DE69424601T2

DE69424601T2 - Modifizierter Ölgehalt in Samen

Info

Publication number: DE69424601T2
Application number: DE69424601T
Authority: DE
Inventors: Gerard Francis Barry; Ganesh Murthy Kishore; David Martin Stark
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1993-07-12
Filing date: 1994-07-11
Publication date: 2001-01-25
Anticipated expiration: 2014-07-12
Also published as: EP0708835A1; US5498830A; EP0708835B1; JPH09500274A; EP0634491A1; US5608149A; DE69424601D1; CA2165669A1; WO1995002696A1; ES2148308T3; US6538179B1; DE69431352D1; DK0634491T3; AU7316094A; GR3034038T3; CA2165669C; AU675158B2; EP0634491B1; US5608150A; JP3539961B2

Description

Jüngste Fortschritte in der Gentechnik haben die notwendigen Werkzeuge geliefert, um Pflanzen zu transformieren, so dass sie Fremdgene enthalten. Es ist nun möglich, Pflanzen zu erzeugen, die einzigartige Charakteristika aufweisen, die von agronomischer Bedeutung und von Bedeutung für die Verarbeitung der Ernte sind. Ein solches vorteilhaftes Merkmal ist ein verbesserter Stärke- und/oder Feststoffgehalt und eine Qualitätsverbesserung bei verschiedenen Erntepflanzen. Die WO 91/19806 berichtet von der Verwendung eines Gens, das für ADP-Glukose-pyrophosphorylase (ADPGPP) kodiert, welche einen Schlüsselschritt in der Biosynthese von Stärke und Glykogen katalysiert. Das bevorzugte Gen stammt aus E. coli, und das resultierende Enzym ist eine kaum regulierte, hochaktive Variante.
Eine weitere wünschenswerte Eigenschaft ist die Verringerung von Öl in bestimmten Nahrungsmittel-Erntepflanzen, wie Erdnüssen. Eine Senkung des Lipidgehalts in den Samen bestimmter Pflanzen ist wegen gesundheitlicher Bedenken oder zwecks verbesserter Verarbeitungsqualitäten wünschenswert. Beispielsweise wäre eine Erdnussbutter mit wenigen Kalorien, mit einem höheren Stärkegehalt und geringeren Ölgehalt günstig. Auch wären Sojabohnen mit niedrigerem Ölgehalt günstiger, für die Herstellung bestimmter Produkte, wie Tofu, Sojasauce, Soja-Fleischstreckungsmittel und Sojamilch besser. Außerdem ist ein niedrigerer Ölgehalt in bestimmten, von Samen stammenden Produkten, wie Getreidestärke und Weizenmehl, wünschenswert. Uberraschenderweise zeigte es sich, dass eine solche Fettreduktion durch Expression eines Gens, das für eine deregulierte ADPGPP kodiert, wie glgC16, in den Samen erreicht wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung sieht strukturelle DNA-Konstrukte vor, die für ein ADP-Glycose-pyrophosphorylasö- (ADPGPP)-Enzym kodieren und die zur Herstellung von Samen mit verringertem Ölgehalt nützlich sind.
Bei der Durchführung von obigem ist gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von genetisch transformierten Pflanzen, die einen erhöhten Stärkegehalt aufweisen, vorgesehen, welches die Schritte umfasst:
(a) Insertieren eines rekombinanten doppelsträngigen DNA- Moleküls in das Genom einer Pflanzenzelle, welches DNA-Molekül aufweist
(i) einen Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Samen-spezifischen Promotoren,
(ii) eine strukturelle DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, welche für ein Fusionspolypeptid kodiert, mit einem Aminoterminalen Plastid-Transit-Peptid und einem ADP-Glucose-pyrophosphorylase-Enzym,
(iii) eine 3'-nicht-translatierte DNA-Sequenz, die in Pflanzenzellen wirkt, um eine Transkriptionstermination und den Zusatz polyadenylierter Nukleotide an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken;
(b) Erhalt transformierter Pflanzenzellen; und
(c) Regenerieren genetisch transformierter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen, welche Pflanzen einen erhöhten Stärkegehalt aufweisen.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes, doppelsträngiges DNA-Molekül vorgesehen, welches der Reihe nach enthält:
(a) einen Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Samen-spezifischen Promotoren;
(b) eine strukturelle DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, welche für ein Fusionspolypeptid kodiert, mit einem Amino-terminalen Plastid- Transit-Peptid und einem ADP-Glucose-pyrophosphorylase-Enzym; und
(c) eine 3'-nicht-translatierte Region, die in Pflanzenzellen wirkt, um eine Transkriptionstermination und den Zusatz polyadenylierter Nukleotide an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken, wobei dieser Promotor in Bezug auf die strukturelle DNA heterolog ist.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind transformierte Pflanzenzellen vorgesehen, die DNA enthalten, welche aus den oben erwähnten Elementen (a), (b) und (c) besteht. Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind differenzierte Ölsamen-Erntepflanzen vorgesehen, die einen verringerten Ölgehalt in den Samen aufweisen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Expression eines Pflanzengens, das in doppelsträngiger DNA-Form existiert, ist mit einer Transkription von Messenger- RNA (mRNA) von einem Strang auf die DNA durch RNA-Polymeraseenzym und die nachfolgende Verarbeitung des mRNA-Primär- Transkripts im Inneren des Zellkerns verbunden. Bei dieser Verarbeitung spielt eine 3'-nicht-translatierte Region eine Rolle, die Polyadenylat-Nukleotide an das 3'-Ende der RNA hinzufügt.
Die Transkription von DNA in mRNA wird durch eine Region der DNA reguliert, die gewöhnlich als Promotor bezeichnet wird. Die Promotorregion enthält eine Basen-Sequenz, die der RNA-Polymerase signalisiert, sich mit der DNA zu verbinden und·die Transkription der mRNA zu beginnen, wobei einer der DNA-Stränge als Matrize verwendet wird, um einen entsprechenden komplementären RNA-Strang herzustellen.
Promotoren, von welchen man weiß oder feststellt, dass sie eine Transkription von DNA in Pflanzenzellen bewirken, können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Promotoren können beispielsweise aus einer Vielfalt von Quellen, wie Pflanzen und Pflanzenviren, stammen und umfassen den verstärkten CaMV355S-Promotor und aus Pflanzengenen, wie den ssRUBISCO- Genen, isolierte Promotoren, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Wie nachstehend beschrieben, ist bevorzugt, dass der besondere ausgewählte Promotor eine ausreichende Expression bewirken können sollte, um zur Produktion einer wirksamen Menge an ADPGPP-Enzym zu führen, um die gewünschte Verringerung des Ölgehalts zu bewirken. Daher wird es bevorzugt, eine Expression des ADPGPP-Gens im Samengewebe der Pflanze und während der gesamten Samenentwicklung zu bewirken. Der gewählte Promotor sollte die gewünschte Gewebs- und Entwicklungsspezifität aufweisen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Menge an ADPGPP, die notwendig ist, um die gewünschte Verringerung des Ölgehalts zu induzieren, je nach der Pflanzenart variieren kann, und außerdem, dass eine überhöhte ADPGPP-Aktivität für die Pflanze schädlich sein könnte. Daher sollte die Promotor-Funktion durch Auswahl eines Promotors mit den gewünschten Gewebe-Expressionsfähigkeiten und annähernder Promotorstärke und Auswahl einer Transformante, die die gewünschte ADPGPP-Aktivität in den Ziel geweben erzeugt, optimiert werden. Der Weg der Selektion aus dem Pool von Transformanten wird bei der Expression heterologer Struktur-Gene bei Pflanzen routinemäßig verwendet, da es zwischen Transformanten, die dasselbe heterologe Gen enthalten, infolge der Stelle der Insertion des Gens im Pflanzengenom Unterschiede gibt. (Allgemein als "Positionseffekt" bezeichnet). Promotoren können durch Screenen einer cDNA-Bank eines Pflanzensamens auf Gene, die selektiv sind oder vorzugsweise in Samen exprimiert werden, als Samen-spezifisch identifiziert werden, wonach die Promotorregionen bestimmt werden, um Samenselektive oder Samen-verstärkte Promotoren zu erhalten. Man nimmt an, dass die meisten Enzyme, die beim Kohlehydratstoffwechsel eine Rolle spielen, Samen-spezifische Formen haben, aus welchen Samen-spezifische Promotoren erhalten werden können. Beispiele für solche Enzyme sind Saccharosesynthase, -invertase und ADPGPP (beide Untereinheiten).
Es sind mehrere Samen-spezifische Promotoren bekannt. β- Conglycinin (auch als 7S-Protein bekannt), ist eines der Haupt- Lagerproteine in der Sojabohne (Glycine max) (Tierney, 1987). Promotoren aus jedem der Gene für seine drei Untereinheiten können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die β- Untereinheit von β-Conglycinin wurde unter Verwendung des endogenen Promotors in den Samen der transgenen Petunie und des Tabaks exprimiert, was zeigt, dass der Promotor in anderen Pflanzen auf Samen-spezifische Weise wirkt (Bray, 1987). Das nachstehende Beispiel 1 veranschaulicht die Verwendung der α'- Untereinheit dieses Promotors mit einer ADPGPP in Canola. Man weiß, dass auch das Gen für das 11S-Lager-Protein der Sojabohne auf Samen-spezifische Weise exprimiert wird, und sein Promotor kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Zwei Samen-spezifische Promotoren aus Brassica napus wurden identifiziert. Es sind der Promotor für Napin und der Promotor für Cruciferin (Murphy, 1989). Die Promotoren für die für Phaseolin (aus Bohnen) und Oleosin (aus Raps, Sojabohne und anderen) kodierenden Gene sind bei der vorliegenen Erfindung ebenfalls nützlich. (Zheng, 1993)
Die Zeine sind eine Gruppe von Lager-Proteinen, die man im Endosperm von Mais findet. Genomische Klone für Zein-Gene wurden isoliert (Pedersen, 1982), und die Promotoren aus diesen Klonen, einschließlich der 15 kD, 16kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD und Gamma- Gene, konnten ebenfalls zur Expression eines ADPGPP-Gens in den Samen von Mais und anderen Pflanzen verwendet werden. Ein Endosperm-spezifischer Promotor des 19 kD-Zeins wurde identifiziert (Quattrocchio, 1990). Andere Promotoren, von welchen man weiß, dass sie in Mais wirken, umfassen die Promotoren für die folgenden Gene: waxy, Brittle, Shrunken 2, Branching-Enzyme 1 und II, Stärke-Synthasen, Debranching-Enzyme, Oleosine, Gluteline und Saccharose-Synthasen.
Beispiele für Promotoren, die für die Expression eines ADPGPP-Gens in Weizen geeignet sind, umfassen jene für die Gene für die ADPGPP-Untereinheiten, für das gebundene Granulum und andere Stärke-Synthasen, für die Branching und Debranching- Enzyme, für die reichlichen Embryogenese-Proteine, für die Gliadine und für die Glutenine. Beispiele für solche Promotoren in Reis umfassen jene für die Gene der ADPGPP-Untereinheiten, für das gebundene Granulum und andere Stärke-Synthasen, für die Branching-Enzyme, für die Debranching-Enzyme, für Saccharose- Synthasen und für die Gluteline (Zheng, 1993). Beispiele für solche Promotoren für Gerste umfassen jene für die Gene für die ADPGPP-Untereinheiten, für das gebundene Granulum und andere Stärke-Synthasen, für die Branching-Enzyme, für die Debranching- Enzyme, für Saccharose-Synthasen, für die Hordeine, für die Embryoglobuline und die Aleuron-spezifischen Proteine.
Promotoren für Gene, die für andere Proteine kodieren als für Lagerung oder Kohlehydratstoffwechsel können sich bei der vorliegenden Erfindung als nützlich erweisen. Beispielsweise hat das Acyl-Trägerprotein-Gen einen Promotor, von dem man weiß, dass er auf Samen-spezifische Weise wirkt. (Baerson, 1993). Die von einem DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung erzeugte RNA enthält auch eine 5'-nicht-translatierte Leader- Sequenz. Diese Sequenz kann von dem Promotor stammen, der für die Expression des Gens ausgewählt wurde, und sie kann spezifisch modifiziert werden, um die Translation der mRNA zu steigern. Die 5'-nicht-translatierten Regionen können auch aus viralen RNAs erhalten werden, aus geeigneten eukaryontischen Genen, oder aus einer synthetischen Gen-Sequenz. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Konstrukte, wie in den folgenden Beispielen präsentiert, beschränkt, in welchen die nicht translatierte Region von der 5'-nicht-translatierten Sequenz stamint, die die Promotor-Sequenz begleitet. Statt dessen kann die nicht-translatierte Leader-Sequenz von einem nicht verwandten Promotor oder einer Kodiersequenz, wie oben besprochen, stammen.
Die DNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung enthalten auch eine strukturelle Kodiersequenz in doppelsträngiger DNA-Form, welche für ein Fusions-Polypeptid kodiert, umfassend ein Aminoterminales Plastid-Transit-Peptid und ein ADPGPP-Enzym. Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete ADPGPP-Enzym unterliegt vorzugsweise einer verringerten allosterischen Kontrolle in Pflanzen. Ein solches unreguliertes ADPGPP-Enzym kann aus bekannten Enzymen, die eine unregulierte Enzymaktivität aufweisen, ausgewählt sein, oder es kann durch Mutagenese aus nativen Bakterien-, Algen- oder Pflanzen-ADPGPP-Enzymen, wie nachstehend genauer besprochen, hetgestellt sein. In einigen Fällen gestatten die grundlegenden Unterschiede im Wesen der Regulatoren, die die Aktivität des Wildtyp-ADPGPP-Enzyms modulieren, die Verwendung des Wildtyp-Gens selbst; in diesen Fällen erleichtert die Konzentration der Regulatoren innerhalb der Pflanzenorganellen das Ausfindigmachen einer signifikanten ADPGPP-Enzym-Aktivität.

Bakterien-ADP-Glucose-PVrophosphorylasen

Die E.coli-ADPGPP wurde als streng reguliertes Enzym gut charakterisiert. Es zeigte sich, dass der Aktivator, Fructose- 1,6-biphosphat, das Enzym aktiviert, indem er seine Vmax steigert, und indem er die Affinität des Enzyms für seine Substrate erhöht (Preiss, 1966 und Gentner, 1967). Außerdem moduliert Fructose-1,6-biphosphat (FBP) auch die Empfindlichkeit des Enzyms gegen die Inhibitoren Adenosin-5'-monophosphat (AMP) und anorganisches Phosphat (Pi) (Gentner, 1968).
Im Jahre 1981 wurde das E. coli-K12ADPGPP-Gen (glgC) zusammen mit den Genen für Glykogen-Synthase und Branching-Enzym kloniert, und das resultierende Plasmid wurde pOP12 genannt (Okita, 1981). Das glgC-Gen, welches im Jahre 1983 sequenziert wurde, enthält 1293 bp (SEQ ID NO: 1) und kodiert für 431 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2) mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von 48.762 (Baecker, 1983).
Das glgC16-Gen wurde durch chemische Mutagenese des E.coliK12-Stamms PA 601 mit N-Methyl-N'-nitrosoguanidin (Cattaneo, 1969 und Creuzet-Sigal, 1972) generiert. Beim Vergleich der Kinetik der glgC16-ADPGPP mit dem Stamm zeigte sich, dass die glgC16-ADPGPP eine höhere Affinität für ADP-Glucose in Abwesenheit des Aktivators, Fructose-1,6-biphosphat (FBP) hat, und die für die Hälfte der maximalen Aktivierung des Enzyms notwendige Konzentration des FBP war in glgC16 verringert. Die Hemmung der ADPGPP-Aktivität in glgC16 durch 5'-AMP (AMP) war ebenfalls verringert.
Die DNA-Sequenz des glg-C16-Gens ist jetzt bekannt (SEQ ID NO : 3) (Kumar, 1989). Beim Vergleich der von glgC16 abgeleiteten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) mit nicht-isogener E. coli K-12 3000 wurde eine Aminosäureänderung festgestellt: Gly 336 zu Asp (Meyer et al., 1993).
Eine Anzahl anderer ADPGPP-Mutanten wurde in E. coli gefunden. Die Expression jeder derselben oder anderer bakterieller ADPGPP-Wildtyp oder -Mutanten konnte ebenfalls verwendet werden, um die Stärkeproduktion in Pflanzen zu steigern. E. coli K12 Stamm 6047 (glgC47) sammelt während der stationären Phase etwa dieselbe Menge an Glykogen an, wie der Stamm 618 (glgC16). Der Stamm 6047 zeigt sowie 618 eine höhere apparente Affinität für FBP und eine größere Aktivität in Abwesenheit von FBP. Berichten zufolge ist jedoch das Enzym aus Stamm 6047 im Vergleich zum Enzym aus Stamm 618 empfindlicher für eine Hemmung durch AMP (Latil-Damotte, 1977).
Das glgC-Gen aus Salmonella typhimurium LT2 wurde ebenfalls kloniert und sequenziert (Leung und Preiss 1987a). Das Gen kodiert für 431 Aminosäuren mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von 45.580. Das Salmonella typhimurium LT2 glgC-Gen und das gleiche Gen aus E. coli K-12 weisen eine 90% Identität auf Aminosäure-Ebene und eine 80% Identität auf DNA-Ebene auf. Wie die E. coli ADPGPP wird die Salmonella typhimurium LT2 ADPGPP auch durch FBP aktiviert und wird durch AMP inhibiert (Leung und Preiss 1987b). Diese substantielle Konservierung in Aminosäuresequenzen lässt darauf schließen, dass die Einführung von Mutationen, die eine Verstärkung der ADPGPP-Aktivität in E. coli bewirken, in das S. typhimurium ADPGPP-Gen eine ähnliche Wirkung auf das ADPGPP-Enzym dieses Organismus haben sollte.
Eine Reihe anderer Bakterien-ADPGPPs wurde durch ihre Reaktion auf Aktivatoren und Inhibitoren charakterisiert (zwecks Überblick, vgl. Preiss 1973). Wie die Escherichia coli-ADPGPP, werden die ADPGPPs aus Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Citrobacter freundii und Escherichia aurescens alle durch FBP aktiviert und durch AMP inhibiert. Die ADPGPP aus Aeromonas formicans wird durch Fruktose-6-phosphat oder FBP aktiviert und durch ADP inhibiert. Die Serratia marcescens-ADPGPP wurde jedoch durch keinen der getesteten Metaboliten aktiviert. Die photosynthetische Rhodospirillum rubrum hat eine ADPGPP, die durch Pyruvat aktiviert wird, und keine der getesteten Verbindungen, einschließlich Pi, AMP oder ADP, inhibieren das Enzym. Mehrere Algen-ADPGPPs wurden untersucht, und es zeigte sich, dass sie eine Regulierung aufweisen, die ähnlich jener ist, die für Pflanzen-ADPGPPs gefunden wurde. Offensichtlich könnten die ADPGPPs aus vielen Organismen verwendet werden, um die Stärke- Biosynthese und -Akkumulation in Pflanzen zu steigern.

Pflanzen-ADP-Glucose-pyrophosphorylasen

Man dachte einmal, UDP-Glucose wäre das Hauptsubstrat für die Stärke-Biosynthese in Pflanzen. Es zeigte sich jedoch, dass ADP-Glucose ein besseres Substrat für die Stärke-Biosynthese ist als UDP-Glucose (Recondo, 1961). In diesem selben Bericht steht, dass ADPGPP-Aktivität in Pflanzenmaterial gefunden wurde.
Eine Spinatblatt-ADPGPP wurde teilweise gereinigt, und es zeigte sich, dass sie durch 3-Phosphoglycerat (3-PGA) aktiviert und durch anorganisches Phosphat inhibiert wird (Ghosh et al., 1966). Der Bericht von Ghosh et al. deutete an, dass die Biosynthese der Blatt-Stärke durch die Menge an ADP-Glucose reguliert wurde. Der Aktivator, 3-PGA, ist das Hauptprodukt der CO&sub2; - Fixierung bei der Photosynthese. Während der Photosynthese würden die Mengen an 3-PGA zunehmen und eine Aktivierung von ADPGPP bewirken. Gleichzeitig würden die Mengen an Pi wegen der Photophosphorylierung abnehmen, wodurch die Inhibierung von ADPGPP verringert wird. Diese Veränderungen würden eine Steigerung der ADP-Glucose-Produktion und der Stärke-Biosynthese bewirken. Während der Dunkelheit würden die 3-PGA-Mengen abnehmen und die Pi- Mengen zunehmen, wodurch die Aktivität von ADPGPP verringert wird und somit die Biosynthese von ADP-Glucose und Stärke verringert wird.
Die ADPGPP aus Spinatblättern wurde später zur Homogenität gereinigt, und es zeigte sich, dass sie Untereinheiten von 51 und 54 kDa enthält (Morell, 1987). Auf Grund von gegen die beiden Untereinheiten gerichteten Antikörpern hat das 51 kDa- Protein eine Homologie sowohl mit den Mais-Endosperm- als auch Kartoffelknollen-ADPGPPs, jedoch nicht mit dem 54 kDa-Protein des Spinatblatts.
Die Sequenz eines cDNA-Klons einer ADPGPP-Untereinheit eines Reis-Endosperms wurde beschrieben (Anderson, 1989a). Der Klon kodierte für ein Protein von 483 Aminosäuren. Ein Vergleich der Reis-Endosperm-ADPGPP- und der E. coli-ADPGPP-Proteinsequenzen zeigt eine etwa 30% Identität. Ebenfalls im Jahre 1989 wurde ein cDNA-Klon mit beinahe ganzer Länge für das Weizen-Endosperm- ADPGPP sequenziert (Olive, 1989). Der Weizen-Endosperm-ADPGPP- Klon hat etwa 24% Identität mit der ADPGPP-Proteinsequenz aus E. coli, während die Weizen- und die Reis-Klone etwa 40% Identität auf Proteinebene aufweisen.
Die Mais-Endosperm-ADPGPP wurde gereinigt, und es zeigte sich, dass sie katalytische und regulierende Eigenschaften ähnlich jenen anderer Pflanzen-ADPGPPs aufweist (Plaxton, 1987). Das native Molekulargewicht des Mais-Endosperm-Enzyms ist 230.000, und es ist aus vier Untereinheiten ähnlicher Größe zusammengesetzt.
Das native Molekulargewicht der ADPGPP der Kartoffelknolle beträgt Berichten zufolge 200.000, mit einer Untereinheits-Größe von 50.000 (Sowokinos, 1982). Die Aktivität der Knollen-ADPGPP hängt beinahe vollständig von 3-PGA ab, und wie bei anderen Pflanzen-ADPGPPs wird sie durch Pi inhibiert. Es wurde nachgewiesen, dass die Kartoffelknollen- und Blatt-ADPGPPs in ihren physikalischen, katalytischen und allosterischen Eigenschaften ähnlich sind (Anderson, 1989b).

Herstellung veränderter ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gene mittels Mutagenese

Der Fachmann wird erkennen, dass, obwohl dies nicht unbedingt notwendig ist, bessere Ergebnisse durch die Verwendung von ADPGPP-Genen, die einer reduzierten allosterischen Regulierung unterliegen ("dereguliert") und, mehr bevorzugt, keinen signifikanten Höhen allosterischer Regulierung unterliegen ("unreguliert"), unter Beibehaltung adäquater katalytischer Aktivität, erhalten werden können. In Zellen, die normalerweise keine signifikanten Stärke-Mengen akkumulieren, kann die Expression eines "regulierten" Enzyms ausreichen. In Stärkeakkumulierenden Zellen und Geweben ist ein "dereguliertes" oder "unreguliertes" Enzym das bevorzugte System. Die strukturelle Kodiersequenz für ein Bakterien- oder Pflanzen-ADPGPP-Enzym kann in E. coli oder in einem anderen geeigneten Wirt mutagenisiert werden und auf erhöhte Glykogen-Produktion gescreent werden, wie für das glgC16-Gen von E. coli beschrieben. Es sollte erkannt werden, dass die Verwendung eines Gens, das für ein ADPGPP-Enzym kodiert, welches nur Modulatoren (Aktivatoren/Inhibitoren) unterliegt, die in der ausgewählten Pflanze in Mengen vorhanden sind, die die katalytische Aktivität nicht signifikant inhibieren, keine Enzym-(Gen-)Modifikation erfordert. Diese "unregulierten" oder "deregulierten" ADPGPP-Gene können dann in Pflanzen, wie hierin·beschrieben, insertiert werden, um transgene Pflanzen zu erhalten, die einen erhöhten Stärkegehalt aufweisen.
Beispielsweise kann jedes ADPGPP-Gen in den E. coli B-Stamm AC70R1-504 (Leung, 1986) kloniert werden. Dieser Stamm hat ein defektes ADPGPP-Gen und ist für die anderen Glykogen-Biosynthese-Enzyme fünf- bis siebenfach dereprimiert. Die ADPGPP- Gen/cDNAs können auf ein Plasmid hinter dem E. coli glgC- Promotor oder jedem anderen Bakterien-Promotor gegeben werden. Dieses Konstrukt kann dann entweder einer site-directed oder einer zufälligen Mutagenese unterzogen werden. Nach der Mutagenese würden die Zellen auf reiches Medium mit 1% Glucose plattiert. Nachdem sich die Kolonien entwickelt haben, würden die Platten mit Iodlösung (0,2 Gew./Vol.-% 121 0,4 Gew./Vol.-% KI in H&sub2;O, Creuzet-Sigal, 1972) überspült. Durch Vergleich mit einer identischen Platte, die nicht-mutierte E. coli enthält, können Kolonien, die mehr Glykogen produzieren, durch ihre dünklere Färbung entdeckt werden.
Da der Mutagenese-Vorgang Promotor-Mutationen geschaffen haben könnte, muss von jeder putativen ADPGPP-Mutante aus der ersten Screening-Runde das ADPGPP-Gen in einen nicht-mutierten Vektor rekloniert werden, und das resultierende Plasmid wird auf dieselbe Weise gescreent. Von jenen Mutanten, die beide Screening-Runden schaffen, werden die ADPGPP-Aktivitäten mit und ohne die Aktivatoren und Inhibitoren getestet. Durch Vergleichen der Reaktionen der mutierten ADPGPPs auf Aktivatoren und Inhibitoren mit den nicht-mutierten Enzymen kann die neue Mutante charakterisiert werden.
Der Bericht von Plaxton und Preiss im Jahre 1987 zeigt, dass die Mais-Endosperm-ADPGPP regulierende Eigenschaften ähnlich jenen der anderen Pflanzen-ADPGPPs aufweist. Sie zeigen, dass frühere Berichte, die behaupten, dass die Mais-Endosperm-ADPGPP eine erhöhte Aktivität in Abwesenheit von Aktivator (3-GPA) und verminderte Empfindlichkeit gegenüber dem Inhibitor (Pi) aufweist, auf eine proteolytische Spaltung des Enzyms während des Isolierungsvorgangs zurückzuführen waren. Durch Veränderung eines ADPGPP-Gens zur Erzeugung eines Enzyms, das der proteolytisch gespaltenen Mais-Endosperm-ADPGPP analog ist, wird eine verringerte allosterische Regulierung erreicht. Der jüngste Bericht betreffend die apparente Neuheit der Regulierung der Gerste-Endosperm-ADPGPP und ihrer apparenten Unempfindlichkeit gegenüber 3-PGA wird nicht allgemein akzeptiert, da der Bericht zeigt, dass die Enzympräparation rasch abgebaut wurde und mit denselben Problemen behaftet sein kann, die für die Mais- Endosperm-Präparation identifiziert wurden.
Zum Testen einer flüssigen Kultur von E. coli auf ADPGPP- Aktivität werden die Zellen in einer Zentrifuge abzentrifugiert und in etwa 2 ml Extraktionspuffer (0.05 M Glycylglycin pH 7,0, 5,0 mM DTE, 1,0 mM EDTA) pro Gramm Zellpaste resuspendiert. Die Zellen werden durch zweimaliges Durchleiten durch eine "French Press" lysiert. Die Zellextrakte werden in einer Mikrozentrifuge 5 min lang geschleudert, und die Überstände werden durch Hindurchleiten durch eine G-50-Spin-Säule entsalzt.
Der Enzym-Test für die Synthese von ADP-Glucose ist eine Modifikation eines veröffentlichten Verfahrens (Haugen, 1976). Jede 100 ul-Testmischung enthält: 10 uMol Hepes pH 7,7, 50 ug BSA, 0,05 uMol [C¹ &sup4;]Glucose-1-phosphat, 0,15 uMol ATP, 0,5 uMol MgCl&sub2;, 0,1 ug anorganische Pyrophosphatase von kristalliner Hefe, 1 mM Ammoniummolybdat, Enzym, Aktivatoren oder Inhibitoren nach Wunsch, und Wasser. Die Testmischung wird 10 min lang bei 37ºC inkubiert und durch 60 Sekunden langes Kochen gestoppt. Die Testmischung wird in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert, und 40 ul des Überstands werden in eine Synchrom Synchropak AX-100 Anionenaustauscher-HPLC-Säule injiziert. Die Probe wird mit 65 mM KPi, pH 5, 5, eluiert. Nicht umgesetztes [C¹ &sup4;]Glucose-1- phosphat eluiert bei etwa 7-8 Minuten, und [C¹ &sup4;]ADP-Glucose eluiert bei etwa 13 Minuten. Die Enzymaktivität wird durch die Menge der im ADP-Glucose-Peak gefundenen Radioaktivität bestimmt.
Die Pflanzen-ADPGPP-Enzymaktivität ist streng reguliert, sowohl durch positive (3-Phosphoglycerat; 3-PGA) als auch durch negative Effektoren (anorganisches Phosphat; Pi) (Ghosh und Preiss, 1966; Copeland und Preiss 1981; Sowokinos und Preiss 1982; Morell et al., 1987; Plaxton und Preiss, 1987; Preiss, 1988; ), und das Verhältnis von 3-PGA : Pi spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stärke-Biosynthese durch Modulieren der ADPGPP-Aktivität (Kaiser und Bassham, 1979). Die Pflanzen-ADPGPP-Enzyme sind Heterotetramere aus zwei großen/"shrunken" und zwei kleinen/"Brittle" Untereinheiten (Morell et al., 1987; Lin et al., 1988a, 1988b; Krishnan et al., 1986; Okita et al., 1990), und es gibt klare Beweise, die nahelegen, dass das Heterotetramer die aktivste Form von ADPGPP ist. Dieser Hinweis wird durch die Isolierung von "stärkelosen" Pflanzenmutanten, welche in einer der Untereinheiten defizient sind (Dickinson und Preiss, 1969; Lin et al., 1988a, 1988b), und durch die Charakterisierung eines "ADPGPP"-Homotetramers aus kleinen Untereinheiten, von dem es sich zeigte, dass es nur eine geringe Enzymaktivität hat (Lin et al., 1988b), gestützt. Zusätzlich wurden vorgeschlagene Effektor-Wechselwirkungs-Reste für beide Untereinheiten identifiziert (Morell et al., 1988). Ein direkter Beweis für die aktive Form des Enzyms und eine weitere Unterstützung der kinetischen Daten, die für das gereinigte Kartoffel-Enzym berichtet wurden, stammt aus der Expression der Kartoffel-ADPGPP-Aktivität in E. coli und dem Vergleich der kinetischen Eigenschaften dieses Materials mit jenem aus Kartoffelknollen (Iglesias et al., 1993).
Unregulierte Enzymvarianten der Pflanzen-ADPGPP werden auf ähnliche Weise identifiziert und charakterisiert wie jene, die zur Isolierung der E. coli GlgC16 und verwandten Mutanten führte. Eine Reihe von Pflanzen-ADPGPP-cDNAs oder Teile solcher cDNAs für sowohl die großen als auch die kleinen Untereinheiten wurden sowohl aus Monocotylen als auch Dicotylen kloniert (Anderson et al., 1989a; Olive et al., 1989; Muller et al., 1990). Die von den Pflanzen-cDNAs kodierten Proteine sowie jene, die von Bakterien beschrieben sind, zeigen einen hohen Grad an Konservierung (Bhave et al., 1990). Insbesondere wurde eine hoch konservierte Region identifiziert, die auch einige der Reste enthält, die in Enzymfunktion- und Effektor-Wechselwirkungen impliziert sind (Morell et al., 1988; Smith-White und Preiss, 1992). Klone der Gene der Kartoffelknollen-ADPGPP-Untereinheit wurden isoliert. Zu diesen zählt ein komplettes Gen einer kleinen Untereinheit, zusammengesetzt durch die Addition von Sequenzen aus dem ersten Exon des genomischen Klons mit einem cDNA-Klon beinahe ganzer Länge desselben Gens, und einem fast vollständigen Gen für die große Untereinheit. Die Nukleotid- Sequenz (SEQ ID NO: 7) und die Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO: 8) des zusammengesetzten Gens der kleinen Untereinheit sind nachstehend angegeben. Die hier gezeigte Nukleotid-Sequenz unterscheidet sich vom ursprünglich isolierten Gen auf folgende Weise: eine BglII+NcoI-Stelle wurde am ATG-Codon eingeführt, um die Klonierung des Gens in E. coli und Pflanzenexpressionsvektoren durch site-directed Mutagenese unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer-Sequenz
GTTGATAACAAGATCTGTTAACCATGGCGGCTTCC (SEQ ID NO: 11) zu erleichtern:
Eine SacI-Stelle wurde am Stop-Codon unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer-Sequenz
CCAGTTAAAACGGAGCTCATCAGATGATGATTC (SEQ ID NO: 12) eingeführt.
Die SacI-Stelle dient als 3'-Klonierungsstelle. Eine interne Bg3II-Stelle wurde entfernt, wobei die Oligonukleotid-Primer- Sequenz
GTGTGAGAACATAAATCTTGGATATGTTAC (SEQ ID NO: 13) verwendet wurde. Dieses zusammengesetzte Gen wurde in E. coli unter der Kontrolle des recA-Promotors in einer PrecA-GenlOL-Expressionskassette (Wong et al., 1988) exprimiert, um messbare Mengen des Proteins zu erzeugen. Ein initiierendes Methionin-Codon wird durch sitedirected Mutagenese platziert, wobei die Oligonukleotid-Primer- Sequenz
GAATTCACAGGGCCATGGCTCTAGACCC (SEQ ID NO: 14) verwendet wurde, um das reife Gen zu exprimieren.
Die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID NO: 9) und die Aminosäure- Sequenz (SEQ ID NO: 10) des fast vollständigen Gens der großen Untereinheit sind nachstehend angegeben. Ein mit üerendes Methionin-Codon wurde durch site-directed Mutagenese am reifen N-Terminus platziert, wobei die Oligonukleotid-Primer-Sequenz AAGATCAAACCTGCCATGGCTTACTCTGTGATCACTACTG (SEQ ID NO: 15) verwendet wurde.
Der Grund für das initiierende Methionin ist, die Expression dieses Gens der großen Untereinheit in E. coli zu erleichtern. Eine Hindill-Stelle befindet sich 103 bp nach dem Stop-Codon und dient als die 3'-Klonierungsstelle. Das vollständige große ADPGPP-Gen wird mittels der 5'-RACE-Vorgangsweise (Rapid Amplification of cDNA Ends; Frohman, 1990; Loh, 1989) isoliert. Die Oligonukleotid-Primer für diese Vorgangsweise sind wie folgt:
1) GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGGCCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 16);
2) GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGG (SEQ ID NO: 17); und
3) CCTCTAGACAGTCGATCAGGAGCAGATGTACG (SEQ ID NO: 18).
Die ersten zwei sind äquivalent den ANpolyC- bzw. AN-Primern von Loh et al. (1989), und der dritte ist das umgekehrte Komplement für eine Sequenz im großen ADPGPP-Gen, das sich nach der PstI- Stelle in SEQ ID NO: 9 befindet. Die PCR-5'-Sequenzprodukte werden als EcoRT/HindIII/BamHI-Pstl-Fragmente kloniert und sind leicht mit dem bestehenden Gen-Teil zusammensetzbar.
Die schwach regulierten Enzym-Mutanten von ADPGPP werden durch anfängliche Durchmusterung von Kolonien aus einer mutagenisierten E. coli-Kultur, die eine erhbhte Glykogen-Synthese zeigen, durch Iodfärbung von 24-48-Stunden-Kolonien auf Luria- Agar-Platten, die Glucose zu 1% enthalten, und nachfolgende Charakterisierung der Reaktionen auf die ADPGPP-Enzyme aus diesen Isolaten auf die positiven und negativen Effektoren dieser Aktivität (Cattaneo et al., 1969; Preiss et al., 1971) identifiziert. Eine ähnliche Vorgangsweise wird für die Isolierung solcher Varianten der Pflanzen-ADPGPP-Enzyme angewendet. Bei gegebenem Expressionssystem für jedes der Untereinheits-Gene wird eine Mutagenese jedes Gens separat mit einem aus einer Vielfalt bekannter Mittel, sowohl chemischer oder auch physikalischer Mittel (Miller, 1972) auf Kulturen, die das Gen enthalten, oder auf gereinigter DNA durchgeführt. Ein anderer Weg ist die Verwendung einer PCR-Vorgangsweise (Ehrlich, 1989) auf dem vollständigen Gen in Anwesenheit inhibierender MN&spplus;&spplus;-Ionen, einem Zustand, der zu einer hohen Fehleinbaurate von Nukleotiden führt. Eine PCR-Vorgangsweise kann auch mit Primern direkt angrenzend an eine spezifische Region des Gens verwendet werden, wobei dieses mutagenisierte Fragment dann in die nicht-mutagenisierten Gen-Segmente rekloniert wird. Eine willkürliche synthetische Oligonukleotid-Vorgangsweise kann auch verwendet werden, um eine hoch mutagenisierte kurze Region des Gens zu generieren, indem Nukleotide in der Synthese-Reaktion gemischt werden, damit sie zu Fehleinbau an allen Positionen in dieser Region führen. Diese kleine Region wird von Restriktionsstellen flankiert, die zur Re-Insertion dieser Region in den Rest des Gens benützt werden. Die resultierenden Kulturen oder Transformanten werden mittels der Standard-Iod-Methode auf jene gescreent, die höhere Glykogen-Mengen haben als Kontrollen. Vorzugsweise erfolgt dieses Screening in einem E. coli-Stamm, dem nur die ADPGPP-Aktivität mangelt, und der phenotypisch Glykogenminus ist und durch glgC auf Glykogen-plus komplementiert wird. Der E. coli-Stamm sollte jene anderen Aktivitäten beibehalten, die für die Glykogen-Produktion notwendig sind. Beide Gene werden gemeinsam im selben E. coli-Wirt exprimiert, indem die Gene auf kompatible Plasmide mit verschiedenen selektierbaren Marker- Genen platziert werden, und diese Plasmide haben auch·ähnliche Kopienzahlen im bakteriellen Wirt, um die Heterotetramer-Bildung zu maximieren. Ein Beispiel für ein solches Expressionssystem ist die Kombination von pMON17335 und pMON17336 (Iglesias et al., 1993). Die Verwendung separater Plasmide ermöglicht das Screenen einer mutagenisierten Population von nur einem Gen alleine oder in Verbindung mit dem zweiten Gen nach Transformation in einen kompetenten Wirt, der das andere Gen exprimiert, und das Screenen von zwei mutagenisierten Populationen nach der Kombination derselben im selben Wirt. Nach erneuter Isolierung der Plasmid-DNÄ aus Kolonien mit stärkerer Iodfärbung werden die ADPGPP-Kodierseguenzen in Expressionsvektoren rekloniert, der Phenotyp wird verifiziert, und die ADPGPP-Aktivität und ihre Reaktion auf die Effektor-Moleküle werden bestimmt. Verbesserte Varianten zeigen eine erhöhte Vmax, eine reduzierte Inhibition durch den negativen Effektor (Pi), oder eine geringere Abhängigkeit vom Aktivator (3-PGA) für eine maximale Aktivität. Der Test auf solche verbesserte Charakteristika umfasst die Bestimmung der ADPGPP-Aktivität in Anwesenheit von Pi bei 0,045 mM (I0,5 = 0,045 mM) oder in Anwesenheit von 3-PGA bei 0,075 mM (A0,5 = 0,075 mM). Die nützlichen Varianten zeigen < 40% Inhibierung bei dieser Konzentration des Pi, oder zeigen > 50% Aktivität bei dieser Konzentration von 3-PGA. Nach der Isolierung verbesserter Varianten und der Bestimmung der verantwortlichen Untereinheit oder Untereinheiten, wird (werden) durch Nukleotid- Sequenzierung die Mutation(en) bestimmt. Die Mutation wird durch Wieder-Schaffung dieser Veränderung durch site-directed Mutagenese und Wieder-Testen der ADPGPP-Aktivität in Gegenwart von Aktivator und Inhibitor bestätigt. Diese Mutation wird dann in das äquivalente komplette ADPGPP-cDNA-Gen transferiert, durch Re-Klonieren der die Änderung enthaltenden Region aus der geänderten bakteriellen Expressionsform in die Pflanzenform, die die Amyloplasten-Targeting-Sequenz enthält, oder durch site-directed Mutagenese des kompletten nativen ADPGPP-Pflanzen-Gens.

Auf Chloroplasten/Amyloplasten gerichtete Expression der ADPGPP-Aktivität

Man weiß, dass die Biosynthese von Stärke in Pflanzen- Chloroplasten und -Amyloplasten (hier kollektiv als Plastide bezeichnet) stattfindet. In den untersuchten Pflanzen ist die ADPGPP auf diesen Plastiden lokalisiert. Viele auf Chloroplasten lokalisierte Proteine werden als Vorläufer aus Zellkern-Genen exprimiert und werden durch ein Chloroplasten-Transit-Peptid (CTP), welches während der Import-Schritte entfernt wixd, auf den Chloroplasten gerichtet. Zu den Beispielen für solche Chloroplasten-Proteine zählen die kleine Untereinheit von Ribulose-1,5-biphosphat-carboxylase (ssRUBISCO, SSU), 5-Enolpyruvatshikimat-3-phosphat-synthase (EPSPS), Ferredoxin, Ferredoxin-oxidoreduktase, das Light-harvesting-complex-Protein I und -Protein II, und Thioredoxin F. Es wurde in vivo und in vitro nachgewiesen, dass Nicht-Chloroplasten-Proteine auf Chloroplasten gerichtet werden können, indem man Proteinfusionen mit einem CTP verwendet, und dass eine CTP-Sequenz ausreicht, um ein Protein auf den Chloroplasten zu richten. In gleicher Weise werden auf Amyloplasten lokalisierte Proteine aus Zellkern-Genen als Vorläufer exprimiert und durch ein Amyloplasten-Transit- Peptid (ATP) auf den Amyloplasten gerichtet.
Bei den beispielhaften Ausführungsformen wurde ein spezialisiertes CTP, das vom ssRUBISCO 2A-Gen aus Arabidopsis thaliana (SSU 1A) (Timko, 1988) stammte, verwendet. Dieses CTP (CTP1) wurde durch eine Kombination von site-directed Mutagenesen konstruiert. Die CTP1-Nukleotid-Sequenz (SEQ ID NO: 5) und die korrespondierende Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO: 6) sind nachstehend angeführt. CTP1 besteht aus dem SSU 1A CTP (Aminosäure 1-55), den ersten 23 Aminosäuren des reifen SSU 1A-Proteins (56- 78), einem Serin-Rest (Aminosäure 79), einem neuen Segment, das die Aminosäuren 50 bis 56 aus dem CTP und die ersten zwei aus dem reifen Protein (Aminosäuren 80-87) wiederholt, und einem Alanin- und Methionin-Rest (Aminosäuren 88 und 89). Eine NcoI- Restriktionsstelle befindet sich am 3'-Ende (reicht über das Met-Codon), um die Konstruktion präziser Fusionen an das 5' eines ADPGPP-Gens zu erleichtern. In einer späteren Stufe wurde eine BglII-Stelle vor dem N-Terminus der SSU 1A-Seguenzen eingeführt, um die Einführung der Fusionen in Pflanzentransformationsvektoren zu erleichtern. Eine Fusion wurde zwischen der strukturellen DNA, die für CTP1 CTP kodiert, und dem glgC16-Gen aus E. coli zusammengestellt, um eine komplette strukturelle DNA-Sequenz zu erzeugen, die für das Plastid-Transit- Peptid/ADPGPP-Fusionspolypeptid kodiert.
Der Fachmann wird erkennen, dass, wenn bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung entweder eine einzige Pflanzen-ADPGPPcDNA, die für "shrunken" und/oder "brittle" Untereinheiten kodiert, verwendet wird, oder beide Pflanzen-ADPGPP-cDNAs, die für "shrunken" und "brittle" Untereinheiten kodieren, verwendet werden, das endogene CTP oder ATP am einfachsten und vorzugsweise verwendet werden könnte. Daher sollte für die Zwecke der vorliegenden Erfindung der Ausdruck "Plastid-Transit-Peptide" so ausgelegt werden, dass er sowohl Chloroplasten-Transit-Peptide als auch Amyloplasten-Transit-Peptide umfasst. Der Fachmann wird auch erkennen, dass verschiedene andere chimäre Konstrukte hergestellt werden können, die die Funktionalität eines bestimmten Plastid-Transit-Peptids nützen, um das angrenzende ADPGPP-Enzym in den Pflanzenzellen-Chloroplasten/-Amyloplasten einzuführen, je nach der Gewebespezifität des Promotors.

Polyadenylierungssignal

Die 3'-nicht-translatierte Region des chimären Pflanzen-Gens enthält ein Polyadenylierungssignal, das in Pflanzen wirkt, um die Addition von Polyadenylat-Nukleotiden an das 3'-Ende der RNA zu bewirken. Beispiele für geeignete 3'-Regionen sind (1) die 3'-transkribierten, nicht-translatierten Regionen, die das polyadenylierte Signal von Agrobacterium der Tumorinduzierenden (Ti) Plasmid-Gene enthalten, wie das Nopalin-Synthase-(NOS)-Gen, und (2) Pflanzen-Gene, wie die Sojabohnen-Lagerprotein-Gene und die kleine Untereinheit des Ribulose-1,5-biphosphat-carboxylase- (ssRUBISCO)-Gens. Ein Beispiel für eine bevorzugte 3'-Region ist jene aus dem NOS-Gen, die in den nachfolgenden Beispielen · genauer beschrieben ist.

Pflanzentransformation/-regeneration

Pflanzen, bei welchen man durch die Ausübung der vorliegenden Erfindung bewirken kann, dass sie einen verringerten Ölgehalt haben, umfassen Mais, Weizen, Reis, Erbsen, Erdnuss, Canola/Ölsamen-Raps, Baumwolle, Gerste, Sorghum, Sojabohne, Sonnenblume, Mandel, Kaschu, Pekan und Walnuss, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt.
Ein doppelsträngiges DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung, welches das funktionelle Pflanzen-ADPGPP-Gen enthält, kann mittels irgendeines geeigneten Verfahrens in das Genom einer Pflanze insertiert werden. Zu den geeigneten Pflanzen-Transformationsvektoren zählen jene, die von einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens stammen, sowie jene, die beispielsweise von Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) und der EPA-Veröffentlichung 120.516 (Schilperoort et al.) geoffenbart wurden. Zusätzlich zu Pflanzen-Transformationsvektoren, die aus den Ti- oder den Wurzelinduzierenden (Ri) Plasmiden von Agrobacterium stammen, können alternative Methoden verwendet werden, um die DNA-Konstrukte dieser Erfindung in Pflanzenzellen zu insertieren. Solche Methoden können beispielsweise die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme steigern, freie DNA-Lieferung über Mikroprojektil-Bombardment und Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen involvieren.
Beispiele für Vektoren, die zur Expression von glgC16 und anderen ADPGPP-Genen in Monocotylen und Dicotylen entworfen sind, werden von Kishore in WO 91/19806 berichtet. Diese werden zur Transformation der gewünschten Pflanzenzellen mit dem geeigneten Verfahren verwendet.
Wenn eine passende Zahl von Zellen (oder Protoplasten), die das ADPGPP-Gen oder c-DNA enthalten, erhalten worden ist, werden die Zellen (oder Protoplasten) zu ganzen Pflanzen regeneriert. Die Wahl der Methodik für den Regenerationsschritt ist nicht kritisch, wobei geeignete Protokolle für Wirte aus Leguminosae (Alfalfa, Sojabohne, Klee etc.), Cruciferae (Kohl, Rettich, Canola/Rapssamen, etc.) Gramineae (Weizen, Gerste, Reis, Mais etc.), verschiedene Ernte-Blumen, wie Sonnenblume, Nuss-tragende Bäume, wie Mandeln, Kaschus, Walnüsse und Pekans, erhältlich sind. Vgl. z. B. Ammirato, 1984; Shimamoto, 1989; Fromm, 1990; Vasil, 1990; Hayashimoto, 1989; und Datta, 1990.
Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um die Ausübung der vorliegenden Erfindung besser zu erläutern und sollten keinesfalls so ausgelegt weren, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.

Beispiel 1:

Um das E. coli GlgC16-Gen in Pflanzenzellen zu exprimieren und um das Enzym auf die Plastide zu richten, musste das Gen mit einer DNA, die für das Plastid-Targeting Transit-Peptid (nachstehend hierin als CTP/ADPGPP-Gen bezeichnet) kodiert, und mit den entsprechenden regulierenden Regionen der Pflanze verschmolzen werden. Detaillierte Beispiele dafür, wie man dies erreicht, kann man in WO 91/19806 finden.
Die CTP-glgC16-Gen-Fusion wurde hinter dem oben beschriebenen Sojabohnen-β-Conglycinin-7S-Lager-Promotor platziert. Diese Kassette wurde in pMON17227, einen von Barry et al. in WO 92/04449 (1991) geoffenbarten und beschriebenen Ti-Plasmidvektor kloniert, um den Vektor pMON17315 zu bilden. Dieser Vektor wurde verwendet, um Canola durch Agrobacterium-Transformation zu transformieren, gefolgt von einer Glyphosat- Selektion. Regenerierte Pflanzen wurden analysiert, und das Vorhandensein des Enzyms in den meisten Transformanten wurde mittels Western blot-Analyse bestätigt. Samen von vier transformierten Linien wurden erhalten und auf Öl-, Stärke- und Proteingehalt und Feuchtigkeit analysiert. Es zeigte sich, dass der Stärkegehalt auf 8,2-18,2 Prozent (bezogen auf das Frischgewicht) im Vergleich zu 0,9-1,6 Prozent iii Kontrolllinien < nur mit pMON17227 transformiert) zügenommen hatte. Man stellte fest, dass der Ölgehalt von 26,7-31,6 Prozent in den Kontrollen auf 13,0-15,5 Prozent in den transformierten Linien abgenommen hatte. Proteingehalt und Feuchtigkeit waren nicht wesentlich verändert. Bei einigen Linien war das Samengewicht erhöht, was darauf hinweisen kann, dass die gesamte Ausbeute auch erhöht sein kann.

LITERATURSTELLEN

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Zheng, et al. (1993) The Plant Journal 4(2): 357-366.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Monsanto Company
(B) STRASSE: 800 North Lindbergh Boulevard
(C) ORT: St. Louis
(D) STAAT: Missouri
(E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
(F) POSTLEITZAHL: 63167
(G) TELEFON: (314)694-3131
(H) TELEFAX: (314)694-5435
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Modifizierter Ölgehalt in Samen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 18
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, Version#1,25(EPA)
(vi) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 08/090523
(B) ANMELDEDATUM: 12. Juli 1993
(vi) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/709663
(B) ANMELDEDATUM: 07. Juni 1991
(vi) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/539763
(B) ANMELDEDATUM: 18. Juni 1990
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LNGE: 1296 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 1: VON 1 BIS 1296
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1293
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 431 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VEROFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 2: VON 1 BIS 431
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1296 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1293
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 3: VON 1 BIS 1296
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 431 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGLE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: Protein
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 4: VON 1 BIS 431
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 355 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 88..354
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 5: VON 1 BIS 355
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 89 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 6: VON 1 BIS 89
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1575 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 3..1565
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 7: VON 1 BIS 1575
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 521 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 8: VON 1 BIS 521
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1519 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRAIIGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1410
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP ß536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 9: VON 1 BIS 1519
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 470 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 10: VON 1 BIS 470
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 11: VON 1 BIS 35
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 12: VON 1 BIS 33
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: DNA (synthetisch)
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 13: VON 1 BIS 30
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear.
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 14: VON 1 BIS 28
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 0 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: DNA (synthetisch)
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 15: VON 1 BIS 40
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 16: VON 1 BIS 39
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 16: VON 1 BIS 24
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) ART: Nukleinäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(H) DOKUMENT NR.: EP 0536293 A1
(I) ANMELDETAG: 07. Juni 1991
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM: 14. April 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 18: VON 1 BIS 32
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Pflanzensamen mit verringertem Ölgehalt, wobei erhöhte Mengen von ADP-Glucose-pyrophosphorylase in den Samen vorgesehen werden, indem die Pflanze unter Verwendung der folgenden Schritte transformiert wird:

(a) Insertieren eines rekombinanten doppelsträngigen DNA- Moleküls in das Genom einer Pflanzenzelle, welches DNA-Molekül aufweist:

(i) einen in Pflanzen wirkenden Promotor zur Bewirkung der Erzeugung einer RNA-Sequenz in Pflanzensamen,

(ii) eine strukturelle DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, welche für ein Fusionspolypeptid kodiert, mit einem Amino-terminalen Plastid- Transit-Peptid und einem ADP-Glucose-pyrophosphorylase-Enzym,

(iii) eine 3'-nicht-translatierte DNA-Sequenz, die in Pflanzenzellen wirkt, um eine Transkriptionstermination und den Zusatz polyadenylierter Nukleotide an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken;

(b) Erhalt transformierter Pflanzenzellen; und

(c) Regenerieren genetisch transformierter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen, welche Pflanzen Samen mit einem verringerten Ölgehalt erzeugen;

wobei das ADP-Glucose-pyrophosphorylase-Enzym dereguliert ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym aus E. coli stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Enzym glgC16 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Weizen, Canola, Soyabohne, Mais, Baumwolle, Sonnenblume, Mandel, Kaschu, Pekan, Walnuß und Erdnuß.