作探针。另外，若用PCR扩增编码杆菌于生的TG的DNA时，也可用其作为探针。然而，由于经PCR扩增的DNA不包括编码杆菌衍生的TG的全长DNA，所以用经PCR扩增的DNA作探针，从杆菌染色体基因文库中分离编码杆菌衍生的TG的全长DNA。

White，T.J等人(in Trend Genet，5，185(1989)等)中描述了PCR的操作方法。在Molecular Biologi-cal Methods for Bacillus (John Wiley & Sons，Ltd(1990)，等)中描述了制备杆菌染色体DNA的方法。在Molecular Biological Methads for Bacillus，(JohnWiley & Sons，Ltd(1990)等)中描述了构建杆菌等染色体基因文库的方法。在Molecular Cloning(2ndEdition，Cold Spring Harbor Press(1989)等)中描述了用DNA分子作探针从基因文库中分离所需DNA分子的方法。

为了确定编码杆菌衍生的TG并且已按上述方法分离的DNA的碱基序列，所用的方法在A Practical Guideto Molecular Cloning，John Wiley & Sons，Inc(1985)中作了描述。为了进行碱基测序，还可使用AppliedBiosystems Co.生产的DNA测序仪。

编码本发明杆菌衍生的TG的一个DNA示于序列表中的Sequence Number 2。从枯草芽孢杆菌AJ1307的染色体DNA中分离所述DNA。编码本发明杆菌衍生的TG的DNA不仅仅限于示于序列表中的Sequence Num-ber 2中的序列。根据其所来源的杆菌种和菌株，DNA应有不同的碱基序列。

可以将编码从杆菌染色体DNA分离的TG的DNA进行人工突变以修饰所述的DNA碱基序列。进行所述人工突变的一种常用方法是例如在Method in Enzymol，154(1987)中描述的位点特异性突变。任何人工突变的DNA，只要编码杆菌衍生的TG，则均在本发明编码杆菌衍生的TG的DNA之范围内。

含有通过将编码枯草芽孢杆菌AJ1307衍生物的TG的DNA与载体DNA相连而构建的重组DNA的E.coliAJ13172细胞已根据布达佩斯条约，于1995年12月20保藏在NIBH的国际保藏中心，国际保藏号为FERMBP-5346。

通过将载体DNA与编码杆菌衍生的TG的DNA相连而构建重组DNA。然后用重组DNA转化细胞以得到转化体细胞，在培养基中培养转化体细胞以使细胞在培养基和/或细胞中生产并积累杆菌衍生的TG，然后收集TG而可以大量生产杆菌衍生的TG。

在需要用重组DNA技术生产大量蛋白质的许多情况下，所生产的蛋白质是细胞内的，与生产所述蛋白质的转化体中的包含体有关。这种生产蛋白质之表达方法的优点在于可使所需的蛋白质免于被所用细胞中的蛋白酶消化，而且通过破碎细胞，然后离心所得的细胞碎片可以很容易地纯化所需的蛋白质。

用蛋白质变性剂溶解由此得到的蛋白质包含体，然后除去变性剂基本上恢复所溶蛋白质的活性，此后，将所溶解的蛋白质变成正确折叠的具生理活性蛋白质。已知许多与此方法有关的实例，一个实例就是恢复人白细胞介素2的活性(见日本特许公开No.61-257931)。

为了从蛋白质包含体中得到活化的蛋白质，必需要有一系列的溶解、恢复活性等过程，而且所述的操作过程往往比直接生产活化的蛋白质的更复杂。然而，若在细胞中生产大量的蛋白质，而且若所生产的蛋白质对细胞的生长有影响，则可以以所述无活性包含体形式在细胞中积累蛋白质，由此减低蛋白质的影响。

至于大量生产所需蛋白质包含体的方法，已知有在强启动子控制下表述所需蛋白质本身的方法，以及表达以融合蛋白形式的所需蛋白质的方法，其中所需的蛋白质与已知大量表达的另一种蛋白质融合。

此外，可有效地先将一些限制蛋白酶酶识别位点在适当位置插入融合蛋白，以便在其表达后，可将所需的蛋白质从融合蛋白中切出。

用重组DNA技术转化的用于大量生产蛋白质的宿主细胞包括细菌细胞，放线菌细胞，酵母细胞，霉菌细胞，植物细胞，劝物细胞等。通常，大肠杆菌，E.coli是优选的。这是由于有许多用E.coli细胞大量生产蛋白质的现有技术。下文描述用转化的E.coli细胞生产本发明杆菌衍生的TG的方法。

至于用于表达编码杆菌衍生的TG之DNA的启动子，可使用的是一般用于使E.coli生产外源蛋白质的启动子。例如，可使用的强启动子如T7启动子，trp启动子，lac启动子，tac启动子，PL启动子等。

为了使宿主细胞生产作为融合蛋白质包含体的杆菌衍生的TG，应将编码另一种蛋白质，优选的亲水肽的基因连到每个宿主细胞中杆菌衍生的TG基因的上游或下游位点以便在其中构建融合蛋白基因。编码另一种蛋白质的基因可以是任何一种有能力增加在宿主细胞积累的所需蛋白质并且在融合蛋白变性和复性后，可提高融合蛋白稳定性的基因。候选基因有T7基因10，β-半乳糖苷酶基因，二氢叶酸还原酶基因，干扰素γ基因，白细胞介素-2基因，凝乳酶原基因等。

若将这些基因中的任一种与编码杆菌衍生的TG的基因相连，则这两种基因的阅读框架的密码子应是相同的。可利用在适宜的限制性核酸内切酶位点彼此相连的基因或任何有适宜序列的合成DNA。

为了提高由宿主细胞生产杆菌衍生的TG的数量，优选的是将有转录终止序列的终止子连在融合蛋白基因的下游位点。终止子包括，例如T7终止子，fd噬菌体终止子，T4终止子，四环素抗性基因终止子，大肠杆菌TrpA基因终止子，等。

若含有编码杆菌衍生的TG或编码由杆菌衍生的TG和另一蛋白质组成的融合蛋白之基因的载体被导入E.coli，测优选的是所谓多拷贝载体。所述载体包括：例如puc质粒，pBR332质粒和其衍生物。为了更好地筛选所得的转化体，所述载体最好含有象氨苄青霉毒抗性基因等这样的标记。对于所述质粒，含有强启劝子的各种表达载体均是可从商业途径获得的(例如，由TakaraShuzo Co生产pUC质粒，由Clonetec Co.生产的pPROK质粒，由Clonetec Co生产的pKK233-2等)。

将含有启动子的DNA片段，编码杆菌衍生的TG或编码由杆菌衍生的TG和另一蛋白质组成的融合蛋白的基因和终止子以这样的顺序相连，然后与载体DNA相连以构建重组DNA。

用所述重组DNA转化E.coli细胞，然后培养所得的转化体细胞以使其表达并生产杆菌衍生的TG或由杆菌衍生的TG和另一蛋白质组成的融合蛋白。

至于转化的宿主，可以用任何适于表达外源基因的菌株。特别优选的是E.coli JM109(DE3)菌株和JM109菌株。在Molecular cloning(2nd Edition，ColdSpring Harbor Press(1989)等中描述了转化方法和筛选所得转化体的方法。

若表达了融合蛋白时，则可对其进行修饰，以便用限制性蛋白酶可从融合蛋白中切去TG，所述限制蛋白酶含有在TG中没有的，作为识别序列的序列，如血液凝集因子Xa，激肽释放酶等。

至于生产培养基，可使用任何通常用于培养E.coli细胞的常规培养基，如M9-Casamino培养基，LB培养基等。应根据所用的载体标记，启动子、宿主细胞类型等适当筛选培养条件和诱导生产的条件。

为了回收并收集杆菌衍生的TG或由杆菌衍生的TG和另一种蛋白质组成的融合蛋白，例如可用下述各种方法。

若已将TG或融合蛋白溶解在培养细胞中，则收集细胞，然后破碎或溶解，由此得到的含细胞碎片的液体可作为粗酶液。如果需要，将液体进一步进行常规沉淀，过滤、柱层杆等，由此在使用前纯化TG或融合蛋白。

如果需要，也可使用经其抗体纯化TG或融合蛋白的方法。

若形成蛋白质包含体，则可用蛋白质变性剂将其溶解。在这种情况下，可将蛋白质包含体与含有它的细胞一起溶解。然而，考虑随后的纯化步骤，优选的是在溶解前，先分离包含体。用任何已知的方法均可从细胞中分离包含体。例如，破碎细胞，然后离心等，由此回收包含体。

至于用于溶解蛋白质包含体的蛋白质变性剂，可使用盐酸胍(例如，浓度为6M，pH5-8)，脲(例如浓度为8M)等。

经透析等除去所用的蛋白质变性剂，再次得到活性蛋白。用于所述渗析的渗析溶液可以是tris-Hcl缓冲液，磷酸盐缓冲液等。其浓度可以从20mM到0.5M，其pH可从5到8。

复性步骤中的蛋白质浓度限定在不高于500μg/ml左右。为了防止由此复性的杆菌衍生的TG进行自交联，就需要使渗透温度不高于5℃，为了回收蛋白质变性剂，除上述渗析方法外，还可用稀释法，超滤法等。为了恢复蛋白质的活性，可使用这些方法中的任何一种。

若将具序列表中Sequence Number 2序列的DNA作为编码杆菌衍生的TG的DNA，则可得到含有在Se-quence Number 2碱基序列下所示之氨基酸序列的杆菌衍生的TG。在该DNA中，开放阅读框架的范围从第118A到第8692C残基。

实施例：

下面利用下列实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不仅限于这些实施例的实施方案。

实施例1，生产并纯化TG

培养枯草芽孢杆菌AJ1307细胞以使其有足够的TG活性。用Schae ffer’s培养基，于37℃经液体震荡培养或液体通气和搅拌培养完成培养。所用Schae ffer’s培养基的组分有8g/l Bacto营养液，1g/l KCl，0.12g/lMgSO₄·7H₂O，1mMCaCl₂，10μM MnCl₂，和1μMFeSO₄，pH7.0。

首先，将AJ1307菌株的细胞于20ml培养基中培养24小时，进行种子培养。再将5ml含种子细胞的培养物培养于各100ml的三批培养基中。当各培养基中的细胞达到对数生长后期时，将各培养物转到900ml另一种培养基中。当连续培养细胞时，三批培养基依次相连。当各培养中的细胞又长到对数生长后期时，将共3升培养物转到27升另一种培养基中，然后再培养，同时以1/4vvm通气并以350rpm搅拌。

在细胞再达到对数生长后期时，将30升培养物转到270升另一种培养基中，进一步在其中培养，同时以1/20vvm通气并以200rpm搅拌。这是最后的培养。在细胞达到稳定期后，再继续培养6小时。此后，完成最后的培养。将最后的培养物用冷水迅速冷却到20℃或20℃以下。然后用连续离心机离心以收集细胞。用由此得到的细胞作为起始材料，从中用下列方法纯化TG。

按如下的酶活性检测法确定下文所得酶液的TG活性。将含1μl待检酶液的50μl试剂液(100mMTris-HCl，pH7.5，6.3mg/ml二甲基酪蛋白，10nM¹⁴C-腐胺，1.2μCi)于37℃反应30分钟，然后将40μl由此反应的液体吸附到滤纸上，用10％TCA固定。接着用5％TCA溶液洗涤3次，用液体闪烁计数器计数其放射性。将由此计数的值称为酶液的TG活性。

1.洗涤细胞：

将培养后收集的细胞悬于50mM Tris-HCl(pH7.5)中，以20,000xg离心30分钟再次收集沉淀部分形式的细胞。这种悬浮和离心步骤是为了洗涤细胞。将这种细胞洗涤过程共重复2次。

2.溶解细胞：

向1份重量的由此洗涤的湿细胞中加入9份重量已用冰冷却的Buffer 1(100mM Tris-HCl(pH7.5)，0.5mg/ml溶菌酶，20μg/ml DNase I，1mM EDTA，2mM苯基甲烷磺酰基氟化物(PMSF)，使细胞悬于缓冲液中。在冰上将所得的悬浮液搅拌1到3小时，由此使细胞溶解。

3.制备孢子：

溶解后，于4℃，以20,000g将所得溶液离心30分钟。测量各离心上清液和将离心的沉淀悬于Buffer 2(100mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA)而制备的悬浮液的TG活性。结果，在沉淀悬浮液中检测到TG活性。用显微镜观察沉淀悬浮液，结果表明悬浮液含细菌孢子和溶解的细胞碎片残留物。

将已检测了TG活性的沉淀悬浮液搅拌30分钟，同时用冰冷却，接着，以20,000×g将其离心30分钟，然后测量各离心的上清液和将离心的沉淀悬于Buffer 2中而制备的悬浮液的TG活性。结果，在沉淀悬浮液中检测到TG活性。

用Buffer 2进行这种悬浮、搅拌和离心步骤是为了洗涤孢子。将所述的孢子洗涤共重复4次。在此过程中，总能在沉淀部分检测到TG活性。将孢子共洗涤4次后，用显微镜观察已检测了TG活性之沉淀部分的最后的悬浮液，结果表明，悬浮液几乎不含有细胞碎片残留物，而只含有细菌孢子。显微镜观察还表明没有萌发的孢子。

4.溶解TG：

洗涤后，将孢子离心并收集沉淀部分，然后将其悬于已预先加热到37℃的Buffer 3(0.1M Na₂CO₃，1mM EDTA，50mM DTT，pH10.0)中。将所得悬浮液的pH调整到10.0，然后于37℃将悬浮液搅拌30分钟。接着将其以20,000xg离心30分钟，检测各离心上清液和将离心沉淀悬于Buffer 3而制备的悬浮液的TG活性。

结果，在离心的上清液检测到TG活性。结果证实溶解了TG。含TG的溶液称为粗TG溶液。

5.在酸性条件下沉淀并除去伴存的蛋白质

通过滤纸过滤粗TG溶液，然后将乙酸加到所得的滤物中以使滤物的pH达5.8。接着在5℃将滤物搅拌1小时。其结果是形成白色沉淀，认为是等电蛋白质沉淀。然后以20,000xg将其离心30分钟，由此从离心上清液中分离沉淀。将沉淀溶于Buffer 3。分别检测离心上清液和沉淀之溶液的TG活性。结果，在离心上清液中检测到TG活性。

6.用(NH₄)₂SO₄沉淀TG

向已检测了其TG活性的离心上清液中加入1/20体积(相对于上清液而言)的1M Tris-HCl(pH7.5)。接着加入(NH₄)₂SO₄，溶解于其中，使终浓度达50％的饱和度。加入NaOH使所得溶液的pH达7.5。接着在冰上将其搅拌2小时，然后以20,000xg离心30分钟。对Buffer 4(25mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM叠氢化钠)渗析由此离心的上清液，同时将离心的沉淀溶于Buffer 4，然后对Buffer 4渗析。通过渗析，完全除去了(NH₄)₂SO₄，分别检测上清液部分和沉淀部分的TG活性。结果，在离心的沉淀部分，或就是说，存在50％-饱和的(NH₄)₂SO₄时形成的沉淀部分中检测到TG活性。

7.疏水层析：

对Buffer 5(50mM Tris-HCl，0.75M MgSO₄，0.02％(w/v)叠氮化钠，pH9.0)渗析已检测了其TG活性的溶液。以20,000xg将所得渗析物离心30分钟以分析上清液。将由此得到的上清液加到已预先用缓中液平衡的疏水层析柱，phenyl Sepharose.HP(由pharmaciaCo生产的)。通过这一步骤，TG被吸附到凝胶上。

用Buffer 5洗掉未吸附到凝胶上的蛋白质(未吸附的蛋白质)。接着用含乙二醇的缓冲液作为洗脱液洗脱吸附的蛋白质。在洗脱中，MgSO₄和乙二醇在缓冲液中的浓度呈线性变化。即，使所用缓冲液中的MgSO₄浓度从0.75M线性变化到0M；而其中乙二醇浓度从0％(v/v)线性变化到10％(v/v)，以便完成洗脱。

分别检测经洗脱而得到的洗脱物部分的TG活性，结果是在约150到200mM的MgSO₄浓度和约7到8％(v/v)的乙二醇浓度洗脱的洗脱物中观察到TG活性。

8.凝胶渗透：

用超滤装置(centriprep由Amicon Co生产的)浓缩有TG活性的部分，然后对Buffer 6(25mMTris-HCl，150mM NaCl，1％(v/v)乙二醇，0.02％(2/v)叠氮化钠，pH8.0)渗析。以20,000xg将所得的渗析物浓缩10分钟以收集所得的上清液。将由此所得的上清液用于预先用Buffer 6平衡的凝胶渗透柱，Sepharacryl S200HR(由pharmacia Co生产的)。检测各洗脱部分的TG活性。结果，在分子量为约18,000到约22,000左右的部分中检测到TG活性

9.阴离子交换层析：

使用超滤膜浓缩由此所得的TG部分，然后对Buffer 7(25mM哌嗪，1％(v/v)乙二醇，0.02％叠氮化钠，pH10.5)渗析。以20,000xg离心所得的渗析物10分钟，以收集上清液。将由此所得的上清液用于已由Buffer 7平衡的阴离子交换层析柱，Mono-Q(由Pharmacia Co.生产的)。由此，将TG吸附到凝胶上。

用Buffer 7洗掉未吸附的蛋白质。接着用含NaCl的缓冲液作为洗脱液洗脱吸附的蛋白质。使所用缓冲液中的NaCl浓度从0mM线性变化到500mM，以此完成洗脱。检测由洗脱而得到的各洗脱物部分的TG活性，结果表明，在约50mM到150mM的NaCl浓度洗脱的洗脱物中观察到TG活性。

将由此所得的活性部分用于SDS-PAGE，然后用考马斯亮兰染色。由此证实纯化的TG有一个带，估测TG的分子量可能为约28,000到约30,000(见图1)。

确定纯化部分的相对活度有所增加。具体地说，测量上述粗TG溶液的TG活度和纯化之活性部分的TG活性。结果表明：由于经过了系列纯化所以每单位纯化部分蛋白质重的相对TG活性提高到粗溶液的600倍。在本文所用的测量活性的方法中，估计纯化部分的相对TG活性是约2.5×10⁴dpm/mg/30分钟(37℃，pH7.5)。

10.确定TG N-末端周围的氨基酸序列。按如下确定用上述方法纯化之TG N-末端周围的氨基酸序列。

存在SDS的情况下，将约10μg纯化的TG部分(以蛋白质计)经聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将凝胶中的TG转到膜滤纸上。由此，用蛋白质测序仪从其N-末端开始分析TG的氨基酸序列。

具体地说，按使用Milliblot(由Millipore Co.生产)的半干系统(见Protein Structure Analysis，由H.Hirano编写，Tokyo Kagaku Dojin出版)，将所需的酶从经电泳而得的凝胶转录到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。然后用蛋白质测序仪(Model 476A，由ABI Co生产)测定由此转录到PVDF膜上之所需酶的氨基酸序列。

因此，确定从其N-末端开始含35个残基之TG的氨基酸序列。由此确定的转谷氨酰胺酶之N-末端周围的氨基酸序列示于序列表中的Sequence Number 1。

实施例2：确定TG的pH和温度范围

用下列方法测量TG酶活性依赖pH的变化由此确定TG适宜的pH范围。

至于用于酶促反应的缓冲液，可使用甲酸钠缓冲液(pH：2.0，3.0，3.5，4.0)，乙酸钠缓冲液(pH：4.5，5.0，5.5，6.0)，Tris-HCl缓冲液(pH：7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)和Na₂CO₃缓冲液(pH：9.0，9.5，10.5，12.0)。

为了测量TG活性，可用使用¹⁴C-标记的腐胺和二甲基酪蛋白为底物的上述方法。分别将缓冲液以50mM的浓度加到反应系统中。至于酶源，可使用预先制备的浓度为2μg/ml的纯TG部分。反应在37℃进行30分钟。

根据各反应系统的pH值范围，确定酶活性的相对值。在pH为8.2(用pH为8.5的Tris-HCl为缓冲液时)时，反应系统有最高的TG活性，将其作为标准：100。结果示于图2。

已发现本发明TG适宜的pH范围是约7到约9，严格地说是从约7.7到约8.8(见图2)。另一方面，由新墨西哥州立大学小组报告的枯草芽孢杆菌衍生的TG的适宜pH值范围是9.5或更高。因此，由他们报道的TG与本发明杆菌衍生的TG有明显的不同。

按下述方法测量TG酶活性方面的温度依赖性改变，由此确定TG适宜的温度范围。

为了测量TG活性，可使用上述介绍用¹⁴C-标记的腐胺和二甲基酪蛋白为底物的方法。具体地说，用0.1MTris-HCl将反应系统的pH调整到7.5，至于酶源，将浓度为2μg/ml预先制备的纯TG部分加到反应系统中。在温度为25℃到80℃的水浴中使反应系统反应30分钟。

根据反应温度的变化测量酶活性的相对值。在60℃，反应系统有最大的TG活性，将此定为100。结果示于图3。

已发现本发明TG的适宜温度范围在约40℃到约65℃，更严格地说，在约50℃到约62℃(见图3)。

实施例3：确定TG的温度稳定性

按下述方法确定本发明TG的温度稳定性。

在10℃到80℃的变化温度水浴内，使预先制备的纯TG部分反应10分钟。此后，按与实施例2中相同的方法测量各系统的TG活性。根据反应温度的变化确定酶活性的相对值。将反应系统的最高TG活性定为100。结果示于图4。

已发现本发明的TG在不高于约60℃的温度内，均是稳定的(见图4)。

实施例4：用TG交联蛋白质

按下述方法确定本发明TG的蛋白质——交联活性。

制备含终浓度为1mg/ml α-酪蛋白，0.1MTris-HCl(pH7.5)，5mM DTT和5mM叠氮化钠的反应系统。

本文所用的α-酪蛋白是由Sigma Co.生产的市售产品。向该系统加入终浓度为440μg/ml预先制备的纯TG部分。

在37℃水浴，将该反应系统反应18小时。使由此反应的系统进行SDS-PAGE，结果除底物α-酪蛋白的带外，在更高聚合物一侧还有一个带。这表明了α酪蛋白的交联聚合。结果示于图5。

这些结果证实了本发明TG的蛋白质-交联活性(见图5)

当用本发明TG对牛血清白蛋白(BSA)反应时，也会得到与上述相同的结果。即，本发明TG也会使底物蛋白BSA交联。

实施例5：各种试剂对TG活性的影响

检测，如果有，各种试剂对TG活性的影响。本发明检测的试剂是N-乙基马来酰胺(NEM)，胱胺，苯基甲烷磺酰基氟化物(PMSF)，(NH₄)₂SO₄，Na₂SO₄，EDTA，EGTA，CaCl₂，DTT和2-巯基乙醇(2-ME)。所有试剂均购自Nacalai Tesque，Inc.Co.。

至于酶源，用浓度为2μg/ml预先制备的纯TG部分。用蛋白质检测盒(由Bio Rad Co.生产)测量蛋白质浓度。

为了检测TG活性，可以使用上述以¹⁴C-标记的腐胺和二甲基酪蛋白为底物(pH7.5，37℃)的方法。至于酶源，用浓度为2μg/ml预制的纯TG部分。于37℃反应30分钟。

用下列方法检测TG活性。将上述纯TG部分与各种已调至适宜浓度的试剂混合，然后在冰上放30分钟。将与各试剂反应的酶源溶液调至浓度为2μg/ml，然后与底物反应，检测在所得反应系统中仍有的TG活性(pH7.5，37℃)。

以未与任一种试剂反应的TG部分的TG活性为100(对照)，与各试剂反应的反应系统中保留的TG活性记为对照的相对值。结果示于下文表1。

本发明TG的TG活性受NEM的抑制，而不受还原剂DTT和2-ME的抑制，相反某些程度上可提高其活性。这些结果说明Cys残基可能参与了TG活性的表达。

本发明TG不受DTT的抑制，而已知由新墨西哥州立大学小组报告的枯草芽孢杆菌衍生的TG会受DTT的抑制。即两种TG有明显不同的特性。

此外，本发明TG不为Na₂SO₄抑制，但受(NH₄)₂SO₄和胱胺的抑制。因此，说明本发明TG的特征在于在含有一些胺的反应系统中，其活性受到抑制。

另外，螯合剂EGTA和EDTA不抑制本发明的TG。从其该特性来看，本发明的TG不同于由新墨西哥州立大学小组报道的TG。换句话说，应该说本发明的TG没有需要金属离子如Ca²⁺，等的特性。本文用于检测TG活性的含本发明TG的反应系统不含Ca²⁺，而且本发明TG在这些无Ca²⁺的反应系统，中有TG活性。从这些结果看，可以得出结论：本发明的TG是不依赖Ca²⁺的。

此外，在存在低于5mMCa²⁺的条件下，本发明TG仍有不少于50％的TG活性。因此，本发明的TG不同于由新墨西哥州立大学小组报道的TG，即已知后者会在很大程度上为5mM或更高浓度的Ca²⁺所抑制(见表1)。

实施例6：

纯化来自枯草孢杆菌AJ12866菌株的TG，并检测其特性。

于37℃在Schaeffer培养基中通过振荡培养16小时而培养枯草芽孢杆菌AJ12866的细胞。将3ml培养物加到30ml另-Schaeffer培养基中，并于37℃再培养12小时。所用的Schaeffer培养基含有8g/l的Bacto营养液，1g/l KCl，0.12g/l MgSO₄·7H₂O)，1mM CaCl₂，10μM MnCl₂和1μM FeSO₄pH7.0。

将培养物以10,000xg离心20分钟以分离沉淀和上清液。

用玻璃珠磨碎沉淀。分别检测培养物上清液、培养物沉淀和磨碎的沉淀物液体(细胞碎片液)TG活性。如下为本文用于检测酶活性的方法。将含10μl待测酶样品的50ul反应系统(100mM Tris-HCl，pH7.5，6.3mg/ml二甲基酪蛋白，10nM¹⁴C-腐胺，1.2μCi)在37℃保持30分钟，由此使底物反应。反应后，将40μl反应混合物吸附到滤纸上。在反应混合物中，由于其中TG的催化作用，腐胺将与二甲基酪蛋白反应。将腐胺和二甲基酪蛋白结合的反应产物吸附到滤纸上。通过向其中加入10％TCA，将结合的反应产物固定到滤纸上。然后用5％TCA溶液将滤纸洗涤3次，再用液体闪烁计数器计数固定到滤纸上的¹⁴C放射性。由此测量的值相当于酶样品的相对TG活性。所得的结果示于下文表2。

这些结果表明作为含细菌孢子部分的磨碎的沉淀物液体具有高于其他样品的TG活性。

实施例7：确定诱导杆菌衍生的TG的阶段

按与实施例6相同的方法，培养枯草芽孢杆菌AJ12866的细胞，以给定的间隔测量取样的细胞碎片悬浮液的TG活性。为了制备细胞碎片悬液并测量TG活性，涉及到实施例1和实施例6的方法。用培养物的浊度代表被培养的枯草芽孢杆菌AJ12866细胞的生长程度。为了确定培养物的浊度，将波长为610nm的射线用于培养物，然后测量射线的吸收值。所得的结果示于图6。从这些结果了解列在细胞生长达到稳定阶段并细胞开始形成其孢子(开始培养后约4小时)后，培养物的TG活性开始增加。

实施例8：纯化杆菌衍生的TG

使用按实施例7中的方法培养的细胞，完成下列实验。

将枯草芽孢杆菌AJ12866菌株的细胞悬于反应系统(0.5mg/ml溶菌酶，20μg/ml DNase I， 0.1M Tris-HCl(pH7.5)，2mM DTT，1mM EDTA，2mMPMSF)中，然后在冰上反应2小时以使细胞溶解。以20,000xg将反应混合物离心20分钟，将所得的沉淀部分悬于洗涤系统(0.1M Tris-HCl，(pH7.5)，1mMEDTA，2mM PMSF)。将所得的悬液离心，收集沉淀物。将该操作过程共重复2次。

将所得沉淀部分悬于缓冲液(0.1M Na₂CO₃(pH10)，1mM EDTA，2mM PMSF)中，在37℃放30分钟。同时存在于沉淀物部分的部分物质溶于缓冲液中，TG活性转移到可溶部分中。将其离心，所得的上清液有TG活性。加入乙酸，将上清液的pH调到6.0。将其称为粗酶液。超滤离心粗酶液，然后对缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1M NaCl)渗析，从而交换缓中液。将所得粗酶液进行凝胶渗透，收集洗脱的TG活性部分。确定该部分的酶学特性。

结果说明了下列事实，为了确定这些特性，涉及实施例1到5的方法。

(1)TG适宜的pH范围是约7到约9(见图7)。(2)TG适宜的温度范围是约40℃到约65℃(见图8)。(3)有关其温度稳定性，TG在约60℃或以下是稳定的(见图9)。(4)胱胺，NEM和(NH₄)₂SO₄很大程度上抑制TG(见图10和表3)。(5)DTT不抑制TG活性，相反，存在1mM DTT时，其活性提高1.5倍或更高(见图11。(6)EDTA对TG活性几乎没有影响(见图12)。(7)5mM或更高浓度的Ca²⁺不抑制TG活性。TG活性的表达不需要存在Ca²⁺。换句话说，TG不依赖Ca²⁺(见图13)。(8)TG的分子量为(a)约18,000到约22,000(由凝胶渗透测量的)和(b)约28,000到约30,000(由SDS-PAGE测量的)。

另外，确定了TG N末端附近的氨基酸序列，即，从其N-末端开始的35中残基的氨基酸序列。结果表明，本文所得的TG与以前所得的枯草芽孢杆菌AJ1307衍生的TG有高度的同源性。具体地说，两种TG的氨基酸序列彼此仅在第22个氨基酸残基有所不同。AJ1307衍生的TG在第22位氨基酸残基是Asn，而AJ12866衍生的TG在第22倍的氨基酸残基是Asp。

上述实验的结果表明得自枯草芽孢杆菌AJ12866的TG与上述枯草芽孢杆菌AJ1307衍生的TG有相同特性。

实施例9.蛋白质与本发明TG的胶化

将实施例8中经凝胶渗透所得的TG活性组分与10％酪氨酸溶液(25mM Tris-HCl(pH7.5)，5mMDTT)以1∶9的比例混合，然后于37℃反应24小时。反应后，使溶液胶化。

将实施例1中所得的纯TG以2单位/g蛋白质的浓度加到7％明胶溶液中，于35℃反应2小时。反应后，使明胶蛋白质溶液胶化。

实施例10.分离杆菌衍生的TG基因

(1)纯化TG并确定其N-末端氨基酸序列

检测实施例1中所确定的杆菌衍生的TG部分氨基酸序列(对应于序列表中的Sequence Number 1)是否与已知肽的任何氨基酸序列同源。然而，发现与GenBank(LASL-GDB)，SWISS-PROT和NBRF(PIR)中登记的任何氨基酸序列均没有同源性。

TG的氨基酸序列是在普通密码子基础上反转译的，从中推测编码氨基酸序列的碱基序列。因此，检测所述碱基序列是否与任何已知核酸的碱基序列同源。

结果表明前者与登记于GeneBank(LASL-GDB)一种碱基序列有高度同源性。本文发现的与本发明TG的碱基序列同源的碱基序列登记号为L29189，其来源是D.W.Hanlon & G.W.Ordal，(J.Biol.，Chem，Vol269，PP.14038-14046(1994))。该参考文献公开了位于上游侧区的编码枯草芽孢杆菌跨膜受体的基因碱基序列，其中公开的，而且本文发现与本文TG的碱基序列同源的碱基序列。具体地说，发现本发明TG的碱基序列在第1到第68个碱基残基上与所公开的碱基序列同源。由68个碱基对组成的后一种碱基序列位于枯草芽孢杆菌mcpB基因的5’上游位点，而且其转录方向与mcpB基因的相反。由68个碱基对组成的序列编码的肽之功能与由D.W.Hanlon & G.W.Ordal(J.Biol Chem Vol 269，pp14038-14046(1994)公开的无关。

本发明人推测由68个碱基对组成的序列可能是编码本发明杆菌衍生的TG之基因的部分，然后分离全长基因。

(2)收集细胞：

在下述条件下培养枯草芽孢菌株AJ1307的细胞。用Schaeffer培养基，于37℃完成振荡培养。首先，在20ml Schaeffer培养基中过夜培养AJ1307菌株的细胞以进行接种培养，最后在100ml另一Schaeffer培养基中培养含接种细胞的5ml培养物。

(3)从细胞中分离染色体DNA。

在上述条件下，细胞达到对数生长后期后，将100ml培养物离心(12,000xg，4℃，15分钟)，收集细胞。将细胞悬于10ml 50∶20TE(50mM Tris-HCl，pH8.0，20mM EDTA)中，洗涤，再离心收集细胞。然后再将细胞悬于10ml 50∶20TE中。将0.5ml 20mg/ml的溶菌酶溶液和1ml 10％SDS溶液加到所得悬浮液中，其中于55℃将细胞培养20分钟。培养后，将与悬浮液相同体积的10∶1TE的酚加到悬浮液中，由此使悬浮液去蛋白质。将与水层相同体积的2-丙醇加到所得的水层中，以此沉淀DNA并收集。将所得DNA沉淀物溶于0.5ml 50∶20TE，然后加入5μl 10mg/ml RNase和5μl10mg/ml蛋白酶K，于55℃反应2小时。反应后，将与溶液相同体积的10∶1TE饱和的酚加到溶液中，从而使溶液去蛋白质。向所分离的水层加入与该层体积相同的24∶1氯仿/异戊醇，然后搅拌，接着收集水层。将该过程共重复2次。向最后所得的水层中加入终浓度为0.4M的3M乙酸钠溶液(pH5.2)和2倍该层体积的乙醇。收集沉淀的DNA，用70％乙醇洗涤，干燥，然后溶于1ml 10∶1TE中。

(4)经PCR制备DNA片段：

为了分离并扩增含编码杆菌衍生的TG之基因的DNA分子，可使用TakaRa LA PCR体外克隆盒(Takara shuzo Co生产)。下文除非特别说明，将按该盒所附说明书的说明完成下列实验。

同限制酶Hind III消化前面步骤(3)所制备的5μg染色体DNA。接着由乙醇沉淀收集与Hind III盒相连的DNA片段。再使其经乙醇沉淀，然后用引物C1和引物S1使收集的DNA进行第一次PCR。所用引物C1的碱基序列对应于序列表中的sequence Number 3，引物S1对应其中的Sequence Number 4。在所用的TaKaRa LAPCR体外克隆盒中含有引物C1，其碱基序列在Hind III盒的碱基序列内。引物S1的碱基序列与上述编码枯草芽孢杆菌跨膜受体的基因的碱基序列中的第566 G到第600A的区域互补。

用Gene Amp PCR System 9600(由Perkin ElmerCo.生产)在下述条件下共进行30个循环的PCR反应。

一个循环：

98℃20秒，

68℃3分

接着将反应混合物稀释到1/100，向其中加入引物C2和引物S2，进行第2次PCR。第2次PCR的条件与第1次PCR的相同。引物C2和S2的碱基序列分别对应序列表中的Sequence Number 5和Sequeuce Num-ber 6。在所用的TaKaRa LA PCR体外克隆盒中含有引物C2，其碱基序列在Hind III盒的碱基序列内。引物S2的碱基序列与上述编码枯草芽孢杆菌跨膜受体之基因碱基序列中的第34T到第68T的区域互补。

反应后，使3μl反应混合物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，证实扩增了约2kb的DNA片段。

5)用puc18克隆PCR扩增的DNA片段：

将约2kb PCR扩增的DNA片段通过与puc18相连而克隆。用Sure Clone Ligation盒(由Pharmacia Co.生产)完成克隆。下文除非特别说明，按该盒所附说明书的说明完成下列实验。对400ng约2kb的扩增的DNA片段进行加工以使其两个末端成为平端，然后将其磷酸化。磷酸化后，纯化DNA片段，再与已用SmaI消化的pUC18相连。用含所连之DNA片段的反应液，用DNA转化E.coli细胞。

从所得的转化细胞中筛选用含约2kb DNA片段的pUC18按需转化的JM109转化体。至于筛选，涉及在Molecular Cloning(2nd Edition，Cold Spring HarborPress(1989))中描述的筛选方法。

(6)确定该基因的DNA序列：

按Molecular Cloning(2no1 Edition，Cold SpringHarbor Press(1989))中描述的方法制备所筛选转化的质粒，由此确定其中约2kb扩增的DNA片段的碱基序列。用Dye Terminator Cycle Sequencing盒(由ABICo.生产)并按该盒所附说明书说明的方法进行测序。用DNA Sequencer373(由ABI CO.生产)进行电泳。

测序的结果表明PCR扩增的DNA片段含有序列表中Sequencer Number 2第118A到第1042T的碱基序列区域。至于Sequence Number 2的碱基序列，从第118A到852C的区域是开放阅读框架，ORF编码之多肽的氨基酸序列可在普通密码子的基础上推测出。所研究的氨基酸序列与Sequence Number 2的碱基序列一起示于下文。

对于氨基酸序列来说，从其N-末端到第35个氨基酸残基的区域与前面步骤(I)中涉及的由35个氨基酸残基组成的氨基酸序列完全相同。由此可以得出结论：PCR扩增的DNA片段是所需杆菌衍生的TG基因。

可以得出结论：Sequence Number 2碱基序列与D.W.Hanlon & G.W.Ordal(J.Biol Chem.，Vol.269pp14038-14046(1994)公开的碱基序列间的差异应归因于它们所用菌株之间的不同。

将含有杆菌衍生的TG基因的质粒称为pBSTG75-11，其中所述的TG基因以pUC18衍生的lac启动子作用于该基因的方向插入。

实施例11.从染色体DNA文库克隆杆菌衍生的TG基因

(1)染色体NA文库的形成

用Hind III完全消化实施例10中制备的1μg染色体DNA。经乙醇沉淀回收DNA，然后溶于10μl 10∶1TE中。将5μl所得溶液与已用Hind III消化的1ng pUC118(由Takara Shuzo Co.生产)混合，用BAP去磷酸化，再用DNA Ligation.Kit Ver 2(由Takara Shuzo 生产)将所述DNA与pUC118相连。将100μl E.coli JM109菌株的感受态细胞(由Takara Shuzo Co生产)与3μl所连接的反应混合物混合，用所述DNA转化E coli TM 109菌株。在转化体细胞上包被一层适宜的固体培养基以制备染色体DNA文库。

(2)探针的形成：

至于探针，所用的是实施例1中得到的全长TG基因。用pBSTG75-11为模板，用引物S2和引物S3进行PCR。用TaKaRa LA PCR盒Ver.2进行PCR。

制备100μl含10ng模板pBSTG75-11，20pmol引物S2和20pmol引物S3的反应系统，然后反应。引物S3是与TG基因(Sequence Number 2)第818碱基到852碱基的区域互补的35单体，其碱基序列对应于序列表中的Sequence Number 7。在下列条件下共进行30个循环的PCR。

一个循环：

94℃30秒

55℃30秒

72℃1分

用1％琼脂糖凝胶(Seaplaque GTG，由FMC CO生产)电泳分离用上述反应扩增的DNA片段。切出所需的带，用Easy Prep System(由Phamacia z Co.生产)和PCR Products Prep盒(由Pharnacia Co.生产)从中纯化DNA。因此最后得到200μl DNA(4ng/μl)溶液。

用³²P标记DNA片段，然后作为探针。用RandomPrimer DNA Labeling Kit Ver.2(Takara Shuzo Co.生产)，按该盒所附说明书说明的方法用(α-³²P)dCTP(3000Ci/mmol)(Amersham Co.生产)标记探针。

(3)菌落杂交

在下文涉及在Molecular Cloning (2nd Edition，Cold Spring Harbor Press(1989))中描述的菌落杂交的一个实例。

将染色体DNA文库的菌落转移到尼龙滤膜或(Hybond-N，Amersham Co.生产)上，然后碱变性，中和并固定。用Rapid-Hyb Buffer(Amersham Co.生产)完成杂交。具体地说，将滤膜浸在缓冲液中，在65℃预杂交4小时。此后，将上述步骤(2)中制备的标记探针加到缓冲液中，于65℃杂交2小时。接着用含0.1％SDS的2×SSC，在室温将滤膜洗涤20分钟。此外，用含0.1％SDS的0.1×SSC，在65℃经15分钟洗2次。

该步骤的结果表明：产生了5个与探针杂交的菌落。

(4)确定TG基因的DNA序列

按与实施例5中相同的方法，确定已插入pUC118中之DNA片段的碱基序列。测序的结果表明：该DNA有序列表中Sequence Number 2的碱基序列。

实施例12：在大肠杆菌中表达杆菌衍生的TG基因：

(1)含有重组TG基因之E.coli细胞的培养和细胞中重组TG基因的表达的诱导：

在实施例10中得到的质粒pBSTG75-11含有编码杆菌衍生的TG的DNA和编码lacZ蛋白质的DNA，前种DNA连在后一种DNA的下游位点。从其碱基序列，推测所设计的质粒能表达融合蛋白，所述融合蛋白含有具有序列表中Sequence Number 8之氨基酸序列的肽，该肽由11个氨基酸组成，并已加到杆菌衍生的TG中，位于TG序列开头的Met残基之前。

在该试验中，所用的是用pBSTG75-11转化的E.coli JM109的实验细胞和用pUC18转化的E.coliJM109的对照细胞，将实验细胞和对照细胞分别于37℃在含100mg/ml氨苄青毒素的LB培养基中进行振荡培养。具体地说，将细胞植入30ml培养基中，振荡培养过夜以制备接种培养物。另一方面，制备4个各含30ml新鲜培养基的烧瓶。以5％的细胞浓度，将用pBSTG75-11转化的E.coli JM109实验细胞的接种培养物植入2个烧瓶中。两个烧瓶分别称为实验组1和实验组2。另一方面，以5％的细胞浓度，将用pUC 18转化的E.coliJM109对照细胞的接种培养物植入另两个烧瓶。两个烧瓶分别称为实验组3和实验组4。培养各组细胞。在610nm的吸收值达到约0.7后，以1mM的终浓度只向实验组1和实验组3中加入IPTG。4小时后，终止各组细胞的培养。

(2)确定诱导和表达的蛋白质：

终止培养后，用显微镜观察各培养物中的细胞。结果表明：只有用pBSTG25-11转化的，并已向其中加入了IPTG的JM109细胞含有蛋白质包含体。

终止培养后，将各10ml培养物离心(以12,000xg，15分钟)以收集细胞。将细胞悬于2ml 10mMTris-HCl(pH7.5)中，洗涤，然后再离心以收集细胞。将细胞悬于1ml相同的缓冲液中，用Mini-beadBeater(Nakenyaku Co生产)通过与0.1mm Zirconia珠一起，将所得悬浮液振荡3分钟而破碎。将所破碎的悬浮液进行SDS-PAGE，然后用CBB染色.结果表明：实验组1的悬浮液(用pBSTG75-11转化的并由IPTG诱导的JM109细胞)有约29,000到约30,000的带。从所鉴定的分子量，推测实验组1的细胞表达了预期的融合蛋白。

(3)确定TG活性

测量所表达蛋白质的TG活性。具体地说，将10μl含破碎细胞的预制的悬浮液加到含二甲基酪蛋白和¹⁴C-标记的腐胺的反应系统中，然后反应。反应后，将反应混合物吸附到滤纸上，用液体闪烁计数器测量滤纸上二甲基酪蛋白结合的腐胺量。结果示于下文表4。这些结果证实用pBSTG75-11转化的并由IPTG诱导的JM109细胞实验组1中)有TG活性。

用pBSTG75-11转化的E.coli KM109菌株称为E.coli AJ13172，根据布达佩斯条约，已于1995年12月20日保藏在Bioengineering laboratory的国际保藏中心。国际保藏是FERM BP-5446。

现已证明其有序列表中Sequence Number 2碱基序列的DNA编码有TG活性的酶。即，已清楚，该DNA有杆菌衍生的TG基因。另外，还证明，即使将编码不同肽的其他DNA加到该DNA中，所得的结合DNA也能表达杆菌衍生的TG基因，而且由结合DNA表达的融合蛋白也有TG活性。此外，已明确可以E.coli的所需转化细胞，在细胞内表达蛋白质包含体形式的融合蛋白，而且所述蛋白质的表达可以由适宜的启动子控制。

本发明的优点：

根据本发明，可以从食品工业中可用的微生物、杆菌，例如枯草芽孢杆菌等得到此前未知的新TG。

本发明新TG的优点在于(1)与任何其它动物衍生的TG不同，它不需钙，因此其使用不受限制，而且可以以低成本生产，和(2)生产本发明TG的杆菌比放线菌生长快，因此可以以比放线菌衍生的TG低的成本生产杆菌衍生的TG。

本发明TG不同于由新墨西哥州立大学报告的TG，在于(1)前者的活性不受5mM或更高浓度Ca²⁺的抑制，(2)前者的适宜pH范围在中性到弱碱性之间，(3)前者不由DTT抑制，(4)前者不受螯合剂如EGTA等的抑制，(5)前者只由在孢子形成阶段的杆菌生产。

由于可以用本发明TG生产交联的聚合物，因此可用其工业上生产各种食品。

另外，由于本发明TG得自特别用于生产食品的杆菌，因此在食品工业中有很高的.实际.价值。

序列表

Sequence Number：1

序列长度：35

序列类型：氨基酸

拓朴结构：线性

序列类型：肽

来源

生物名称：枯草芽孢杆菌

菌株名称：AJ1307

序列：

Met Ile Ile Val Ser Gly Gln Leu Leu Arg Pro Gln Asp Ile Glu Asn

1 5 10 15

Trp Gln Ile Asp Gln Asn Leu Asn Pro Leu Leu Lys Glu Met Ile Glu

20 25 30

Thr Pro Val

35

Sequence Number：2

序列长度：1042

序列类型：核酸

链数：2条(双链)

拓扑结构：线性

序列类型：基因组DNA

来源：

生物名称：枯草芽孢杆菌

菌株名称：AJ1307

序列：

CTGCTTAAAA AGTTTTAAAA TAAAAAATGG AAGAAGTTTT TTTTGGCAGT CTTCTGTCTT 60

TTTAGCTTTC ATTGCCCAAG CTCTTTGCAT ATCTTATATA AACAAGGGGG GCTAAAC 117

ATG ATT ATT GTA TCA GGA CAA TTG CTC CGT CCC CAG GAT ATT GAA AAT 165

Met Ile Ile Val Ser Gly Gln Leu Leu Arg Pro Gln Asp Ile Glu Asn

1 5 10 15

TGG CAG ATT GAT CAA AAT CTG AAT CCG CTG TTA AAA GAG ATG ATT GAG 213

Trp Gln Ile Asp Gln Asn Lau Asn Pro Leu Leu Lys Glu Met Ile Glu

20 25 30

ACG CCT GTT CAG TTT GAT TAT CAT TCA ATT GCT GAA CTG ATG TTT GAG 261

Thr Pro Val Gln Phe Asp Tyr His Ser Ile Ale Glu Leu Met Phe Glu

35 40 45

CTT AAA CTG CGG ATG AAT ATT GTA GCA GCG GCA AAG ACG CTG CAC AAA 309

Leu Lys Leu Arg Met Asn Ile Val Ala Ala Ala Lys Thr Leu His Lys

50 55 60

AGC GGG GCG AAG TTT GCC ACT TTT TTA AAA ACA TAC GGG AAT ACA ACG 357

Ser Gly Ala Lys Phe Ala Thr Phe Leu Lys Thr Tyr Gly Asn Thr Thr

65 70 75 80

TAT GGA GGG GTT TCA CCG GAG GGC GCC TTG GAG CTG AAA TAC AGA ATG 405

Tyr Trp Arg Val Ser Pro Glu Gly Ala Leu Glu Leu Lys Tyr Arg Met

85 90 95

CCG CCT TCA AAA GCG ATT CGG GAC ATT GCA GAG AAC GGC CCG TTT TAT 453

Pro Pro Ser Lys Ala Ile Arg Asp Ile Ala Glu Asn Gly Pro Phe Tyr

100 105 110

GCG TTT GAA TGC GCA ACC GCA ATC GTT ATC ATT TAT TAC TTG GCC TTA 501

Ala Phe Glu Cys Ala Thr Ala Ile Val Ile Ile Tyr Tyr Leu Ala Leu

115 120 125

ATC GAT ACA ATC GGT GAA GAT AAA TTC AAT GCC AGC TTT GAC AGA ATT 549

Ile Asp Thr Ile Gly Glu Asp Lys Phe Asn Ala Ser Phe Asp Arg Ile

130 l35 140

ATT TTA TAT GAC TGG CAT TAT GAG AAA TTG CCG ATC TAT ACG GAA ACA 597

Ile Leu Tyr Asp Trp His Tyr Glu Lys Leu Pro Ile Tyr Thr Glu Thr

145 150 l55 160

GGA CAC CAC TTT TTC CTT GGA GAT TGT TTG TAT TTT AAG AAT CCT GAA 645

Gly His His Phe Phe Leu Gly Asp Cys Leu Tyr Phe Lys Asn Pro Glu

165 170 175

TTT GAT CCG CAA AAG GCG CAA TGG AGA GGC GAA AAT GTG ATT TTA CTG 693

Phe Asp Pro Gln Lys Ala Gln Trp Arg Gly Glu Asn Val Ile Leu Leu

180 185 190

GGG GAA GAT AAA TAT TTT GCC CAT GGT CTT GGA ATC TTA AAC GGA AAG 741

Gly Glu Asp Lys Tyr Phe Ala His Gly Leu Gly Ile Leu Asn Gly Lys

195 200 205

CAA ATT ATA GAT AAG CTG AAT TCT TTT AGG AAA AAA GGA GCC TTA CAG 789

Gln Ile Ile Asp Lys Leu Asn Ser Phe Arg Lys Lys Gly Ala Leu Gln

210 215 220

TCA GCC TAC CTT CTG TCT CAG GCG ACC AGA CTG GAT GTT CCG TCT CTT 637

Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Gln Ala Thr Arg Leu Asp Val Pro Ser Leu

225 230 235 240

TTC CGC ATC GTC CGC TAAAAAGCCC CATCGCCTAT TTTCGGGACG ATGGGGTTTC 892

Phe Arg Ile Val Arg

245

AAATGCCTTT CGTTTTCGAT AGAAGGGGGC TGTGCCGAAA TATTGGTTCG CAGCCCACTC 952

CATTTTTTCA AGGTCATTTC TTGTCACGAT TGGATCCTGG CTGCTCCATT TGATAAAAGCG 1012

GACAAAATAG TAGCCTTTGA TAGGAACCAT 1042

Sequence Number：3

序列长度：35

序列类型：核酸

链数：一条(单链)

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

PCR的引物C1

序列：

GTACATATTG TCGTTAGAAC GCGTAATACG ACTCA(35)

Sequence Number：4

序列长度：35

序列类型：核酸

链数：1条(单链)

拓朴结构：线性

序列类型：合成DNA

PCR的引物S1

序列

TGGCGCTTGT ACATAAGTGC CGTTATCTGC GCCCC(35)

Sequence Number：5

序列长度：35

序列类型：核酸

链型：1条(单链)

拓朴结构：线性

序列类型：合成DNA

PCR引物C2

序列：

CGTTAGAACG CGTAATACGA CTCACTATAG GGAGA(35)

Sequence Number：6

序列长度：35

序列类型：核酸

链数：1条(单链)

拓朴结构：

序列类型：合成DNA

PCR的引物S2

序列

ATGATTATTG TATCAGGACA ATTGCTCCGT CCCCA(35)

Sequence Number：7

序列长度：35

序列类型：核酸

链型：1条(单链)

拓朴结构：

序列类型：合成DNA

PCR引物s3

序列：

GCGGACGATG CGGAAAAGAG ACGGAACATC CAGTC(35)

Sequence Number：8

序列长度：11

序列类型：氨基酸

链数：1条(单链)

拓朴结构：线性

序列类型：肽

来源

生物名称：E.Coli序列

Met(1) Thr Met Ile Thr (5) Asn Ser Ser Ser Val (10) Pro

附图简要说明

[图1]表示纯TG-1的SDS-PAGE结果。

[图2]表示与TG-1活性有关的pH曲线。

[图3]表示与TG-1活性有关的温度曲线。

[图4]表示TG-1的温度稳定性。

[图5]表示与TG-1交联的α-酪蛋白。

[图6]表示TG-生产细胞的生长与生产的TG-2活性间的关系。

[图7]表示与TG-2活性有关的pH曲线。

[图8]表示与TG-2活性有关的温度曲线。

[图9]表示TG-2的温度稳定性。

[图10]表示抑制对TG-2的影响。

[图11]表示DTT对TG-2的影响。

[图12]表示EDTA对TG-2的影响。

[图13]表示Ca²⁺对TG-2的影响。

表1.各试剂对TG活性的影响

试剂	浓度	剩余的活性(相对值)
试剂	浓度	剩余的活性(相对值)	-	-	1.0
NEM	1mM	17	-	-	1.0
NEM	1mM	17	胱胺	2mM	0
PMSF	5mM	89	胱胺	2mM	0
PMSF	5mM	89	(NH₄)₂SO₄	10mM	1
Na₂SO₄	10mM	87	(NH₄)₂SO₄	10mM	1
Na₂SO₄	10mM	87	EDTA	10mM	107
EGTA	10mM	98	EDTA	10mM	107
EGTA	10mM	98	CaCl₂	5mM	65
DTT	10mM	119	CaCl₂	5mM	65
DTT	10mM	119	2-ME	10mM	111

表2

相对活性
相对活性	培养物上清液 280
培养物沉淀 510	培养物上清液 280
培养物沉淀 510	磨碎的沉淀液 10200

表3.各试剂对TG活性的影响

试剂	浓度	剩余的活性相对值
试剂	浓度	剩余的活性相对值	-	-	100
PMSF	5mM	95	-	-	100
PMSF	5mM	95	(NH₄)₂SO₄	10mM	3
Na₂SO₄	10mM	85	(NH₄)₂SO₄	10mM	3
Na₂SO₄	10mM	85	EGTA	10mM	94
2-ME	10mM	122	EGTA	10mM	94

表4.各转化体的TG活性

所含的质粒	用IPTG诱导	TG活性(dpm)
所含的质粒	用IPTG诱导	TG活性(dpm)	pBSTG75-11实验组1	+	496
pBSTG75-11实验组2	-	0	pBSTG75-11实验组1	+	496
pBSTG75-11实验组2	-	0	pUC18实验组3	+	0
pUC18实验组4	-	0	pUC18实验组3	+	0

Claims

1.杆菌衍生的转谷氨酰胺酶，其特征在于

(1)其适宜的pH在约7和9之间；

(2)其适宜的温度在约40℃和65℃之间；

(3)其在约60℃或60℃以下是稳定的，

(4)其不依赖Ca²⁺，且于5mMCa²⁺存在的条件下，有50％或更多的活性，

5)其可以由NEM，胱胺和(NH₄)₂SO₄中的任一种物质抑制，

6)EDTA，DTT和2-ME中的任一种物质对其均未有抑制，

7)其分子量为(a)约18,000到约22,000(经凝胶渗透而测量的)和(b)约28,000到约30,000(经SDS-PAGE测量的)，和

8)它催化肽链中谷氨酰胺残基上γ-羧基酰胺的转酰基作用。

2.根据权利要求1的杆菌-衍生的转谷氨酰胺酶，它具有序列表中Sequence Number 1的氨基酸序列。

3.根据权利要求1的转谷氨酰胺酶，其中所述杆菌是枯草芽孢杆菌。

4.生产具有交联结构的蛋白质，非蛋白质氨基酸聚合物，肽或其衍生物的方法，其特征在于通过权利要求1的转谷氨酰胺酶的作用而交联在蛋白质，非蛋白质氨基酸聚合物，肽或其衍生物中的Gln和Lys残基，由此在蛋白质，非蛋白质氨基酸聚合物、肽或其衍生物分子之间或之内形成分子间或分子内交联的ε-(γ-Glu)-Lys键。

5.编码权利要求1转谷氨酰胺酶的DNA。

6.根据权利要求5的DNA，至少具有序列表中所列Sequence Number 2之碱基序列中的第118碱基到852碱基序列。

7.通过将载体DNA与权利要求5的DNA相连而得到的重组DNA。

8.用权利要求7的重组DNA转化的细胞。

9.生产杆菌衍生的转谷氨酰胺酶的方法，其特征在于在培养基中培养权利要求8的细胞以此在培养基和/或细胞中生产并积累杆菌衍生的转谷氨酰胺酶，然后收集转谷氨酰胺酶。