JP2005528104A - トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするトウモロコシヌクレオチド配列およびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、食品の操作および変換の分野および新たな能力を有するトランスジェニック植物の開発において必要とされている植物由来のTGaseが不足しているという問題に取り組むものである。
本発明は、以下から選択されるヌクレオチド配列を含む植物由来のTGase活性を有するタンパク質をコードするDNA分子(以下、本発明のDNA分子と称する)を提供する:
a) 配列番号1、配列番号3のヌクレオチド配列またはその断片;および、
b) a)の配列と類似するヌクレオチド配列。
発現バンク
本発明のcDNAは、ラムダ-ZAPII(登録商標)中のcDNA発現バンクから単離した。この発現バンクは、2週齡のZea mays subsp. mays plantulae(同型接合体 B73、温室条件下で栽培、Dr. Alice Barkan、of the University of Oregon, USAから提供)のメッセンジャーRNAから開始して、EcoRIおよびXhoI標的から得た。
使用するバンクの力価を測定した後、XL-Blue(登録商標)株のコロニーをMgSO4および20%マルトースを含有する液体LB培地に接種した。
抗体と相互作用するタンパク質をそれぞれコードするcDNAを含む2つのファージを単離および精製した後、それらを”ExAssist(商標) Interference-Resistant Helper Phage (Stratagene)”によって切り出した。共感染はXL1-Blue株にて行い、感染は XLOLR(登録商標)において行った。ディッシングは使用したベクター(pBluescript)を判定する選抜培地にて行った。本発明者らの場合、形質転換コロニーを選抜する培地はアンピシリン(50μg/ml)、1 mM IPTG およびX-Gal (40μg/ml)(酵素β-ガラクトシダーゼの基質であり、その遺伝子はインサートまたはcDNAにより壊される)を追加したLB-アガーであった。
各切り出しのために、目的のcDNAを含むプラスミドDNAの単離を、SDSおよびNaOHを用い、酢酸カリウムで中和し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)の混合物で精製し、エタノールで沈降させる、細菌溶解小規模MINIPREP技術により行った。次いでそれをRNAase 酵素を追加したTE 1xバッファーに再懸濁した。
各場合において、pBluescript中のインサートの存在の確認は、プラスミドDNAのサンプルを、バンクを作成するのに用いたものと同じエンドヌクレアーゼ酵素(EcoRIおよびXhol)で消化することにより行った。消化は各制限酵素に要求される条件(バッファーおよび温度)で行った。消化を行うと、cDNA即ちインサートがベクターから遊離する。これは常套のTBE 1XまたはTAE 1X バッファー中での0.5%アガロースゲル電気泳動によって確認した。
2つであることが判明した目的のcDNAを含むミニプレパレーションのサンプルを同定した後、これらをフェノール、クロロホルムおよびイソアミルアルコールの混合物および純粋なクロロホルムを用いて沈降させ、精製し、配列決定を行った。配列決定すべきサンプルを水に溶解した。
pBluescript SK-における2つのファージの切り出しによって2つの部分的cDNAが得られ、この全長コード配列をRACE技術によって決定した。この目的のため、トウモロコシ葉から得たトータルRNAからメッセンジャーRNAをポリdTカラムによって精製し、一本鎖DNAの合成の鋳型に用いた。これを行うために、既知のcDNA配列から推定した特異的オリゴヌクレオチド(オリゴE1,3'-5':GATTCTCCCTGATAAG、配列番号5)および逆転写酵素を用いた。末端デオキシトランスフェラーゼ酵素(TdT)により一本鎖DNAにポリTテイルを付加し、第2のDNA鎖を得た。これは以下のオリゴヌクレオチドを用いるPCR技術によって行った:ポリTテイルを有するDNAに特異的な5' RACE Abridged Anchor Primer (GIBCO BRL(登録商標)) (オリゴアンカー5'-3':GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG、配列番号6)および第2の既知の配列の上記部分的cDNAに特異的なオリゴヌクレオチドであってオリゴE2、3'-5':GTTCTCCAGCATCTCCAG(配列番号7)に対応するもの。
cDNAから発現するタンパク質のTGase活性の測定
目的のcDNAを含む2つのクローンのファージのそれぞれにて、大腸菌(XL-Blue株)培養物を液体LB培地中で感染し、それに10 mMのIPTGを添加した。37℃での溶解後、抽出物の全タンパク質の濃度をLowry法によって定量し(Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr, AL & Randall RJ. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275)、以下に説明する実験を行って、トランスグルタミナーゼ活性を測定し、目的のcDNAを含まないファージによる溶解抽出物と比較した。
両方のファージ(f1は配列番号2のTGaseを含み、f2は配列番号4のTGaseを含む)によって得た溶解抽出物のそれぞれを用いて全タンパク質濃度600μgの酵素抽出物を調製し、酵素試験を30℃で30分間行った。酵素混合物は、タンパク質抽出物の他に、0.6 mMのプトレシン、185 kBqのトリチウム標識プトレシン(0.85 TBq/nmol)、20 mMのTris-HCl* pH 8および3 mMのCaCl2を含むものとした。反応を2mMのプトレシンを含む10%トリクロロ酢酸で終了させた。サンプルを繰り返し沈降させ、ペレットの放射能を測定した(Bernet、E., Claparols, L., Dondini、L., Santos、M.A., Serafini-Fracassini, D.- & Torne, J. Ma 1999): Changes in polyamine content、arginine and ornithine decarboxylases and transglutaminase activities during light/dark phases (of initial differentiation) in maize calluses and their chloroplast. Plant Physio Biochem. 37(12): 899-909)。TGase活性は1時間あたりのタンパク質1ミリグラムあたりのプトレシンのpmolとして測定した。活性はファージf1およびf2から得たタンパク質抽出物における方が、かかるTGase のcDNAを含まないファージからの抽出物より高かった。
この試験は、少量の総タンパク質からのサンプルのTGase活性を市販のブタ肝臓TGaseと比較して測定する、Covalab(登録商標)から購入したキットによって行った。この方法により、ペプチドおよびポリアミン基質からサンプルのTGase活性によって形成されるグルタミル誘導体を比色定量試験によって検出した。活性はTGaseユニットとして測定し、ここで0.6 mUの市販のTGaseが450 nmの吸光度 1±0.05 ODに対応する。
Claims (12)
- トウモロコシ由来であり、TGase活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
- 配列番号1であることを特徴とする請求項1のヌクレオチド配列。
- 配列番号3であることを特徴とする請求項1のヌクレオチド配列。
- 請求項1から3のいずれかのヌクレオチド配列に対してヌクレオチドレベルで少なくとも60%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも95%の程度の同一性を有し、かつ、TGase活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
- 請求項1から4のいずれかのヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- プラスミドpGEMT15およびpGEMT21からなる群に属する請求項5の発現ベクター。
- 請求項1から4のいずれかのヌクレオチド配列によってコードされるTGase活性を有するタンパク質。
- 配列番号2または配列番号4のいずれかである請求項7のTGase活性を有するタンパク質。
- 請求項5または6の発現ベクターを含みTGase活性を有するタンパク質の発現を可能にする、大腸菌株「CECT」5705または5706を含む形質転換細胞。
- 請求項7または8のTGase活性を有する組換えタンパク質の産生方法における請求項9の形質転換細胞の使用。
- 食品、例えば魚、チーズ、ヨーグルト、アイスクリーム、マヨネーズおよび肉の食感、堅さ、弾力、水分または粘度を維持または向上させるため、様々な密度のゼラチンを形成させるため、そして脂肪含量が少ない加熱処理食品を調製するための、食品の操作、加工および変換における、請求項7または8のTGase活性を有するタンパク質の使用。
- 植物の成長および発達、形態形成、光合成および細胞死を含む、TGaseに起因する機能の操作によって生じる新規な能力を有するトランスジェニック植物の開発における、請求項5または6の発現ベクターの使用。
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