CN109154003A - 用于靶向多肽的双转运肽 - Google Patents

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T·塞萨尔
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Abstract

本发明涉及重组的嵌合核酸分子，其包含编码双转运肽的核酸序列，所述编码双转运肽的核酸序列有效连接至编码目的多肽的异源核酸序列，当其在植物中过量表达时，赋予所述植物除草剂耐受性。

Description

用于靶向多肽的双转运肽
发明领域
本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及通过使用新型双转运肽将目的多肽靶向叶绿体和/或线粒体。
背景技术
植物细胞含有两个最初来源于内共生细菌的细胞器：线粒体和质体。由于它们的内共生起源，这些细胞器含有它们自己的DNA，但实际上只有一些基因由这些基因组编码。最初存在的许多其他基因已经转移到宿主的核基因组中，它们表达的产物被靶向回相应的细胞器。尽管将蛋白质靶向线粒体和叶绿体通常是高度特异性的，但已发现越来越多的例子，其中相同的蛋白质被输入这两种细胞器(Peeters和Small，Biochimica et BiophysicaActa 1541(2001)，第54-63页)。在许多其他功能中，这两种细胞器因其在能量代谢中的作用而闻名，特别是呼吸作用和光合作用。由于线粒体和叶绿体包含细胞核中编码并输入相应细胞器的几千种蛋白质，因此认为靶向通常对一种或另一种细胞器具有高度特异性。即使可能有一些蛋白质在理论上由两个细胞器共享，但大多数蛋白质在它们靶向的细胞器中具有特定功能，以致于错误靶向可能被反选择为有价值蛋白质的不必要损失，或者甚至是对于细胞器为破坏性的(Peeters和Small，Biochimica et Biophysica Acta 1541(2001)，第54-63页)。Peeters和Small在他们的综述中列出了真核生物(植物)中的大约20个例子，其中一个基因产生位于细胞不同部分的多个产物。根据这些作者，单基因有两种基本方式可以向两种细胞器提供产物。它可以具有“双”靶向序列，由在蛋白质N端串联的靶向线粒体和叶绿体的序列代表，所述序列间插有备选的转录和/或翻译起始、和/或备选的外显子剪接。获得双靶向的第二种方式是具有所谓的“模糊”靶向前序列，其被线粒体和叶绿体均识别为输入信号。
据报道，在其N端具有天然编码的转运肽序列的基因包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCo)的叶绿体小亚基，de Castro Silva Filho等人(1996)Plant MoI.Biol.30:769-780；Schnell,D.J.等人(1991)J.Biol.Chem.266(5):3335-3342；5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，Archer等人(1990)J.Bioenerg.and Biomemb.22(6):789-810；色氨酸合酶，Zhao,J.等人(1995)J.Biol.Chem.2 70(l l):6081-6087；质体蓝素，Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33):20357-20363；分支酸合酶，Schmidt等人(1993)J.Biol.Chem.268(36):27477-27457；和光捕获叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)，Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263:14996-14999。尽管已经描述了几种转运肽，但是只有少数已经成功地用于尝试将嵌合分子靶向高等植物中的叶绿体和/或线粒体。本发明要解决的问题是将由细胞质核糖体合成的蛋白质精确且有效地靶向至其合适的细胞内位置。这对于在合适的细胞器或区室中需要转基因产物的转基因高等植物是必需的。本发明提供了新的双转运肽，其有效地将异源目的多肽转运入转基因高等植物的叶绿体和/或线粒体。
发明概述
因此，本发明的第一个实施方案涉及重组的嵌合核酸分子，其包含编码双转运肽的核酸序列，所述编码双转运肽的核酸序列有效连接至编码目的多肽的异源核酸序列。
优选地，所述转运肽来自苋属(Amaranthus)或来自看麦娘属(Alopecurus)。
在另一优选的实施方案中，所述双转运肽包含SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98的氨基酸序列，或其变体或片段。
在另一优选的实施方案中，所述异源目的多肽是一种多肽，当其在植物中过量表达时，赋予所述植物除草剂耐受性。
在另一优选的实施方案中，所述异源目的多肽来自原核生物。
更优选地，原核生物属于选自埃希氏菌属(Escherichia)、红嗜热盐菌属(Rhodothermus)、丰祐菌属(Opitutus)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus)。
甚至更优选地，所述多肽具有PPO活性并赋予对PPO抑制性除草剂的耐受性。
在一个特别优选的实施方案中，所述具有PPO活性的多肽包含SEQ ID NO:137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,511,512,513,514,515,516,517,518,519,520,521,522,523,524,525,526,527,528,529,530,531,532,533,534,535的序列、或其变体或片段。
在一个尤其特别优选的实施方案中，本发明的重组嵌合核酸分子包含编码SEQ IDNO:112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,136,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623或624所示的多肽的核酸序列、或其活性变体和片段。
另一方面，本发明涉及包含本发明核酸分子的表达盒，其有效连接至驱动在植物中表达的启动子。
另一方面，本发明涉及包含本发明的表达盒的植物细胞。
另一方面，本发明涉及包含本发明植物细胞的植物或植物部分。
另一方面，本发明涉及衍生自本发明植物的种子。
另一方面，本发明涉及在植物中表达编码目的多肽的核酸的方法，包括(a)将本发明的核酸分子或本发明的表达盒引入植物细胞中，和(b)从其再生植物，所述植物包含本发明的核酸分子或本发明的表达盒。
另一方面，本发明涉及一种产生除草剂耐受性植物的方法，包括(a)将本发明的核酸分子或本发明的表达盒引入植物细胞中，和(b)从其再生植物，所述植物包含本发明的核酸分子或本发明的表达盒。
另一方面，本发明涉及一种控制植物栽培场所不希望的植被的方法，该方法包括以下步骤：
a)在该场所提供除草剂耐受性植物，所述除草剂耐受性植物包含本发明的核酸分子或本发明的表达盒
b)向该场所应用有效量的除草剂，
其中所述除草剂的有效量不会杀死或抑制a)的除草剂耐受性植物的生长。
另一方面，本发明涉及在控制本发明植物附近的杂草的同时生长所述植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)生长所述植物；和
b)将包含PPO抑制性除草剂的除草剂组合物应用于所述植物和杂草，
其中所述除草剂在该除草剂抑制相应野生型植物生长的水平通常抑制原卟啉原氧化酶。
另一方面，本发明涉及用于杂草控制的组合，包含(a)本发明的核酸分子，该多核苷酸能够在植物中表达，从而对该植物提供PPO抑制性除草剂的耐受性；和(b)PPO抑制性除草剂。
另一方面，本发明涉及制备用于杂草控制的组合的方法，包括(a)提供本发明的核酸分子，该核酸分子能够在植物中表达，从而对该植物提供PPO抑制性除草剂的耐受性；和(b)提供PPO抑制性除草剂。
在一个优选的实施方案中，所述提供核酸分子的步骤包括提供含有所述核酸分子的植物。
在另一个优选的实施方案中，所述提供核酸分子的步骤包括提供含有所述核酸分子的种子。
优选地，所述方法还包括将PPO抑制性除草剂应用于该种子的步骤。
另一方面，本发明涉及用于杂草控制的组合的用途，所述用于杂草控制的组合包含(a)本发明的核酸分子，该核酸分子能够在植物中表达，从而对该植物提供PPO抑制性除草剂的耐受性，和(b)PPO抑制性除草剂，用于在植物栽培场所控制杂草。
附图简述
图1显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：113的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图2显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：114的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图3显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：115的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图4显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：116的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图5显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：117的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图6显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：118的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图7显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：119的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图8显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：120的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图9显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：121的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图10显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：123的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图11显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：127的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图12显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：128的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图13显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：130的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图14显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：133的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图15显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：134的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图16显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：126的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图17显示了用所示量的苯嘧磺草胺喷洒包含SEQ ID NO：124的T1拟南芥属植物。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。底部上方含有2株野生型植物，上部5盆含有独立的转基因事件(T1植物，通过证实抗性基因AHAS的存在而选择)。
图18显示了用所示量的苯嘧磺草胺处理的T2拟南芥属植物。小图A：未转化的对照；B：用编码包含SEQ ID NO：117的多肽的核酸转化的；C：用编码包含SEQ ID NO：118的多肽的核酸转化的；D：用编码包含SEQ ID NO：121的多肽的核酸转化的；E：用编码包含SEQ IDNO：128的多肽的核酸转化的；
图19显示了用所示量的Trifludimoxazine处理的T2拟南芥属植物。小图A：未转化的对照；B：用编码包含SEQ ID NO：119的多肽的核酸转化的；C：用编码包含SEQ ID NO：117的多肽的核酸转化的；D：用编码包含SEQ ID NO：118的多肽的核酸转化的；E：用编码包含SEQ ID NO：121的多肽的核酸转化的；F：用编码包含SEQ ID NO：128的多肽的核酸转化的；
图20显示了用所示量的苯嘧磺草胺或Trifludimoxazine处理的T0大豆插条。小图A：未转化的对照；B：用编码包含SEQ ID NO：118的多肽的核酸转化的(事件1)；C:用编码包含SEQ ID NO：118的多肽的核酸转化的(事件2)；D:用编码包含SEQ ID NO：118的多肽的核酸转化的(事件3)；.
图21 A–H显示了用多种PPO抑制性除草剂处理的非转基因的和转基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)。所示的应用率为g ai/ha。处理后14天拍摄照片。
21 A:用所示量g ai/ha的苯嘧磺草胺处理(A＝野生型/非转基因的；B＝转基因SEQ ID NO:121；C＝转基因SEQ ID NO:128；D＝转基因SEQ ID NO:117；E＝SEQ ID NO:118)
21 B:用所示量g ai/ha Trifludimoxazine处理(A＝野生型/非转基因的；B＝转基因SEQ ID NO:121；C＝转基因SEQ ID NO:128；D＝转基因SEQ ID NO:117；E＝SEQ ID NO:118；F＝转基因SEQ ID NO:119)
21 C:用所示量g ai/ha甲磺草胺处理(A＝野生型/非转基因的；B＝转基因SEQ IDNO:118)
21 D:用所示量g ai/ha丙炔氟草胺处理(A＝野生型/非转基因的；B＝转基因SEQID NO:118)
21 E:用所示量g ai/ha苯嘧磺草胺+丙炔氟草胺的混合物处理(A＝野生型/非转基因的；B＝转基因SEQ ID NO:118)
21 F:用所示量g ai/ha苯嘧磺草胺+Trifludimoxazine的混合物处理(A＝野生型/非转基因的；B＝转基因SEQ ID NO:118)
21 G:用所示量g ai/ha苯嘧磺草胺+甲磺草胺的混合物处理(A＝野生型/非转基因的；B＝转基因SEQ ID NO:118)
21 H:用所示量g ai/ha苯吡啶处理(A＝野生型/非转基因的；B＝转基因SEQ IDNO:118)
图22显示了用多种PPO除草剂处理的非转基因的和转基因的拟南芥，采用四种处理(1–4)。(1)是未处理的检查，2–4是以降低的应用率处理的植物(2是最高的和(4)是最低的。参照评价表4的应用率。处理后14天拍摄照片(A:S3100；B:苯嘧磺草胺；C:Trifludimoxazin；D:苯嘧磺草胺+Trifludimoxazin；E:丙炔氟草胺)。
图23显示了T1代PPO除草剂喷洒。对转基因的和非转基因的拟南芥喷洒10(＝1)、50(＝2)和150(＝3)g ai/ha苯嘧磺草胺作为委派应用(post application)(4＝未处理的)。处理后8天(喷洒后的天数)拍摄照片。上部5盆含有独立的转基因事件，而底部在白线下的2盆含有非转基因植物。
23 A:转基因的＝SEQ ID NO:113
23 B:转基因的＝SEQ ID NO:120
23 C:转基因的＝SEQ ID NO:129
一般性定义
应当理解本发明不限于如描述那样的具体方法学、方案、细胞系、植物物种或属、构建体和试剂。还应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图限制本发明，本发明将仅受所附权利要求书限制。必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓。因此，例如，对“一种载体”的称谓是对一种或多种载体的称谓并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。
术语“约”在本文中用来指大约、大致、左右和在……范围内。当术语“约”与一个数字范围联合使用时，它通过扩展界限值高于和低于所述数值而修饰该范围。通常而言，术语“约”在本文中用来通过20％、优选地10％之上或之下(更高或更低)变异而修饰高于和低于所述值的数值。
如本文中所用，词汇“或”意指特定列出的任一成员并且还包括该列出的成员的任意组合。
如本文所用的“表达盒”是指线性或环状核酸分子。它包含DNA以及RNA序列，其能够指导特定核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达。通常，它包含有效连接至目的多核苷酸的启动子，其任选地有效连接至终止信号和/或其他调节元件。本发明的表达盒的特征在于它应包含如下文所定义的转录调节核苷酸序列。表达盒还可以包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目的蛋白质，但也可以在有义或反义方向编码感兴趣的功能性RNA，例如反义RNA或非翻译RNA。包含目的多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指其至少一种组分相对于其至少一种其它组分是异源的。表达盒也可以是一种天然存在的、但是已经以可用于异源表达的重组形式获得的表达盒。表达盒可以完全在细胞外组装(例如，通过重组克隆技术)。然而，也可以使用部分内源组分组装表达盒。例如，可以通过在内源序列的上游放置(或插入)启动子序列来获得表达盒，所述内源序列由此通过所述启动子序列功能性连接和受到控制。同样地，待表达的核酸序列可以置于(或插入)内源启动子序列的下游，从而形成表达盒。可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下表达表达盒中的核苷酸序列，所述诱导型启动子仅在宿主细胞暴露于某些特定外部刺激时才启动转录。在多细胞生物的情况下，启动子也可以对特定组织或器官或发育阶段(例如，本发明的胚优先或胚特异性启动子)具有特异性。在一个优选的实施方案中，这样的表达盒将包含与目的核苷酸序列连接的本发明的转录起始区。这种表达盒优选具有多个限制性位点，用于插入目的基因，使其处于调节区的转录调节之下。表达盒可额外地含有选择标记基因。该表达盒按5'-3'转录方向包含在植物中有功能的转录及翻译起始区、目的DNA序列和转录及翻译终止区。终止区可以相对于转录起始区是天然的，可以相对于目的DNA序列是天然的，或可以衍生自另一个来源。便利的终止区从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒可获得，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区和下文描述的其他终止区(还参见，Guerineau 1991；Proudfoot1991；Sanfacon 1991；Mogen 1990；Munroe 1990；Ballas 1989；Joshi 1987)。表达盒还可包含多克隆位点。在这种情况下，多克隆位点优选以允许多克隆位点中引入的多核苷酸与转录调节序列有效连接的方式排列。除了上述组分外，本发明的表达盒优选地可以包含同源重组所需的组分，即来自靶基因座的侧翼基因组序列。然而，还考虑了表达盒，其基本上由下文所定义的转录调节核苷酸序列组成。
“启动子”是指通常在其编码序列的上游(5')的核苷酸序列，其通过提供对正确转录所需的RNA聚合酶和其他因子的识别来控制编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，其是短DNA序列，在一些情况下包含TATA盒和用于指定转录起始位点的其他序列，向其添加调节元件以增强表达。“启动子”还指包含最小启动子加调节元件的核苷酸序列，且其能够控制编码序列或功能性RNA的表达。这种类型的启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后者元件通常称为增强子。因此，“增强子”是DNA序列，其可以刺激启动子活性，并且可以是启动子的天然元件或是插入的异源元件，以增强启动子的水平或组织特异性。它能够在两个方向上操作(正常或翻转)，并且即使在从启动子的上游或下游移动时也能够起作用。增强子和其他上游启动子元件都结合介导其作用的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以整体衍生自天然基因，或由不同的元件组成，所述不同的元件衍生自天然存在的不同启动子，或甚至由合成的DNA片段组成。启动子还可含有参与蛋白质因子结合的DNA序列，其控制响应生理或发育条件的转录起始的有效性。“起始位点”是第一核苷酸周围的位置，其是转录序列的一部分，其也被定义为位置+1。相对于该位点对基因的所有其他序列和其控制区域进行编号。下游序列(即，3'方向上的其他蛋白质编码序列)称为正的，而上游序列(主要是5'方向上的控制区)称为负的。在缺乏上游激活的情况下，无活性或具有大大降低的启动子活性的启动子元件，例如TATA元件，被称为“最小”或“核心”启动子。在合适的转录因子存在下，最小启动子发挥允许转录的功能。“最小”或“核心”启动子因此仅由转录起始所需的所有基础元件组成，例如，TATA盒和/或起始子。
“组成型启动子”是指能够在植物的所有或几乎所有发育阶段期间在所有或几乎所有植物组织中表达可读框(ORF)的启动子。每一转录激活元件不表现出绝对的组织特异性，但在大多数植物组织中介导转录激活，其达到转录最活跃的植物组织中至少1％水平的转录激活。“组成型表达”是指使用组成型启动子的表达。
“受调节的启动子”指非组成型地指导基因表达，而是以时间和/或空间受调节的方式指导表达的启动子，并且包括组织特异性启动子和诱导型启动子。其包括天然的和合成的分子，以及可以是合成的和天然的分子组合的分子。不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中、或不同的发育阶段、或响应不同的环境条件而表达。不断发现可用于植物细胞中的多种类型的新型启动子，多个例子可见于Okamuro等人(1989)的编辑物。可用于植物中的典型的受调节的启动子包括但不限于安全剂诱导型启动子、源自四环素诱导型系统的启动子、源自水杨酸诱导型系统的启动子、源自醇诱导型系统的启动子、源自糖皮质激素诱导型系统的启动子、源自病原体诱导型系统的启动子，和源自蜕皮激素诱导型系统的启动子。“条件性”和“受调节的表达”是指受调节的启动子控制的表达。
“诱导型启动子”指可以在一种或多种细胞类型中通过外部刺激开启的受调节的启动子，所述外部刺激例如化学品、光、激素、胁迫或病原体。如本文所用，术语“转录调节性核苷酸序列”指影响待转录的相关(或功能性连接)的核苷酸序列转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。转录调节性核苷酸序列可以相对于待转录的核苷酸序列具有不同的定位。转录调节性核苷酸序列可以位于待转录序列(例如，编码序列)的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)。转录调节性核苷酸序列可以选自包含增强子、启动子、翻译前导分子、内含子、5'-非翻译序列、3'-非翻译序列和多聚腺苷化信号序列的组。它们包括天然序列和合成序列以及可以作为合成序列和天然序列的组合的序列。术语“转录调节性核苷酸序列”不限于启动子。然而，优选地，本发明的转录调节性核苷酸序列包含至少一个启动子序列(例如，位于基因的转录起点上游的能够引起下游序列转录的序列)。在一个优选的实施方案中，本发明的转录调节性核苷酸序列包含相应基因的启动子序列并且–任选地和优选地–包含所述基因的天然5'非翻译区。另外，也可以使用所述基因的3’非翻译区和/或多聚腺苷化区。
如本文所用，术语“顺式调节元件”或“启动子基序”指赋予总体控制基因表达的一个方面的顺式作用转录调节元件。顺式元件可以发挥作用以结合转录因子，即调节转录的反式作用蛋白质因子。一些顺式元件结合多于一种转录因子，并且转录因子可以与多于一个顺式元件以不同亲和力相互作用。本发明的启动子合乎需要地含有可以赋予或调节基因表达的顺式元件。可以通过许多技术来鉴定顺式元件，包括缺失分析法，即，从启动子5'末端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹法、甲基化干扰法、电泳迁移率变动测定法、借助连接作用介导PCR的体内基因组足迹法和其他常规测定法的DNA结合蛋白分析法；或通过常规DNA序列比较方法与已知顺式元件基序进行DNA序列相似性分析。顺式元件的精细结构可以通过诱变(或置换)一个或多个核苷酸或通过其他常规方法进一步研究。顺式元件可以通过化学合成或通过从包含这类元件的启动子分离而获得，并且它们可以用额外的旁侧分布核苷酸合成，所述旁侧分布核苷酸含有可用限制性酶位点以促进后续操作。
启动子(有或无增强子)的“表达模式”是表达水平的模式，其表现为所述启动子在植物中的何处和哪些发育阶段中起始转录。当一种启动子的表达模式与其他启动子的表达模式只有极少重叠时，启动子的组的表达模式被认为是互补的。可以通过测量标准转录的报告子mRNA的“稳态”浓度，确定启动子的表达水平。该测量是间接的，因为报告子mRNA的浓度不仅依赖于其合成速率，还依赖于mRNA的降解速率。因此，稳态水平是合成速率和降解速率的产物。然而，当转录的分子相同时，可认为降解速率以固定的速率进行，并且因此该值可作为合成速率的量度。当以该方式比较启动子时，本领域技术人员可利用的技术是杂交S1-RNA酶分析、Norther印迹和竞争性RT-PCR。该技术列表并非以任何方式代表所有可利用的技术，而是描述用于分析mRNA的转录活性和表达水平的常用方法。几乎所有启动子的转录起点的分析已经揭示了在转录开始处通常不会没有单个碱基，而是具有或多或少成簇的起始位点集合，每个簇占mRNA的一些起始起点。由于该分布在启动子之间存在差异，因此群体中的每个报告子mRNA的序列都将彼此不同。由于每个mRNA种类或多或少对降解易感，因此，对不同的报告子mRNA不能期待具有单个降解速率。对多个真核启动子序列已显示，在起始位点(起始子)附近的序列在决定由特异性启动子指导的RNA表达水平中具有重要的作用。这还包括转录的序列的部分。因此，启动子与报告子序列的直接融合将导致次优的转录水平。分析表达模式和水平的常用方法是通过确定细胞中积累的蛋白质的“稳态”水平。本领域技术人员已知的报告子基因的常用候选对象是β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)和具有荧光特性的蛋白质，如来自水母(Aequora victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)。然而，在原则上，更多种蛋白质也适合该目的，只要所述蛋白质不干扰本质的植物功能。多种工具适合进行定量和定位。可以方便地产生或获得基于例如免疫化学、酶学、荧光检测和定量的检测系统。可以使用蛋白质表达的原位分析，来确定植物组织提取物或完整的组织中的蛋白质水平。一般而言，具有一种嵌合的启动子报告子构建体的单个转化品系的报告子基因的表达水平可不同。通常还观察到这类转化体不表达任何可检测的产物(RNA或蛋白质)的现象。表达的变异通常归因于“位置效应”，尽管该无活性的潜在分子机制通常不明。
“组织特异性启动子”指不在全部植物细胞中表达、而仅在特定器官(如叶或种子)的一个或多个细胞类型中、特定组织(如胚或子叶)或特定细胞类型(如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)中表达的调节型启动子。这些还包括按时间方式如在早期或晚期胚发生中、叶扩展期间、正在发育的种子或果实中的果实成熟、在充分分化的叶中或在衰老开始时受调节的启动子。为了本发明的目的，“组织特异的”优选地指“种子特异的”或“种子优先的”或胚特异的或胚优先的。
如本文所用，“种子”优选指整个种子、胚乳和胚组织，更优选指胚组织。本发明意义上的“特异的”是指当存在于植物中时，与本文提及的转录调节性核苷酸序列有效连接的目的多核苷酸将主要在指定的组织或细胞中表达。本文所指的主要表达的特征在于在所述组织或细胞中相对于其他植物组织的可检测转录的统计学上显着更高的量。统计学上显着更高的转录量优选地是在至少一种具有可检测转录的其他组织中发现量的至少两倍、三倍、四倍、五倍、十倍、一百倍、五百倍或千倍的量。备选地，它是在所示组织或细胞中的表达，其中在其他组织或细胞中的转录量小于总体(整株植物)表达量的1％、2％、3％、4％或最优选地5％。转录量与细胞或组织中存在的转录本(即RNA)的量或转录本编码的多肽的量直接相关。基于RNA或多肽测量转录的合适技术是本领域熟知的。除了上述之外，组织或细胞特异性备选地和优选地意指表达是受限的或几乎限于指定的组织或细胞，即在其他组织中基本上没有可检测的转录。本文所指的几乎限于是指在少于10个，少于5个，少于4个，少于3个，少于两个或一个其他组织中可检测到非特异的表达。在本发明的上下文中，“种子优先的”或“胚优先的”是指通过转录调节元件转录核酸序列，使得所述核酸序列在种子中的转录贡献在植物的任何发育阶段期间、在整个植物中从所述核酸序列转录的RNA的全部量的多于50％，优选地多于70％，更优选地多于80％。
“表达”指内源基因、ORF或其部分或转基因在植物中的转录和/或翻译。例如，在反义构建体的情况下，表达可以指仅反义DNA的转录。此外，表达指有义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定积累。表达还可以指蛋白质的产生。
种子特异性表达可以通过比较与表达控制序列有效连接的目的核酸(例如，报告基因，例如GUS)在下列组织和阶段中的表达来确定：1)5叶期的根和叶，2)V-7阶段的茎，3)开花期的叶、壳和穗丝(第一次出现穗丝)，4)授粉时的小穗/雄花穗，5)授粉后5、10、15、20和25天的穗或籽粒。优选地，目的核酸的表达可以在授粉后5、10、15、20和25天的穗或籽粒中在附图所示的分析试验中测定。可以通过多种熟知的技术测定目的多核苷酸的表达，例如通过Northern印迹或WO 02/102970中所描述的原位杂交技术测定，优选地按附于本发明的实施例所述的GUS组织化学分析方法测定。用于分析种子特异性表达的转基因植物也能够通过技术人员所熟知、并在本说明书其它地方讨论的技术产生。
术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物，包括含有糖、磷酸和碱基的单体(核苷酸)，该碱基是嘌呤或嘧啶。除非具体限制，该术语涵盖了含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其与参照核酸具有相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指出，特定的核酸序列还暗示性的涵盖了保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补的序列，以及明确述及的序列。具体而言，可以通过产生这样的序列来实现简并密码子取代，该序列中一个或多个选定(或所有)密码子的第3位被混合的碱基和/或脱氧次黄苷残基取代(Batzer 1991；Ohtsuka 1985；Rossolini1994)。“核酸片段”是给定核酸分子的部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传材料，而核糖核酸(RNA)参与DNA内所含信息向蛋白质中转移。术语“核苷酸序列”指可以是单链或双链的DNA或RNA的聚合物，任选的含有能够整合到DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。术语“核酸”或“核酸序列”还可以与基因、cDNA、DNA和基因编码的RNA互换的使用。
本发明涵盖了分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。在本发明的上下文中，“分离的”或“纯化的”DNA分子，或“分离的”或“纯化的”多肽是籍人力，脱离其天然环境而存在的DNA分子或多肽，因而不是天然产物。分离的DNA分子或多肽可以以纯化的形式存在，或者可以存在于非天然的环境中，例如转基因宿主细胞中。例如，“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质，或其生物学活性部分，是基本不含其他细胞材料，或者当通过重组技术产生时基本不含培养基，或者当合成产生时基本不含化学前体或其他化学品。优选地，“分离的”核酸不含核酸所来源的生物体的基因组DNA中天然位于核酸侧翼(即，位于核酸的5’或3’端的序列)的序列(优选地蛋白质编码序列)。例如，在各实施方案中，分离的核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列是在该核酸所来源的生物体的基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼的。基本不含细胞材料的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重计)的污染蛋白的蛋白质或多肽制备物。当本发明的蛋白质或其生物学活性部分是重组产生的时，优选地培养基占少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的化学前体或非目标蛋白质的化学品。本发明的核苷酸序列包括天然存在的序列以及突变(变体)形式。此类变体仍然具有理想的活性，即，启动子活性或由非变体核苷酸序列的可读框编码的产物的活性。
术语“变体”涉及序列(例如，多肽或核酸序列——例如，本发明的转录调节性核苷酸序列)时，意在表示基本相似的序列。对于包含可读框的核苷酸序列，变体包括这样的序列，由于遗传密码的简并性，该序列编码与天然蛋白质相同的氨基酸序列。天然存在的等位变体可以使用例如普遍已知的分子生物学技术鉴别，如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，例如使用定点诱变产生的，和编码天然蛋白质的可读框，以及编码相对于天然蛋白质具有氨基酸取代的多肽的序列。一般而言，本发明的核苷酸序列变体与天然的(野生型或内源)核苷酸序列，即，例如与SEQ ID NO：99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,135,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,500,501,502,503,504,505,506,507,508,509,510,536,537,538,539,540,541,542,543,544,545,546,547,548,549,550,551,552,553,554,555,556,557,558,559,560,561,562,563,564,565,566,567,568,569,570,571,572,573,574,575,576,577,578,579,580,581,582,583,584,585,587,588,589或591具有至少40、50、60至70％，例如优选71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，一般至少80％，例如81％-84％，至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％和99％核苷酸序列同一性。
可以“优化”本发明的核酸分子用于增强在目标植物中的表达(参见例如WO 91/16432；Perlak 1991；Murray 1989)。以该方式，可以利用植物优选的密码子合成基因或基因片段中的可读框(参见例如Campbell&Gowri，1990关于宿主优选的密码子使用的讨论)。因而，可以优化核苷酸序列用于在任何植物中表达。认识到可以优化或合成所有的或任何部分的基因序列。即，还可以使用合成的或部分优化的序列。变体核苷酸序列和蛋白质还涵盖了源自诱变和重组操作方法的序列和蛋白质，例如DNA改组。使用此类操作方法，可以操作一种或多种不同的编码序列，来产生具有理想特性的新的多肽。以此方式，从相关多核苷酸序列的群体中产生重组多核苷酸的文库，该多核苷酸序列包含具有实质的序列同一性的序列区域，并可以在体外或体内同源重组。此种DNA改组的策略是本领域已知的(参见例如Stemmer 1994；Stemmer 1994；Crameri 1997；Moore 1997；Zhang 1997；Crameri 1998；和US 5,605,794，6，8，10和12,837,458)。
使用以下术语来描述两个或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分数”和(e)“基本上的同一性”。
(a)如本文中所用，“参考序列”是作为序列比较基础所用的定义序列。参考序列可以是指定序列的亚集合或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或完整cDNA或基因序列。
(b)如本文中所用，“比较窗口”指多核苷酸序列的连续和指定区段，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，在比较窗口中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即缺口)以最佳地比对两个序列。通常，比较窗口是至少20个连续核苷酸长度，并且任选地可以是30、40、50、100个或更长的连续核苷酸长度。本领域技术人员理解为了避免因多核苷酸序列中包含缺口而致与参考序列的高度相似性，一般引入缺口罚分并且从匹配数中扣除缺口罚分。
比对序列用于比较的方法是本领域熟知的。因此，可以使用数学算法完成任意两个序列之间同一性百分数的确定。这类数学算法的优选的非限制性例子是Myers和Miller，1988的算法；Smith等人，1981的局部同源性算法；Needleman和Wunsch，1970的同源性比对算法；Pearson和Lipman，1988的检索相似性法；Karlin和Altschul，1990的算法，如Karlin和Altschul，1993中修改的算法。
这些数学算法的计算机执行可以用于序列的比较以确定序列同一性。此类执行包括但不限于：PC/Gene程序(从Intelligenetics，Mountain View，Mountain View，Calif.可获得)中的CLUSTAL；ALIGN程序(第2.0版)和Wisconsin Genetics软件包第8版(从GeneticsComputer Group(GCG)，575Science Drive，Madison，Wis.，USA可获得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。可以利用默认参数进行使用这些程序的比对。充分描述了CLUSTAL程序(Higgins 1988，1989；Corpet 1988；Huang 1992；Pearson 1994)。ALIGN程序基于上文的Myers和Miller算法。Altschul等人，1990的BLAST程序基于上文的Karlin和Altschul算法。优选地使用Clustal W算法(Thompson 1994；例如，在软件VectorNTITM，第9版中；Invitrogen Inc.)，采用评分矩阵BLOSUM62MT2，用默认设置(缺口开口罚分15/19，缺口延伸罚分6.66/0.05；缺口分离罚分范围8；％比对延迟同一性40；使用残基特异性开口和亲水残基开口)，执行多重比对(即超过2个序列的比对)。
用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这种算法涉及首先通过确定查询序列中长度为W的短字，鉴定高评分序列对(HSP)，其中与数据库序列中具有相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足某些正值阈评分T。将T称作相邻字评分阈值(Altschul，1990)。这些初始相邻字命中充当种子，所述种子用于启动检索以找到含有这些种子的更长HSP。所述字命中随后在两个方向沿每个序列尽可能远地延伸，只要可以提高累积比对评分即可。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的惩罚评分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积评分。字命中在每个方向上的延伸在以下情况时停止：累积比对评分从其最大实现值跌落达量X，累积评分因积累一个或更多负评分残基比对而达到或低于零，或抵达两个序列中任一序列的末端。
除计算序列同一性百分数之外，BLAST算法也执行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供2个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配会因偶然发生的概率指示。例如，如果最小总和概率在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中小于约0.1、更优选小于约0.01并且最优选小于约0.001，则测试核酸序列视为类似于参考序列。
为了出于比较目的获得缺口比对，可以如Altschul等人，1997中所述那样使用缺口BLAST(在BLAST 2.0中)。备选地，(BLAST2.0中的)PSI-BLAST可以用来执行检测分子之间远缘关系的迭代检索。参见Altschul等人，上文。当使用BLAST、缺口BLAST和PSI-BLAST时，可以使用相应程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN、用于蛋白质的BLASTX)的默认参数。(用于核苷酸序列的)BLASTN程序使用字长度(W)11、期望(E)10、临界值100、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长度(W)3、期望(E)10和BLOSUM62评分矩阵作为默认(参见Henikoff和Henikoff，1989)。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。比对也可以通过视检以手工进行。
为了本发明的目的，优选地使用BlastN程序(第1.4.7版或更高版本)连同其默认参数(字长度(W)11、期望值(E)10、临界值100、M＝5、N＝-4和两条链的比较)或任何等同程序，将用于确定序列同一性百分数的核苷酸序列与特定的核苷酸序列(例如，本文公开的启动子序列)比较。“等效程序”是指任何序列比较程序，其对于所讨论的任何两个序列，当与优选程序产生的相应比对相比时，所述的序列比较程序产生了具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的百分序列同一性的比对结果。
为了本发明的目的，用于确定与特定多肽或氨基酸序列的序列同一性/同源性百分数的多肽或氨基酸序列的比较优选地使用BlastP程序(版本1.4.7或更高版本)及其默认参数进行(字长度(W)为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoff&Henikoff,1989)；参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)或任何等效程序。“等同程序”意指任何序列比较程序，其中对于所讨论的任意两个序列而言，与通过优选程序生成的相应比对结果比较时，所述的序列比较程序生成了具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分数的比对结果。
(c)如本文中所用，“序列同一性”或“同一性”在两个核酸或多肽序列的上下文中意指，当为了指定比较窗口范围内的最大对应性进行比对时，在这两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数就蛋白质而使用时，认识到不相同的残基位置往往差异在于保守性氨基酸置换，其中氨基酸残基被置换为具有相似化学属性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并且因而不改变该分子的功能性属性。当序列差异在于保守性置换时，可以向上调节序列同一性百分数以针对该置换的保守本质进行校正。将因此类保守性置换而不同的序列称作具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调节的方法是本领域技术人员熟知的。通常地，这涉及将保守性置换计算为部分而非完全的错配，因而提高序列同一性百分数。因此，例如，将记分1给予一个相同氨基酸并且将记分0给予一个非保守性置换的情况下，向一个保守性置换给予一个在0至1之间的记分。计算保守性置换的记分，例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，Calif.)中执行那样。
(d)如本文中所用，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列而测定的值，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比时，所述多核苷酸序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即缺口)以最佳地比对这两个序列。通过以下方式计算百分数，即确定其中相同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数并且将结果乘以100以产生序列同一性百分数。
(e)(i)术语多核苷酸序列的“基本上的同一性”意指包含下述序列的多核苷酸，其中使用所述的比对程序之一，使用标准参数时，所述序列与参考序列相比具有至少38％、例如39％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％、优选地至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更优选地至少90％、91％、92％、93％或94％和最优选地至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。本领域技术人员将会认识到通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、可读框定位等，可以适当调整这些值以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列基本上的同一性通常情况下意指至少38％、50％或60％,优选地至少70％或80％，更优选地至少90％、95％，和最优选地至少98％的序列同一性。
核苷酸序列基本上同一的另一个指标是这两个分子是否在严格条件下彼此杂交(见下文)。通常，将严格条件选择是在确定的离子强度和pH，低于特定序列的热解链温度(Tm)约5℃。但是，严格条件涵盖约1℃至约20℃范围内的温度，这取决于如本文中另行规定的所需严格程度。如果严格条件下彼此不杂交的核酸编码的多肽基本上同一，则所述核酸仍是基本上同一的。例如当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，这种情况可以出现。两个核酸序列基本上同一的另一个指标是当第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽在免疫上发生交叉反应时。
(ii)术语“基本上的同一性”在肽的上下文中表示肽包含在指定的比较窗口范围内与参考序列具有至少38％、例如39％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％、优选地80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％,或89％、更优选地至少90％、91％、92％、93％或94％或甚至更优选地，95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。优选地，使用Needleman和Wunsch(1970)同源性比对算法实施最佳比对。两个肽序列基本上同一的一个指标是一种肽与针对第二肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，在两个肽仅因保守性置换而不同的情况下，一个肽与第二肽基本上同一。
对于序列比较，一般地一个序列充当与受试序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将受试序列和参考序列输入计算机，根据需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算受试序列的序列同一性百分数。
如上所述，两个核酸序列基本上同一的另一个指标是这两个分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交至”指某分子在严格条件下仅与特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交，此时所述序列存在于复杂混合物(例如，总细胞DNA或RNA)中。“基本上结合”指探针核酸和靶核酸之间的互补性杂交并且包含可以通过降低杂交介质的严格性而容许的少量错配以实现所需的对靶核酸序列的检测。
在核酸杂交实验如DNA印迹和RNA印迹杂交的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。Tm是(在确定的离子强度和pH下)这样的温度，在所述温度，50％的靶序列与完美匹配的探针杂交。特异性一般是杂交后的洗涤、作为关键因素的离子强度和终末洗涤溶液的温度的函数。对于DNA-DNA杂交分子，Tm可以从Meinkoth和Wahl，1984的等式逼近：
Tm＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)–500/L
其中M是一价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，并且L是以碱基对计的杂交分子长度。对于每1％的错配，Tm下降约1℃；因此，可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件以与具有目的同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有>90％同一性的序列，则可以将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择成比确定的离子强度和pH时特定序列及其互补序列的热解链点I低约5℃。然而，极严格条件可以利用比热解链点I低1、2、3或4℃时的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比热解链点I低6、7、8、9或10℃时的杂交和/或洗涤；低严格性条件可以利用比热解链点I低11、12、13、14、15或20℃时的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交组合物和洗涤组合物和所需的Tm，普通技术人员将理解，内在描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果想要的错配程度产生小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，则优选增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。对核酸杂交的广泛指导存在Tijssen，1993中。通常，将高度严格杂交和洗涤条件选择成比确定的离子强度和pH时特定序列的热解链点Tm低约5℃。
高度严格的洗涤条件的例子是在72℃时0.15M NaCl持续约15分钟。严格洗涤条件的例子是在65℃时0.2×SSC洗涤持续15分钟(对于SSC缓冲液的描述，参见Sambrook，上文)。经常，高严格性洗涤之前是低严格性洗涤以除去背景探针信号。用于例如多于100个核苷酸的双链体的中等严格性洗涤的例子是在45℃时1×SSC持续15分钟。用于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤的例子是在40℃时4X至6×SSC持续15分钟。对于短探针(例如，约10个至50个核苷酸)，严格条件一般地涉及在pH 7.0至8.3时小于约1.5M、更优选地约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)的盐浓度，并且温度一般是至少约30℃并且对于长探针(例如，>50个核苷酸)，是至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格性条件。通常，2X(或高于)特定杂交测定法中对不相关探针所观察的信噪比表示检测到特异性杂交。在严格条件下彼此不杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本上同一的，则所述核酸仍是基本上同一的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，出现这种情况。
将非常严格的条件选择成等于特定探针的Tm。用于DNA印迹法或RNA印迹法中的滤膜上杂交具有多于100个互补性残基的互补性核酸的非常严格杂交条件的例子是例如，在37℃于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60℃至65℃于0.1×SSC中洗涤。示例性低严格性条件包括在37℃用30％至35％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并且在50℃至55℃于1X至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格性条件包括在37℃于40％至45％甲酰胺，1.0M NaCl，1％SDS中杂交，并且在55℃至60℃于0.5X至1×SSC中洗涤。
以下是可以用来克隆与本发明参考核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列的成组杂交/洗涤条件的例子：参考核苷酸序列优选地与该参考核苷酸序列在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤(非常低严格性条件)；更合乎需要地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤(低严格性条件)；更合乎需要地仍在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤(中等严格性条件)；优选地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤(高严格性条件)；更优选地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤(非常高严格性条件)。
术语“可读框”和“ORF”指编码序列的翻译起始和终止密码子之间被编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指编码序列中3个相邻的核苷酸单元(密码子)，分别说明蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止。
“编码的序列”或“编码序列”指编码具体氨基酸分子且排除了非编码序列的DNA或RNA分子。其可以构成“不中断的编码序列”，即，缺少内含子，例如为cDNA形式，或者其可以包括一个或多个以恰当的剪切接合点为边界的内含子。“内含子”是RNA中的序列，其包含在初级转录物中，但通过细胞内的RNA切割和重新连接而被去除以产生可以翻译成蛋白质的成熟mRNA。
“有效连接的”或“功能性连接的”优选地指在单个核酸片段上的多个核酸序列的关联，使得一个核酸序列的功能受其他核酸序列的影响。例如，认为调节DNA序列与编码RNA或多肽的DNA序列是“有效连接的”或“关联的”，如果这两个序列的位置使调节DNA序列影响编码DNA序列的表达(即，编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制之下)。编码序列可以以有义或反义取向与调节序列有效连接。
术语“异源DNA序列”、“外源DNA区段”或“异源核酸”一般指源自对于特定宿主细胞外来来源的序列，或者如果来自相同的来源，则是对其原始形态修饰过的。“异源”通常是指对细胞而言不是内源的核酸序列或不是核酸序列存在的天然基因组的一部分，并且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微投射(microprojection)等添加到细胞中。因此，宿主细胞中的异源基因包括是特定宿主细胞内源性的基因，但经过了例如使用DNA改组的修饰。该术语还包括天然存在的DNA分子的非天然存在的多拷贝。因此，该术语指对于细胞外源或异源的DNA区段，或对于细胞同源但位于宿主细胞核酸内通常不可见所述元件的位置中的DNA区段。表达外源DNA区段以产生外源多肽。在本发明的上下文中，编码目的多肽的“异源核酸序列”意指与本发明的双转运肽编码序列不天然有效连接的序列，包括天然存在的DNA序列的非天然存在多拷贝。虽然该核苷酸序列对双转运肽编码序列而言是异源的，但它对植物宿主可以是同源的，或“天然的”，或异源的，或“外源的”。在一些情况下，转化的植物可能具有表型变化。
在核苷酸序列同一性的上下文中，“与……同源”指两条核酸分子的核苷酸序列之间或两条蛋白质分子的氨基酸序列之间的相似性。这类同源性的估算是由在本领域技术人员普遍已知的严格条件下的DNA-DNA或DNA-RNA杂交提供的(如Haines和Higgins(编著)，Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，U.K.所述)，或由两条核酸或蛋白质之间的序列相似性比较提供的。
将“载体”定义为尤其包括处于双链或单链的线性或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元载体，其可以是或不是可自我传代的或可移动的，并且可以通过整合到细胞基因组中或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制型质粒)，来转化原核或真核宿主。
具体而言，包括了穿梭载体，其意为能够天然地或经设计地在两种不同的宿主生物中复制的DNA运载体，可选自放线菌及相关物种、细菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。
优选地，载体中的核酸处于用于宿主细胞(例如微生物，如细菌或植物细胞)中的转录的恰当启动子或其他调节元件的控制下，并且与其有效连接。载体可以是在多种宿主中有功能的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，可以含有其自身的启动子或其他调节元件，而在cDNA的情况下，可以处于用于宿主细胞中的表达的恰当启动子或其他调节元件的控制下。
“克隆载体”通常含有一个或少数限制性内切酶识别位点，在所述位点处可以以可确定的方式插入外源DNA序列，而不丢失载体的必需生物学功能，还可以插入适用于鉴别和选择用克隆载体转化的细胞的标志物基因。标志物基因通常包括提供四环素抗性、潮霉素抗性、卡那霉素抗性、链霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
“转基因”指已经通过转化导入到基因组中并稳定地或瞬时地维持的基因。转基因可包括，例如，与待转化的特定的植物的基因异源或同源的基因。此外，转基因可包含插入到非天然生物中的天然基因，或嵌合基因。术语“内源基因”指在生物基因组的天然位置上的天然基因。“外源基因”指通常在宿主生物中不可见，但通过基因转移导入的基因。
术语“转化”指将核酸片段转移到宿主细胞的基因组中。含有经转化的核酸片段的宿主细胞被称为“转基因”细胞，并且包含转基因细胞的生物被称为“转基因生物”。转化植物和植物细胞的方法的实例包括农杆菌介导的转化(De Blaere1987)和粒子轰击技术(US4,945,050)。通过熟练的技术人员普遍已知的方法从转基因细胞再生完整的植物(参见例如，Fromm 1990)。
“转化的”、“转基因的”和“重组的”指其中导入了异源核酸分子的宿主生物，如细菌或植物。本领域普遍已知并公开了可以将核酸分子稳定地整合到基因组中(Sambrook1989；Innis 1995；Gelfand 1995；Innis&Gelfand 1999)。例如，“转化的”、“转化体”，和“转基因”植物或愈伤组织已经过了转化过程，并含有整合到其染色体中的外源基因。术语“未转化的”指没有经过转化过程的正常植物。当多核苷酸或多肽是人工的或工程化的、或是衍生自人工的或工程化的蛋白质或核酸时，所述多核苷酸或多肽是“重组的”。例如，插入载体或任何其他异源位置的多核苷酸，例如在重组生物的基因组中的多核苷酸，使得它与在自然界中发现的通常位于该多核苷酸侧翼的核苷酸序列无关，从而它是重组的多核苷酸。从重组多核苷酸体外或体内表达的多肽是重组多肽的实例。同样地，天然不存在的多核苷酸序列(例如天然存在的基因的变体)是重组的。
“瞬时转化的”指其中已导入了转基因和外源DNA的细胞(例如，通过农杆菌介导的转化或生物射弹轰击方法)，但不进行稳定维持的选择。
“稳定转化的”指在转化后在选择培养基上经过选择并再生的细胞。
“染色体整合的”指外源基因或DNA构建体通过共价键整合到宿主DNA中。当基因不是“染色体整合的”时，它们可以是“瞬时表达的”。基因的瞬时表达指不是整合到宿主染色体中，而是独立发挥功能的基因表达，例如作为自主复制质粒或表达盒的一部分，或作为其他生物系统(如病毒)的一部分。“遗传上稳定的”和“可遗传的”指染色体整合的遗传元件，所述遗传元件稳定维持在植物中并在连续的世代之间被后代稳定遗传。
“转基因植物”是具有一个或多个植物细胞的植物，所述植物细胞含有如下文详述中所定义的表达载体。
“初级转化体”和“T0世代”指与初始转化的组织具有相同遗传世代的转基因植物(即，自转化后尚未经历减数分裂和受精)。
“次级转化体”和“T1、T2、T3等世代”指通过一个或多个减数分裂和受精的循环，源自初级转化体的转基因植物。它们可以源自初级或次级转化体的自花授粉，或初级或次级转化体与其他转化的或未转化的植物杂交。
“植物组织”包括分化的和未分化的组织或植物，包括但不限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、瘤组织和多种形式的细胞和培养物，例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织。植物组织可以在植物中，或在器官、组织或细胞培养物中。
术语“改变的植物性状”意指转基因植物中相对于野生型或非转基因植物宿主的任何表型或基因型的改变。
词语“植物”指任何植物，特别是指农业上有用的植物(例如，种子植物)，“植物细胞”是植物的结构和生理学单元，包含细胞壁，但也可以指原生质体。植物细胞可以是分离的单细胞或培养的细胞的形式，或者作为更有组织的单元的部分，例如植物组织，或分化成存在于植物发育的任何阶段的结构的植物器官。这类结构包括一种或多种植物器官，包括但不限于果实、芽、茎、叶、花瓣等。优选地，术语“植物”包括整个植物、芽营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、花萼、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如，维管组织、地下组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、毛状体等)，及其后代。可用于本发明方法中的植物类别一般宽泛地是只要易于进行转化技术的高等或低等植物类别，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、苔藓和多细胞藻类。其包括多种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。植物界的高等和低等植物的所有种属都包含在本发明的范围内。进一步包括了成熟的植物、种子、芽和幼苗，及其来源的部分、繁殖材料(例如种子和果实)和培养物，例如细胞培养物。
发明详述
因此，本发明的第一个实施方案涉及重组嵌合核酸分子，其包含有效连接至编码目的多肽的异源核酸序列的编码双转运肽的核酸序列。
如本文所用，术语“双转运肽”是指叶绿体和/或线粒体前体蛋白的N-末端部分，并且有助于特异性识别叶绿体和/或线粒体表面以及介导前蛋白质跨过叶绿体膜并进入叶绿体内的各个亚室(例如基质、类囊体和类囊体膜)和/或线粒体中的翻译后易位。因此，如本文所用，具有“双转运肽活性”的多肽包含当有效连接至目的蛋白质的N-末端区域时促进目的多肽易位至叶绿体和/或线粒体的多肽。
术语“嵌合”序列是指具有连接在一起的两个或更多个异源序列的序列。如本文所用，“异源”双转运肽包含这样的转运肽序列，所述转运肽序列对于其有效连接的目的多肽来说是外来的。
在一个实施方案中，与衍生自例如高等植物生物体的双转运肽相比，本文公开的双转运肽提供改善的易位。当与参考转运肽相比时，本文公开的双转运肽可以导致至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90，至少约100％，或更大，或至少约2倍，至少约3倍，至少约4倍或更大地改善多肽易位到叶绿体和/或线粒体中。可以根据易位到叶绿体和/或线粒体中的多肽的量、易位到叶绿体和/或线粒体中的活性多肽的量或两者来测量改善。还可以用叶绿体和/或线粒体靶向的目的蛋白转化的生物的表型的改善来测量改善。例如，当本发明的双转运肽用于将除草剂抗性蛋白靶向植物的叶绿体和/或线粒体时，可以根据除草剂抗性的改善来测量活性的改善。
本发明的发明人惊奇地发现，将认为被分类为“杂草”的植物物种的2型原卟啉原氧化酶(PPO-2)的N-末端双转运肽与该转运肽异源的目的多肽相连接改善了所述目的多肽向叶绿体和/或线粒体的转运。
网站http://weedscience.org/提供了这些所谓的杂草物种的完整清单，其中一些可能是抗除草剂或耐受除草剂的。本领域技术人员将认识到，来自多种杂草物种的PPO-2多肽的双转运肽以及与PPO-2多肽的该双转运肽具有高度相似性的双转运肽包括在本发明中。
具体而言，那些杂草物种包括苘麻(Abutilon theophrasti)、铁苋菜(Acalyphaaustralis)、藿香蓟(Ageratum conyzoides)、匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)、窄叶泽泻(Alisma canaliculatum)、川泽泻(Alisma plantago-aquatica)、看麦娘(Alopecurusaequalis)、日本看麦娘(Alopecurus japonicas)、大穗看麦娘(Alopecurusmyosuroides)、白苋(Amaranthus albus)、北美苋(Amaranthus blitoides)、苋谷(Amaranthus blitum)(ssp.oleraceus)、Amaranthus cruentus、绿穗苋(Amaranthushybridus)(syn:quitensis)、长芒苋(Amaranthus palmeri)、鲍威氏苋(Amaranthuspowellii)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)、刺苋(Amaranthus spinosus)、糙果苋(Amaranthus tuberculatus)(＝A.rudis)、皱果苋(Amaranthus viridis)、豚草(Ambrosiaartemisiifolia)、三裂叶豚草(Ambrosia trifida)、耳基水苋(Ammannia auriculata)、红花水苋(Ammannia coccinea)、野欧黄菊(Anthemis arvensis)、臭春黄菊(Anthemiscotula)、阿披拉草(Apera spica-venti)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、南非金盏草(Arctotheca calendula)、无心菜(Arenaria serpyllifolia)、滨藜(Atriplex patula)、野燕麦(Avena fatua)、不实野燕麦(Avena sterilis)、不实野燕麦长颖亚种、圆叶虎耳(Bacopa rotundifolia)、菵草(Beckmannia syzigachne)、三叶鬼针草(Bidens pilosa)、Bidens subalternans、狼把草(Bidens tripartite)、Bifora radians、无尾水筛(Blyxaaubertii)、臂形草(Brachiaria eruciformis)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、芜菁(Brassica rapa)(＝B.campestris)、非洲芥末(Brassica tournefortii)、双雄雀麦(Bromus diandrus)、硬雀麦(Bromus diandrus ssp.Rigidus)(＝B.rigidus)、日本雀麦(Bromus japonicas)、垂花飞廉(Bromus rubens)、黑麦状雀麦(Bromus secalinus)、贫育雀麦(Bromus sterilis)、旱雀麦(Bromus tectorum)、田紫草(Buglossoides arvensis)(＝Lithospermum arvense)、小果亚麻荠(Camelina microcarpa)、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、麝香飞廉(Carduus nutans).意大利蓟(Carduus pycnocephalus)、矢车菊(Centaurea cyanus)、黄星蓟(Centaurea solstitialis)、白藜(Chenopodium album)、条纹藜(Chenopodium album var.striatum)(＝C.strictum var.glaucophyllum)、小藜(Chenopodium ficifolium)、多孢藜(Chenopodium polyspermum)、单藜(Chenopodiumsimplex)(＝杂种藜(C.hybridum))、孟仁草(Chloris barbata)＝(C.inflate)、黄花菜(Chloris elata)、截头虎尾草(Chloris truncate)、虎尾草(Chloris virgate)、苘蒿(Chrysanthemum coronarium)、丝路蓟(Cirsium arvense)、毛野牡丹藤(Clidemiahirta)、节节草(Commelina diffusa)、田旋花(Convolvulus arvensis)、香丝草(Conyzabonariensis)、小蓬草(Conyza Canadensis)、苏门白酒草(Conyza sumatrensis)、革命菜(Crassocephalum crepidioides)、屋根草(Crepis tectorum)、蔺状隐花草(Crypsisschoenoides)、萼距花(Cuphea carthagenenis)、田野菟丝子(Cuscuta pentagona)(＝C.campestris)、糙毛绊根草(Cynodon hirsutus)、洋狗尾草(Cynosurus echinatus)、短叶茳芏(Cyperus brevifolius)、扁穗莎草(Cyperus compressus)、异型莎草(Cyperusdifformis)、油莎草(Cyperus esculentus)、碎米莎草(Cyperus iria)、香附(Cyperusodoratus)、星果泻(Damasonium minus)、曼陀罗(Datura stramonium)、野胡萝卜(Daucuscarota)、播娘蒿(Descurainia Sophia)、升马唐(Digitaria ciliaris)、两耳草(Digitaria insularis)、止血马唐(Digitaria ischaemum)、马唐(Digitariasanguinalis)、二行芥(Diplotaxis erucoides)、细叶二行芥(Diplotaxis tenuifolia)、虻眼草(Dopatrium junceum)、光头稗(Echinochloa colona)、大骨草(Echinochloa crus-galli var.crus-galli)、台湾稗草(Echinochloa crus-galli var.formosensis)、西来稗(Echinochloa crusgalli var.zelayensis)、孔雀稗(Echinochloa crus-pavonis)、埃瑞克稗(Echinochloa erecta)、稻稗(Echinochloa oryzoides)、水稗(Echinochloaphyllopogon)(＝E.oryzicola)、车前叶蓝蓟(Echium plantagineum)、长花皱稃草(Ehrharta longiflora)、三蕊沟繁缕(Elatine triandra var.pedicellata)、迷你牛毛毡(Eleocharis acicularis)、牛筋草(Eleusine indica)、东北柳叶菜(Epilobiumciliatum)、四叶柳叶菜(Epilobium tetragonum)、费城飞莲(Erigeron philadelphicus)、路易斯安纳野黍(Eriochloa punctuate)、Erucaria hispanica、粗梗糖芥(Erysimumrepandum)、白苞猩猩草(Euphorbia heterophylla)、水虱草(Fimbristylis miliacea)、密花球果紫堇(Fumaria densiflora)、鼬瓣花(Galeopsis tetrahit)、睫毛牛膝菊(Galinsoga ciliate)、猪殃殃(Galium aparine)、锯锯藤(Galium spurium)、三角草(Galium tricornutum)、Gamochaeta pensylvanica、粗叶耳草(Hedyotis verticillata)、向日葵(Helianthus annuus)、Hirschfeldia incana、大麦草(Hordeum murinumssp.Glaucum)、墙大麦(Hordeum murinum ssp.Leporinum)、下轮叶黑藻(Hydrillaverticillata)、田间鸭嘴草(Ischaemum rugosum)、假苍耳(Iva xanthifolia)、单刚毛狗尾草(Ixophorus unisetus)、扫帚草(Kochia scoparia)、毒莴苣(Lactuca serriola)、Lamium amplexicaule、紫萍(Landoltia punctate)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、千金子(Leptochloa chinensis)、黍千金子(Leptochloa panicoides)、糙千金子(Leptochloa scabra)、多小枝千金子(Leptochloa virgate)、黄花绒叶草(Limnocharisflava)、直立石龙尾(Limnophila erecta)、无柄花石龙尾(Limnophila sessiliflora)、美洲母草(Lindernia dubia)(＝美洲母草主变种(Lindernia dubia var.major))、狭叶母草(Lindemia micrantha)、陌上草(Lindemia procumbens)、多年生黑麦草(Loliumperenne)、多花黑麦草(Lolium perenne ssp.Multiflorum)、欧黑麦草(Loliumpersicum)、硬直黑麦草(Lolium rigidum)、丁香蓼(Ludwigia prostrate)、同花母菊(Matricaria discoidea)、母菊(Matricaria recutita)(＝洋甘菊(M.chamomilla))、台湾通泉草(Mazus fauriei)、短小通泉草(Mazus pumilus)、冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)、蓋裂果(Mitracarpus hirtus)、雨久花(Monochoria korsakowii)、鸭舌草(Monochoria vaginalis)、鹅肠菜(Myosoton aquaticum)、智利针茅(Nassellaneesiana)、三叉针茅(Nassella trichotoma)、球果芥(Neslia paniculata)、森林稻(Oryza sativa var.sylvatica)、细叶黍(Panicum capillare)、洋野黍(Panicumdichotomiflorum)、虞美人(Papaver rhoeas)、银胶菊(Parthenium hysterophorus)、杯子菊(Pentzia suffruticosa)、短刺虉草(Phalaris brachystachys)、小虉草(Phalarisminor)、变形虉草(Phalaris paradoxa)、毛连菜(Picris hieracioides)、车前草(Plantago lagopus)、长车前草(Plantago lanceolate)、早熟禾(Poa annua)、扁蓄蓼(Polygonum aviculare)、卷茎蓼(Polygonum convolvulus)(＝Fallopia convolvulus)、水蓼(Polygonum hydropiper)、酸模叶蓼(Polygonum lapathifolium)、宾西法尼亚蓼(Polygonum pensylvanicum)、春蓼(Polygonum persicaria)、棒头草(Polypogon fugax)、长芒棒头草(Polypogon monspeliensis)、马齿苋(Portulaca oleracea)、乌头叶毛茛(Ranunculus acris)、野萝卜(Raphanus raphanistrum)、秋冬萝卜(Raphanus sativus)、皱果荠(Rapistrum rugosum)、印度蔊菜(Rorippa indica)、喙稃草(Rostraria smyrnacea)(＝Lophochloa smyrnacea)、印度节节菜原变种(Rotala indica var.uliginosa)、亚拉圭亚小百叶(Rotala pusilla)、筒轴茅(Rottboellia cochinchinensis)(＝R.exaltata)、齿果酸模(Rumex dentatus)、冠果草(Sagittaria guyanensis)、蒙特登慈姑(Sagittariamontevidensis)、矮慈姑(Sagittaria pygmaea)、慈菇(Sagittaria trifolia)、风滚草(Salsola tragus)、蔺草(Schoenoplectus fluviatilis)、萤蔺(Schoenoplectusjuncoides)、北水毛花(Schoenoplectus mucronatus)(＝Scirpus mucronatus)、猪毛草(Schoenoplectus wallichii)、硬草(Sclerochloa dura)、耿氏硬草(Sclerochloakengiana)、弗纳利斯千里光(Senecio vernalis)、欧洲千里光(Senecio vulgaris)、大狗尾草(Setaria faberi)、金狗尾草(Setaria pumila)(＝S.glauca)、倒刺狗尾草(Setariaverticillata)、翠绿狗尾草(Setaria viridis)、巨狗尾草(Setaria viridis var.major)(＝var.robusta-alba、var.robustapurpurea)、刺金午时花(Sida spinose)、蝇子草(Silene gallica)、欧白芥(Sinapis alba)、野芥(Sinapis arvensis)、戟叶抪娘蒿(Sisymbrium orientale)、大蒜芥(Sisymbrium thellungii)、雪花草(Snowdeniapolystachya)、少花龙葵(Solanum americanum)、龙葵(Solanum nigrum)、东方龙葵(Solanum ptycanthum)、翅果假吐金菊(Soliva sessilis)、花叶滇苦菜(Sonchus asper)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、甜高粱(Sorghum bicolor)、苏丹高粱(Sorghum bicolorssp.Drummondii)(＝Sorghum sudanese)、约翰逊草(Sorghum halepense)、大爪草(Spergula arvensis)、尖瓣花(Sphenoclea zeylanica)、鼠尾粟(Sporobolus fertilis)、繁缕(Stellaria media)、菥蓂(Thlaspi arvense)、贯叶三棱(Tripleurospermumperforatum)(＝T.inodorum)、类黍尾稃草(Urochloa panicoides)、车前叶臂形草(Urochloa plantaginea)(＝巴拉草(Brachiaria plantaginea))、欧荨麻(Urticaurens)、麦蓝菜(Vaccaria hispanica)、箭筈豌豆(Vicia sativa)、欧洲福克斯泰尔羊茅(Vulpia bromoides)、苍耳(Xanthium strumarium)、黄鹌菜(Youngia japonica)。
在一个优选的实施方案中，所述双转运肽来自苋属或来自看麦娘属。
可以考虑来自其他植物物种的与苋属或看麦娘属的PPO-2双转运肽具有一定程度的同源性的其他多肽、其他PPO-2或PPO-2样多肽的双转运肽是有用的，并因此包括在本发明中。
因此，在另一优选的实施方案中，所述双转运肽包含SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98的氨基酸序列、或其变体或片段。
“片段”意指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分，和因此由其编码的蛋白质。多核苷酸的片段可以编码保留双转运肽活性的蛋白质片段，并因此能够促进目的多肽转运到植物的叶绿体和/或线粒体中。备选地，可用作杂交探针的多核苷酸的片段通常不编码保留生物学活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可以为至少约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170个核苷酸或多达全长的双转运肽。编码双转运肽的生物学活性部分的多核苷酸的片段将编码存在于任一SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97或98中的至少10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,60,65,70,75,80,85个连续的氨基酸、或多达氨基酸的总数。
就序列(例如多肽或核酸序列，诸如本发明的转录调节性核苷酸序列)而言，术语“变体”旨在表示基本上相似的序列。对于包含可读框的核苷酸序列，变体包括由于遗传密码简并性而编码天然蛋白质的相同氨基酸序列的那些序列。诸如这些变体的天然存在的等位基因变体可使用熟知分子生物学技术，例如用聚合酶链反应(PCR)及杂交技术来鉴别。变体核苷酸序列亦包括源自合成的核苷酸序列，例如通过使用定点诱变所生成的核苷酸序列，以及针对可读框，编码天然蛋白质的序列、和编码相对于天然蛋白质具有氨基酸替换的多肽(例如，本文公开的本发明的嵌合多肽)的那些核苷酸序列。
一般而言，本发明的核苷酸序列变体将与SEQ ID NO:99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、135、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、587、588、589或591中所示的核苷酸序列具有至少30、40、50、60至70％，例如优选地71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，一般而言至少80％，例如81％-84％、至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％及99％的核苷酸“序列同一性”。多核苷酸的％同一性通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)(其中缺口产生罚分＝5以及缺口延伸罚分＝0.3)来确定。除非另外说明，查询序列长度为至少45个核苷酸，且GAP分析在至少45个核苷酸区域上比对两条序列。优选地，查询序列是至少150个核苷酸长，且GAP分析在至少150个核苷酸的区域上比对两条序列。更优选地，查询序列是至少300个核苷酸长，且GAP分析在至少300个核苷酸的区域上比对两条序列。甚至更优选地，GAP分析在它们的全长上比对两条序列。
此外，本发明的核苷酸序列变体将与编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97或98的双转运肽的核苷酸序列具有至少30、40、50、60至70％，例如优选地71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，一般而言至少80％，例如81％-84％、至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％及99％的核苷酸“序列同一性”。多核苷酸的％同一性通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)(其中缺口产生罚分＝5以及缺口延伸罚分＝0.3)来确定。除非另外说明，查询序列长度为至少45个核苷酸，且GAP分析在至少45个核苷酸区域上比对两条序列。优选地，查询序列是至少150个核苷酸长，且GAP分析在至少150个核苷酸的区域上比对两条序列。更优选地，查询序列是至少300个核苷酸长，且GAP分析在至少300个核苷酸的区域上比对两条序列。甚至更优选地，GAP分析在它们的全长上比对两条序列。
对于确定的多肽而言，可以理解的是，高于上文提供的％同一性数字将涵盖优选的实施方案。因此，适用时，根据最小的％同一性数字，优选的是，本发明的PPO多肽包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534或535有至少40％、更优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％，并且甚至更优选至少99.9％同一性的氨基酸序列。
“变体”多肽意指通过在全长双转运肽的N-末端和/或C-末端缺失(所谓的截短)或添加一个或多个氨基酸；在全长双转运肽的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质中一个或多个位点处替代一个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,511,512,513,514,515,516,517,518,519,520,521,522,523,524,525,526,527,528,529,530,531,532,533,534或535的蛋白质的多肽。此类变体可以由例如遗传多态性或人工操作产生。用于这类操作的方法通常是本领域已知的。
此外，可以修饰本文公开的多种双转运肽以改善和/或改变目的多肽向叶绿体中的转运。例如，双转运肽可以含有额外的区域，所述额外的区域改变或改善与促进前体从核糖体到叶绿体表面的胞质因子的相互作用。参见，例如，Hiltbrunner等人(2001)Journalof Cell Biology 154:309-316,Jackson-Constan等人(2001)Biochimica et BiophysicaActa 1541:102-113，这两篇文献均引入本文作为参考。可使用其他区域来增加细胞器输入的效率。参见，例如，May等人(2000)Plant Cell 12:53-64,Qbadou等人(2006)EMBOJournal 25:1837-1837和Sohrt等人(2000)Journal of Cell Biology 148:1213-1221，在此引入作为参考。这类区域可以是天然的(衍生自PPO-2多肽的区域)或与有效连接的PPO-2双转运肽是异源的。确定本发明的双转运肽序列将目的蛋白质靶向叶绿体的效率的测定法是已知的。参见，例如，Mishkind等人(1985)J of Cell Biol 100:226-234，其全部内容在此引入作为参考。将报告基因如葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)或绿色荧光蛋白(GFP)有效连接至该双转运肽序列。将该融合物置于合适启动子的控制之后，连接到转化载体中，并转化到植物或植物细胞中。在足够的时间用于表达和定位到细胞器中之后，提取细胞器级分并测定报告子活性。可以将分离的序列靶向和递送报告蛋白到叶绿体和/或线粒体的能力与其他已知的双转运肽序列进行比较(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30:769-780)。也可以在体外通过向分离的叶绿体级分添加蛋白酶来验证蛋白质输入。成功输入叶绿体的蛋白质对外部添加的蛋白酶具有抗性，而保留在胞质溶胶和/或线粒体中的蛋白质易于消化。还可以通过叶绿体和/或线粒体中功能性蛋白质的存在来验证蛋白质输入，使用标准的分子技术进行检测，通过评估靶向叶绿体和/或线粒体的蛋白质的表达产生的表型，或通过显微镜进行所述验证。
本文公开的双转运肽将所需的目的蛋白质靶向到叶绿体和/或线粒体，并且可以促进蛋白质转运到所述细胞器中。这伴随着叶绿体加工蛋白酶在适当的转运肽切割位点处从成熟的多肽或蛋白质切割转运肽。因此，双转运肽还包含合适的切割位点，用于正确加工叶绿体内包含的前蛋白质成为成熟多肽。
任何目的多核苷酸(即“目的多肽”)可以与本文公开的双转运肽编码序列一起使用。此类目的多核苷酸/多肽包括但不限于除草剂耐受性编码序列、杀虫编码序列、杀线虫编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物和生物胁迫耐受编码序列或改变植物性状例如产量、谷物质量、营养含量、淀粉质量和数量、固氮和/或利用氮、油含量和/或组成的序列。本发明更具体的目的多核苷酸包括但不限于提高作物产量的基因、改善作物需求性的多肽、编码赋予非生物胁迫(例如干旱、氮、温度、盐度、毒性金属或微量元素)抗性的蛋白质的基因、或那些赋予对除虫剂和除草剂等毒素的抗性的蛋白质的基因、或编码赋予生物胁迫(如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的攻击、以及与这些生物有关的疾病的发展)抗性的蛋白质的基因。已经认识到，可将任何目的多肽有效连接至本发明的双转运肽编码序列，并且在植物中表达，只要由多核苷酸编码的所述多肽在叶绿体和/或线粒体中有功能。
可以有效连接至本发明双转运肽的示例性目的多核苷酸包括编码以下多肽的多核苷酸：具有杀害虫和/或杀昆虫活性的多肽，例如其他苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene 48:109)、凝集素(Van Damme等(1994)PlantMol.Biol.24:825)、pentin(描述于美国专利号5,981,722)等；对于疾病或除草剂抗性而言期望的性状(例如，腐马素(fumonisin)脱毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒(avirulence)和疾病抗性基因(Jones等(1994)Science266:789；Martin等,(1993)Science262:1432；Mindrinos等(1994)Cell78:1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；草甘膦(glyphosate)抗性(例如，5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因，描述于美国专利号4,940,935和5,188,642；或草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)基因，描述于Castle等(2004)Science,304:1151-1154；以及美国专利申请公布号20070004912，20050246798，和20050060767))；草铵膦(glufosinate)抗性(例如，膦丝菌素(phosphinothricin)乙酰转移酶基因PAT和BAR，描述于美国专利号5,561,236和5,276,268)；对除草剂(包括磺酰脲、DHT(2,4D)和PPO除草剂)的抗性(例如，草甘膦乙酰转移酶、芳氧基链烷酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶和原卟啉原氧化酶)；赋予对除草剂例如HPPD除草剂的耐受性或抗性的细胞色素P450或其变体(美国专利申请系列号12/156,247；美国专利号6,380,465；6,121,512；5,349,127；6,649,814；和6,300,544；以及PCT专利申请公布号WO2007000077)；以及对于加工或工艺产品而言期望的性状，例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；改性油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱分支酶(SDBE))；以及聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5,602,321；β-酮硫解酶，多羟基丁酸合酶，和乙酰乙酰-CoA还原酶(Schubert等(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847)利于多羟基链烷酸(PHAs)的表达)；上述公开特此并入此处作为参考。
在一个优选的实施方案中，所述异源目的多肽是一种多肽，其当在植物中过量表达时，赋予所述植物除草剂耐受性。“除草剂抗性蛋白”或来自由“编码除草剂抗性的核酸分子”表达的蛋白质包括赋予细胞比不表达该蛋白质的细胞耐受更高浓度的除草剂的能力的蛋白质，或者比不表达该蛋白质的细胞更长时间地耐受某浓度的除草剂。除草剂抗性性状可以通过将编码抗除草剂的基因引入植物中，所述基因起到抑制以下酶的作用：原卟啉原氧化酶(PPO)、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦乙酰转移酶(GAT)、细胞色素P450单加氧酶、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)、乙酰羟酸合酶(AHAS；EC4.1.3.18，亦称为乙酰乳酸合酶或ALS)、羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、八氢蕃茄红素去饱和酶(PD)、及麦草畏(dicamba)降解酶，如WO02/068607中所公开，或如WO2008141154或WO 2005107437中公开的苯氧基乙酸-和苯氧基丙酸-衍生物降解酶。
在一个特别优选的实施方案中，可以有效连接至本发明双转运肽的所述目的多肽具有PPO活性并对PPO抑制性除草剂赋予耐受性。原卟啉原氧化酶(在本文中通常称为PPO；EC:1.3.3.4)是原卟啉IX生物合成中的关键酶，自20世纪60年代以来己用于选择性杂草控制。PPO催化叶绿素和血红素生物合成中最后的共同步骤，所述步骤将原卟啉原IX氧化成原卟啉IX(Matringe等，1989.Biochem.1.260:231)。
WO2012/080975、WO2013/189984、WO2015/022636、WO2015/022640、WO2015/022639和WO2015/092706中公开了本发明所涵盖的目的PPO多肽的直向同源序列，其内容在此全部引入作为参考。
“直向同源物”是指来自不同生物的基因，这些基因来自物种形成，并且也可以衍生自共同的祖先基因。本领域众所周知，旁系同源物和直向同源物在给定位点处可共有具有适合氨基酸残基的独特结构域，诸如用于特定底物的结合袋、或用于与其它蛋白质相互作用的结合基序。
在一个优选的实施方案中，具有PPO活性的所述异源目的多肽来自原核生物，优选地来自细菌。
更优选地，原核生物优选地为细菌，为属于选自埃希氏菌属、红嗜热盐菌属、丰祐菌属、绿屈挠菌属、不动杆菌属和芽孢杆菌属的细菌。
在一个特别优选的实施方案中，具有PPO活性的所述多肽包含SEQ ID NO:137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,511,512,513,514,515,516,517,518,519,520,521,522,523,524,525,526,527,528,529,530,531,532,533,534,535的序列、或其变体或片段。
在描述本发明的双转运肽的上下文中给予SUPRA的“变体”和“片段”的定义同样适用于所述目的PPO多肽。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的嵌合核酸分子包含编码SEQ ID NO:112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,136,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623或624所示的多肽的核酸序列、或其活性变体和片段。
本发明的重组嵌合核酸分子提供在表达盒中，用于在目的植物中表达。
因此，在另一方面，本发明涉及包含有效连接至驱动植物中表达的启动子的本发明核酸分子的表达盒。
所述盒将包括有效连接于本发明的嵌合核酸分子的调控序列。如本文所用的术语“调控元件”指，能够调控有效连接的多核苷酸的转录的多核苷酸。它包括但不限于启动子、增强子、内含子、5'UTR及3'UTR。“有效连接”是指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始且介导对应于该第二序列的DNA序列转录。一般而言，有效连接意指所连接的核酸序列为毗邻的，以及当需要连接两个蛋白质编码区时，为毗邻且在同一阅读框中的。所述盒可额外地含有至少一种待共转化入生物中的额外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供额外的基因。提供带多个限制性位点的此表达盒，所述限制性位点可以用于将嵌合核酸分子插在调控区的转录调控下。表达盒可额外地含有可选择标记基因。
本发明的表达盒可以以5'-3'转录方向包括在植物中具有功能的转录及翻译起始区(即启动子)、本发明的嵌合核酸分子、及转录和翻译终止区(即终止区)。对于植物宿主和/或本发明的嵌合核酸分子而言，启动子可为天然的或类似的、或外源的或异源的。另外，启动子可为天然序列或备选地为合成序列。当启动子对于植物宿主而言为“外源”或“异源”的时，其意指启动子不存在于该启动子所引入的天然植物中。当启动子对于本发明的嵌合核酸分子而言为“外源”或“异源”的时，其意指启动子对于有效连接的本发明嵌合核酸分子而言不是天然的或不是天然存在的启动子。如本文所用，嵌合基因包含有效连接于转录起始区的编码序列，所述转录起始区对编码序列而言是异源的。
尽管可能优选使用异源启动子表达本发明的嵌合核酸分子，但可以使用天然启动子序列。此构建体会改变植物或植物细胞中编码的目的多肽的表达水平。由此，改变该植物或植物细胞的表型。
终止区可以就转录起始区而言是天然的，可以就有效连接的目的序列而言是天然的，可以就植物宿主而言是天然的，或可以源于另一来源(即对于启动子、目的嵌合核酸分子、植物宿主、或其任何组合而言为外源或异源的)。合适的终止区可从根癌农杆菌的Ti质粒获得，诸如章鱼碱合酶及胭脂碱合酶终止区。亦参见Guerineau等(1991)MoI.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe等(1990)Gene91:151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；和Joshi等(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。适当时，可对(一个或多个)基因进行优化以增加其在经转化的植物中的表达。即，可使用植物偏好的密码子来合成基因，以改进表达。关于宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11。本领域中可获得用于合成植物偏好的基因的方法。参见例如美国专利号5,380,831,和5,436,391,以及Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498，以引用的方式并入本文中作为参考。
己知其它序列修饰可增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括：消除假的多聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的编码序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其它经充分表征的序列。可将序列的G-C含量调整至通过参考宿主细胞中表达的已知基因而计算出的该给定细胞宿主的平均水平。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。用于增强基因表达的核苷酸序列亦可用于植物表达载体中。它们包括玉米Adhl、intronl基因的内含子(Callis等，Genes and Development 1:1183-1200,1987)、及来自烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic virus)(TMV)、玉米褪绿斑驳病毒(MaizeChlorotic Mottle Virus)及苜蓿花叶病毒(Alfalfa Mosaic Virus)的前导序列(W-序列)(Gallie等，Nucleic Acid Res.15:8693-8711,1987和Skuzeski等，Plant MoI.Biol.15:65-79,1990)。己证实来自玉米的shrunken-1基因座的第一内含子可增加嵌合基因构建体中基因的表达。美国专利号5,424,412和5,593,874公开了特定内含子在基因表达构建体中的用途，且Gallie等(Plant Physiol.106:929-939,1994)也己经证明内含子可以用于在组织特异的基础上调控基因表达。为了进一步增强或优化嵌合核酸分子基因表达，本发明的植物表达载体也可含有包含基质附着区(MAR)的DNA序列。然后，用此经修饰的表达系统转化的植物细胞可表现出本发明核苷酸序列的过量表达或组成性表达。
本发明的表达盒可另外在表达盒构建体中包含5'前导序列。此前导序列可起增强翻译的作用。翻译前导序列为本领域所知并且包括：细小核糖核酸病毒(picornavirus)前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5'非编码区)(Elroy-Stein等，(1989)Proc.Natl.Acad.ScL USA 86:6126-6130)；马铃薯Y病毒(potyvirus)前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒(Tobacco Etch Virus))(Gallie等，(1995)Gene 165(2):233-238)、MDMV前导序列(玉米矮化花叶病毒(Maize Dwarf Mosaic Virus))(Virology 154:9-20)、及人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等，(1991)Nature 353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA4)(Jobling等，(1987)Nature 325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等(1989)，于Molecular Biology of RNA,Cech编辑(Liss,New York),第237-256页)；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等，(1991)Virology 81:382-385)。也见Della-Cioppa等(1987)PlantPhysiol.84:965-968。还可以利用已知可增强翻译的其它方法，例如内含子等。
在制备表达盒时，可操作多种DNA片段，以提供处于正确方向及合适地处于正确阅读框中的DNA序列。为此目的，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可涉及其它操作以提供方便的限制性位点、移除多余DNA、移除限制性位点等。出于此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再替换，例如转换和颠换。
许多启动子可用于实施本发明。可基于所需结果，选择启动子。核酸可与组成性、组织偏好性或其它启动子组合用于在植物中的表达。此类组成性启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子及公开于W099/43838和美国专利号6,072,050中的其它组成性启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等，(1985)Nature 313:810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等，(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素(Christensen等，(1989)Plant MoI.Biol.12:619-632及Christensen等，(1992)Plant MoI.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等，(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等，(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成性启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；及6,177,611中所述的。
组织偏好性启动子可用于靶向增强特定植物组织内的嵌合多肽表达。此类组织偏好性启动子包括但不限于叶偏好性启动子、根偏好性启动子、种子偏好性启动子及茎偏好性启动子。组织偏好性启动子包括Yamamoto等，(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等，(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等，(1997)MoI.Gen Genet.254(3):337-343；Russell等，(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等，(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp等，(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等，(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等，(1994)Plant CellPhysiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco等，(1993)Plant MoI Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka e/[alpha]/.(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia等，(1993)Plant J.4(3):495-505。必要时，此类启动子可经修饰用于弱表达。
用于叶绿体转化的方法为本领域已知。参见例如Svab等，(1990)Proc.Natl.Acad.ScL USA 87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。所述方法依赖于粒子枪递送含有可选择标记物的DNA和经同源重组使DNA靶向质体基因组。另外，可通过组织偏好性地表达核编码的质体导向的RNA聚合酶，通过反式激活沉默的质体携带的转基因，实现质体转化。此类系统己报导于McBride等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305中。为在叶绿体中表达，可以对待靶向叶绿体的目的核酸加以优化，以解决植物细胞核与该细胞器之间的密码子使用差异。以这种方式，可使用叶绿体偏好性密码子合成目的核酸。参见例如美国专利号5,380,831，其以引用的方式并入本文中作为参考。
本发明的表达盒可包括用于选择经转化的细胞的另一可选择标记基因。可选择标记基因，包括本发明的那些，可以用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)及潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物(诸如草胺磷(glufosinate ammonium)、溴苯腈(bromoxynil)、咪唑啉酮类(imidazolinones)、及2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-滴))的抗性的基因。一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christophers on等，(1992)Proc.Natl.Acad.ScL USA 89:6314-6318；Yao等，(1992)Cell 71:63-72；Reznikoff(1992)MoI Microbiol 6:2419-2422；Barkley等，(1980)于The Operon,第177-220页中；Hu等，(1987)Cell 48:555-566；Brown等，(1987)Cell 49:603-612；Figge等，(1988)Cell 52:713-722；Deuschle等，(1989)Proc.Natl Acad.AcL USA 86:5400-5404；Fuerst等，(1989)Proc.Natl Acad.ScL USA 86:2549-2553；Deuschle等，(1990)Science 248:480-483；Gossen(1993)博士论文,University of Heidelberg；Reines等，(1993)Proc.NatlAcad.ScL USA 90:1917-1921；Labow等，(1990)MoI Cell Biol 10:3343-3356；Zambretti等，(1992)Proc.Natl Acad.ScL USA 89:3952-3956；Bairn等，(1991)Proc.Natl Acad.ScLUSA 88:5072-5076；Wyborski等，(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics MoI Struc.Biol 10:143-162；Degenkolb等，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595；Kleinschnidt等，(1988)Biochemistry27:1094-1104；Bonin(1993)博士论文,University of Heidelberg；Gossen等，(1992)Proc.Natl Acad.ScL USA 89:5547-5551；Oliva等，(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919；Hlavka等，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology,第78卷(Springer-Verlag,Berlin)；Gill等，(1988)Nature 334:721-724。这些公开内容以引用的方式并入本文中作为参考。可选择标记基因的以上列表不意在构成限制。任何可选择标记基因均可用于本发明中。
本发明还提供包含含有如上所述嵌合多肽核酸的表达盒的经分离的重组表达载体，其中载体在宿主细胞中的表达导致，较之宿主细胞的野生型品种，对PPO抑制性除草剂的增加的耐受性。如本文所用，术语“载体”指能够转运己经与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其指其中可连接额外的DNA片段的环状双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中额外的DNA片段可连接至病毒基因组中。某些载体能够在引入所述载体的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合于该宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”与“载体”可互换使用，因为质粒为最常用形式的载体。然而，本发明旨在包括起等价功能的其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体以适于在宿主细胞中表达核酸的形式包含本发明的核酸，这意指重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞而选择的一种或多种调控序列，其有效连接于待表达的核酸序列上。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成性表达的那些调控序列、及指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些调控序列。本领域技术人员将理解的是，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需要的多肽的表达水平等因素。可将本发明的表达载体引入宿主细胞中以由此生产由本文所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或肽(例如，嵌合多肽、融合多肽等)。
在本发明的一个优选的实施方案中，嵌合多肽在植物和植物细胞(诸如单细胞植物细胞(诸如藻类)(见Falciatore等,1999,Marine Biotechnology 1(3):239-251及其中的参考文献)及高等植物的植物细胞(例如种子植物，诸如作物植物)中表达。可通过任何手段将嵌合多核苷酸“引入”植物细胞中，所述手段包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染、生物射弹等。
适用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的方法可见于Sambrook等，(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)及其它实验室手册，诸如Methods in Molecular Biology,1995,第44卷，Agrobacterium protocols,编辑：Gartland和Davey,Humana Press,Totowa,New Jersey。由于增加的PPO抑制性除草剂耐受性是希望遗传进入广泛多种植物(如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽油菜及卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵及万寿菊、茄科植物(如马铃薯、烟草、茄子及蕃茄)、野豌豆属物种(Vicia species)、豌豆、紫花苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属物种(Salix species)、乔木(油棕、椰子)、多年生草本植物及饲料作物)中的一般性状，所以这些作物植物也是遗传工程改造的优选靶植物，构成本发明的另一实施方案。在优选的实施方案中，植物为作物植物。饲料作物包括但不限于小麦草(Wheatgrass)、金丝雀虉草(Canarygrass)、无芒雀麦(Bromegrass)、Wildrye Grass、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅(Orchardgrass)、苜蓿(Alfalfa)、Salfoin、百脉根(Birdsfoot Trefoil)、杂种车轴草(Alsike Clover)、红花苜蓿(Red Clover)及草木樨(Sweet Clover)。
在本发明一个实施方案中，通过农杆菌介导的基因转移，将嵌合多核苷酸转染到植物中。本领域技术人员已知的一种转化方法为：将开花植物浸入农杆菌溶液中，其中该农杆菌含有嵌合多肽核酸，随后对经转化的配子进行育种。可使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell,1986,Mol.Gen.Genet.204:383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株，进行农杆菌介导的植物转化。可通过标准的转化及再生技术进行转化(Deblaere等，1994,Nucl.Acids.Res.13:4777-4788；Gelvin,Stanton B.和Schilperoort,Robert A,PlantMolecular Biology Manual,第2版，Dordrecht:Kluwer Academic Publ.,1995.-inSect.,Ringbuc Zentrale Signatur:BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick,Bernard R.和Thompson,John E.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,BocaRaton:CRC Press,1993 360S.,ISBN 0-8493-5164-2)。例如，油菜籽油菜可经由子叶或下胚轴转化而加以转化(Moloney等，1989,Plant Cell Report 8:238-242；De Block等，1989,Plant Physiol.91:694-701)。用于农杆菌及植物选择的抗生素的使用取决于用于转化的二元载体和农杆菌菌株。油菜籽油菜选择通常使用卡那霉素作为可选择植物标记物来进行。可使用例如由Mlynarova等，1994,Plant Cell Report 13:282-285所述的技术，对亚麻进行农杆菌介导的基因转移。此外，可使用例如欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中所述的技术，进行大豆的转化。可通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取，或经由碳化硅纤维技术，实现玉米转化。(参见例如Freeling和Walbot“The maize handbook”Springer Verlag:New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)。玉米转化的一个具体实例见于美国专利号5,990,387中，小麦转化的一个具体实例见于PCT申请号WO 93/07256中。
根据本发明，若引入的嵌合多核苷酸掺入到非染色体自主复制子中或整合到植物染色体中，则其可稳定地维持于植物细胞中。备选地，引入的嵌合多核苷酸可存在于染色体外非复制性载体上，且瞬时表达或具有瞬时活性。
在同源重组载体中，嵌合多核苷酸在其5’及3’末端可以侧接额外的核酸分子，以允许在载体携带的外源性嵌合多核苷酸与微生物或植物中的内源性基因之间发生同源重组。该额外的侧翼嵌合核酸分子的长度足以导致与内源性基因成功地同源重组。典型地，在载体中包括数百碱基对至多达数千碱基对的侧翼DNA(在5'和3'端)(同源重组载体的描述参见例如Thomas,K.R.,和Capecchi,M.R.,1987,Cell 51:503；或展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)中基于cDNA的重组参见Strepp等，1998,PNAS,95(8):4368-4373)。然而，因为嵌合多核苷酸通常与PPO基因在极少氨基酸处不同，所以侧翼序列并非是始终需要的。将同源重组载体引入微生物或植物细胞中(例如经由聚乙二醇介导的DNA引入)，并使用本领域已知的技术选择其中引入的嵌合多核苷酸己与内源基因同源重组的细胞。
在另一实施方案中，可产生含有选择的系统的重组微生物，所述系统允许所引入的基因的受调控的表达。例如，在载体上包括嵌合多核苷酸且将该基因置于lac操纵子控制下，可以允许嵌合多核苷酸仅在IPTG存在下表达。此类调控系统为本领域所熟知。
本发明的另一方面涉及宿主细胞，其中己引入本发明的重组表达载体。术语“宿主细胞”及“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解的是，此术语不仅指特定的主题细胞，也适用于此类细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而出现在后继世代中，所以此子代实际上可能不与亲本细胞完全相同，但其仍然包括在如本文中所使用的术语的范畴内。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。例如，嵌合多核苷酸可表达于细菌细胞(诸如谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum))、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其它微生物如谷氨酸棒状杆菌中。其它适合的宿主细胞为本领域技术人员所知。
本发明的宿主细胞(诸如培养的原核或真核宿主细胞)可用于生产(亦即表达)嵌合多核苷酸。因此，本发明还提供使用本发明宿主细胞来生产嵌合多肽的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中己引入编码嵌合多肽的重组表达载体，或其基因组中己引入编码野生型或嵌合多肽的基因)直至嵌合多肽产生。在另一个实施方案中，方法还包括从培养基或宿主细胞分离嵌合多肽。本发明的另一方面涉及经分离的嵌合多肽及其生物活性部分。当通过重组DNA技术生产时，“经分离的”或“经纯化的”多肽或其生物活性部分不含一些细胞物质，或当经化学合成时其不含化学前体或其它化学物质。措辞“基本不含细胞物质”包括嵌合多肽的制备物，其中多肽与天然或重组生产该多肽的细胞的一些细胞组分分离。在一个实施方案中，措辞“基本不含细胞物质”包括嵌合多肽的制备物，其具有少于约30％(以干重计)的非嵌合多肽物质(在本文中亦称为“污染性多肽”)、更优选少于约20％的非嵌合多肽物质、还更优选少于约10％的非嵌合多肽物质、和最优选少于约5％的非嵌合多肽物质。
当重组生产嵌合多肽或其生物活性部分时，其优选地也基本不含培养基，即培养基占少于约20％、更优选少于约10％、且最优选少于约5％的多肽制备物体积。措辞“基本不含化学前体或其它化学物质”包括嵌合多肽制备物，其中多肽与多肽合成中涉及的化学前体或其它化学物质分离。在优选的实施方案中，经分离的多肽或其生物活性部分缺乏来自嵌合多肽所源自的同一生物的污染性多肽。典型地，此类多肽通过例如在其它植物中或在微生物(诸如谷氨酸棒状杆菌、纤毛虫、藻类或真菌)中重组表达嵌合多肽来生产。
另一方面，本发明涉及包含本发明的表达盒的植物细胞。优选地，表达盒包含嵌合核酸分子，所述嵌合核酸分子包含(a)SEQ ID NO:99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111或135的序列、或其本文定义的片段或变体；b)包含a)之任一的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和c)与a)至b)之任一的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选的实施方案中，所述植物细胞的表达盒包含编码SEQ ID NO:112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,136,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623或624所示多肽的嵌合核酸分子、或其活性变体和片段。
优选地，与植物细胞的野生型物种相比，本发明的嵌合核酸分子在植物细胞中的表达导致对除草剂的抗性或耐受性增加。
另一方面，本发明涉及包含本发明植物细胞的植物或植物部分。
在具体的实施方案中，植物和/或植物部分已稳定掺入了至少一种本发明的嵌合核酸分子或其变体或片段。
因此，提供了植物、植物细胞、植物部分和种子，其包含有效连接至编码目的多肽的异源多核苷酸的至少一种含有编码双转运肽序列的多核苷酸，其中所述双转运肽包含任一SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98或其变体和片段。
还提供了包含具有SEQ ID NO:99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111或135所示序列的嵌合核酸分子的植物、植物细胞和种子。
还提供了包含嵌合核酸分子的植物、植物细胞和种子，所述嵌合核酸分子编码SEQID NO:112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,136,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623或624所示的多肽、或其活性变体和片段。
术语“植物”以其最广泛意义加以使用，其涉及有机体物质，且意欲涵盖属于植物界成员的真核生物，植物的实例包括但不限于，维管束植物、蔬菜、粮食、花卉、乔木、草本植物、灌木、草类、藤本植物、蕨类植物、苔藓、真菌及藻类等，以及用于无性繁殖的克隆(clone)、旁蘖(offset)及植物部分(例如插条(cutting)、压条(piping)、嫩枝(shoot)、根茎(rhizome)、地下茎、丛生秆(clump)、根颈(crown)、鳞茎(bulb)、球茎(corm)、块茎(tuber)、根茎、组织培养中产生的植物/组织等)。术语“植物”进一步涵盖整个植物、植物祖先及后代、以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花、小花、果实、肉茎、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、保卫细胞、及植物的任何其它己知器官、组织和细胞、以及组织和器官，其中每一以上所提及者皆包含目的基因/核酸。术语“植物”亦涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉及小孢子，同样，每一以上所提及者皆包含目的基因/核酸。
本发明的植物包括属于超家族植物界(Viridiplantae)的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或草料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，选自：槭树属(Acer spp.)、狲猴桃属(Actinidia spp.)、秋葵属(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属(Agropyron spp.)、匍匐剪股颍(Agrostis stolonifera)、葱属(Alliumspp.)、苋属(Amaranthus spp.)、固沙草(Ammophila arenaria)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、落花生属(Arachis spp)、波罗蜜属(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatuavar.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusasp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Betavulgaris)、芸苔属(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turnip rape)])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属(Carya spp.)、红花(Carthamustinctorius)、栗属(Castanea spp.)、吉贝(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属(Citrus spp.)、椰子属(Cocos spp.)、咖啡属(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可乐属(Colaspp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属(Corylus spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属(Cucurbita spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、山蚂蝗属(Desmodiumspp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属(Dioscorea spp.)、柿树属(Diospyros spp.)、稗属(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Eiaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、龙爪稷(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostistef)、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia unifora)、荞麦属(Fagopyrum spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属(Fortunella spp.)、草莓属(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycinemax)、黄豆(Soja hispida)或Soja max)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属(Lathyrusspp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、Luzulasylvatica、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersicon esculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、苹果属(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、薄荷属(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属(Momordica spp)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉属(Musa spp.)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Olea spp.)、仙人掌属(Opuntia spp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)、(例如稻(Oryzasativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、鳄梨属(Persea spp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalarisarundinacea)、菜豆属(Phaseolus spp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属(Phoenixspp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属(Physalis spp.)、松属(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属(Pisum spp.)、早熟禾属(Poa spp.)、杨属(Populusspp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、萝卜(Rapbanussativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属(Rubus spp.)、甘蔗属(Saccharum spp.)、柳属(Salix sp.)、接骨木属(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属(Sesamum spp.)、白芥属(Sinapissp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindusindica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、Triticum macha、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticummonococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vignaspp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、沼生菰(Zizaniapalustris)、枣属(Ziziphus spp.)、苋(amaranth)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、西兰花(broccoli)、球芽甘蓝(Brussels sprouts)、卷心菜(cabbage)、卡诺拉油菜(canola)、胡萝卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘蓝(collardgreens)、亚麻(flax)、无头甘蓝(kale)、小扁豆(lentil)、油籽油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、马铃薯(potato)、稻(rice)、大豆(soybean)、草莓(strawberry)、甜菜(sugar beet)、甘蔗(sugar cane)、向日葵(sunflower)、蕃茄(tomato)、西葫芦(squash)、茶树(tea)及藻类(algae)等等。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例尤其包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜籽油菜(rapeseed)、棉花、蕃茄、马铃薯或烟草。更优选地，植物为单子叶植物，例如甘蔗。更优选地，植物为谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高梁或燕麦。
另一方面，本发明涉及衍生自本发明植物的种子。
另一方面，本发明涉及在植物中表达编码目的多肽的核酸的方法，包括(a)将本发明的核酸分子或本发明的表达盒导入植物细胞，和(b)从其再生植物，所述植物包含本发明的核酸分子或本发明的表达盒。
术语“表达”或“基因表达”意指，一个特定基因或多个特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别意指，一个基因或多个基因或遗传构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，加上或不加上mRNA随后翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录及所得mRNA产物的加工。
为了获得所需效果，即对除草剂具有耐受性或抗性的植物，应理解的是，可以通过本领域技术人员已知的方法及手段，“过量表达”至少一种核酸。
如本文所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指，超出原始野生型表达水平之外的任何表达形式。用于增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，其包括例如由适当启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可将用作启动子或增强子元件的经分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(一般为上游)，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，可通过突变、缺失和/或替换在体内改变内源性启动子(参见Kmiec,US 5,565,350；Zarling等,WO9322443)，或可将经分离的启动子以适当的方向及距本发明基因的距离引入植物细胞中，以控制基因的表达。
如果期望多肽表达，则通常期望在多核苷酸编码区的3'末端包括多聚腺苷酸化区。多聚腺苷酸化区可源于天然基因、来自多种其它植物基因、或来自T-DNA。欲添加的3'端序列可源于例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者可选地源于另一植物基因，或次优选地源于任何其它真核生物基因。
也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)。通常内含子放置在转录单位5’末端附近时，增强基因表达的作用最大。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见The Maize Handbook,第116章,Freeling和Walbot编辑,Springer,N.Y.(1994)。
本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。能够随后通过器官发生或者胚发生进行克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可用于和最适于待转化的具体物种的克隆增殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、现有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以例如作为质粒以非整合的状态维持。可选地，其可以整合入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。
外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用若干转化方法的任一种向适当的祖先细胞引入目的基因。可以利用公开的转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、或者使用病毒或花粉转化和微投射(microprojection)。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens,F.A.等,(1882)Nature 296,72-74；Negrutiu I.等,(1987)Plant Mol.Biol.8:363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等,(1985)Bio/Technol 3,1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等,(1986)Mol.Gen Genet202:179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等,(1987)Nature 327:70)；用(非整合型)病毒感染，等等。优选通过农杆菌介导的转化，产生转基因植物，包括转基因作物植物。一个有利的转化法是植物原位转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。已经证明，根据本发明尤为有利的是使转化的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent,PlantJ.(1998)16,735–743)。农杆菌介导的稻转化方法包括公知的稻转化方法，例如在任一如下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta,199:612-617,1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506,1993),Hiei等(Plant J.6(2):271-282,1994)，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50,1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1):13-22,2002)中所述，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。作为举例说明，所述方法还由B.Jenes等,Techniques for Gene Transfer,在转基因的Plants,卷1,Engineering和Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，例如模式植物，像拟南芥属植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana)在本发明范围内不视为作物植物)；或者作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤的叶子或切碎的叶子浸在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养之。通过根癌农杆菌的植物转化由例如，和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16,9877中描述，或者尤其可以参见F.F.White,Vectors for Gene Transferin Higher Plants在转基因的Plants,卷1,Engineering和Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press,1993,第15-38页。
除了转化体细胞(其之后不得不再生为完整植株)，还可以转化植物分生组织的细胞，特别是可以发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育中的植物获得种子，其中一定比例的植物被转化因而是转基因的[Feldman,KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet208:274-289；Feldmann K(1992).在C Koncz,N-H Chua和J Shell编辑Methods inArabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,第274-289页]。可选的方法基于花序的反复去除以及莲座中心切割部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5:551-558；Katavic(1994).Mol GenGenet,245:363-370)。然而，特别有效的方法是改良的真空浸润法，如“浸花法”(floraldip)。对于拟南芥的真空浸润，减压下用农杆菌悬液处理完整植株[Bechthold,N(1993).CR Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199]，而对于“浸花法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂孵育[Clough,SJ和Bent,AF(1998).The Plant J.16,735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中为母系遗传，从而降低或消除了转基因通过花粉流失的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等,2004[Nature Biotechnology 22(2),225-229]系统展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导位点特异性整合到质体基因组中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述由Bock(2001)Transgenic plastids in basic research和plantbiotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日；312(3):425-38或Maliga,P(2003)Progresstowards commercialization of plastid transformation technology.TrendsBiotechnol.21,20-28给出。最近报道了其它生物技术进步，为无标记物的质体转化体，这可通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等,2004,Nature Biotechnology 22(2),225-229)。遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者和Willmitzer的出版物。
通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，接着使转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与未转化的植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能性方案是在使用合适的选择剂的琼脂板上生长种子(酌情在灭菌后)，从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对可选择标记例如上文所述标记的存在，筛选转化的植物。
DNA转移和再生之后，还可例如用Southern分析，评价推定转化的植物，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所公知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以呈多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞已转化而含有表达盒)；转化的和非转化的组织的嫁接体(例如在植物中，转化的砧木嫁接到非转化的接穗上)。
另一方面，本发明涉及一种产生除草剂耐受性植物的方法，包括(a)将本发明的核酸分子或本发明的表达盒引入植物细胞中，和(b)从其再生植物，所述植物包含本发明的核酸分子或本发明的表达盒。
另一方面，本发明涉及一种控制植物栽培场所不希望的植被的方法，该方法包括以下步骤：
c)在该场所提供除草剂耐受性植物，所述除草剂耐受性植物包含本发明的核酸分子或本发明的表达盒；
d)向该场所应用有效量的除草剂，
其中所述除草剂的有效量不会杀死或抑制a)的除草剂耐受性植物的生长。
术语“控制不期望的植物”应理解为意指，灭杀杂草和/或否则阻滞或抑制杂草的正常生长。杂草在最广泛意义上理解，意指生长在不期望其出现的地方(例如(作物)植物栽培场所)的所有那些植物。本发明之杂草包括例如双子叶及单子叶杂草。双子叶杂草包括但不限于以下各属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、猪殃殃属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛藤菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、Emex、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛莨属(Ranunculus)及蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括但不限于以下各属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、稷属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、穇属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高梁属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristylis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、翦股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)及阿披拉草属(Apera)。此外，本发明的杂草可包括例如生长于不期望位置的作物植物。例如，若玉米植物在大豆植物田地中是不希望的，则在主要包含大豆植物的田地中的自生玉米植物可被视为杂草。
另外，在某些实施方案中，本发明的嵌合核酸分子可与目的多核苷酸序列的任何组合堆叠以产生具有所需表型的植物。例如，本发明的核酸可与任何其它编码具有杀害虫和/或杀昆虫活性的多肽的多核苷酸堆叠，所述多肽诸如苏云金芽孢杆菌毒素蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；及Geiser等人(1986)Gene 48:109中)。
例如，可以和本发明的嵌合核酸分子堆叠在一起的多核苷酸包括：编码赋予对害虫/病原体例如病毒、线虫、昆虫或真菌等的抗性的多肽的核酸。可以与本发明的核酸堆叠的示例性多核苷酸包括编码如下的多核苷酸：具有杀害虫和/或杀昆虫活性的多肽，例如其它苏云金芽孢杆菌毒蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等,(1986)Gene 48:109),凝集素(Van Damme等(1994)PlantMol.Biol.24:825),pentin(描述于美国专利号5,981,722)等；对于疾病或除草剂抗性而言期望的性状(例如，腐马素(fumonisin)脱毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒(avirulence)和疾病抗性基因(Jones等(1994)Science 266:789；Martin等,(1993)Science 262:1432；Mindrinos等(1994)Cell 78:1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；草甘膦(glyphosate)抗性(例如，5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因，描述于美国专利号4,940,935和5,188,642；或草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)基因，描述于Castle等(2004)Science,304:1151-1154；以及美国专利申请公布号20070004912,20050246798,和20050060767))；草铵膦(glufosinate)抗性(例如，膦丝菌素(phosphinothricin)乙酰转移酶基因PAT和BAR,描述于美国专利号5,561,236和5,276,268)；对除草剂，包括磺酰脲、DHT(2,4D)和PPO除草剂的抗性(例如，草甘膦乙酰转移酶、芳氧基链烷酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶和原卟啉原氧化酶)；赋予对除草剂例如HPPD除草剂的耐受性或抗性的细胞色素P450或其变体(美国专利申请系列号12/156,247；美国专利号6,380,465；6,121,512；5,349,127；6,649,814；和6,300,544；以及PCT专利申请公布号WO2007000077)；以及对于加工或工艺产品而言期望的性状，例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；改性油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase),淀粉合酶(SS),淀粉分支酶(SBE),和淀粉脱分支酶(SDBE))；以及聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5,602,321；β-酮硫解酶,多羟基丁酸合酶，和乙酰乙酰-CoA还原酶(Schubert等(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847)利于多羟基链烷酸(PHAs)的表达)；上述公开特此并入此处作为参考。
一般而言，在本文中使用的术语“除草剂”意指灭杀植物、控制或以其它方式不利地改变植物生长的活性成分。除草剂的优选量或浓度为“有效量”或“有效浓度”。“有效量”及“有效浓度”分别意指足以灭杀类似的、野生型的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长的量及浓度，但该量不会灭杀本发明的除草剂抗性植物、植物组织、植物细胞及宿主细胞、或不会同样严重地抑制其生长。典型地，除草剂的有效量为常规用于农业生产系统中灭杀目的杂草的量。此量为一般技术人员所知。当在植物的任何生长阶段或在种植或萌发前直接向植物或植物的场所施用时，用于本发明的除草剂将表现出除草活性。所观测到的效果取决于待控制的植物物种、植物生长阶段、施用参数——稀释及喷雾液滴大小、固体组分的粒子大小、使用时的环境条件、所用的具体化合物、所用的具体助剂及载体、土壤类型等、以及所施用的化学品的量。这些及其它因子可如本领域技术人员所知的加以调整以促进非选择性或选择性除草作用。一般而言，优选在萌发后对相对不成熟的不期望植被施用除草剂，以达到对杂草的最大控制。
“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”植物意指，植物对处于通常将灭杀正常或野生型植物或抑制其生长的水平的至少一种除草剂具有耐受性或抗性。“除草剂耐受性野生型或嵌合多肽蛋白”或“除草剂抗性野生型或嵌合多肽蛋白”意指，当存在至少一种己知干扰PPO活性的除草剂且该除草剂处于己知将抑制野生型嵌合多肽的PPO活性的浓度或水平时，相对于野生型嵌合多肽的PPO活性而言，此嵌合多肽显示更高PPO活性。此外，此除草剂耐受性或除草剂抗性嵌合多肽蛋白的PPO活性在本文中可称为“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”PPO活性。
一般而言，如果如本文所述的可在本发明的上下文中使用的PPO抑制性除草剂(也称作化合物A)和/或除草剂化合物B能够形成几何异构体例如E/Z异构体，则可以在本发明的组合物中使用纯异构体及其混合物两者。如果如本文所述的PPO抑制性除草剂A和/或除草剂化合物B具有一个或多个手性中心，且因而以对映异构体或非对映异构体存在，则可以在根据本发明的组合物中使用纯对映异构体和非对映异构体及其混合物两者。如果如本文所述的PPO抑制性除草剂A和/或除草剂化合物B具有可离子化官能团，则它们还可以以其农业上可接受的盐的形式使用。通常，合适的是，阳离子的盐和酸的酸加成盐，其中，其阳离子或阴离子对活性化合物的活性无副作用。优选的阳离子为碱金属的离子，优选锂、钠和钾离子，碱土金属的离子，优选钙和镁离子，以及过渡金属的离子，优选锰、铜、锌和铁的离子，进一步为铵和取代的铵，其中1个至4个氢原子被C1-C4-烷基、羟基-C1-C4-烷基、C1-C4-烷氧基-C1-C4-烷基、羟基-C1-C4-烷氧基-C1-C4-烷基、苯基或苄基替代，优选铵、甲基铵、异丙基铵、二甲基铵、二异丙基铵、三甲基铵、庚基铵、十二烷基铵、十四烷基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丁基铵、2-羟乙基铵(乙醇胺盐(olamine salt))、2-(2-羟基乙-1-氧基)乙-1-基铵(二甘醇胺盐)、二(2-羟基乙-1-基)铵(二乙醇胺盐(diolamine salte))、三(2-羟乙基)铵(三乙醇胺盐(trolamine salt))、三(2-羟丙基)铵、苄基三甲基铵、苄基三乙基铵、N,N,N-三甲基乙醇铵(胆碱盐)，此外离子，锍离子，优选三(C1-C4-烷基)锍，诸如三甲基锍和氧化锍离子，优选三(C1-C4-烷基)氧化锍离子，以及最后多元胺诸如N,N-双-(3-氨基丙基)甲基胺和二亚乙基三胺的盐。可用的酸加成盐的阴离子主要为氯离子、溴离子、氟离子、碘离子、硫酸氢根、甲基硫酸根、硫酸根、磷酸二氢根、氢磷酸根、硝酸根、碳酸氢根、碳酸根、六氟硅酸根、六氟磷酸根、苯甲酸根以及还有C1-C4-链烷酸的阴离子，优选甲酸根、乙酸根、丙酸根和丁酸根。
如本文所述的具有羧基的PPO抑制性除草剂A和/或除草剂化合物B可以以酸的形式、以上文提及的农业上适宜的盐或以农业上可接受的衍生物的形式使用，例如作为酰胺诸如单-和二-C1-C6-烷基酰胺或芳基酰胺，作为酯例如烯丙基酯、炔丙基酯、C1-C10-烷基酯、烷氧基烷基酯、tefuryl((四氢呋喃-2-基)甲基)酯，以及还可以作为硫酯例如C1-C10-烷基硫酯。优选的单-和二-C1-C6-烷基酰胺为甲基和二甲基酰胺。优选的芳基酰胺为，例如N-酰苯胺(anilide)和2-氯N-酰苯胺(2-chloroanilide)。优选的烷基酯为例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、mexyl(1-甲基己基)、meptyl(1-甲基庚基)、庚基、辛基或异辛基(2-乙基己基)酯。优选的C1-C4-烷氧基-C1-C4-烷基酯为直链或支链C1-C4-烷氧基乙酯，例如2-甲氧基乙酯、2-乙氧基乙酯、2-丁氧基乙基(butotyl)酯、2-丁氧基丙酯或3-丁氧基丙酯。直链或支链C1-C10-烷基硫酯的实例为乙基硫酯。
可根据本发明使用的PPO抑制性除草剂的实例为氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、aclonifen、唑啶炔草(azafenidin)、bencarbazone、双苯嘧草酮(benzfendizone)、治草醚(bifenox)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟酮唑草(carfentrazone)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、氯硝醚(chlomethoxyfen)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、异丙吡草酯(fluazolate)、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)、酰亚胺苯氧乙酸(flumiclorac)、酰亚胺苯氧乙酸戊酯(flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、达草氟(fluthiacet)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、草灵(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、戊唑草(pentoxazone)、氟唑草胺(profluazol)、双唑草腈(pyraclonil)、氟唑草酯(pyraflufen)、氟唑草酯(pyraflufen-ethyl)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、噻二唑胺(thidiazimin)、tiafenacil、草枯醚(chlornitrofen)、炔草胺(flumipropyn)、氯草醚(fluoronitrofen)、flupropacil、氟呋草醚(furyloxyfen)、硝氟草醚(nitrofluorfen)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS353292-31-6；S-3100)、N-乙基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452098-92-9)、N-四氢糠基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452099-05-7)、N-四氢糠基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452100-03-7)、3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪烷-2,4-二酮(CAS 451484-50-7)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)、2-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-4,5,6,7-四氢-异吲哚-1,3-二酮(CAS 1300118-96-0)、1-甲基-6-三氟甲基-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮、(E)-4-[2-氯-5-[4-氯-5-(二氟甲氧基)-1H-甲基-吡唑-3-基]-4-氟-苯氧基]-3-甲氧基-丁-2-烯酸甲酯[CAS 948893-00-3]、3-[7-氯-5-氟-2-(三氟甲基)-1H-苯并咪唑-4-基]-1-甲基-6-(三氟甲基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(CAS 212754-02-4)，和
式III的尿嘧啶
其中
R30和R31彼此独立地为F、Cl或CN；
R32为O或S；
R33为H、F、Cl、CH3或OCH3；
R34为CH或N；
R35为O或S；
R36为H、CN、CH3、CF3、OCH3、OC2H5、SCH3、SC2H5、(CO)OC2H5或CH2R38，
其中R38为F、Cl、OCH3、SCH3、SC2H5、CH2F、CH2Br或CH2OH；且R37为(C1-C6-烷基)氨基、(C1-C6-二烷基)氨基、(NH)OR39、OH、OR40或SR40
其中R39为CH3、C2H5或苯基；且
R40彼此独立地为C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C3-C6-炔基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C2-C6-氰基烷基、C1-C4-烷氧基-羰基-C1-C4-烷基、C1-C4-烷基-羰基-氨基、C1-C6-烷基亚磺酰基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷基-磺酰基-C1-C6-烷基、C1-C6-二烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷基-羰基氧基-C1-C6-烷基、苯基-羰基-C1-C6-烷基、三(C1-C3-烷基)-甲硅烷基-C1-C6-烷基、三(C1-C3-烷基)-甲硅烷基-C1-C6-烯基、三(C1-C3-烷基)-甲硅烷基-C1-C6-炔基、三(C1-C3-烷基)-甲硅烷基-C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、二甲氨基、四氢吡喃基、四氢呋喃基-C1-C3-烷基、苯基-C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、苯基-C1-C3-烷基、吡啶基-C1-C3-烷基、吡啶基、苯基，
所述吡啶基和苯基彼此独立地被1个至5个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、C1-C3-烷基或C1-C2-卤代烷基；
C3-C6-环烷基或C3-C6-环烷基-C1-C4-烷基、
所述环烷基彼此独立地是未取代的或被1个至5个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、C1-C3-烷基和C1-C2-卤代烷基；
包括它们的农业上可接受的碱金属盐或铵盐。
优选的可根据本发明使用的PPO抑制性除草剂为：氟锁草醚(Acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、唑啶炔草(azafenidin)、bencarbazone、双苯嘧草酮(benzfendizone)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)、酰亚胺苯氧乙酸戊酯(flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、草灵(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、戊唑草(pentoxazone)、氟唑草酯(pyraflufen-ethyl)、苯嘧磺草胺(saflufenacil)、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS353292-31-6；S-3100)、N-乙基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452098-92-9)、N-四氢糠基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452099-05-7)、N-四氢糠基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452100-03-7)、3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪烷-2,4-二酮(CAS 451484-50-7)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)、2-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-4,5,6,7-四氢-异吲哚-1,3-二酮(CAS 1300118-96-0)、1-甲基-6-三氟甲基-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(CAS 1304113-05-0)、3-[7-氯-5-氟-2-(三氟甲基)-1H-苯并咪唑-4-基]-1-甲基-6-(三氟甲基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(CAS 212754-02-4)，
式III.1的尿嘧啶(对应于式III的尿嘧啶，其中R30为F，R31为Cl，R32为O；R33为H；R34为CH；R35为O且R37为OR40)
其中
R36为OCH3、OC2H5、SCH3或SC2H5；
且
R40为C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C3-C6-炔基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C3-氰基烷基、苯基-C1-C3-烷基、吡啶基-C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基或C3-C6-环烷基-C1-C4-烷基，
所述环烷基未被取代或被1个至5个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、C1-C3-烷基和C1-C2-卤代烷基；
和
式III.2的尿嘧啶(对应于式III的尿嘧啶，其中R30为F；R31为Cl；R32为O；R33为H；R34为N；R35为O且R37为OR40，其中R40为C1-C6-烷基)
特别优选的可根据本发明使用的PPO抑制性除草剂为：氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪烷-2,4-二酮(CAS 451484-50-7)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4＝trifludimoxazin)、和2-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-4,5,6,7-四氢-异吲哚-1,3-二酮(CAS 1300118-96-0)、1-甲基-6-三氟甲基-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(CAS 1304113-05-0)，
式III.1.1的尿嘧啶(对应于式III的尿嘧啶，其中R30为F，R31为Cl，R32为O；R33为H；R34为CH；R35为O，R36为OCH3且R37为OR40)
其中
R40为C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C3-C6-炔基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C3-氰基烷基、苯基-C1-C3-烷基、吡啶基-C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基或C3-C6-环烷基-C1-C4-烷基、所述环烷基未被取代或被1个至5个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、C1-C3-烷基和C1-C2-卤代烷基；
优选为CH3、CH2CH2OC2H5、CH2CHF2、环己基、(1-甲基环丙基)甲基或CH2(吡啶-4-基)；
式III.2.1的尿嘧啶(对应于式III的尿嘧啶，其中R30为F；R31为Cl；R32为O；R33为H；R34为N；R35为O且R37为OR40，其中R40为CH3)
和
式III.2.2的尿嘧啶(对应于式III的尿嘧啶，其中R30为F；R31为Cl；R32为O；R33为H；R34为N；R35为O且R37为OR40，其中R40为C2H5)
尤其优选的PPO抑制性除草剂为下面表A中列出的PPO抑制性除草剂A.1至A.15：
表A
上文所述的可用于实施本发明的PPO抑制性除草剂常常最好与一种或多种其它除草剂联合应用以获得对更广谱的不期望植物的控制。例如，PPO抑制性除草剂还可以与其他除草剂联合使用，其中针对该其他除草剂，作物植物天然具有耐受性、或经由表达一个或多个其它转基因而对其具有抗性(如前所述)、或经由诱变和育种方法而对其具有抗性(如下文描述)。当与其它靶向除草剂联合使用时，PPO抑制剂除草剂(本发明植物对其已经具备抗性或耐受性)可与其它一种或多种除草剂一起配制，与其它一种或多种除草剂罐混，或与其它一种或多种除草剂顺序应用。
适用于混合物的组分可以例如，选自类别b1)至b15)的除草剂
B)b1)-b15)类除草剂：
b1)脂质生物合成抑制剂；
b2)乙酰乳酸合酶抑制剂(ALS抑制剂)；
b3)光合作用抑制剂；
b4)原卟啉原-IX氧化酶抑制剂，
b5)漂白除草剂；
b6)烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶抑制剂(EPSP抑制剂)；
b7)谷氨酰胺合成酶抑制剂；
b8)7,8-二氢蝶酸合酶抑制剂(DHP抑制剂)；
b9)有丝分裂抑制剂；
b10)非常长链脂肪酸合成抑制剂(VLCFA抑制剂)；
b11)纤维素生物合成抑制剂；
b12)去偶除草剂(decoupler herbicides)；
b13)生长素除草剂(auxinic herbicides)；
b14)生长素转运抑制剂；和
b15)选自溴丁酰草胺(bromobutide)、氯甲丹(chlorflurenol)、氯甲丹(chlorflurenol-methyl)、环庚草醚(cinmethylin)、苄草隆(cumyluron)、茅草枯(dalapon)、棉隆(dazomet)、苯敌快(difenzoquat)、苯敌快(difenzoquat-metilsulfate)、噻节因(dimethipin)、甲胂钠(DSMA)、香草隆(dymron)、敌草腈(endothal)及其盐、乙苯酰草(etobenzanid)、氟燕灵(flamprop)、氟燕灵(flamprop-isopropyl)、甲氟燕灵(flamprop-methyl)、强氟燕灵(flamprop-M-isopropyl)、麦草伏(flamprop-M-methyl)、抑草丁(flurenol)、抑草丁(flurenol-butyl)、调嘧醇(flurprimidol)、膦铵素(fosamine)、膦铵素(fosamine-ammonium)、茚草酮(indanofan)、indaziflam、抑芽丹(maleichydrazide)、氟草磺(mefluidide)、威百亩(metam)、methiozolin(CAS 403640-27-7)、叠氮甲烷(methyl azide)、溴甲烷(methyl bromide)、苯丙隆(methyl-dymron)、碘甲烷(methyliodide)、甲胂一钠(MSMA)、油酸(oleic acid)、氯嗪草(oxaziclomefone)、壬酸(pelargonic acid)、稗草畏(pyributicarb)、灭藻醌(quinoclamine)、苯氧丙胺津(triaziflam)、灭草环(tridiphane)和6-氯-3-(2-环丙基-6-甲基苯氧基)-4-哒嗪醇(CAS499223-49-3)及其盐和酯的其它除草剂；
包括它们农业可接受的盐或衍生物。
可以与根据本发明的PPO抑制性除草剂组合的除草剂B的实例是：
b1)来自脂质生物合成抑制剂组：
ACC除草剂类，如枯杀达(alloxydim)、枯杀达(alloxydim-sodium)、丁氧环酮(butroxydim)、烯草酮(clethodim)、炔草酯(clodinafop)、炔草酯(clodinafop-propargyl)、噻草酮(cycloxydim)、氰氟草酯(cyhalofop)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、氯甲草(diclofop)、禾草灵(diclofop-methyl)、唑禾草灵(fenoxaprop)、唑禾草灵(fenoxaprop-ethyl)、高唑禾草灵(fenoxaprop-P)、高唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)、吡氟禾草灵(fluazifop)、吡氟禾草灵(fluazifop-butyl)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P-butyl)、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、吡氟氯禾灵(haloxyfop-methyl)、精吡氟氯禾灵(haloxyfop-P)、精吡氟氯禾灵(haloxyfop-P-methyl)、唑酰草胺(metamifop)、唑啉草酯(pinoxaden)、环苯草酮(profoxydim)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾灵(quizalofop)、喹禾灵(quizalofop-ethyl)、喹禾灵(四氢糠基酯)(quizalofop-tefuryl)、精喹禾灵(quizalofop-P)、精喹禾灵(quizalofop-P-ethyl)、精喹禾灵(四氢糠基酯)(quizalofop-P-tefuryl)、稀禾定(sethoxydim)、醌肟草(tepraloxydim)、肟草酮(tralkoxydim)、4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟基-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS 1312337-72-6)；4-(2',4'-二氯-4-环丙基[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟基-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS 1312337-45-3)；4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟基-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS 1033757-93-5)；4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3,5(4H,6H)-二酮(CAS 1312340-84-3)；5-(乙酰基氧基)-4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS 1312337-48-6)；5-(乙酰基氧基)-4-(2′,4'-二氯-4-环丙基-[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮；5-(乙酰基氧基)-4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS 1312340-82-1)；5-(乙酰基氧基)-4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS 1033760-55-2)；4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS 1312337-51-1)；4-(2′,4'-二氯-4-环丙基-[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯；4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS 1312340-83-2)；4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS 1033760-58-5)；以及非ACC除草剂类，如呋草黄(benfuresate)、苏达灭(butylate)、草灭特(cycloate)、茅草枯(dalapon)、哌草丹(dimepiperate)、扑草灭(EPTC)、禾草畏(esprocarb)、乙呋草黄(ethofumesate)、四氟丙酸(flupropanate)、草达灭(molinate)、坪草丹(orbencarb)、克草猛(pebulate)、苄草丹(prosulfocarb)、TCA、杀草丹(thiobencarb)、丁草威(tiocarbazil)、野麦畏(triallate)和灭草猛(vernolate)；
b2)来自ALS抑制剂组：
磺酰脲类，如磺氨黄隆(amidosulfuron)、四唑黄隆(azimsulfuron)、苄嘧黄隆(bensulfuron)、苄嘧黄隆(bensulfuron-methyl)、氯嘧黄隆(chlorimuron)、氯嘧黄隆(chlorimuron-ethyl)、绿黄隆(chlorsulfuron)、醚黄隆(cinosulfuron)、环丙黄隆(cyclosulfamuron)、胺苯黄隆(ethametsulfuron)、胺苯黄隆(ethametsulfuron-methyl)、乙氧嘧黄隆(ethoxysulfuron)、啶嘧黄隆(flazasulfuron)、氟吡磺隆(flucetosulfuron)、氟定黄隆(flupyrsulfuron)、氟定黄隆(flupyrsulfuron-methyl-sodium)、甲酰氨磺隆(foramsulfuron)、吡氯黄隆(halosulfuron)、吡氯黄隆(halosulfuron-methyl)、啶咪黄隆(imazosulfuron)、碘黄隆(iodosulfuron)、碘甲黄隆钠(iodosulfuron-methyl-sodium)、iofensulfuron、iofensulfuron-sodium、甲基二磺隆(mesosulfuron)、metazosulfuron、甲黄隆(metsulfuron)、甲黄隆(metsulfuron-methyl)、烟嘧黄隆(nicosulfuron)、嘧苯胺磺隆(orthosulfamuron)、环丙氧黄隆(oxasulfuron)、氟嘧黄隆(primisulfuron)、氟嘧黄隆(primisulfuron-methyl)、propyrisulfuron、氟丙黄隆(prosulfuron)、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron)、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron-ethyl)、玉嘧黄隆(rimsulfuron)、嘧黄隆(sulfometuron)、嘧黄隆(sulfometuron-methyl)、乙黄黄隆(sulfosulfuron)、噻黄隆(thifensulfuron)、噻黄隆(thifensulfuron-methyl)、醚苯黄隆(triasulfuron)、苯黄隆(tribenuron)、苯黄隆(tribenuron-methyl)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron-methyl)和三氟甲磺隆(tritosulfuron)，
咪唑啉酮类如咪草酯(imazamethabenz)、咪草酯(imazamethabenz-methyl)、咪草啶酸(imazamox)、甲基咪草烟(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)和咪草烟(imazethapyr)，三唑并嘧啶类除草剂和磺酰苯胺类如唑嘧磺胺酸(cloransulam)、唑嘧磺胺盐(cloransulam-methyl)、唑嘧磺胺(diclosulam)、氟唑啶草(flumetsulam)、双氟磺草胺(florasulam)、唑草磺胺(metosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)、pyrimisulfan和啶磺草胺(pyroxsulam)，
嘧啶基苯甲酸酯类如双嘧苯甲酸(bispyribac)、双嘧苯甲酸钠(bispyribac-sodium)、嘧苯草肟(pyribenzoxim)、环酯草醚(pyriftalid)、肟啶草(pyriminobac)、肟啶草(pyriminobac-methyl)、嘧硫苯甲酸(pyrithiobac)、嘧硫苯甲酸钠(pyrithiobac-sodium)、4-[[[2-[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基)氧基]苯基]甲基]氨基]苯甲酸1-甲基乙基酯(CAS 420138-41-6)、4-[[[2-[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基)氧基]苯基]甲基]氨基]苯甲酸丙基酯(CAS 420138-40-5)、N-(4-溴苯基)-2-[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基)氧基]苯甲胺(CAS420138-01-8)，
磺酰氨基羰基三唑啉酮类除草剂如氟酮磺隆(flucarbazone)、氟酮磺隆钠(flucarbazone-sodium)、丙苯磺隆(propoxycarbazone)、丙苯磺隆钠(propoxycarbazone-sodium)、thiencarbazone和thiencarbazone-methyl；以及triafamone；
其中本发明的一个优选实施方案涉及包含至少一种咪唑啉酮类除草剂的组合物；
b3)来自光合作用抑制剂组：
胺唑草酮(amicarbazone)，光合系统II抑制剂，例如三嗪类除草剂，包括氯代三嗪类、三嗪酮类、三嗪二酮类、甲硫基三嗪类和哒嗪酮类除草剂，如莠灭净(ametryn)、莠去津(atrazine)、杀草敏(chloridazone)、草净津(cyanazine)、敌草净(desmetryn)、戊草津(dimethametryn)、六嗪同(hexazinone)、赛克津(metribuzin)、扑灭通(prometon)、扑草净(prometryn)、扑灭津(propazine)、西玛津(simazine)、西草净(simetryn)、甲氧去草净(terbumeton)、特丁津(terbuthylazin)、去草净(terbutryn)和草达津(trietazin)；芳基脲类如氯溴隆(chlorobromuron)、绿麦隆(chlorotoluron)、枯草隆(chloroxuron)、丁隆(dimefuron)、敌草隆(diuron)、伏草隆(fluometuron)、异丙隆(isoproturon)、异隆(isouron)、利谷隆(linuron)、苯嗪草(metamitron)、噻唑隆(methabenzthiazuron)、色满隆(metobenzuron)、甲氧隆(metoxuron)、绿谷隆(monolinuron)、草不隆(neburon)、环草隆(siduron)、丁唑隆(tebuthiuron)和赛二唑素(thidiazuron)，苯基氨基甲酸酯类如异苯敌草(desmedipham)、卡草灵(karbutilat)、苯敌草(phenmedipham)、乙苯敌草(phenmedipham-ethyl)，腈类除草剂如杀草全(bromofenoxim)、溴苯腈(bromoxynil)及其盐和酯、碘苯腈(ioxynil)及其盐和酯，尿嘧啶类如除草定(bromacil)、环草定(lenacil)和特草定(terbacil)，以及噻草平(bentazon)和噻草平(bentazon-sodium)，达草止(pyridate)、pyridafol、蔬草灭(pentanochlor)和敌稗(propanil)，以及光合系统I抑制剂如敌草快阳离子(diquat)、敌草快(diquat-dibromide)、对草快阳离子(paraquat)、对草快(paraquat-dichloride)和对草快(paraquat-dimetilsulfate)。其中，本发明的一个优选实施方案涉及包含至少一种芳基脲类除草剂的组合物。其中，本发明的一个同样优选实施方案涉及包含至少一种三嗪类除草剂的组合物。其中，本发明的一个同样优选实施方案涉及包含至少一种腈类除草剂的组合物；
b4)来自原卟啉原-IX氧化酶抑制剂组：
氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、唑啶炔草(azafenidin)、bencarbazone、双苯嘧草酮(benzfendizone)、治草醚(bifenox)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟酮唑草(carfentrazone)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、氯硝醚(chlomethoxyfen)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、异丙吡草酯(fluazolate)、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)、酰亚胺苯氧乙酸(flumiclorac)、酰亚胺苯氧乙酸戊酯(flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、达草氟(fluthiacet)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、草灵(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、戊唑草(pentoxazone)、氟唑草胺(profluazol)、双唑草腈(pyraclonil)、氟唑草酯(pyraflufen)、氟唑草酯(pyraflufen-ethyl)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、噻二唑胺(thidiazimin)、tiafenacil、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯(CAS353292-31-6；S-3100)、N-乙基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452098-92-9)、N-四氢糠基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452099-05-7)、N-四氢糠基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452100-03-7)、3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪烷(triazinan)-2,4-二酮、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)、2-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-4,5,6,7-四氢-异吲哚-1,3-二酮、1-甲基-6-三氟甲基-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(CAS 1304113-05-0)、(E)-4-[2-氯-5-[4-氯-5-(二氟甲氧基)-1H-甲基-吡唑-3-基]-4-氟-苯氧基]-3-甲氧基-丁-2-烯酸甲酯[CAS 948893-00-3]、和3-[7-氯-5-氟-2-(三氟甲基)-1H-苯并咪唑-4-基]-1-甲基-6-(三氟甲基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(CAS 212754-02-4)；
b5)来自漂白除草剂组：
PDS抑制剂：氟丁酰草胺(beflubutamid)、吡氟草胺(diflufenican)、氟草同(fluridone)、氟咯草酮(flurochloridone)、呋草酮(flurtamone)、达草灭(norflurazon)、氟吡酰草胺(picolinafen)和4-(3-三氟甲基苯氧基)-2-(4-三氟甲基苯基)嘧啶(CAS180608-33-7)，HPPD抑制剂：苯并双环酮(benzobicyclon)、吡草酮(benzofenap)、异草酮(clomazone)、异氟草(isoxaflutole)、甲基磺草酮(mesotrione)、pyrasulfotole、吡唑特(pyrazolynate)、苄草唑(pyrazoxyfen)、磺草酮(sulcotrione)、tefuryltrione、tembotrione、topramezone和bicyclopyrone，漂白剂；未知靶：苯草醚(aclonifen)、杀草强(amitrole)和flumeturon；
b6)来自EPSP合酶抑制剂组：
草甘膦、草甘膦-异丙基铵(glyphosate-isopropylammonium)、glyposate-potassium、和草硫膦(glyphosate-trimesium)(sulfosate)；
b7)来自谷氨酰胺合酶抑制剂组：
双丙氨酰膦(bilanaphos(bialaphos))、双丙氨酰膦(bilanaphos-sodium)、草铵膦、草铵膦(glufosinate-P)和草铵膦(glufosinate-ammonium)；
b8)来自DHP合酶抑制剂组：
黄草灵(asulam)；
b9)来自有丝分裂抑制剂组：
K1组的化合物：二硝基苯胺类如氟草胺(benfluralin)、地乐胺(butralin)、敌乐胺(dinitramine)、丁氟消草(ethalfluralin)、氟消草(fluchloralin)、黄草消(oryzalin)、胺硝草(pendimethalin)、氨基丙氟灵(prodiamine)和氟乐灵(trifluralin)，氨基磷酸酯类如胺草磷(amiprophos)、甲基胺草磷(amiprophos-methyl)和草胺磷(butamiphos)，苯甲酸类除草剂如敌草索(chlorthal)、敌草索(chlorthal-二甲基)，吡啶类如氟硫草定(dithiopyr)和噻氟啶草(thiazopyr)，苯甲酰胺类如拿草特(propyzamide)和丙戊草胺(tebutam)；K2组的化合物：氯苯胺灵(chlorpropham)、苯胺灵(propham)和长杀草(carbetamide)；其中优选K1组化合物，尤其优选二硝基苯胺类；
b10)来自VLCFA抑制剂组：
氯乙酰胺类如乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、丁草胺(butachlor)、克草胺(dimethachlor)、噻吩草胺(dimethanamid)、精噻吩草胺(dimethenamid-P)、吡草胺(metazachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、S-异丙甲草胺(metolachlor-S)、烯草胺(pethoxamid)、丙草胺(pretilachlor)、扑草胺(propachlor)、异丙草胺(propisochlor)和噻醚草胺(thenylchlor)，羟基乙酰苯胺类(oxyacetanilide)如氟噻草胺(flufenacet)和苯噻草胺(mefenacet)，乙酰苯胺类如草乃敌(diphenamid)、萘丙胺(naproanilide)和草萘胺(napropamide)，四唑啉酮类如四唑酰草胺(fentrazamide)，以及其它除草剂如莎稗磷(anilofos)、唑草胺(cafenstrole)、fenoxasulfone、ipfencarbazone、哌草磷(piperophos)、派罗克杀草砜(pyroxasulfone)；和式II.1,II.2,II.3,II.4,II.5,II.6,II.7,II.8和II.9的异唑啉化合物：
式(I)I的异唑啉化合物是本领域已知的，例如见WO 2006/024820，WO 2006/037945，WO 2007/071900和WO 2007/096576；
在VLCFA抑制剂中，优选氯代乙酰胺类和氧基乙酰胺类；
b11)来自纤维素生物合成抑制剂组：
草克乐(chlorthiamid)、敌草腈(dichlobenil)、胺草唑(flupoxam)、indaziflam、丙氧丙胺津(triaziflam)、异草胺(isoxaben)、和1-环己基-5-五氟苯氧基-14-[1,2,4,6]硫杂三嗪-3-基胺；
b12)来自去偶剂除草剂组：
地乐酚(dinoseb)、地乐消酚(dinoterb)以及二硝甲酚(DNOC)及其盐；
b13)来自生长素除草剂组：
2,4-滴及其盐和酯例如clacyfos、2,4-滴B及其盐和酯、aminocyclopyrachlor及其盐和酯、氨草啶(aminopyralid)及其盐如氨草啶-三(2-羟基丙基)铵及其酯、草除灵(benazolin)、草除灵(benazolin-ethyl)、草灭平(chloramben)及其盐和酯、稗草胺(clomeprop)、二氯皮考啉酸(clopyralid)及其盐和酯、麦草畏(dicamba)及其盐和酯、2,4-滴丙酸(dichlorprop)及其盐和酯、高2,4-滴丙酸(dichlorprop-P)及其盐和酯、氟草烟(fluroxypyr)、氟草烟(fluroxypyr-butometyl)、氟氯胺啶(fluroxypyr-meptyl)、halauxifen及其盐和酯(CAS 943832-60-8)；2甲4氯(MCPA)及其盐和酯、2甲4氯乙硫酯(MCPA-thioethyl)、MCPB及其盐和酯、2甲4氯丙酸(mecoprop)及其盐和酯、高2甲4氯丙酸(mecoprop-P)及其盐和酯、毒莠定(picloram)及其盐和酯、二氯喹啉酸(quinclorac)、喹草酸(quinmerac)、TBA(2,3,6)及其盐和酯、以及绿草定(triclopyr)及其盐和酯；
b14)来自生长素转运抑制剂组：二氟吡隆(diflufenzopyr)、二氟吡隆钠盐(diflufenzopyr-sodium)、抑草生(naptalam)和抑草生(naptalam-sodium)；
b15)来自其它除草剂：溴丁酰草胺(bromobutide)、氯甲丹(chlorflurenol)、氯甲丹(chlorflurenol-methyl)、环庚草醚(cinmethylin)、苄草隆(cumyluron)、cyclopyrimorate(CAS 499223-49-3)及其盐和酯、茅草枯(dalapon)、棉隆(dazomet)、苯敌快(difenzoquat)、苯敌快(difenzoquat-metilsulfate)、噻节因(dimethipin)、甲胂钠(DSMA)、香草隆(dymron)、敌草腈(endothal)及其盐、乙苯酰草(etobenzanid)、氟燕灵(flamprop)、氟燕灵(flamprop-isopropyl)、甲氟燕灵(flamprop-methyl)、强氟燕灵(flamprop-M-isopropyl)、麦草伏(flamprop-M-methyl)、抑草丁(flurenol)、抑草丁(flurenol-butyl)、调嘧醇(flurprimidol)、膦铵素(fosamine)、膦铵素(fosamine-ammonium)、茚草酮(indanofan)、indaziflam、抑芽丹(maleic hydrazide)、氟草磺(mefluidide)、威百亩(metam)、methiozolin(CAS 403640-27-7)、叠氮甲烷(methylazide)、溴甲烷(methyl bromide)、苯丙隆(methyl-dymron)、碘甲烷(methyl iodide)、甲胂一钠(MSMA)、油酸(oleic acid)、氯嗪草(oxaziclomefone)、壬酸(pelargonicacid)、稗草畏(pyributicarb)、灭藻醌(quinoclamine)、苯氧丙胺津(triaziflam)以及灭草环(tridiphane)。
可与根据本发明的PPO抑制性除草剂组合使用的优选除草剂B为
b1)来自脂质生物合成抑制剂组：
烯草酮(clethodim)、炔草酯(clodinafop-propargyl)、噻草酮(cycloxydim)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、禾草灵(diclofop-methyl)、高唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P-butyl)、吡氟精吡氟氯禾灵(haloxyfop-P-methyl)、唑酰草胺(metamifop)、唑啉草酯(pinoxaden)、环苯草酮(profoxydim)、喔草酯(propaquizafop)、精喹禾灵(quizalofop-P-ethyl)、精喹禾灵(四氢糠基酯)(quizalofop-P-tefuryl)、稀禾定(sethoxydim)、醌肟草(tepraloxydim)、肟草酮(tralkoxydim)，4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟基-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS 1312337-72-6)；4-(2',4'-二氯-4-环丙基[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟基-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS 1312337-45-3)；4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟基-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS 1033757-93-5)；4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3,5(4H,6H)-二酮(CAS 1312340-84-3)；5-(乙酰基氧基)-4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS 1312337-48-6)；5-(乙酰基氧基)-4-(2′,4'-二氯-4-环丙基-[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮；5-(乙酰基氧基)-4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS 1312340-82-1)；5-(乙酰基氧基)-4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS 1033760-55-2)；4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS1312337-51-1)；4-(2′,4'-二氯-4-环丙基-[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯；4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS 1312340-83-2)；4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS 1033760-58-5)；呋草黄(benfuresate)、哌草丹(dimepiperate)、扑草灭(EPTC)、禾草畏(esprocarb)、乙呋草黄(ethofumesate)、草达灭(molinate)、坪草丹(orbencarb)、苄草丹(prosulfocarb)、杀草丹(thiobencarb)、和野麦畏(triallate)；
b2)来自ALS抑制剂组：
磺氨黄隆(amidosulfuron)、四唑黄隆(azimsulfuron)、苄嘧黄隆(bensulfuron-methyl)、双嘧苯甲酸钠(bispyribac-sodium)、氯嘧黄隆(chlorimuron-ethyl)、绿黄隆(chlorsulfuron)、唑嘧磺胺盐(cloransulam-methyl)、环丙黄隆(cyclosulfamuron)、唑嘧磺胺(diclosulam)、胺苯黄隆(ethametsulfuron-methyl)、乙氧嘧黄隆(ethoxysulfuron)、啶嘧黄隆(flazasulfuron)、双氟磺草胺(florasulam)、氟酮磺隆钠(flucarbazone-sodium)、氟吡磺隆(flucetosulfuron)、氟唑啶草(flumetsulam)、氟定黄隆(flupyrsulfuron-methyl-sodium)、甲酰氨磺隆(foramsulfuron)、吡氯黄隆(halosulfuron-methyl)、咪草酯(imazamethabenz-methyl)、咪草啶酸(imazamox)、甲基咪草烟(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、啶咪黄隆(imazosulfuron)、碘黄隆(iodosulfuron)、碘甲黄隆钠(iodosulfuron-methyl-sodium)、iofensulfuron、iofensulfuron-sodium,甲基二磺隆(mesosulfuron)、metazosulfuron、唑草磺胺(metosulam)、甲黄隆(metsulfuron-methyl)、烟嘧黄隆(nicosulfuron)、嘧苯胺磺隆(orthosulfamuron)、环丙氧黄隆(oxasulfuron)、五氟磺草胺(penoxsulam)、氟嘧黄隆(primisulfuron-methyl)、propoxycarbazon-sodium、propyrisulfuron、氟丙黄隆(prosulfuron)、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron-ethyl)、嘧苯草肟(pyribenzoxim)、pyrimisulfan、环酯草醚(pyriftalid)、肟啶草(pyriminobac-methyl)、嘧硫苯甲酸钠(pyrithiobac-sodium)、啶磺草胺(pyroxsulam)、玉嘧黄隆(rimsulfuron)、嘧黄隆(sulfometuron-methyl)、乙黄黄隆(sulfosulfuron)、thiencarbazone-methyl、噻黄隆(thifensulfuron-methyl)、醚苯黄隆(triasulfuron)、苯黄隆(tribenuron-methyl)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron-methyl)、三氟甲磺隆(tritosulfuron)，以及triafamone；
b3)来自光合作用抑制剂组：
ametryn、胺唑草酮(amicarbazone)、莠去津(atrazine)、噻草平(bentazone)、bentazone-sodium、溴苯腈(bromoxynil)及其盐和酯、杀草敏(chloridazone)、绿麦隆(chlorotoluron)、草净津(cyanazine)、异苯敌草(desmedipham)、敌草快(diquat-dibromide)、敌草隆(diuron)、伏草隆(fluometuron)、六嗪同(hexazinone)、碘苯腈(ioxynil)及其盐和酯、异丙隆(isoproturon)、环草定(lenacil)、利谷隆(linuron)、苯嗪草(metamitron)、噻唑隆(methabenzthiazuron)、赛克津(metribuzin)、对草快阳离子(paraquat)、对草快(paraquat-dichloride)、苯敌草(phenmedipham)、敌稗(propanil)、达草止(pyridate)、西玛津(simazine)、去草净(terbutryn)、terbuthylazine和赛二唑素(thidiazuron)；
b4)来自原卟啉原-IX氧化酶抑制剂组：
氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、唑啶炔草(azafenidin)、bencarbazone、双苯嘧草酮(benzfendizone)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)、酰亚胺苯氧乙酸戊酯(flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、草灵(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、戊唑草(pentoxazone)、氟唑草酯(pyraflufen-ethyl)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、N-乙基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452098-92-9)、N-四氢糠基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452099-05-7)、N-四氢糠基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452100-03-7)、3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪烷(triazinan)-2,4-二酮、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)、2-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-4,5,6,7-四氢-异吲哚-1,3-二酮、1-甲基-6-三氟甲基-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮和3-[7-氯-5-氟-2-(三氟甲基)-1H-苯并咪唑-4-基]-1-甲基-6-(三氟甲基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(CAS212754-02-4)；
b5)来自漂白除草剂组：
苯草醚(aclonifen)、氟丁酰草胺(beflubutamid)、苯并双环酮(benzobicyclon)、异草酮(clomazone)、吡氟草胺(diflufenican)、氟咯草酮(flurochloridone)、呋草酮(flurtamone)、异氟草(isoxaflutole)、甲基磺草酮(mesotrione)、达草灭(norflurazon)、氟吡酰草胺(picolinafen)、pyrasulfotole、吡唑特(pyrazolynate)、磺草酮(sulcotrione)、tefuryltrione、tembotrione、topramezone、bicyclopyrone、4-(3-三氟甲基苯氧基)-2-(4-三氟甲基苯基)嘧啶(CAS 180608-33-7)、杀草强(amitrole)和flumeturon；
b6)来自EPSP合酶抑制剂组：
草甘膦、草甘膦-异丙基铵(glyphosate-isopropylammonium)、草甘膦钾盐(glyphosate-potassium)、和草硫膦(glyphosate-trimesium)(sulfosate)；
b7)来自谷氨酰胺合酶抑制剂组：
草铵膦(glufosinate)、草铵膦(glufosinate-P)、草铵膦(glufosinate-ammonium)；
b8)来自DHP合酶抑制剂组：黄草灵(asulam)；
b9)来自有丝分裂抑制剂组：
氟草胺(benfluralin)、氟硫草定(dithiopyr)、丁氟消草(ethalfluralin)、黄草消(oryzalin)、胺硝草(pendimethalin)、噻氟啶草(thiazopyr)和氟乐灵(trifluralin)；
b10)来自VLCFA抑制剂组：
乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、莎稗磷(anilofos)、丁草胺(butachlor)、唑草胺(cafenstrole)、噻吩草胺(dimethanamid)、精噻吩草胺(dimethenamid-P)、四唑酰草胺(fentrazamide)、氟噻草胺(flufenacet)、苯噻草胺(mefenacet)、吡草胺(metazachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、S-异丙甲草胺(S-metolachlor)、萘丙胺(naproanilide)、草萘胺(napropamide)、丙草胺(pretilachlor)、fenoxasulfone、ipfencarbazone、派罗克杀草砜(pyroxasulfone)、噻醚草胺(thenylchlor)、和如上所述的式II.1,II.2,II.3,II.4,II.5,II.6,II.7,II.8和II.9的异唑啉化合物；
b11)来自纤维素生物合成抑制剂组：
敌草腈(dichlobenil)、胺草唑(flupoxam)、异草胺(isoxaben)、和1-环己基-5-五氟苯氧基-14-[1,2,4,6]硫杂三嗪-3-基胺；
b13)来自生长素除草剂组：
2,4-滴及其盐和酯、aminocyclopyrachlor及其盐和酯、氨草啶(aminopyralid)及其盐如氨草啶铵盐(aminopyralid-tris(2-hydroxypropyl)ammonium)及其酯、二氯皮考啉酸(clopyralid)及其盐和酯、麦草畏(dicamba)及其盐和酯、高2,4-滴丙酸(dichlorprop-P)及其盐和酯、氟氯胺啶(fluroxypyr-meptyl)、halauxifen及其盐和酯(CAS 943832-60-8)、MCPA及其盐和酯、MCPB及其盐和酯、高2甲4氯丙酸(mecoprop-P)及其盐和酯、毒莠定(picloram)及其盐和酯、二氯喹啉酸(quinclorac)、喹草酸(quinmerac)、以及绿草定(triclopyr)及其盐和酯；
b14)来自生长素转运抑制剂组：二氟吡隆(diflufenzopyr)和二氟吡隆钠盐(diflufenzopyr-sodium)；
b15)来自其它除草剂：溴丁酰草胺(bromobutide)、环庚草醚(cinmethylin)、苄草隆(cumyluron)、cyclopyrimorate(CAS 499223-49-3)及其盐和酯、茅草枯(dalapon)、苯敌快(difenzoquat)、苯敌快(difenzoquat-metilsulfate)、甲胂钠(DSMA)、香草隆(dymron)(＝daimuron)、氟燕灵(flamprop)、氟燕灵(flamprop-isopropyl)、甲氟燕灵(flamprop-methyl)、强氟燕灵(flamprop-M-isopropyl)、麦草伏(flamprop-M-methyl)、茚草酮(indanofan)、indaziflam、威百亩(metam)、溴甲烷(methylbromide)、甲胂一钠(MSMA)、氯嗪草(oxaziclomefone)、稗草畏(pyributicarb)、苯氧丙胺津(triaziflam)以及灭草环(tridiphane)。
特别优选的可与根据本发明的PPO抑制性除草剂组合使用的除草剂B为：
b1)选自如下的脂质生物合成抑制剂：炔草酯(clodinafop-propargyl)、噻草酮(cycloxydim)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、高唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)、唑啉草酯(pinoxaden)、环苯草酮(profoxydim)、醌肟草(tepraloxydim)、肟草酮(tralkoxydim)，4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟基-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS 1312337-72-6)；4-(2',4'-二氯-4-环丙基[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟基-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS 1312337-45-3)；4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5-羟基-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3(6H)-酮(CAS 1033757-93-5)；4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3,5(4H,6H)-二酮(CAS 1312340-84-3)；5-(乙酰基氧基)-4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS 1312337-48-6)；5-(乙酰基氧基)-4-(2′,4'-二氯-4-环丙基-[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮；5-(乙酰基氧基)-4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS 1312340-82-1)；5-(乙酰基氧基)-4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-3,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-2H-吡喃-3-酮(CAS 1033760-55-2)；4-(4'-氯-4-环丙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS 1312337-51-1)；4-(2′,4'-二氯-4-环丙基-[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯；4-(4'-氯-4-乙基-2'-氟[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS1312340-83-2)；4-(2',4'-二氯-4-乙基[1,1'-联苯基]-3-基)-5,6-二氢-2,2,6,6-四甲基-5-氧代-2H-吡喃-3-基碳酸甲酯(CAS 1033760-58-5)；禾草畏(esprocarb)、苄草丹(prosulfocarb)、杀草丹(thiobencarb)、和野麦畏(triallate)；
b2)选自如下的ALS抑制剂：苄嘧黄隆(bensulfuron-methyl)、双嘧苯甲酸钠(bispyribac-sodium)、环丙黄隆(cyclosulfamuron)、唑嘧磺胺(diclosulam)、氟唑啶草(flumetsulam)、氟定黄隆(flupyrsulfuron-methyl-sodium)、甲酰氨磺隆(foramsulfuron)、咪草啶酸(imazamox)、甲基咪草烟(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、啶咪黄隆(imazosulfuron)、碘黄隆(iodosulfuron)、碘甲黄隆钠(iodosulfuron-methyl-sodium)、iofensulfuron、iofensulfuron-sodium,甲基二磺隆(mesosulfuron)、metazosulfuron、烟嘧黄隆(nicosulfuron)、五氟磺草胺(penoxsulam)、propoxycarbazon-sodium、propyrisulfuron、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron-ethyl)、啶磺草胺(pyroxsulam)、玉嘧黄隆(rimsulfuron)、乙黄黄隆(sulfosulfuron)、thiencarbazone-methyl、三氟甲磺隆(tritosulfuron)，以及triafamone；
b3)选自如下的光合作用抑制剂：ametryn、莠去津(atrazine)、敌草隆(diuron)、伏草隆(fluometuron)、六嗪同(hexazinone)、异丙隆(isoproturon)、利谷隆(linuron)、赛克津(metribuzin)、对草快阳离子(paraquat)、对草快(paraquat-dichloride)、敌稗(propanil)、去草净(terbutryn)和terbuthylazine；
b4)选自如下的原卟啉原-IX氧化酶抑制剂：氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯(CAS353292-31-6；S-3100)、3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪烷(triazinan)-2,4-二酮、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)、和2-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-4,5,6,7-四氢-异吲哚-1,3-二酮和1-甲基-6-三氟甲基-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮；
b5)选自如下的漂白除草剂：异草酮(clomazone)、吡氟草胺(diflufenican)、氟咯草酮(flurochloridone)、异氟草(isoxaflutole)、甲基磺草酮(mesotrione)、氟吡酰草胺(picolinafen)、磺草酮(sulcotrione)、tefuryltrione、tembotrione、topramezone、bicyclopyrone、杀草强(amitrole)和flumeturon；
b6)选自如下的EPSP合酶抑制剂：草甘膦、草甘膦-异丙基铵(glyphosate-isopropylammonium)、和草硫膦(glyphosate-trimesium)(sulfosate)；
b7)选自如下的谷氨酰胺合酶抑制剂：草铵膦(glufosinate)、草铵膦(glufosinate-P)、和草铵膦(glufosinate-ammonium)；
b9)选自如下的有丝分裂抑制剂：胺硝草(pendimethalin)和氟乐灵(trifluralin)；
b10)选自如下的VLCFA抑制剂：乙草胺(acetochlor)、唑草胺(cafenstrole)、精噻吩草胺(dimethenamid-P)、四唑酰草胺(fentrazamide)、氟噻草胺(flufenacet)、苯噻草胺(mefenacet)、吡草胺(metazachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、S-异丙甲草胺(S-metolachlor)、fenoxasulfone、ipfencarbazone和派罗克杀草砜(pyroxasulfone)；优选如上所述的式II.1,II.2,II.3,II.4,II.5,II.6,II.7,II.8和II.9的异唑啉化合物；
b11)选自如下的纤维素生物合成抑制剂：异草胺(isoxaben)；
b13)选自如下的生长素除草剂：2,4-滴及其盐和酯例如clacyfos和aminocyclopyrachlor及其盐和酯、氨草啶(aminopyralid)及其盐和酯、二氯皮考啉酸(clopyralid)及其盐和酯、麦草畏(dicamba)及其盐和酯、氟氯胺啶(fluroxypyr-meptyl)、二氯喹啉酸(quinclorac)和喹草酸(quinmerac)；
b14)选自如下的生长素转运抑制剂：二氟吡隆(diflufenzopyr)和二氟吡隆钠盐(diflufenzopyr-sodium)；
b15)选自如下的其它除草剂：香草隆(dymron)(＝daimuron)、茚草酮(indanofan)、indaziflam、氯嗪草(oxaziclomefone)和苯氧丙胺津(triaziflam)。
此外，当与如上所述的化合物B组合使用时，可能有用的是与安全剂组合施用PPO抑制性除草剂。安全剂是防止或降低对有用植物的损害但不对除草剂在不希望的植物上的除草作用具有显著影响的化合物。它们可以在播种之前施用(例如在种子处理时、在枝或秧苗上)或在有用植物的萌发前或萌发后施用。
此外，安全剂C、PPO抑制性除草剂和/或除草剂B可以同时或依次施用。
合适的安全剂例如是(喹啉-8-氧基)乙酸类、1-苯基-5-卤代烷基-1H-1,2,4-三唑-3-羧酸类、1-苯基-4,5-二氢-5-烷基-1H-吡唑-3,5-二羧酸类、4,5-二氢-5,5-二芳基-3-异唑羧酸类、二氯乙酰胺类、α-肟基苯基乙腈类、苯乙酮肟类、4,6-二卤代-2-苯基嘧啶类、N-[[4-(氨基羰基)苯基]磺酰基]-2-苯甲酰胺类、1,8-萘二甲酸酐类、2-卤代-4-卤代烷基-5-噻唑羧酸类、硫代磷酸酯类和N-烷基-O-苯基氨基甲酸酯类及其可农用盐和可农用衍生物如酰胺、酯和硫酯，条件是它们具有酸基。
优选安全剂C的实例是解草酮(benoxacor)、喹氧乙酸(cloquintocet)、抑害腈(cyometrinil)、cyprosulfamide、抑害胺(dichlormid)、dicyclonon、dietholate、解草唑(fenchlorazole)、解草啶(fenclorim)、解草安(flurazole)、肟草安(fluxofenim)、解草呋(furilazole)、双苯唑酸(isoxadifen)、吡咯二酸(mefenpyr)、mephenate、萘二甲酸酐(naphthalic anhydride)、解草腈(oxabetrinil)、4-二氯乙酰基-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(MON4660，CAS 71526-07-3)和2,2,5-三甲基-3-二氯乙酰基-1,3-唑烷(R-29148，CAS 52836-31-4)。
尤其优选的安全剂C是解草酮(benoxacor)、喹氧乙酸(cloquintocet)、cyprosulfamide、抑害胺(dichlormid)、解草唑(fenchlorazole)、解草啶(fenclorim)、解草安(flurazole)、肟草安(fluxofenim)、解草呋(furilazole)、双苯唑酸(isoxadifen)、吡咯二酸(mefenpyr)、萘二甲酸酐(naphthalic anhydride)、解草腈(oxabetrinil)、4-(二氯乙酰基)-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(MON4660，CAS 71526-07-3)和2,2,5-三甲基-3-二氯乙酰基-1,3-唑烷(R-29148，CAS 52836-31-4)。
特别优选的安全剂C是解草酮(benoxacor)、喹氧乙酸(cloquintocet)、cyprosulfamide、抑害胺(dichlormid)、解草唑(fenchlorazole)、解草啶(fenclorim)、解草呋(furilazole)、双苯唑酸(isoxadifen)、吡咯二酸(mefenpyr)、萘二甲酸酐(naphthalic anhydride)、4-二氯乙酰基-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(MON4660，CAS71526-07-3)和2,2,5-三甲基-3-二氯乙酰基-1,3-唑烷(R-29148，CAS 52836-31-4)。
还优选的安全剂C是解草酮(benoxacor)、喹氧乙酸(cloquintocet)、cyprosulfamide、抑害胺(dichlormid)、解草唑(fenchlorazole)、解草啶(fenclorim)、解草呋(furilazole)、双苯唑酸(isoxadifen)、吡咯二酸(mefenpyr)、4-二氯乙酰基-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(MON4660，CAS 71526-07-3)和2,2,5-三甲基-3-二氯乙酰基-1,3-唑烷(R-29148，CAS 52836-31-4)。
作为组分C构成本发明组合物的组分的特别优选的安全剂C是如上定义的安全剂C；特别是以下表C中所列的安全剂C.1-C.12：
表C
PPO抑制性除草剂(化合物A)和b1)-b15)组的活性化合物B和活性化合物C是已知的除草剂和安全剂，例如参见The Compendium of Pesticide Common Names(http://www.alanwood.net/pesticides/)；Farm Chemicals Handbook 2000，第86卷，MeisterPublishing Company，2000；B.Hock，C.Fedtke，R.R.Schmidt，Herbizide[除草剂]，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，1995；W.H.Ahrens，Herbicide Handbook，第7版，Weed ScienceSociety of America，1994；以及K.K.Hatzios，Herbicide Handbook，第7版增补，WeedScience Society of America，1998。2,2,5-三甲基-3-二氯乙酰基-1,3-唑烷[CAS号52836-31-4]也称为R-29148。4-二氯乙酰基-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷[CAS号71526-07-3]也称为AD-67和MON 4660。
基于当前知识，可以将活性化合物分配至相应的作用机制。如果数种作用机制适用于一种活性化合物，则这种物质仅被分配到一种作用机制。
具有羧基的活性化合物B和C可以以酸的形式、以上文提及的农业上适宜的盐的形式、或以农业上可接受的衍生物的形式，在根据本发明的组合物中使用。
在麦草畏的情况下，适宜的盐包括其中反离子是农业上可接受的阳离子的盐。例如，麦草畏的适宜盐为麦草畏-钠、麦草畏-钾、麦草畏-甲基铵、麦草畏-二甲基铵、麦草畏-异丙基铵、麦草畏-二甘醇胺、麦草畏-乙醇胺(olamine)、麦草畏-二乙醇胺(diolamine)、麦草畏-三乙醇胺(trolamine)、麦草畏-N,N-双-(3-氨基丙基)甲基胺和麦草畏-二亚乙基三胺。适宜酯的实例为麦草畏-甲基酯(dicamba-methyl)和麦草畏丁酰基酯(dicamba-butotyl)。
2,4-滴的合适盐为2,4-滴-铵、2,4-滴-二甲基铵、2,4-滴-二乙基铵、2,4-滴-二乙醇铵(2,4-D-diolamine)、2,4-滴-三乙醇铵、2,4-滴-异丙基铵、2,4-滴-三异丙醇铵、2,4-滴-庚基铵、2,4-滴-十二烷基铵、2,4-滴-十四烷基铵、2,4-滴-三乙基铵、2,4-滴-三(2-羟丙基)铵、2,4-滴-三(异丙基)铵、2,4-滴-三乙醇胺(trolamine)、2,4-滴-锂、2,4-滴-钠。2,4-滴的合适酯的实例为2,4-滴-丁酰基酯(2,4-D-butotyl)、2,4-滴-2-丁氧基丙酯、2,4-滴-3-丁氧基丙酯、2,4-滴-丁酯、2,4-滴-乙酯、2,4-滴-乙基己酯、2,4-滴-异丁酯、2,4-滴-异辛酯、2,4-滴-异丙酯、2,4-D-meptyl、2,4-滴-甲酯、2,4-滴-辛酯、2,4-滴-戊酯、2,4-滴-丙酯、2,4-D-tefuryl和clacyfos。
2,4-DB的合适盐为例如2,4-DB-钠、2,4-DB-钾和2,4-DB-二甲基铵。2,4-DB的合适酯为例如2,4-DB-丁酯和2,4-DB-异辛酯(2,4-DB-isoctyl)。
2,4-滴丙酸的合适盐为例如(2,4-滴丙酸)-钠、(2,4-滴丙酸)-钾和(2,4-滴丙酸)-二甲基铵。(2,4-滴丙酸)的合适酯的实例为(2,4-滴丙酸)-2-丁酰基酯(dichlorprop-butotyl)和(2,4-滴丙酸)-异辛酯。
MCPA(2甲4氯)的合适盐和酯包括2甲4氯-丁酰基酯(MCPA-butotyl)、2甲4氯-丁酯、2甲4氯-二甲基铵、2甲4氯-二乙醇胺(diolamine)、2甲4氯-乙酯、2甲4氯-乙硫酯(MCPA-thioethyl)、2甲4氯-2-乙基己酯、2甲4氯-异丁酯、2甲4氯-异辛酯、2甲4氯-异丙酯、2甲4氯-异丙基铵、2甲4氯-甲酯、2甲4氯-乙醇胺(olamine)、2甲4氯-钾、2甲4氯-钠和2甲4氯-三乙醇胺(trolamine)。
MCPB的合适盐为MCPB钠。MCPB的合适酯为MCPB-乙酯。
二氯皮考啉酸的合适盐为二氯皮考啉酸-钾、二氯皮考啉酸-乙醇胺(olamine)和二氯皮考啉酸-三-(2-羟丙基)铵。二氯皮考啉酸的合适酯的实例为二氯皮考啉酸-甲酯。
氟草烟(fluroxypyr)的合适酯的实例为氟氯胺啶(fluroxypyr-meptyl)和氟草烟-2-丁氧基-1-甲基乙酯，其中氟氯胺啶(fluroxypyr-meptyl)是优选的。
毒莠定(picloram)的合适盐为毒莠定-二甲基铵、毒莠定-钾、毒莠定-三异丙醇铵、毒莠定-三异丙基铵和毒莠定-三乙醇胺(trolamine)。毒莠定的合适酯为毒莠定-异辛酯。
绿草定(triclopyr)的合适盐为绿草定-三乙基铵。绿草定的合适酯为例如绿草定-乙酯和绿草定-丁酰基酯(tricopyr-butotyl)。
草灭平(chloramben)的合适盐和酯包括草灭平-铵、草灭平-二乙醇胺、草灭平-甲基酯、草灭平-甲基铵和草灭平-钠。草芽平(2,3,6-TBA)的合适盐和酯包括草芽平-二甲基铵、草芽平-锂、草芽平-钾和草芽平-钠。
氨草啶(aminopyralid)的合适盐和酯包括氨草啶-钾和氨草啶-三(2-羟丙基)铵。
草甘膦的合适盐为例如草甘膦铵、草甘膦-二铵、草甘膦-二甲基铵、草甘膦-异丙基铵、草甘膦-钾、草甘膦钠、草硫膦以及乙醇胺和二乙醇胺盐，优选草甘膦-二铵、草甘膦-异丙基铵和草硫膦(sulfosate)。
草铵膦的合适盐为例如草铵膦(glufosinate-ammonium)。
草铵膦(glufosinate-P)的合适盐为例如glufosinate-P-ammonium。
溴苯腈(bromoxynil)的合适盐和酯为例如溴苯腈-丁酸酯、溴苯腈-庚酸酯、溴苯腈-辛酸酯、溴苯腈-钾和溴苯腈-钠。
碘苯腈(ioxonil)的合适盐和酯为例如碘苯腈-辛酸酯、碘苯腈-钾和碘苯腈-钠。
2甲4氯丙酸(mecoprop)的合适盐和酯包括2甲4氯丙酸-丁酰基酯(mecoprop-butotyl)、2甲4氯丙酸-二甲基铵、2甲4氯丙酸-二乙醇胺、2甲4氯丙酸-ethadyl、2甲4氯丙酸-2-乙基己酯、2甲4氯丙酸-异辛酯、2甲4氯丙酸-甲酯、2甲4氯丙酸-钾、2甲4氯丙酸-钠和2甲4氯丙酸-三乙醇胺。
高2甲4氯丙酸的合适盐为例如高2甲4氯丙酸-丁酰基酯(mecoprop-P-butotyl)、高2甲4氯丙酸-二甲基铵、高2甲4氯丙酸-2-乙基己酯、高2甲4氯丙酸-异丁酯、高2甲4氯丙酸-钾和高2甲4氯丙酸-钠。
二氟吡隆(diflufenzopyr)的合适盐为例如二氟吡隆(diuflufenzopyr-sodium)。
抑草生(naptalam)的合适盐为例如抑草生(naptalam-sodium)。
aminocyclopyrachlor的合适盐和酯为例如aminocyclopyrachlor-二甲基铵、aminocyclopyrachlor-甲基酯、aminocyclopyrachlor-三异丙醇铵、aminocyclopyrachlor-钠和aminocyclopyrachlor-钾。
二氯喹啉酸(quinclorac)的合适盐为例如二氯喹啉酸-二甲基铵。
喹草酸(quinmerac)的合适盐为例如喹草酸-二甲基铵。
咪草啶酸(imazamox)的合适盐为例如咪草啶酸-铵。
甲基咪草烟(imazapic)的合适盐为例如甲基咪草烟-铵和甲基咪草烟-异丙基铵。
灭草烟(imazapyr)的合适盐为例如灭草烟-铵和灭草烟-异丙基铵。
灭草喹(imazaquin)的合适盐为例如灭草喹-铵。
咪草烟(imazethapyr)的合适盐为例如咪草烟-铵和咪草烟-异丙基铵。
topramezone的合适盐为例如topramezone-钠。
本文下面提及的本发明的优选实施方案应被理解为彼此独立地或彼此组合地是优选的。
根据本发明的优选实施方案，组合物包含至少一种、优选恰好一种除草剂B作为组分B。
根据本发明的另一个优选实施方案，组合物包含至少两种、优选恰好两种彼此不同的除草剂B。
根据本发明的另一个优选实施方案，组合物包含至少三种、优选恰好三种彼此不同的除草剂B。
根据本发明的另一优选的实施方案，组合物包含作为组分A的至少一种，优选地恰好一种PPO抑制性除草剂，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)、尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)，以及作为组分B的至少一种，优选恰好一种除草剂B。
根据本发明的另一优选的实施方案，组合物包含作为组分A的至少一种，优选地恰好一种PPO抑制性除草剂，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)、尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)，以及至少两种，优选地恰好两种，彼此不同的除草剂B。
根据本发明的另一优选的实施方案，组合物包含作为组分A的至少一种，优选地恰好一种PPO抑制性除草剂，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)、尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)，以及至少三种，优选地恰好三种，彼此不同的除草剂B。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)、尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b1)的除草活性化合物，尤其是选自烯草酮(clethodim)、炔草酯(clodinafop-propargyl)、噻草酮(cycloxydim)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、高唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)、吡氟禾草灵(fluazifop)、唑啉草酯(pinoxaden)、环苯草酮(profoxydim)、喹禾灵(quizalofop)、稀禾定(sethoxydim)、醌肟草(tepraloxydim)、肟草酮(tralkoxydim)、禾草畏(esprocarb)、苄草丹(prosulfocarb)、杀草丹(thiobencarb)和野麦畏(triallate)。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b2)的除草活性化合物，特别地选自苄嘧黄隆(bensulfuron-methyl)、双嘧苯甲酸钠(bispyribac-sodium)、唑嘧磺胺盐(cloransulam-methyl)、环丙黄隆(cyclosulfamuron)、唑嘧磺胺(diclosulam)、氟唑啶草(flumetsulam)、氟定黄隆(flupyrsulfuron-methyl-sodium)、甲酰氨磺隆(foramsulfuron)、吡氯黄隆(halosulfuron-methyl)、咪草啶酸(imazamox)、甲基咪草烟(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、啶咪黄隆(imazosulfuron)、碘黄隆(iodosulfuron)、碘甲黄隆钠(iodosulfuron-methyl-sodium)、甲磺胺黄隆(mesosulfuron-methyl)、metazosulfuron,烟嘧黄隆(nicosulfuron)、五氟磺草胺(penoxsulam)、propoxycarbazon-sodium、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron-ethyl)、嘧硫苯甲酸钠(pyrithiobac-sodium)、啶磺草胺(pyroxsulam)、玉嘧黄隆(rimsulfuron)、乙黄黄隆(sulfosulfuron)、thiencarbazone-methyl、噻黄隆(thifensulfuron-methyl)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)和三氟甲磺隆(tritosulfuron)。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)、尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b3)的除草活性化合物，特别地选自ametryn、莠去津(atrazine)、噻草平(bentazone)、溴苯腈(bromoxynil)、敌草隆(diuron)、伏草隆(fluometuron)、六嗪同(hexazinone)、异丙隆(isoproturon)、利谷隆(linuron)、赛克津(metribuzin)、对草快阳离子(paraquat)、对草快(paraquat-dichloride)、prometryne,敌稗(propanil)、去草净(terbutryn)和terbuthylazine。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)、尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b4)的除草活性化合物，特别地选自氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、唑啶炔草(azafenidin)、bencarbazone、双苯嘧草酮(benzfendizone)、治草醚(bifenox)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟酮唑草(carfentrazone)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、氯硝醚(chlomethoxyfen)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、异丙吡草酯(fluazolate)、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)、酰亚胺苯氧乙酸(flumiclorac)、酰亚胺苯氧乙酸戊酯(flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、达草氟(fluthiacet)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、草灵(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、戊唑草(pentoxazone)、氟唑草胺(profluazol)、双唑草腈(pyraclonil)、氟唑草酯(pyraflufen)、氟唑草酯(pyraflufen-ethyl)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、噻二唑胺(thidiazimin)、tiafenacil、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS353292-31-6；S-3100)、N-乙基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452098-92-9)、N-四氢糠基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452099-05-7)、N-四氢糠基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS 452100-03-7)、3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪烷-2,4-二酮、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)、2-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-4,5,6,7-四氢-异吲哚-1,3-二酮、1-甲基-6-三氟甲基-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]嗪-6-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮、(E)-4-[2-氯-5-[4-氯-5-(二氟甲氧基)-1H-甲基-吡唑-3-基]-4-氟-苯氧基]-3-甲氧基-丁-2-烯酸甲酯[CAS 948893-00-3]、3-[7-氯-5-氟-2-(三氟甲基)-1H-苯并咪唑-4-基]-1-甲基-6-(三氟甲基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(CAS 212754-02-4)。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)、组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b5)的除草活性化合物，特别地选自异草酮(clomazone)、吡氟草胺(diflufenican)、氟咯草酮(flurochloridone)、异氟草(isoxaflutole)、甲基磺草酮(mesotrione)、氟吡酰草胺(picolinafen)、磺草酮(sulcotrione)、tefuryltrione、tembotrione、topramezone、bicyclopyrone、杀草强(amitrole)和flumeturon。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)、尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b6)的除草活性化合物，特别地选自草甘膦、草甘膦-异丙基铵(glyphosate-isopropylammonium)和草硫膦(glyphosate-trimesium)(sulfosate)。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)、尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b7)的除草活性化合物，特别地选自草铵膦(glufosinate)、草铵膦(glufosinate-P)和草铵膦(glufosinate-ammonium)。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b9)的除草活性化合物，特别地选自胺硝草(pendimethalin)和氟乐灵(trifluralin)。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)),尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b10)的除草活性化合物，特别地选自乙草胺(acetochlor)、唑草胺(cafenstrole)、精噻吩草胺(dimethenamid-P)、四唑酰草胺(fentrazamide)、氟噻草胺(flufenacet)、苯噻草胺(mefenacet)、吡草胺(metazachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、S-异丙甲草胺(S-metolachlor)、fenoxasulfone和派罗克杀草砜(pyroxasulfone)。同样地，优选下述组合物，其中，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)，尤其优选的苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS 1258836-72-4)，所述组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b10)的除草活性化合物，特别地选自如上所定义的式II.1,II.2,II.3,II.4,II.5,II.6,II.7,II.8和II.9的异唑啉化合物。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b13)的除草活性化合物，特别地选自2,4-滴及其盐和酯、aminocyclopyrachlor及其盐和酯、氨草啶(aminopyralid)及其盐如氨草啶-三(2-羟丙基)铵及其酯、二氯皮考啉酸(clopyralid)及其盐和酯、麦草畏(dicamba)及其盐和酯、氟氯胺啶(fluroxypyr-meptyl)、二氯喹啉酸(quinclorac)和喹草酸(quinmerac)。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b14)的除草活性化合物，特别地选自二氟吡隆(diflufenzopyr)和二氟吡隆钠盐(diflufenzopyr-sodium)。
根据本发明的另一优选的实施方案，除PPO抑制性除草剂外，优选地氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯嘧磺草胺、甲磺草胺(sulfentrazone)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(CAS 353292-31-6；S-3100)、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，尤其优选地苯嘧磺草胺、1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮(CAS1258836-72-4)，组合物还包含至少一种并且尤其是恰好一种来自组b15)的除草活性化合物，特别地选自香草隆(dymron)(＝daimuron)、茚草酮(indanofan)、indaziflam、氯嗪草(oxaziclomefone)和苯氧丙胺津(triaziflam)。
术语“二元组合物”包括包含一种或多种、例如1、2或3种PPO抑制性除草剂活性化合物和一种或多种、例如1、2或3种除草剂B的组合物。
在包含作为组分A的至少一种PPO抑制性除草剂和至少一种除草剂B的二元组合物中，活性化合物A:B的重量比一般在1:1000至1000:1的范围内，优选在1:500至500:1的范围内，特别地在1:250至250:1的范围内，并且特别优选在1:75至75:1的范围内。
另一方面，本发明涉及在控制本发明植物附近的杂草的同时生长所述植物的方法，所述方法包括以下步骤：
c)生长所述植物；和
d)将包含PPO抑制性除草剂的除草剂组合物应用于所述植物和杂草，其中所述除草剂在该除草剂抑制相应野生型植物生长的水平通常抑制原卟啉原氧化酶。
另一方面，本发明涉及用于杂草控制的组合，包含(a)本发明的核酸分子，该多核苷酸能够在植物中表达，从而对该植物提供PPO抑制性除草剂的耐受性；和(b)PPO抑制性除草剂。
另一方面，本发明涉及制备用于杂草控制的组合的方法，包括(a)提供本发明的核酸分子，该核酸分子能够在植物中表达，从而对该植物提供PPO抑制性除草剂的耐受性；和(b)提供PPO抑制性除草剂。
在一个优选的实施方案中，所述提供核酸分子的步骤包括提供含有所述核酸分子的植物。
在另一个优选的实施方案中，所述提供核酸分子的步骤包括提供含有所述核酸分子的种子。
优选地，所述方法还包括将PPO抑制性除草剂应用于该种子的步骤。
另一方面，本发明涉及用于杂草控制的组合的用途，所述用于杂草控制的组合包含(a)本发明的核酸分子，该核酸分子能够在植物中表达，从而对该植物提供PPO抑制性除草剂的耐受性；和(b)PPO抑制性除草剂，以在植物培育地点控制杂草。
在其他方面，提供了处理本发明植物的方法。
在一些实施方案中，该方法包括使植物接触农业上可接受的组合物。
另一方面，本发明提供制备后代种子的方法。该方法包括种植本发明植物的种子或能够产生本发明植物的种子。在一个实施方案中，该方法还包括从种子生长后代植物；和从后代植物收获后代种子。在其它实施方案中，该方法还包括向后代植物施用除草组合物。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明转基因植物的可收获部分。优选地，可收获部分包含本发明嵌合核酸分子或嵌合多肽。可收获部分可以是包含嵌合核酸分子或嵌合多肽的种子、根、叶和/或花、或其部分。大豆植物的优选部分是包含嵌合核酸分子或嵌合多肽的大豆。
在另一实施方案中，本发明涉及从本发明植物、其部分或可收获部分获得的产品。优选的植物产品是草料、种子粉(seed meal)、油、或种子处理包衣的种子(seed-treatment-coated seeds)。优选地，所述粉和/或油包含本发明的嵌合多肽核酸或嵌合多肽。
在另一实施方案中，本发明涉及用于生产产品的方法，该方法包括：
a)生长本发明植物或可通过本发明方法获得植物；和
b)从或由本发明植物和/或这些植物的部分例如种子产生所述产品。
又在一实施方案中，该方法包括步骤：
a)生长本发明植物；
b)从植物上移下如上定义的可收获部分；和
c)从或由本发明可收获部分产生所述产品。
可以在植物生长地点生产所述产品，可以从植物生长地点取走植物或其部分以生产产品。典型地，生长植物，从植物上取得(如果可行的话，重复周期性地取走)期望的可收获部分，从植物可收获部分制备产品。在每次实施本发明方法时，生长植物的步骤可以仅实施一次，而允许反复多次实施产品生产步骤，例如通过重复获取本发明植物的可收获部分以及如果必要的话进一步加工这些部分以产生产品。也可以重复生长本发明植物的步骤，储存植物或可收获部分，然后利用积累的植物或植物部分实施一次产品生产。此外，生长植物和产生产品的步骤可以在时间上重叠，甚至在很大程度上同时进行和/或相继地进行。一般，在生长植物一段时间后生产产品。
在一个实施方案中，通过本发明方法产生的产品是植物产品，例如，但不限于，食品、饲料、食品增补物、饲料增补物、纤维、化妆品和/或药物。食品被视为用于营养和/或用于补充营养的组合物。特别地，动物饲料和动物饲料增补物可以被视为食品。
在另一实施方案中，本发明生产方法用于制备农产品，例如，但不限于，植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖、脂肪、油、聚合物、维生素等等。
实施例
实施例1：表达盒的克隆
编码包含SEQ ID NO:112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,136,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623或624的多肽的全部核酸编码序列均由Geneart(Geneart AG,Regensburg,Germany)合成和克隆。合理设计的突变体由Geneart合成。随机PPO基因文库由Geneart合成。通过进行质粒小量制备，从大肠杆菌TOP10中分离质粒，并通过DNA测序进行确认。
实施例2：工程化构建含有本发明的表达盒的除草剂耐受性植物
通过Olhoft等(美国专利号2009/0049567)所述的方法，生产除草剂耐受性大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)和卡诺拉油菜(欧洲油菜(Brassica napus)或芜菁(Brassica Rapa var.)或Brassica campestris L.)植物。对于大豆或拟南芥的转化，使用如由Sambrook等(Molecular cloning(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述的标准克隆技术，将包含嵌合核酸分子的表达盒/构建体克隆到二元载体中，所述嵌合核酸分子编码包含SEQ ID NO:112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,136,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623或624的多肽，所述二元载体包含在泛素启动子(PcUbi)和胭脂碱合酶终止子(NOS)序列之间的抗性标记基因盒(AHAS)和嵌合多肽序列(标为GOI)。对于玉米转化而言，应用如Sambrook等人(Molecular cloning(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press)所描述的标准克隆技术，将野生型或嵌合多肽序列克隆到二元载体中，所述二元载体包含在玉米泛素启动子(ZmUbi)和胭脂碱合酶终止子(NOS)序列之间的抗性标记基因盒(AHAS)和嵌合多肽序列(标为GOI)。将二元质粒引入到根癌农杆菌中用于植物转化。通过农杆菌介导的转化，将质粒构建体引入大豆幼苗外植体主节(primary node)处的腋生分生组织细胞中。在接种并与农杆菌共培养之后，将外植体转移至无选择物的芽诱导培养基中培养1周。随后将外植体转移至含有1-3μM灭草烟(imazapyr)(Arsenal)的芽诱导培养基中培养3周，以选择经转化的细胞。然后将主节处具有健康的愈伤组织/芽垫(shoot pad)的外植体转移至含有1-3μM灭草烟(imazapyr)的芽伸长培养基中，直至芽伸长或外植体死亡。使转基因小植物生根，经TaqMan分析转基因的存在，转移到土壤中，在温室中生长至成熟。通过McElver和Singh(WO2008/124495)描述的方法转化玉米植物。经由农杆菌介导的转化，将含有嵌合多肽序列的植物转化载体构建体引入到玉米未成熟胚中。
在补充有0.5-1.5μM咪草烟(imazethapyr)的选择培养基上选择经转化的细胞3-4周。转基因小植物在植物再生培养基上再生并随后生根。对转基因小植物进行TaqMan分析转基因的存在，之后移植至盆栽混合物中并且在温室中生长至成熟。通过如由McElver和Singh(WO 2008/124495)描述的花浸蘸法，用野生型或嵌合多肽序列转化拟南芥。对转基因拟南芥植物进行TaqMan分析，用于分析整合基因座的数量。通过由Peng等(US 6653529)描述的原生质体转化，进行稻(Oryza sativa)转化。在温室研究和小块样地(mini-plot)研究中，测试含有嵌合多肽序列的大豆、玉米、和稻的T0或T1转基因植物对除草剂的改善的耐受性，其中利用下述除草剂：trifludimoxazine、苯嘧磺草胺(saflufenacil)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、治草醚(bifenox)、甲磺草胺(sulfentrazone)、和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照)。
实施例3.组织培养条件
已经开发了体外组织培养诱变测定试验来分离和表征对原卟啉原氧化酶抑制性除草剂(trifludimoxazine、苯嘧磺草胺、丙炔氟草胺(flumioxazin),氟丙嘧草酯(butafenacil),氟锁草醚(acifluorfen),乳氟禾草灵(lactofen),治草醚(bifenox),甲磺草胺(sulfentrazone),和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照))具有耐受性的植物组织(例如玉米和稻组织)。该测定使用在体外组织培养中发现的体细胞无性系变异。可以通过化学诱变和其后在浓度渐增的除草剂上逐步筛选，以增强源自体细胞无性系变异的自发突变。
本发明提供了用于促进可再生的脆弱胚发生玉米或稻愈伤组织生长的组织培养条件。愈伤组织起始于4个不同的玉米或稻栽培种，分别包括玉蜀黍(Zea mays)以及Japonica(Taipei 309,Nipponbare,Koshihikari)和Indica(Indica 1)品种。将种子在70％乙醇中处理约1分钟，随后以20％商用Clorox漂白剂处理20分钟，以对其进行表面消毒。以无菌水清洗种子，铺置于愈伤组织诱导培养基上。测试各种愈伤组织诱导培养基。所测试的培养基的成分列于表1中。
表1
在对大量的变量进行测试后，选择R001M愈伤组织诱导培养基。在30℃于暗中保持培养物。10-14天后，将胚发生愈伤组织传代至新鲜培养基上。
实施例4.筛选除草剂耐受性愈伤组织
在确定组织培养条件后，使用trifludimoxazine、苯嘧磺草胺、苯吡啶、丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、治草醚(bifenox)、甲磺草胺(sulfentrazone)、和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照)，在杀伤曲线中分析组织存活，以进一步建立筛选条件。仔细考虑除草剂在组织中的累积以及其在细胞和培养基中的留存性和稳定性。通过这些实验，确立了用于突变材料最初筛选的亚致死剂量。在建立trifludimoxazine、苯嘧磺草胺、丙炔氟草胺(flumioxazin),氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、治草醚(bifenox)、甲磺草胺(sulfentrazone)、和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照)在筛选培养基中的起始剂量后，以每次转移增加PPO抑制物浓度的方式逐步地筛选组织，直到回收到在毒性剂量下生长旺盛的细胞。在含有筛选试剂的R001M中对所获得的愈伤组织每3-4周进一步进行传代。对超过26,000个的愈伤组织进行4-5次传代选择，直到选择压力高于通过杀伤曲线和连续培养物观察所确定的毒性水平。备选地，液体培养物在MS711R中开始于愈伤组织，期间缓慢摇动及每周传代。一旦液体培养物建立后，在每次传代时将筛选试剂直接加到烧瓶中。经过2-4轮液体筛选后，将培养物转移到固体R001M培养基上的滤膜上进一步生长。
实施例5.再生植物
再生耐受性组织，并对其进行有关嵌合核酸分子存在的分子表征和/或有关在存在选择试剂下酶活性改变的生化表征。此外，也对直接和/或间接涉及四吡咯生物合成和/或代谢路径中的基因进行测序，以表征突变。最后，对改变命运(例如代谢、转运、运输)的酶进行测序，以表征突变。在除草剂筛选后，使用如下培养基方案再生愈伤组织：R025M培养10–14天；R026M培养约2周；R327M培养直到出现良好形成的芽；R008S培养直到芽生根良好以转移到温室。再生在光下进行。在再生期间不加入筛选剂。一旦形成强壮的根后，将M0再生植物移植到温室内的方形或圆形盆中。移植植物罩以透明塑料杯直到它们适应温室条件。将温室设置为日/夜周期为27℃/21℃(80°F/70°F)，用600W高压钠灯补光以维持14小时的日长。视天气，根据需要给植物浇水，和每天施肥。
实施例6.序列分析
从克隆植物(分开用于移植和单个地进行分析)收集叶片组织。使用96Magnetic DNA Plant System试剂盒(Promega,美国专利号6,027,945及6,368,800)，按生产商的指导，提取基因组DNA。使用合适的正向和反向引物对分离的DNA进行PCR扩增。
使用Hotstar Taq DNA聚合酶(Qiagen)，采用如下touchdown热循环程序，进行PCR扩增：96℃ 15分钟；接着进行35个循环(96℃ 30秒；58℃–0.2℃/循环，30秒；72℃，3分30秒)，72℃，10分钟。通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的浓度和片段大小。使用PCR引物(DNALandmarks,或Entelechon)对去磷酸化的PCR产物直接测序进行分析。使用Vector NTIAdvance 10TM(Invitrogen)分析色谱图trace文件(.scf)，鉴定相对于野生型的突变。基于序列信息，在几个个体中鉴定了突变。在代表性色谱图上进行序列分析，以默认设置进行相应的AlignX比对并进行编辑以识别(call)次级峰。
实施例7.证实除草剂耐受性
在温室研究和小块样地(mini-plot)研究中，利用下述除草剂，测试含有本发明表达盒的大豆、玉米、卡诺拉品种和稻的T0或T1转基因植物对除草剂的改善的耐受性：trifludimoxazine、苯嘧磺草胺、苯吡啶、丙炔氟草胺(flumioxazin),氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、治草醚(bifenox)、甲磺草胺(sulfentrazone)、S-3100、tiafenacil和它们的混合物和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照)，所述本发明表达盒编码包含序列SEQ ID NO:112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,136,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623或624的多肽。对于出苗前处理，播种后通过细撒布型喷嘴直接施加除草剂。温和地灌溉容器以促进萌发和生长并随后用透明塑料罩盖住直至植物已经生根。除非已遭受除草剂破坏，否则该覆盖可以引起试验植物的一致萌发。对于出苗后处理，取决于植物习性，首先将试验植物培育至3至15cm高度，并随后仅用除草剂处理。为此目的，将试验植物直接播种并且在同一个容器中培育，或首先将它们分开培育并在处理之前数天移栽至试验容器中。
为了检验T0植物，可以使用插枝。在大豆植物的情况下，用于插枝的最佳枝条为约7.5至10cm高度，存在至少两个茎节。每个插枝取自原始转化体(母本植物)并浸入生根激素粉(吲哚-3-丁酸，IBA)中。随后将插枝置于生物圆顶室(bio-dome)内的绿洲楔块(oasiswedges)中。还同时取野生型插枝以充当对照。将插枝在生物圆顶室中保持5-7天并且随后移栽至花钵并且随后在生长室再适应两天。随后，将插枝转移至温室，适应大约4天，并且随后进行如所示的喷洒试验。根据物种，保持植物在10-25℃或20-35℃。试验时间延续3周。在这段时间期间，管护植物并且评价它们对各种处理的反应。在处理后2周和3周进行除草剂损伤评价。按0％至100％评定植物损伤，0％表示无损伤并且100％表示彻底死亡。图20中显示了结果。
在48孔板中，测试了转基因拟南芥对trifludimoxazine、苯嘧磺草胺、苯吡啶、丙炔氟草胺(flumioxazin),氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、治草醚(bifenox)、甲磺草胺(sulfentrazone)、S-3100、tiafenacil和它们的混合物和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照)的改善的耐受性。因此，通过在乙醇+水(以体积计为70+30)中搅拌5分钟对T2种子进行表面灭菌，用乙醇+水(以体积计为70+30体积)冲洗一次，用无菌去离子水冲洗两次。将种子重新悬浮于溶于水的0.1％琼脂中(w/v)。将每孔4至5粒种子置于由半强度murashige skoog营养液(pH 5.8)组成的固体营养培养基上(Murashige和Skoog(1962)Physiologia Plantarum 15:473-497)。将化合物溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，并在固化前加入到培养基中(最终DMSO浓度为0.1％)。将多孔板在22℃，75％相对湿度和110μmol Phot*m-2*s-1的生长室中用14:10小时光照：暗光周期孵育。在播种后7至10天与野生型植物相比来评估生长抑制。
另外，在温室研究中测试了转基因T1拟南芥属植物对以下除草剂：trifludimoxazine、苯嘧磺草胺、苯吡啶、丙炔氟草胺(flumioxazin),氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、治草醚(bifenox)、甲磺草胺(sulfentrazone)、S-3100、tiafenacil和它们的混合物和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照)的改善的耐受性。表2和图1–17中显示了结果。
表2
另外，在温室研究中测试了转基因T2拟南芥属植物对trifludimoxazine和苯嘧磺草胺的改善的耐受性。图18–19中显示了结果。
另外，在温室研究中用多种PPO抑制性除草剂处理了多个转基因拟南芥属植物。表3、表4和图21–23中显示了结果。
表3
除草剂处理后14天的除草剂损伤评估。100＝完全的植物损伤，0＝与未处理的检查相比未观察到损伤
表4
除草剂处理后14天的除草剂损伤评估。100＝完全的植物损伤，0＝与未处理的检查相比未观察到损伤
实施例8.使用组织培养进行除草剂筛选
按如上所述，选择应用的培养基和形成杀伤曲线。使用了不同的技术进行筛选。采用逐步筛选，或采用除草剂的临致死水平。在每种情况下，对于每轮新的筛选，转移所有愈伤组织。筛选为4-5轮的培养，每轮3-5周。将愈伤组织置于尼龙膜上以便于转移(200微米孔径膜,Biodesign,Saco,Maine)。裁剪膜以适合100x20mm大小的培养皿，使用前进行高压蒸汽灭菌，每个培养皿中放置25-35块愈伤组织(每块愈伤组织的平均重量为22mg)。此外，在液体培养基中以每周传代的方式对一组愈伤组织进行筛选，然后在半固体培养基上进行进一步筛选。使用trifludimoxazine、苯嘧磺草胺、丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、治草醚(bifenox)、甲磺草胺(sulfentrazone)、和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照)，筛选突变品系。基于产生可再生突变品系的愈伤组织的百分比、或基于按所用组织克数确定的品系数，获得突变体的效率是高的。
实施例9：玉米全株植物转化和PPO抑制剂耐受性测定
按照Peng等(WO2006/136596)给出的方案，转化了未成熟胚。通过Taqman分析，测定了植物中T-DNA的存在，其中以存在于所有构建体中的nos终止子为靶。将健康外观的植物运到温室以使其硬化和进行随后的喷洒试验。植物单个地移栽至4”花盆的MetroMix 360土壤中。一旦在温室(日/夜周期27℃/21℃，通过600W高压钠灯支持14小时日长)中后，允许植物生长14天。然后喷雾处理植物：25至200g ai/ha苯嘧磺草胺+1.0％v/v甲基化种子油(MSO)和/或25-200g ai/ha trifludimoxazine加1％MSO。其它除草剂也以相似方式进行了测试以验证交叉抗性：丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、治草醚(bifenox)、甲磺草胺(sulfentrazone)、和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照)。在处理后7、14和21天评价除草剂损伤。在喷雾后2、7、14和21天进行除草剂损伤评价以寻找对新生长点和整体植物健康的损伤。将位居前面的存活植物移栽到装有MetroMix360的gallon盆中用于产生种子。
实施例10：大豆植物转化和PPO抑制剂耐受性测定
按照Siminszky等,Phytochem Rev.5:445-458(2006)之前的描述，转化了大豆栽培种Jake。再生后，转化体移栽至小花盆的土壤中，置于生长室(16hr日/8hr夜；25℃日/23℃夜；65％相对湿度；130-150μE m-2s-1)，随后通过Taqman分析测定T-DNA的存在。几周后，将健康的转基因阳性单拷贝事件移栽到较大的花盆中，允许其在生长室中生长。用于插枝的最佳枝条为约3-4英寸高，存在至少两个茎节。每个插枝取自原始转化体(母本植物)并浸入生根激素粉(吲哚-3-丁酸，IBA)中。随后将插枝置于生物圆顶室内的绿洲楔块中。取母本植物在温室中至成熟，并收获种子。同时还取野生型插枝以充当阴性对照。将插枝在生物圆顶室中保持5-7天并且随后移栽至3英寸花钵并且随后在生长室再适应两天。随后，将插枝转移至温室，适应大约4天，并且随后进行喷雾处理：0至200g ai/ha苯嘧磺草胺+1％MSO和/或25-200g ai/ha trifludimoxazine加1％MSO。其它除草剂也以相似方式进行了测试以验证交叉抗性：丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、治草醚(bifenox)、甲磺草胺(sulfentrazone)、和光合作用抑制剂敌草隆(diuron)(作为阴性对照)。在处理后2、7、14和21天评价除草剂损伤。结果显示在表20。
评分 存活植物的表型(植物毒性)
1 无明显损伤(无植物毒性)
2 小量的叶损伤，植物将存活
3 中等量的叶损伤，植物将存活
4 严重量的叶损伤，植物将存活
5 无存活植物——所有植物死亡/正在死亡
下列给出了上述测定的损伤分值的定义
分值损伤描述
0 无损伤
1 极小损伤，仅几块叶损伤或萎黄
2 极小损伤，有略微较强的萎黄。总体生长点未被破坏
3 在次生叶组织上略微较强的损伤，但是初生叶和生长点未被破坏。
4 整体植物形态轻微改变，在次生生长点和叶组织中一些萎黄和坏死。茎完整。在1周内高度可能再生长。
5 整体植物形态明显不同，在一些叶和生长点上有一些萎黄和坏死，但是初生生长点完整。茎组织仍为绿色。在1周内高度可能再生长。
6 在新的小叶生长上可以观察到强损伤。植物具有高度可能性会在不同生长点仅通过再生长而存活。大多数叶子萎黄/坏死，但是茎组织仍然是绿色的。可能具有再生长，但是具有显著的损伤外观。
7 大多数活的生长点坏死。可能有单个生长点，所述生长点能存活并且可以是部分萎黄或绿色的并且部分坏死。二叶仍然是萎黄的，有一些绿色；包括茎在内的植物的剩余部分坏死。
8 植物将很可能死亡，且全部生长点坏死。一叶可仍然是萎黄的，具有一些绿色。植物的剩余部分坏死。
9 植物死亡。
*未测试
实施例14：烟草叶中的瞬时蛋白质表达
如先前所述(Voinnet O.等，2003，The Plant Journal 33,949-956)，进行嵌合多肽序列(例如SEQ ID NO:112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,136,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623或624)的瞬时表达。简言之，如实施例5所述进行GOI的克隆和农杆菌转化(菌株：GV2260)。用带有含由启动子和终止子序列控制的GOI基因的双元载体构建体的转基因农杆菌悬浮液(OD600为1.0)浸润本氏烟草(Nicotiana benthamiana)幼叶。在浸润48小时至72小时后，将打孔的叶盘(直径0.75cm)转移到具有含不同浓度的目的除草剂的培养基(半强度Linsmaier-Skoog(Linsmaier和Skoog(1965)Physiol.Plant.18：100-127)营养液或者水)的6孔板中。将多孔板在22℃，75％相对湿度和110μmol Phot*m-2*s-1的生长室中以14：10h光照：黑暗光周期培育。
实施例15：瞬时转化的烟草叶盘的除草剂耐受性的证实
将如实施例14所述产生的表达由GOI编码的蛋白质的叶盘进行对除草剂处理的提高的耐受性分析。为了分析除草剂损伤，将叶绿素荧光确定为指示性标记(Dayan和Zaccaro(2012)Pest.Biochem.Physiol.102：189-197)。除了通过视觉检测来监测除草剂效果之外，在开始除草剂处理48小时之后，使用MAXI成像PAM仪(IMAGINE-PAM M-Series，Walz，Effeltrich，Germany)进行光系统II的光合产量检测。根据制造商的说明测量PSII产量。基于转化的与空载体转化的叶盘的PSII产量抑制的IC50值来计算耐受系数。用苯嘧磺草胺或trifludimoxazine处理48小时的空载体转化的叶盘中PSII产量抑制的IC50值分别测量为1.1*10-7M或1.1*10-8M。

Claims (22)

1.重组的嵌合核酸分子，其包含编码双转运肽的核酸序列，所述编码双转运肽的核酸序列有效连接至编码目的多肽的异源核酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述双转运肽来自苋属(Amaranthus)。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述双转运肽来自看麦娘属(Alopecurus)。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述双转运肽包含SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98的氨基酸序列、或其变体或片段。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其中所述异源目的多肽是一种多肽，当其在植物中过量表达时，赋予所述植物除草剂耐受性。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中所述异源目的多肽来自原核生物。
7.根据权利要求5或6所述的核酸分子，其中所述多肽具有PPO活性并赋予对PPO抑制性除草剂的耐受性。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其中具有PPO活性的所述多肽包含SEQ ID NO:137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,511,512,513,514,515,516,517,518,519,520,521,522,523,524,525,526,527,528,529,530,531,532,533,534,535的序列、或其变体或片段。
9.表达盒，其包含有效连接至驱动在植物中表达的启动子的权利要求1至8中任一项所述的核酸分子。
10.植物细胞，其包含权利要求9所述的表达盒。
11.植物或植物部分，其包含权利要求10所述的植物细胞。
12.种子，其衍生自权利要求11所述的植物。
13.在植物中表达编码目的多肽的核酸的方法，包括(a)将权利要求1至7中任一项所述的核酸分子或权利要求8所述的表达盒引入植物细胞中，和(b)从其再生植物，所述植物包含权利要求1至8中任一项所述的核酸分子或权利要求9所述的表达盒。
14.产生除草剂耐受性植物的方法，包括(a)将权利要求1至8中任一项所述的核酸分子或权利要求9所述的表达盒引入植物细胞中，和(b)从其再生植物，所述植物包含权利要求1至8中任一项所述的核酸分子或权利要求9所述的表达盒。
15.控制植物栽培场所不希望的植被的方法，该方法包括以下步骤：
a)在该场所提供除草剂耐受性植物，所述除草剂耐受性植物包含权利要求1至8中任一项所述的核酸分子或权利要求9所述的表达盒；
b)向该场所应用有效量的除草剂，
其中所述除草剂的有效量不杀死或抑制a)的除草剂耐受性植物的生长。
16.在控制权利要求11所述的植物附近的杂草的同时生长所述植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)生长所述植物；和
b)将包含PPO抑制性除草剂的除草剂组合物应用于所述植物和杂草，
其中所述除草剂在该除草剂抑制相应野生型植物生长的水平通常抑制原卟啉原氧化酶。
17.用于杂草控制的组合，包含(a)权利要求1至8中任一项所述的核酸分子，该多核苷酸能够在植物中表达，从而对该植物提供PPO抑制性除草剂的耐受性；和(b)PPO抑制性除草剂。
18.制备用于杂草控制的组合的方法，包括(a)提供权利要求1至8中任一项所述的核酸分子，该核酸分子能够在植物中表达，从而对该植物提供PPO抑制性除草剂的耐受性；和(b)提供PPO抑制性除草剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述提供核酸分子的步骤包括提供含有所述核酸分子的植物。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述提供核酸分子的步骤包括提供含有所述核酸分子的种子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法还包括将PPO抑制性除草剂应用于该种子的步骤。
22.用于杂草控制的组合的用途，所述用于杂草控制的组合包含(a)权利要求1至8中任一项所述的核酸分子，该核酸分子能够在植物中表达，从而对该植物提供PPO抑制性除草剂的耐受性，和(b)PPO抑制性除草剂，用于在植物栽培场所控制杂草。
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