CN111334546A - 人白介素2-红色荧光蛋白在毕赤酵母中的重组表达及其体外缓释促进t细胞增殖的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人白介素2‑红色荧光蛋白在毕赤酵母中的重组表达及其体外缓释促进T细胞增殖的应用，其包括如下步骤：将重组人白介素2‑红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的种子液接种到发酵培养基中发酵，当发酵液的OD600值趋于稳定时，停止发酵，将发酵液纯化处理后，即得到人白介素2‑红色荧光蛋白。与现有技术相比，本发明中以pGAP‑KanR为组成型表达质粒，采用了以甘油为碳源的发酵培养基，实现了连续高密发酵，操作简便，成本更低，解决了现有技术中发酵过程中需要额外添加物质进行诱导的缺陷。

Description

人白介素2-红色荧光蛋白在毕赤酵母中的重组表达及其体外 缓释促进T细胞增殖的应用
技术领域
本发明属于重组微生物及重组蛋白制备技术领域，具体涉及一种重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的构建方法及其水凝胶体外缓释的方法和在促进CD3+pan T细胞增殖中的应用。
背景技术
白介素2是一种由T淋巴细胞产生的细胞因子，作为免疫系统的一部分，具有刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞生长并促进其活化的功能。2014年，Steven A.Rosenberg使用白介素2来治愈黑色素瘤病人，在细胞免疫治疗领域进行探索和尝试。目前，白介素2已被应用于黑色素瘤、肾癌等的临床治疗，并取得较好的治疗效果。此外，据报道人白介素2长期培养T细胞可以促进终末分化；用白介素2短期培养的T细胞回输到患者体内可产生明显的抗肿瘤效果。现有专利中的白介素2多以大肠杆菌为表达宿主进行生产，但大多以包涵体的形式存在于细胞内，必须经过细胞破碎、杂蛋白去除、包涵体复性及纯化标签去除等系列步骤，才能获得高质量产品，提高了生产成本，不利于大规模工业化生产。并且工程化大肠杆菌在长期的生产过程中会出现质粒丢失的现象，一定程度上影响了产量。而毕赤酵母作为一种甲基营养型酵母，有较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。其遗传背景清晰，分子操作手段成熟，已经实现了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段等多种外源基因的表达。其中AOX1与GAP是酵母表达中使用最多的启动子，但使用AOX1需要甲醇诱导。甲醇运输与存储存在危险，监控困难，且甲醇有可能污染蛋白产品，因此有必要将毕赤酵母的AOX1甲醇启动子替换为组成型GAP甘油启动子，既可实现分批发酵，避免了危险品甲醇的使用，又降低了成本。
然而，白介素2作用半衰期短且在较大剂量下具有急毒性，应用和疗效均受到一定程度的限制。目前主要通过增加给药次数和剂量，来维持白介素2在治疗部位的浓度。这无疑会在一定程度上增加治疗费用、加剧患者的生理负担。而水凝胶作为一种药物缓释载体，由于其良好的生物相容性，持续时间长、靶向能力强等特点而受被广泛应用，已被FDA批准适用于特定医学应用。而γ-聚谷氨酸水凝胶作为一种氨基酸类的性能优异的包裹材料，制备过程温和，不会造成蛋白类药物活性大幅降低，在体内不会引发剧烈的排异反应，并可以长期释放药物，最终被机体吸收。利用水凝胶包裹白介素2，根据临床所需药物浓度，控制水凝胶性能参数，减少注射给药次数，实现药物缓释。同时在有害的环境(如胃里的酶或者低pH环境)中，水凝胶可以保护蛋白质不受损害，因此固定在水凝胶中的生物分子活性能够保持较长的时间。利用水凝胶包裹白介素2，根据临床所需药物浓度，控制水凝胶性能参数，一次性注射给药，实现药物缓释，且使用该缓释方法产生的药效理论上优于多次注射白介素2溶液。
目前已报道的可用于药物缓释的材料有很多种，比如生物可降解高分子材料、不可生物降解高分子材料、有序介孔材料、纳米磁性药物载体、磷酸钙盐、多孔微晶玻璃载体材料等。其中，由具有网状交联结构、引入一部分疏水基团和亲水残基的水溶性可生物降解高分子制成的水凝胶，在缓释蛋白类药物方面具有特别的优势。水凝胶具有生物粘附性、生物相容性和可降解性等众多优点，且具有多层次、多尺度的超微结构，是最常用的药物载体之一。水凝胶作为大分子药物的控释材料更为适宜，因为水凝胶所含有的大量水性环境适合极性蛋白质分子的扩散。与疏水聚合物相比，与被固定化的酶与组织相互作用较弱，在有害的环境(如胃里的酶或者低pH)中，水凝胶可以保护蛋白质不受损害，固定在水凝胶中的生物分子活性能够保持较长的时间。γ-聚谷氨酸是一种制备水凝胶的理想材料，其侧链上大量羟基负电荷的排斥作用使其具有较大的空间伸展性，在较低浓度下也具有强烈的分子间相互作用。本发明申请中使用的是γ-聚谷氨酸水凝胶包裹人白介素2-红色荧光蛋白用于研究免疫细胞的增殖，为以后体外癌症细胞研究及体内应用提供基础。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，一种重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株在制备人白介素2-红色荧光蛋白中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供上述方法制备得到的人白介素2-红色荧光蛋白的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供上述人白介素2-红色荧光蛋白制备得到的负载人白介素2-红色荧光蛋白水凝胶体外缓释的方法，以解决现有技术中白介素2作用半衰期短、有急毒性等技术性问题。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述白介素2-红色荧光蛋白水凝胶的应用。
本发明整体上提供一种可以有效降低成本的整合型技术方案，保证人白介素2-红色荧光蛋白的清晰、稳定、可靠来源，提高了下游实验的可控性。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株在制备人白介素2-红色荧光蛋白中的应用，包括如下步骤：将重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的种子液接种到发酵培养基中发酵，3～5天后当发酵液的OD600值趋于稳定时，停止发酵，将发酵液纯化处理后，即得到白介素2-红色荧光蛋白。
其中，所述的重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的构建方法，其包括如下步骤：
(1)将人白介素2-红色荧光蛋白(hIL-2-RFP)基因克隆到表达载体上pGAP-KanR，得到重组质粒pGAP-hIL-2-RFP(其质粒图谱如图3，核苷酸序列如SEQ ID NO.5))；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒电转入毕赤酵母中，利用抗性标记进行筛选，得到重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株；
其中，人白介素2-红色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的毕赤酵母为GS115，其保存编号ATCC 20864。
步骤(1)中，人白介素2-红色荧光蛋白(hIL-2-RFP)基因的合成方法为：去除天然人白介素2(NCBI:NP_000577，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的前20个信号肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS)；为防止由于第三个Cys位点的存在造成二硫键的错配而产生无活性的异构体和多聚体，将天然人白介素2中第125位的Cys突变为Ala；将人白介素2与红色荧光蛋白之间以连接肽GGGGS连接；为便于下游分离纯化，将pPIC9K质粒中的信号肽序列添加至人白介素2-红色荧光蛋白基因上游；根据毕赤酵母密码子使用频率对序列进行优化后合成人白介素2-红色荧光蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤(1)中，表达载体pGAP-KanR的构建方法为：
(i)以KanR基因(来源于pPIC9K质粒)为模板，PCR获得上下游同源臂，得到序列；
(ii)将步骤(i)得到的序列克隆至载体pGAPZB(图1)上，替换BleoR基因，得到重组质粒；
(iii)将步骤(ii)制得的重组质粒转化至E.coli DH5α中，经质粒酶切、PCR、测序验证，获得pGAP-KanR质粒；
其中，载体pGAPZB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
其中，上下同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；
其中，pGAP-KanR质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，所述的接种为将重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的种子液按照0.5％～2％(优选1％)的体积比接种到发酵培养基中发酵。
其中，所述的发酵培养基中各组分为甘油40g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、硫酸铵10g/L、无氨基酵母氮源3.4g/L、磷酸钾缓冲液(磷酸二氢钾8.34g/L和磷酸氢二钾0.87g/L)，溶剂为水。
其中，所述的发酵为在25～35℃、100～400rpm条件下振荡培养发酵；优选30℃、200rpm条件下振荡培养发酵。
其中，所述的纯化处理为将发酵离心，将所得上清液超滤浓缩后，使用镍柱亲和层析，进一步纯化产物蛋白，即得重组人白介素2-红色荧光蛋白。
上述应用制备得到的人白介素2-红色荧光蛋白也在本发明的保护范围之内。
上述人白介素2-红色荧光蛋白在γ-聚谷氨酸水凝胶中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述负载人白介素2-红色荧光蛋白γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法为将人白介素2-红色荧光蛋白包裹到γ-聚谷氨酸水凝胶内。
上述应用制备得到的负载人白介素2-红色荧光蛋白γ-聚谷氨酸水凝胶也在本发明的保护范围之内。
上述负载人白介素2-红色荧光蛋白γ-聚谷氨酸水凝胶在扩增CD3+pan T细胞中的应用也在本发明的保护范围之内；其中，将负载人白介素2-红色荧光蛋白γ-聚谷氨酸水凝胶在体外作用于CD3+pan T细胞，观察缓释效率和细胞增殖效率。
上述人白介素2-红色荧光蛋白或负载人白介素2-红色荧光蛋白的γ-聚谷氨酸水凝胶在制备抗肿瘤药物中的应用也在本发明的保护范围之内；其中，所述的肿瘤包括黑色素瘤和乳腺癌。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明中以pGAP-KanR为组成型表达质粒，采用了以甘油为碳源的发酵培养基，实现了连续高密发酵，操作简便，成本更低，解决了现有技术中发酵过程中需要额外添加物质进行诱导的缺陷。
(2)本发明保证了人白介素2的清晰、稳定、可靠来源，提高了下游实验的可控性，提供了一种可以有效降低成本的整合型技术方案。毕赤酵母能够长期稳定地表达目的蛋白，有利于保证γ-聚谷氨酸水凝胶包裹白介素2产品的质量，使得其在体外扩增T细胞的实验变得更加可控，具有良好的体内应用前景。从上游毕赤酵母合成目标产物白介素2，到下游利用γ-Glu水凝胶将其包裹以制成缓释制剂。本发明为该“负载蛋白水凝胶缓释制剂”将来可能涉及到的科学研究应用——包括但不仅限于体外T细胞增殖、动物模型体内实验——提供了从小分子到大分子到细胞甚至个体水平的完整实验方案。目前，科研用人白介素2市价依然较高，通过实验室中易于操作的合成、纯化等步骤即可获得理化性质符合科研要求的人白介素2，在很大程度上节约了研究成本。
(3)毕赤酵母的优势：
目前市场上应用的表达体系问题：现有专利中的人白介素2多以大肠杆菌为表达宿主进行生产，但大多以包涵体的形式存在于细胞内，必须经过细胞破碎、杂蛋白去除、包涵体复性及纯化标签去除等系列步骤，才能获得高质量产品，提高了生产成本，不利于大规模工业化生产。并且工程化大肠杆菌在长期的生产过程中会出现质粒丢失的现象，一定程度上影响了产量。另外，大肠杆菌在发酵的过程中会产生内毒素，用于医用产品还得额外去除内毒素，增加了成本。
使用毕赤酵母的优势：作为一种甲基营养型酵母，毕赤酵母有较完善的外源基因表达系统，其遗传背景清晰，分子操作手段成熟，具有表达质粒可在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合、能使产物正确折叠并适当糖基化、易于高密度发酵、培养经济方便等特点。另外，毕赤酵母表达效率高，且由于毕赤酵母天然外泌型产物较少，通过添加信号肽序列可实现目的蛋白的大量外泌，有利于下游的分离纯化工作。可实现目的蛋白长期、稳定、高效地生产。
节省成本，缩短时间：从实验室直接一步到位得到白介素2-红色荧光蛋白，经简单纯化便可应用于动物临床实验。
(4)使用γ-聚谷氨酸水凝胶缓释的优势：
白介素2使用限制：白介素2作用半衰期短且在较大剂量下具有急毒性，应用和疗效均受到一定程度的限制。目前，主要通过增加给药次数和剂量，来维持白介素2在治疗部位的浓度。这无疑会在一定程度上增加治疗费用、加剧患者的生理负担。
γ-聚谷氨酸水凝胶优点：γ-聚谷氨酸水凝胶是一种性能优异的包裹材料，制备过程温和，不会造成蛋白类药物活性大幅降低，同时具有良好的生物相容性，在体内不会引发剧烈的排异反应，并可以长期释放药物，最终被机体吸收。利用水凝胶包裹人白介素2-红色荧光蛋白，根据临床所需药物浓度，控制水凝胶性能参数，一次性注射给药，实现药物缓释。同时在有害的环境(如胃里的酶或者低pH环境)中，水凝胶可以保护蛋白质不受损害，固定在水凝胶中的生物分子活性能够保持较长的时间。
附图说明
图1为质粒pGAPZ B图谱。
图2为质粒pGAP-KanR图谱。
图3为重组质粒pGAP-hIL-2-RFP图谱。
图4为不同浓度水凝胶包裹的人白介素2-红色荧光蛋白体外释放图谱；释放温度37℃，溶解人白介素2-红色荧光蛋白的溶液为0.01mol/L pH为7.4的PBS。
图5为不同浓度的人白介素2-红色荧光蛋白体外pan T细胞的增值效率；横坐标为人白介素2-红色荧光蛋白的浓度取对数值，浓度单位为nM。
图6为以法向残差为纵坐标，预测值为横坐标的残差散点图。
图7为模型诊断与观测值的对比，结果显示模型诊断符合观测值。
图8的表中为模型拟合所获得的一系列动力学参数。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1pGAP-KanR质粒的构建
合成KanR基因(来源于pPIC9K质粒，购自Thermo Fisher Scientific公司产品目录编号V175-20。)，并在其上下游添加同源臂(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示)；使用限制性内切酶SmaⅠ酶切开pGAPZ B质粒(图1，购自Thermo Fisher Scientific公司产品目录编号V20020，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，通过一步克隆将KanR序列克隆至pGAPZ B载体上，替换BleoR基因；将重组质粒转化至E.coli DH5α中，经质粒酶切、PCR、测序验证，获得pGAP-KanR质粒(图2)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
一步克隆体系如下表：
Figure BDA0002424834650000071
其中线性化载体、插入片段的使用量可由下面公式计算获得：
片段的最适用量＝[0.04×片段的碱基对数]ng
线性化载体的最适用量＝[0.02×线性化载体的碱基对数]ng
实施例2人白介素2-红色荧光蛋白的生产与分离纯化
(一)目标基因hIL-2-RFP的合成
天然人白介素2(NCBI:NP_000577)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，去除前20个信号肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS)；为防止由于第三个Cys位点的存在造成二硫键的错配而产生无活性的异构体和多聚体，将天然人白介素2第125位Cys突变为Ala；将人白介素2与红色荧光蛋白序列之间以连接肽GGGGS连接；为便于下游分离纯化，将pPIC9K质粒中的信号肽序列添加至人白介素2-红色荧光蛋白基因上游；根据毕赤酵母密码子使用频率对序列进行优化后合成人白介素2-红色荧光蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中1-267核苷酸为α信号肽序列，268-666核苷酸为人白介素2序列，667-681核苷酸为连接肽序列，682-1356核苷酸为红色荧光蛋白序列。
(二)重组质粒的构建与验证
将hIL-2-RFP基因通过5'EcoRI(GAATTC)and 3'NotI(GCGGCCGC)克隆至pGAP-KanR载体。
(1)处理hIL-2-RFP基因的双酶切体系如下表(酶与Buffer均来自ThermoScientificTM)：
Figure BDA0002424834650000081
在37℃水浴锅中孵育该体系20分钟可获得具有粘性末端的hIL-2-RFP基因。
(2)处理pGAP-KanR质粒的酶切体系如下表(酶与Buffer均来自ThermoScientificTM)：
Figure BDA0002424834650000082
在37℃水浴锅中孵育该体系15分钟可获得线性化的pGAP-KanR质粒。
(3)使用Thermo ScientificTM的T4 DNA Ligase配置DNA连接体系。连接体系如下：
Figure BDA0002424834650000083
在22℃的水浴锅中孵育该体系10分钟后，将连接液转化至E.coli DH5α中，经质粒酶切、PCR、测序验证，获得pGAP-hIL-2-RFP质粒(图3)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
(三)毕赤酵母重组菌的构建与验证
重组质粒电转化毕赤酵母。具体方法如下：
毕赤酵母感受态细胞的制备：
①从冻存管中接种毕赤酵母GS115(ATCC 20864)至装有5mL YPD液体培养基的试管中，于30℃、200rpm条件下培养18-24h，得毕赤酵母种子液。接种150μL毕赤酵母种子液于装有50mL YPD液体培养基的摇瓶中，30℃，200rpm条件下培养至OD600为0.6-0.8；
②将摇瓶置于冰上预冷(使菌体停止生长)，将培养物转入离心管，使用高速冷冻离心机，4℃，5000g转速离心10min，用50mL预冷的ddH20重悬细胞；
③同上离心，用25mL预冷ddH20重悬细胞；
④同上离心，用2mL预冷1M(即1mol/L)山梨醇重悬细胞；
⑤同上离心，用1 00μL预冷1M山梨醇重悬细胞。
转化：
①将电击杯先浸于75vt％乙醇中，再浸于100％乙醇中，洗净后置于超净台中晾干，然后放在冰上预冷；
②取60μL上述感受态细胞与10-15μL线性化DNA混合，转入预冷的0.2cm电击杯中；
③于冰上放置5min；
④擦净电击杯外表的水，放入电转仪插槽，选择合适的程序，电击；
⑤立即加入1mL预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转入灭菌的离心管中；
⑥于30℃下静置2h。
⑦2h后取出含G418的YPD平板，按下表所示菌液量均匀涂布，每个G418浓度梯度涂布两块平板。
Figure BDA0002424834650000091
⑧将所涂平板置于30℃培养箱中倒置培养，直至长出菌落。此过程约需3-4天。
⑨挑取筛选平板上长出的菌落，进行菌落PCR验证。
对菌落PCR验证结果呈阳性的转化子进行接种，扩大培养，保藏，提取基因组，进行基因组PCR验证。对于验证结果呈阳性的转化子，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序结果正确的即确认为重组菌。
(四)重组菌在生产人白介素2-红色荧光蛋白的表达纯化
1.重组菌的培养及产物的表达纯化
采用构建的重组菌生产人白介素2-红色荧光蛋白。具体方法如下：活化重组菌，于50mL甘油发酵培养基(甘油40g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、硫酸铵10g/L、无氨基酵母氮源3.4g/L、磷酸二氢钾8.34g/L和磷酸氢二钾0.87g/L)中30℃、200rpm条件下培养12h，得到种子液。将种子液以最适1％体积比的接种量接种于200mL甘油发酵培养基中，在30℃、200rpm条件下振荡培养。每24h取样镜检，并测定OD600值，3-5天后当OD600值趋于稳定时，停止发酵过程。将发酵液分装于两支100mL离心管中，在5000rpm条件下离心5min。离心结束后，收集上清。使用30kDa孔径的超滤管对上清进行超滤，在4℃，4000rpm条件下离心20min后，收集滤膜上的液体。
2.纯化
使用Takara公司的镍柱对超滤所得产品进行亲和层析。其中亲和层析过程中所用的平衡缓冲液、洗涤缓冲液以及洗脱液配制好后，均使用浓盐酸调节pH至7.4，并进行超声脱气处理，方可使用。具体操作步骤如下：
①取已填料的镍柱，尖端朝下静置至蓝色树脂完全沉淀，加入10mL平衡缓冲液(磷酸钠19.01g/L，氯化钠17.533g/L，咪唑1.362g/L)进行平衡，打开下方出液口的塞子，将滴落液体引导至废液桶；
②待10mL液体流出完毕后盖上出液口塞子，加入经超滤处理好的澄清样品，封上顶部盖子，将柱子缓慢反复颠转1小时(或倒置一小时)，此过程在4℃下进行；
③将柱子尖端朝下垂直安放，让树脂沉在柱子底部，并在尖端下方接EP管，大小视加样多少定；
④拆下上方和下方塞子，收集滴落的液体，收集完毕后返回②步骤继续加样，直至所有样品处理完毕；
⑤用10mL的平衡缓冲液(磷酸钠19.01g/L，氯化钠17.533g/L，咪唑1.362g/L)洗涤柱子，然后用10mL洗涤缓冲液(磷酸钠19.01g/L，氯化钠17.533g/L，咪唑2.723g/L)再次洗涤柱子；
⑥用10mL洗脱液(磷酸钠19.01g/L，氯化钠17.533g/L，咪唑20.424g/L)洗脱柱子，收集所有流出液体。
实施例3γ-聚谷氨酸水凝胶包裹人白介素2-红色荧光蛋白的缓释效应模型
考察水凝胶交联度、溶胀比、降解率以及孔径等理化性质对药物释放效果(由释放效率和释放浓度表征)的影响，最终确定药物最优的释放效果和水凝胶的最佳理化指标。本试验建立了逐步回归分析模型和药物释放动力模型。
(1)逐步回归分析是将水凝胶各理化性质为自变量xi与药物最佳释放速率yj建立总回归方程，接着对总回归方程和已引入回归方程的变量计算其偏平方回归和，然后按偏回归平方和由小到大地依次对方程中其他变量进行检验。将对影响不显著的变量剔除，保留的即为有显著影响的因子。由此建立最优化的回归方程，得出生产最优释放效果的药物下的水凝胶的最佳理化指标。
由R分析所得总回归方程结果如下，其中x3代表水凝胶浓度，x4代表-NH2/-CHO的摩尔比，其中-NH2/-CHO的摩尔比表征水凝胶的交联密度，在合适的摩尔比区间里，摩尔比值与交联度呈负相关。接着对模型进行残差分析，计算上述逐步回归模型的普通残差和标准化残差，判断可能存在的异常点，得到相应的回归诊断分析(图6)。再通过对数变换更新逐步回归模型，并再次计算更新后模型的标准化残差，剔除掉异常观测值后得到优化的残差散点图(图7)。
Figure BDA0002424834650000111
(2)药物释放动力模型旨在描述药物释放到最佳浓度区间的稳定时长。将实验数据和Peppas-Sahlin Model曲线进行拟合，从而得到一系列的动力学常数K值(图8)，从中筛选出符合缓释曲线的水凝胶样本。考虑到存在滞后期的因素，又引入修正后的Peppas-Sahlin Model，同理筛选出符合条件的水凝胶样本。
与目前普遍存在的缓释模型相比，本实施例中的缓释效应模型创新性引入逐步回归分析的方法。回归分析不仅可以预测并求出函数，还可以对结果进行残差检验，从而得到模型精度。总之，用数学方法定量分析实际问题，通过剔除非本质的、不显著的参数影响以及调整相关变量和参数，从而为实验提供指导，保证系统完整的反映实际情况和解决实际问题。
实施例4体外释药试验
以人白介素2-红色荧光蛋白为模型药物，进行水凝胶的体外药物释放研究。
(1)取0.8g的γ聚谷氨酸分别溶于8mL和6.7mL的PBS中配得质量分数为10％和12％的γ聚谷氨酸原胶，取1.2g的透明质酸分别溶于12mL和10mL的醋酸中配得质量分数为10％和12％的透明质酸原胶。
(2)取0.8g人白介素2-红色荧光蛋白溶于100mL PBS中配得质量分数为0.8％的模型药物溶液。
(3)分别向γ聚谷氨酸原胶和透明质酸原胶中加入200μL模型药物溶液，使其充分溶解。
(4)分别取200μLγ聚谷氨酸原胶和透明质酸原胶置于圆形模具中，用封口膜封闭，在37°培养箱中放置4h使其充分交联。
(5)将成型后的水凝胶浸泡于80mL PBS中，然后放在圆形模具中用封口膜封闭，在37℃下不断振荡。
(6)隔四小时取200μL释放介质，采用BCA蛋白浓度试剂盒，通过显色反应测定蛋白总含量，试验持续72小时。
待实验完毕，通过以下公式进行累计释放速率的计算。
累计释放速率(％)＝总体积×C(人白介素2-红色荧光蛋白)(n)+ΣC(人白介素2-红色荧光蛋白)(n-1)×0.2/w*100％
W为待测样品的载药量(μg)，C(人白介素2-红色荧光蛋白)(n)为t时间里第n次测量时释放到PBS中的人白介素2-红色荧光蛋白浓度(μg/mL)，C(人白介素2-红色荧光蛋白)(n-1)为第n-1次测量时释放到PBS中的人白介素2-红色荧光蛋白浓度(μg/mL)，∑C(人白介素2-红色荧光蛋白)(n-1)为前n-1次测定的人白介素2-红色荧光蛋白浓度之和。图4为测得的不同浓度水凝胶包裹的人白介素-2-红色荧光蛋白体外释放图谱，显示了水凝胶包裹人白介素2-红色荧光蛋白的缓释效果，可以缓解白介素2-红色荧光蛋白释放的急毒性。
实施例5CD3+pan T增殖实验
(1)培养基的配制
基本培养基：量取新生牛血清(FBS)10mL，加RPMI 1640培养液90mL，4℃保存。
完全培养基：量取基础培养液100mL，加入0.25mg刀豆素A(ConA)。
(2)CD3+pan T的复苏与扩增
将CD3+Pan T细胞(购自南京金贝津生物科技有限公司，目录编号PB03-4C)复苏，并加入基本培养基中，于37℃条件下扩增培养，至浓度达1.0×107个/mL。
(3)CD3+pan T增殖测定
实验前，将上述扩增所得细胞离心，然后将细胞加入基本培养基中，调整其浓度至1.0×106个/mL，得细胞悬液。在96孔板中，除背景空白孔加入完全培养液100μL外，其余每孔接种细胞悬液100μL(即每孔1.0×105个细胞)。再加入不同剂量的白介素2-红色荧光蛋白(0.3,1,3,10,30,100and 300nM)，完全培养基100μL(RPMI1640含有10％FBS，2.5μg/mLConA)。加样结束后，将96孔板放入细胞培养箱，37℃、5％CO2培养72h。在淋巴细胞培养68h后，取96孔板每孔加入20μL的CCK8试剂，继续培养4h后结束培养，使用酶标仪在450nm处检测吸收度。如图5所示，实验结果显示人白介素2-红色荧光蛋白能通过水凝胶缓释在体外促进CD3+panT细胞的增殖。
本发明提供了一种重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的构建及其水凝胶体外缓释促进CD3+pan T细胞增殖的方法和应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 人白介素2-红色荧光蛋白在毕赤酵母中的重组表达及其体外缓释促进T细胞增殖的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 153
<212> PRT
<213> 人白介素(hIL)
<400> 1
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 2
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人白介素2-红色荧光蛋白(hIL-2-RFP)
<400> 2
atgaggttcc cttctatttt taccgccgtc cttttcgccg cttctagtgc tttggctgct 60
ccagtcaaca ctaccactga ggacgaaacc gcccaaattc cagctgaagc cgtcatcggt 120
tacagtgacc ttgagggaga cttcgatgtc gccgtcttgc ctttctctaa ctctaccaac 180
aacggtttgt tgttcattaa caccaccatc gcctctatcg ctgccaagga agagggtgtc 240
tctttggaga agagggaggc tgaagccgct ccaacctctt ctagtaccaa gaagacccag 300
cttcagcttg agcacttgtt gcttgacctt caaatgatct tgaatggtat caataactat 360
aaaaatccaa aattgactag aatgttgact ttcaagttct acatgccaaa gaaggccacc 420
gagttgaagc acttgcaatg cttggaggag gagttgaagc cacttgagga ggtcttgaac 480
cttgcccaga gtaagaactt ccaccttagg ccaagggacc ttatctctaa cattaacgtc 540
atcgtcttgg agttgaaggg atctgagacc accttcatgt gcgaatacgc cgatgagact 600
gccaccatcg tcgagttctt gaatagatgg atcaccttcg cccagtctat catctctacc 660
ttgaccggag gaggaggttc tatggccagt tctgaggacg tcatcaagga atttatgaga 720
ttcaaggtta gaatggaggg atctgtcaat ggtcacgagt tcgagatcga aggagaggga 780
gagggtaggc cttatgaggg aacccagacc gctaagctta aggtcaccaa gggaggtcct 840
cttccattcg cttgggacat ccttagtcct caattccaat atggatctaa ggcctatgtc 900
aagcacccag ccgacattcc agactatctt aagcttagtt ttccagaggg atttaagtgg 960
gagagagtca tgaacttcga ggacggaggt gttgtcaccg tcacccaaga ctcttctttg 1020
caagatggtg agttcatcta caaggttaaa ttgaggggaa ctaatttccc atctgacggt 1080
ccagttatgc aaaaaaagac catgggatgg gaagcttcta ccgagaggat gtacccagaa 1140
gacggtgccc ttaagggaga gattaaaatg aggttgaagt tgaaggacgg tggacactat 1200
gatgccgagg tcaagactac ctacatggcc aagaagccag ttcagcttcc cggagcttac 1260
aaaactgata ttaagttgga catcactagt cataacgagg actacaccat cgtcgagcag 1320
tacgagaggg ccgagggaag gcatagtact ggtgct 1356
<210> 3
<211> 2882
<212> DNA
<213> 载体(pGAPZB)
<400> 3
agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60
atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120
cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180
gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240
aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300
ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360
gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420
ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480
tatttcgaaa cgaggaattc acgtggccca gccggccgtc tcggatcggt acctcgagcc 540
gcggcggccg ccagctttct agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatagcgcc 600
gtcgaccatc atcatcatca tcattgagtt ttagccttag acatgactgt tcctcagttc 660
aagttgggca cttacgagaa gaccggtctt gctagattct aatcaagagg atgtcagaat 720
gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata 780
gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta 840
tctcgcagct gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt 900
tttcttggta tttcccactc ctcttcagag tacagaagat taagtgagac cttcgtttgt 960
gcggatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 1020
tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 1080
tttccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 1140
aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 1200
tttctttttc ttgaaatttt tttttttagt ttttttctct ttcagtgacc tccattgata 1260
tttaagttaa taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt 1320
acaacttttt ttacttcttg ttcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagggcgg 1380
tgttgacaat taatcatcgg catagtatat cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa 1440
ctaaaccatg gccaagttga ccagtgccgt tccggtgctc accgcgcgcg acgtcgccgg 1500
agcggtcgag ttctggaccg accggctcgg gttctcccgg gacttcgtgg aggacgactt 1560
cgccggtgtg gtccgggacg acgtgaccct gttcatcagc gcggtccagg accaggtggt 1620
gccggacaac accctggcct gggtgtgggt gcgcggcctg gacgagctgt acgccgagtg 1680
gtcggaggtc gtgtccacga acttccggga cgcctccggg ccggccatga ccgagatcgg 1740
cgagcagccg tgggggcggg agttcgccct gcgcgacccg gccggcaact gcgtgcactt 1800
cgtggccgag gagcaggact gacacgtccg acggcggccc acgggtccca ggcctcggag 1860
atccgtcccc cttttccttt gtcgatatca tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac 1920
gccctccccc cacatccgct ctaaccgaaa aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg 1980
tccctattta tttttttata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt 2040
ttcttttttt tctgtacaga cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg 2100
agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgcaagct ggagaccaac atgtgagcaa 2160
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2220
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2280
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2340
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2400
ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2460
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2520
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 2580
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 2640
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 2700
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 2760
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 2820
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgcatgaga 2880
tc 2882
<210> 4
<211> 3297
<212> DNA
<213> 质粒(pGAP-KanR)
<400> 4
agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60
atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120
cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180
gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240
aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300
ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360
gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420
ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480
tatttcgaaa cgaggaattc acgtggccca gccggccgtc tcggatcggt acctcgagcc 540
gcggcggccg ccagctttct agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatagcgcc 600
gtcgaccatc atcatcatca tcattgagtt ttagccttag acatgactgt tcctcagttc 660
aagttgggca cttacgagaa gaccggtctt gctagattct aatcaagagg atgtcagaat 720
gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata 780
gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta 840
tctcgcagct gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt 900
tttcttggta tttcccactc ctcttcagag tacagaagat taagtgagac cttcgtttgt 960
gcggatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 1020
tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 1080
tttccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 1140
aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 1200
tttctttttc ttgaaatttt tttttttagt ttttttctct ttcagtgacc tccattgata 1260
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acaacttttt ttacttcttg ttcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagggcgg 1380
tgttgacaat taatcatcgg catagtatat cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa 1440
ctaaaccatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg aggccgcgat taaattccaa 1500
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aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt 1680
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cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga 1800
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ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa 1920
cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt 1980
ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga 2040
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acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 2160
gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat 2220
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ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa 2820
tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 2880
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 2940
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3000
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3060
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3120
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3180
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3240
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgca tgagatc 3297
<210> 5
<211> 4610
<212> DNA
<213> 质粒(pGAP-hIL-2-RFP)
<400> 5
agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60
atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120
cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180
gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240
aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300
ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360
gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420
ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480
tatttcgaaa cgaggaattc atgaggttcc cttctatttt taccgccgtc cttttcgccg 540
cttctagtgc tttggctgct ccagtcaaca ctaccactga ggacgaaacc gcccaaattc 600
cagctgaagc cgtcatcggt tacagtgacc ttgagggaga cttcgatgtc gccgtcttgc 660
ctttctctaa ctctaccaac aacggtttgt tgttcattaa caccaccatc gcctctatcg 720
ctgccaagga agagggtgtc tctttggaga agagggaggc tgaagccgct ccaacctctt 780
ctagtaccaa gaagacccag cttcagcttg agcacttgtt gcttgacctt caaatgatct 840
tgaatggtat caataactat aaaaatccaa aattgactag aatgttgact ttcaagttct 900
acatgccaaa gaaggccacc gagttgaagc acttgcaatg cttggaggag gagttgaagc 960
cacttgagga ggtcttgaac cttgcccaga gtaagaactt ccaccttagg ccaagggacc 1020
ttatctctaa cattaacgtc atcgtcttgg agttgaaggg atctgagacc accttcatgt 1080
gcgaatacgc cgatgagact gccaccatcg tcgagttctt gaatagatgg atcaccttcg 1140
cccagtctat catctctacc ttgaccggag gaggaggttc tatggccagt tctgaggacg 1200
tcatcaagga atttatgaga ttcaaggtta gaatggaggg atctgtcaat ggtcacgagt 1260
tcgagatcga aggagaggga gagggtaggc cttatgaggg aacccagacc gctaagctta 1320
aggtcaccaa gggaggtcct cttccattcg cttgggacat ccttagtcct caattccaat 1380
atggatctaa ggcctatgtc aagcacccag ccgacattcc agactatctt aagcttagtt 1440
ttccagaggg atttaagtgg gagagagtca tgaacttcga ggacggaggt gttgtcaccg 1500
tcacccaaga ctcttctttg caagatggtg agttcatcta caaggttaaa ttgaggggaa 1560
ctaatttccc atctgacggt ccagttatgc aaaaaaagac catgggatgg gaagcttcta 1620
ccgagaggat gtacccagaa gacggtgccc ttaagggaga gattaaaatg aggttgaagt 1680
tgaaggacgg tggacactat gatgccgagg tcaagactac ctacatggcc aagaagccag 1740
ttcagcttcc cggagcttac aaaactgata ttaagttgga catcactagt cataacgagg 1800
actacaccat cgtcgagcag tacgagaggg ccgagggaag gcatagtact ggtgctgcgg 1860
ccgccagctt tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc gccgtcgacc 1920
atcatcatca tcatcattga gttttagcct tagacatgac tgttcctcag ttcaagttgg 1980
gcacttacga gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag aggatgtcag aatgccattt 2040
gcctgagaga tgcaggcttc atttttgata cttttttatt tgtaacctat atagtatagg 2100
attttttttg tcattttgtt tcttctcgta cgagcttgct cctgatcagc ctatctcgca 2160
gctgatgaat atcttgtggt aggggtttgg gaaaatcatt cgagtttgat gtttttcttg 2220
gtatttccca ctcctcttca gagtacagaa gattaagtga gaccttcgtt tgtgcggatc 2280
ccccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg 2340
gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aattttccct 2400
ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag 2460
accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt 2520
ttcttgaaat tttttttttt agtttttttc tctttcagtg acctccattg atatttaagt 2580
taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt 2640
tttttacttc ttgttcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaaggg cggtgttgac 2700
aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag gaactaaacc 2760
atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat 2820
gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 2880
tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 2940
gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 3000
cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 3060
atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 3120
gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 3180
tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 3240
gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 3300
gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 3360
cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 3420
ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 3480
ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 3540
ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaatttt cctcggagat ccgtccccct 3600
tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc cctcccccca 3660
catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc cctatttatt 3720
tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc 3780
tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg 3840
gacgctcgaa ggctttaatt tgcaagctgg agaccaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 3900
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 3960
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 4020
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 4080
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac 4140
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 4200
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 4260
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 4320
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 4380
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 4440
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 4500
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 4560
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gcatgagatc 4610
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 上游同源臂(up)
<400> 6
accatggcca agttgaccag t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游同源臂(down)
<400> 7
gaggagcagg actgacacgt 20

Claims (10)

1.一种重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株在制备人白介素2-红色荧光蛋白中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的种子液接种到发酵培养基中发酵，当发酵液的OD600值趋于稳定时，停止发酵，将发酵液纯化处理后，即得到人白介素2-红色荧光蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的构建方法包括如下步骤：
(1)将人白介素2-红色荧光蛋白基因克隆到表达载体上pGAP-KanR，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒电转入毕赤酵母中，筛选得到重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株；
其中，人白介素2-红色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的表达载体pGAP-KanR的构建方法为：
(i)以KanR基因为模板，PCR获得上下游同源臂，得到序列；
(ii)将步骤(i)得到的序列克隆至载体pGAPZB上，替换BleoR基因，得到重组质粒；
(iii)将步骤(ii)制得的重组质粒转化至E.coliDH5α中，经质粒酶切、PCR、测序验证，获得pGAP-KanR质粒；
其中，上下同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；
其中，pGAP-KanR质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将重组人白介素2-红色荧光蛋白的毕赤酵母表达菌株的种子液按照0.5％～2％的体积比接种到发酵培养基中发酵。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基中各组分为甘油40g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、硫酸铵10g/L、无氨基酵母氮源3.4g/L、磷酸二氢钾8.34g/L和磷酸氢二钾0.87g/L。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的发酵为在25～35℃、100～400rpm条件下振荡培养发酵。
7.权利要求1～6中任意一项所述应用制备得到的人白介素2-红色荧光蛋白。
8.权利要求7所述人白介素2-红色荧光蛋白在γ-聚谷氨酸水凝胶中的应用。
9.权利要求8所述应用制备得到的负载人白介素2-红色荧光蛋白的γ-聚谷氨酸水凝胶。
10.权利要求7所述的人白介素2-红色荧光蛋白或权利要求9所述的负载人白介素2-红色荧光蛋白的γ-聚谷氨酸水凝胶在扩增CD3+pan T细胞或制备抗肿瘤药物中的应用。
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