WO2003102128A1 - Secuencia de nucleotidos de maiz codificante de una proteina con actividad transglutaminasa, y su uso - Google Patents

Secuencia de nucleotidos de maiz codificante de una proteina con actividad transglutaminasa, y su uso Download PDF

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protein
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seq
tgase activity
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José María TORNÉ CUBIRÓ
María Asunción SANTOS LOZANO
David Talavera Baro
Enrique Villalobos Amador
Juan Rigau Lloveras
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII

Definitions

  • NUCLEOTIDE SEQUENCE OF CODING CORN OF A PROTEIN WITH TRANSGLUTAMINASE ACTIVITY, AND ITS USE.
  • the invention relates to the identification of new proteins of plant origin with TGase activity and their use in the field of food handling, processing and transformation and in the development of transgenic plants with new capacities.
  • Transglutamines (TGase; EC2.3.2.13) (R-glutaminyl-peptide-aminase- ⁇ -glutamyl transferase) catalyze amide bonds between a primary amino group of a polyamine or a lysine (amino donor) and a ⁇ -carboxamide group of a glutamyl residue of some proteins (amino receptor), by an intermediate reaction whereby the enzyme binds to the substrate by reaction between the ⁇ -carboxyamide group of the glutamyl residue of the protein and a sulfydryl group of a center cistern residue enzyme active (Serafini-Fracassini, D., Del Duca, S., & Beninati, S. 1995. Plant Transglutaminases. Phytochemistry 40: 355-365). The result of the activity of the
  • TGase is: a) the modification of the conformation of the protein itself and b) other more extensive conformation changes as a result of unions between the same protein and between different proteins to form high molecular weight conjugates.
  • TGases are: factor XIII of blood coagulation, which is a plasma protein, and TGase K involved in the formation of the corneal layer of the epidermis.
  • factor XIII of blood coagulation which is a plasma protein
  • TGase K involved in the formation of the corneal layer of the epidermis.
  • some of the genes responsible for some of the aforementioned TGases have already been cloned and the involvement of TGases in important processes such as cell differentiation, tissue stabilization or programmed cell death (Ichinose, A.) is becoming known.
  • Bottenus, RE & Davie EW 1990 Structure of transglutaminases. J. of Biol. Chemistry.
  • transglutaminase has an added value for biotechnological purposes.
  • This new supplementary facet as a metabolite of interest comes from its ability to create covalent bonds between different proteins. This property has been used for example to maintain the texture of foods such as fish and meat, reducing the need to use salts (surimi, etc).
  • salts surimi, etc.
  • For the formulation of gelatins of different density etc. To prepare cooked with less fat (tofu). It is also able to maintain the consistency, elasticity, humidity or viscosity of a product at different temperatures. It is also used in different lactic processes: cheeses, yogurts, ice cream, etc. So much so, that it is currently used as an "additive" in many bio-food processes, with the recommended dose in the USA for this use of 65 ppm.
  • TGase have generated the formulation of different patents on: methods of obtaining, using etc. and they have made this substance a commercial product such as those that Ajinomoto has been distributing, with the name of: Activa TG®.
  • the companies that market the product are Ajinomoto Co. Inc of Tokyo (also extended in North America) and Rohm Enzyme of USA (www.skidmore- sales.com/whatsnew/newsletter/surnmer2001.pdf). However, in Spain no company that is dedicated to the industrial production of TGasa has been located.
  • the invention faces the problem associated with the shortage of plant-based TGases necessary in the field of food handling and transformation and in the development of transgenic plants with new capacities.
  • the solution provided by this invention is based on the fact that the inventors have identified DNA sequences with TGase activity (TGase; EC2.3.2.13) from the corn.
  • TGase activity of the proteins encoded from said DNA sequences has been revealed in experiments from extracts of these proteins. Therefore, an object of this invention is said DNA molecules.
  • Another additional object of this invention is a vector comprising at least one of said DNA molecules.
  • a further object of this invention is the use of said DNA molecules or of said vectors, to produce transformed cells capable of expressing recombinant proteins with TGase activity, or to introduce said coding sequence of a protein with TGase activity in plant cells.
  • the microorganism cells and the resulting transgenic plants also constitute additional objects of this invention.
  • a further object of the present invention is proteins with TGase activity expressed from said DNA sequences and their use in food handling and transformation.
  • the invention provides a DNA molecule, hereinafter referred to as a DNA molecule of the invention, from plants and a protein encoder with TGase activity comprising a nucleotide sequence selected from: a) the nucleotide sequence identified as SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 or a fragment thereof; and b) a nucleotide sequence analogous to the sequence defined in a),
  • analogous is intended to include any DNA sequence that can be isolated or constructed based on the nucleotide sequence shown in the SEC. ID. NO 1 or SEQ ID NO 3, for example, by the introduction of conservative or non-conservative nucleotide substitutions, including the insertion of one or more nucleotides, the addition of one or more nucleotides at any of the ends of the molecule or the deletion of one or more nucleotides at either end or inside the sequence.
  • an analogous DNA molecule is substantially homologous to the nucleotide sequence identified as SEQ. ID. NO: 1 or SEQ ID NO 3.
  • substantially homologous means that the nucleotide sequences in question have a degree of identity, at the nucleotide level, of at least 60% , preferably of at least 85%, or more preferably of at least 95%.
  • the DNA molecule of the invention is derived from corn and can be found in similar forms in other higher plant species, among others: rice, wheat, Arabidopsis, etc., where they can be naturally or otherwise, could also be as a result of a process of gene transformation in which the transformed organism reproduces said DNA molecules.
  • the DNA molecule of the invention can be isolated, by conventional techniques, from the DNA of any plant that contains it, by using probes or oligonucleotides, prepared thanks to the nucleotide sequence information of said DNA molecule. , provided in this invention.
  • the DNA molecule of the invention includes fragments thereof that exhibit said GTase activity.
  • the DNA molecule of the invention is a corn DNA molecule of SEQ TD NO 1 or SEQ ID NO 3.
  • the DNA molecule of the invention can be used, in general, in the generation of an expression vector, hereinafter the expression vector of the invention, which allows the expression of these proteins with TGase activity in a wide range of host cells.
  • the expression vector of the present invention comprises at least one DNA sequence of the invention and at least one promoter that directs the transcription of the gene of interest, to which it is operably linked, and other necessary sequences or appropriate for transcription of the gene of interest and its appropriate regulation in time and place, for example, start and end signals, cut-off sites, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators (enhancers), transcriptional silencers (silencers), etc.
  • Examples of appropriate expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each specific case among plasmids, artificial yeast chromosomes (YACs), artificial bacterial chromosomes (BACs), artificial chromosomes based on bacteriophage Pl (PACs), cosmids or viruses, which may also contain a bacterial or yeast origin of replication so that it can be amplified in bacteria or yeasts, as well as a usable marker to select transfected cells other than the gene or genes of interest. Therefore, the invention also relates to a vector comprising a DNA molecule of the invention.
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid which, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of that cell and replicated along with the host cell chromosome.
  • the vector of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art (Kovesdi et al. 1997. Curr Opin Biotech 8: 583-
  • a particular object of the present invention is plasmids pGEMT15 and pGEMT21 containing SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3, respectively.
  • the invention also provides a cell comprising a DNA molecule or expression vector of the invention.
  • the host cells that can be transformed with said expression vector can be, for example, GRAS bacterial cells and yeasts. These cells containing the expression vector of the present invention can be used for the overproduction of proteins with TGase activity encoded by the DNA molecule of the present invention.
  • a particular object of the present invention is a protein with TGase activity, among others, with an amino acid sequence as described in SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4. These results allow new possibilities to transform a GRAS bacterial system to be opened. (Generally Recognized as Safe) or a yeast that would serve, through heterologous expression, to produce the mentioned new TGase proteins.
  • a protein with TGase activity can be used in multiple food handling, processing and transformation processes thanks to its ability to create covalent bonds between different proteins.
  • This property has been used for example to maintain the texture of foods such as fish and meat, reducing the need to use salts see US5928689 "Method for treating PSE meat with transglutaminase", WO0162888 "Improved composition of marine product”; for the formulation of gelatins of different density; to prepare cooked with less fat (tofu) see US 6342256 “Tofu produc ⁇ s excellent in freeze resistance and process for producing the same", US6042851 "Process for producing packed to ⁇ u”.
  • TGase activity proieins of the present invention are examples of the potential uses of the TGases of the present invention. Therefore, a particular object of the present invention is the use of TGase activity proieins of the present invention, among others, the proteins SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4, or solutions containing them, in handling, Food preparation and transformation.
  • the Chiya Kuraishi e ⁇ al review, 2001 Transglu ⁇ aminase: lis u ⁇ iliza ⁇ ion in ihe food indus ⁇ ry Food Reviews International 17 (2): 221-246
  • DNA molecule or expression vector of the invention can be used in genetic transformation procedures of plains for the purposes of human research and in the development of transgenic plaques with new capabilities caused by the manipulation of the functions attributed to said TGase ( plant growth and development, morphogenesis, photosynthesis and cell death) by altering the expression of said proteins.
  • negative phage 13 which does not contain any TGase cDNA.
  • Calcium the proieic extract and in the absence of calcium.
  • GTP addition of 1 mM of GTP.
  • MDC addition of 1 mM MDC.
  • a 40 mg proiein / ml.
  • b 60 mg pro ⁇ / ml.
  • c 80 mg proi./ml.
  • Example 1 Isolation and cloning of two cDNAs that code for two proteins of the corn transglutaminase family by immunographing.
  • the cDNAs of the present invention were isolated from a cDNA expression bank in Lambda-ZAP II ®, constructed with the EcoRI and Xhol targets, starting from two week old seedling messenger RNA from Zea mays subsp. mays, cultivate homozygous B73, growing under greenhouse conditions (donated by Dr. Alice Barkan, from the University of Oregon, USA). Antibody used in the immunographed
  • a 58 kDa plant transglutaminase purified from Helianthus tuberosus leaf chloroplast extracts was used as an antigen.
  • a polyclonal antibody was obtained in chicken (Villalobos, E., Torné, JM, Ollés, C, Claparols, I. & Sanios, MA 2001. Subcellular location of a translucently related to grana development in different maize cell types. Prooplasm. 216: 155-163).
  • the specificity of the antibody was determined by the technique of "do ⁇ blo ⁇ ", using commercial pig liver ostraglulaminase, as well as by western blo ⁇ with purified proiein (Dondini, L. 1998.
  • the complementary methodology is described in our work: Villalobos, E., Torné, JM, Ollés, C, Claparols, I. & Sanios, MA 2001. Subcellular localization of a transglutaminase related to grana developmen ⁇ in differen ⁇ maize cell ⁇ ypes. Pro ⁇ oplasma. 216: 155-163). Immunographed from the bank.
  • a colony of strain XL-Blue® is inoculated in liquid LB medium containing MgSO4 (1M) and 20% maltose. After culturing the bacteria until reaching an OD of 2.0 (600 nm), the bacterial culture is mixed with 4.5 x 10 4 pfu of the library, to which 10 mM EPTG is added. After infection and inoculation in plates with the LB + 10 mM MgSO4 medium, a disk of nitrocellulose saturated with 10 mM TPTG is placed on them. After incubating the plates with the filter for 4 hours, they are cooled and the filter is washed with PBS. Finally, once the membrane is blocked with skim milk or BSA, it proceed to development and labeling with antibody. To identify the lysis where the positive phages are found that have to be injected with the antibody against the
  • Transgluiaminase of H. ruberosus a wes ⁇ ern blo ⁇ analysis of said membrane is performed and revealed on a photographic plate, mediated by ECL reagent.
  • the culture medium that selects the transforming colonies is LB-agar added with Ampicillin (50 ⁇ g / ml), 1 mM IPTG and the X-Gal substrate (40 ⁇ g / ml), of the enzyme ⁇ -galaclosidase, whose gene is interrupted by the insert or cDNA.
  • the isolation of the plasmid DNA is performed by means of the small-scale MINEPREP technique of bacterial lysis using SDS and NaOH, neutralized with potassium acetate, and purified with a phenol mixture: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) and precipitating with ethanol. It is subsequently resuspended in TE IX Buffer added with the enzyme RNase.
  • the purified messenger RNA is obtained by polydT column, which is used as a template for the synthesis of single stranded DNA.
  • polydT column which is used as a template for the synthesis of single stranded DNA.
  • a specific oligonucleoid deduced from the known cDNA sequence oligo El, 3'-5 ': GATTCTCCCTGATAAG, SEQ ID NO 5
  • the reverse transcripry enzyme are used.
  • TdT terminal deoxytransferase
  • the sequence of the cycles was as follows: first 2 minutes at 94 ° C and then 34 cycles of: 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 46 ° C for oligo n ° l, but 30 seconds at 60 ° C for oligo n ° 2, followed in both cases for 7 minutes at 72 ° C. Finally leave a few hours at 5 ° C.
  • the PCR product is cloned into a suitable vector (such as pGEMT), using the enzyme ligase. Then, E. coli strains of the DH5-alpha type are transformed and the bacteria are grown in a selective medium. Plasmid DNA is extracted by means of the Miniprep technique, already described, purified and the fragment obtained is sequenced.
  • nucleoid complex coding sequences including the four nucleolides obtained with the RACE technique, are described in SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3, respectively.
  • Expression vectors containing the SEQ ID sequences NO 1 and SEQ ID NO 3 and used for the transformation of host cells are plasmid pGEMT15 and pGEMT21, respectively.
  • amino acid sequences obtained from the nucleoid sequences have homologies with the transgluiaminase-like active center domains of other non-vegetative systems described in the zone corresponding to amino acids: 431-474 for the protein of SEQ ID NO 2 ( 60.97 kDa) and 485-528 for the prolein of SEQ ID NO 4 (67 kDa).
  • a cistern (Cys) was described in both cases as an essential amino acid for enzyme activity (Cys439 in SEQ ID NO 2 and Cys493 in SEQ ID NO 4). Daios Base consulted: www.ncbi.nlm.nih /).
  • Example 2 Verification of the transglutaminase activity of the proteins expressed by said cDNA. Determination of the TGase activity of the protein expressed by the cDNA.
  • An enzyme extract is prepared with each of the lysis extracts obtained with both phages ( ⁇ containing the TGase of SEQ ID NO 2 and £ 2 containing the TGase of SQ ID NO 4), at a concentration of loyal proieins of 600 ⁇ g, and an enzymatic assay is performed at 30 ° C for 30 minutes.
  • the enzyme mixture contains, in addition to the protein extract, 0.6 mM of putrescine, 185 kBq of tri-putrescine (0.85 TBq / nmol), 20 mM of Tris.ClH pH 8 lantern and 3 mM of CaCl 2 .
  • the reaction is blocked with 10% trichloracetic acid containing 2 mM putrescine.
  • TGase activity is measured in pmres of putrescine per milligram of protein and per hour and was higher in the proieic strains obtained from phage fl and £ 2 with respect to the extract from a phage that does not contain any of the cDNA of TGasa esias .
  • This test consists of a ki ⁇ supplied by Covalab®, which determines, from small amounts of io ⁇ al protein, the TGase activity of the notch, compared to that of a commercial TGase of pig liver.
  • the method deletes the gluiamyl derivatives formed from the peptide and the polyamine substrate, by TGase activity of the sample, by a colorimetric assay.
  • the activity is measured in Units of TGase (U), considering that 0.6 mU of commercial TGase corresponds to an absorbance value at 450 nm of 1 ⁇ 0.05 OD.
  • the two proic exlracios corresponding to the two lysis products show TGase type activity in the two methods of detecting said activity used and described above (fl and £ 2) compared to the extract from a phage that does not contain any of these cDNA (f3).
  • the data is shown in Figures 1 and 2.

Abstract

La invención proporciona una molécula de ADN proveniente de maiz y codificante de una proteína con actividad TGasa, asícomo un vector de expresión génica que comprende esta molécula de ADN. Un objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de dicha molécula de ADN o vector para producir células transformadas capaces de expresar proteínas recombinantes con actividad TGasa, o para introducir dicha secuencia codificante de una proteína con actividad TGasa en células de plantas. Las células de microorganismos y las plantas transgénicas resultantes también constituyen objetos adicionales de esta invención. Además, estas proteínas con actividad TGasa expresadas a partir de dichas secuencias de ADN pueden ser empleadas, entre otros usos, en la manipulación, procesamiento y transformación de alimentos.

Description

SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS DE MAÍZ CODIFICANTE DE UNA PROTEINA CON ACTIVIDAD TRANSGLUTAMINASA, Y SU USO.
SECTOR DE LA TÉCNICA
La invención se relaciona con la identificación de nuevas proteínas de origen vegetal con actividad TGasa y su uso en el campo de la manipulación, procesamiento y transformación de alimentos y en el desarrollo de plantas transgénicas con nuevas capacidades.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las transglutaminasas (TGasa; EC2.3.2.13) (R-glutaminil-peptido-aminasa-γ- glutamil transferasa) catalizan uniones amidas entre un grupo amino primario de una poliamina o de una lisina (donador amino) y un grupo γ-carboxiamida de un residuo glutamil de algunas proteínas (amino receptor), mediante una reacción intermedia por la que el enzima se une al sustrato por reacción entre el grupo γ-carboxiamida del residuo glutamil de la proteína y un grupo sulfidrilo de un residuo de cisterna del centro activo del enzima (Serafini-Fracassini, D., Del Duca, S., & Beninati, S. 1995. Plant Transglutaminases. Phytochemistry 40: 355-365). El resultado de la actividad de la
TGasa es: a) la modificación de la conformación de la propia proteína y b) otros cambios de conformación más extensos como resultado de uniones entre la misma proteína y entre proteínas diferentes para formar conjugados de elevado peso molecular.
Existen estudios con TGasas en humanos, también en animales, plantas, vertebrados inferiores, algunas bacterias, algas y levaduras (Makarova, K.S., Aravind, L. & Koovin, EN. 1999. A superfamily of archaeal, bacterial, and eukaryotic proteins homologous to animal transglutaminases. Protein Science 8:1714-1719; Bergamini, C.M., Dean, M., Tanfani, F., Ferrari, C. & Scatturin. 1999. Conformational stability of human erythrocyte transglutaminase: patterns of thermal unfolding at acid and alkaline pH. Eur. J.Biochem. 266:575-582.; Cariello, L., Ristoratore, F. & Zanitti, L. 1997. A new transglutaminase-like from ascidian Ciona intestinalis. FEBS Lett 408:171-176; Lorand, L. & Conrad, S.M. 1984. Transglutaminases. Mol Cell Biochem 58:9-35; Serafíni-Fracassini, D., Del Duca S. & Beninati S. 1995. Plant Transglutaminases. Phytochemistry 40:355-365 ; Tokunaga, F., Muta, T., Iwanaga, S., Ichinose, A., Davie, EW, Kuma, K. & Miyata, T. 1993. Limulus hemocyte transglutaminase. cDNA cloning, amino acid sequence and tissue localization. J Biol Chem 268:262-268). Las TGasas más conocidas son: el factor XIII de la coagulación de la sangre, que es una proteína del plasma, y la TGasa K implicada en la formación de la capa córnea de la epidermis. Por otro lado, ya han sido clonados algunos de los genes responsables de algunas de las TGasas citadas y se va conociendo la implicación de las TGasas en importantes procesos como la diferenciación celular, la estabilización de tejidos o la muerte celular programada (Ichinose, A., Bottenus, R.E. & Davie E.W. 1990. Structure of transglutaminases. J. of Biol. Chemistry. 265(23): 13411-13414; Bergamini, C.M., Dean, M., Tanfani, F., Ferrari, C. & Scatturin. 1999. Conformational stability of human erythrocyte transglutaminase: patterns of thermal unfolding at acid and alkaline pH. Eur. J.Biochem. 266: 575-582; Nemes ,Z., Marekov, L.N. & Steinert, P.M. 1999. Involucrin cross-linking by transglutaminase 1. J. of Biol. Chemistry. 274(16): 11013- 11021). También estas enzimas parecen estar implicadas en enfermedades neurodegenerativas, tumores, enfermedades celíacas, etc, por ello son un grupo de enzimas de alto interés en los estudios clínicos. En torno a estos estudios clínicos existen diferentes patentes relacionadas con TGasas: US5,736,132 "Method of promoting adhesión between tissue surfaces" solicitada por Orthogene, Inc. 1998; US 5,726,051 "Transglutaminase gene" solicitada por Oklahoma Medical Research Foundation, 1998.
La función de las TGasas vegetales es menos conocida aunque los primeros datos sobre su existencia se publicaron hace ya unos años (Icekson I. & Apelbaun, A. 1987. Evidences for transglutaminase activity in plant tissue. Plant Physiol. 84. 972- 974; Serafmi-Fracassini D., Del Duca S., & D'Orazi D. 1988. First evidence for polyamine conjugation mediated by an enzyme activity in plants. Plant Physiol. 87:757). Los estudios en plantas se han centrado sobre todo en aspectos bioquímicos relacionados con la actividad, sustratos sobre los que actúa y tejidos donde abunda, pero no se ha estudiado su papel funcional en los muchos procesos en que se tienen datos parciales sobre su intervención, como son: crecimiento y desarrollo, morfogénesis en general, fotosíntesis y muerte celular (Margosiak, S.A., Drama,A., Bruce-Carver, M.R., González, A.P. Louie, D. & Kuehn. 1990. Identification of the large subunit of ribulosel,5-bisphosphate carboxylase/oxigenase as a substrate for transglutaminase in Medicago sativa L. (Alfalfa). Plant Physiol. 92: 88-96; Del Ducca, S., Tidu, V., Bassi, R., Expósito, C, & Serafíni-Fracassini, D. 1994. Identification of chlorophyll-a/b proteins as substrates of transglutaminase activity in isolated chloroplasts oϊHelianthus tuberosus L. Planta 193: 283-289; Del Ducca, S., Della Mea, M., Muñoz de Rueda, P. & Serafini-Fracassini, D. 2000 Factors affecting transglutaminase activity catalizing polyamine conjugation to endogenous substrates in the entire chloroplast. Plant Physiol Biochem 38:429-439) Además, se ha de destacar que la transglutaminasa tiene un valor añadido para finalidades biotecnológicas. Esta nueva faceta suplementaria como metabolito de interés, proviene de su capacidad de crear uniones covalentes entre proteínas distintas. Esta propiedad se ha usado por ejemplo para mantener la textura de alimentos como pescado y carnes, reduciendo la necesidad de utilizar sales (surimi, etc). Para la formulación de gelatinas de distinta densidad etc. Para preparar cocinados con menos grasas (tofú). También es capaz de mantener la consistencia, elasticidad, humedad o viscosidad de un producto en diferentes temperaturas. Se usa asimismo en distintos procesados lácticos: quesos, yogures, helados, etc. Tanto es así, que actualmente se usa como "aditivo" en muchos procesados bioalimentarios, siendo la dosis recomendada en USA para este uso de 65 ppm.
Todas estas posibilidades de la TGasa han generado la formulación de diferentes patentes sobre: métodos de obtención, utilización etc. y han hecho de esta substancia un producto comercial como por ejemplo los que viene distribuyendo la empresa Ajinomoto, con el nombre de: Activa TG®. Las empresas que comercializan el producto son Ajinomoto Co. Inc de Tokio (extendida también en Norteamérica) y Rohm Enzyme de USA (www.skidmore- sales.com/whatsnew/newsletter/surnmer2001.pdf). Sin embargo, en España no se ha localizado ninguna empresa que se dedique a la producción industrial de TGasa.
La primera TGasa que se ha sobreexpresado para fines comerciales como los antes indicados, se realizó en bacterias (Streptoverticillium sp.) por la empresa Ajinomoto, quién patentó el procedimiento y las diferentes mejoras posteriores de este protocolo inicial (US5,156,956 "Transglutaminase" (1992)). Asimismo esta misma empresa tiene patentado, otro sistema similar, pero mediante la transformación de Crassostrea gigas (US5,736,356 "Transglutaminase originating from Crassostrea gigas" (1998)) y de Bacillus subtilus (US5,948,662 "Bacillus-derived transglutaminase" (1999)). En los últimos años, el grupo de investigación autor de la presente invención ha realizado asimismo trabajos previos a nivel bioquímico, sobre la implicación de la TGasa en la morfogénesis de callos de maíz y su relación con la luz (Bernet, E., Claparols, L, Dondini, L., Santos, M.A., Serafini-Fracassini, D. & Torné, J.Ma. 1999. Changes in polyamine contení, arginine and ornithine decarboxylases and transglutaminase activities during light/dark phases (of initial differentiation) in maize calluses and their chloroplast. Plant Physiol Biochem. 37(12): 899-909). Además, recientemente se ha publicado la inmunolocalización de este enzima en distintos sistemas celulares de maíz, en relación con el desarrollo de los cloroplastos (Villalobos, E., Torné, J.M., Ollés, C, Claparols, I. & Santos, M.A. 2001. Subcellular localization of a transglutaminase related to grana development in different maize cell types. Protoplasma. 216: 155-163). Sin embargo, no se han encontrado resultados sobre la identificación molecular y actividad funcional con transglutaminasas vegetales, por lo que es de alto interés comercial nuevos conocimientos sobre dichas transglutaminasas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción breve
La invención se enfrenta con el problema asociado con la escasez de TGasas de origen vegetal necesarias en el campo de la manipulación y transformación de alimentos y en el desarrollo de plantas transgénicas con nuevas capacidades. La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han identificado unas secuencias de ADN con actividad TGasa (TGasa; EC2.3.2.13) a partir del maiz. La actividad TGasa de las proteínas codificadas a partir de dichas secuencias de ADN se ha puesto de manifiesto en experimentos a partir de extractos de estas proteínas. Por tanto, un objeto de esta invención lo constituyen dichas moléculas de ADN.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un vector que comprende, al menos, una de dichas moléculas de ADN. Un objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de dichas moléculas de ADN o de dichos vectores, para producir células transformadas capaces de expresar proteínas recombinantes con actividad TGasa, o para introducir dicha secuencia codificante de una proteína con actividad TGasa en células de plantas. Las células de microorganismos y las plantas transgénicas resultantes también constituyen objetos adicionales de esta invención.
Un objeto adicional de la presente invención lo constituye las proteínas con actividad TGasa expresadas a partir de dichas secuencias de ADN y su empleo en la manipulación y transformación de alimentos.
Descripción Detallada de la invención
La invención proporciona una molécula de ADN, en adelante molécula de ADN de la invención, proveniente de plantas y codificante de una proteína con actividad TGasa que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: a) la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 o un fragmento de la misma; y b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a),
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de ADN que pueda ser aislada o construida en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. NO 1 ó a la SEQ ID NO 3, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia.
En general, una molécula de ADN análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos identificada como la SEQ. ID. NO: 1 ó SEQ ID NO 3. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La molécula de ADN de la invención procede de maíz y puede encontrarse en formas parecidas en otras especies de plantas superiores, entre otras: arroz, trigo, Arabidopsis, etc, donde pueden estar de forma natural o en otro caso, también podrían estar como resultado de un proceso de transformación génica en el que el organismo transformado reproduzca dichas moléculas de ADN. La molécula de ADN de la invención puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier planta que la contenga, mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos, preparados gracias a la información de la secuencia de nucleótidos de dicha molécula de ADN, proporcionada en esta invención.
La molécula de ADN de la invención incluye los fragmentos de la misma que presentan dicha actividad GTasa.
En una realización particular, la molécula de ADN de la invención es una molécula de ADN de maiz de SEQ TD NO 1 ó de SEQ ID NO 3.
La molécula de ADN de la invención puede ser utilizada, en general, en la generación de un vector de expresión, en adelante vector de expresión de la invención, que permite la expresión de estas proteínas con actividad TGasa en una amplia gama de células huésped. En general, el vector de expresión de la presente invención comprende, al menos, una secuencia de ADN de la invención y, al menos, un promotor que dirige la transcripción del gen de interés, al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcipción del gen de interés y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACs), cromosomas artificiales de bacteria (BACs), cromosomas artificiales basados en el bacteriófago Pl (PACs), cósmidos o virus, que pueden contener, además, un origen bacteriano o de levadura de replicación para que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras, así como un marcador utilizable para seleccionar las células transfectadas diferente al gen o genes de interés. Por tanto, la invención también se refiere a un vector que comprende una molécula de ADN de la invención. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma de la célula huésped.
El vector de la invención puede ser obtenido por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Kovesdi et al. 1997. Curr Opin Biotech 8:583-
589 Transgenic Res. 10:83-103; Coffm et al. 1998. Retroviruses, CSHLP; Robbins et al.
1998. Trends Biotech. 16:35-40; Anderson. 1998. Nature 392:25-30; Schindelhauer.
1999. BioEssays 21:76-83). Un objeto particular de la presente invención lo constituye los plásmidos pGEMT15 y el pGEMT21 que contienen las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3, respectivamente.
La invención también proporciona una célula que comprende una molécula de ADN o vector de expresión de la invención. Las células hospedadoras que se pueden transformar con dicho vector de expresión pueden ser, por ejemplo, células bacterianas y levaduras GRAS. Estas células que contienen el vector de expresión de la presente invención pueden ser utilizadas para la sobreproducción de las proteínas con actividad TGasa codificadas por la molécula de ADN de la presente invención. Un objeto particular de la presente invención lo constituye una proteína con actividad TGasa, entre otras, con una secuencia de aminoácidos según se describe en la SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4. Estos resultados permiten abrir nuevas posibilidades de transformar un sistema bacteriano GRAS (Generally Recognized as Safe) o una levadura que serviría, a través de la expresión heteróloga, para producir las mencionadas nuevas proteínas TGasas. Como se ha indicado anteriormente una proteína con actividad TGasa puede ser utlizada en múltiples procesos de manipulación, procesamiento y transformación de alimentos gracias a su capacidad de crear uniones covalentes entre proteínas distintas. Esta propiedad se ha usado por ejemplo para mantener la textura de alimentos como pescado y carnes, reduciendo la necesidad de utilizar sales véase patente US5928689 "Method for treating PSE meat with transglutaminase", WO0162888 "Improved composition of marine product"; para la formulación de gelatinas de distinta densidad; para preparar cocinados con menos grasas (tofú) véase US 6342256 "Tofu producís excellent in freeze resistance and process for producing the same", US6042851 "Process for producing packed toíu". También es capaz de mantener la consistencia, elasticidad, humedad o viscosidad de un producto en difereníes íemperaturas. Se usa asimismo en distintos procesados lácticos: quesos (US6270814 "Incorporaíion of whey inlo process cheese", solicitud US20010053398 "Cheese whey proíein having improved texture process for producing the same and use thereof "), yogures, helados, mayonesas, salsas y en la producción de fideos (EP0948905 "Enzyme preparaíions comprising íransgluíaminase and process for producing noodles", US6106887 "Process for obíaining a modified cereal flour"), de chocolate (US6063408 "Process for producing chocolate"), de producios derivados a partir de patata (solicitud US20020004085 "Methods for producing potaío producís"), de azúcar (JP2000354498 "Production of sugar from cereal flour material by íransgluíaminase treatmení"). Los distintos usos, entre oíros, descritos en las paíeníes anteriores para las TGasas son ejemplos de los potenciales usos de las TGasas de la preseníe invención. Por lo íanío, un objeto particular de la presente invención es la utilización de las proíeínas con actividad TGasa de la presente invención, entre otras, las proteínas SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4, o soluciones que las contengan, en la manipulación, preparación y transformación de alimentos. A continuación se indica como ejemplo de las aplicaciones de las proíeínas con actividad TGasa de la presente invención la revisión de Chiya Kuraishi eí al, 2001 (Transgluíaminase: lis uíilizaíion in ihe food indusíry Food Reviews International 17 (2): 221-246). Finalmente, existen oirás aplicaciones distintas de las comentadas anteriormente de las proteínas con actividad TGasa de la preseníe invención y de las que se indican como ilustración de dichas aplicaciones las siguientes paíeníes, eníre otras: -"Meíhod for enzymaíic íreaímení of wool" Patente USA. Appl. N° 161824 (1998) MacDeviít eí al, April 2000. -"Enzymaíically protein encapsulating oil partióles by complex coacervation" Appl. N° 791953 (1997). Soper, Jon C. Et al. March 2000.
-" Cross-linked gelaíin gels and meíhods of making íhem" Appl. N° 641463 (1996) Bishop, P.D. eí al. ZymoGeneíics, hιc.(Seaííle, WA. USA). -"Process for obíaining a modified cereal flour" Appl. N° 977575 Ajinomoío Co. Inc (Tokyo JP). Yamazaki el al. Augusí 2000.
-"Microbial transgluíaminase, íheir production and use" Appl. N° 294565, (1999). NovoNordisk A/S (Bagsvaerd, DK) Bech eí al. Feb. 2001. Además, la molécula de ADN o vector de expresión de la invención pueden emplearse en procedimientos de transformación genética de plañías con finalidades íanio de investigación íundameníal y en el desarrollo de plañías transgénicas con nuevas capacidades provocadas por la manipulación de las funciones atribuidas a dicha TGasa (crecimiento y desarrollo de la planta, morfogénesis, fotosíntesis y muerte celular) mediante la alteración de la expresión de dichas proteínas.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1.- Acíividad TGasa (medida en pmol de Puí incorporada) de un exíracío proteico correspondiente a cada uno de los producios de lisis fágica descrito en el apartado de metodología, correspondientes a los fagos positivos fl y £2 (que contienen un distinto cDNA de TGasa de maíz: fl= SEQ ID NO 1 y f2= SEQ ID NO 3) y al fago negativo 13 (que no contiene ningún cDNA de TGasa). Además, se muestra el efecto de distintos factores que influyen sobre la acíividad TGasa de los extractos, descritos como propios de dicha actividad enzimática TGasa en oíros sistemas: Calcio= el extracto proíeico y en ausencia de calcio. GTP= adición de 1 mM de GTP. MDC= adición de 1 mM de MDC. Figura 2.- Acíividad de los dos exíracíos proíeicos correspondientes a los dos fagos independientes que contienen los dos cDNA de la TGasa (fl= SEQ ID N° 1; £2= SEQ ID N° 2), frente a un fago que no contiene ninguno de estos cDNA (£3), con respecto a la cantidad de proieína del ensayo. La actividad se mide en miliunidades (mU) de TGasa, por incorporación de biotincadaverina, como se describe en el apartado de metodología. a= 40 mg proíeína/ml. b= 60 mg proí/ml. c= 80 mg proi./ml.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1.- Aislamiento y clonaje de dos cDNA que codifican para dos proteínas de la familia de transglutaminasas de maíz mediante inmunocribado. Banco de expresión.
Los cDNA de la présenle invención, fueron aislados a partir de un banco de expresión de cDNA, en Lambda-ZAP II ®, construida con las dianas EcoRI y Xhol, partiendo de ARN mensajero de plántulas de dos semanas de edad de Zea mays subsp. mays, cultivar homocigoto B73, creciendo bajo condiciones de invernadero (donada por la Dra. Alice Barkan, de la Universidad de Oregon, USA). Anticuerpo utilizado en el inmunocribado
Se utilizó como antígeno una transglutaminasa vegetal de 58 kDa purificada a partir de extractos de cloroplastos de hojas de Helianthus tuberosus. Se obtuvo un anticuerpo policlonal en gallina (Villalobos, E., Torné, J.M., Ollés, C, Claparols, I. & Sanios, M.A. 2001. Subcellular localizaíion of a íransgluíaminase relaíed ío grana development in different maize cell types. Proíoplasma. 216: 155-163). La especificidad del anticuerpo se determinó por la íécnica de "doí bloí", utilizando íransglulaminasa comercial de hígado de cerdo, así como por western bloí con proíeína purificada (Dondini, L. 1998. Poliammine légate e íransgluíaminasi nelle plante. PhD íesis. Universidad de Bolonia. líalia). La titulación se realizó mediante la técnica de western bloí. (La metodología compleía se deíalla en nuestro trabajo: Villalobos, E., Torné, J.M., Ollés, C, Claparols, I. & Sanios, M.A. 2001. Subcellular localization of a transglutaminase relaíed ío grana developmení in differení maize cell íypes. Proíoplasma. 216: 155-163). Inmunocribado del banco.
Una vez conocido el íííulo del banco utilizado, se inocula una colonia de la cepa XL- Blue® en medio LB líquido conteniendo MgSO4 (1M) y maltosa al 20%. Después de cultivar las bacterias hasía alcanzar una DO de 2,0 (600 nm), se realiza la mezcla del cultivo bacteriano con 4,5 x 10 4pfu de la librería, a la que se añade EPTG 10 mM. Después de la infección e inoculación en placas con el medio LB + 10 mM de MgSO4, se coloca sobre ellas un disco de nitrocelulosa saturado con 10 mM de TPTG. Después de incubar las placas con el filtro durante 4 horas, se enfrían y se lava el filtro con PBS. Finalmente, una vez bloqueada la membrana con leche desnaíada o BSA, se procede al revelado y marcado con anticuerpo. Para deíecíar las lisis donde se encuentran los fagos positivos que han de iníeraccionar con el anticuerpo contra la
Transgluíaminasa de H. ruberosus, se realiza un análisis wesíern bloí de dicha membrana y se revela en placa fotográfica, medianíe el reactivo ECL.
Excisión in vivo de los fagémidos en pBluescript SK- y selección de colonias positivas. Una vez aislados y purificados los dos fagos, que contienen los cDNAs que codifican respectivamente para una proíeína que iníeracciona con el anticuerpo, se procede a su excisión medianíe el sisíema "ExAssisí™ rníerference-Resisíaní Helper Phage (Síraíagene)". La coinfección se realizó en cepas XLl-Blue y la infección en cepas XLOLR®. El plaqueo se realiza en un medio selectivo que determina el vector utilizado (pBluescripl). En nuesíro caso, el medio de cultivo que selecciona las colonias transformantes es LB-agar adicionado con Ampicilina (50 μg/ml), IPTG 1 mM y el susíraío X-Gal (40 μg/ml), del enzima β-galaclosidasa, cuyo gen es interrumpido por el inserto o cDNA.
Aislamiento deplάsmidos a pequeña escala (MINIPREP).
Para cada excisión, el aislamiento del ADN plasmídico, que contiene el cDNA de interés, se realiza medianíe la íécnica de MINEPREP a pequeña escala de la lisis bacteriana utilizando SDS y NaOH, neutralizada con acetato de potasio, y purificada con una mezcla de fenol:cloroformo:isoamil-alcohol (25:24:1) y precipitando con etanol. Posteriormente se resuspende en Tampón TE IX adicionado con el enzima ARNasa.
Comprobación de la presencia de cDNA en el vector pBluescript. En cada caso, la comprobación de la presencia del inserto en el pBluescripí se realiza medianíe digestiones de una muestra del ADN plasmídico, obíenido con las mismas enzimas endonucleasas con las que se construyó el banco (EcoRI y Xhol). La digestión se realiza según los requerimientos de cada enzima de restricción (Tampón y temperatura). Una vez realizada la digestión, el cDNA o inserto ha quedado liberado del vector. Esto se verifica con una electroforesis convencional en gel de agarosa 0.5 % en Tampón TBE IX o TAE IX.
Secuenciaciόn (Servicio de Secuenciaciόn del IBMB, CSIC de Barcelona).
Una vez identificadas las muestras de las minipreparaciones que contienen los cDNA de interés, que resultaron ser dos en nuesíro caso, se precipiian y purifican medianíe el uso de la mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico y cloroformo puro antes del proceso de secuenciación. Las muestras a secuenciar se disovieron en agua. Determinación de la secuencia codificante completa mediante la técnica de RACE Las excisiones de los dos fagos en pBluescripí SK-, permiíieron obíener dos cDNA parciales cuya secuencia codificaníe compleía se definió mediante la lécnica de RACE. Para ello, a partir de ARN íoíal extraído de hoja de maíz, se obtiene el ARN mensajero purificado por columna de polydT, el cual se emplea como molde para la síntesis de ADN de cadena sencilla. Para ello, se utiliza un oligonucleóíido específico deducido de la secuencia de cDNA conocida (el oligo El, 3'-5': GATTCTCCCTGATAAG, SEQ ID NO 5) y el enzima íranscripíasa inversa. Después de añadir al ADN de cadena sencilla una cola de poliT medianíe el enzima "terminal deoxytransferase" (TdT), se procede a obíener la segunda cadena de ADN. Esto se realiza medianíe la íécnica de PCR utilizando el oligonucleóíido 5' RACE Abridged Anchor Primer (GIBCO BRL®), específico para ADN con cola de poliT (oligo ANCHOR 5 '-3': GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG, SEQ ID NO 6) y un segundo oligonucleóíido específico del cDNA parcial de secuencia conocida, deíallado anteriormente, y que corresponde al oligo E2 3'-5': GTTCTCCAGCATCTCCAG, SEQ ID NO 7). Con los subsiguientes ciclos de PCR se amplifica dicho ADN. La secuencia de los ciclos fue la siguiente: primero 2 minutos a 94°C y seguidamente 34 ciclos de: 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 46 °C para el oligo n°l, pero 30 segundos a 60 °C para el oligo n°2, seguidos en ambos casos de 7 minutos a 72 °C. Finalmente se deja unas horas a 5 °C. El producto de PCR se clona en un vector adecuado (como es el pGEMT), utilizando el enzima ligasa. A continuación, se transforman cepas de E. coli del tipo DH5-alfa y se crecen las bacterias en un medio selectivo. Se extrae el ADN plasmídico medianíe la lécnica de Miniprep, ya descriía, se purifica y se secuencia el fragmento obtenido. En nuestro caso, para ambas secuencias parciales de cDNA, el fragmento necesario para compleíar la secuencia codificaníe resulíó ser de solo cuatro nucleólidos. Las secuencias codificantes compleías de nucleóíidos, incluyendo los cuaíro nucleolidos obtenidos con la íécnica RACE, se encuentran descriías en la SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3, respectivamente. Los vectores de expresión conteniendo las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3 y utilizados para la transformación de las células huésped son el plásmido pGEMT15 y el pGEMT21, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos obíenidas a partir de las secuencias de nucleóíidos presentan homologías con los dominios del centro activo tipo transgluíaminasa de oíros sistemas descritos, no vegeíales, en la zona correspondiente a los aminoácidos: 431-474 para la proíeína de SEQ ID NO 2 (60,97 kDa) y 485-528 para la proleína de SEQ ID NO 4 (67 kDa). En esías zonas se encuentra en ambos casos una cisterna (Cys) descriía como aminoácido esencial para la actividad del enzima (Cys439 en SEQ ID NO 2 y Cys493 en SEQ ID NO 4). Base de Daíos consulíada: www.ncbi.nlm.nih/). Además, como se indican en las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3 se observan unas regiones de 27 nucleóíidos repelidas en tándem en ambas secuencias, SEQ ID NO 1 y SEQ ED NO 3, aunque en número distinto, de 15 y 21 repeticiones, respectivamente y con pequeñas variaciones de nucleotidos entre algunas de ellas. Hay que desíacar que esías mencionadas regiones repetidas no se han descrito anteriormente en las TGasas conocidas, por lo que son características de la molécula de ADN de la preseníe invención.
Ejemplo 2.- Comprobación de la actividad transglutaminasa de las proteínas expresadas por dichos cDNA. Determinación de la actividad TGasa de la proteína expresada por el cDNA.
Con cada uno de los dos clones de los fagos coníeniendo los cDNA de interés, se infecía un cultivo de E. coli (cepa XL-Blue), en medio de cultivo LB líquido, al que se añade IPTG 10 mM. Después de la lisis a 37°C, se cuanlifica por el método de Lowry la concentración de proíeína íolal del exíracío (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr, AL& Randall RJ. 1951. Protein measuremení wiíh íhe Folin phenol reagenl. J.Biol. Chem. 193:265-275) y con él se realizan los ensayos descritos a continuación, para determinar su acíividad íransgluíaminasa frente a un exíracío de lisis con un fago que no contiene el cDNA de interés.
1.- Método de detección de actividad TGasa mediante determinación de las proteínas marcadas con putrescina tritiada.
Se prepara un exíracío enzimático con cada uno de los extractos de lisis obtenidos con ambos fagos (ñ que contiene la TGasa de SEQ ID NO 2 y £2 que contiene la TGasa de SQ ID NO 4), en una concentración de proíeínas loíales de 600 μg, y se realiza un ensayo enzimático a 30°C durante 30 minutos. La mezcla enzimática contiene, además del extracto proteico, 0.6 mM de putrescina, 185 kBq de putrescina triíiada (0.85 TBq/nmol), 20 mM de lampón Tris.ClH pH 8 y 3 mM de CaCl2. La reacción se bloquea con ácido tricloracético al 10% conteniendo 2 mM de putrescina. Las muesíras se precipilan repetidamente y se mide la radioactividad del pelleí (Berneí, E., Claparols, L, Dondini, L., Sanios, M.A., Serafini-Fracassini, D. & Torné, J.Ma. 1999). Changes in polyamine coníent, arginine and orniíhine decarboxylases and transgluíaminase activiíies during lighl/dark phases (of initial differeníiaíion) in maize calluses and their chloroplasl. Plañí Physiol Biochem. 37(12): 899-909). La actividad TGasa se mide en pmols de putrescina por miligramo de proteína y por hora y fue mayor en los extraíos proíeicos obtenidos de los fagos fl y £2 con respecto al extracto a partir de un fago que no contiene ninguno de los cDNA de esías TGasa.
2. Método de detección de la actividad TGasa mediante ensayo tipo Elisa, utilizando CBZ-Gln-Gly como primer sustrato y biotincadaverina como segundo.
Esíe ensayo consiste en un kií suministrado por la empresa Covalab®, que determina, a partir de pequeñas cantidades de proteína íoíal, la acíividad TGasa de la muesíra, frente a la de una TGasa comercial de hígado de cerdo. El método delecía los gluíamil-derivados formados a partir del pépíido y de la poliamina sustrato, por actividad TGasa de la muesíra, mediante un ensayo coloriméírico. La acíividad se mide en Unidades de TGasa (U), considerando que 0.6 mU de TGasa comercial corresponde a un valor de absorbancia a 450 nm de 1 ± 0.05 OD.
Los dos exlracíos proíeicos correspondientes a los dos producios de lisis, muestran actividad tipo TGasa en los dos métodos de detección de dicha actividad utilizados y descritos anteriormente (fl y £2) en comparación con el extracto proveniente de un fago que no contiene ninguno de estos cDNA (f3). Los datos se muestran en las Figuras 1 y 2.
Además, en la Figura 1 se muesíra el efecto de distintos factores sobre la actividad TGasa de los exíracíos, descritos como propios de dicha actividad enzimáíica TGasa en oíros sisíemas. Así, la acíividad de la proíeína expresada disminuye significativamente: a] en ausencia de calcio, b] en presencia de 1 mM de GTP, c] en presencia de 1 mM denodansilcadaverina (MDC) y d] en el extracto de lisis con un fago que no posee el cDNA de interés (f3). Un par cultivos de la bacteria derivada de Escherichia coli, tipo dH5α, transformadas con un plásmido (pBlueScripí) que contiene un cDNA de maíz y portadoras de un plásmido que coníiene el gen que codifica la proíeína de secuencia SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4 de maíz respecíivameníe, identificados como
15TGZM02 y 21TGZM02, han sido deposiíados en la Colección Española de Cultivos
Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasoí,
46100 Burjasot, Valencia, España, el ¿7? de Mayo de 2002, correspondiéndoles el número de depósito CECT: 5705 para 15TGZM02 y 5706 para 21TGZM02, respectivamente.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Secuencia de nucleóíidos codificaníe de una proíeína con acíividad TGasa caracterizada porque proviene del maiz. 2.- Secuencia de nucleólidos según la reivindicación 1 caracterizada por la SEQ JJD NO
1.
3.- Secuencia de nucleóíidos según la reivindicación 1 caracterizada por la SEQ ID NO
3
4.- Secuencia de nucleótidos caracterizada porque presenta, con respecto a una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, un grado de identidad, a nivel de nucleóíidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 85%, o más prefereníemeníe de, al menos, un 95%.y porque codifica una proíeína con acíividad Tgasa.
5.- Vector de expresión caracterizado porque coníiene una secuencia de nucleóíidos según una cualquiera de las reivinidcaciones 1 a la 4.
6.- Vector de expresión según la reivinidcación 5 caracterizado porque pertenece, eníre oíros, al siguiente grupo: plásmido pGEMT15 y el pGEMT21.
7.- Proíeína con acíividad TGasa caracterizada porqué esíá codificada por una secuencia de nucleóíidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4. 8.- Proíeína con acíividad TGasa según la reivindicación 7 caracterizada porque pertenece, entre otras, al siguiente grupo: SEQ ID NO 2 y SEQ ED NO 4.
9.- Célula transformada caracterizada porque coníiene un vector de expresión según una cualquiera de las reivinidicaciones 5 y 6 y porque permite la expresión de proíeínas con actividad TGasa, eníre otras, las cepas E. coli CECT 5705 y 5706. 10.- Uso de la célula transformada según la reivindicación 9 en procedimientos para la producción de proíeína recombinaníe con acíividad TGasa según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8.
11.- Uso de la proíeína con actividad TGasa según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 en la manipulación, procesamiento y transformación de alimentos, eníre oíros procesos, para mantener o mejorar la textura, consislencia, elasticidad, humedad o viscosidad de alimentos como pescado, queso, yogures, helados, mayonesas y carnes, para la formulación de gelatinas de disíinía densidad y para preparar cocinados con menos grasas.
12.- Uso de los vecíores de expresión según las reivindicaciones 5 y 6 en el desarrollo de plañías íransgénicas con nuevas capacidades provocadas por la manipulación de las funciones atribuidas a dicha TGasa, enlre otras, crecimienío y desarrollo de la plañía, morfogénesis, fotosíntesis y muerte celular.
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