JP2013509178A - 修飾された中性脂質を被包するタンパク質及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
第1の態様では、本発明は、少なくとも1つの人工的に導入したシステインを含む修飾オレオシンをコードするポリヌクレオチドを提供する。用語オレオシンはステロレオシン及びカレオシンも含む。従って、修飾オレオシンは、修飾オレオシン、修飾カレオシン又は修飾ステロレオシンから選択されてもよい。一実施形態では、修飾オレオシンは修飾オレオシンである。別の実施形態では、修飾オレオシンは修飾カレオシンである。別の実施形態では、修飾オレオシンは修飾ステロレオシンである。各種類のオレオシンの例(オレオシン、カレオシン及びステロレオシン)が本明細書に記載される。
構築物
宿主細胞
TAG合成酵素も発現する宿主細胞
宿主細胞の種類
植物
植物はTAG酵素も発現する
人工的に導入されたシステインを伴う修飾されたオレオシンポリペプチド
人工的に導入されたシステインを含む修飾オレオシンとの融合タンパク質
修飾オレオシンを含む油体
修飾オレオシンとの融合タンパク質を含む油体
エマルション
組成物
本発明の油体を含む植物及びその一部
本発明の油体を含む動物飼料
油体を作出する方法
a)それぞれ少なくとも1つの人工的に導入されたシステインを含む少なくとも2つの修飾オレオシンと
b)トリアシルグリセロールと
c)リン脂質
を混ぜ合わせる工程を含む。
生体内(生体内の油体)で組み合わせるすべての成分
宿主細胞はTAG合成酵素も発現する
生体内で産生された油体を精製するための追加の方法工程
生体内で産生され、精製された油体の架橋の程度を変える追加の方法工程
試験管内(試験管内/人工的な油体)で組み合わせる成分
試験管内/人工的な油体の架橋の程度を変化させる追加の方法工程
a)本発明の修飾オレオシンをコードする少なくとも1つの核酸分子を宿主細胞に導入することと
b)修飾オレオシンを発現させるために宿主細胞を培養することを含む。
a)本発明の修飾オレオシンをコードする少なくとも1つの核酸分子とTAG合成酵素をコードする核酸分子を宿主細胞に導入することと
b)修飾オレオシンとTAG合成酵素を発現させるために宿主細胞を培養することを含む。
油体
組成物
本発明の油体を含む植物及びその一部
本発明の油体を含む動物飼料
植物
好まれる油糧種子の属はBrassicaである。好まれる油糧種子の種は、Brassica napusである。
好まれる油糧種子の属はBrassicaである。好まれる油糧種子の種は、Brassica oleraceaeである。
好まれる油糧種子の属はZeaである。好まれる油糧種子の種は、Zea Maysである。
好まれる油糧種子の属はCarthumusである。好まれる油糧種子の種は、Carthamus tinctoriusである。
好まれる油糧種子の属はHelianthusである。好まれる油糧種子の種は、Helianthus annuusである。
好まれる油糧種子の属はZeaである。好まれる油糧種子の種は、Zea Maysである。
好まれる油糧種子の属はSesamumである。好まれる油糧種子の種は、Sesamum indicumである。
好まれる貯蔵牧草の属はZeaである。好まれる貯蔵牧草の種は、Zea Maysである。
好まれる穀類生産の属は、Hordeumである。好まれる穀類生産の種は、Hordeum vulgareである。
好まれる牧草の属は、Loliumである。好まれる牧草の種は、Lolium perenneである。
好まれる牧草の属は、Loliumである。好まれる牧草の種は、Lolium arundinaceumである。
好まれる牧草の属は、Trifoliumである。好まれる牧草の種は、Trifolium repensである。
好まれる牧草の属は、Hordeumである。好まれる牧草の種は、Hordeum vulgareである。
好まれるバイオ燃料の属はMiscanthusである。好まれるバイオ燃料の種は、Miscanthus giganteusである。
好まれるバイオ燃料の属はSaccharumである。好まれるバイオ燃料の種は、Saccharum officinarumである。
好まれるバイオ燃料の属はPanicumである。好まれるバイオ燃料の種は、Panicum virgatumである。
油体
油体の安定性
人工油体
油体及び人工油体の応用
エマルション
生体水素化
オレオシン
・およそ140〜230アミノ酸残基に相当する15〜25kDa。
・タンパク質配列は、その全長に沿って4つの部分にほぼ均等に分割することができ、それは、N末端親水性領域と、2つの中央の疎水性領域(プロリンノブ又はノブによって連結された)と、C末端親水性領域に相当する。
・オレオシンのトポロジーは、親水性領域が隣接する折り畳まれた疎水性のコアを含むその物理的特性に起因する。この配置は、オレオシンに両親媒性の性質を付与し、リン脂質単層に包埋される疎水性ドメインを結果的に生じる(Tzen et al., 1992)一方で、隣接する親水性ドメインは細胞質の水性環境にさらされる。
・通常、オレオシンはシステインを含有しない。
ステロレオシン
ステロレオシンは、14残基の疎水性アンカー領域によって接続された2つの両親媒性α−螺旋(各螺旋で912残基)を含むN末端アンカー断片を含む。可溶性のデヒドロゲナーゼドメインはNADP+結合サブドメインとステロール結合サブドメインを含有する。ステロレオシンAとBの明らかな違いは、その多様なステロール結合サブドメインに存在する(Lin and Tzen, 2004)。ステロレオシンは、その疎水性ドメインにプロリンノブを有し、その親水性鎖の一方にステロール結合デヒドロゲナーゼを有する。
カレオシン
gqueryにて利用可能)によってさらなる配列を容易に特定することができる。
植物脂質の生合成
トリアシルグリセロールの生合成
葉におけるTAGの蓄積
葉の老化−TAG中間体を介した脂質の再利用
人工的に導入されたシステインを含むように操作された修飾オレオシン
修飾オレオシンとの融合タンパク質
非修飾オレオシンとの融合タンパク質
成長組織には、芽、葉、根、茎が挙げられる。好まれる成長組織は葉である。
成長組織に特異的なプロモータの例は、米国特許第6,229,067号;及び同第7,629,454;号;及び同第7,153,953;号;及び同第6,228,643号に見い出される。
花粉に特異的なプロモータの例は、米国特許第7,141,424号;及び同第5,545,546号;及び同第5,412,085号;及び同第5,086,169号;及び同第7,667,097号に見い出される。
種子に特異的なプロモータの例は、米国特許第6,342,657号;及び同第7,081,565号;及び同第7,405,345号;及び同第7,642,346号;及び同第7,371,928号に見い出される。
果実に特異的なプロモータの例は、米国特許第5,536,653号;及び同第6,127,179号;及び同第5,608,150号;及び同第4,943,674に見い出される。
ポリヌクレオチド及び断片
ポリペプチド及び断片
変異体
ポリヌクレオチドの変異体
bl2seq−iヌクレオチド1−jヌクレオチド2−FF−pblastn
パラメータ−FFは低い複雑性区分のフィルタリングをオフにする。パラメータ−pは、配列の対について適切なアルゴリズムを選択する。bl2seqは、ライン”Identities=”にて同一ヌクレオチドの数と比率の双方として配列同一性を報告する。
bl2seq−iヌクレオチド1−jヌクレオチド2−FF−ptblastx
パラメータ−FFは低い複雑性区分のフィルタリングをオフにする。パラメータ−pは、配列の対について適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性の領域を見つけ、無作為配列を含有する固定参照サイズのデータベースにて偶然、そのような一致を見るように期待できる回数の予測数である「E値」をそのような各領域について報告する。このデータベースのサイズは、Bl2seqプログラムにおける初期設定によって設定される。1よりはるかに小さい、小さなE値については、E値はそのような無作為の一致のおよその確率である。
ポリペプチド変異体
bl2seq−iヌクレオチド1−jヌクレオチド2−FF−pblastp
構築物、ベクター及びその成分
(a)構築物が形質転換される宿主細胞にて機能的なプロモータと、
(b)発現されるポリヌクレオチドと、
(c)構築物が形質転換される宿主細胞にて機能的なターミネータ
を含む。
(5’)GATCTA…….TAGATC(3’)
(3’)CTAGAT…….ATCTAG(5’)のように、
相補鎖である反復する配列である。
宿主細胞
ポリヌクレオチドを単離する又は作出する方法
変異体を特定する方法
物理的方法
コンピュータに基づく方法
ポリペプチドを単離する方法
構築物及びベクターを作製する方法
ポリヌクレオチド、構築物又はベクターを含む宿主細胞を作製する方法
構築物又及びベクターを含む植物細胞及び植物を作製する方法
植物の遺伝子操作の方法
植物
オレオシン(又はOle)_0−0は操作されたシステインを含まないオレオシンを意味する。
オレオシン(又はOle)_1−1は各親水性鎖に操作されたシステインを1つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン(又はOle)_1−3はN末端の親水性鎖に操作されたシステインを1つとC末端の親水性鎖に操作されたシステインを3つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン(又はOle)_3−1は、N末端の親水性鎖に操作されたシステインを3つとC末端の親水性鎖に操作されたシステインを1つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン(又はOle)_3−3はN末端の親水性鎖に操作されたシステインを3つとC末端の親水性鎖に操作されたシステインを3つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン(又はOle)_5−6はN末端の親水性鎖に操作されたシステインを5つとC末端の親水性鎖に操作されたシステインを6つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン(又はOle)_6−7はN末端の親水性鎖に操作されたシステインを6つとC末端の親水性鎖に操作されたシステインを7つ持つオレオシンを意味する。
実施例1:ウサギ抗ゴマ種子オレオシン抗体の創製
C末端のHisタグを含有する完全長のゴマ種子オレオシン(ヌクレオチド配列は配列番号1に示す)を大腸菌で発現させ、常法によって封入体を調製した。封入体を結合緩衝液(100mMのリン酸緩衝液、pH8.0、500mMのNaCl、8Mの尿素、及び10mMのイミダゾール)にて可溶化し、平衡化したイオン金属アフィニティクロマトグラフィ(IMAC)Niアガロース(Invitrogen)を含有するカラムに負荷した。6容の洗浄緩衝液(100mMのリン酸緩衝液、pH8.0、500mMのNaCl、6Mの尿素、及び50mMのイミダゾール)で洗浄することによって結合しなかったタンパク質をカラムから取り除いた。溶出緩衝液(100mMのリン酸緩衝液、pH8.0、500mMのNaCl、6Mの尿素、及び250mMのイミダゾール)の1容アリコートでタンパク質を溶出した。溶出した分画をSDS−PAGE/クマシー染色によって分析し、Bradfordのアッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。265μgのIMAC精製した組み換えオレオシンタンパク質を等量のフロインド完全アジュバントと混合して最終容量0.5mlとした。採血前の採血に続いて、1回目の注射をウサギの首の後ろ及び肩にて複数部位に投与した。77μgの精製オレオシンを含有する追加免疫注射を感作の後3週間と7週間で行い、9週目に予備解析のために約3mlの試験採血を行った。0.25%v/vのフェノールと0.01%v/vのメルチオレートの添加によって血清を保護し、200μlのアリコートにて−20℃で保存した。
実施例2:1以上の人工的に導入したシステイン残基を含有する修飾オレオシンの設計及び大腸菌での発現
大腸菌での発現のための多数の修飾オレオシン構築物を設計した。これらは、N末端及びC末端の親水性の鎖に1又は3のシステイン残基を含有した。構築物は、システイン残基を含有しないGenBankクローンAF091840であるゴマ種子オレオシン(配列番号16)のヌクレオチド配列及び翻訳されたポリペプチド配列に基づいた。
N末端の単一システイン(Ole−1−x) Glu3Cys
N末端の3個のシステイン(Ole−3−x) Glu3Cys、Arg12Cys、Gln23Cys
C末端の単一システイン(Ole−x−1) Gln137Cys
C末端の3個のシステイン(Ole−x−3) Gln112Cys、Lys123Cys、Gln137Cys
少なくとも1つの人工的に導入したシステインを含有する修飾オレオシンの大腸菌における発現と精製
ドットブロットを用いて、システインを伴わないオレオシンに結合する実施例1に記載した抗ゴマ種子オレオシン抗体(Ab)の能力を、システインを含有するオレオシン(実施例2に記載)に対して比較した。事前に平衡化したHybond−PPVDF転移膜上で12〜0.25ngに連続希釈したOle−0−0とOle−1−3とOle−3−1のスポットを作った。これを一次抗体としての1:2000の抗ゴマ種子オレオシン抗体と共にインキュベートした。次いでブロットを適当な二次抗体と共にインキュベートし、化学発光によって発色させた(図7)。結果は、免疫ブロットでは、抗ゴマ種子オレオシン抗体は、システイン残基を伴ったオレオシンよりもシステイン残基を伴わないオレオシンに対して一桁感度が高いことを示す。異なった感度の結果として、免疫ブロットによる解析のためのゲルには異なった量の組換えタンパク質を負荷することが必要だった。均一ではないレーンの負荷にもかかわらず、単量体とオリゴマーの形態の間での相対的な分布という点でレーン間にて異なったオレオシンを比較することは未だ可能である。
実施例4:少なくとも1つの人工的に導入されたシステインを含有し、架橋の程度を変えている大腸菌で発現させた修飾オレオシンを伴った人工的な油体の創製
次いで150μg又は1mgの組換えオレオシンを含有するように計算した実施例3に記載された上清のアリコートを乾燥させることによって人工的な油体(AOB)を調製した。
AOBの完全性の定量的判定
水中油エマルションは高温ではあまり安定ではない;従って、種々の数の導入システインを持つ修飾オレオシンが高温でのAOBの完全性に影響するかどうかを検討するのは興味深い。これを達成するために、本出願者らは95℃のリン酸緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH8、100mMのNaCl)にてOB及びAOB(異なったオレオシンを含有する)の完全性を判定する(上記方法を用いて)。AOBを2時間加熱する。完全性は上記のように判定する。
ジスルフィドの狙いの1つは、第一胃の微生物叢による生体水素化からのある程度の保護を提供することである。第一胃液によるAOB安定性の評価は以下のように評価することができる。AOBを等量の第一胃液(25μl)に加える。39℃にて試料を0、15、30、60、120及び240分間インキュベートし、インキュベートの終了時に等量の負荷緩衝液(Invitrogen)を加え、混合し、70℃にて1時間加熱する。SDS−PAGE/免疫ブロットによって15μlの各試料/負荷緩衝液混合物を比較する。完全性は上記のように判定する。
制御可能で反復可能な高度に分解性の環境にて修飾オレオシンの影響を検討するために、1:1(g/gタンパク質)のプロテイナーゼK(Invitrogen)を含有するリン酸緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、pH8、100mMのNaCl)にて37℃で4時間インキュベートした後、AOB(異なった修飾オレオシンを含有する)の完全性を判定する(上記の方法を用いて)。プロテイナーゼKの最大活性は65℃未満で達成されるが、AOBの不安定性に対する温度の影響を減らすためにさらに低い温度を用いる。完全性は上記のように判定する。
実施例5:1以上の人工的に導入されたシステインを含有する修飾オレオシンの設計及び植物体内での発現
本出願者らは、N及びCの末端鎖で異なった数のシステインを持つゴマ種子オレオシンの個々のコーディング配列(GenBankクローンAF091840に基づく)を合成した。コーディング配列には5’NotI部位と3’NdeI部位が隣接した。attL1部位、NotI部位及びNdeI部位に続くnos停止配列、前向きCaMV35Sプロモータ、シロイヌナズナのDGAT1(S205A)(配列番号11〜20及び図1〜5)に加えてそれ自体のUBQ10イントロン、attL2部位を含有する別個のアクセプターカセットを合成した。異なった数のシステインを持つゴマ種子オレオシンはNotI部位とNdeI部位を介して個々にアクセプターカセットに移した。次いでLR組換え反応を介して、これら完成したカセットのそれぞれを植物バイナリーベクターpRSh1、図6に移した(Winichayakul et al., 2008)。これによってオレオシンをCaMV35Sプロモータ(pRSh1の中にすでに含有された)の下流に置き、nosターミネータ(pRSh1の中にすでに含有された)をシロイヌナズナのDGAT1(S205A)(図1〜5)の下流に置いた。ゴマ種子オレオシン(システインを伴った)とDGAT1をコードするヌクレオチド配列をシロイヌナズナでの発現について最適化し、これには、コドン頻度、GC含量の最適化、隠れたスプライス部位の除去、mRNA不安定配列の除去、ポリアデニル化部位と思われる部位の除去、及び3ヌクレオチド停止コドンの付加が含まれた(Brown et al, 1990; Beelman and Parker, 1995; Rose, 2004; Rose and Beliakoff, 2000; Norris et al., 1993)。
システインを含有するゴマ種子オレオシンによるシロイヌナズナの形質転換
実施例6:少なくとも1つの人工的に導入されたシステインを含有する修飾オレオシンを持つ油体のシロイヌナズナ種子からの抽出及び精製
砂のヘラ先と750μlの抽出緩衝液(600mMのスクロースを含有する10mMのリン酸緩衝液、pH7.5)を含有する乳鉢と乳棒により200mgの種子を粉砕することによって、又はWiggenhauserD-130ホモゲナイザーを用いて300μlの抽出緩衝液中で25mgの種子をホモジネートすることによって、実施例5に記載されたように作出された植物の種子から粗精製のOB調製物を調製した。さらなる750μlの抽出緩衝液を加え、乳鉢中のスラリーを2mlの微量遠心管に移し、ホモゲナイザー先端を抽出緩衝液ですすぎ、この容量をホモジネートした種子に加えた。次いで試料を20,000×gで5分間遠心し、これによって、沈殿物と、遊離のTAGと同様に無傷の及び崩壊した双方の油体を含有する非混和性の油層が重層した水性上清が残った。上部の油層を穏やかにチューブの横に寄せ、水性層と沈殿物を捨てた。次いで抽出緩衝液にてボルテックスすることによって油層をチューブの側面から再び再懸濁し、新しい2mlの微量遠心管に入れた。最終容量を抽出緩衝液で0.5mlに合わせた。
WiggenhauserD-130ホモゲナイザーを用い、300μlの抽出緩衝液(600mMのスクロースを含有する10mMのリン酸緩衝液、pH7.5)にて25mgのシロイヌナズナ種子(実施例5に記載されたように形質転換した植物の)を粉砕した。種子が粉々になるまで粉砕し、試料は種子からデンプンが放出されるにつれて「クリーム状」で泡だって見えた。ホモゲナイザー先端を1mlの緩衝液ですすぎ、この容量を砕いた種子に加えた。ここまでで試料を4つのロットで調製し、14,000rpmにて5分間遠心した。細いゲル負荷用の先端を用いて油層をチューブの側面に穏やかに寄せ、水性層を新しいチューブに取り移した。抽出緩衝液を用いて油層をチューブの側面から再び懸濁し、新しい2mlのチューブに入れた。最終容量を抽出緩衝液で0.5ml(チューブの側面で読み取って)に合わせ、試料を2つに分け、酸化剤(3mMのGSSG)を一方のチューブに加え、室温にて10分間インキュベートした。次いで油体調製物を等量の2×ゲル負荷緩衝液に加え、5分間煮沸した後、ゲルに負荷した。
吸収(OD600)、血球計算盤を用いたAOBの直接的計数、又は顕微鏡による合体の視覚的評価のいずれかを用いたOBの安定性と完全性の評価は、高度に変化しやすいことを示し、とりわけ、試料採取前の撹拌の程度、取り出した試料の量、顕微鏡下に置かれた時間によって影響を受けた。これを回避するために、本出願者らは、完全性を比較する手段として、種々の処理の間、OBから周辺媒体に放出されるTAGの量を定量するための試料採取法を考案した。AOB緩衝液(250μlのGCガラス挿入チューブにてOBの試料中プロテイナーゼK[PNK]と総タンパク質の比が1:1で使用するときPNKを含有する)を用いて、本質的に等量の(TAGとタンパク質のBradfords測定のFAMES−GC/MS概算に基づく)OB調製物を総容量200μlで作製し、プラスチックの蓋で覆った。処理(温度の上昇又はPNKへの暴露)に続いて、15μlの魚油(Vitamax(登録商標)、オーストラリア)を試料に加え、ボルテックスで混合し、その後、5,200gにて1分間遠心した。魚油の添加とその後のボルテックスによって、OBから漏れ出したTAGが添加された魚油と混合するのが可能になり、短い遠心により浮かばせることができる。4μlの油相を採取し、脂肪酸メチルエステル化(FAME)に供し、次いで、Browseら(1986)によって記載されたように、GC−MS(島津、モデル番号、50mQC2/BPX70−0.25GCキャピラリーカラム(SGE)を装着した)によって解析する。添加した魚油の非存在下では、OBから漏れ出したTAGの量が少なすぎて遠心の後でさえ、採取可能な眼に見える層を形成できなかったが;そのような場合、最大容量は6μlだった。魚油とゴマ油の非常に異なった液体特性によって我々は、添加したTAGから漏れ出したTAGを容易に区別することができた。
水中油エマルションは高温ではあまり安定ではない;従って、種々の数の導入システインを持つ修飾オレオシンが高温でのOB及びAOBの完全性に影響するかどうかを検討するのは興味深い。これを達成するために、本出願者らは95℃のリン酸緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH8、100mMのNaCl)にてOB(異なったオレオシンを含有する)の完全性を判定する(上記方法を用いて)。AOBを2時間加熱する。完全性は上記のように判定する。
ジスルフィドの狙いの1つは、第一胃の微生物叢による生体水素化からのある程度の保護を提供することである。第一胃液によるOB安定性の評価は以下のように評価することができる。OBを等量の第一胃液(25μl)に加える。39℃にて試料を0、15、30、60、120及び240分間インキュベートし、インキュベートの終了時に等量の負荷緩衝液(Invitrogen)を加え、混合し、70℃にて10分間加熱する。SDS−PAGE/免疫ブロットによって15μlの各試料/負荷緩衝液混合物を比較する。完全性は上記のように判定する。
制御可能で反復可能な高度に分解性の環境にて修飾オレオシンの影響を検討するために、1:1(g/gタンパク質)のプロテイナーゼK(Invitrogen)を含有するリン酸緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、pH8、100mMのNaCl)にて37℃で4時間インキュベートした後、OB(異なった修飾オレオシンを含有する)の完全性を判定する(上記の方法を用いて)。プロテイナーゼKの最大活性は65℃未満で達成されるが、OBの不安定性に対する温度の影響を減らすためにさらに低い温度を用いる。完全性は上記のように判定する。
実施例7:シロイヌナズナの葉における油体の産生
ほとんどの植物(Lolium perenneを含む)では、葉の脂質の大半はグリセロールに結合し、ジアシルグリセロールとして存在する。それらは脂質二重層に取り込まれ、そこで複数の細胞内小器官の膜として又は細胞自体の膜として機能する。葉における脂質二重層の大半は葉緑体チラコイド膜である。少量の葉脂質はクチクラ外層ワックスとして存在し、さらに小さな比率がトリアシルグリセロール(TAG)の形態で存在する。
DGAT1(S205A)とゴマ種子オレオシン構築物(Oleo_0−0又はOleo_1−1又はOleo_1−3又はOleo_3−1又はOleo_3−3のいずれか、配列番号11〜20、図1〜5)を過剰発現しているトランスジェニックシロイヌナズナの葉から油体を抽出することができる。
Ole_3−3株は、DGAT1(S205A)と同時発現させた場合、TAGの形態で高い脂質レベルの相当なレベルを有したが、Ole_0−0を含有する株はDGAT1過剰発現対照を超える高い脂質レベルを有さなかった。Ole_1−1、Ole_1−3及びOle_3−1は、葉における脂質蓄積のレベルと各鎖で操作されたシステインの数の増加との間に相関があることを示した(表3)。
・鎖の長さ−追加の残基が付加してシステインのための空間を作ると、OBを移動する自由度によって接触する能力が限定されるので、結局のところ、疎水性ドメインの相互作用の程度は低下する。
・+、−、及び両親媒性の残基の比率を維持すること−これら残基の均衡とこれら残基の分布が劇的に変化すると、親水性鎖がOBの表面と実際には相互作用しなくなるので、リパーゼや合体に対する保護を提供しなくなる。
・イオウの利用性−オレオシン分子当たりのシステインの数を増やすことは、イオウが限定されていれば、植物を栄養的ストレス下に置くことになる。
5つのジスルフィド・オレオシン/DGAT1(S205A)遺伝子構築物と対照1つ(DGAT1(S205A)を含有するが、オレオシンを含有しない構築物)を植物バイナリーベクターpRSh1に移し(Winichayakul et al., 2008)、アグロバクテリウムが介在する形質転換によって野生型シロイヌナズナを形質転換した。
シロツメクサ(白クローバ)の形質転換は、Voiseyら(1994)の手順に従って実施した。
葉(及び種子)における油体集合体の判定
種子にてオレオシンタンパク質を過剰発現するホモ接合性株の種子を発芽させて2、3、4又は5週間成長させた。誘導体化させることなく、遊離の脂肪酸、ジアシルグリセリド、ワックスエステル、ステロールエステル及びトリアシルグリセリドの分離と特定を可能にするRTX65TG Restekカラムを用いたGC/MSと同様にFAMES GC/MSのために十分な葉材料を回収した。
10mgの凍結乾燥した葉粉末を13×100mmのネジ蓋付きチューブに入れ、10μlの非メチル化内部標準(C15:0FA、4mg/ml、ヘプタンに溶解した)を加えた。この混合物に、水スカベンジャーとしての5%の2,2−ジメトキシプロパンで処理した1mlのメタノール性HCl試薬(無水メタノールを用いて1Mに希釈した3M溶液の1ml)を加えた。次いでN2気体でチューブをフラッシュし、次いでテフロン(登録商標)製の蓋で直ちに封をし、80℃で1時間加熱した。チューブを室温に冷却した後、10μlの事前にメチル化した標準(ヘプタンに溶解したC17:0の4mg/ml)を加えた。この混合物に0.6mlのヘプタンと1.0mlの0.9%(w/v)NaClを加え、ボルテックスによって十分に混合した。室温にて500rpmで1分間遠心した後、100μlの上層(ヘプタンを含有する)を回収し、GC/MS解析用の茶色のバイアルに組み込んだ平底のガラス製インサートに移した。
SGEキャピラリーカラムBPX70(50m×0.22mm×0.25μm)を用いてFAMES GC/MSを解析した。GC/MSの条件は以下のとおりであった:温度は、15℃/分で80℃から150℃まで、次いで8℃/分で250℃までにプログラムし、10分間等温に保持した。試料はスプリット方式で注入し;28.4ml/分の全流量;0.82ml/分のカラム流量;及び3.0ml/分のパージ流量。圧力は150kPaで保持し、イオン源温度は200℃であり、界面温度は260℃保持した。50m/zで開始し、350m/zで終了する走査方式で質量分光法によって標的化合物を取得した。
Ruiz−Lopezら(2003)の改変された方法を用いてTAGを抽出した。手短には、各TAGの解析について、風袋重量を測ったネジ蓋付きチューブに34〜80mgの間の凍結乾燥した葉粉末を入れ、秤量し、MeOH中0.17MのNaClを2.4ml加え、ボルテックスによって混合した。4.8mlのヘプタンと10μlの内部標準(C14:0、10μg/μl)を加えた後、懸濁液を穏やかに混合し、振盪することなく80℃の水槽にて2時間インキュベートした。室温に冷却した後、上相(脂質を含有する)を新しいネジ蓋付きチューブに移し、N気体のもとで乾燥するまで蒸発させた。最終的に、乾燥させた粉末を100μlのヘプタンに再懸濁し、十分に混合し、TAG分析用の茶色のガラスバイアルに組み込んだ平底のガラス製インサートに移した。
Hewlett Packard(HP)のGCとShimadzu Scientific Instruments社のMS(QP2010)にてTAGの分析を行った。分析はすべて、電子衝撃(EI)イオン化方式におけるRESTEKキャピラリーカラムMXT−65TG(65%ジフェニル/35%ジメチルポリシロキサン、30.0m×0.10μm厚さ×0.25mm直径)にて行った。キャリア気体としてヘリウムを使用した。試料はすべて、1.0μlアリコート及び1.2ml/分のカラム流量にてスプリットレス方式で注入した。ガスクロマトグラフは、15℃/分で200℃から370℃までプログラムし、370℃で15分間等温を保持した。試料注入ポートの温度は350℃、カラムオーブンの温度は200℃に維持し、131.1kPaの圧力及び3.0ml/分のパージ流量とした。質量分光法の条件は以下のとおりであった:イオン源温度はGC・MS実行の間260℃で維持し、質量スペクトルは、70eVのイオン化電圧、60μAの放射電流及び350℃の界面温度で得た。取得方式は走査当たり5000、0.25秒の速度での走査によった。45m/z〜1090m/zの電荷比まで質量によるクロマトグラフのピークを9分に開始し、25分に終了して回収した。
実施例8:N及びC末端の親水性鎖にて追加のシステイン残基を含有するように操作したさらなるオレオシン、カレオシン及びステロレオシン
参考文献
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Claims (84)
- 人工的に導入されたシステインを持つ修飾オレオシンをコードするポリヌクレオチド
少なくとも1つの人工的に導入されたシステインを含む修飾オレオシンをコードするポリヌクレオチド。 - 修飾オレオシンが、そのうちの少なくとも1つが人工的に導入される少なくとも2つのシステインを含む請求項1のポリヌクレオチド。
- 修飾オレオシンがそれぞれ、
i)少なくとも2つの人工的に導入されたシステイン、
ii)少なくとも3つの人工的に導入されたシステイン、
iii)少なくとも4つの人工的に導入されたシステイン、
iv)少なくとも5つの人工的に導入されたシステイン、
v)少なくとも6つの人工的に導入されたシステイン、
vi)少なくとも7つの人工的に導入されたシステイン、
vii)少なくとも8つの人工的に導入されたシステイン、
viii)少なくとも9つの人工的に導入されたシステイン、
ix)少なくとも10の人工的に導入されたシステイン、
x)少なくとも11の人工的に導入されたシステイン、
xi)少なくとも12の人工的に導入されたシステイン、
xii)少なくとも13の人工的に導入されたシステイン、又は
xiii)少なくとも14の人工的に導入されたシステインを含む請求項3のポリヌクレオチド。 - 修飾オレオシンがN末端親水性領域で少なくとも1つのシステイン及びC末端親水性領域で少なくとも1つのシステインを含む請求項2又は3のポリヌクレオチド。
- システインがオレオシンのC末端及びN末端の親水性領域の間で実質的に均一に分布する請求項4のポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが、目的タンパク質に融合された修飾オレオシンを含む融合タンパク質をコードする請求項1〜5のいずれか1項のポリヌクレオチド。
構築物 - 請求項1〜6のいずれか1項のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物又は発現構築物。
- ポリヌクレオチド構築物がプロモータ配列に操作可能に連結される請求項7の遺伝子構築物又は発現構築物。
- プロモータ配列が植物におけるポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である請求項8の遺伝子構築物又は発現構築物。
宿主細胞 - 請求項1〜6のいずれか1項のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれか1項のポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの発現産物を発現するように遺伝子操作される宿主細胞。
- 請求項7〜9のいずれか1項の構築物を含む宿主細胞。
TAG合成酵素も発現する宿主細胞 - トリアシルグリセロール(TAG)合成酵素を発現するようにも遺伝子操作される請求項10〜12のいずれか1項の宿主細胞。
- トリアシルグリセロール(TAG)合成酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む請求項13の宿主細胞。
- 核酸がプロモータ配列に操作可能に連結される請求項14の宿主細胞。
- トリアシルグリセロール(TAG)合成酵素をコードする核酸に連結されるプロモータ配列が植物において核酸配列の発現を駆動することが可能である請求項15の宿主細胞。
宿主細胞の種類 - 細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、藻類細胞及び植物細胞から選択される宿主細胞である請求項10〜16のいずれか1項の宿主細胞。
- 植物細胞である請求項10〜16のいずれか1項の宿主細胞。
植物 - 請求項18の植物細胞を含む植物。
- 請求項1〜6のいずれか1項のポリヌクレオチドによってコードされる修飾オレオシンを発現する請求項19の植物。
- 植物の成長組織で修飾オレオシンを発現する請求項19の植物。
- 植物の種子で修飾オレオシンを発現する請求項19の植物。
- 植物の花粉で修飾オレオシンを発現する請求項19の植物。
TAG酵素も発現する植物 - トリアシルグリセロール(TAG)合成酵素を発現するようにも遺伝子操作される請求項20〜23のいずれか1項の植物。
- トリアシルグリセロール(TAG)合成酵素が修飾オレオシンと同じ組織で発現される請求項24の植物。
- 好適な対照植物の約0.5〜約4倍多い総脂質を発現する請求項19〜25のいずれか1項の植物。
人工的に導入されたシステインを伴う修飾オレオシンポリペプチド - 請求項1〜6のいずれか1項のポリヌクレオチドによってコードされる修飾オレオシン。
- 少なくとも1つの人工的に導入されたシステインを含む修飾オレオシン。
- そのうちの少なくとも1つが人工的に導入される少なくとも2つのシステインを含む請求項28の修飾オレオシン。
- i)少なくとも2つの人工的に導入されたシステイン、
ii)少なくとも3つの人工的に導入されたシステイン、
iii)少なくとも4つの人工的に導入されたシステイン、
iv)少なくとも5つの人工的に導入されたシステイン、
v)少なくとも6つの人工的に導入されたシステイン、
vi)少なくとも7つの人工的に導入されたシステイン、
vii)少なくとも8つの人工的に導入されたシステイン、
viii)少なくとも9つの人工的に導入されたシステイン、
ix)少なくとも10の人工的に導入されたシステイン、
x)少なくとも11の人工的に導入されたシステイン、
xi)少なくとも12の人工的に導入されたシステイン、
xii)少なくとも13の人工的に導入されたシステイン、又は
xiii)少なくとも14の人工的に導入されたシステインを含む請求項29の修飾オレオシン。 - N末端親水性領域で少なくとも1つのシステイン及びC末端親水性領域で少なくとも1つのシステインを含む請求項29又は30の修飾オレオシン。
- システインがオレオシンのC末端及びN末端の親水性領域の間で実質的に均一に分布する請求項31の修飾オレオシン。
人工的に導入されたシステインを含む修飾オレオシンとの融合タンパク質 - 請求項27〜32のいずれか1項の修飾オレオシンと目的タンパク質を含む融合タンパク質。
修飾オレオシンを含む油体 - 請求項27〜32のいずれか1項の修飾オレオシンを含む油体。
- 請求項27〜32のいずれか1項の修飾オレオシンを少なくとも2つ含む油体。
- 修飾オレオシンのシステイン残基間の少なくとも1つのジスルフィド結合を介して少なくとも2つの修飾オレオシンが互いに架橋する請求項35の油体。
- 修飾オレオシンが架橋しない請求項35の油体。
- 目的タンパク質に融合したオレオシンを含む融合タンパク質をさらに含む請求項34〜36のいずれか1項の油体。
- 融合タンパク質におけるオレオシンが人工的に導入されたシステインを含まない請求項38の油体。
修飾オレオシンとの融合タンパク質を含む油体 - 融合タンパク質のオレオシンがオレオシン部分にて人工的に導入されたシステインを含む請求項38の油体。
- それぞれ人工的に導入されたシステインを含む少なくとも2つの融合タンパク質を含む請求項40の油体。
- 融合タンパク質の修飾オレオシン部分におけるシステイン残基間のジスルフィド結合を介して融合タンパク質の少なくとも2つが互いに架橋する請求項41の油体。
(修飾オレオシンを含む)エマルション - 請求項27〜32のいずれか1項の修飾オレオシンを含むエマルション。
(油体を含む)エマルション - 請求項34〜42のいずれか1項の油体を含むエマルション。
(修飾オレオシンを含む)組成物 - 請求項27〜32のいずれか1項の修飾オレオシンを含む組成物。
(油体を含む)組成物 - 請求項34〜42のいずれか1項の油体を含む組成物。
- 油体と好適なキャリアを含む請求項46の組成物。
- 適当な酸化還元環境によってキャリアが緩衝化され、修飾オレオシンの所望の程度の架橋を達成する請求項47の組成物。
- 皮膚塗布用に製剤化される請求項45〜48のいずれか1項の組成物。
本発明の油体を含む植物及びその一部 - 請求項34〜42のいずれか1項の油体を含む植物又はその一部。
- 請求項34〜42のいずれか1項の油体を含む植物の成長組織。
- 請求項34〜42のいずれか1項の油体を含む植物の種子。
本発明の油体を含む動物飼料 - 請求項34〜42のいずれか1項の油体を含む動物飼料。
- 請求項19〜26及び50〜52のいずれか1項の植物又はその一部又はその組織を含む動物飼料。
方法
油体の作出方法 - 油体を作出する方法であって、前記方法が、
a)請求項27〜32のいずれか1項の修飾オレオシンを少なくとも2つ、トリアシルグリセロールと
b)リン脂質
を組み合わせる工程を含む方法。 - 作出される油体の酸化還元環境を制御することによって油体における修飾オレオシンの架橋の程度を調節する追加の工程を含む請求項55の方法。
- 修飾オレオシンの少なくとも一部が融合タンパク質の一部であり、前記融合タンパク質は修飾オレオシンと目的タンパク質を含む請求項55又は56の方法。
生体内で混ぜ合わせられる全成分(生体内油体) - a)、b)及びc)の成分が宿主細胞内で混ぜ合わせられる請求項55〜57のいずれか1項の方法。
- 修飾オレオシンが宿主細胞で発現される請求項58の方法。
- 宿主細胞が修飾オレオシンを発現するように遺伝子操作される請求項58又は59の方法。
宿主細胞がTAG酵素も発現する方法 - 宿主細胞がトリアシルグリセロール(TAG)合成酵素を発現するようにも遺伝子操作される請求項58〜60のいずれか1項の方法。
- 宿主細胞が生物の一部を形成する請求項58〜61のいずれか1項の方法。
- 生物が植物である請求項62の方法。
- 植物が好適な対照植物より約50%〜約400%多い脂質を蓄積する請求項62の方法。
生体内で産生された油体を精製するための追加の方法工程 - 細胞又は生物から油体を精製する追加の工程を含む請求項58〜64のいずれか1項の方法。
生体内で産生された精製油体の架橋の程度を変化させる追加の方法工程 - 精製油体の酸化還元環境を制御することによって、生体内で産生された精製油体における修飾オレオシンの架橋の程度を調節する追加の工程を含む請求項58〜65のいずれか1項の方法。
試験管内(試験管内での/人工的な油体)で混ぜ合わせられる成分 - a)、b)及びc)の成分を試験管内で混ぜ合わせる請求項55〜57のいずれか1項の方法。
試験管内での/人工的な油体の架橋の程度を変化させる追加の方法工程 - a)、b)及びc)の成分を混ぜ合わせる酸化還元環境を制御することによって架橋の程度を調節する追加の工程を含む請求項67の方法。
- 油体が含有される酸化還元環境を制御することによって、油体が形成された後、架橋の程度を調節する請求項68の方法。
油体 - 請求項65〜69のいずれか1項の方法によって産生される油体。
油の産生方法 - 油を産生する方法であって、油の産生を導く条件にて請求項10〜18のいずれか1項の宿主細胞又は請求項19〜26のいずれか1項の植物を培養することを含む方法。
- 好適な対照植物よりも多い油を蓄積する植物を作出する方法であって、請求項1〜6のいずれか1項のポリヌクレオチドによってコードされる修飾オレオシンを発現するポリヌクレオチドで形質転換された植物を提供することを含む方法。
- TAG合成酵素を発現するのでTAGを合成するTAG合成酵素をコードするポリヌクレオチドでも植物が形質転換される請求項72の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項のポリヌクレオチド及びTAG合成酵素をコードするポリヌクレオチドの双方によって単一植物又は植物細胞を形質転換することにより植物が作出される請求項73の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項のポリヌクレオチドで形質転換された第1の植物を、TAG合成酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換された第2の植物と交配させて、請求項1〜6のいずれか1項のポリヌクレオチドとTAG合成酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換された植物を作出することによって植物を作出する請求項72の方法。
- 植物が、好適な対照植物よりも約50%〜約400%多い脂質を蓄積する請求項72〜75のいずれか1項の方法。
- 油がTAGである請求項71〜76のいずれか1項の方法。
- 植物の成長組織で油が産生される請求項71〜77のいずれか1項の方法。
- 植物が動物飼料に加工される請求項71〜78のいずれか1項の方法。
- 植物がバイオ燃料供給原料に加工される請求項71〜78のいずれか1項の方法。
- 宿主細胞にて油体を産生する方法であって、
a)請求項1〜6のいずれか1項の少なくとも1つのポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、
b)修飾オレオシンを発現させるために前記宿主細胞を培養することを含む方法。 - 宿主細胞にて油体を産生する方法であって、
a)請求項1〜6のいずれか1項の少なくとも1つのポリヌクレオチドとTAG合成酵素をコードする核酸分子を宿主細胞に導入することと、
b)修飾オレオシンとTAG合成酵素を発現させるために前記宿主細胞を培養することを含む方法。 - 宿主細胞が油分画に加工される請求項71、77、81又は82の方法。
- 油が、燃料、オレオケミカル、又は栄養用若しくは化粧用の油、ポリ不飽和脂肪酸(PUFA)、又はそれらの組み合わせに加工される請求項83のいずれか1項の方法。
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