EP1135510A2 - Dna-sequenz, kodierend einen glutamat/malat-translokator, plasmide, bakterien, hefen und pflanzen, enthaltend diesen transporter - Google Patents

Dna-sequenz, kodierend einen glutamat/malat-translokator, plasmide, bakterien, hefen und pflanzen, enthaltend diesen transporter

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EP1135510A2
EP1135510A2 EP99958097A EP99958097A EP1135510A2 EP 1135510 A2 EP1135510 A2 EP 1135510A2 EP 99958097 A EP99958097 A EP 99958097A EP 99958097 A EP99958097 A EP 99958097A EP 1135510 A2 EP1135510 A2 EP 1135510A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna sequence
glutamate
malate
translocator
deletion
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99958097A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ulf-Ingo FLÜGGE
Andreas Weber
Peter Westhoff
Uta Dressen
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SYMPORE GmbH
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
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    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Definitions

  • DNA - S FREQUENCY encoding a glutamate / malate translocator, plasmids, bacteria, yeasts and plants containing these transporters.
  • the present invention relates to DNA sequences from Sorghum bi color SEQ-ID No. 1, Flaveria bidentis SEQ-ID No. 3 and Spinacia oleracea SEQ-ID No. 5, which contain the coding region of a glutamate / malate translocator, the introduction of which into a plant genome changes the formation and transfer of carbon backbones for the fixation of nitrogen and the transfer of assimilated nitrogen in transgenic plants, plasmids, yeasts and bacteria containing this DNA Sequences, as well as transgenic plants, in which changes in the activity of the glutamate / malate translocator and thus changes in the nitrogen and carbon metabolism are caused by the introduction of the DNA sequences.
  • the invention further relates to transgenic plants which are affected by the change in the activity of the glutamate / malate translocator in their ability to photorespiration.
  • the invention also relates to the use of the described sequences of the glutamate / malate translocator for identifying related translocators from plants (angiosperms, gymsperms and algae) by hybridization with low stringency or by PCR techniques, and to the use of the glutamate / malate translocators as a target for herbicides.
  • the nitrogen supply to the plant must be influenced by fertilization.
  • the energy for nitrogen assimilation comes from the light reaction of photosynthesis or in roots and other non-green tissues from dissimilation and is not a limiting factor under normal field conditions.
  • 2-oxoglutarate (ketoglutarate) is the primary acceptor of reduced nitrogen in the glutamine synthetase / glutamine-2-oxoglutarate aminotransferase (GOGAT) reaction.
  • reduced nitrogen ammonium nitrogen
  • glutamate oxoglutarate aminotransferase (GOGAT; glutamate synthase) catalyzes the transfer of an amino acid using reduction equivalents.
  • the entire reaction sequence of the glutamine synthetase / GOGAT reaction is located in the stroma of the plastids of the plants. These organelles are enclosed by two lipid bilayer membranes, the outer molecular sieve character of which allows compounds up to a size of approx. 10 kDa to pass freely (Flügge and Benz,
  • the inner membrane is permeable to some smaller compounds such as water, carbon dioxide, oxygen and nitrite, but not to larger charged molecules such as glutamate or malate.
  • This key compound of the gl tamine synthetase / GOGAT reaction must be moved from the cytosol of the plant cell through a specific translocator across the inner plastid envelope membrane into the stroma of the plastid.
  • the transport of 2-oxoglutarate in the plastids takes place in exchange for malate from the
  • 2-oxoglutarate is imported into the chloroplast and the end product of the glutamine synthetase / GOGAT reaction, glutamate, is exported.
  • Glutamate serves as the preferred amino group donor in a whole series of transamination reactions, for example in the biosynthesis of the amino acids alanine or phenylalanine etc.
  • Most nitrogen-containing compounds in the plant, such as amino acids, nucleic acids or alkaloids, first require glutamate as the primary amino group donor in their biosynthetic pathway. Glutamate is also an important form of transport for organically bound nitrogen within the plant and is fed as such into the plant's leading tissue (the phloem).
  • the most common amino acids in phloem juice are usually glutamate, glutamine and aspartate.
  • Transporters are involved in the allocation of the photoassimilate (ie primarily sugar and amino acids) from the "source” - to the "sink” organs at a crucial point - such as the chloroplastid triose phosphate / phosphate translocator, the sucrose translocator, via which the sieve tubes loaded with the transport form of the photoassimilate sucrose and the glucose-6-phosphate / phosphate translocator of the amyloplasts. Changes in the activity of a specific membrane transporter can have a major impact on plant metabolic performance.
  • the glutamate / malate translocator of the plastid envelope membrane plays a key role in the intracellular distribution of the amino group acceptors and donors involved in nitrogen fixation. If it was possible to clone this translocator and to use the sequence obtained to modulate the activity of the translocator in plants, this opened the way to plants with a changed carbon / nitrogen ratio. This means that plants could be produced which, for example, contained fewer carbohydrates (sugar, starch, fats) and more organic nitrogen compounds (protein, amino acids, alkaloids). There is an urgent need for plants with such changed content substances, because the vast majority of people on earth depend on plant nutrition, with the consequence of a constant undersupply of proteins in these strata of the population.
  • plastid translocators require a corresponding presequence ("targeting" sequence) for correct addressing to the inner plastid membrane, which directs the attached mature protein to the plastids correctly (review article See: Keegstra et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40: 471-501; Lubben et al., 1988, Photosynth. Res. 17: 173-194; diegge, 1990, J. Cell Sei. 96: 351-354).
  • the mature part (the part of the protein which remains after the presequence has been cleaved off by a specific protease) of the plastid envelope membrane proteins contains further information which is necessary for the specific insertion of the proteins into the membrane are responsible and prevent transport of the envelope membrane proteins over the envelope membrane into the plastid stroma or, in the case of the chloroplasts, the thylakoid membrane (Knight and Gray, 1995, Plant Cell 7: 1421-1432 or ' own investigations: Brink et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 20808-20815).
  • the protein / lipid interaction is important for correct insertion and the plastid envelope membrane differs fundamentally in its lipid composition from that of other cell organelles and also the bacteria (Joyard et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199: 489-509), it is very unlikely that an insertion, albeit a small one, of a heterologous protein will then also be functional, that is to say that a transporter from other systems in the conformation and orientation corresponding to its function in the Plastid envelope membrane can be installed.
  • C 3 plants eg potato, tomato
  • C plants such as millet (Sorghum bicolor) or Flave ria bidentis
  • mesophyll and bundle sheath cells which are involved in the production of the photoassimilate are.
  • mesophyll cells the primary fixation of atmospheric carbon dioxide takes place with the formation of a C4 body (eg malate), which is then transported to the bundle sheath cells.
  • the corresponding cDNA insert was used as a probe for the subsequent screening of a cDNA library from Sorgum bicolor and a cDNA clone could be isolated which contains the complete cDNA (2088 base pairs) for the corresponding precursor protein with a molecular mass of 59 kDa contained.
  • Transformants expressing the corresponding plasmid were isolated. Transport experiments, carried out with membrane fractions of the yeast transformants reconstituted in artificial membranes, showed that this translocator catalyzes the transport of malate in exchange for glutamate (or aspartate). In contrast to the 2-oxoglutarate / malate translocator, this translocator also accepts amino acids (glutamate and aspartate) as counter-exchange substrates, see working examples 2 and 3. The transporter was given the name glutamate / malate translocator.
  • the present invention thus provides DNA sequences which originate from a plant genome and code for a plastid glutamate / malate translocator, the information contained in the nucleotide sequence leading to the formation and expression in plant cells of a ribonucleic acid and A glutamate / malate translocator activity can be introduced into the cells via this ribonucleic acid or an endogenous glutamate / malate translocator activity can be suppressed.
  • the invention particularly relates to the DNA sequences from sorghum bicolor (millet) with the nucleotide sequence SEQ-ID No. 1, a DNA sequence from Flaveria bidentis with the nucleotide sequence SEQ-ID No. 3 and a DNA sequence from Spinacia oleracea (spinach) with the nucleotide sequence SEQ-ID No. 5th
  • the invention further relates to DNA sequences which are identified by the sequence shown under SEQ ID No. 1, 3 or 5 mentioned DNA sequence or parts thereof or derivatives which are derived from these sequences by insertion, deletion or substitution, hybridize and code for a plastid protein which has the biological activity of a dicarboxylic acid translocator, in particular a glutamate / malate -Translocators owns.
  • the present invention relates to the use of the DNA sequence SEQ-ID No. 1, 3 or 5 or parts thereof or derivatives obtained by insertion, deletion or Substitution derived from these sequences for the transformation of pro- and eukaryotic cells.
  • the DNA sequence SEQ-ID No. 1, 3 or 5 are introduced into plasmids and are combined with control elements for expression in prokaryotic or eukaryotic cells, see exemplary embodiments 2 and 4.
  • control elements are, on the one hand, transcription promoters and, on the other hand, transcription terminators.
  • the plasmids can be used to transform eukaryotic cells with the aim of expressing a translatable messenger ribonucleic acid (RNA) which allows the synthesis of a plastid glutamate / malate translocator in the transformed cells, or with the aim of expressing a non-translatable, inversely oriented ("antisense"), messenger ribonucleic acid, which prevents the synthesis of the endogenous glutamate / malate translocators.
  • RNA messenger ribonucleic acid
  • antisense inversely oriented
  • RNA in accordance with the sequence of a plant glutamate / malate translocator according to the invention enables a change in plant nitrogen metabolism, the economic importance of which is that an improvement in the forwarding of glutamate from the cytosol of the plastids to a change in the ratio of Carbohydrates (sugar, starch, organic acids) and fats in favor of nitrogen compounds (amino acids, proteins, possibly alkaloids) takes place. Plants can thus be produced which are richer in valuable protein but have a lower content of carbohydrates and fats.
  • the transcriptional start area can be both native or homologous and foreign or heterologous to the host plant. Termination areas are interchangeable.
  • the DNA sequence of the transcription start and termination regions can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components.
  • cloning vectors are available which contain a replication signal for E. coli and a marker which allows selection of the transformed cells. Examples of vectors are pBR322, pUC series, M13 mp series, pACYC 184 etc. Depending on the method of introducing desired genes into the plant, further DNA sequences may be required.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the Ti and Ri plasmid T-DNA must be added as a flank region to the genes to be introduced.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and sufficiently described (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters BV. Ablasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Critic. Rev. Plant Sc. 4: 1-46; An et al., 1985, EMBO J. 4: 277-287). Once the DNA has been integrated into the genome, it is generally stable there and is also retained in the offspring of the originally transformed cell.
  • Whole plants can then be regenerated in a suitable selection medium.
  • the plants obtained in this way can then be tested for the presence of the introduced DNA using conventional molecular biological methods.
  • These plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties.
  • the DNA sequences SEQ-ID No. 1, 3 or 5 can also be introduced into plasmids and thereby provided with control elements for the expression in cells of fission yeasts, see embodiment example 2.
  • the introduction of the glutamate / malate translocator leads to a considerable one Increase in the activity of the glutamate / malate translocator measurable by reconstitution in artificial liposomes in the recombinant yeast cells. In recombinant yeast cells, a much higher malate transport activity can be demonstrated.
  • the DNA sequences SEQ-ID No. 1, 3 or 5 can also be introduced into plasmids which permit mutagenesis or a sequence change by recombination of DNA sequences in prokaryotic or eukaryotic systems. This allows the specificity of the glutamate / malate translocator to be changed e.g. towards an affinity for other dicarboxylic acids.
  • DNA sequence SEQ-ID No. 1, 3 or 5 (or parts or derivatives of this sequence) can be used according to standard methods (in particular hybridization screening of cDNA libraries with low stringency using the DNA sequence according to the invention or parts of the DNA sequences
  • the DNA sequence SEQ-ID No. 1, 3 or 5 contains areas in the translated protein that are able to specifically direct the protein synthesized in the cytoplasm on ribosomes to plastids and to prevent the occurrence of the protein in other membrane systems of the cell. This is in contrast to the known mitochondrial 2-oxoglutarate translocators, which do not contain such an addressing sequence.
  • the protein range which directs the protein encoded by the DNA sequence according to the invention to plastids lies within the first hundred amino acids of the protein, is not necessary for the transport function of the protein and is removed after the protein has been successfully inserted into the plastid envelope membrane.
  • the translocator protein By exchanging this "plastid targeting" sequence for one of the known “targeting" sequences, for example for mitochondria, the translocator protein could be eukaryotic in another membrane system. conduct cells and could possibly change the transport properties across the membrane.
  • the "plastid targeting" sequence of the glutamate / malate translocator or endogenous regions of the mature protein could be used to direct foreign proteins (eg bacterial transport proteins or transporters from yeast) into the plastids or into the plastid envelope membrane of plant cells.
  • the phage lambda ZAPII and the phagemid pBluescript II KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 7583- 7600) is used.
  • the vector SAP-E (Truenit et al., 1996, Plant Cell 8: 2169-2182) was used for the transformation of yeasts.
  • the E. coli strain DH5 ⁇ (Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) was used for the pBluescriptKS (pBSC) phagemid and for SAP-E and pBinAR constructs.
  • the DNA was transferred into the agrobacteria by direct transformation using the method of Hofgen and Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16: 9877).
  • the plasmid DNA of transformed agrobacteria was isolated by the method of Birnboim and Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523) and, after a suitable restriction cleavage, analyzed for correctness and orientation by gel electrophoresis. 4.
  • DSM 12480 Phagemid pFbGMTl (GMTl sequence SEQ-ID No. 3 from Flaveria bidentis) (DSM 12478)
  • Poly (A + ) RNA was isolated from leaves of Sorghum bicolor, converted into double-stranded cDNA using a standard cDNA synthesis kit and cloned into the vector Lambda-ZAPII (Wyrich et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37 : 319-335).
  • partial digestion with pectinases and cellulases from leaves of Sorghum bicolor prepared mesophyll and bundle sheath cells and from them poly (A + ) RNA. From the mesophyll or Bundle sheath RNA was produced with the help of reverse transcriptase and radioactive nucleotides, a hybridization probe with which the cDNA library was screened differentially.
  • the cDNA library was screened with the cDNA clone HHU51 as a hybridization probe. Lambda clones that reacted positively were cleaned using standard methods. The pBluescript phagemid with the cDNA insert coding for the glutamate / malate translocator was released by in vivo excision (Short & Sorge, 1992, Meth. Enzymol. 216: 495-208). The
  • the Sorghum bicolor (millet) cDNA was then used to generate the corresponding cDNA clones from Flaveria bidentis (clone pFbGMTl) (SEQ-ID No. 3) and Spinacia oleracea (spinach, clone pSoGMTl) (SEQ-ID No. 5) isolate.
  • SAP-E yeast Expression vector
  • the plasmid was transformed into S. pombe cells deficient in leucine synthesis deficient by LiCl / PEG (Ito et al., 1983, J. Bact. 153: 163-168). Transformants were selected by selection on minimal medium without leucine, since the SAP GMT construct gives the yeast cells the ability to grow on leucine-free medium.
  • Yeast cells transformed with the SAP-GMT plasmid were grown in minimal medium to an optical density at 600 nm of 1.0 and harvested by centrifugation at 3,000 x g for 5 min. The cells were then broken up by shaking vigorously with 1/2 vol (based on the cells) of glass beads and glass beads and cell fragments were separated off by centrifugation (600 g for 1 min). The supernatant was adjusted to a concentration of 0.5% (weight / volume) Triton X-100, the same volume of liposomes was added and the resulting proteoliposomes were immediately frozen in liquid nitrogen.
  • the liposomes were previously prepared by sonicating soybean phospholipid (20 mg / ml) for 10 min at 4 ° C in the presence of 200 mM tricine-NaOH (pH 7.6), 40 mM malate and 60 mM potassium gluconate. After thawing the proteoliposomes and re-sonicating the suspension with 10 pulses, the proteoliposomes were removed from the surrounding medium by size exclusion chromatography on Sephadex G-25, previously with 10 mM tricine-NaOH (pH 7.6), 100 mM sodium gluconate and 50 mM potassium gluconate had been equilibrated. The eluted proteoliposomes were used to measure malate transport activity. The measurement was carried out according to the "inhibitor-stop" method described by Menzlaff and wellgge (1993, Biochim. Biophys. Acta 1147: 13-18).
  • the malate transport activity in the SAP GMT transformants was compared to the malate transport activity of transformants that were only transformed with the vector SAP without the GMT insertion. It was shown that the malate transport activity in the SAP GMT transformants (measured in pmol transported 14 C-malate / mg protein per minute) was many times higher than in the SAP control transformants. It could also be shown that, in contrast to the already known 2-oxoglutarate / malate translocator, the glutamate / malate translocator is able to catalyze the transport of amino acids (glutamate / aspartate) in exchange for malate, see Table 1. Table 1
  • the recombinant glutamate / malate translocator and, for comparison, the recombinant 2-oxoglutarate / malate expressed in the split yeast Schizosaccharomyces pombe were reconstituted in liposomes which had been preloaded with the specified substrates.
  • the transport activities were determined as described by wellgge (Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1110: 112-118) and are given as a percentage of the activity which was measured with malate-preloaded liposomes.
  • the 100% transport activity was 175 pmol / mg protein per minute.
  • pBSC-GMT phagemid pBluescript-GMT
  • the insert was isolated by restriction digestion with EcoRV and Smal and into the vector pBinAR
  • the transformants obtained were examined with the aid of Southern blot analyzes for the presence of the intact, non-rearranged chimeric gene. With the help of the "whole leaf reconstitution method" (Flügge and Weber, 1994, Planta, 194: 181-185) the malate transport activity in comparison to control transformants (transformed with vector pBinAR without insertion) was examined, as was the C / N- Ratio, photosynthesis rate, photorepiration and growth.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen aus Sorghum bicolor (Hirse), Flaveria bidentis und Spinacia oleracea (Spinat), die die Kodierregion eines Glutamat-/Malat-Translokators enthalten, deren Einführung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für die Fixierung von Stickstoff und die Weiterleitung des assimilierten Stickstoffs in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien, enthaltend diese DNA-Sequenzen, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA-Sequenzen Veränderungen der Aktivität des Glutamat-/Malat-Translokators und somit Änderungen im Stickstoff- und Kohlenstoffstoffwechsel hervorgerufen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, die durch die Veränderung der Aktivität des Glutamat-/Malat-Translokators in ihrer Fähigkeit zur Photorespiration beeinflusst sind. Ebenso betrifft die Erfindung die Benukung der beschriebenen Sequenzen des Glutamat-/Malat-Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus Pflanzen (Angiospermen, Gymnospermen und Algen) durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz oder durch PCR-Techniken, sowie die Nutzungd der Glutamat-/Malat-Translokatoren als Ziel ("Target") für Herbizide.

Description

DNA-Sequenz kodierend einen Glutamat/Malat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter.
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen aus Sorghum bi color SEQ-ID No. 1, Flaveria bidentis SEQ-ID No. 3 und Spinacia oleracea SEQ-ID No. 5, die die Kodierregion eines Glutamat/Malat- Translokators enthalten, deren Einführung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für die Fixierung von Stickstoff und die Weiterleitung des assimilierten Stickstoffs in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien enthaltend diese DNA-Sequenzen, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA-Sequenzen Veränderungen der Aktivität des Glutamat/Malat-Translokators und somit Änderungen im Stickstoff- und KohlenstoffStoff echsel hervorgerufen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung transgene Pflan- zen, die durch die Veränderung der Aktivität des Glutamat/Malat- Translokators in ihrer Fähigkeit zur Photorespiration beeinflußt sind. Ebenso betrifft die Erfindung die Benutzung der beschriebenen Sequenzen des Glutamat/Malat-Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus Pflanzen (Angiospermen, Gymno- spermen und Algen) durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz oder durch PCR-Techniken, sowie die Nutzung der Glutamat/Malat- Translokatoren als Ziel ("Target") für Herbizide.
Nur Pflanzen, Bakterien und Hefen sind zur Überführung von anor- ganischem Stickstoff (Nitratstickstoff) in organisch gebundenen Stickstoff in großem Maßstab (in der Regel in Form von Aminosäuren) durch reduktive Aminierung von organischen KohlenstoffVerbindungen befähigt. Der Rest der belebten Welt, insbesondere Nutztiere und Menschen, ist auf Pflanzen als primäre Lieferanten organischer Stickstoffverbindungen angewiesen. Die Assimilation von anorganischem Stickstoff in Pflanzen durch Bindung an organischen Kohlenstoff hängt von der Verfügbarkeit von Stickstoff, Kohlenstoff-Grundgerüsten und Energie ab.
Die Stickstoffversorgung der Pflanze ist durch Düngung zu beeinflussen. Die Energie für die Stickstoffassimilation stammt aus der Lichtreaktion der Photosynthese bzw. in Wurzeln und anderen nicht-grünen Geweben aus der Dissimilation und ist unter normalen Feldbedingungen kein begrenzender Faktor. 2-Oxoglutarat ( -Ketoglutarat) ist nach heutigem Kenntnisstand der primäre Akzeptor reduzierten Stickstoffs in der Glutaminsynt- hetase/Glutamin-2-Oxoglutarat-Aminotransferase (GOGAT) -Reaktion. In dieser Reaktionsfolge wird zunächst durch die Glutaminsynthe- 5 tase reduzierter Stickstoff (Ammoniumstickstoff ) unter Energieverbrauch auf die Aminosäure Glutamat übertragen. Es entsteht Glutamin. In einer Folgereaktion katalysiert nun die Glutamat- Oxoglutarat-Aminotransferase (GOGAT; Glutamatsynthase) unter Verbrauch von Reduktionsäquivalenten die Übertragung einer Amino-
10 gruppe von Glutamin auf 2-0xoglutarat ( ransaminierung) . Es entstehen zwei Moleküle Glutamat. In der Summe werden aus einem Molekül Glutamat, einem Molekül 2-Oxoglutarat, einem Molekül Ammonium sowie ATP als Energieäquivalent und reduziertem Ferredoxin als Reduktionsäquivalent zwei Moleküle Glutamat, ADP und oxidier-
15 tes Ferredoxin gebildet. Es ist ersichtlich, daß ein Nettogewinn von einem Molekül organischer Stickstoffverbindung (Glutamat) bei jedem Durchlauf des Reaktionszykius durch die reduktive Aminie- rung eines Moleküls 2-Oxoglutarat erzielt wird.
20 Die gesamte Reaktionsfolge der Glutaminsynthetase/GOGAT-Reaktion ist im Stroma der Piastiden der Pflanzen lokalisiert. Diese Organelle sind von zwei Lipiddoppelschichtmembranen umschlossen, deren äußere Molekularsiebcharakter hat und Verbindungen bis zu einer Größe von ca. 10 kDa frei passieren läßt (Flügge und Benz,
25 1984, FEBS Lett. 169: 85-89). Die innere Membran ist permeabel für einige kleinere Verbindungen wie Wasser, Kohlendioxid, Sauerstoff und Nitrit, nicht jedoch für größere geladene Moleküle wie zum Beispiel Glutamat oder Malat.
30 Diese Schlüsselverbindung der Gl taminsynthetase/GOGAT-Reaktion muß aus dem Cytosol der pflanzlichen Zelle durch einen spezifischen Translokator über die innere Plastidenhüllmembran in das Stroma des Piastiden bewegt werden. Der Transport von 2-Oxogluta- rat in den Piastiden erfolgt im Gegentausch mit Malat aus dem
35 Piastiden durch den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator. Das bei diesem Vorgang in das Cytosol exportierte Malat wird von einem zweiten Translokator, dem Glutamat/Malat-Translokator, im Gegentausch mit Glutamat zurücktransportiert. Es sei darauf hingewiesen, daß der 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, im Gegensatz zum
40 Glutamat/Malat-Translokator, nicht den Transport von Glutamat (oder auch Aspartat) zu katalysieren vermag. Im Ergebnis wird, ohne einen Nettotransport von Malat, das über beide Translokator- Systeme zirkuliert ("Doppel-Translokator", Woo et al . , 1987, Plant Physiol. 84: 624-632; Flügge et al . , 1988, Planta 174:
45 534-541) , 2-Oxoglutarat in den Chloroplasten importiert und das Endprodukt der Glutaminsynthetase/GOGAT-Reaktion, Glutamat, exportiert. Glutamat dient in der Pflanze als bevorzugter Amino- gruppen-Donator in einer ganzen Reihe von Transaminierungsreak- tionen, zum Beispiel bei der Biosynthese der Aminosäuren Alanin oder Phenylalanin etc. Die meisten stickstoffhaltigen Verbindungen in der Pflanze wie Aminosäuren, Nukleinsäuren oder Alkaloide benötigen in ihrem Biosyntheseweg zunächst Glutamat als primären Aminogruppendonator . Weiterhin ist Glutamat eine wichtige Transportform für organisch gebundenen Stickstoff innerhalb der Pflanze und wird als solche in das Leitgewebe der Pflanze (das Phloem) eingespeist. Die häufigsten Aminosäuren im Phloemsaft sind in der Regel Glutamat, Glutamin und Aspartat.
Transporter sind in die Allokation des Photoassimilates (d. h. primär Zucker und Aminosäuren) von den "Source"- zu den "Sink" -Organen an entscheidender Stelle eingebunden - wie der chloroplastidäre Triosephosphat/Phosphat-Translokator, der Saccharose-Translokator, über den die Siebröhren mit der Transport- form des Photoassimilates Saccharose beladen werden und der Glu- kose-6-phosphat/Phosphat-Translokator der Amyloplasten. Änderungen der Aktivität eines spezifischen Membran-Transporters können große Auswirkungen auf die Stoffwechselleistungen der Pflanzen haben. So konnte vor kurzem gezeigt werden, daß die Effektivität der photosynthetischen Kohlenstoffreduktion (Lichtreaktion und Calvin-Zyklus) ganz wesentlich durch die Aktivität des chloropla- stidären Triosephosphat/Phosphat-Translokators beeinflußt werden kann, der den Austransport des fixierten Kohlenstoffs aus dem Chloroplasten katalysiert. Die Hemmung dieses Transporters in planta über die Expression einer entsprechenden "antisense" mRNA führt zu einem verminderten Export des primären Photoassimilates (Triosephosphat, 3-Phosphoglycerat) , das unter diesen Umständen innerhalb des Chloroplasten abgeleitet wird in die Biosynthese von Stärke, die sich massiv anstaut (Riesmeier et al . , 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6160-6164; Heineke et al . , 1994, Planta 193: 174-180). Dieses Translokatorprotein stellt demzufolge eine Engstelle im KohlenstoffStoffwechsel des " Source" -Ge- webes dar. Auch die Reduktion der Saccharose-Transport-Aktivität über eine "antisense" -Inhibierung des für den Transport in die Siebröhren verantwortlichen Saccharose-Transporters (Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713) führt zu einem drastischen Phänotyp der Pflanzen: sie sind wesentlich kleiner, die Blätter sind geschädigt und die Pflanzen bilden, im Fall der Kartoffeln, kaum noch Knollen aus d. h. die Versorgung der "Sink" -Gewebe mit Photoassimilaten ist stark reduziert (Riesmeier et al., 1994, EMBO J. 13: 1-7) .
Ebenso führt die eine Reduktion der Transportkapazität für
2-Oxoglutarat über die Plastiden-Hüllmembran durch antisense-Re- pression der 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator mRNA in Tabak- Pflanzen zu einem drastischen Phänotyp. Die Pflanzen zeigen einen gestauchten, stark verlangsamten Wuchs mit verspäteter Blüte. Die Blätter zeigten ein Ausbleichen entlang der Leitbündel, die Interkostalfelder waren noch grün gefärbt. Die Pflanzen akkumulier - ten Ammonium und Chlorid, wiesen jedoch drastisch verringerte Nitratgehalte auf (eigene, unveröffentlichte Beobachtungen) . Da der Glutamat/Malat-Translokator in denselben biochemischen Stoffwechselweg in zentraler Position eingebunden ist, kann von einer ähnlichen Auswirkung einer Repression dieses Transporters auf den Phänotyp von Pflanzen ausgegangen werden. Weiterer Beleg für diese Annahme ist eine Beobachtung von Somerville (1983, 1985), in der eine EMS-Mutante des Glutamat/Malat-Translokators in Ara - bidopsis beschrieben wird. Diese ist unter ambienten C02-Bedingun- gen nicht lebensfähig, da sie keinen vollständigen Photorespira- tionsweg ausführen kann (Somerville und Ogren, 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 1290-1294; Somerville und Somerville, 1985, Plant Science Letters 37: 217-220). Die beschriebene Mutante konnte bislang jedoch nicht zur Identifizierung und Klonierung eines Glutamat/Malat-Translokators genutzt werden.
Wie oben beschrieben, nimmt der Glutamat/Malat-Translokator der Plastidenhüllmembran eine Schlüsselrolle bei der intrazellulären Verteilung der an der Stickstoff-Fixierung beteiligten Aminogrup- pen-Akzeptoren und -Donatoren ein. Gelänge es, diesen Transloka- tor zu klonieren und mit Hilfe der erhaltenen Sequenz die Aktivität des Translokators in Pflanzen zu modulieren, eröffnete dies den Weg zu Pflanzen mit einem veränderten Kohlenstoff/Stickstoff- Verhältnis. Dies bedeutet, daß Pflanzen erzeugt werden könnten, die z.B. weniger Kohlenhydrate (Zucker, Stärke, Fette) und mehr organische Stickstoffverbindungen (Protein, Aminosäuren, Alka- loide) enthielten. An Pflanzen mit derart veränderten Inhalts - Stoffen besteht dringender Bedarf, denn der überwiegende Teil der Menschen auf der Erde ist auf pflanzliche Ernährung angewiesen, mit der Konsequenz einer ständigen Unterversorgung an Eiweißen in diesen Bevölkerungsschichten. Ebenso wird in der Tierfütterung in den entwickelten Ländern zunehmend Tier- und Fischmehl dem Viehfutter beigemengt, um die Eiweißversorgung der Zuchttiere zu verbessern. Futterpflanzen mit höherem Proteingehalt wären hier sicher die bessere Alternative, insbesondere mit Blick auf die durch die Verfütterung von Tiermehlen entstehenden Probleme wie BSE etc. Ein Einfluß einer Überexpression des 2-Oxoglutarat/Ma- lat-Translokators in Tabak auf das C/N-Verhältnis von Tabak- Pflanzen konnte bereits gezeigt werden (Weber, 1995, Dissertation, Universität Würzburg) . Da der Glutamat/Malat-Translokator ein breiteres Substratspektrum aufweist als der 2-Oxoglutarat/Ma- lat-Translokator, ist diese Einflußnahme auf das C/N-Verhältnis in transgenen Pflanzen mit veränderter Expression dieses Transporters anzunehmenderweise noch ausgeprägter.
Der drastische Phänotyp einer Mutation des Glutamat/Malat-Trans- lokators (siehe oben) macht dieses Protein als Target für Herbizide interessant. Ein Hemmstoff dieses Transporters dürfte als Totalherbizid einsetzbar sein. Wie auch für ein weiteres Enzym des Photorespirationsweges gezeigt werden konnte (Glutaminsynthe- tase, GS) führt eine Hemmung dieses Enzyms durch ein Herbizid (Phosphinotricine, BASTA) zum Absterben der behandelten Pflanzen. Durch Einführung einer Enzymaktivität, die den möglichen Hemmstoff metabolisiert und damit wirkungslos macht, könnte eine gezielte Resistenz gegen diesen Wirkstoff erzeugt werden. Ebenso wäre dies durch eine gezielte Veränderung der DNA- bzw. der hier- aus resultierenden Aminosäure-Sequenz des Transporters möglich. Eine solche Veränderung würde die Bindungseigenschaften des Hemmstoffs verändern und diesen damit wirkungslos machen ohne hierbei jedoch die Transportfunktion zu beeinträchtigen. Zur Auffindung eines solchen Hemmstoffes und zum Auffinden möglicher Sequenzän- derungen des Transporter-Proteins kann das von uns beschriebene System der Rekonstitution rekombinanter Proteine in Proteoliposo- men mit anschließender Funktionsmessung eingesetzt werden (siehe Ausführungsbeispiel 2) .
Es ist uns vor kurzem gelungen, eine für den plastidären 2-Oxog- lutarat/Malat-Translokator kodierende cDNA zu klonieren (Weber et al., 1995, Biochemistry 34: 2621-2627). Die Primärsequenz dieses Translokators unterscheidet sich grundsätzlich von den Sequenzen der bekannten 2-0xoglutarat/Malat-Carrier aus den Mitochondrien von Rinderherzen und aus menschlichen Mitochondrien (Runswick et al., 1990, Biochemistry 29:11033-11040; Iacobazzi et al., 1992, DNA Seq. 3(2): 79-88). Diese Transporter spielen eine wichtige Rolle im mitochondrialen Dikarbonsäure-Stoffwechsel (u.a. Malat/ Aspartat-Shuttle, Oxoglutarat/Isocitrat-Shuttle) und sind der Fa- milie mitochondrialer Metabolittransporter zugehörig, die untereinander nahe verwandt sind. Für die meisten mitochondrialen Car- rier, wie auch für den 2-Oxoglutarat-Carrier konnte gezeigt werden, daß diese ohne eine sie zu den Organellen dirigierende Adressierungs-Sequenz ("Targeting"-Sequenz) in die Mitochondrien- me bran eingebaut werden (Runswick et al . , 1990, Biochemistry 29: 11033-11040) . Es ist also anzunehmen, daß die "Targeting"-Infor- mation im reifen Carrierprotein enthalten ist.
Im Gegensatz hierzu benötigen plastidäre Translokatoren für eine korrekte Adressierung zu der inneren Piastidenmembran eine entsprechende Präsequenz ("Targeting"-Sequenz) , die das anhängende reife Protein korrekt zu den Piastiden dirigiert (Übersichtsarti- kel hierzu: Keegstra et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40: 471-501; Lubben et al., 1988, Photosynth. Res. 17: 173-194; Flügge, 1990, J. Cell Sei. 96: 351-354). Neben der für die "Plastiden-Adressierung" nötigen Präsequenz gibt es im reifen Teil (der Teil des Proteins, der nach der Abspaltung der Präsequenz durch eine spezifische Protease verbleibt) der Plastidenhüllmembran-Proteine noch weitere Informationen, die für die spezifische Insertion der Proteine in die Membran verantwortlich sind und einen Transport der Hüllmembranproteine über die Hüllmembran in das Plastidenstroma oder, im Fall der Chloroplasten, die Thylakoidmembran verhindern (Knight und Gray, 1995, Plant Cell 7: 1421-1432 bzw.' eigene Untersuchungen: Brink et al . , 1995, J. Biol. Chem. 270: 20808-20815). Eigene Arbeiten zeigten ferner am Beispiel eines mitochondrialen Carriers, des ADP/ATP- Transporters, daß dieses Protein nicht oder nur mit einer sehr geringen Effizienz zu Piastiden dirigiert und dort in die Hüll- membran eingebaut werden kann. Selbst ein Hybridprotein, bestehend aus einer plastidären Präsequenz (die Information für die Plastiden-Adressierung enthaltend) und diesem mitochondrialen Carrier, zeigte gegenüber dem authentischen Protein einen kaum erhöhten Einbau in die Plastidenhüllmembran (Silva-Filho et al . , 1997, J. Biol. Chem. 272: 15264-15269; unveröffentlichte Beobachtungen) . Da für eine korrekte Insertion die Protein/Lipid-Wech- selwirkung von Bedeutung ist und sich die plastidäre Hüllmembran in ihrer Lipidzusammensetzung grundlegend von der anderer Zellorganellen und auch der Bakterien unterscheidet (Joyard et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199: 489-509), ist es sehr unwahrscheinlich, daß eine, wenn auch geringfügige, Insertion eines heterolo- gen Proteins, dann auch funktionell ist, d.h., daß ein Trans- porter aus anderen Systemen überhaupt in einer seiner Funktion entsprechenden Konformation und Orientierung in die Plastidenhüllmembran eingebaut werden kann.
Somit ist es nach gegenwärtigem Stand der Technik nicht möglich, mit Hilfe bekannter Piastiden-"Targeting" -Sequenzen z.B. mito- chondriale oder prokaryontische Dikarbonsäure-Transporter funktionell in die innere Plastidenhüllmembran zu integrieren. Beim gegenwärtigen Stand der Technik ist es erfolgversprechender, die für die Konstruktion der oben geschilderten Pflanzen notwendige DNA-Sequenz durch Klonierung des authentischen plastidären Glutamat/Malat-Translokators zu erhalten.
Obwohl dieses Transportsystem auch den Transport von Malat katalysiert, ist seine Primärstruktur anzunehmenderweise sehr unter- schiedlich von der des kürzlich identifizierten 2-Ketoglutarat/ Malat-Translokators. Versuche, den Translokator über eine niedrig stringente Durchmusterung einer pflanzlichen cDNA-Bibliothek mit einer von dem 2-Ketoglutarat/Malat-Translokator abgeleiteten Sonde zu identifizieren, blieben erfolglos, ebenso wie die Identifizierung des Translokators über eine biochemische Charakterisierung, Reinigung und Isolation des Glutamat/Malat-Transloka- tors .
Zur Identifizierung des Translokators wurde daher ein alternativer, molekularbiologischer, Ansatz gewählt, der auf der differen- tiellen Expression einer bestimmten mRNA-Spezies in verschiedenen cDNA-Populationen beruht (differentielles Screening; Ausführungs- beispiel 1) . Im Gegensatz zu C3-Planzen (z.B. Kartoffel, Tomate) besitzen C-Pflanzen, wie z.B. Hirse (Sorghum bicolor) oder Flave ria bidentis) zwei verschiedene Zelltypen, Mesophyll- und Bündel - scheidenzellen, die in die Produktion des Photoassimilates einge- bunden sind. In den Mesophyllzellen erfolgt die Primärfixierung des atmosphärischen Kohlendioxids unter Bildung eines C4-Körpers (z.B. Malat), der dann in die Bündelscheidenzellen transportiert wird. Dort läuft, nach Freisetzung des Kohlendioxids aus dem C4-Körper, die eigentliche Biosynthese des Photoassimilates ab. Es wurden cDNA Banken aus Mesophyllzellen und aus Bündelscheiden- zellen von Sorghum bicolor hergestellt und geprüft, welche mRNAs spezifisch nur in den Bündelscheidenzellen exprimiert werden. Auf diese Weise gelang es, einen Partial-cDNA-Klon zu identifizieren, der eine geringe Homologie mit dem 2-Oxoglutarat/Malat Transloka- tor aufwies (Wyrich et al . , 1998, Plant Mil. Biol. 37: 319-335). Das entsprechende cDNA-Insert wurde als Sonde für die anschließende Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek aus Sorgum bicolor genutzt und es konnte ein cDNA-Klon isoliert werden, der die vollständige cDNA (2088 Basenpaare) für das entsprechende Vorstufen- protein mit einer molekularen Masse von 59 kDa enthielt.
Ein Vergleich der aus der cDNA abgeleiteten Proteinsequenz mit Sequenzen der Datenbanken ergab eine nur geringe Ähnlichkeit mit dem bekannten 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator (ca. 50 %) . Somit konnte vermutet werden, daß diese cDNA für einen Transporter kodiert, dessen Aktivität unterschiedlich zu der des 2-Oxoglutarat/ Malat-Translokators ist. Ferner zeigte sich eine Homologie zu einer genomischen DNA-Sequenz aus Arabidopsis thaliana, die über die international verfolgten Sequenzierungsprojekte erhalten wurde. Diese Sequenz ist auf Chromosom 5 von Arabidopsis thaliana lokalisiert und zeigt ebenfalls geringe Homologie zur Sequenz des 2-Oxoglutarat/Malat-Translokators aus Spinat von ca. 50%. Im Rahmen des Genomsequenzierungsprojektes wurde hier nur auf die Homologie verwiesen, es erfolgte jedoch nicht die Bestimmung der Funktion. Die Funktionsbestimmung des durch die cDNA kodierten Transport - proteins erfolgte in einem heterologen Expressionssystem, der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe . Da aufgrund eigener Beobachtungen Transportproteine aus monokotylen Pflanzen nicht heterolog exprimiert werden können, wurden zunächst cDNA Sequenzen aus der C4-Pflanze Flaveria bidentis und aus der C3-Pflanzen Spinat isoliert, die der Sequenz der Sorghum bicolor cDNA entsprachen. Dann wurde das cDNA-Insert aus Flaveria bidentis in einen eukaryoti- schen Hefe-Expressionsvektor eingebracht und mit diesem Konstrukt Zellen der Spalthefe ( Schizosaccharomyces pombe) transformiert. Transformanden, die das entsprechende Plasmid exprimierten, wurden isoliert. Transportexperimente, durchgeführt mit in künstlichen Membranen rekonstituierten Membranfraktionen der Hefetrans- formanden, ergaben, daß dieser Translokator den Transport von Ma- lat im Gegentausch mit Glutamat (oder Aspartat) katalysiert. Im Gegensatz zu dem 2-Oxoglutarat/Malat-Tanslokator akzeptiert also dieser Translokator auch Aminosäuren (Glutamat und Aspartat) als Gegentauschsubstrate, siehe Ausführungsbeispiele 2 und 3. Der Transporter erhielt den Namen Glutamat/Malat-Translokator.
Die vorliegende Erfindung stellt also DNA-Sequenzen zur Verfügung, die aus einem pflanzlichen Genom stammen und für einen plastidären Glutamat/Malat-Translokator kodieren, wobei die in der Nukleotidabfolge enthaltene Information bei Einführung und Ex- pression in pflanzliche Zellen zur Bildung einer Ribonukleinsäure führt und über diese Ribonukleinsäure eine Glutamat/Malat-Translokator Aktivität in die Zellen eingeführt werden kann oder eine endogene Glutamat/Malat-Translokator Aktivität unterdrückt werden kann.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere die DNA-Sequenzen aus Sorghum bicolor (Hirse) mit der Nukleotidabfolge SEQ-ID No. 1, eine DNA-Sequenz aus Flaveria bidentis mit der Nukleotidabfolge SEQ-ID No. 3 und eine DNA-Sequenz aus Spinacia oleracea (Spinat) mit der Nukleotidabfolge SEQ-ID No. 5.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die mit der unter SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 genannten DNA-Sequenz oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Sub- stitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Dikarbonsäuretranslokators, insbesondere eines Glutamat/Malat-Translokators besitzt.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen. Um die Expression des Glutamat/Malat-Translokators in transformierten Zellen zu gewährleisten, kann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 in Plasmide eingebracht werden und dabei mit Steuerelementen für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontisehen Zellen kombiniert werden, siehe Ausführungsbeispiele 2 und 4. Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promoto- ren und andererseits Transkriptions-Terminatoren. Mit den Plasmi- den können eukaryontische Zellen transformiert werden mit dem Ziel der Expression einer übersetzbaren Botenribonukleinsäure (RNA) , die die Synthese eines plastidären Glutamat/Malat-Translokators in den transformierten Zellen erlaubt, oder mit dem Ziel der Expression einer nicht übersetzbaren, invers orientierten ("antisense"), Botenribonukleinsäure, die die Synthese der endogenen Glutamat/Malat-Translokatoren verhindert. Zu diesem Zweck könnten auch kürzere Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 oder DNA-Sequenzen mit einem relativ hohen Grad an Homologie (mehr als ca. 65 % Homologie) verwendet werden. Ebenso kann die Expression von endogenen Dikarbonsäuretransloka- toren durch die Expression eines für diesen Zweck konstruierten Ribozyms unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen inhibiert werden. Durch die Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz eines pflanzlichen Glutamat/Malat- Translokators ist eine Veränderung des pflanzlichen Stickstoffme- tabolismus möglich, deren wirtschaftliche Bedeutung darin liegt, daß eine Verbesserung der Weiterleitung von Glutamat aus dem Cytosol der Piastiden zu einer Veränderung des Verhältnisses von Kohlenhydraten (Zucker, Stärke, org. Säuren) und Fetten zugunsten der StickstoffVerbindungen (Aminosäuren, Proteine, evtl. Alka- loide) stattfindet. Es können somit Pflanzen erzeugt werden, die reicher an wertvollem Protein sind, jedoch einen geringeren Gehalt an Kohlenhydraten und Fetten aufweisen. Diese Modifikation steigert den ernährungsphysiologischen Wert von Pflanzen und da- mit auch deren wirtschaftlichen Wert. Weiterhin ermöglicht die heterologe Expression der beschriebenen Sequenz in Spalthefen (Ausführungsbeispiele 2 und 3; ferner: Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2155-2159) Struktur-Funktionsstudien des Glutamat/Malat-Translokators, die letztendlich zur Ent- wicklung eines spezifischen Hemmstoffs für dieses Protein führen könnte, insbesondere ist hier an die Herbizidentwicklung zu denken, da die Hemmung eines Proteins mit Schlüsselfunktion im Stoffwechselgeschehen zwangsweise letal für die Pflanze wäre. Ferner können diese Struktur-Funktionsstudien Grundlage für eine gerichtete Mutagenese der Substratbindungsstelle des Transloka- tors sein, um die Substratspezifität des Transporters gezielt zu verändern.
Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244: 1293-1299; Potrykus, 1991, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol . 42: 205-225). Zur Expression von kodierenden Sequenzen in pflanzen müssen diese mit transkriptioneil regulatorischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren genannt, sind bekannt (u. a. Koster-Töpfer et al . , 1989, Mol. Gen. Genet. 219: 390-396). Ferner müssen die Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminations-Signal versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Solche Elemente sind ebenfalls beschrieben (Gielen et al . , 1989, EMBO J. 8, 23-29). Der transkriptioneile Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Ter- minationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und -terminationsregionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Bei- spiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pA- CYC 184 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanze das Ti oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend beschrieben (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B-V. Ab- lasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al . , Critic. Rev. Plant Sei. 4: 1-46; An et al . , 1985, EMBO J. 4: 277-287). Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber Bioziden oder Antibiotika wie Kanamycin, Bleomy- cin oder Hygromycin verleiht. Der individuell eingeführte Marker wird daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektropo- ration sowie ballistische Methoden. Aus dem transformierten
Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Selektionsmedium ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mit gängigen molekularbiologischen Methoden auf die Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 (oder Teile dieser Sequenz oder Derivate dieser Sequenz) können auch in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für die Expression in Zellen von Spalthefen versehen werden, siehe Ausführungsbeispiel 2. Die Einführung des Glutamat/Malat-Translokators führt zu einer erheblichen Zunahme der durch Rekonstitution in künstliche Liposomen meßbaren Aktivität des Glutamat/Malat-Translokators in den rekombinanten Hefezellen. In rekombinaten Hefezellen ist eine vielfach höhere Malat-Transportaktivität nachweisbar. Es ist somit denkbar, mit Hilfe der beschriebenen DNA- Sequenz SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 (oder Teilen oder Derivaten dieser Sequenz) Hefezellen so zu verändern, daß sie einen veränderten Proteingehalt aufweisen. Hierbei käme der Vorteil eines plastidären Translokators aus Pflanzen zum tragen, nicht den endogenen Regulations- und Kompartiment-Adressierungsmechanismen der Spalt - hefen zu unterliegen. Diese Stämme wären insbesondere für die Futtermittelindustrie von herausragender Bedeutung.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 (oder Derivate oder Teile dieser Sequenz) können auch in Plasmide ein- gebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erlauben. Dadurch kann die Spezifität des Glutamat/Malat-Translokators verändert werden z.b. in Richtung einer Affinität für andere Dikarbonsäuren.
Ebenso könnte eine Unempfindlichkeit des Glutamat/Malat-Translokators für spezifische Herbizide erreicht werden. Mit Hilfe von Standardverfahren (Sambrock et al . , 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche und/oder Basendeletionen vorgenommen und/oder synthetische oder natürliche Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können Adapter oder linker hinzugefügt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die nicht benötigte DNA entfernen, eingesetzt werden. Dort wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. 5 Transitionen oder TransVersionen in Frage kommen, können in vi - tro-Mutagenese, " rimer epair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden wie z.B. die Expression des modifizier-
10 ten Proteins in Spalthefe und die Messung der modifizierten
Transporteigenschaften in artifiziellen Liposomen (siehe Ausführungsbeispiele 2 und 3; ferner: Loddenkötter et al . , 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2155-2159;. sowie Fischer et al., 1997, Plant Cell, 9: 453-462; Kammerer et al. 1998, Plant Cell 10:
15 105-117) oder die Messung der modifizierten Transporteigenschaften am in transgenen Pflanzen exprimierten Protein mit Hilfe einer kürzlich von uns zu diesem Zweck entwickelten Methode (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194: 181-185) angewandt.
20 Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 (oder Teile oder Derivate dieser Sequenz) kann dazu genutzt werden, nach Standardverfahren (insbesondere Hybridisierungs-Durchmuste- rung von cDNA-Bibliotheken mit niedriger Stringenz unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder Teilen der DNA-Se-
25 quenz SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 als Sonde oder die Erstellung von Sonden für stringente und niedrig stringente Durchmusterungs- Strategien durch Ableitung von degenerierten und/oder nicht degenerierten Primern aus der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz für PCR- Experimente mit DNA oder cDNA aus anderen Pflanzen aus dem Genom
30 von Pflanzen ähnliche Sequenzen zu isolieren, die für Proteine kodieren, die ebenfalls Dikarbonsäuren transportieren.
Die er indungsgemäße DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, 3 oder 5 enthält im übersetzten Protein Bereiche, die in der Lage sind, das im Cy- 5 toplasma an Ribosomen synthetisierte Protein spezifisch zu Pla- stiden zu dirigieren und das Auftreten des Proteins in anderen Membransystemen der Zelle zu verhindern. Dies steht im Gegensatz zu den bekannten mitochondrialen 2-Oxoglutarat Translokatoren, die eine solche Adressierungssequenz nicht enthalten. Der Pro- 0 teinbereieh, der das durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodierte Protein zu Piastiden dirigiert, liegt innerhalb der ersten hundert Aminosäuren des Proteins, ist für die Transportfunktion des Proteins nicht erforderlich und wird nach erfolgreicher Insertion des Proteins in die Plastidenhüllmembran entfernt. Durch 5 Austausch dieser "Plastid-targeting" -Sequenz gegen eine der bekannten "Targeting"-Sequenzen z.B. für Mitochondrien ließe sich das Translokator-Protein in ein anderes Membransystem eukaryonti- scher Zellen dirigieren und könnte dort möglicherweise die Transporteigenschaften über die Membran verändern. Ebenso könnte die "Plastid-targeting"-Sequenz des Glutamat/Malat-Translokators oder endogene Bereiche des reifen Proteins dazu genutzt werden, fremde Proteine (z.B. bakterielle Transportproteine oder Transporter aus Hefen) in die Piastiden bzw. in die Plastidenhüllmembran pflanzlicher Zellen zu dirigieren.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele werden die wichtigsten eingesetzten Verfahren im folgenden erläutert.
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung der cDNA für den Glutamat/Malat-Translokator aus Sorghum bicolor und Flaveria trinervia wurde der Phage Lambda ZA- PII sowie der Phagemid pBluescript II KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 7583-7600) verwendet.
Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor SAP-E (Truenit et al., 1996, Plant Cell 8: 2169-2182) verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sei. 66: 221-230) kloniert.
2. Bakterien- und Hefestämme
Für das pBluescriptKS (pBSC) Phagemid sowie für SAP-E- und pBi- nAR-Konstrukte wurde der E. coli Stamm DH5α (Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) verwendet .
Die Transformation der pBinAR-Konstrukte in Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium fcumefaciens-Stammes C58C1, pGV2260 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8720) durchgeführt.
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Hofgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch auf Richtigkeit und Orientierung analysiert. 4. Pflanzentransformation
Pro Transformation wurden 15 kleine mit Schmirgelpapier und Skalpell verwundete Blätter einer Tabak-Sterilkultur in 10 ml MS-Me- dium mit 2 % Saccharose gelegt, welches 100 μl einer unter strenger Selektion gewachsenen, transformierten Agrobacterium tumefa - ciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 15 minütigem leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6 % Glukose, 2 mg/1 Zeatinribose, 0,02 mg/1 Naphthylessigsäure, 0,02 mg Giberellin- säure, 500 mg/1 Betabactyl®, 100 mg/1 Kanamycin und 0,8 % Bacto- Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3.000 Lux Beleuchtungsstärke wurde die Betabactylkonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.
Hinterlegungen:
Am 12.11.1998 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Phagemide in Form von E. coli Stämmen, enthaltend diese Phage- mide, hinterlegt :
Phagemid pSbGMTl (GMTl-Sequenz SEQ-ID No. 1 aus
Sorghum bicolor) (DSM 12480) Phagemid pFbGMTl (GMTl-Sequenz SEQ-ID No. 3 aus Flaveria bidentis) (DSM 12478)
Phagemid pSoGMTl (GMTl-Sequenz SEQ-ID No. 5 aus
Spinacia oleracea) (DSM 12479)
Ausführungsbeispiel 1
Isolierung und Klonierung der für den Glutamat/Malat-Translokator kodierenden cDNAs
Aus Blättern von Sorghum bicolor wurde poly(A+)-RNA isoliert, mit Hilfe eines Standard-cDNA-Synthesekits in doppelsträngige cDNA überführt und diese in den Vektor Lambda-ZAPII kloniert (Wyrich et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37: 319-335). Parallel dazu wurde durch partiellen Verdau mit Pektinasen und Cellulasen aus Blättern von Sorghum bicolor Mesophyll- und Bündelscheidenzellen prä- pariert und aus diesen wiederum poly (A+) -RNA. Aus der Mesophyllbzw. Bündelscheiden-RNA wurde mit Hilfe der Reversen Transkrip- tase und radioaktiver Nukleotide eine Hybridisierungssonde hergestellt, mit der die cDNA-Bibliothek differentiell durchgemustert wurde. Die Sichtung führte u.a. zur Isolierung einer ca. 900 bp großen cDNA (HHU51) , die Ähnlichkeiten zu einer cDNA aus Spinat erkennen ließ, die für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator kodiert (Weber et al . , 1995, Biochemistry 34: 2521-2627) und die bei Sorghum bicolor bündelscheidenspezifisch exprimiert wird (Wy- rich et al . , 1998, Plant Mol. Biol. 37: 319-335).
Um Vollängenklone für die in HHU51 kodierten Transloaktorpartial- sequenzen zu isolieren, wurde die cDNA-Bibliothek mit dem cDNA- Klon HHU51 als Hybridisierungssonde durchgemustert. Positiv reagierende Lambda-Klone wurden nach Standardverfahren gereinigt. Das pBluescript-Phagemid mit dem cDNA-Insert kodierend für den Glutamat/Malat-Translokator wurde durch in vivo-Exzission (Short & Sorge, 1992, Meth. Enzymol. 216: 495-208) freigesetzt. Die
Klone wurden durch Bestimmung der DNA-Sequenz analysiert (Dideo- xymethode: Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467) und aus dieser DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 die Primärstruktur des Glutamat/Malat-Translokators (Klon pSbGMTl) be- stimmt.
Die cDNA aus Sorghum bicolor (Hirse) wurde anschließend benutzt, um die entsprechenden cDNA Klone aus Flaveria bidentis (Klon pFbGMTl) (SEQ-ID No. 3) und Spinacia oleracea (Spinat, Klon pSoGMTl) (SEQ-ID No . 5) zu isolieren.
Ausführungsbeispiel 2
Expression des Glutamat/Malat Translokators aus Flaveria bidentis in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe
Das Phagemid pBluescript (pBSC) , enthaltend die Insertion kodierend für den Glutamat/Malat-Translokator, wurde über die sich an den beiden Enden befindlichen EcoRI-Schnittstellen mit der Endo- nuclease EcoRI linearisiert und das so erhaltene Fragment in die singuläre EcoRI Klonierungsstelle des Hefe-Expressionsvektors SAP-E (Truenit et al . , 1996, Plant Cell 8: 2169-2182) kloniert. Nach Amplifikation des Konstrukts (SAP-GMT) in E. coli wurde das Plasmid in durch LiCl/PEG kompetent gemachte (Ito et al., 1983, J. Bact. 153: 163-168) Leucinsynthese-defiziente S. pombe Zellen transformiert. Transformanden wurden durch Selektion auf Minimal - medium ohne Leucin selektiert, da das SAP-GMT-Konstrukt den Hefe- zellen die Fähigkeit zum Wachstum auf leucinfreiem Medium verleiht. Ausführungsbeispiel 3
Messung der Glutamat/Malat-Translokator Aktivität in rekombinaten Hefelinien
Mit dem SAP-GMT Plasmid transformierte Hefezellen wurden in Mini- malmedium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 1.0 angezogen und durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min geerntet. Anschließend wurden die Zellen durch kräftiges Schütteln mit 1/2 vol (bezogen auf die Zellen) Glasperlen aufgebrochen und Glasperlen und Zellbruchstücke durch Zentrifugation (600 g für 1 min) abgetrennt. Der Überstand wurde auf eine Konzentration von 0.5 % (Gewicht/Volumen) Triton X-100 eingestellt, mit dem gleichen Volumen Liposomen versetzt und die resultierenden Proteoli- posomen sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Liposomen wurden zuvor durch Beschallen von Soj abohnen-Phospholipid (20 mg/ml) für 10 min bei 4°C in Gegenwart von 200 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 40 mM Malat und 60 mM Kaliumglukonat hergestellt. Nach dem Auftauen der Proteoliposomen und erneutem Beschallen der Sus- pension mit 10 Pulsen a l s wurden die Proteoliposomen vom umgebendem Medium durch Größenausschlußchromatographie auf Sephadex G-25, das zuvor mit 10 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 100 mM Natrium- glukonat und 50 mM Kaliumglukonat equilibriert worden war, abgetrennt. Die eluierten Proteoliposomen wurden für die Messung der Malat-Transportaktivität eingesetzt. Die Messung wurde nach der von Menzlaff und Flügge (1993, Biochim. Biophys. Acta 1147: 13-18) beschriebenen " Inhibitor-Stop" Methode durchgeführt.
Die Malat-Transportaktivität in den SAP-GMT Transformanden wurde mit der Malat-Transportaktivität von Transformanden verglichen, die lediglich mit dem Vektor SAP ohne die GMT-Insertion transformiert waren. Es zeigte sich, das die Malat-Transportaktivität in den SAP-GMT Transformanden (gemessen in pmol transportiertes 14C-Malat/mg Protein pro Minute) um ein Vielfaches höher war als in SAP Kontroll-Transformanden. Es konnte ferner gezeigt werden, daß, im Gegensatz zu dem bereits bekannten 2-Oxoglutarat/Malat- Translokator, der Glutamat/Malat-Translokator den Transport von Aminosäuren (Glutamat/Aspartat) im Gegentausch mit Malat zu katalysieren vermag, siehe Tabelle 1. Tabelle 1
Substrat-Spezifitäten des rekonstituierten Glutamat/Malat-Translokators
Rekombinantes Rekombinanter fbGMT-Protein 2-Oxoglutarat/Malat
Translokator
Liposomen beladen mit:
Malat (100 %) (100 %)
Succinat 179 % 83 %
2-Oxoglutarat 57 % 44 %
Glutamat 99 % 3 %
Aspartat 109 % 13 %
Der rekombinante und in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe exprimierte Glutamat/Malat-Translokator bzw. zum Vergleich der rekombinante 2-Oxoglutarat/Malat wurden in Liposomen rekonstituiert, die mit den angegebenen Substraten vorbeladen worden waren. Die Transportaktivitäten wurden ermittelt wie von Flügge (Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1110: 112-118) beschrieben und sind in Prozent der Aktivität angegeben, die mit Malat-vorbelade- nen Liposomen gemessen wurden. Die 100% Transportaktivität betrug 175 pMol/mg Protein pro Minute.
Daten von Weber et al., 1995, Biochemistry 34: 2621-2627.
Ausführungsbeispiel 4
Transformation von Pflanzen mit einer Konstruktion zur Überexpression der Kodierregion des Glutamat/Malat-Translokators
Aus dem Phagemid pBluescript-GMT (pBSC-GMT) , der als Insertion die cDNA für den Glutamat/Malat-Translokator aus Spinat enthielt
(siehe Ausführungsbeispiel 1) , wurde die Insertion durch Restrik- tionsverdau mit EcoRV und Smal isoliert und in den Vektor pBinAR
(Höfgen u. Willmitzer, 1990, Plant Sei. 66: 221-230) der zuvor mit dem Enzym Smal geschnitten worden war, kloniert. Nach Ampli- fikation des resultierenden Konstrukts pBinAR-GMT in E. coli wur- den das Konstrukt in Agrobakterien transformiert und diese dann zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffel eingesetzt.
Die erhaltenen Transformanden wurden mit Hilfe von Southern-Blot Analysen auf die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten Chimären Gens untersucht. Mit Hilfe der "Gesamtblatt-Rekonstituti- onsmethode" (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194: 181-185) wurde die Malattransportaktivität im Vergleich zu Kontrolltransforman- den (transformiert mit Vektor pBinAR ohne Insertion) untersucht, ebenso das C/N-Verhältnis, Photosyntheserate, Photorepiration und Wachstum.

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Sequenz, die die Kodierregion eines Glutamat/Malat-Trans- lokators enthält, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenz die Nukleotidabfolge SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3 oder SEQ-ID No. 5 aufweist.
2. DNA-Sequenz, die mit der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3 oder SEQ-ID No . 5 gemäß Anspruch 1 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidares Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Glutamat/Malat-Translokators besitzt.
3. Plasmide enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet ist.
4. Phagemid pSbGMTl hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 12480 als E. coli Stamm DH5α pSbGMTl enthaltend dieses Plasmid.
5. Phagemid pFbGMTl hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 12478 als E. coli Stamm DH5α pFbGMTl enthaltend dieses Plasmid.
Phagemid pSoGMTl hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 12479 als E. coli Stamm DH5α pSoGMTl enthaltend dieses Plasmid.
7. Bakterien, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 bzw. enthaltend Plasamide/Phagemide gemäß den Ansprüchen 3 bis 6, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.
8. Hefen, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 bzw. enthaltend Plasmide gemäß Anspruch 3, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.
9. Hefen enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 bzw. enthaltend Plasmide gemäß Anspruch 3, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet ist.
10. Pflanzenzellen enthaltend eine DNA- Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 bzw. Anspruch 3.
11. Transformierte Pflanzenzellen und aus diesen regenerierte transgene Pflanzen enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese DNA-Sequenz als Bestandteil eines re- kombinaten DNA-Moleküls in die Pflanzenzellen eingeführt wird.
12. Verwendung von einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet ist, zur Einführung in pro- oder eukaryonti- sehe Zellen, wobei diese DNA- Sequenz mit Steuerelementen, die die Transkription und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft ist und zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Glutamat/Malat-Translokators bewirkt, führt.
13. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet ist, zur Isolierung von DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, das die biologische Aktivität eines Glutamat/Malat-Translokators besitzt.
14. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet ist, wobei diese Sequenz eine kodierende Re- gion enthält, die für ein reifes Protein mit der biologischen Aktivität eines Glutamat/Malat-Translokators kodiert, zur Kombination mit "Targeting"-Sequenzen für andere Zellkompar- timente oder zelluläre Membransysteme, wodurch das reife Protein in andere Kompartimente oder Membransysteme dirigiert wird.
15. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet ist, zur Identifizierung von Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf den Transport von Dikarbonsäu- ren über die innere Plastidenhüllmembran haben.
16. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Se- quenz abgeleitet ist, zur Isolierung entsprechender genomischer Klone.
17. Verwendung von Promotorbereichen oder von Promotorteilbereichen gemäß Anspruch 16 zur gewebespezifischen Expression von Genen.
18. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet ist zur Herstellung einer DNA-Sequenz, die für einen pflanzlichen plastidären Dikarbonsäuretranslokator mit einer veränderten Spezifität kodiert.
19. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet ist, zur Identifizierung von Insertionsmu- tanten, zur homologen Rekombination oder zur Expression einer nicht translatierbaren RNA, die mittels eines " antisense" -Ef - fektes, einer Kosupress'ion oder einer Ribozymaktivität die Synthese eines oder mehrerer endogener plastidärer Glutamat/ Malat-Translokatoren in den Zellen verhindert.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6465217B1 (en) * 2000-07-05 2002-10-15 Paradigm Genetics, Inc. Methods and compositions for the modulation of chorismate synthase and chorismate mutase expression or activity in plants
DE10163167A1 (de) * 2001-12-21 2003-07-03 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren und Verwendung coryneformer Bakterien
US7329797B2 (en) 2004-12-08 2008-02-12 Ceres, Inc. Modulating plant carbon levels
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US7335760B2 (en) 2004-12-22 2008-02-26 Ceres, Inc. Nucleic acid sequences encoding zinc finger proteins
US8222482B2 (en) 2006-01-26 2012-07-17 Ceres, Inc. Modulating plant oil levels
EP2275142A3 (de) 2006-06-30 2011-05-11 Andre Koltermann Konjugate für Krebs-Immuntherapie
CN117535312B (zh) * 2024-01-10 2024-04-09 中国农业大学 一种液泡膜阴离子通道蛋白在调控玉米碳氮平衡中的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4420782C1 (de) * 1994-06-15 1995-08-17 Fluegge Ulf Ingo Prof Dr DNA-Sequenz, kodierend einen 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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