CN103421199A

CN103421199A - 一种利用酶法获得的γ-聚谷氨酸水凝胶及其制备方法

Info

Publication number: CN103421199A
Application number: CN2013101675071A
Authority: CN
Inventors: 惠明; 高春媛; 田青; 赵红月; 黄亮; 夏克东; 黄继红
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明涉及一种制备生物可降解的高吸水性γ-聚谷氨酸（γ-PGA）水凝胶的方法。该方法为：利用谷氨酰胺转氨酶（TG酶）作为交联剂，通过酰基转移反应，交联γ-PGA与酪蛋白，形成一种复合蛋白质高吸水性水凝胶。本发明还涉及一种生物可降解的高吸水性γ-聚谷氨酸（γ-PGA）水凝胶及其用途。本发明的优点是：（1）反应条件温和，时间短，操作简便，设备要求低；（2）原料来源安全，绿色环保，可降解；（3）凝胶内部有许多活性位点，可结合药物，保持药物活性，是一种理想的生物医药材料；（4）凝胶具有较高的吸水溶胀性和稳定的持水性。

Description

一种利用酶法获得的γ-聚谷氨酸水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种含有γ-聚谷氨酸组分的新型氨基酸水凝胶，具体涉及一种利用谷氨酰胺转氨酶交联制备水凝胶的方法与水凝胶的用途。

背景技术

近年来，水凝胶广泛应用于食品生物、农林园艺、石油化工、医疗卫生等方面。但是目前制备水凝胶的材料多为化学合成，不仅原料与制备会对环境造成一定的污染，同时制备出的产品在自然界中分解缓慢，这样也会对环境造成污染。此外，随着水凝胶在生物医药领域中的应用日益广泛,由于生物医药材料的特殊要求，促进了人们对生物可降解水凝胶的研究。

微生物发酵生产的γ-聚谷氨酸 (γ-PGA)正是具有制备生物可降解水凝胶潜力的新型高分子材料。γ-PGA是一种水溶性高分子，由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过γ-谷氨酰胺键聚合而成，其侧链存在大量游离羧基，易于修饰。利用γ-PGA 制备的水凝胶可完全被生物降解，无毒副作用，具有生物相容性，其原料和制备过程均不会对环境造成污染，是一种环境友好型水凝胶。目前生产聚谷氨酸水凝胶的方法主要分为两个方面，物理方法和化学方法。物理方法即利用⁶⁰Co γ-射线交联制备水凝胶，但是这种方法对设备要求很高，操作不便。化学方法，即加入疏水性的化学交联剂，例如二元胺，卤代烷，硫化物，环氧树脂，复合盐还有乙二醇缩水甘油醚等等，通过一系列化学反应制得，这些交联剂多为石油资源，用于生物医药领域会存在一定的安全性问题，此外生产过程复杂，成本较高。

本发明意外地发现，运用谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase,TG酶）可以成功地将一种疏水性蛋白质——酪蛋白，与γ-PGA交联，生成不溶于水的，且在水中可以充分溶胀的氨基酸水凝胶。该反应条件温和，操作简单，对设备要求较低。本发明中使用的 TG酶来源于微生物，主要用于食品加工中，是一种具有改善蛋白质组织、风味及货架期等功能性质的生物酶。酪蛋白来源于脱脂牛乳，由αs₁ - 酪蛋白、αs₂ - 酪蛋白、β- 酪蛋白和κ- 酪蛋白等组分构成，属于疏水性最强的那类蛋白质。

本发明制备的水凝胶，不溶于水，25℃下可以吸收高达自身重量200倍以上的水，呈透明状的冻状，具有较好的稳定性、耐压保水性。此外由于原料来源安全，因此可用于生物医药和食品领域：可用做药物载体提高药物的水溶性及缓释性，可加入食品中作为具有营养价值的风味改良剂。

发明内容

本发明涉及一种通过生物酶法获得的γ-聚谷氨酸（γ-PGA）水凝胶及其制备方法。具体为：利用谷氨酰胺转氨酶（TG酶），通过酰基转移反应，将γ-PGA、γ-PGA盐、和或其混合物，与酪蛋白交联，增强γ-PGA的疏水性，得到不溶于水，但能在水中充分吸水溶胀的γ-PGA水凝胶，吸水溶胀后的水凝胶呈半透明冻状，室温下可吸收自身重量200倍以上的水。经优化实验，酶反应的最佳条件为pH 7.4，温度 40℃，酶浓度0.3%（质量分数），时间6 ~ 7小时。

本发明具有以下优点：

1. 反应条件温和，时间短，操作简便，设备要求低；

2. 原料来源安全，绿色环保，可降解，且降解产物为氨基酸，具有一定的营养价值；

3. 凝胶内部有许多活性位点，可结合药物，保持药物活性，是一种理想的生物医药材料；

4.具有较高的吸水溶胀性和稳定的持水性。

具体实例

本发明将以下下列实例作进一步说明，然而应注意，这些实例仅为例示本发明，而非用以限制本发明的范围。

实例一

γ-PGA为市售的分子质量为120万道尔顿的食品药品级原料，含量达99%（质量分数）；干酪素为含量为92%的生化试剂；TG酶为市售食品级酶试剂，其中含有1 %（质量分数）的酶和99 %（质量分数）的麦芽糊精。

以pH 7.4的Tris/HCl缓冲液为溶剂，配制1%~5%（质量分数）的γ-PGA溶液和10%（质量分数）的酪蛋白溶液，其中酪蛋白溶液要50℃过夜水浴搅拌溶解，将配制好的两种溶液各取10mL混合，调节pH到7.4，加入0.3%（质量分数）的TG酶，搅拌溶解后，放入40℃水浴锅中，7小时后取出，沸水浴5分钟，放入冰箱4℃冷藏15小时，即可形成凝胶，将上清液倒出，用蒸馏水洗去凝胶表面残留的未交联组分，之后将凝胶冷冻干燥或50℃鼓风干燥，即可得凝胶成品。将干燥好的凝胶浸入蒸馏水中，每隔一段时间通过四层纱布过滤掉未被吸收的水，称重，得凝胶湿重，重复操作，直到凝胶吸水达到饱和。凝胶吸水倍率（吸水倍率 = 凝胶湿重/凝胶干重）随时间变化如下表：

反应时间	吸水倍率
		10	3.95
16	20.00
		23	66.30
29	90.20
		35	110.75

实例二

原料来源同实例一。

以pH 7.4 的Tris/HCl缓冲液为溶剂，配制10 %（质量分数）的酪蛋白溶液，50℃过夜水浴搅拌溶解，取16mL配制好的酪蛋白溶液，加入1mL ~ 5mL pH 7.4的Tris/HCl缓冲液和0.1g~0.5g的γ-PGA粉末，混匀，调节pH到7.4，加入0.3%（质量分数）的TG酶，搅拌溶解后，放入40℃水浴锅中，6小时后取出，沸水浴5分钟，放入冰箱4℃冷藏15小时,即可形成凝胶，将上清液倒出，用蒸馏水洗去凝胶表面残留的未交联组分，之后将凝胶冷冻干燥或50℃鼓风干燥，即可得凝胶成品。将干燥好的凝胶浸入蒸馏水中，每隔一段时间，利用4层纱布过滤掉未被吸收的水，称重，得凝胶湿重，重复操作，直到凝胶吸水达到饱和。凝胶吸水倍率（吸水倍率 =凝胶湿重/凝胶干重）随时间变化如下表：

反应时间(h)	吸水倍率
		10	3.23
28	15.49
		42	49.86
46	82.25
		54	239.84

实例三：

原料来源同实例一。

以pH 7.4 的Tris/HCl缓冲液为溶剂，配制10%（质量分数）的酪蛋白溶液， 50℃过夜水浴搅拌溶解，取15mL~19mL配制好的酪蛋白溶液，加入1mL ~ 5mL pH 7.4的Tris/HCl缓冲液和1.67g ~ 2.11g的γ-PGA粉末，混匀，调节pH到7.4，加入0.3%（质量分数）的TG酶，搅拌溶解后，放入40℃水浴锅中，6小时后取出，沸水浴5分钟，放入冰箱4℃冷藏15小时，可使原料全部交联形成凝胶，不会残留上清液，之后将凝胶冷冻干燥或50℃鼓风干燥，即可得凝胶成品。将干燥好的凝胶浸入蒸馏水中，每隔一段时间，利用4层纱布过滤掉未被吸收的水，称重，得凝胶湿重，重复操作，直到凝胶吸水达到饱和。凝胶吸水倍率（吸水倍率 = 凝胶湿重/凝胶干重）随时间变化如下表：

反应时间（h）	吸水倍率
		10	3.47
28	7.52
		42	42.39
46	65.49
		50	91.47

Claims

1.一种利用谷氨酰胺转氨酶交联制备γ-聚谷氨酸水凝胶的方法：

（1）以γ-聚谷氨酸（γ-PGA）或γ-聚谷氨酸盐和酪蛋白（干酪素）为反应底物；

（2）以谷氨酰胺转氨酶（TG酶）为交联剂；

通过酶法交联直接反应，生成γ-聚谷氨酸水凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种利用谷氨酰胺转氨酶交联制备γ-聚谷氨酸水凝胶的方法步骤如下：

（1）配制pH 7.4的Tris/HCl缓冲液，以缓冲液为溶剂，配制10%（质量分数）的酪蛋白溶液以及适当质量分数的γ-聚谷氨酸溶液，其中干酪素要50℃过夜水浴搅拌溶解；

（2）将配制好的酪蛋白溶液，与适当质量分数的γ-聚谷氨酸溶液或适当质量的γ-聚谷氨酸混合，调节pH到7.4，加入0.3%（质量分数）的谷氨酰胺转氨酶，搅拌溶解后，放入40℃水浴锅中,6 ~ 7小时后取出，沸水浴5分钟，之后放入冰箱4℃冷藏15小时,即可形成凝胶；

（3）将上清液倒出，用蒸馏水洗去凝胶表面残留的未交联组分，之后将凝胶冷冻干燥或50℃鼓风干燥48h，即可得凝胶成品。

3.根据权利要求2所述的酶法制备水凝胶的最适条件为：pH 7.4，温度 40℃，酶浓度0.3 %（质量分数），时间6 ~ 7小时。

4.根据权利要求2所述的酶法制备水凝胶，γ-聚谷氨酸与酪蛋白的质量比不同所形成的凝胶的吸水特性也不同；当γ-聚谷氨酸与酪蛋白的质量比为9∶1，总底物浓度为10%时，底物可全部交联形成凝胶。

5.根据权利要求1所述的水凝胶，用于医药卫生、食品、化妆品、农业园艺领域。