PT634491E

PT634491E - Teor em oleo modificado e sementes

Info

Publication number: PT634491E
Application number: PT94870118T
Authority: PT
Inventors: Gerard Francis Barry; Ganesh Murthy Kishore; David Martin Stark
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1993-07-12
Filing date: 1994-07-11
Publication date: 2000-11-30
Also published as: ES2148308T3; EP0708835B1; DE69424601T2; DE69431352T2; US6538179B1; AU675158B2; ATE223969T1; DK0634491T3; US5608149A; CA2165669A1; JP3539961B2; ATE193328T1; AU7316094A; JPH09500274A; EP0634491A1; EP0708835A1; US5608150A; EP0634491B1; GR3034038T3; US5498830A

Description

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- 1 - DESCRIÇÃO "TEOR EM ÓLEO MODIFICADO EM SEMENTES"

Avanços recentes em engenharia genética têm fornecido as ferramentas necessárias para transformar plantas de forma a conterem genes estrangeiros. É agora possível produzir plantas com características únicas com importância nos processamentos agronómico e de colheita. Um tal traço vantajoso é o aumento do teor e qualidade de amido e/ou sólidos em várias plantas de cultivo. A WO 91/19806 relata o uso de um gene que codifica a ADPglucose pirofosforilase (ADPGPP), que catalisa um passo chave na biossíntese do amido e do glicogénio. O gene preferido é da E. coli e a enzima resultante é uma variante deficientemente regulada e altamente activa.

Outro traço desejável é a redução de óleo em certos cereais alimentícios, tal como o amendoim. Diminuir o teor em lípidos nas sementes de certas plantas é desejável devido a preocupações na saúde ou para melhorar qualidades de processamento. Por exemplo, uma manteiga de amendoim de baixas calorias, contendo um maior teor em amido e menor teor em óleo seria benéfico. Igualmente, soja contendo menor teor em óleo seria melhor para a produção de certos produtos, tais como tofu, molho de soja, diluentes de alimentos de soja, e leite de soja. Adicionalmente, é desejável um menor teor em óleo em certos produtos derivados de sementes, tais como grão de amido ou farinha triga. Tem sido surpreendentemente encontrado que tal redução em gordura é conseguida pela expressão de um gene que codifica uma ADPGPP desregulada, tal como o g/gC16 nas sementes. -2-

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece construções de ADN estrutural que codificam uma enzima ADPglucose pirofosforilase (ADPGPP) e que são úteis na produção de sementes contendo um reduzido teor em óleo.

Completando o precedente, é fornecido, em conformidade com um aspecto da presente invenção, um método de produção de plantas geneticamente transformadas que têm elevado teor em amido, compreendendo os passos de: (A) inserção no genoma de uma célula de planta uma molécula recombinante de ADN em dupla cadeia compreendendo a. um promotor que é seleccionado a partir do grupo consistindo de promotores específicos de sementes, b. uma sequência de ADN estrutural que origina a produção de uma sequência de ARN que codifica um polipeptídeo de fusão compreendendo um peptídeo de transporte plastídio amino-terminal e uma enzima ADPglucose pirofosforilase, c. uma sequência de ADN 3' não traduzida cujas funções nas células de plantas são causar a terminação da transcrição e a adição de nucleótidos poliadenilados à extremidade 3' da sequência do ARN; (B) obtenção de células de plantas transformadas; e (C) regeneração a partir das células de plantas transformadas plantas geneticamente transformadas que têm um elevado teor em amido.

Em conformidade com outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma molécula recombinante de ADN em dupla cadeia compreendendo em sequência: (D) um promotor que é seleccionado a partir do grupo consistindo de promotores específicos de sementes; (E) uma sequência de ADN estrutural que origina a produção de uma sequência de ARN que codifica um polipeptídeo de fusão compreendendo um peptídeo de transporte plastídio amino-terminal e uma enzima ADPglucose pirofosforilase; e (F) uma região 3' não traduzida cujas funções nas células de plantas são causar a terminação de transcrição e a adição de nucleótidos poliadenilados à extremidade 3' da sequência do ARN, sendo o referido promotor heterólogo com respeito ao ADN estrutural.

Tem também sido fornecido, em conformidade com outro aspecto da presente invenção, células de plantas transformadas que contêm ADN compreendido nos elementos (a), (b) e (c) acima mencionados. Ainda em conformidade com outro aspecto da presente invenção, são fornecidas plantas de cultivo com sementes oleaginosas diferenciadas que têm um reduzido teor de óleo nas sementes. -4-

DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A expressão de um gene de planta que existe na forma de ADN em dupla cadeia envolve a transcrição de ARN mensageiro (ARNm) a partir de uma cadeia de ADN pela enzima ARN polimerase, e o subsequente processamento do transcrito primário de ARNm dentro do núcleo. Este processamento envolve uma região 3' não traduzida que adiciona nucleótidos poliadenilados à extremidade 3' do ARN. A transcrição do ADN no ARNm é regulada por uma região de ADN geralmente referida como o promotor. A região do promotor contém uma sequência de bases que dá o sinal à ARN polimerase para se associar ao ADN, e para iniciar a transcrição do ARNm usando uma das cadeias de ADN como molde para construir uma cadeia complementar correspondente de ARN.

Os promotores que são conhecidos ou que sejam encontrados que originam a transcrição de ADN em células de plantas podem ser usados na presente invenção. Tais promotores podem ser obtidos de uma variedade de fontes tais como plantas e vírus de plantas e incluem, mas não estão limitados, ao promotor CaMV35S realçador e promotores isolados a partir de genes de plantas tais como genes ssRUBISCO. Tal como em baixo é descrito, é preferido que o promotor particular seleccionado seja capaz de causar uma expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficaz de enzima ADPGPP para originar a desejada redução no teor em óleo. Assim, é preferido causar a expressão do gene ADPGPP nos tecidos de semente da planta e ao longo de todo o desenvolvimento da semente. O promotor escolhido deve ter a desejada especificidade para o tecido e de desenvolvimento. Os especialistas na matéria irão reconhecer que a quantidade de ADPGPP necessária para induzir a desejada diminuição no teor em óleo pode variar com o tipo de planta e que, além disso, -5- demasiada actividade em ADPGPP pode ser nociva para a planta. Assim, a função do promotor deve ser optimizada por selecção de um promotor com as desejadas capacidades de expressão de tecido e força de promotor aproximada e selecção de um transformante que produza a desejada actividade de ADPGPP nos tecidos alvo. Esta selecção de aproximação a partir da piscina de transformantes é habitualmente empregue na expressão de genes estruturais heterólogos em plantas uma vez que existe diferença entre os transformantes contendo o mesmo gene heterólogo devido ao local de inserção do gene dentro do genoma da planta. (Geralmente referido como o "efeito de posição").

Os promotores podem ser identificados para serem específicos a sementes por exame de uma biblioteca de ADNc de uma semente de planta para genes que são selectivamente ou preferencialmente expressos em sementes e então determinar as regiões do promotor para obter promotores selectivos de semente ou realçadores de semente. Acredita-se que a maior parte das enzimas envolvidas no metabolismo de hidratos de carbono têm formas específicas a semente a partir das quais se podem obter promotores específicos a semente. Exemplos de tais enzimas são a sacarose sintetase, invertase, e ADPGPP (ambas as subunidades). Vários promotores específicos a semente são bem conhecidos. A conglicinina-β (também conhecido como a proteína 7S) é uma das principais proteínas de armazenamento da soja (Glicina max) (Tiemey, 1987). Os promotores de cada um dos genes para as três subunidades podem ser usados na presente invenção. A subunidade-β da conglicinina-β tem sido expressa, usando o seu promotor endógeno, nas sementes de petúnia e tabaco transgénicos, mostrando que o promotor funciona de um modo específico a semente noutras plantas (Bray, 1987). O exemplo 1 em baixo demonstra o uso da subunidade a' deste promotor com uma ADPGPP em colza. O gene para a proteína de armazenamento 11S da soja é também conhecido como sendo expresso dum modo específico a semente e o seu promotor pode ser usado na presente invenção.

Dois promotores específicos a semente da Brassica napus têm sido identificados. Eles são o promotor para a napina e o promotor para a cruciferina (Murphy, 1989). Os promotores para os genes que codificam a faseolina (de feijão) e a oleosina (de colza, soja, e outros) são também úteis na presente invenção. (Zheng, 1993).

As zeínas são um grupo de proteínas de armazenamento encontradas no endosperma do milho. Têm sido isolados clones genómicos para genes de zeína (Pedersen, 1982), e os promotores destes clones, incluindo os genes 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD, e gama, podem também ser usados para expressar um gene de ADPGPP nas sementes de milho e outras plantas. Um promotor específico a endosperma da zeína 19 kD tem sido identificado (Quattrocchio, 1990). Outros promotores conhecidos para funcionar no milho incluem os promotores para os seguintes genes: waxy, Brittle, Shrunken 2, enzimas ramificadas I e II, amido sintase, enzimas desramificadas, oelosinas, glutelinas, e sacarose sintases.

Exemplos de promotores apropriados para a expressão de um gene de ADPGPP no trigo incluem aqueles para os genes para as subunidades de ADPGPP, para o limite dos grânulos e outras amido sintetases, para as enzimas ramificadas e desramificadas, para as proteínas embriogénese-abundantes, para as gliadinas, e para as gluteninas. Exemplos de tais promotores no arroz incluem aqueles para os genes para as subunidades de ADPGPP, para o limite dos grânulos e outras amido sintetases, para as enzimas ramificadas, para as enzimas desramificadas, para a sacarose sintetase, e para as glutelinas (Zheng, 1993). -7-

Exemplos de tais promotores para a cevada incluem aqueles para os genes para as subunidades de ADPGPP, para o limite dos grânulos e outras amido sintetases, para as enzimas ramificadas, para as enzimas desramificadas, para a sacarose sintetase, para as hordeínas, para as globulinas embrionárias, e as proteínas específicas a aleurona.

Os promotores para genes que codificam proteínas que não de armazenamento ou para o metabolismo de hidratos de carbono podem ser encontrados como sendo úteis na presente invenção. Por exemplo, o gene da proteína veículo de acilo tem um promotor que se sabe que funciona de um modo específico a semente. (Baerson, 1993). O ARN produzido por uma construção de ADN da presente invenção também contém uma sequência líder 5' não traduzida. Esta sequência pode ser derivada do promotor seleccionado para expressar o gene, e pode ser especificamente modificada de tal forma que aumente a tradução do ARNm. As regiões 5' não traduzidas podem também ser obtidas de ARNs virais, de genes eucariotas apropriados, ou de uma sequência de gene sintética. A presente invenção não está limitada a construções, tal como apresentado nos exemplos seguintes, onde a região não traduzida é derivada da sequência 5' não traduzida que acompanha a sequência do promotor. Mais propriamente, a sequência líder não traduzida pode ser derivada de um promotor ou sequência de código não relacionado tal como acima discutido.

As construções de ADN da presente invenção também contêm uma sequência de codificação estrutural na forma de ADN em dupla cadeia, que codifica um polipeptídeo de fusão compreendendo um péptido de transporte plastídio amino-terminal e uma enzima ADPGPP. A enzima ADPGPP utilizada na presente invenção é de preferência sujeita a controlo alostérico reduzido nas -8- plantas. Uma tal enzima ADPGPP não regulada pode ser seleccionada de enzimas conhecidas que exibem actividade enzimática não regulada ou pode ser produzida por mutagénese de enzimas nativas de ADPGPP bacterianas, ou de algas ou de plantas tal como a seguir discutido em grande detalhe. Em alguns casos, as diferenças substanciais na natureza dos reguladores que modulam a actividade da enzima ADPGPP do tipo selvagem permitem o uso do próprio gene do tipo selvagem; nestes casos, a concentração dos reguladores dentro dos organelos das plantas irão facilitar a extracção de uma significativa actividade da enzima ADPGPP. ADPglucose Pirofosforilases Bacteriana A ADPGPP de E. coli tem sido bem caracterizada como uma enzima fortemente regulada. Tem-se mostrado que o activador fructose 1,6-bifosfato activa a enzima aumentando a sua Vmax, e aumentando a afinidade da enzima para os seus substractos (Preiss, 1966 e Gentner, 1967). Adicionalmente, a fructose 1,6-bifosfato (FBS) também modula a sensibilidade da enzima para os inibidores adenosina-5 '-monofosfato (AMP) e fosfato inorgânico (Pj) (Gentner, 1968).

Em 1981, o gene de ADPGPP da E. coli Kl 2 (g/gC), juntamente com os genes para o glicogénio sintetase e para a enzima ramificada, foram clonados, e o plasmídeo resultante foi designado por pOP12 (Okita, 1981). O gene g/gC, que foi sequenciado em 1983, contém 1293 pb (SEQ ID NO:l) e codifica 431 aminoácidos (SEQ ID NO:2) com um peso molecular deduzido de 48.762 (Baecker, 1983). O gene g/gC16 foi gerado por mutação química da estirpe PA 601 de E. coli Kl2 com N-metil-N'-nitrosoguanidina (Cattaneo, 1969 e Creuzet- -9-

Sigal, 1972). Quando as cinéticas do g/gC 16 de ADPGPP foram comparadas com as progenitoras, verificou-se que o g/gC16 de ADPGPP tinha uma maior afinidade para a ADPglucose na ausência do activador, fructose 1,6-bifosfato (FBP), e a concentração de FBP necessária para uma activação metade da máxima da enzima diminuiu no g/gC16. A inibição da actividade da ADPGPP no g/gC16 pela 5'-AMP (AMP) foi também reduzida. A sequência de ADN do gene g/gC16 é agora conhecida (SEQ ID NO: 3) (Kumar, 1989). Quando a sequência de aminoácidos deduzida de g/gC 16 (SEQ ID NO: 4) foi comparada com a E. coli K-12 3000 não isogénica, foi notada uma troca de aminoácido: Gli 336 com Asp (Meyer et al., 1993).

Uma série de outros mutantes de ADPGPP têm sido encontrados em E. coli. A expressão de qualquer destes ou outros ADPGPP bacterianos do tipo selvagem ou mutantes podem também ser usados para aumentar a produção de amido em plantas. A estirpe 6047 de E. coli Kl2 (g/gC47) acumula cerca da mesma quantidade de glicogénio durante a fase estacionária assim como a estirpe 618 (g/gC16). A estirpe 6047, tal como a 618, mostram uma maior afinidade aparente para a FBP, e maior actividade na ausência de FBP. No entanto, a enzima da estirpe 6047 é relatada como sendo mais sensível a inibição por AMP quando comparada com a enzima da estirpe 618 (Latil-Damotte, 1977). O gene g/gC da Salmonella typhimurium LT2 também tem sido clonado e sequenciado (Leung e Preiss 1987a). O gene codifica 431 aminoácidos com um peso molecular deduzido de 45.580. O gene g/gC de Salmonella typhimurium LT2 e o mesmo gene de E. coli K-12 têm 90% de identidade ao nível dos aminoácidos e 80% de identidade ao nível do ADN. Tal como a ADPGPP de E. coli, a ADPGPP de Salmonella typhimurium LT2 é também activada pela FBP e é inibida pela AMP (Leung e Preiss 1987b). Esta substancial - 10- conservação em sequências de aminoácidos sugere que a introdução de mutações que causam o aumento da actividade de ADPGPP em E. coli no gene ADPGPP de S. Typhimurium deve ter um efeito similar na enzima ADPGPP deste organismo.

Uma série de outras ADPGPPs bacterianas têm sido caracterizadas pela sua resposta a activadores e inibidores (para análise ver: Preiss 1973). Tal como a ADPGPP de E. coli, as ADPGPPs de Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Citrobacter freundii, e Escherichia aurescens são todas activadas pela FBP e são inibidas pela AMP. A ADPGPP de Aeromonas formicans é activada pela fructose 6-fosfato ou FBP, e é inibida pela ADP. A ADPGPP de Serratia marcescens, no entanto, não foi activada por qualquer metabolito testado. A Rhodospirillum rubrum fotossintética tem uma ADPGPP que é activada pelo piruvato, e nenhum dos compostos testados, incluindo Pj, AMP ou ADP, inibem a enzima. Várias ADPGPPs de algas têm sido estudadas e verificou-se que têm uma regulação similar à encontrada para ADPGPPs de plantas. Obviamente, as ADPGPPs de vários organismos podem ser usadas para aumentar a biossíntese e acumulação de amido em plantas. ADPglucose Pirofosforilases de Planta A certa altura, pensou-se que a UDPglucose era o substracto primário para a biossíntese de amido em plantas. No entanto, verificou-se ser a ADPglucose um melhor substracto para a biossíntese de amido do que a UDPglucose (Recondo, 1961). Este mesmo relatório refere que a actividade de ADPGPP foi encontrada em materiais de plantas.

Uma ADPGPP de folha de espinafre foi parcialmente purificada e mostrou-se ser activada pela 3-fosfoglicerato (3-PGA) e inibida por fosfato - 11 - inorgânico (Ghosh et al., 1966). A divulgação de Ghosh et al. sugeria que a biossíntese de amido de folha de espinafre era regulada pelos níveis de ADPglucose. O activador, 3-PGA, é o produto primário da fixação de CO2 na fotossíntese. Durante a fotossíntese, os níveis de 3-PGA iriam aumentar, causando a activação da ADPGPP. Ao mesmo tempo, os níveis de P, iriam diminuir devido à fotofosforilação, diminuindo a inibição da ADPGPP. Estas mudanças iriam causar um aumento na produção da ADPglucose e na biossíntese de amido. Durante a ausência de luz, os níveis de 3-PGA iriam diminuir, e os níveis de Pj iriam aumentar, diminuindo a actividade da ADPGPP e, portanto, diminuindo a biossíntese da ADPglucose e amido. A ADPGPP de folhas de espinafre foi posteriormente purificada até à homogeneidade e mostrou conter subunidades de 51 e 54 kDa (Morell, 1987). Baseado em anticorpos feitos crescer contra as duas subunidades, a proteína de 51 kDA apresenta homologia com ambos os ADPGPPs do endosperma de milho e tubérculo de batata, mas não com a proteína de 54 kDA da folha de espinafre. A sequência de um clone de ADNc de uma subunidade de ADPGPP de endosperma de arroz tem sido divulgada (Anderson, 1989a). O clone codificou uma proteína de 483 aminoácidos. Uma comparação entre as sequências da ADPGPP de endosperma de arroz e a proteína ADPGPP de E. coli mostra cerca de 30% de identidade. Também em 1989, um clone de ADNc com praticamente a totalidade do comprimento para a ADPGPP de endosperma de trigo foi sequenciada (Olive, 1989). O clone de APGPP de endosperma de trigo tem cerca de 24% de identidade com a sequência da proteína ADPGPP de E. coli, enquanto que os clones de trigo e arroz têm 40% de identidade ao nível da proteína. A ADPGPP de endosperma de milho tem sido purificada e mostra - 12- ter propriedades catalíticas e regulatórias similares às de outras ADPGPPs de plantas (Plaxton, 1987). O peso molecular nativo da enzima de endosperma de milho é de 230.000, e é composta de quatro subunidades de tamanho similar. O peso molecular nativo da ADPGPP de tubérculo de batata é divulgado como sendo de 200.000, com um tamanho de subunidade de 50.000 (Sowokinos, 1982). A actividade da ADPGPP de tubérculo é quase completamente dependente da 3-PGA, e tal como outras ADPGPPs de planta, é inibida pela Pj. As ADPGPPs de tubérculo e folha de batata foram demonstradas como tendo propriedades físicas, catalíticas, e alostéricas similares (Anderson, 1989b).

Produção de Genes Alterados de ADPglucose Pirofosforilase por Mutagénese

Os entendidos na especialidade irão reconhecer que embora não sendo absolutamente necessário, obtêm-se melhores resultados usando genes de ADPGPP sujeitos a uma regulação alostérica reduzida (“desregulados”) e mais preferencialmente não sujeitos a níveis significativos de regulação alostérica (“não regulados”) enquanto se mantém uma actividade catalítica adequada. Em células que normalmente não acumulam quantidades significativas de amido, a expressão de uma enzima “regulada” pode ser suficiente. Em células e tecidos acumuladores de amido, uma enzima “desregulada” ou “não regulada” é o sistema preferido. A sequência de codificação estrutural para uma enzima ADPGPP bacteriana ou de planta pode ser mutagenizada em E. coli ou noutro hospedeiro apropriado e examinada para uma maior produção de glicogénio tal como descrito para o gene g/gC16 de E. coli. Deve ser realizado que o uso de um gene que codifica uma enzima ADPGPP que está somente sujeito a moduladores (activadores/inibidores), que estão presentes na planta seleccionada em níveis que não inibem de forma significativa a actividade catalítica, não necessitarão de - 13- modificações da enzima (gene). Estes genes de ADPGPP “não regulados” ou “desregulados” podem então ser inseridos em plantas tal como aqui descrito para obter plantas transgénicas contendo um maior teor em amido.

Por exemplo, qualquer gene de ADPGPP pode ser clonado na estirpe AC70R1-504 de E. coli B (Leung, 1986). Esta estirpe tem um gene de ADPGPP imperfeito, e é desreprimido cinco a sete vezes para as outras enzimas biossintéticas de glicogénio. O gene/ADNc de ADPGPP pode ser colocado num plasmídeo antes do promotor glgC de E. coli ou qualquer outro promotor bacteriano. Esta construção pode então ser sujeita a mutagénese quer dirigida para local quer aleatória. Após a mutagénese, as células irão ser plaqueadas em meio enriquecido com glucose a 1%. Após se terem desenvolvido as colónias, as placas irão ser inundadas com solução de iodo (I2 a 0,2% p/v, Kl a 0,4% p/v em H20, Creuzet-Sigal, 1972), Por comparação com uma placa idêntica contendo E. coli não mutada, as colónias que produzem mais glicogénio podem ser detectadas pela sua coloração no escuro.

Uma vez que o processo de mutagénese pode ter criado mutações no promotor, qualquer mutante de ADPGPP putativo da primeira série de exames irá que ter o gene de ADPGPP reclonado num vector não mutado e o plasmídeo resultante irá ser examinado da mesma forma. Os mutantes que passam em ambas as séries de exame irão então ter as suas actividades de DAPGPP analisadas com e sem os activadores e inibidores. Por comparação das respostas das ADPGPPs mutadas aos activadores e inibidores para as enzimas não mutadas, o novo mutante pode ser caracterizado. A divulgação por Plaxton e Preiss em 1987 demonstra que a ADPGPP de endosperma de milho tem propriedades regulatórias similares às de outras ADPGPPs de planta. Eles mostram que divulgações anteriores - 14- reivindicando que a ADPGPP de endosperma de milho tinham um aumento de actividade na ausência de activador (3-PGA) e diminuição de sensibilidade ao inibidor (Pj), eram devidos a uma clivagem proteolítica da enzima durante o processo de isolamento. Por alteração dum gene de ADPGPP para produzir uma enzima análoga à ADPGPP de endosperma de milho proteoliticamente clivada, irá ser alcançada uma menor regulação alostérica. A recente divulgação com respeito à aparente inovação da regulação da ADPGPP de endosperma de cevada e a sua aparente insensibilidade à 3-PGA não é geralmente aceite uma vez que a divulgação mostra que a preparação da enzima é rapidamente degradada e pode sofrer dos mesmos problemas identificados para a preparação do endosperma de milho.

Para analisar uma cultura líquida de E. coli para a actividade da ADPGPP, as células são feitas rodar numa centrifugadora e ressuspensas em cerca de 2 ml de tampão de extracção (glicilglicina 0,05 M pH 7,0; DTE 5,0 mM; EDTA 1,0 mM) por grama de massa de célula. As células são lisadas passando-as duas vezes através de uma Prensa Francesa. Os extractos de células são centrifugados numa microcentrífuga durante 5 minutos, e os sobrenadantes são dessalgados passando-os através de uma coluna de rotação G-50.

A análise da enzima para a síntese de ADPglucose é uma modificação de um procedimento publicado (Haugen, 1976). Cada 100 μΐ de análise contém: 10 pmol de Hepes pH 7,7; 50 pg BSA; 0,05pmole de [14C]glucose-l-fosfato, 0,15 pmole ATP; 0,5 pmole MgCl2; 0,1 pg de pirofosfatase inorgânica cristalina de levedura, molibdato de amónio 1 mM, enzima, activadores ou inibidores como desejado, e água. A análise é incubada a 37°C durante 10 minutos, e é parada por ebulição durante 60 segundos. A análise é centrifugada numa microcentrífuga, e 40 pl do sobrenadante são injectados numa coluna HPLC de permuta aniónica Synchrom Synchropak AX-100. A - 15- amostra é eluída com KPj 65 mM pH 5,5. A [14C]glucose-l-fosfato não reagida elui durante 7-8 minutos, e a [14C]ADPglucose elui em aproximadamente 13 minutos. A actividade da enzima é determinada pela quantidade de radiactividade encontrada no pico de ADPglucose. A actividade da enzima ADPGPP de planta é fortemente regulada, por ambos os efectores positivo (3-fosfoglicerato; 3-PGA) e negativo (fosfato inorgânico; Pj) (Ghosh e Preiss, 1996; Copeland e Preiss 1981; Sowokinos e Preiss 1982; Morell et al., 1987; Plaxton e Preiss, 1987; Preiss, 1988) e a razão de 3-PGA:Pi desempenha um papel proeminente na regulação da biossíntese de amido pela modulação da actividade da ADPGPP (Kaiser e Bassham, 1979). As enzimas de ADPGPP de planta são heterotetrâmeros de duas subunidades grandes/”contraídas” e duas pequenas/”Frágeis” (Morell et al., 1987; Lin et al., 1988a, 1988b; Krishnan et al., 1986; Okita et al., 1990) e existe forte evidência para sugerir que o heterotetrâmero é a forma mais activa da ADPGPP. Suporte para esta evidência vem do isolamento de mutantes “sem amido” de planta que são deficientes numa das subunidades (Dickinson e Preiss, 1969; Lin et al., 1988a, 1988b) e da caracterização de um homotetrâmero de “ADPGPP” de subunidades pequenas que se verificou ter somente baixa actividade de enzima (Lin et al., 1988b). Adicionalmente, têm sido identificados resíduos de interacção efectora proposta para ambas as subunidades (Morell et al., 1988). A evidência directa para a forma activa da enzima e o suporte adicional dos dados de cinética divulgados para a enzima de batata purificada, vem da expressão da actividade da ADPGPP de batata em E. coli e a comparação das propriedades cinéticas deste material com as dos tubérculos de batata (Iglesias et al., 1993).

As variantes de enzima não regulada da ADPGPP de planta são identificadas e caracterizadas de um modo similar ao que resultou no isolamento do glgC\6 de E. coli e mutantes relacionados. Uma série de ADNc's de ADPGPP de planta, ou porções de tais ADNc's, para ambas as subunidades grande e pequena, foram clonados a partir de quer de monocotiledóneas quer de dicotiledóneas (Anderson et al., 1989a; Olive et al., 1989; Muller et al., 1990). As proteínas codificadas pelos ADNc's de planta, bem como aquelas descritas de bactérias, mostram um elevado grau de conservação (Bhave et al., 1990). Em particular, uma região altamente conservada, contendo também alguns dos resíduos implicados em função de enzima e interacções de efector, foi identificada (Morell et al., 1998; Smith-White e Preiss, 1992). Clones dos genes de subunidades de ADPGPP de tubérculo de batata têm sido isolados. Estes incluem um gene de uma subunidade pequena completa, junto por adição de sequências do primeiro exão do clone genómico com um clone de ADNc com praticamente a totalidade do comprimento do mesmo gene, e um gene praticamente completo para a subunidade grande. A sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:7) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:8) do gene da subunidade pequeno junta são dadas em baixo. A sequência de nucleótidos aqui apresentada difere do gene originalmente isolado nas seguintes formas: um local 5g/II+Nco/ foi introduzido no codão ATG para facilitar a clonagem do gene em vectores de expressão de E. coli e de plantas por mutagénese dirigida para local utilizando a sequência oligonucleótida iniciadora GTTGATAACAAGATC-TGTTAACCATGGCGGCTTCC (SEQ ID NO:l 1).

Um local Saci foi introduzido no codão de terminação utilizando a sequência oligonucleótida iniciadora CCAGTTAAAACGGAGCTCATCAGA-TGATGATTC (SEQ ID NO: 12). O local Saci serve como um local de clonagem 3'. Um local Bglii interno foi removido utilizando a sequência oligonucleótida iniciadora GTGTGAGAACATAAATCTTGGATATGTTAC (SEQ ID NO: 13). Este gene junto foi expresso em E. coli sob o controlo do promotor recA numa cassete de expressão PrecA-genelOL (Wong et al., 1988) para produzir níveis mensuráveis da proteína. Um codão de metionina de iniciação é colocado por - 17- mutagénese dirigida para local utilizando a sequência oligonucleótida iniciadora GAATTCACAGGGCCATGGCTCTAGACCC (SEQ ID NO: 14) para expressar o gene maturo. A sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:9) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) do gene da subunidade grande praticamente completa são dadas em baixo. Um codão de metionina de iniciação foi colocado no terminal-N maturo por mutagénese dirigida para local utilizando a sequência oligonucleótida iniciadora AAGATCAAACCTGCCATGGCTTACTCTGTGAT-CACTACTG (SEQ ID NO: 15). O objectivo da metionina de iniciação é facilitar a expressão deste gene de subunidade grande em E. coli. Um local Yiindlll é localizado 103 pb após o codão de terminação e serve como o local de clonagem 3'. O gene de ADPGPP grande completo é isolado pelo método 5' RACE (Rápida Amplificação de Extremidades de ADNc; Frohman, 1990; Loh, 1989). Os oligonucleótidos iniciadores para este método são como se segue: 1) GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGGCCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 16); 2) GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGG (SEQ ID NO: 17); e 3) CCTCTAGACAGTCGATCAGGAGCAGATGTACG (SEQ ID NO: 18). Os dois primeiros são o equivalente aos iniciadores ANpolyC e AN de Loh et al. (1989), respectivamente, e o terceiro é o complemento inverso a uma sequência no gene de ADPGPP grande, localizado após o local Pst I na SEQ ID NO:9. Os produtos da PCR da sequência 5' são clonados como fragmentos EcoRI/HindUI/BamHl-Pstl e são facilmente ligados com a porção de gene existente.

Os mutantes de enzimas debilmente reguladas da ADPGPP são identificados marcando inicialmente as colónias de uma cultura de E coli sujeita a mutação que mostram uma elevada síntese de glicogénio, colorando com iodo as colónias com 24-48 horas em placas de Luria-Agar contendo glucose a 1%, e então caracterizando as respostas das enzimas ADPGPP destes isolados para os - 18- efectores positivos e negativos desta actividade (Cattaneo et al., 1969; Preiss et al., 1971). Uma aproximação similar é aplicada ao isolamento de tais variantes de enzimas ADPGPP de planta. Dado um sistema de expressão para cada um dos genes de subunidade, a mutagénese de cada gene é levada a cabo separadamente, por qualquer um de uma variedade de meios conhecidos, quer químicos quer físicos (Miller, 1972) em culturas contendo o gene ou em ADN purificado. Outra aproximação é usar um método de PCR (Ehrlich, 1989) no gene completo na presença de iões Mn++ inibidores, uma condição que conduz a uma maior razão de má incorporação de nucleótidos. Um procedimento de PCR pode também ser usado com iniciadores adjacentes a somente uma região específica do gene, e este fragmento mutagenizado) então reclonado nos segmentos de gene não mutagenizados. Pode também ser usado um processo de oligonucleótido sintético aleatório para gerar uma região pequena altamente mutagenizada do gene misturando nucleótidos na reacção sintética para resultar numa má incorporação em todas as posições nesta região. Esta região pequena é flanqueada por locais de restrição que são usados para reinserir esta região na restante parte do gene. As culturas ou transformantes resultantes são examinadas pelo método do iodo padrão para aqueles exibindo níveis de glicogénio superiores aos dos controlos. De preferência este exame é levado a cabo numa estirpe de E. coli deficiente somente em actividade de ADPGPP e é fenotipicamente glicogénio-negativa e que seja complementada para glicogénio-positiva pelo glgC. A estirpe de E. coli deve reter as outras actividades necessárias para a produção de glicogénio. Ambos os genes são expressos juntamente no mesmo hospedeiro de E. coli colocando os genes em plasmídeos compatíveis com diferentes genes de marca de selecção, e estes plasmídeos têm também números de cópias similares no hospedeiro bacteriano para maximizar a formação heterotetrâmera. Um exemplo de um tal sistema de expressão é a combinação do pMON17335 e pMON17336 (Iglesias et al., 1993). O uso de plasmídeos separados permite o exame de uma população mutagenizada de somente um gene, ou em conjunção com o segundo gene seguindo-se a transformação num hospedeiro competente expressando o outro gene, e o exame de duas populações mutagenizadas seguindo-se a combinação destes no mesmo hospedeiro. A seguir ao re-isolamento do ADN plasmídeo das colónias com maior coloração com iodo, as sequências de codificação de ADPGPP são reclonadas em vectores de expressão, o fenótipo verificado, e a actividade de ADPGPP e a sua resposta às moléculas efectoras determinada. As variantes melhoradas irão exibir maior Vmax, menor inibição pelo efector negativo (Pi), ou menor dependência do activador (3-PGA) para uma actividade máxima. O exame para tais características melhoradas envolve a determinação da actividade de ADPGPP na presença de Pi a 0,045 mM (I0)5 = 0,045 mM) ou na presença de 3-PGA a 0,075 mM (A0;5 = 0,075 mM). As variantes úteis irão exibir uma inibição <40% a esta concentração em P; ou exibir uma actividade >50% a esta concentração em 3-PGA. A seguir ao isolamento de variantes melhoradas e à determinação da subunidade ou subunidades responsável(eis), a(s) mutação(ões) é(são) determinada(s) por sequenciação de nucleótidos. A mutação é confirmada recreando esta alteração por mutagénese dirigida para local e reanálise da actividade da ADPGPP na presença de activador e inibidor. Esta mutação é então transferida para o gene ADNc de ADPGPP completo equivalente, reclonando a região contendo a alteração da forma de expressão bacteriana alterada para a forma de planta contendo a sequência alvo de amiloplasto, ou por mutagénese dirigida para local do gene de ADPGPP de planta nativo completo.

Expressão Dirieida a Cloroplasto/Amiloplasto da Actividade de ADPGPP

Sabe-se que a biossíntese de amido dá-se nos cloroplastos e amiloplastos de plantas (aqui conjuntamente referidos como plastídios). Nas plantas que têm sido estudadas, a ADPGPP está localizada nestes plastídios. Muitas proteínas localizadas no cloroplasto são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são dirigidas para o cloroplasto por um péptido de transporte cloroplasto (CTP) que é removido durante os passos de importação. Exemplos de tais proteínas de cloroplastos incluem a subunidade pequena da Ribulose-l,5-bifosfato carboxilase (ssRUBISCO, SSU), 5-enolpiruvatossicimato-3-fosfato sintetase (EPSPS), Ferredoxina, oxidorreductase da Ferredoxina, o complexo de recolha de Luz da proteína I e proteína II, e Tiorredoxina F. Tem sido demonstrado in vivo e in vitro que proteínas que não do cloroplasto podem ser conduzidas para o cloroplasto por uso de proteínas de fusão com um CTP e que uma sequência de CTP é suficiente para conduzir uma proteína para o cloroplasto. Do mesmo modo, as proteínas de amiloplastos são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são conduzidas para o amiloplasto por um péptido de transporte amiloplasto (ATP).

Nas inclusões exemplares, uma CTP especializada, derivada do gene ssRUBISCO IA de Arabidobsis thaliana (SSU IA) (TIMKO, 1998) foi usado. Este CTP (CTP1) foi construído por uma combinação de mutagénese dirigida para local. A sequência de nucleótidos de CTP1 (SEQ ID NO:5) e a correspondente sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:6) são dadas em baixo. A CTP 1 é feita da CTP SSU IA (aminoácidos 1-55), os primeiros 23 aminoácidos da proteína SSU 1A matura (56-78), um resíduo serina (aminoácido 79), um novo segmento que repete os aminoácidos 50 a 56 a partir da CTP e os dois primeiros a partir da proteína matura (aminoácidos 80-87), e um resíduo alanina e metionina (aminoácidos 88 e 89). Um local de restrição Ncol está localizado na extremidade 3' (atravessa o codão Met) para facilitar a construção de fusões precisas no 5' de um gene de ADPGPP. Numa fase posterior, foi introduzido um local BglII contra a corrente do terminal-N das sequências de SSU 1 Apara facilitar a introdução das fusões em vectores de transformação de plantas. Foi colocada uma fusão entre o ADN estrutural que codifica a CTP1 CTP e o gene g/gC16 de E. coli para -21 - produzir uma sequência de ADN estrutural completa codificando o péptido de transporte plastídio/polipeptídeo de fusão ADPGPP.

Os entendidos na matéria irão reconhecer que se for usado quer um único ADNc de ADPGPP de planta que codifica subunidades contraídas e/ou frágeis quer ambos os ADNc de ADPGPP de planta que codificam subunidades contraída e frágeis na prática da presente invenção, a CTP ou ATP endógena pode mais facilmente e preferencialmente ser usada. Por isso, para aplicação da presente invenção o termo "péptidos de transporte plastídio" deve ser interpretado como incluindo ambos os péptidos de transporte cloroplasto e peptídeos de transporte amiloplasto. Os entendidos na matéria irão também reconhecer que podem ser feitas várias outras construções quiméricas que utilizam a funcionalidade de um péptido de transporte plastídio particular para importar a enzima ADPGPP contígua para o cloroplasto/amiloplasto da célula de planta dependendo da especificidade a tecido do promotor.

Sinal de Poliadenilacão A região 3' não traduzida do gene de planta quimérica contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleótidos poliadenilados à extremidade 3' do ARN. Exemplos de regiões 3' apropriados são (1) as regiões 3' transcritas, não traduzidas contendo o sinal de poliadenilação de Agrobacterium os genes plasmídeos indutores de tumor (Ti), tal como o gene da nopalina sintetase (NOS), e (2) genes de plantas tais como os genes da proteína de armazenamento da soja e a subunidade pequena do gene da ribulose-l,5-bifosfato carboxilase (ssRUBISCO). Um exemplo de uma região 3' preferida é aquela do gene NOS, descrita em grande detalhe nos exemplos a seguir. -22-

Transformação/Regeneração de Plantas

As plantas que podem ser manufacturadas para conter um menor teor em óleo através da prática da presente invenção incluem, mas não estão limitadas ao milho, trigo, arroz, ervilha, amendoim, colza oleaginosa, algodão, cevada, sorgo, soja, girassol, amendoeira, cajueiro, nogueira-pecã, e nogueira.

Uma molécula de ADN em dupla cadeia da presente invenção contendo o gene de ADPGPP de planta funcional pode ser inserido no genoma de uma planta por qualquer método apropriado. Vectores de transformação de plantas apropriados incluem aqueles derivados de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens, bem como aqueles divulgados, e. g., por Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) e publicação EPO 120.516 (Schilperoort et al.). Em adição a vectores de transformação de plantas derivados dos plasmídeos Ti ou indutor de raiz (Ri) de Agrobacterium, podem ser usados métodos alternativos para inserir as construções de ADN desta invenção em células de plantas. Tais métodos podem envolver, por exemplo, o uso de liposomas, electroporação, produtos químicos que aumentem a captação de ADN livre, descarga de ADN livre via bombardeamento micropojéctil, e transformação usando vírus ou pólen.

Exemplos de vectores designados para a expressão de genes g/gC16 e outros genes de ADPGPP em monocotiledóneas e dicotiledóneas são relatados por Kishore em WO 91/19806. Estes são usados para transformar as células de plantas desejadas pelo método apropriado.

Quando um adequado número de células (ou protoplastos) contendo o gene ou ADNc de ADPGPP são obtidas, as células (ou protoplastos) são regeneradas em todas as plantas. A escolha da metodologia para os passos de -23 - regeneração não é crítica, estando disponíveis protocolos apropriados para hospedeiros de Leguminosae (alfalfa, soja, trevo, etc.), Cruciferae (couve, rabanete, coza oleaginosa, etc.), Gramineae (trigo, cevada, arroz, milho, etc.), vários cereais florais, tal como o girassol, e árvores produtoras de nozes, tais como amendoeiras, cajueiros, nogueiras, e nogueiras-pecãs. Ver, e.g., Ammirato, 1984; Shimamoto, 1989; Fromm, 1990; Vasil, 1990; Hayashimoto, 1989; eDatta, 1990.

Os exemplos seguintes são fornecidos para melhor elucidar a prática da presente invenção e não devem ser interpretados, em algum caso, como limitantes do alcance da presente invenção.

Exemplo 1

Para expressar o gene glgC16 de E. coli em células de plantas, e para conduzir a enzima para os plastídios, o gene necessita de ser fundido a um ADN que codifica o péptido de transporte de direcção para plastídio (a seguir referido como o gene CTP/ADPGPP), e às regiões regulatórias de plantas adequadas. Exemplos pormenorizados de como tal se deve realizar pode ser encontrado em WO 91/19806. O gene de fusão CTP-g/gC16 foi colocado atrás do promotor de armazenamento conglicininaP- 7S de soja em cima descrito. Esta cassete foi clonada no pMON 17227, um vector plasmídeo Ti divulgado e descrito por Barry et al. em WO 92/04449 (1991), para formar o vector pMON17315. Este vector foi usado para transformar nogueira-pecã por transformação de Agrobacterium seguido de selecção com glifosato. As plantas regeneradas foram analisadas e a presença da enzima na maioria dos transformantes foi confirmada por análises Western blot. As sementes de quatro linhagens transformadas têm sido obtidas e -24- analisadas para o teor em óleo, amido, e proteína e percentagem de humidade. Verificou-se que o teor em amido aumentou para 8,2-18,2 porcento (baseado em peso puro)comparado com 0,9-1,6 porcento em linhagens de controlo (transformadas somente com o pMON17227). Verificou-se que o teor em óleo diminuiu desde 26,7-31,6 porcento nos controlos para 13,0-15,5 porcento nas linhagens transformadas. O teor em proteína e a percentagem de humidade não foram alteradas significativamente. Em algumas linhagens o peso de semente aumentou o que pode indicar que também pode ser aumentado o rendimento total. -25-

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(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA D PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DATÇA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 1: DESDE 1 ATE 1296 -31 -

^ssssx^f^ B essa**® (ix) CARACTERISTICAS:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1293 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: ATG GTT AGT TTA GAG AAG AAC GAT CAC TTA ATG TTG GCG CGC CAG CTG 48 Met Vai Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gin Leu 1 5 10 15 CCA TTG AAA TCT GTT GCC CTG ATA CTG GCG GGA GGA CGT GGT ACC CGC 96 Pro Leu Lys Ser Vai Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg 20 25 30 CTG AAG GAT TTA ACC AAT AAG CGA GCA AAA CCG GCC GTA CAC TTC GGC 144 Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Vai His Phe Gly 35 40 45 GGT AAG TTC CGC ATT ATC GAC TTT GCG CTG TCT AAC TGC ATC AAC TCC 192 Gly Lys Phe Arg Ile Ile Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser 50 55 60 GGG ATC CGT CGT ATG GGC GTG ATC ACC CAG TAC CAG TCC CAC ACT CTG 240 Gly Ile Arg Arg Met Gly Vai Ile Thr Gin Tyr Gin Ser His Thr Leu 65 70 75 80 GTG CAG CAC ATT CAG CGC GGC TGG TCA TTC TTC AAT GAA GAA ATG AAC 288 Vai Gin His Ile Gin Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn 85 90 95 GAG TTT GTC GAT CTG CTG CCA GCA CAG CAG AGA ATG AAA GGG GAA AAC 336 Glu Phe Vai Asp Leu Leu Pro Ala Gin Gin Arg Met Lys Gly Glu Asn 100 105 110 TGG TAT CGC GGC ACC GCA GAT GCG GTC ACC CAA AAC CTC GAC ATT ATC 384 Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Vai Thr Gin Asn Leu Asp Ile Ile 115 120 125 CGT CGT TAT AAA GCG GAA TAC GTG GTG ATC CTG GCG GGC GAC CAT ATC 432 Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Vai Vai Ile Leu Ala Gly Asp His Ile 130 135 140 TAC AAG CAA GAC TAC TCG CGT ATG CTT ATC GAT CAC CTC GAA AAA GGT 480 Tyr Lys Gin Asp Tyr Ser Arg Met Leu Ile Asp His Vai Glu Lys Gly 145 150 155 160 GTA CGT TCT ACC GTT GTT TGT ATG CCA GTA CCG ATT GAA GAA GCC TCC 528 Vai Arg Cys Thr Vai Vai Cys Met Pro Vai Pro Ile Glu Glu Ala Ser 165 170 175 GCA TTT GGC GTT ATG GCG GTT GAT GAG AAC GAT AAA ACT ATC GAA TTC 576 Ala Phe Gly Vai Met Ala Vai Asp Glu Asn Asp Lys Thr Ile Glu Phe 1Θ0 185 190 GTG GAA AAA CCT GCT AAC CCG CCG TCA ATG CCG AAC GAT CCG AGC AAA 624 Vai Glu Lys Pro Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys -32- -32-

195 200 205 TCT CTG GCG AGT ATG GGT ATC TAC GTC TTT GAC GCC GAC TAT CTG TAT 672 Ser Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr 210 215 220 GAA CTG CTG GAA GAA GAC GAT CGC GAT GAG AAC TCC AGC CAC GAC TTT 720 Giu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe 225 230 235 240 GGC AAA GAT TTG ATT CCC AAG ATC ACC GAA GCC GGT CTG GCC TAT GCG 768 Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala 245 250 255 CAC CCG TTC CCG CTC TCT TOC GTA CAA TCC GAC CCG GAT GCC GAG CCG 816 His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Val Gin Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro 250 265 270 TAC TGG CGC GAT GTG GGT ACG CTG GAA GCT TAC TGG AAA GCG AAC CTC 864 Tyr Trp Arg Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu 275 280 28S GAT CTG GCC TCT GTG GTG CCG GAG CTG GAT ATG TAC GAT CGC AAT TGG 912 Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Glu Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp 290 295 300 CCA ATT CGC ACC TAC AAT GAA TCA TTA CCG CCA GCG AAA TTC GTG CAG 960 Pro Xle Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lye Phe Val Gin 305 310 315 320 GAT CGC TCC GGT AGC CAC GGG ATG ACC CTT AAC TCA CTG GTT TCC GGC 1008 Asp Arg ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Gly 325 330 335 GGT TGT GTG ATC TCC GGT TCG GTG GTG GTG CAG TCC GTT CTG TTC TCG 1056 Gly Cys Vai Xle Ser Gly Ser Val Val Val Gin Ser Val Leu Phe Ser 340 345 350 CGC GTT CGC GTG AAT TCA TTC TCC AAC ATT GAT TCC GCC GTA TTG TTA 1104 Arg Vai Arg val Asn Ser Phe Cys Asn Xle Asp Ser Ala Val Leu Leu 355 350 365 CCG GAA GTA TGG GTA GGT CGC TCG TGC CGT CTG CGC CGC TGC GTC ATC 1152 Pro Glu val Trp val Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Val Ile 370 375 380 GAT CGT GCT TGT GTT ATT CCG GAA GGC ATG GTG ATT GGT GAA AAC GCA 1200 Asp Arg Ala Cys val Xle Pro Glu Gly Met Val Ile Gly Glu Asn Ala 385 390 395 400 GAG GAA GAT GCA CGT CGT TTC TAT CGT TCA GAA GAA GGC ATC GTG CTG 1248 Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser Glu Glu Gly Ile Val Leu 405 410 . 415 GTA ACG CGC GAA ATG CTA CGG AAG TTA GGG CAT AAA CAG GAG CGA TAA 1296 Vai Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His Lys Gin Glu Arg -33- (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 431 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DAXA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RE$IDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 2: DESDE 1 ATE 431 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Met Val Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gin Leu 1 5 10 15 Pro Leu Lys Ser Val Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg 20 25 30 Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Val His Phe Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Arg Xle Xle Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser 50 55 60 Gly Xle Arg Arg Met Gly Val Xle Thr Gin Tyr Gin Ser His Thr Leu 65 70 75 80 Val Gin His Ile Gin Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn 85 90 95 Glu Phe Val Asp Leu Leu Pro Ala Gin Gin Arg Met Lys Gly Glu Asn 100 105 110 Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Val Thr Gin Asn Leu Asp Ile Ile 115 120 125 Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Val lie Leu Ala Gly Asp His Ile 130 135 140 Tyr Lys Gin Asp Tyr Ser Arg Met Leu Xle Asp His Val Glu Lys Gly 145 150 155 160 Val Arg Cys Thr Val Val Cys Met Pro Val Pro Xle Glu Glu Ala Ser 165 170 175 Ala Phe Gly Val Met Ala Val Asp Glu Asn Asp Lys Thr Ile Glu Phe 180 185 190

Val Glu Lys Pro Ala Aen Pro Pro Ser Met Pro Aen Asp Pro Ser Lys -34- 195 200 205

Ser Leu Ala ser Met Gly Ile Tyr Vai Phe Aep Ala Asp Tyr Leu Tyr 210 215 220

Glu Leu Leu Glu Glu Aep Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Aep Phe 225 230 235 240

Gly Lye Asp Leu Ile Pro Lye Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala 245 250 255

His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Vai Gin Ser Aep Pro Aep Ala Glu Pro 260 265 270

Tyr Trp Arg Aep Vai Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lye Ala Aen Leu 275 280 285

Asp Leu Ala Ser Vai Vai Pro Glu Leu Asp Met Tyr Aep Arg Asn Trp 290 295 300

Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lye Phe Vai Gin 305 310 315 320

Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Vai Ser Gly 325 330 335

Gly Cys Vai Ile Ser Gly Ser Vai Vai Vai Gin Ser Vai Leu Phe Ser 340 345 350

Arg Vai Arg Vai Asn Ser Phe Cys Asn Ile Asp Ser Ala Vai Leu Leu 355 360 365

Pro Glu Vai Trp Vai Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Vai Ile 370 375 380

Asp Arg Ala Cys Vai Ile Pro Glu Gly Met Vai Ile Gly Glu Asn Ala 385 390 395 400

Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser Glu Glu Gly Ile Vai Leu 405 410 415

Vai Thr Arg Glu Met Leu Arg Lye Leu Gly His Lys Gin Glu Arg 420 425 430 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1296 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (c) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICAS: -35- (QSSsas**

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1293 (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RE$IDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 3: DESDE 1 ATE 1296 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: ATG GTT AGT TTA GAG AAG AAC GAT CAC TTA ATG TTG GCG CGC CAG CTG 48 Met Vai Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gin Leu 1 5 10 15 CCA TTG AAA TCT GTT GCC CTG ATA CTG GCG GGA GGA CGT GGT ACC CGC 96 Pro Leu Lys Ser Vai Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg 20 25 30 CTG AAG GAT TTA ACC AAT AAG CGA GCA AAA CCG GCC GTA CAC TTC GGC 144 Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Vai His Phe Gly 35 40 45 GGT AAG TTC CGC ATT ATC GAC TTT GCG CTG TCT AAC TGC ATC AAC TCC 192 Gly Lys Phe Arg Ile Ile Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser 50 55 60 GGG ATC CGT CGT ATG GGC GTG ATC ACC CAG TAC CAG TCC CAC ACT CTG 240 Gly Ile Arg Arg Met Gly Vai Ile Thr Gin Tyr Gin Ser His Thr Leu 65 70 75 80 GTG CAG CAC ATT CAG CGC GGC TGG TCA TTC TTC AAT GAA GAA ATG AAC 288 Vai Gin His Ile Gin Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn 85 90 95 GAG TTT GTC GAT CTG CTG CCA GCA CAG CAG AGA ATG AAA GGG GAA AAC 336 Glu Phe Vai Asp Leu Leu Pro Ala Gin Gin Arg Met Lys Gly Glu Asn 100 105 110 TGG TAT CGC GGC ACC GCA GAT GCG GTC ACC CAA AAC CTC GAC ATT ATC 384 Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Vai Thr Gin Asn Leu Asp Ile Ile 115 120 125 CGT CGT TAT AAA GCG GAA TAC GTG GTG ATC CTG GCG GGC GAC CAT ATC 432 Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Vai Vai Ile Leu Ala Gly Asp His Ile 130 135 140 TAC AAG CAA GAC TAC TCG CGT ATG CTT ATC GAT CAC GTC GAA AAA GGT 480 Tyr Lys Gin Asp Tyr Ser Arg Met Leu Ile Asp His Vai Glu Lys Gly 145 150 155 160 GTA CGT TGT ACC GTT GTT TGT ATG CCA GTA CCG ATT GAA GAA GCC TCC 528 vai Arg CyB Thr Vai Vai Cys Met Pro Vai Pro Ile Glu Glu Ala Ser 165 170 175 -36- GCA TTT GGC GTT ATG GCG GTT GAT GAG AAC GAT AAA ACT ATC GAA TTC 576 Ala Phe Gly Val Met Ala Val Asp Glu Asn Asp Lys Thr Xle Glu Phe 180 185 190 GTG GAA AAA CCT GCT AAC CCG CCG TCA ATG CCG AAC GAT CCG AGC AAA 624 Vai Glu Lye Pro Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys 195 200 205 TCT CTG GCG AGT ATG GGT ATC TAC GTC TTT GAC GCC GAC TAT CTG TAT 672 Ser Leu Ala Ser Met Gly Xle Tyr Val Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr 210 215 220 GAA CTG CTG GAA GAA GAC GAT CGC GAT GAG AAC TCC AGC CAC GAC TTT 720 Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe 225 230 235 240 GGC AAA GAT TTG ATT CCC AAG ATC ACC GAA GCC GGT CTG GCC TAT GCG 768 Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala 245 250 255 CAC CCG TTC CCG CTC TCT TGC GTA CAA TCC GAC CCG GAT GCC GAG CCG 816 His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Val Gin Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro 260 265 27a TAC TGG CGC GAT GTG GGT ACG CTG GAA GCT TAC TGG AAA GCG AAC CTC 864 Tyr Trp Arg Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu 275 280 285 GAT CTG GCC TCT GTG GTG CCG GAG CTG GAT ATG TAC GAT CGC AAT TGG 912 Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Glu Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp 290 295 300 CCA ATT CGC ACC TAC AAT GAA TCA TTA CCG CCA GCG AAA TTC GTG CAG 960 Pro Xle Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Val Gin 305 310 315 320 GAT CGC TCC GGT AGC CAC GGG ATG ACC CTT AAC TCA CTG GTT TCC GAC 1008 Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Asp 325 330 335 GGT TGT GTG ATC TCC GGT TCG GTG GTG GTG CAG TCC GTT CTG TTC TCG 1056 Gly Cys Vai Ile Ser Gly Ser val Val Val Gin Ser Val Leu Phe Ser 340 345 350 CGC GTT CGC GTG AAT TCA TTC TGC AAC ATT GAT TCC GCC GTA TTG TTA 1104 Arg Vai Arg Val Asn Ser Phe cys Asn xle λβρ Ser Ala Val Leu Leu 355 360 365 CCG GAA GTA TGG GTA GGT CGC TCG TGC CGT CTG CGC CGC TGC GTC ATC 1152 Pro Glu val Trp Val Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Val Xle 370 375 380 GAT CGT GCT TGT GTT ATT CCG GAA GGC ATG GTG ATT GGT GAA AAC GCA 1200 Asp Arg Ala Cys Val Xle Pro Glu Gly Met Val Xle Gly Glu Asn Ala 385 390 395 400 GAG GAA GAT GCA CGT CGT TTC TAT CGT TCA GAA GAA GGC ATC GTG CTG 1248 -37-

Glu Glu Asp Ala Arg 405 Arg Phe Tyr Arg Ser 410 Glu Glu Gly Ile Vai 415 Leu GTA ACG CGC GAA ATG CTA CGG AAG TTA GGG CAT AAA CAG GAG CGA TAA 1296 Vai Thr Arg Glu 420 Met Leu Arg Lys Leu 425 Gly HiS Lys Gin Glu 430 Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 431 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07.-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 4: DESDE 1 ATE 431 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Met Vai Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gin Leu 15 10 15

Pro Leu Lys Ser Vai Ala Leu Xle Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg 20 25 30

Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Vai His Phe Gly 35 40 45

Gly Lys Phe Arg Ile Xle Asp Phe 50 55

Gly Ile Arg Arg Met Gly Vai Ile 65 70

Vai Gin His Ile Gin Arg Gly Trp 85

Glu Phe Vai Asp Leu Leu Pro Ala 100

Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala 115 120

Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Vai 130 135

Tyr Lys Gin Asp Tyr Ser Arg Met 145 150

Vai Arg Cys Thr Vai Vai Cys Met

Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser 60

Thr Gin Tyr Gin Ser His Thr Leu 75 80

Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn 90 95

Gin Gin Arg Met Lye Gly Glu Asn 105 110

Vai Thr Gin Asn Leu Asp Ile Ile 125 vai Ile Leu Ala Gly Asp His Ile 140

Leu Ile Asp His Vai Glu Lys Gly 155 160

Pro Vai Pro Ile Glu Glu Ala Ser -38- 165 170 175

Ala Phe Gly Vai Met Ala Vai Asp Glu Asn Asp Lya Thr Ile Glu Phe 180 185 190

Vai Glu Lya Pro.Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys 195 200 205

Ser Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Vai Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr 210 215 220

Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe 225 230 235 240

Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala 245 250 255

His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Vai Gin Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro 260 265 270

Tyr Trp Arg Asp Vai Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu 275 280 285

Asp Leu Ala Ser Vai Vai Pro Glu Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp 290 295 300

Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Vai Gin 305 310 315 320

Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Vai Ser Asp 325 330 335

Gly Cys Vai Ile Ser Gly Ser Vai Vai Vai Gin Ser Vai Leu Phe Ser 340 345 350

Arg Vai Arg Vai Asn Ser Phe Cys Asn Ile Asp Ser Ala Vai Leu Leu 355 360 365

Pro Glu Vai Trp Vai Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Vai Ile 370 375 380

Asp Arg Ala Cys Vai Ile Pro Glu Gly Met Vai Ile Gly Glu Asn Ala 385 390 395 400

Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser Glu Glu Gly Ile Vai Leu 405 410 415

Vai Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His Lys Gin Glu Arg 420 425 430 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 355 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA: dupla -39- (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 88..354 (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 5: DESDE 1 ATÉ 355 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: AAGCTTGTTC TCATTGTTGT TATCATTATA TATAGATGAC CAAAGCACTA GACCAAACCT 60 CAGTCACACA AAGAGTAAAG AAGAACA ATG GCT TCC TCT ATG CTC TCT TCC 112

Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser 1 5 GCT ACT ATG GTT GCC TCT CCG GCT CAG GCC ACT ATG GTC GCT CCT TTC 159 Ala Thr Met Vai Ala ser Pro Ala Gin Ala Thr Met Vai Ala Pro Phe 10 15 20 AAC GGA CTT AAG TCC TCC GCT GCC TTC CCA GCC ACC CGC AAG GCT AAC 207 Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala Phe Pro Ala Thr Arg Lye Ala Asn 25 30 35 40 AAC GAC ATT ACT TCC ATC ACA AGC AAC GGC GGA AGA GTT AAC TGC ATG 255 Aan Aap Ile Thr Ser Ile Thr Ser Asn Gly Gly Arg Vai Asn Cys Met 45 50 55 CAG GTG TGG CCT CCG ATT GGA AAG AAG AAG TTT GAG ACT CTC TCT TAC 303 Gin Vai Trp Pro Pro Ile Gly Lys Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr 60 65 70 CTT CCT GAC CTT ACC GAT TCC GGT GGT CGC GTC AAC TGC ATG CAG GCC 351 Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly Gly Arg Vai Asn Cys Met Gin Ala 75 80 85 ATG G 355

Met (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 89 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear -40- (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 ATE 89 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 6: DESDE 1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Het Vai Ala Ser Pro Ala 1 s 10 15

Gin Ala Thr Met Vai Ala Pro Phe Aen Gly Leu Lye Ser Ser Ala Ala 20 25 30

Phe Pro Ala Thr Arg Lye Ala Asn Aen Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser 35 40 45

Aen Gly Gly Arg Vai Asn Cye Met Gin Vai Trp Pro Pro Ile Gly Lye 50 55 60

Lys Lye Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Aep Leu Thr Aep Ser Gly 65 70 75 80

Gly Arg Vai Aen Cye Met Gin Ala Met 85 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1575 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA:dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAYE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 3..1565 (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO: DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 DATA DE PUBLICA RESÍDUOS RELEVA ATE 1575

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: CC ATG GCG GCT TCC ATT GGA GCC TTA AAA TCT TCA CCT TCT TCT AAC Met Ala Ala ser Ile Gly Ala Leu Lye Ser Ser Pro ser Ser Asn 47 10 15 -41 - AAT TGC ATC AAT GAG AGA AGA AAT GAT TCT ACA CCT GCT GTA TCC AGC 95 Asn Cye Ile Asn Glu Arg Arg Asn Asp Ser Thr Arg Ala Vai Ser Ser 20 25 30 AGA AAT CTC TCA TTT TCG TCT TCT CAT CTC GCC GGA GAC AAG TTG ATG 143 Arg Aan Leu Ser Phe Ser Ser ser HiS Leu Ala Gly Asp Lys Leu Met 35 40 45 CCT GTA TCG TCC TTA CGT TCC CAA GGA GTC CGA TTC AAT GTG AGA AGA 191 Pro Vai Ser Ser Leu Arg Ser Gin Gly Vai Arg Phe Asn Vai Arg Arg 50 55 60 AGT CCA ATG ATT GTG TCG CCA AAG GCT GTT TCT GAT TCG CAG AAT TCA 239 Ser Pro Met Ile Vai Ser Pro Lys Ala Vai Ser Asp Ser Gin Asn Ser 65 70 75 CAG ACA TGT CTA GAC CCA GAT GCT AGC CGG AGT GTT TTG GGA ATT ATT 287 Gin Thr Cys Leu Asp Pro Asp Ala Ser Arg Ser Vai Leu Gly Ile Ile 80 85 90 95 CTT GGA GGT GGA GCT GGG ACC CGA CTT TAT CCT CTA ACT AAA AAA AGA 335 Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys Arg 100 105 110 GCA AAG CCA GCT GTT CCA CTT GGA GCA AAT TAT CGT CTG ATT GAC ATT 383 Ala Lya Pro Ala Vai Pro Leu Gly Ala Asn Tyr Arg Leu Ile Asp ile 115 120 125 CCT GTA AGC AAC TGC TTG AAC AGT AAT ATA TCC AAG ATT TAT GTT CTC 431 Pro Vai Ser Asn Cys Leu Asn Ser Asn Ile Ser Lys Ile Tyr Vai Leu 130 135 140 ACA CAA TTC AAC TCT GCC TCT CTG AAT CGC CAC CTT TCA CGA GCA TAT 479 Thr Gin Phe Asn Ser Ala Ser Leu Asn Arg His Leu Ser Arg Ala Tyr 145 ISO 155 GCT AGC AAC ATG GGA GGA TAC AAA AAC GAG GGC TTT GTG GAA GTT CTT 527 Ala Ser Asn Met Gly Gly Tyr Lys Asn Glu Gly Phe Vai Glu val Leu 160 165 170 175 GCT GCT CAA CAA AGT CCA GAG AAC ccc GAT TGG TTC CAG GGC ACG GCT 575 Ala Ala Gin Gin ser Pro Glu Asn Pro Asp Trp Phe Gin Gly Thr Ala 180 185 190 GAT GCT GTC AGA CAA TAT CTG TGG TTG TTT GAG GAG CAT ACT GTT CTT 623 Asp Ala Vai Arg Gin Tyr Leu Trp Leu Phe Glu Glu His Thr Val Leu 195 200 205 GAA TAC CTT ATA CTT GCT GGA GAT CAT CTG TAT CGA ATG GAT TAT GAA 671 Glu Tyr Leu Ile Leu Ala Gly λβρ His Leu Tyr Arg Met A8p Tyr Glu 210 215 220 AAG TTT ATT CAA GCC CAC AGA GAA ACA GAT GCT GAT ATT ACC GTT GCC 719 Lye Phe Ile Gin Ala His Arg Glu Thr Asp Ala Asp Ile Thr Val Ala 225 230 235

GCA CTG CCA ATG GAC GAG AAG CGT GCC ACT GCA TTC GGT CTC ATG AAG 767 -42-

Ala Leu Pro Met Asp Glu Lys Arg Ala Thr Ala Phe Gly Leu Met Lys 240 245 250 255 ATT GAC GAA GAA GGA CGC ATT ATT GAA TTT GCA GAG AAA CCG CAA GGA 815 Ile Αβρ Glu Glu Gly Arg lie Ile Glu Phe Ala Glu Lys Pro Gin Gly 260 265 270 GAG CAA TTG CAA GCA ATG AAA GTG GAT ACT ACC ATT TTA GGT CTT GAT 863 Glu Gin Leu Gin Ala Met Lys Vai Asp Thr Thr Ile Leu Gly Leu Asp 275 280 285 GAC AAG AGA GCT AAA GAA ATG CCT TTC ATT GCC AGT ATG GGT ATA TAT 911 Aap Lys Arg Ala Lys Glu Met Pro Phe Ile Ala Ser Met Gly Ile Tyr 290 295 300 GTC ATT AGC AAA GAC GTG ATG TTA AAC CTA CTT CGT GAC AAG TTC CCT 959 Vai Ile Ser Lys Asp Vai Met Leu Asn Leu Leu Arg Asp Lys Phe Pro 305 310 315 GGG GCC AAT GAT TTT GGT AGT GAA GTT ATT CCT GGT GCA ACT TCA CTT 1007 Gly Ala Asn Asp Phe Gly Ser Glu Vai Ile Pro Gly Ala Thr Ser Leu 320 325 330 335 GGG ATG AGA GTG CAA GCT TAT TTA TAT GAT GGG TAC TGG GAA GAT ATT 1055 Gly Met Arg Vai Gin Ala Tyr Leu Tyr Asp Gly Tyr Trp Glu Asp Ile 340 345 350 GGT ACC ATT GAA GCT TTC TAC AAT GCC AAT TTG GGC ATT ACA AAA AAG 1103 Gly Thr zie Glu Ala Phe Tyr Asn Ala Asn Leu Gly Ile Thr Lys Lys 355 360 365 CCG GTG CCA GAT TTT AGC TTT TAC GAC CGA TCA GCC CCA ATC TAC ACC 1151 Pro Vai Pro Asp Phe Ser Phe Tyr Asp Arg Ser Ala Pro Ile Tyr Thr 370 375 380 CAA CCT CGA TAT CTA CCA CCA TCA AAA ATG CTT GAT GCT GAT GTC ACA 1199 Gin Pro Arg Tyr Leu Pro Pro Ser Lys Met Leu Asp Ala Asp Vai Thr 385 390 395 GAT AGT GTC ATT GGT GAA GGT TGT GTG ATC AAG AAC TGT AAG ATT CAT 1247 Asp Ser Vai Ile Gly Glu Gly Cys Vai Ile Lys Asn Cys Lys Ile His 400 405 410 415 CAT TCC GTG GTT GGA CTC AGA TCA TGC ATA TCA GAG GGA GCA ATT ATA 1295 Hie Ser Vai Vai Gly Leu Arg Ser Cys Ile Ser Glu Gly Ala Ile Ile 420 425 430 GAA GAC TCA CTT TTG ATG GGG GCA GAT TAC TAT GAG ACT GAT GCT GAC 1343 Glu Asp Ser Leu Leu Met Gly Ala Asp Tyr Tyr Glu Thr Asp Ala Asp 435 440 445 AGG AAG TTG CTG GCT GCA AAG GGC AGT GTC CCA ATT GGC ATC GGC AAG 1391 Arg Lys Leu Leu Ala Ala Lys Gly Ser Vai Pro Ile Gly Ile Gly Lys 450 455 460 AAT TGT CAC ATT AAA AGA GCC ATT ATC GAC AAG AAT GCC CGT ATA GGG 1439 Aen Cys His Ile Lys Arg Ala Ile Ile Asp Lys Asn Ala Arg Ile Gly -43 - 465 470 475 GAC AAT GTG AAG ATC ATT AAC AAA GAC AAC GTT CAA GAA GCG GCT AGG 1487 Aep Asn Vai Lys Ile Ile Asn Lys Asp Asn Vai Gin Glu Ala Ala Arg 480 485 490 495 GAA ACA GAT GGA TAC TTC ATC AAG AGT GGG ATT GTC ACC GTC ATC AAG 1535 Glu Thr Asp Gly Tyr Phe Ile Lys Ser Gly ile Vai Thr Vai Ile Lys 500 505 510 GAT GCT TTG ATT CCA AGT GGA ATC ATC ATC TGATGAGCTC 1575 Asp Ala Leu Xle Pro Ser Gly Ile Ile ile 515 S20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 521 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DE REGISTO: 07-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 8: DESDE 1 ATE 521 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Met Ala Ala Ser Ile Gly Ala Leu Lys Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn 1 5 10 15 Cys Ile Asn Glu Arg Arg Asn Asp Ser Thr Arg Ala Vai Ser Ser Arg 20 25 30 Asn Leu Ser Phe Ser Ser Ser His Leu Ala Gly Asp Lys Leu Met Pro 35 40 45 Vai Ser Ser Leu Arg Ser Gin Gly Vai Arg Phe Asn Vai Arg Arg Ser 50 55 60 Pro Met Ile Vai Ser Pro Lys Ala Vai Ser Asp Ser Gin Asn Ser Gin 65 70 75 80 Thr Cys Leu Αβρ Pro Asp Ala Ser Arg Ser Vai Leu Gly He Ile Leu 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys Arg Ala 100 105 110 Lys Pro Ala Vai Pro Leu Gly Ala Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ile Pro 115 120 125 -44-

Val Ser Asn Cys Leu Asn Ser Aen Ile Ser Lys Xle Tyr Vai Leu Thr 130 13S 140

Gin Phe Asn Ser Ala Ser Leu Asn Arg His Leu Ser Arg Ala Tyr Ala 145 150 155 160

Ser Asn Met Gly Gly Tyr Lys Asn Glu Gly Phe Vai Glu Vai Leu Ala 165 170 175

Ala Gin Gin Ser Pro Glu Asn Pro Asp Trp Phe Gin Gly Thr Ala Asp 180 185 190

Ala Vai Arg Gin Tyr Leu Trp Leu Phe Glu Glu His Thr Vai Leu Glu 195 200 205

Tyr Leu Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Tyr Arg Het Asp Tyr Glu Lys 210 215 220

Phe Ile Gin Ala His Arg Glu Thr Asp Ala Asp Ile Thr Vai Ala Ala 225 230 235 240

Leu Pro Het Asp Glu Lys Arg Ala Thr Ala Phe Gly Leu Met Lys Xle 245 2S0 255

Asp Glu Glu Gly Arg Ile Ile Glu Phe Ala Glu Lys Pro Gin Gly Glu 260 265 270

Gin Leu Gin Ala Het Lys Vai Asp Thr Thr Ile Leu Gly Leu Asp Asp 275 280 265

Lys Arg Ala Lys Glu Met Pro Phe Ile Ala Ser Het Gly Ile Tyr Vai 290 295 300

Ile Ser Lys Asp Vai Het Leu Asn Leu Leu Arg Asp Lys Phe Pro Gly 305 310 315 320

Ala Aen Asp Phe Gly Ser Glu Vai Ile Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly 325 330 335

Het Arg Vai Gin Ala Tyr Leu Tyr Asp Gly Tyr Trp Glu Asp Ile Gly 340 345 350

Thr Ile Glu Ala Phe Tyr Asn Ala Asn Leu Gly Ile Thr Lys Lys Pro 355 360 365

Vai Pro Asp Phe Ser Phe Tyr Asp Arg Ser Ala Pro Ile Tyr Thr Gin 370 375 380

Pro Arg Tyr Leu Pro Pro Ser Lys Het Leu Asp Ala Asp Vai Thr Asp 385 390 395 400

Ser Vai Ile Gly Glu Gly Cys Vai Ile Lys Asn Cys Lys Ile His His 405 410 415

Ser Vai Vai Gly Leu Arg Ser Cys Ile Ser Glu Gly Ala Ile Ile Glu 420 425 430 -45- ASp Ser Leu Leu Met Gly Ala Asp Tyr Tyr Glu Thr Asp Ala Asp Arg 435 440 445 Lye Leu Leu Ala Ala Lys Gly Ser Vai Pro Ile Gly Ile Gly Lys Asn 450 455 460 Cys Hi8 Zle Lys Arg Ala Ile Ile Asp Lys Asn Ala Arg Ile Gly Asp 465 470 475 480 Asn Vai Lys Ile Ile Asn Lys Asp Asn Vai Gin Glu Ala Ala Arg Glu 485 490 495 Thr Asp Gly Tyr Phe Ile Lys Ser Gly Ile Vai Thr Vai Ile Lys Asp 500 505 510 Ala Leu Ile Pro Ser Gly Ile Ile Ile 515 520 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1519 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 3..1410 (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RE$IDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 9: DESDE 1 ATE 1519 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: AAC AAG ATC AAA CCT GGG CTT GCT TAC TCT GTG ATC ACT ACT GAA AAT Asn Lys Ile Lys Pro Gly Val Ala Tyr ser Val Ile Thr Thr Glu Asn 1 S 10 15 GAC ACA CAG ACT GTG TTC GTA GAT ATG CCA CGT CTT GAG AGA CGC CGG Asp Thr Gin Thr val Phe Val Asp Het Pro Arg Leu Glu Arg Arg Arg 20 25 30 GCA AAT CCA AAG GAT GTG GCT GCA GTC ATA CTG GGA GGA GGA GAA GGG Ala Asn Pro Lys Asp Val Ala Ala Val Ile Leu Gly Gly Gly Glu Gly 35 40 45 ACC AAG TTA TTC CCA CTT ACA AGT AGA ACT GCA ACC CCT GCT GTT CCG Thr Lys Leu Phe Pro Leu Thr Ser Arg Thr Ala Thr Pro Ala Val Pro 192 -46 50 55 60 GTT CGA GGA TGC TAC AGG CTA ATA GAC ATC CCA ATG AGC AAC TGT ATC 240 val Gly Gly Cys Tyr Arg Leu ile Asp ile Pro Met Ser Asn Cys Ile 65 70 75 80 AAC AGT GCT ATT AAC AAG ATT TTT GTG CTG ACA CAG TAC AAT TCT GCT 288 Asn Ser Ala Ile Asn Lye Ile Phe Val Leu Thr Gin Tyr Aen Ser Ala Ô5 90 95 CCC CTG AAT CGT CAC ATT GCT CGA ACA TAT TTT GGC AAT GGT GTG AGC 336 Pro Leu Asn Arg His Ile Ala Arg Thr Tyr Phe Gly Α8Π Gly Val Ser 100 105 110 TTT GGA GAT GGA TTT GTC GAG GTA CTA GCT GCA ACT CAG ACA CCC GGG 384 Phe Gly Asp Gly Phe val Glu Val Leu Ala Ala Thr Gin Thr Pro Gly 115 120 125 GAA GCA GGA AAA AAA TGG TTT CAA GGA ACA GCA GAT GCT GTT AGA AAA 432 Glu Ala Gly Lys Lys Trp Phe Gin Gly Thr Ala Asp Ala Val Arg Lys 130 135 140 TTT ATA TGG GTT TTT GAG GAC GCT AAG AAC AAG AAT ATT GAA. .AAT ATC 480 Phe Ile Trp Val Phe Glu Asp Ala Lys Asn Lys Asn Ile Glu Asn Ile 145 150 155 160 GTT GTA CTA TCT GGG GAT CAT CTT TAT AGG ATG GAT TAT ATG GAG TTG S28 val Val Leu Ser Gly Asp His Leu Tyr Arg Met Asp Tyr Met Glu Leu 165 170 175 GTG CAG AAC CAT ATT GAC AGG AAT GCT GAT ATT ACT CTT TCA TGT GCA 576 Val Gin Asn His Ile Αβρ Arg Asn Ala Asp Ile Thr Leu Ser Cys Ala ISO 185 190 CCA GCT GAG GAC AGC CGA GCA TCA GAT TTT GGG CTG GTC AAG ATT GAC 624 Pro Ala Glu Asp Ser Arg Ala Ser Asp Phe Gly Leu Val Lys Ile Asp 195 200 205 AGC AGA GGC AGA GTA GTC CAG TTT GCT GAA AAA CCA AAA GGT TTT GAT 672 Ser Arg Gly Arg Val Val Gin Phe Ala Glu Lys Pro Lys Gly Phe Αβρ 210 215 220 CTT AAA GCA ATG CAA GTA GAT ACT ACT CTT GTT GGA TTA TCT CCA CAA 720 Leu Lya Ala Met Gin Val Αβρ Thr Thr Leu Val Gly Leu Ser Pro Gin 225 230 235 240 GAT GCG AAG AAA TCC CCC TAT ATT GCT TCA ATG GGA GTT TAT GTA TTC 768 Asp Ala Lys Lys Ser Pro Tyr Ile Ala Ser Met Gly Val Tyr Val Phe 245 250 255 AAG ACA GAT GTA TTG TTG AAG CTC TTG AAA TGG AGC TAT CCC ACT TCT 816 Lys Thr Asp Val Leu Leu Lys Leu Leu Lys Trp Ser Tyr Pro Thr Ser 260 265 270 AAT GAT TTT GGC TCT GAA ATT ATA CCA GCA GCT ATT GAC GAT TAC AAT 864 Asn Aap Phe Gly Ser Glu ile Ile Pro Ala Ala Ile Asp Asp Tyr Asn 275 280 285

-47- GTC CAA GCA TAC ATT TTC AAA GAC TAT TGG GAA GAC ATT GGA ACA ATT 912 Vai Gin Ala Tyr Ile Phe Lys Asp Tyr Trp Glu Asp Ile Gly Thr Ile 290 295 300 AAA TCG TTT TAT AAT GCT AGC TTG GCA CTC ACA CAA GAG TTT CCA GAG 960 Lys Ser Phe Tyr λβη Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gin Glu Phe Pro Glu 305 310 315 320 TTC CAA TTT TAC GAT CCA AAA ACA CCT TTT TAC ACA TCT CCT AGG TTC 1008 Phe Gin Phe Tyr Aep Pro Lys Thr Pro Phe Tyr Thr Ser Pro Arg Phe 325 330 335 CTT CCA CCA ACC AAG ATA GAC AAT TGC AAG ATT AAG GAT GCC ATA ATC 1056 Leu Pro Pro Thr Lys Ile Asp Asn Cys Lys Ile Lys Asp Ala Ile Ile 340 345 350 TCT CAT GGA TGT TTC TTG CGA GAT TGT TCT GTG GAA CAC TCC ATA GTG 1104 Ser His Gly Cys Phe Leu Arg Asp Cys Ser Vai Glu His Ser Ile Vai 355 360 365 GGT GAA AGA TCG CGC TTA GAT TGT GGT GTT GAA CTG AAG GAT ACT TTC 1152 Gly Glu Arg Ser Arg Leu Asp Cys Gly Vai Glu Leu Lys Asp Thr Phe 370 375 380 ATG ATG GGA GCA GAC TAC TAC CAA ACA GAA TCT GAG ATT GCC TCC CTG 1200 Met Met Gly Ala Aep Tyr Tyr Gin Thr j Ser Glu Ile Ala Ser Leu 385 390 395 400 TTA GCA GAG GGG AAA GTA CCG ATT GGA ATT GGG GAA AAT ACA AAA ATA 1248 Leu Ala Glu Gly Lys Vai Pro Ile Gly Ile Gly Glu Asn Thr Lys Ile 405 410 415 AGG AAA TGT ATC ATT GAC AAG AAC GCA AAG ATA GGA AAG AAT GTT TCA 1296 Arg Lys Cys Ile Ile Asp Lys Asn Ala Lys Ile Gly Lys Asn Vai Ser 420 425 430 ATC ATA AAT AAA GAC GGT GTT CAA GAG GCA GAC CGA CCA GAG GAA GGA 1344 Ile Ile Asn Lys Asp Gly Vai Gin Glu Ala Asp Arg Pro Glu Glu Gly 435 440 445 TTC TAC ATA CGA TCA GGG ATA ATC ATT ATA TTA GAG AAA GCC ACA ATT 1392 Phe Tyr Ile Arg Ser Gly Ile Ile Ile Ile Leu Glu Lys Ala Thr Ile 450 455 460 AOA GAT GGA ACA GTC ATC TGAACTAGGG AAGCACCTCT TGTTGAACTA 1440

Arg Asp Gly Thr Vai lie 465 470 CTGGAGATCC AAATCTCAAC TTGAAGAAGG TCAAGGGTGA TCCTAGCACG TTCACCAGTT 1500 GACTCCCCGA AGGAAGCTT 1519 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 470 aminoácidos -48- (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ϋ) (x) TIPO DE MOLÉCULA: proteína INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 1 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 10: DESDE ATE 470 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

Asn Lys Ile Lys Pco Gly Vai Ala Tyr Ser Vai Xle Thr Thr Glu Asn 15 10 15

Asp Thr Gin Thr Vai Phe Vai Asp Met Pro Arg Leu Glu Arg Arg Arg 20 25 30

Ala Asn Pro Lys Asp Vai Ala Ala Vai Ile Leu Gly Gly Gly Glu Gly 35 40 45

Thr Lys Leu Phe Pro Leu Thr Ser Arg Thr Ala Thr Pro Ala Vai Pro 50 55 60

Vai Gly Gly Cys Tyr Arg Leu Ile Asp Ile Pro Het Ser Asn Cys Ile

65 70 75 BO

Asn Ser Ala Ile Asn Lys Ile Phe Vai Leu Thr Gin Tyr Asn Ser Ala 85 90 95

Pro Leu Asn Arg His Ile Ala Arg Thr Tyr Phe Gly Asn Gly Vai Ser 100 105 110

Phe Gly Asp Gly Phe vai Glu Vai Leu Ala Ala Thr Gin Thr Pro Gly 115 120 125

Glu Ala Gly Lys Lys Trp Phe Gin Gly Thr Ala Asp Ala Vai Arg Lys 130 135 140

Phe Ile Trp Vai Phe Glu Asp Ala Lys Asn Lys Asn Ile Glu Asn Xle 145 150 155 160

Vai Vai Leu Ser Gly Asp His Leu Tyr Arg Met Asp Tyr Met Glu Leu 165 170 175

Vai Gin Asn His Ile Asp Arg Asn Ala Asp Ile Thr Leu Ser Cys Ala 180 185 190

Pro Ala Glu Asp Ser Arg Ala Ser Asp Phe Gly Leu Vai Lys Ile Asp 195 200 205

Ser Arg Gly Arg Vai Vai Gin Phe Ala Glu Lys Pro Lys Gly Phe Asp 210 215 220

íSSSS®51® -49-

Leu Lys Ala Met Gin Vai Asp Thr Thr Leu Vai Gly Leu Ser Pro Gin 225 230 235 240

Asp Ala Lys Lys Ser Pro Tyr Ile Ala Ser Met Gly Vai Tyr vai Phe 245 250 255

Lys Thr Asp Vai Leu Leu Lys Leu Leu Lys Trp Ser Tyr Pro Thr Ser 260 265 270

Asn Asp Phe Gly Ser Glu Ile Ile Pro Ala Ala Ile Asp Asp Tyr Asn 275 280 285

Vai Gin Ala Tyr Ile Phe Lys Asp Tyr Trp Glu Asp Ile Gly Thr Ile 290 295 300

Lys Ser Phe Tyr Asn Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gin Glu Phe Pro Glu 305 310 315 320

Phe Gin Phe Tyr Asp Pro Lys Thr Pro Phe Tyr Thr Ser Pro Arg Phe 325 330 335

Leu Pro Pro Thr Lys Ile Asp Asn Cys Lys Ile Lys Asp Ala Ile Ile 340 345 350.

Ser His Gly Cys Phe Leu Arg Asp Cys Ser Vai Glu His Ser Ile Vai 355 360 365

Gly Glu Arg Ser Arg Leu Asp Cys Gly Vai Glu Leu Lys Asp Thr Phe 370 375 380

Met Met Gly Ala Asp Tyr Tyr Gin Thr Glu Ser Glu Ile Ala Ser Leu 385 390 395 400

Leu Ala Glu Gly Lys Vai Pro Ile Gly Ile Gly Glu Asn Thr Lys Ile 405 410 415

Arg Lys Cys Ile Ile Asp Lys Asn Ala Lys Ile Gly Lys Asn Vai Ser 420 425 430

Ile Ile Asn Lys Asp Gly Vai Gin Glu Ala Asp Arg Pro Glu Glu Gly 435 440 445

Phe Tyr Ile Arg Ser Gly Ile Ile Ile Ile Leu Glu Lys Ala Thr Ile 450 455 460

Arg Asp Gly Thr Vai Ile 465 470 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (Á) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA:simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) -50-

(x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO: (H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 A1 (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 11 ATE 35 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: GTTGATAACA AGATCTGTTA ACCATGGCGG CTTCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO: (H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 11: ATE 35 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: CCAGTTAAAA CGGAGCTCAT CAGATGATGA TTC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADELA:simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO: (H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 13: ATE 30 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: GTGTGAGAAC ATAAATCTTG GATATGTTAC DESDE 1 35 DESDE 1 33 DESDE 1 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: 30 -51 - (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADÈIA.simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07.-JUNHO-1991 m DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 14: DESDE 1 ATE 28 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: GAATTCACAG GGCCATGGCT CTAGACCC 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (Á) COMPRIMÉNTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (Cj TIPO DÊ CADEIÃ:simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO: (H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 A1 (I) DATA DO PEDIDO: 07.-JUNHO-1991 m DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 15: DESDE 1 ATE 40 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: AAGATCAAAC CTGCCATGGC TTACTCTGTG ATCACTACTG 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA:simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07.-JUNHO-1991 m DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 16: DESDE 1 ATE 39 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: -52- GGGAATTCAA GCTTGGATCC CGGGCCCCCC CCCCCCCCC 3 9 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) C ARACT ERÍ STIC AS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA.simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 17: DESDE 1 ATÉ 24 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: GGGAATTCAA GCTTGGATCC CGGG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: ÍA) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA.simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (x) INFORMAÇÃO DE PUBLICAÇÃO:

(H) NUMERO DE DOCUMENTO: EP 0536293 AI (I) DATA DO PEDIDO: 07,-JUNHO-1991 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 14-ABRIL-1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 18: DESDE 1 ATE 32 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: CCTCTAGACA GTCGATCAGG AGCAGATGTA CG 32

Lisboa, 18 de Agosto de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrie# RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um método de produção de sementes de plantas contendo um menor teor em óleo compreendendo o fornecimento de maiores níveis de ADPglucose pirofosforilase dentro das referidas sementes por transformação da referida planta usando os seguintes passos: (a) inserção no genoma de uma célula de planta uma molécula de ADN recombinante em dupla cadeia, compreendendo (i) um promotor cuja função nas plantas é originar a produção de uma sequência de ARN em sementes de plantas, (ii) uma sequência de ADN estrutural que origina a produção de uma sequência de ARN que codifica um polipeptídeo de fusão compreendendo um péptido de transporte plastídio amino terminal e uma enzima ADPglucose pirofosforilase, (iii) uma sequência de ADN 3' não traduzida cuja função em células de plantas é originar a terminação da transcrição e a adição de nucleótidos poliadenilados à extremidade 3' da sequência de ARN; (b) obtenção de células de plantas transformadas; e (c) regeneração a partir das células de plantas transformadas plantas geneticamente transformadas que produzem sementes contendo um reduzido teor em óleo; onde a referida enzima ADPglucose pirofosforilase é desregulada.
2. O método da reivindicação 1, em que a referida enzima é de E. coli. -2- 3. 0 método da reivindicação 2, em que a referida enzima é glgC 16.
4. O método da reivindicação 3, em que a referida planta é seleccionada a partir do grupo que consiste de trigo, colza oleaginosa, soja, milho, algodão, girassol, amendoeira, cajueiro, nogueira-pecã, nogueira, e amendoim. Lisboa, 18 de Agosto de 2000

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