JPH09512178A - 色素体の２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体をコードするｄｎａ分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 色素体２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体、特にホウレンソウ（Spinaciaoleracea）から得られた色素体２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体、をコードするＤＮＡ分子、ならびに該ＤＮＡ分子を有する細菌、真菌、トランスジェニック植物細胞、およびトランスジェニック植物が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 色素体の２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体をコードするＤＮＡ分子 本発明は、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体のコード領域を含み、植物 ゲノムへ導入された場合に、トランスジェニック植物における窒素固定のための 炭素骨格の生産および輸送、ならびに同化された窒素の輸送に影響を与える、特 にホウレンソウ（Spinacia oleracea）由来のＤＮＡ分子に関する。本発明はさ らに、該ＤＮＡ分子を含むプラスミド、酵母および細菌に関し、また該ＤＮＡ分 子の導入によって、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の活性が変化し、そ れにより窒素および炭素の代謝が変化したトランスジェニック植物にも関する。 さらに、本発明は、光呼吸能が、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の活性 の変化による影響を受ける、トランスジェニック植物にも関する。本発明は、２ −オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体をコードする開示されたＤＮＡ分子を、低 厳格度ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲの手法によるスピナチアオレラシア （Spinacia oleracea）、その他の植物由来の関連輸送体の同定に用いることに も関し、また該２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体を、除草剤の標的として 用いることにも関する。 有機炭素化合物を還元的にアミノ化することによって、無機窒素（硝酸塩の窒 素）を（通常はアミノ酸の形態で）有機的に固定された窒素へと大規模に転換で きるのは、植物、細菌および酵母だけである。生命界の残余、特に、有用動物お よび人間は、有機窒素化合物の第一級供与者としての植物に依存している。有機 炭素への固定による植物における無機窒素の同化は、窒素、炭素骨格およびエネ ルギーの利用度に依存する。植物の窒素供給は、肥料によって影響されうる。窒 素同化のためのエネルギーは、光合成の明反応から、または根もしくはその他の 非緑色組織では異化から派生し、通常の野外の条件下では、限定要因にはならな い。 現今の知識によれば、２−オキソグルタル酸（α−ケトグルタル酸）は、グル タミンシンターゼ／グルタミン２−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ （ＧＯＧＡＴ）反応で還元された窒素の一次受容体である。この反応において、 グルタミンシンターゼによって還元された窒素（アンモニウム窒素）は、まず、 エネルギーの消費下でグルタミン酸に転移される。グルタミンが形成される。後 続の反応において、グルタミン酸オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ ＧＯＧＡＴ；グルタミン酸シンターゼ）は、還元等価体を消費しつつ、２−オキ ソグルタル酸へのグルタミンのアミノ基の転移を触媒する（アミノ基転移）。 グルタミンシンターゼ／ＧＯＧＡＴ反応の全反応系列が、植物色素体の基質に 局在する。これらの細胞小器官は、脂質二重層膜に囲まれており、その外膜は分 子ふるいの性格を有し、約１０kDの大きさまでの化合物に対しては透過性である ［FlueggeおよびBenz（1984）、FEBS Lett.、169：85〜89］。内側の膜は、水、 二酸化炭素、酸素および亜硝酸塩のような、より小さい何種類かの化合物には透 過性であるが、２−オキソグルタル酸のような、より大きい荷電分子には透過性 でない。グルタミンシンターゼ／ＧＯＧＡＴ反応の重要な化合物である２−オキ ソグルタル酸は、特異的な輸送体によって、植物細胞の細胞質ゾルから葉緑体包 膜の内膜を介して色素体の基質へと移送されなければならない。色素体への２− オキソグルタル酸の輸送は、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体を介して、 色素体からのリンゴ酸と引き換えに生じる。この過程で細胞質ゾルへと輸出され たリンゴ酸は、その基質特異性が２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体と近縁 である第二の輸送体、すなわちジカルボン酸輸送体によって、グルタミン酸と引 き換えに逆輸送される。その結果、両輸送体の系を介して循環するリンゴ酸の正 味の輸送を伴わずに、２−オキソグルタル酸が葉緑体へと輸入され、グルタミン シンターゼ／ＧＯＧＡＴ反応の最終産物であるグルタミン酸が輸出される（「二 重輸送体（double translocator）」、［Wooら（1987）、Plant Physiol.、84： 624〜632；Flueggeら（1988）、Planta、174：534〜541］）。グルタミン酸は、 一連のアミノ基転移反応、例えばアミノ酸のアラニンまたはフェニルアラニン等 の生合成における、植物の好適なアミノ基供与体である。更に、グルタミン酸は 、植物内で有機的に結合した窒素のための、重要な輸送形態である。アミノ酸、 核酸またはアルカロイドのような、植物における最も窒素を含有する化合物は、 それらの生合成経路のための一次アミノ酸供与体として、グルタミン酸を必要と する。 窒素同化に必要な２−オキソグルタル酸は、基本的には、細胞の細胞質におけ るクエン酸の転換によって合成される。より最近の出版物［Riesmeierら（1993 ）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:6160〜6164；Heinekeら（1994）、Planta、19 3：174〜180］は、光合成の炭素反応の有効性がとりわけ、葉緑体包膜の内膜に 局在する輸送体が触媒する、還元され、有機的に結合された、形成された炭素（ トリオースリン酸）の輸出に、実質的に制限されることを示している。したがっ て、炭素代謝において、この輸送体タンパク質が「隘路（bottle-neck）」であ る。色素体２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体は、窒素代謝において類似の 役割を果たしている。 このように、色素体２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体は、グルタミンシ ンターゼ／ＧＯＧＡＴ反応による窒素同化に充分な量の基質を供給する責務を負 うことから、植物の窒素代謝に枢要な役割を果たしている。したがって、この輸 送体の活性を操作することによって、おそらく、植物における窒素同化の有効性 に影響を与えることが可能である。 地球上の人間の大部分が、植物性食物に依存しなければならないため、これら の社会層におけるタンパク質の継続的な不充分な供給を招いていることから、有 機窒素化合物、特にタンパク質およびアミノ酸の含有量が増大した植物が緊急に 必要とされている。工業化された国々では、飼育動物へのタンパク質の供給を改 善するために、動物および魚類飼料が、ますます動物飼料に添加されている。よ り高いタンパク質含量を有する飼料植物は、ＢＳＥのような、特に動物飼料の摂 取から生じる問題を考慮すると、確実に、より良い代替策になるであろう。 輸送体をコードするＤＮＡ配列が入手できるならば、遺伝子工学的手法により 色素体２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の活性に影響を与えることが可能 であると思われる。従来は、このことは不可能であった。更に、２−オキソグル タル酸／リンゴ酸輸送体をコードするＤＮＡ配列が提供されることにより、該輸 送体を特異的に阻害し、したがって除草剤として用いることができる物質の同定 が可能になるであろう。 現在、上記の基質特異性を有する輸送体タンパク質の配列は、ウシ心臓のミト コンドリア、およびヒトのミトコンドリアからのみ公知であるにすぎない［Runs wickら（1990）、Biochemistry、29：11033〜11040；Iacobazziら（1992）、DNA Seq.、3（2）：79〜88］。これらの輸送体は、ミトコンドリアのジカルボン酸 代謝（とりわけリンゴ酸／アスパラギン酸シャトル、オキソグルタル酸／イソク エン酸シャトル）に必須の役割を果たし、密接に関係し合うミトコンドリア代謝 物輸送体の一族に属している。例えば、ミトコンドリアの担体（リン酸／ＯＨ^- 、ＡＤＰ／ＡＴＰ、オキソグルタル酸／リンゴ酸等）は、配列の近縁性、および 分子内反復の存在を特徴とする。更に、２−オキソグルタル酸の担体だけでなく 、ほとんどのミトコンドリアの担体に関して、その細胞内小器官へと指向させる プレ配列（標的化配列）なしにミトコンドリア膜に組み込まれることが示されて いる［Runswickら（1990）、Biochemistry、29：11033〜11040］。したがって、 標的化の情報は、成熟担体タンパク質に含まれていると想定できる。すなわち、 植物におけるミトコンドリアジカルボン酸輸送体の過剰発現は、色素体包膜を介 したオキソグルタル酸輸送の増大ではなく、望ましくない効果であるミトコンド リアジカルボン酸輸送の増大のみを招くにすぎないと考えられる。 上記とは反対に、色素体包膜の内膜のタンパク質は、それらを色素体へと特異 的に指向させるプレ配列を必要とする［総説論文：Keegstraら（1989）、Annu． Rev．Plant Physiol．Plant Mol．Biol.、40：471〜501；Lubbenら（1988）、Ph otosynth．Res.、17：173〜194；Fluegge（1990）、J．Cell Sci.、96：351〜35 4］。「色素体の標的化」に必要なプレ配列に加え、色素体基質またはチラコイ ド膜への包膜を介した包膜タンパク質の輸送を阻害する、色素体包膜タンパク質 の成熟部分（特異的プロテアーゼによるプレ配列の開裂後に残存するタンパク質 の部分）に、更なる情報が存在する［本発明者、未発表の所見；Liら（1992）、 J．Biol．Chem.、267：18999〜19004］。現在まで、従来公知の包膜の内膜タン パク質の成熟部分において、この情報を正確に定位することは、不可能であつた ［３７kDタンパク質：Dreses.Werringloerら（1991）、Eur．J．Biochem.、195 ：361〜368；トリオースリン酸／リン酸輸送体：Flueggeら（1989）、EMBO J． 、８：39〜46；Willeyら（1991）、Planta、183：451〜461；Fischerら（1994） 、Plant Jour．、5（2）：215〜226；Ｃａ²⁺ＡＴＰアーゼ：Huangら（1993）、P roc．Natl．Acad．Sci．USA、90：10066〜10070］。ミトコン ドリアの担体であるＡＤＰ／ＡＴＰ輸送体で実施した本発明者ら自身の研究は、 このタンパク質が、葉緑体に指向することも、そこで包膜の膜に組み込まれるこ とも、全くか、または非常に無効果的にしかできないことを示した。クロロ色素 体プレ配列（葉緑体標的化のための情報を有する）および該ミトコンドリア担体 を含むハイブリッドタンパク質でさえ、真正タンパク質と比較して、葉緑体包膜 への組込みにおいて僅かな増大を示したにすぎない（未発表の所見）。正確な挿 入にはタンパク質／脂質相互作用が重要であること、およびクロロ色素体包膜の 膜は、ミトコンドリアのそれとはその脂質組成が根本的に異なることから［Joya rdら（1991）、Eur．J．Biochem.、199：489〜509］、ミトコンドリアタンパク 質の挿入は、たとえ小型のものであっても、機能的であると思われること、すな わち他の細胞小器官からの輸送体は、その機能に対応する配座および配向で、葉 緑体包膜の膜に何とか組み込めることは、非常に起こりそうもない。 したがって、現在の技術状況では、公知の色素体標的化配列を用いることによ って、例えばミトコンドリアまたは原核生物のジカルボン酸輸送体を、葉緑体包 膜の内膜に機能的に組み込むことは、不可能である。現在の技術状況では、真正 の色素体２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体をクローニングすることによっ て、上記の植物の構成に必要とされるＤＮＡ配列を達成することの方が有望であ る。 しかし、このクローニングは、ミトコンドリアジカルボン酸輸送体由来のプロ ーブを用いる、植物ｃＤＮＡライブラリーの低厳格度のスクリーニングにより実 施することはできない。現時点での知見によれば、クロロ色素体輸送体は、たと えそのタンパク質が匹敵する機能を有していても、他の系（細菌、ミトコンドリ ア）からのあらゆる輸送体と完全に異なる一次配列を有する。そのため、２−オ キソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の生化学的な特徴付け、精製および単離の経路 を辿らなければならず、それは、膜タンパク質では極めて困難である。葉緑体包 膜の内膜の成分としての、45,000ダルトンの見かけ分子量を有する輸送体タンパ ク質の同定は、今では可能となった［MenzlaffおよびFluegge（1993）、Biochim ．Biophys．Acta、1147：13〜18］。しかし、記載された精製手順は、このタン パク質のＮ末端が遮断されており、そのために自動化エドマン分解によるＮ末端 タンパク質配列決定に利用できないことが判明したため、タンパク質配列決定に 充分な量のタンパク質を生産するのに適していない。そのため、色素体２−オキ ソグルタル酸／リンゴ酸輸送体をコードするＤＮＡ分子を、アミノ酸配列から出 発して単離することは、これまでは不可能であった。 それ故、本発明の根底にある課題は、その利用が、増加した量の有機窒素化合 物を合成できるように植物を改質することを可能にする、方法およびＤＮＡ分子 を提供することである。具体的には、本発明の根底にある課題は、色素体２−オ キソグルタル酸／リンゴ酸輸送体をコードするＤＮＡ分子を提供することである 。 この課題は、請求の範囲で特徴付けられる態様の提供によって解決される。 それ故、本発明は、植物細胞における導入および発現に際してリボ核酸の形成 に導き、該リボ核酸を介しての該細胞への２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送 体活性の導入を可能にするか、または内在性２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸 送体活性を抑制する、ヌクレオチド配列に情報が含まれている色素体２−オキソ グルタル酸／リンゴ酸輸送体をコードするＤＮＡ分子に関する。 本発明は、特に、配列番号１に示したアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドするＤＮＡ分子、ならびに配列番号１に示したコード領域を含むＤＮＡ分子に も関する。更に、本発明の前記ＤＮＡ分子とハイブリダイズするＤＮＡ分子、お よびその配列が遺伝暗号の結果として縮重している、２−オキソグルタル酸／リ ンゴ酸輸送体活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子にも関する。本発 明のもう一つの主題は、上記のＤＮＡ分子に相補的であるＤＮＡ分子、ならびに 例えば挿入、置換または欠失によって誘導され、かつ２−オキソグルタル酸／リ ンゴ酸輸送体をコードする、本発明による前記ＤＮＡ分子のフラグメントおよび 誘導体である。 本明細書における用語「ハイブリダイゼーション」は、例えばサンブルック（ Sambrook）ら（1989、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.、Col d Spring Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク州Cold Spring Harbor） に記載のような通常の条件下でのハイブリダイゼーション、好ましくは厳格な条 件下（サンブルックら（上記）に記載のものと同様の）でのハイブリダイゼー ションを意味すると理解される。 本発明のＤＮＡ分子（またはこれらの分子の誘導体もしくは一部）は、原核ま たは真核生物系におけるＤＮＡ配列の組換えによる、突然変異誘発または配列変 更を可能にし、それによって２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の特異性の 変更を可能にするプラスミドへと導入できる。グルタミン酸に対する特異性を改 良し、それと同時にリンゴ酸塩に対する特異性を低下させる方向に、輸送体の特 異性を変化させることによって、グルタミン酸との直接交換における２−オキソ グルタル酸の輸送率をさらに改良するため、上記の「二重輸送体」系を改良する ことができた。また、特異的な除草剤に対する２−オキソグルタル酸／リンゴ酸 輸送体の不感受性も達成できた。塩基置換および／もしくは塩基欠失をもたらす ために、ならびに／または合成もしくは天然配列を付加するために、標準的手法 ［Sambrookら（1989）、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed．、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク州Cold Spring Harbo r］を用いることができる。ＤＮＡフラグメントの連結のために、アダプターま たはリンカーを用いることができる。その上、適切な制限部位を供給するか、ま たは不要なＤＮＡを削除する操作も用い得る。トランジションもしくはトランス バージョンのような挿入、欠失または置換が実施可能な場合は、インビトロでの 突然変異誘発、プライマー修復、制限または結合を用いることができる。解析に 有用な方法は、一般的には、配列解析、制限解析、ならびに分裂酵母における修 飾されたタンパク質の発現、および人工リポソームにおける変更された輸送特性 の測定（実施例４、およびLoddenkoetterら［（1993）、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA、90：2155〜2159；Fischerら（1994）、Plant Journal、5：215〜226］を 参照のこと）、またはこの目的のために本発明者らがつい最近考案した方法［Fl ueggeおよびWeber（1994）、Planta、194：181〜185］を用いる、トランスジェ ニック植物で発現させたタンパク質における変更された輸送特性の測定のような 、その他の生化学的分子生物学的方法である。 本発明によるＤＮＡ分子（またはこれらの分子の一部もしくは誘導体）は、２ −オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体または類似のジカルボン酸輸送体を同様に コードする類似のＤＮＡ分子を、標準的手法によって植物のゲノムから単離する のに用いることができる。特に有用な方法は、本発明によるＤＮＡ分子またはそ の一部をプローブとして用いる、ｃＤＮＡライブラリーの低厳格度ハイブリダイ ゼーションスクリーニング、または、ホウレンソウもしくはその他の植物の、Ｄ ＮＡもしくはｃＤＮＡを用いるＰＣＲ実験のための、本発明によるＤＮＡ分子の 配列から縮重および／または非縮重プライマーを誘導することによる、厳格度お よび低厳格度のスクリーニングという戦略のためのそのようなプローブの構成で ある。このＤＮＡ分子は、色素体包膜の膜の密接に関連するグルタミン酸−リン ゴ酸輸送体（ジカルボン酸輸送体）をコードするＤＮＡ分子を同定および単離す るのに用いることもできる（厳格度の条件を様々に変化させ、そして本発明によ るＤＮＡ分子の様々な領域をプローブとして用いた、ホウレンソウまたはその他 の植物由来のｃＤＮＡライブラリーのサブトラクションスクリーニング法）。 もう一つの態様において、本発明は、本発明によるＤＮＡ分子もしくはその一 部、または挿入、欠失もしくは置換によってこれらのＤＮＡ分子から誘導したそ の誘導体を、原核および真核細胞の形質転換に用いることに関する。形質転換し た細胞における２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の発現を保証するために 、本発明によるＤＮＡ分子をベクター、好ましくはプラスミドに導入し、原核ま たは真核細胞における発現に対する制御因子と結合することができる（実施例３ および５を参照）。そのような制御因子は、転写プロモーターまたは転写ターミ ネーターである。該ベクターは、形質転換された細胞において、色素体２−オキ ソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の合成を可能にする翻訳可能なメッセンジャーリ ボ核酸（ｍＲＮＡ）を発現させる目的で、または内在性２−オキソグルタル酸／ リンゴ酸輸送体の合成を阻害する翻訳不可能な逆配向の（アンチセンス）メッセ ンジャーリボ核酸を発現させる目的で、真核細胞を形質転換するために用いるこ とができる。この目的ために、本発明によるＤＮＡ分子の比較的短いフラグメン ト、または、配列が本発明によるＤＮＡ分子の配列との比較的高度の相同性（約 ６５％を超える相同性）を有するＤＮＡ分子を用いることもできる。同様に、内 在性ジカルボン酸輸送体の発現は、この目的で構成したリボザイムの発現によっ て、および本発明によるＤＮＡ分子を用いて阻害できる。 したがって、もう一つの態様において、本発明は、本発明によるＤＮＡ分子の 一つを含む組換えＤＮＡ分子、例えば、プラスミドｐＢｉｎＡＲ−２１１（ＤＳ Ｍ９２３９）、ｐＥＶＰ１１−２１１（ＤＳＭ９２３７）およびｐＢＳＣ−２１ １（ＤＳＭ９２３８）のようなプラスミドに関する。 特に、本発明の主題は、本発明によるＤＮＡ分子を、原核または真核細胞にお ける発現を可能にするＤＮＡ配列と結合した組換えＤＮＡ分子である。 もう一つの態様において、本発明は、本発明によるＤＮＡ分子、または本発明 による組換えＤＮＡ分子を有する細菌に関する。 更に、本発明は、本発明によるＤＮＡ分子のうちの一つのＤＮＡ配列がコード している２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の活性を有するタンパク質に関 する。好適なタンパク質は、双子葉または単子葉植物、特にアカザ科の植物、お よび特に好ましくはホウレンソウ（Spinacia oleracea）由来のタンパク質であ る。 そのようなタンパク質の生産は、例えば、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸 送体をコードする本発明によるＤＮＡ分子を、原核または真核細胞における転写 を確実に行うＤＮＡ配列と結合することで達成できる。次に、得られた組換え分 子を適切な原核または真核の宿主細胞に導入し、かつそこで発現することができ る。得られたタンパク質は、公知の方法に従って単離できる。色素体包膜の内膜 にタンパク質を局在させるシグナル配列を全く含まない、短縮したタンパク質を 発現することも可能である。 もう一つの好適な態様において、本発明は、植物細胞における２−オキソグル タル酸／リンゴ酸輸送体の発現のための、本発明によるＤＮＡ分子の使用に関す る。 植物の２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体をコードする本発明によるＤＮ Ａ分子に対応するＲＮＡを発現させることによって、植物の窒素代謝を変化させ ることが可能である。その経済的重要性は、細胞質ゾルから色素体への２−オキ ソグルタル酸の輸送の改良により、窒素化合物（アミノ酸、タンパク質、おそら くアルカロイド）に有利な、炭水化物（糖、澱粉、有機酸）および脂肪の比率の 変化がもたらされることである。このようにして、炭水化物および脂肪の含量の 低下を示すが、価値あるタンパク質をより多く含む植物を発生させることができ る。この変化は、植物の栄養価を高め、従ってそれらの経済的価値も高める。 双子葉および単子葉植物の遺伝的改質の方法は、既に知られている［Gasserお よびFraley（1989）、Science、244：1293〜1299；Potrykus（1991）、Ann．Rev ．Plant Mol．Biol．Plant Physiol．、42：205〜225］。植物におけるコード配 列の発現のためには、これらは転写調節因子に結合されていなければならない。 そのような因子は、プロモーターと呼ばれ、公知である［とりわけ、Koester.To epferら（1989）、Mol．Gen．Genet.、219：390〜396］。更に、コード領域は、 それらが正確に転写されるための転写終結シグナルを与えられなければならない 。そのような因子も既に記載されている［Gielenら（1989）、EMBO J．、８：23 〜29］。転写開始領域は、宿主植物に対して未変性または相同であることも、外 来性または異種であることもできる。終結領域は、自由に互換できる。転写の開 始および終結領域のＤＮＡ配列は、合成によって生成するか、もしくは天然の供 給源から得ることができ、または合成および天然ＤＮＡ成分の混合物を含むこと ができる。 高等植物への外来遺伝子の導入を準備するために、大腸菌に対する複製シグナ ル、および形質転換した細胞の選択を可能にするマーカーを有する非常に多くの 入手可能なベクターが存在する。ベクターの例は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系列、 Ｍ１３ｍｐ系列、ｐＡＣＹＣ１８４等である。植物への所望の遺伝子の導入の方 法によっては、更にＤＮＡ配列が必要になることもある。例えば、植物を形質転 換するのにＴｉまたはＲｉプラスミドを用いるならば、導入しようとする遺伝子 に、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの少なくとも右端を、しかし、しば しば右端および左端をフランキング領域として付加しなければならない。植物細 胞の形質転換にＴ−ＤＮＡを用いることは、徹底的に調査され、充分に記載され ている［Hoekema：「The Binary Plant Vector System」、Offsetdrukkerij Kan ters B.V社、オランダ国Ablasserdam（1985）、第５章にて；Fraleyら、Critic ．Rev．Plant Sci．、４：１〜46；Anら（1985）、EMBO J.、４：277〜288］。 導入されたＤＮＡは、一度ゲノムに組み込まれたならば、通常、そこで安定であ り、初めに形質転換された細胞の子孫に保存される。通常、それは、形質転換し た植物細胞に、カナマイシン、ブレオマイシンまたはヒグロマイシンのよう な生物致死剤または抗生物質に対する耐性を賦与する選択マーカーを有する。し たがって個別に導入されたマーカーが、導入ＤＮＡを欠く細胞について形質転換 した細胞の選択を可能にする。 植物宿主細胞にＤＮＡを導入するための多くの手法が、アグロバクテリアを用 いる形質転換以外にも存在する。これらの手法には、プロトプラストの形質転換 、ＤＮＡの微量注入法、電気穿孔法、および弾道法（ballistic methods）が包 含される。そうして、適切な選択培地中で、形質転換した植物材料から全植物体 が再生できる。このようにして得られた植物は、導入ＤＮＡの存在について慣用 の分子生物学の方法によって試験できる。これらの植物は、通常、生長させ、形 質転換された同じ遺伝的情報、または異なる遺伝的情報を有する植物と交雑する ことができる。得られる雑種の個体は、対応する表現型の特性を有する。 それ故、本発明は、本発明による組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック 植物細胞、ならびにこれらのトランスジェニック植物細胞から再生可能なトラン スジェニック植物、および本発明による植物細胞を含むトランスジェニック植物 に関する。これらの植物細胞および植物は、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸 送体の活性を有するタンパク質の発現、または２−オキソグルタル酸／リンゴ酸 輸送体の合成を阻害する翻訳できないＲＮＡ分子の発現を可能にするゲノムに組 み込まれた組換えＤＮＡ分子を含むことを特徴とする。更に、本発明は、本発明 によるトランスジェニック植物の種子に関する。 もう一つの態様において、本発明は、特に、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸 輸送体の構造−機能研究のための、真菌、例えば分裂酵母における本発明による ＤＮＡ分子の異種発現に関する（実施例３、４およびLoddenkoetterら（1993） ［Proc．Natl．Acad．Sci．USA、90：2155〜2159］）。それは、このタンパク質 に対する特異的阻害剤の開発へと導き得る。これに関連して、代謝に枢要な役割 を有するタンパク質の阻害は、その植物にとって必然的に致死性であると思われ ることから、除草剤の開発も着想できる。 したがって、本発明によるＤＮＡ分子（またはこれらの分子の一部、もしくは これらの分子の誘導体）は、こうしてベクターに導入され、真菌細胞、特に分裂 酵母における発現のための制御因子を備えることができる（実施例３を参照）。 ２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の導入は、組換え酵母細胞における２− オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の活性の実質的増大を招き、該活性は、人工 リポソーム中での再構成によって測定できる。これに関連して、ミトコンドリア は、その基質特異性において色素体と類似しているが、そのＤＮＡおよびアミノ 酸配列に関しては類似していない、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体を有 することを留意すべきである［Runswickら（1990）、Biochemistry、29：11033 〜11040］。組換え酵母細胞では、最高１００倍も高いリンゴ酸輸送活性を検出 できる。したがって、本発明によるＤＮＡ分子（またはこれらの分子の一部もし くは誘導体）を用いることによって、変更されたタンパク質含量を示すように酵 母細胞を改質することが想定できる。この目的のためには、植物からの色素体輸 送体の利点、すなわちそれが、融合酵母の内在性の調節および区画標的化の機序 に従わないことが、役立つことになると思われる。酵母細胞におけるリンゴ酸輸 送活性の記載された増大が、ミトコンドリア２−オキソグルタル酸輸送体の発現 によって可能にはならない可能性は、非常に高い。これらの菌株は、飼料産業に とっては、最高に重要になると思われる。 したがって、本発明は、本発明によるＤＮＡ分子または組換えＤＮＡ分子を有 する真菌細胞、特に酵母細胞にも関する。 本発明によるＤＮＡ分子は、コード領域に、細胞質内でリボソーム上で合成さ れたタンパク質を色素体へと特異的に指向させることができ、細胞のその他の膜 系における該タンパク質の出現を阻むための領域を有する。本発明によるＤＮＡ 分子がコードするタンパク質を色素体へと指向させるタンパク質領域は、該タン パク質の初めの１００アミノ酸内に局在し、該タンパク質の輸送機能には不要で あり、そして葉緑体包膜の膜への該タンパク質がうまく挿入された後に除去され る。この色素体標的化配列を、例えばミトコンドリアに対する既知の標的化配列 の一つと置き換えることによって、この輸送体タンパク質を真核細胞の別の膜系 へと指向させることができ、そこで各々の膜を通過する輸送特性を変化させるこ とができる可能性がある。同様に、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の色 素体標的化配列、特に成熟タンパク質の初めの１００アミノ酸、または内在性の 領域は、外来性タンパク質（例えば、膜を介した代謝物の能動もしくは受動輸送 を触媒するタンパク質、酵素、細菌の輸送タンパク質、または酵母からの輸送体 ）を植物細胞の色素体、特に色素体包膜の膜、色素体基質またはチラコイドへと 指向させるのに用いることができた。 1994年６月９日に、ブダペスト条約の規定に従い、ドイツ連邦共和国（Federa l Republic of Germany）ブルンスウィック（Brunswick）にある公認の国際寄託 機関である「Deutsche Sammlung von Mikroorganismen（ＤＳＭ）」［ドイツ微 生物コレクション（German collection of microorganisms）］に、下記のプラ スミドを表示された大腸菌株において寄託した： プラスミド ｐＢｉｎＡＲ−２１１ （ＤＳＭ９２３９） プラスミド ｐＥＶＰ１１−２１１ （ＤＳＭ９２３７） プラスミド ｐＢＳＣ−２１１ （ＤＳＭ９２３８） 図面の説明： 図１：酵母で発現させた組換え２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の輸送活 性の再構成。図は、Ｓ．ポンベ（S．pombe）の細胞膜を含有する再構成リポソー ムにおける［¹⁴Ｃ］リンゴ酸の取り込みを示す。 図２：プラスミドｐＥＶＰ１１−２１１（図２Ａ）およびプラスミドｐＢｉｎＡ Ｒ−２１１（図２Ｂ）のクローニングの模式図。 図３：葉緑体への２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体前駆タンパク質の標的 化、および包膜の内膜への成熟タンパク質のエネルギー依存性挿入。 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、実施例６に記載のとおりに実施し た： レーン１：インビトロで翻訳された前駆タンパク質 レーン２〜４：暗条件 レーン５〜９：明条件 レーン２：ＡＴＰ非存在下 レーン３：２mMＡＴＰ添加 レーン４：２mMＡＴＰ添加後、プロテアーゼ（１００μg／ml）で処理 レーン５：ＡＴＰ非存在下 レーン６：２mMＡＴＰ添加 レーン７：２mMＡＴＰ添加後、プロテアーゼ（１００μg／ml）で処理 レーン８：デカップリング剤（１０μM ＣＣＣＰ）添加 レーン９：２mMＡＴＰ添加；プロテアーゼ前処理の葉緑体（３０μg／ml）。 本発明の根底にある実施例の、より充分な理解のために、用いた方法のいくつ かを、より詳細に下記に説明する。 １．クローニング方法 クローニングには、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（ｐＢＳＣ）［Sh ortら（1988）、Nucl．Acids Res.、16：7583〜7600］と共にファージのラムダ ｇｔ１０を用いた。 酵母の形質転換には、ベクターｐＥＶＰ１１［RusselおよびNurse（1986）、C ell、45：145〜153］を用いた。 植物の形質転換には、遺伝子構成体をバイナリーベクターｐＢｉｎＡＲ［Hoef genおよびWillmitzer（1990）、Plant Sci.、66：221〜230］へとクローニング した。 ２．細菌および酵母の菌株 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（ｐＢＳＣ）ベクターならびにｐＥＶＰ１１およ びｐＢｉｎＡＲ構成体に対して、大腸菌株ＤＨ５α［Hanahanら（1983）、J．Mo l．Biol．、166：557〜580］およびＴＧ１［Gibson（1984）、博士論文、ケンブ リッジ大学、英国］を用いた。 タバコ植物体におけるｐＢｉｎＡＲ構成体の形質転換は、アグロバクテリウム ・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の菌株ＬＢＡ４４０４［Bev an（1984）、Nucl．Acids Res.、12：8711〜8720］を用いて実施した。 ３．アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換 アグロバクテリアへのＤＮＡの転移は、HoefgenおよびWillmitzer［（1988） 、Nucl．Acids Res.、16：9877］による方法に従い、直接形質転換によって実施 した。形質転換したアグロバクテリアのプラスミドＤＮＡは、バーンボイム（Bi rnboim）およびドリー（Doly）［（1979）、Nucl．Acids Res.、７：1513〜1523 ］による方法に従って単離し、適切な制限消化後に、正確度および配向について ゲル電気泳動によって分析した。 ４．植物の形質転換 １回の形質転換ごとに、タバコ無菌培養体の、サンドペーパーおよび外科用メ スで傷つけた小葉１５枚を、厳密に選択的に増殖させた、形質転換したアグロバ クテリウム・ツメファシエンスの一晩培養した物１００μlを含む、２％ショ糖 含有ＭＳ培地１０ml中に置いた。 混合物を１５分間穏やかに振盪した後、１．６％グルコース、２mg／ｌのゼア チンリボース、０．０２mg／ｌのナフチル酢酸、ジベレリン酸０．０２mg、５０ ０mg／１のベータバクチル（Betabactyl）（登録商標）、１５mg／ｌのハイグロ マイシン（Hygromycin）および０．８％バクトアガー（Bacto agar）を含有する ＭＳ培地上に葉を置いた。２５℃、３０００ルクスの光の強さで１週間インキュ ベーションした後、培地のベータバクチル（Betabactyl）濃度が半減した。 実施例は、本発明を例示する。 実施例１ ２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体のペプチドフラグメントの単離、および ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションによるスクリーニングのための プローブの調製 精製２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体タンパク質［MenzlaffおよびFlue gge（1993）、Biochim．Biophys．Acta、1,147：13〜18］を、調製用ＳＤＳポリ アクリルアミドゲル［Laemmli（1970）、Nature、227：680〜685］中で残存不純 物から分離し、硫酸銅（II）染色［Leeら（1987）、Anal．Biochem.、166：308 〜312］によるタンパク質の検出後に、ゲルから切り取り、エンドプロテイナー ゼＬｙｓＣ［EckerskornおよびLottspeich（1989）、Chromatographia、28：92 〜94］を用いてゲル基質中で消化した。得られたペプチドを、ゲルから溶出し、 ＨＰＬＣにより分離した。精製ペプチド分画のアミノ酸配列を、自動化エドマン 分解［Eckerskornら（1988）、Eur．J．Biochem.、176：509〜519］によって気 相中で決定した。これらのアミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチド配列を 、３つのペプチドのアミノ酸から誘導し、それぞれのオリゴヌクレオチドを、イ ンビトロでＤＮＡ合成によって調製した。プローブとして用いるため、オリゴヌ クレオチドキナーゼを用いて³²Ｐリン酸基を５’末端に付着させるこ とによって、オリゴヌクレオチドを放射能標識した。 実施例２ ホウレンソウからの２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体のクローニング 水耕栽培で増殖させたホウレンソウ植物体の若葉から、ポリＡ⁺ＲＮＡを単離 し、これを基本として、ベクターのラムダｇｔ１０［Flueggeら（1989）、EMBO J．、8：39〜46］中にｃＤＮＡライブラリーを構成した。このライブラリーの約 300,000のクローンを合成オリゴヌクレオチドでスクリーニングし、精製２−オ キソグルタル酸／リンゴ酸輸送体のエンドプロテイナーゼＬｙｓＣによるペプチ ドフラグメントに倣ってモデル化した（実施例１を参照）。標準的手法を用いて 、陽性に反応するクローンを精製し、精製プラークから増幅したファージＤＮＡ を調製した後に、ＥｃｏＲＩ制限消化によって、２−オキソグルタル酸／リンゴ 酸輸送体をコードする挿入断片を得て、上記オリゴヌクレオチドをプローブとし て用いるサザンブロット解析によって確認した。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ（ｐＢｓｃ）へのファージＤＮＡの挿入断片の再クローニングの後、ＤＮＡ配 列を決定することによって（ジデオキシ法：［Sangerら（1977）、Proc．Natl． Acad．Sci．USA、74：5463〜5467］）、クローンを分析し、このＤＮＡ配列から 、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の一次構造を推定した。ｃＤＮＡライ ブラリーをスクリーニングするのに用いたオリゴヌクレオチドまたはペプチドの 配列が復元できた。 実施例３ 分裂酵母シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における ホウレンソウからの２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の発現 ２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体をコードする挿入断片を含む上記プラ スミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳＣ）を、エンドヌクレアーゼＳａｌＩで 線状化し、得られた付着末端を酵素Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼで充当した。次い で、ＢａｍＨＩによるもう１回の制限消化によって、該挿入断片をベクターから 切り取り、電気泳動によって単離した。このようにして得たフラグメントを、酵 母発現ベクターｐＥＶＰ１１内に特定の配向で挿入し、これを、初めに、Ｓａｃ Ｉで線状化し、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼで末端を充当し、次いで、再びＢａｍ ＨＩで消化し（図２Ａも参照）、大腸菌内での構成体の増幅の後、ＬｉＣｌ／Ｐ ＥＧによって適格にしておいた［Itoら（1983）、J．Bact.、153：163〜168］ロ イシン合成を欠くＳ．ポンベ（S.pombe）細胞内で形質転換した。ｐＥＶＰ１１ −２１１構成体は、酵母細胞にロイシン欠乏培地における増殖能を酵母細胞に付 与することから、最少必須培地上での選択によって、ロイシン非存在下で形質転 換体を選択した。 実施例４ 組換え酵母系統におけるリンゴ酸輸送活性の測定 ｐＥＶＰ１１−２１１プラスミドを用いて形質転換した酵母細胞（図２Ａ、Ｓ Ｐ−ＤＣ３細胞を参照）を最少必須培地で、６００nmで１．０の光学密度まで増 殖させ、３０００ｘｇで５分間の遠心分離によって採集した。２分の１容量（細 胞を基準にして）のガラスビーズとの混合物を激しく振盪することによって、該 細胞を破裂させ、遠心分離（６００ｘｇで１分間）によって、ガラスビーズと細 胞砕片とを分離した。上清を０．５％（重量／体積）のトリトンＸ−１００の濃 度に調整し、等体積のリポソームを混合物に加え、得られたプロテオリポソーム を、液体窒素中で直ちに凍結した。該リポソームは、２００mMトリシンＮａＯＨ （pH７．６）、４０mMリンゴ酸塩および６０mMグルコン酸カリウムの存在下にお ける、４℃で１０分間のダイズリン脂質（２０mg／ml）の超音波処理によって、 予め調製しておいた。プロテオリポソームの解凍、および懸濁液の毎秒１０パル スでの超音波処理の後、１０mMトリシンＮａＯＨ（pH７．６）、１００mMグルコ ン酸ナトリウムおよび５０mMグルコン酸カリウムで平衡させておいた、セファデ ックスＧ−２５でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、該プロテオリポソ ームを周囲の培地から分離した。溶出したプロテオリポソームは、リンゴ酸輸送 活性を測定するのに用いた。測定は、メンズラフ（Menzlaff）および（Fluegge ）［（1993）、Biochim．Biophys．Acta、1147：13〜18］が記載した「阻害剤停 止（inhibitor stop）」法に従って実施した。 ｐＥＶＰ１１−２１１形質転換体中のリンゴ酸輸送活性を、２１１挿入断片を 含まないベクターｐＥＶＰ１１で形質転換した形質転換体のリンゴ酸輸送活性と 比較した。ｐＥＶＰ１１−２１１形質転換体におけるリンゴ酸輸送活性（タンパ ク質１mgあたりの輸送された¹⁴Ｃリンゴ酸塩のピコモル／時として測定される） は、ｐＥＶＰ１１対照形質転換体より１００倍高いことが判明した（図１）。更 に、組換え輸送体タンパク質は、葉緑体膜の真正タンパク質と比較して、同一の 輸送特性を示すことが立証できた。この知見を下表に示す。 実施例５ ２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体のコード領域の過剰発現のための構築体 による植物の形質転換 ホウレンソウ由来の２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体に対するｃＤＮＡ を挿入断片として含むベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２１１（ｐＢＳＣ−２ １１）（実施例２、図２Ｂを参照）から、ＥｃｏＲＶおよびＳｍａＩを用いた制 限消化によって、挿入断片を単離し、酵素ＳｍａＩで消化したベクターｐＢｉｎ ＡＲ中にクローニングした［HoefgenおよびWillmitzer（1990）、Plant Sci.、6 6：221〜230］。得られた構築体ｐＢｉｎＡＲ−２１１を大腸菌で増幅させた後 、構築体をアグロバクテリアに形質転換し、後者を、タバコおよびバレイショの 葉のセグメントに感染させるために用いた。 得られた形質転換体を、無傷の再配置されていないキメラ遺伝子の存在につい て、サザンブロット解析でスクリーニングした。「全葉再構成法（whole leaver econstitution method）」 ［FlueggeおよびWeber（1994）、Planta、194：181 〜185］を用い、リンゴ酸輸送活性、ならびにＣ／Ｎ比、光合成率、蒸散および 生長を、対照形質転換体（挿入断片なしのベクターｐＢｉｎＡＲで形質転換）と 比較して検討した。 実施例６ 葉緑体に対する２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体前駆タンパク質の標的化 、および包膜内膜への成熟タンパク質のエネルギー依存性挿入 ＳｍａＩを用いて線状化したプラスミドｐＢＳＣ−２１１のインビトロでの転 写を、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用い、製造者（Pharmacia）の指示に従って実 施した。その後のインビトロでの翻訳は、網状赤血球溶解液（Boehringer-Mannh eim）中で実施した。リボソーム後（postribosomal）の上清を、無傷のホウレン ソウ葉緑体におけるタンパク質輸送に用いた。実験は、暗所および明所で実施し 、調製物は、輸入緩衝液［Flueggeら（1989）、EMBO J．、８：39〜46］、無傷 のホウレンソウ葉緑体（クロロフィル２００mgに相当）、および図３に対する凡 例に示した各種添加物を含有した（全体積：３００ml）。２５℃で１５分後、葉 緑体を洗浄し、包膜の膜を単離した［Flueggeら（1989）、EMBO J．、８：39〜4 6 ］。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動［Laemmli（1970）、Nature、227： 680〜685］、およびその後の蛍光光度法［BonnerおよびLaskey（1974）、Eur．J ．Biochem.、46：84〜88］でそれらを解析した（図３）。レーン１は、インビト ロで翻訳された前駆タンパク質（ｐ）を示し、レーン２〜４は暗条件、レーン５ 〜９は明条件である。すべての条件下で、２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送 体の存在は、付着した成熟タンパク質をその標的膜、すなわち葉緑体包膜の内膜 へと正確に指向させ、それを輸入過程の間に特異的プロテアーゼによって裂開し 、成熟タンパク質（ｍ）が形成される。暗所では、輸送体の挿入は、ＡＴＰの付 加によってエネルギーが供給される（レーン３および４）。ＡＴＰ非存在下では （レーン１）、輸入は全く観察されない。明所では、タンパク質の輸入のための エネルギーは、光合成のリン酸化によってＡＴＰの形態で供給されることができ 、これらの条件下での輸入は、外在ＡＴＰに依存しない（レーン５）が、外部か ら添加されたＡＴＰによって上昇しうる（レーン６）。光合成のリン酸化、およ びその結果のＡＴＰ生産が、ＣＣＣＰのようなデカップリング剤の添加によって 阻まれるならば、タンパク質輸入は遮断される（レーン８）。成熟タンパク質は 、内膜に組み込まれて存在し、包膜外膜を透過できないプロテアーゼ（例えばサ ーモリジン）の添加は、内膜に組み込まれた成熟タンパク質に作用できない（レ ーン４および７）。プロテアーゼ（例えばサーモリジン）による葉緑体の前処理 は、輸送体の結合および輸入の完全な欠如へと導く（レーン９）。これは、輸送 体のプレ配列（標的化配列）が第一段階で外膜に局在する受容体に特異的に結合 する必要があることを示す。それが行われた場合にのみ、その後のタンパク質挿 入の段階に至ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号１に示したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ ＮＡ分子； （ｂ）配列番号１に示したコード領域を示すＤＮＡ分子； （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡ分子とハイブリダイズするＤＮＡ分 子； （ｄ）配列が（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡ分子の配列と比較し て遺伝コードの結果として縮重しているＤＮＡ分子；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載の分子に相補的であるＤＮ Ａ分子、 からなる群より選択される色素体２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体をコー ドするＤＮＡ分子。 ２．請求の範囲１記載のＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子。 ３．請求の範囲１記載のＤＮＡ分子が、原核細胞または真核細胞における転写を 確実に行うＤＮＡ配列と結合している、請求の範囲２記載の組換えＤＮＡ分子。 ４．２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の活性を有するタンパク質をコード する翻訳可能なｍＲＮＡの発現を確実に行う、請求の範囲３記載の組換えＤＮＡ 分子。 ５．アンチセンス効果またはリボザイム活性によって一つもしくは複数の２−オ キソグルタル酸／リンゴ酸輸送体の合成を阻害する翻訳不可能なＲＮＡの発現を 確実に行う、請求の範囲３記載の組換えＤＮＡ分子。 ６．変化した特異性を有する色素体ジカルボン酸輸送体の発現を確実に行う、請 求の範囲３記載の組換えＤＮＡ分子。 ７．大腸菌株ＴＧ１ ｐＢＳＣ−２１１でＤＳＭ９２３８として寄託されたプラ スミドｐＢＳＣ−２１１。 ８．大腸菌株ＴＧ１ ｐＥＲＰ１１−２１１＊でＤＳＭ９２３７として寄託され たプラスミドｐＥＶＰ１１−２１１。 ９．大腸菌株ＴＧ１ ｐＢｉｎＡＲ−２１１でＤＳＭ９２３９として寄託された プラスミドｐＢｉｎＡＲ−２１１。 １０．請求の範囲１記載のＤＮＡ分子、請求の範囲２〜６のいずれかに記載の組 換えＤＮＡ分子、または請求の範囲７〜９のいずれかに記載のプラスミドを有す る細菌。 １１．請求の範囲１記載のＤＮＡ分子、請求の範囲２〜６のいずれかに記載の組 換えＤＮＡ分子、または請求の範囲８記載のプラスミドを有する真菌。 １２．請求の範囲２〜６のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子、または請求の範 囲９記載のプラスミドを有するトランスジェニック植物細胞。 １３．請求の範囲１２記載の植物細胞から再生可能であるか、または請求の範囲 １２記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。 １４．請求の範囲１記載のＤＮＡ分子がコードする色素体２−オキソグルタル酸 ／リンゴ酸輸送体の活性を有するタンパク質。 １５．ジカルボン酸輸送体、特に２−オキソグルタル酸／リンゴ酸輸送体または グルタミン酸／リンゴ酸輸送体、の生物学的活性を有するポリペプチドをコード するＤＮＡ分子を単離するための請求の範囲１記載のＤＮＡ分子の使用。 １６．該標的配列を用いることによって原核生物または真核生物のタンパク質を 色素体包膜の膜、プラスミド基質、またはチラコイドへと指向させるための標的 化配列として有用な、請求の範囲１記載のＤＮＡ分子またはその一部の使用。 １７．請求の範囲１記載のＤＮＡ分子または該分子の一部の使用であって、該一 部が、他の細胞区画または細胞膜系に対する標的化配列と組合せて、２−オキソ グルタル酸／リンゴ酸輸送体の生物学的活性を有する成熟タンパク質をコードす るコード領域を含み、それによって該成熟タンパク質が他の区画または膜系へと 指向させられる、使用。 １８．色素体包膜の内膜を介したジカルボン酸またはグルタミン酸の輸送に対す る阻害効果を有する物資を同定するための、請求の範囲１記載のＤＮＡ分子の使 用。