KR100290499B1 - 아미노산 트랜스포터의 dna 서열, 트랜스포터를 포함하는 플라스미드, 박테리아, 효모 및 식물, 및 그들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물 게놈 내로 도입되어 유전자전환 식물 내에서 대사 물질의 전달을 변화시키는 아미노산 트랜스포터의 코딩 영역을 함유하는 DNA 서열, 이들 DNA 서열을 함유하는 플라스미드, 박테리아, 효모 및 식물뿐만 아니라 그들의 용도에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
아미노산 트랜스포터의 DNA 서열, 트랜스포터를 포함하는 플라스미드, 박테리아, 효모 및 식물, 및 그들의 용도
[발명의 분야]
본 발명은 식물 게놈 내로 도입되어 유전자전환 식물 내에서 대사 물질의 전달을 변화시키는 아미노산 트랜스포터의 코딩 영역을 함유하는 DNA 서열, 이들 DNA 서열을 함유하는 플라스미드, 박테리아, 효모 및 식물뿐만 아니라, 그들의 용도에 관한 것이다.
많은 식물 종에 있어서, 세포벽을 통하여 에너지가 풍부한 화합물을 사관부로 전달하는 것이 세포 전체를 통하여 일어난다는 것은 공지되어 있다. 식물 세포 벽을 통하여 아미노산을 침투시키는 트랜스포터 분자는 공지되어 있지 않다.
박테리아의 경우에는, 다수의 아미노산 트랜스포터 시스템이 특성화되어 있다. 방향족 아미노산에 대하여 5 개의 상이한 트랜스포터가 공지되어 있으며, 이들은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 중 하나를 수송할 수 있는 반면, 다른 것들은 개별 아미노산에 대해 특이적이다(Sarsero et al., 1991, J Bacteriol 173: 3231-3234 참조). 수송 과정의 속도 상수는 특이적 수송이 덜 효과적임을 나타낸다. 몇 개의 트랜스포터 단백질에 대한, 상응 유전자가 클로닝되어 왔다. 이는 수송 결핍 변이체를 사용하여 달성되어 왔는데, 이 변이체는 발현 벡터 내의 삽입체로서의 DNA 단편으로 형질전환시킨 후 그들의 수송능에 대하여 선별하였다(Wallace et al., 1990, J Bacteriol 172: 3214-3220 참조). 변이체는 아미노산의 독성 유사체의 존재하에서 그들의 성장력으로 선별하였는데, 왜냐하면 변이체는 이들 아미노산 유사체를 흡수할 수 없으므로 손상을 받지 않기 때문이다.
상응하는 상보성(complementation) 연구를 진핵 효모, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하여 수행하여 왔다. 문헌(Tanaka ＆ Fink, 1985, Gene 38: 205-214)은 돌연변이의 상보성으로 동정된 히스티딘 트랜스포터를 기재하고 있다. 문헌(Vandenbol et al., 1989, Gene 83: 153-159)은 사카로마이세스 세레비지에의 프롤린 트랜스포터를 기재하고 있다. 효모는 프롤린에 대한 두 개의 상이한 퍼미아제(permeases)를 소유한다. 하나는 보다 낮은 효율로 수송하며 또한 기타 아미노산에도 사용될 수 있는 반면, 다른 하나는 프롤린-특이적이며 높은 친화도를 가지고 작용한다. 후자는 put 4유전자로부터 코딩되었다. 이것은 분자량 69 kDa의 펩티드에 대한 개방 판독 프레임(open reading frame)을 가진다. 단백질은 12 개의 막-침투(membrane-penetrating) 영역을 함유하지만, 분비를 위한 어떤 N-말단 신호 서열도 함유하지 않는다. 이것이 인테그랄(integral) 막 단백질의 일반적인 특성이다. 이 퍼미아제는 효모로부터의 아르기닌 퍼미아제 및 히스티딘 퍼미아제에 대해 상동성을 갖지만, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 프롤린 퍼미아제에 대해서는 그렇지 않다.
식물 세포에 있어서, 담배 현탁 배양액으로 연구한 결과, 아르기닌, 아스파라긴, 페닐알라닌 및 히스티딘의 수송이 pH 및 에너지에 의존한다는 것이 밝혀져 있다. 1000 배 과량의 류신이 다른 아미노산의 수송을 방해한다는 사실로부터, 모든 아미노산이 동일한 트랜스포터를 사용한다고 가정할 수 있다(McDaniel et al., 1982., Plant Physlo 69: 246-249). 문헌(Li and Bush, 1991, Plant Physlol 96: 1338-1344)은 베타 불가리스(Beta Vulgaris)의 세포막 소포체 내의 지방족, 중성 아미노산에 대한 두 개의 수송 시스템을 알아냈다. 알라닌, 메티오닌, 글루타민 및 류신이 트랜스포터 단백질 상에서 서로를 치환하는 반면, 다른 한편으로, 이소류신, 발린 및 트레오닌은 상호 경쟁 효과를 가진다. 혼합 경쟁 역학 연구(Li ＆ Bush 1990, Plant Physiol 94: 268-277)에서는, 4 개의 상이한 수송 시스템이 밝혀진 바 있다. 낮은 친화도를 가지고 작용하는 모든 중성 아미노산에 대한 트랜스포터 외에도, 이소류신, 트레오닌, 발린 및 프롤린에 대해서는 낮은 친화도를 갖는 높은 친화도형이 존재한다. 염기성 아미노산에 대한 것 뿐만 아니라 산성 아미노산에 대한 또 다른 트랜스포터가 존재한다.
식물 트랜스포터 단백질의 트랜스포터 분자 또는 유전자는 공지되어 있지 않다.
식물 아미노산 트랜스포터의 코딩 영역을 포함하며, 식물 게놈 중에 통합되어 뉴클레오티드 서열 내에 포함된 그의 정보가 RNA를 형성함으로써 신규의 아미노산 수송 활성이 식물 세포 내에 도입되거나 고유의 아미노산 트랜스포터 활성이 발현될 수 있는 DNA 서열을 이제 기재한다.
아미노산 트랜스포터의 DNA 서열이라는 용어는, 예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 아미노산 트랜스포터를 코딩하는 cDNA 서열로 이해할 수 있다.
아미노산 트랜스포터의 코딩 영역의 동정은 효모 사카로마이세스 세레비지에의 특정 돌연변이체 내에서 발현시킴으로써, 트랜스포터 분자를 코딩하는 식물 DNA 서열의 단리를 가능케 하는 방법으로 수행된다. 이를 위하여, 식물 유전자 라이브러리로부터 단리하고자 하는 코딩 영역이 코딩하는 트랜스포터 분자의 대상이 되는 물질을 흡수할 수 없는 적절한 효모 변이체가 제공되어야 한다.
질소원으로서 프롤린 또는 시트룰린만이 존재하는 배지에서는 성장할 수 없는 돌연변이체는 문헌(Jauniaux et al., 1987, Eur J Biochem 164:601-606)에 의하여 개시되어 있다.
식물 아미노산 트랜스포터를 동정하는 데에 사용할 수 있는 효묘 균주를 제조하기 위해서는, 유일한 질소원으로서 프롤린 및(또는) 시트룰린만이 있는 배지에서는 성장할 수 없는 효모 돌연변이체를, 예를 들어, 삽입체로서 아라비돕시스 탈리아나로부터 얻은 cDNA 라이브러리의 cDNA 단편을 함유한 pFL 61 플라스미드를 사용하여 형질전환시킨다.
또한, 히스티딘 합성(his 4) 및 히스티딘 흡수(his 1)에 결함이 있는 이중 돌연변이체 JT16(Tanaka ＆ Fink, 1985, Gene 38:205-214)를 상기한 pFL 61 플라스미드를 사용하여 형질전환시키고, 히스티딘을 가한 배지 중에서 배양한다.
놀랍게도 효모 세포의 형질전환 도중에, 특정 식물 cDNA 단편이 효모 변이체를 상보할(complement) 수 있다는 것이 지금에 와서야 밝혀졌다. 이러한 cDNA로 부터 코딩된 단백질의 성질을 분석함으로써, 이러한 변이의 상보 현상은 광범위한 특이성 스펙트럼을 갖는 식물 아미노산 트랜스포터를 코딩하는 코딩 영역에 기인함을 알 수 있을 것이다(실시예 3 참조).
이러한 아미노산 트랜스포터의 코딩 영역은, 예를 들어, 하기의 뉴클레오티드 서열 중의 하나로 표시된다:
1. 서열(서열 번호 1)
2. 서열(서열 번호 2)
예를 들어, 서열 번호 1 및 서열 번호 2와 같은, 형질전환된 효모 균주의 도움으로 동정된 본 발명의 DNA 서열은 플라스미드 내로 도입될 수 있고, 그렇게 함으로써 진핵 세포 내의 발현을 위한 조향 인자(steering element)들과 결합될 수 있다(실시예 4 참조). 이들 조향 인자들은 한편으로는 전사 프로모터이며, 다른 한편으로는 전사 종결 서열이다. 세포 내에서 아미노산 트랜스포터의 합성을 가능하게 하는 번역 가능한 mRNA를 발현시킬 목적으로, 또는 세포 내에서 고유 아미노산 트랜스포터의 합성을 방해하는 번역 불가능한 RNA를 발현시킬 목적으로, 이 플라스미드를 사용하여 진핵 세포를 형질전환시킬 수 있다. 식물 아미노산 트랜스포터에 대한 본 발명 서열에 상응하는 RNA의 발현에 의하여, 식물의 아미노산 대사의 변화뿐 아니라, 총 질소 대사를 변화시키는 것이 가능한데, 이의 경제적 중요성은 명백하다. 질소는 성장 제한의 주된 원인이 되는 영양소이다. 배의 생존 능력뿐만 아니라, 종자의 발아능은 저장 조직 내의 질소 함량에 직접적으로 의존한다. 단백질 함량이 높은 고단백 식료의 생성은 충분한 질소의 공급에 의존한다. 질소는 본질적으로 아미노산의 형태로 수송된다. 따라서 그들의 수확부로의 아미노산 수송능을 개선하는 것은 농경 식물의 수율 증가를 유도할 것이다. 개개의 기관에서 아미노산의 흡수를 촉진시킬 수 있는 가능성은, 예를 들어, 전분을 생산하기 위해 재배되는 감자에서와 같이, 이용 공정의 요구에 따라 질소를 거의 함유하지 않는 기관의 질적 개선을 가능케한다. 이외에도 개개의 조직, 예를 들어, 잎의 성장은 둔화되는 반면 수확부의 생장은 증가되는 식물 전체적 변화가 가능하다. 이러한 관점에서, 저장 물질의 형성 증가를 유도하는 작물 영양기의 연장을 생각할 수도 있다.
쌍자엽 식물 및 단자엽 식물의 유전자 변화를 위한 방법은 예를 들어 이미 문헌(Gasser, C. S., Fraley, R. T., 1989, Science 244: 1293-1299; Potrykus, 1991, Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol 42: 205-225)에 공지되어 있다. 식물 내의 발현을 위하여, 코딩 서열은 전사 조절 인자(element)와 결합되어야 한다. 프로모터로 불리는 이러한 인자가 공지되어 있다(유럽 특허 제375091호).
또한, 코딩 영역에는 그들이 정확하게 전사될 수 있는 전사 종결 신호가 제공되어야 한다. 이러한 인자는 또한 문헌(Gielen et al., 1989, EMBO J 8: 23-29)에 기재되어 있다. 전사 개시 영역은 숙주 식물에 대하여 내생적 및(또는) 동종성일뿐 아리라, 외래적 및(또는) 이종성일 수 있다. 필요에 따라서, 종결 영역은 서로 상호교환적일 수 있다. 전사 개시 및 종결 영역의 DNA 서열은 합성되거나, 천연적으로 얻을 수 있거나, 또는 합성 및 천연 DNA 구조물의 혼합물로부터 얻을 수 있다. 고등 식물 내에 외래 유전자를 도입하기 위하여, 이. 콜라이(E. coli)에 대한 복제 신호 및 형질전환된 세포를 선별케 하는 마커를 포함하는 다수의 클로닝 벡터가 이용가능하다. 이러한 벡터의 예로는 pBR 322, pUC-시리즈, M13 mp-시리즈, pACYC 184 등이 있다. 식물 내에 목적하는 유전자를 도입하는 방법에 따라, 기타 DNA 서열이 적절할 수 있다. 예를 들어, 식물 세포의 형질전환을 위하여 Ti- 또는 Ri-플라스미드를 사용하는 경우에, Ti- 및 Ri-플라스미드 T-DNA의 적어도 우측 경계, 그러나 종종 우측 및 좌측 경계 모두가, 플랭킹(flanking) 영역으로서, 도입되는 유전자에 부착된다. 식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 용도는 깊이 연구되어 왔으며, 문헌 [유럽 특허 제120 516호(Hoekama, In: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij kanters B.V. Alblasserdam, (1985), Chapter V; Fraley et at., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46 및 An et al., (1985) EMBO J. 4: 277-287]에 잘 기재되어 있다. 일단 도입된 DNA가 게놈 중에 통합되면, 대체로 게놈내에서 안정하며 또한 원래 형질전환된 세포의 자손 내에서도 유지된다. 도입된 DNA는 통상 형질전환된 식물 세포에 카나마이신(kanamycin), G. 148, 블레오마이신(bleomycin), 히그로마이신(hygromycin) 또는 포스피노트리신(phosphlnotricin)등과 같은 살생물제 또는 항생제에 대하여 저항성을 유발하는 선별 마커(marker)를 함유한다. 따라서, 사용된 개개의 마커는 도입 DNA가 없는 세포로부터 형질전환된 세포를 선별케 하여야 한다.
식물 숙주 세포로의 DNA 도입을 위해서는, 아그로박테리아(Agrobacteria)를 사용한 형질전환 외에도 많은 다른 기술이 가능하다. 이러한 기술에는 원형질 융합법, DNA 미세주입법 및 전기천공법(electroporation), 그 외에도 탄도법(ballistic method) 및 바이러스 감염법 등이 포함된다. 형질전환된 식물 재료로부터, 선별을 위해 항생제 또는 살생물제를 함유한 적절한 배지에서 전체 식물체가 재생될 수 있다. 그 다음 여기서 얻어지는 식물에 대해 도입된 DNA가 존재하는지에 대해 시험할 수 있다. 주입법 및 전기 천공법에서는 플라스미드에 특별한 요건을 두지 않는다. 예를 들어, pUC-유도체와 같은 간단한 플라스미드가 사용될 수 있다. 그러나, 그러한 형질전환된 세포로부터 전체 식물체가 재생되어야 하는 경우에는 선별 가능한 마커 유전자의 존재가 필수적이다. 형질전환된 세포는 식물 내에서 통상적인 방식으로 성장한다[참조. Mccormick et al., (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84]. 이러한 식물은 정상적으로 성장할 수 있으며, 동일한 형질전환된 유전자 또는 상이한 유전자를 보유한 식물과 교배할 수도 있다. 여기서 얻어지는 잡종 개체는 상응하는 표현형 특성을 가진다.
또한 본 발명의 DNA 서열은 플라스미드 내로 도입되어 원핵 세포 중의 발현을 위한 조향 인자와 결합된다. 원핵 및 진핵 세포의 막 구조의 상당한 차이에도 불구하고, 박테리아에 의한 진핵 세포 아미노산 트랜스포터의 번역 가능한 RNA 서열의 형성은, 놀랍게도 원핵 세포가 이제 특정 기질에 대하여 특이성을 가지는 진핵 아미노산 트랜스포터를 이용할 수 있다는 것을 의미한다. 이는 트랜스포터 뿐만 아니라, 그의 기질의 특성을 연구하는 데에 사용할 수 있는 박테리아 균주 생성을 가능하게 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 플라스미드를 함유하는 박테리아에 관한 것이다.
본 발명의 DNA 서열은 또한 원핵 또는 진핵 시스템 중에서 DNA 서열의 재조합을 통한 돌연변이 유발 또는 서열 변화를 허용하는 플라스미드 내로 도입될 수 있다. 이 방법으로 아미노산 트랜스포터의 특이성이 변화될 수 있다. 이와 같이, 트랜스포터의 특이성은 변화될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 서열을 포함하며 원핵 및 진핵 세포의 형질전환에 사용할 수 있는 플라스미드의 유도체 또는 부분에 관한 것이다.
표준 방법(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA)을 사용하여, 염기 교환을 수행하거나 천연 또는 합성 서열을 부가할 수 있다. DNA 단편을 서로 결합시키기 위하여, 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)를 단편에 도입할 수 있다. 또한, 적절한 제한 효소 절단 위치를 제조하거나 과도한 DNA 또는 제한 효소 절단 위치를 제거하기 위하여 조작할 수 있다. 예를 들어, 천이(transition) 및 전환(transversion)과 같은 삽입, 결실, 또는 치환을 수행하고자 하는 경우 시험관 내 변이유발법, 프라이머 수복(primer repair), 제한효소법, 라이게이션법을 사용할 수 있다. 분석 방법에 있어서는, 통상적으로 서열 분석, 제한 효소 분석 및 기타 생화학 분자생물학적 방법을 사용할 수 있다. 각각의 조작후, 사용된 DNA 서열은 절단되어 다른 DNA 서열에 결합될 수 있다. 각각의 플라스미드 서열은 동일한 플라스미드 또는 상이한 플라스미드 내에서 클로닝될 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 서열의 유도체 또는 부분 및 플라스미드는 또한 원핵 및 진핵 세포의 형질전환을 위하여 사용될 수 있다. 또한, 아미노산 또는 기타 올리고사카리드 트랜스포터 분자도 코딩하는, 여러 종의 식물의 게놈 상의 유사한 서열을 단리시키기 위해 본 발명의 DNA 서열이 표준 방법에 따라 사용될 수 있다. 이러한 서열을 사용하여, 유전자전환 식물의 수송 과정을 변화시키는, 식물 세포의 형질전환을 위한 구조물을 제조할 수 있다.
연관된 DNA 서열을 확정하기 위해서는, 먼저 한 식물형 중의 유전자의 내용물 또는 한 식물형 내의 유전자의 발현을 나타내는 유전자 라이브러리를 제조하여야 한다. 전자는 게놈성 라이브러리인 반면, 후자는 cDNA 라이브러리이다. 이들로부터, 본 발명의 DNA 서열을 프로브로 사용하여 연관된 서열들을 단리할 수 있다. 일단 연관된 유전자가 동정되어 단리되면, 서열의 결정 및 이들 서열로부터 코딩된 단백질의 특성 분석이 가능하다.
본 발명의 기본을 이루는 실시예를 이해하기 위하여 이들 시험에 필수적이며 그 자체로서 공지된 모든 방법들을 먼저 열거한다:
1. 클로닝 방법
이. 콜라이 내에서 클로닝하기 위하여, 벡터 pBluescriptSK(Short et al., 1988, Nucl Acids Res 16: 7583-7600)를 사용하였다.
효모의 형질전환을 위하여, 벡터 pFL61(Minet ＆ Lacroute, 1990, Curr Genet 18: 287-291)을 사용하였다.
식물 형질전환을 위하여 이원형 벡터 pBIN-Hug 내의 유전자 구조물을 클로닝하였다.
2. 박테리아 및 효모 균주
pBluescriptSK 벡터 뿐만 아니라 PBinAR 구조물을 위하여, 이 콜라이 균주 XL1blue(Bullock et al., 1987, Biotechniques, 5, 376-378)를 사용하였다.
효모 중 cDNA 라이브러리의 발현을 위한 출발 균주로서, 효모 균주 22574d(Jauniaux et al., 1987, Eur J Biochem 164: 601-606)를 사용하였다.
감자 식물 내에서 플라스미드의 형질전환은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 LBA4404(Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720)를 사용하여 수행하였다.
3. 아그로박테리움 투메파시엔스의 형질전환
아그로박테리아로의 DNA의 전달은 문헌(＆ Willmitzer, 1988, Nucleic Acids Res 16: 9877)의 방법에 따라서 직접 형질전환시켜 수행하였다. 형질전환된 아그로박테리움의 플라스미드 DNA를 문헌(Birnboim and Doly, 1979, Nucl Acids Res 7: 1513-1523)의 방법에 따라 단리시키고, 적절한 제한 효소로 절단한 후에 겔 전기영동시켜 분석하였다.
4. 식물 형질전환
칼로 상처를 낸, 무균 감자 배양물의 작은 잎 10개를, 선별 조건 하에서 기른 아그로박테리움 투메파시엔스 철야 배양물 30-50 μl를 함유한 2 % 아미노산 첨가 MS 배지 10 ml에 넣었다. 3-5분 동안 온화하게 진탕한 후에, 1.6 % 글루코오스, 2 mg/l의 제아틴 리보오스, 0.02 mg/l의 나프틸아세트산, 0.02 mg/l의 지베렐산, 500 mg/l의 클라포란, 50 mg/l의 카나마이신 및 0.8 %의 박토 아가를 함유한 MS 배지상에 잎을 펼쳐놓았다. 25℃ 및 3000 룩스에서 1 주일 동안 인큐베이션한 후 배지 내의 클라포란 농도가 반으로 감소하였다.
[수탁]
하기의 플라스미드 및 효모 균주는 1992년 6월 12일에 독일연방공화국 브라운 슈바이크 소재의 도이췌 잠룽 폰 미크로오가니스멘(데에스엠)에 기탁되었다(수탁 번호).
플라스미드 pPPP1-20 (DSM 7129)
플라스미드 pBinPPP1-20(DSM 7130)
[도면의 간단한 설명]
제1도는 서열 번호 1을 함유하는 플라스미드 pPPP1-20를 나타낸다. 가는 선은 pBluescriptSK로부터의 서열에 해당한다. 굵은 선은 cDNA 삽입물을 나타낸다. 삽입물의 절단 위치가 나타나 있다.
제2도는 배지로부터의14C-프롤린의 흡수를 나타낸다.
no = 경쟁자 없이 흡수에 걸리는 시간
프롤린 = 4 배 과량의 표지하지 않은 프롤린의 존재시 흡수 시간
시트룰린 = 4 배 과량의 표지하지 않은 시트룰린의 존재시 흡수 시간
GABA = 4 배 과량의 감마-아미노부티르산의 존재시 흡수 시간
시간 = 초
cpm = 붕괴/분
제3도는 서열 번호 2를 함유하는 플라스미드 pAAP2를 나타낸다. 가는 선은 pBluescriptSK로부터의 서열에 해당한다. 굵은 선은 cDNA 삽입물을 나타낸다. 삽입물의 절단 위치가 나타나 있다.
제4도는 효모 균주 22574d::AAP2를 사용한 경쟁 실험을 나타내는데, 여기서 4 배 과량의 다른 아미노산 또는 그들의 유사체의 존재하에서 배지로부터14C 표지된 L-프롤린의 흡수를 측정한다. 세 개의 문자 코드로 된 아미노산에 대한 표준 약어 이외에도 다음이 사용된다.
Cit = 시트룰린; D-Pro = D-프롤린; OH-Pro = 히드록시프롤린 및 A2C = 아제티딘-2-카르복실산.
제5도는 효모 균주 JT16::AAP2를 사용한 경쟁 실험을 나타내는데, 여기서 10 배 과량의 다른 아미노산 또는 그들의 유사체의 존재하에서 배지로부터14C 표지된 L-히스티딘의 흡수를 측정하였다. 세 개의 문자 코드로 된 아미노산에 대한 표준 약어 이외에도 다음을 사용한다.
Cit = 시트룰린, Orn = 오르니틴; Can = 카나바닌; 및 NH4 = 암모늄.
하기의 실시예는 식물 아미노산 트랜스포터의 클로닝 및 동정뿐만 아니라, 그의 기능 및 용도를 설명한다.
[실시예 1]
[식물 아미노산 트랜스포터의 cDNA의 클로닝]
효모 균주 22574d의 프롤린 수송 변이(Jauniaux et at., 1987, Eur J Biochem 164: 601-606) 및(또는) 균주 JT16의 히스티딘 합성 및 수송 변이(Tanaka ＆ Fink, 1985, Gene 38: 205-214)의 상보성 시험을 위하여, 문헌[Minet et al., 1992, Plant J 2:417-422]에 의해 이용 가능한 효모 발현 벡터 pFL61(Minet ＆ Lacroute, 1990, Curr Genet 18: 287-291)중 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(이엽 단계)로부터 얻은 미성숙 배의 cDNA를 사용하였다. cDNA-삽입물을 포함한 약 1 μg의 벡터를 문헌(Dohmen et at., 1991, Yeast 7. 691-192)의 방법에 따라 효모 균주 22574d 및(또는) JT16 내로 형질전환시켰다. 유일한 질소원으로서 4 mM 프롤린이 있는 배지 또는 6 mM 히스티딘이 있는 배지에서 성장할 수 있는 효모 형질 전환체를 증식시켰다. 이들 균주로부터 표준 방법을 사용하여 플라스미드-DNA를 제조하였다. 특정 돌연변이를 상보할 수 있는 클론은 유사한 제한 효소 타입의 cDNA 삽입물을 갖는 플라스미드를 함유하였다. 이들은 1.6 내지 1.7 kb 사이의 크기였다.
[실시예 2]
[플라스미드 pFL61-ppp1-20의 cDNA 삽입물의 서열 분석]
22574d 돌연변이에도 불구하고 질소원으로서 프롤린만으로 성장할 수 있는 실시예 1에서와 유사한 방법으로 얻은 효모 균주 PPP1-20으로부터, 플라스미드 pFL61-ppp1-20을 단리시키고 그의 cDNA 삽입물을 NotI 단편으로서 제조한 다음 벡터 pBluescriptSK 중에서 클로닝하였다. 이 방법으로, 플라스미드 pPPP1-20을 얻었다(제1도 참조). 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 삽입물을 문헌[Sanger et al., 1977, Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467]의 방법에 따라 서열화하였다. 서열은 상기에 나타내었다.
유사한 방법으로, his4/hip1 이중 돌연변이에도 불구하고, 히스티딘이 첨가된 배지에서 성장할 수 있는 효모주로부터, 플라스미드 pFL61-aap2를 단리시키고, 그의 삽입물을 또한 pBluescriptSK 중의 NotI 단편으로서 클로닝하였다. 생성된 플라스미드 pAAP2를 서열화하고 그 서열(서열 번호 2)을 상기에 나타내었다. 플라스미드 pAAP2는 pPPP1-20(제1도 참조)과 유사한 구조를 가지지만 삽입물 서열 번호 1 대신에, 삽입물 서열 번호 2를 가진다(제3도 참조).
[실시예 3]
[효모 균주 PPP1-20 및 AAP2 내로의14C-표지된 단백질의 흡수 연구]
실시예 1에서와 유사한 방법으로 얻은 효모 균주 22574d::PPP1-20 및 22574d::AAP2를 배양물이 대수 증식기에 도달할 때까지 액체 배지에서 성장시켰다. 배양물을 원심분리시킨 후에, 100 mm 트리스/HCl pH 4.5, 2 mM MgCl2및 0.6 M 소르비톨 중에 세포를 세척하고 현탁시켰다. 이 현탁액 약 100 μl를 동일 완충액 100 μl 중의 0.5 mM L-프롤린과 1 μCi14C 표지된 L-프롤린의 용액에 가하였다. 표지된 아미노산의 흡수를 문헌[Cirillo, 1989, Meth Enzymol 174: 617-622]에 기술된 방법에 따라 측정하였다. 표지된 아미노산의 흡수를 한편으로는 베타 불가리스(Beta vulgaris)로부터 얻은 막 소포체 내의 아미노산 수송의 억제제인 단백질 개질물 디에틸 피로카르보네이트와, 그리고 다른 한편으로는 다른 단백질 개질물과 함께 인큐베이션시켜 비교하였다. 계산된 감소치를 표 1 및(또는) 표 3에 나타내었다. 트랜스포터의 특이성을 여러 아미노산 및 유사체를 사용하여 판독할 수 있는 경쟁 실험을 PPP1-20에 대해서는 표 2에 그리고 AAP2에 대해서는 제4도에 나타내었다. 균주 JT16::AAP2에서의 히스티딘 흡수에 대한 경쟁을 시험하는 유사한 실험을 실시예 5에 기재하였다. PPP1-20에 대한 시간은 제2도에 나타내었다.
[실시예 4]
[아미노산 트랜스포터의 코딩 영역의 과다-발현을 위한 구조물을 사용한 식물의 형질전환]
삽입물로서 아라비돕시스로부터 얻은 아미노산 트랜스포터에 대한 cDNA를 함유하는 플라스미드 pPPP1-20으로부터, BamHI 절단 후에, 삽입물의 내부 단편을 단리시키고, 효소 BamHI로 먼저 선형화된 pAJ로부터의 BamHI 절단 위치에서 클로닝하였다. 이어서, cDNA를 pAJ로부터 EcoRI/HindIII 단편으로서 제조하고, 벡터 pBIN-HYG 내에서 클로닝하였다. 아그로박테리아로 형질전환시킨 후에, 이를 담배 및 감자의 잎 단편을 감염시키기 위하여 삽입하였다.
10 개의 독립적으로 얻은 형질전환체(여기서, 완전한 재배열되지 않은 키메라 유전자의 존재는 서던 블롯 분석을 사용하여 입증되었다)를 아미노산 및 질소 함량의 변화에 대하여 시험하였다. 이 외에도, 아미노산 합성, 광합성율 및 수송률을 시험하였다.
[실시예 5]
[효모 균주 AAP2의14C-표지된 히스티딘의 흡수의 연구]
실시예 1과 유사한 방법으로 얻은 효모 균주 JT16::AAP2를 배양물이 대수 증식기에 도달할 때 까지 액체 배지 내에서 성장시켰다. 배양물을 원심분리한 후에, 10 mm 트리스/HCl(pH 4.5), 2 mm MgCl2및 0.6 M 소르비톨 중에 세포를 세척하고 현탁시켰다. 현탁액 약 100 ml를 동일한 완충액 100 μl 중 0.5 mm L-히스티딘과 1 μCi14C-표지된 L-히스티딘의 용액에 가하였다. 표지된 아미노산의 흡수를 문헌[von Cirillo, 1989, Meth Enzymol 174: 617-622)에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 표지된 아미노산의 흡수를 상이한 아미노산 및 유사체를 10 배 과량으로 사용한 경쟁 실험으로 비교하였다. 그 관계를 제5도에 나타내었다.
[표 1]
[표 2]
[표 2a]
[표 3]

Claims (19)

  1. 하기의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 게놈 중에 통합됨으로써 RNA를 생성시키고, 이 RNA의 번역에 의하여 또는 이 RNA에 의해 발생되는 안티-센스 효과에 의하여 신규의 아미노산 수송 활성이 식물 세포 내에 도입되거나 또는 고유 아미노산 트랜스포터 활성이 억제될 수 있는, 막 수송을 위한 아미노산 트랜스포터의 코딩 영역을 포함하는 식물 유래의 DNA 분자.
  2. 하기의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 2)을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 게놈 중에 통합됨으로써 RNA를 생성시키고, 이 RNA의 번역에 의하여 또는 이 RNA에 의해 발생되는 안티-센스 효과에 의하여 신규의 아미노산 수송 활성이 식물 세포 내에 도입되거나 또는 고유 아미노산 트랜스포터 활성이 억제될 수 있는, 막 수송을 위한 아미노산 트랜스포터의 코딩 영역을 포함하는 식물 유래의 DNA 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 DNA 분자를 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  4. 플라스미드 pPPP1-20 (DSM 7129).
  5. 서열 번호 1 대신에 서열 번호 2의 삽입물을 포함하는, 플라스미드 pPPP1-20의 구조를 가지는 플라스미드 pAAP2.
  6. 플라스미드 pBin PPP1-20 (DSM 7130).
  7. 제1항 또는 제2항에 따른 DNA 분자를 포함하는 감자(Solanum tuberosum).
  8. 제1항 또는 제2항에 따른 DNA 분자를 포함하는 박테리아.
  9. 제1항 또는 제2항에 따른 DNA 분자를 포함하는 효모 균주.
  10. 제3항에 따른 플라스미드를 사용하는 원핵 및 진핵 세포의 형질전환 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 따른 아미노산 트랜스포터의 DNA 분자를 사용하는, 트랜스포터의 특이성이 변화된 플라스미드의 제조 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 따른 아미노산 트랜스포터의 DNA 분자를 사용하여 식물의 게놈으로부터 아미노산 트랜스포터 분자를 코딩하는 핵산 분자의 단리 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 따른 아미노산 트랜스포터의 DNA 분자를 사용하는, 원핵 및 진핵 세포 내에서 아미노산 트랜스포터의 합성을 가능하게 하는 번역 가능한 mRNA의 발현 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 따른 아미노산 트랜스포터의 DNA 분자를 사용하는 원핵 및 진핵 세포 내에서 아미노산 트랜스포터의 합성을 억제하는 번역불가능한 mRNA의 발현 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 따른 아미노산 트랜스포터의 DNA 분자를 조향 인자와 함께 사용하여 원핵 및 진핵 세포 내에서 아미노산 트랜스포터를 발현시키는 방법.
  16. 아미노산 흡수에 결함이 있는 효모 균주를 식물 DNA로 형질전환시키는 것을 포함하는, 효모 돌연변이의 상보(complementation)에 의한 식물 아미노산 트랜스포터의 동정 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 따른 아미노산 트랜스포터의 DNA 분자를 사용하여 식물을 형질전환시키는 것을 포함하는, 아미노산 및 질소 대사가 변화된 식물의 제조 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 따른 아미노산 트랜스포터의 DNA 분자를 사용하여 농작물을 형질전환시키는 것을 포함하는, 수율이 증가된 농작물의 제조 방법.
  19. 제1항 또는 제2항에 따른 아미노산 트랜스포터의 DNA 분자를 사용하여 원핵 및 진핵세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 원핵 및 진핵 세포 내의 아미노산의 수송 방법.
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