HU220252B - Aminosav-transzporter DNS-szekvenciák, transzportert tartalmazó plazmidok, baktériumok, élesztők és növények és azok alkalmazása - Google Patents

Aminosav-transzporter DNS-szekvenciák, transzportert tartalmazó plazmidok, baktériumok, élesztők és növények és azok alkalmazása Download PDF

Info

Publication number
HU220252B
HU220252B HU9500030A HU9500030A HU220252B HU 220252 B HU220252 B HU 220252B HU 9500030 A HU9500030 A HU 9500030A HU 9500030 A HU9500030 A HU 9500030A HU 220252 B HU220252 B HU 220252B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ile
gly
thr
leu
ser
Prior art date
Application number
HU9500030A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9500030D0 (en
HUT68809A (en
Inventor
Wolf-Bernd Frommer
Original Assignee
HOECHST Schering AgrEvo GmbH.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HOECHST Schering AgrEvo GmbH., filed Critical HOECHST Schering AgrEvo GmbH.,
Publication of HU9500030D0 publication Critical patent/HU9500030D0/hu
Publication of HUT68809A publication Critical patent/HUT68809A/hu
Publication of HU220252B publication Critical patent/HU220252B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány olyan DNS-szekvenciákkal kapcsolatos, melyek aminosavtranszporterek kódolórégióit tartalmazzák, mely transzporterek növényi genomba való bejuttatása módosítja a metabolitok szállítását az ezen DNSszekvenciákat tartalmazó transzgenikus növényekben, kapcsolatos plazmidokkal, baktériumokkal, élesztőgombákkal és növényekkel, valamint kapcsolatos ezek alkalmazásával is.
Számos növényfaj esetében ismert, hogy az energiában gazdag vegyületek a floemhez sejtfalon keresztül való eljuttatása az egész sejten keresztül megy végbe. Az aminosavak sejtfalon keresztül való penetrációját lehetővé tevő transzportermolekulák nem ismertek.
Baktériumokban számos aminosavtranszport-rendszert jellemeztek már. Az aromás aminosavak esetében 5 különböző transzportért írtak le, melyek közül az egyik a fenilalanint vagy a tirozint, vagy a triptofánt képes transzportálni, míg a többi egyéni aminosavakra specifikus (lásd Sarsero et al., 1991, J. Bacteriol. 173:3231-3234). A szállítási folyamat sebességi konstansa azt jelzi, hogy a specifikus transzport kevésbé hatékony. Számos transzporterprotein esetében klónozták a megfelelő géneket. Ezt úgy érték el, hogy transzporthiányos mutánsokat használtak, melyeket expreszsziós vektorban inszertekként DNS-ffagmentekkel való transzformálás után a transzportáló képességükre szelektáltak (lásd Wallace et al., 1990, J. Bacteriol. 172:3214-3220). A mutánsokat aminosavak toxikus analógjainak jelenlétében való szaporodási képességüktől függően szelektálták, mivel ezeket nem tudták felvenni és így nem lehetett károsítani.
Megfelelő komplementációs kísérleteket végeztek el eukarióta élesztőgombával, Saccharomyces cerevisiae-vel. Tanaka és Fink (1985, Gene 38:205-214) leírtak egy hisztidintranszportert, melyet egy mutációkomplementációval azonosítottak. Vandelbol et al (1989, Gene, 83:153-159) egy prolintranszportert írtak le Saccharomyces cerevisiae esetében. Az élesztőgomba két eltérő permeázt tartalmaz a prolin esetén. Az egyik kisebb hatékonysággal szállít és más aminosavakhoz is használható, míg a másik egy prolinspecifikus szállító, mely nagy affinitással dolgozik. Ez utóbbit a put4 génből kódolták. Ez a gén egy 69 kD molekulasúlyú peptid nyílt leolvasási keretét hordozza. A protein 12 membránpenetráló régiót tartalmaz, azonban nincs a szekrécióhoz való semmilyen N-terminális jelszekvenciája. Ez tipikus tulajdonsága az integrál membránproteineknek. A permeázok homológiát mutatnak az élesztőgombából származó arginin és hisztidin permeázokkal, azonban az Escherichia co/zból származó prolin permeázzal nem.
Növényi sejtek esetében, dohányszuszpenzió-tenyészetekkel végzett kísérletek alapján azt találták, hogy az arginin, az aszparagin, a fenilalanin és a hisztidin transzportja pH- és energiafuggó. Ha a leucin 1000-szeres feleslegben van, meggátolja a többi aminosav szállítását, ami feltételezi, hogy az összes ugyanazt a transzportért használja (McDaniel et al., 1982., Plánt Physiol. 69:246-249). Li és Bush (1991, Plánt Physiol. 96:
1338-1344) két transzportrendszert határoztak meg az alifás semleges aminosavak esetében a Béta vulgáris plazmamembrán vezikulumaiban. Egyrészt az alanin, a metionin, a glutamin és a leucin helyettesítik egymást a transzporterproteinen, másrészt az izoleucin, a valin és a treonin rendelkezik kölcsönösen versenyképes hatással. Vegyes kompetíciós kinetikai vizsgálatban (Li és Bush, 1990, Plánt Physiol. 94:268-277) 4 különböző transzportrendszert különböztettek meg. Az összes neutrális aminosav részére rendelkezésre álló transzporter mellett, mely alacsony affinitással dolgozik, létezik egy nagy affinitású típus is, mely alacsony affinitást mutat az izoleucinnal, a treoninnal, a valinnal és a prolinnal szemben. További transzporterek léteznek savas, valamint bázikus aminosavak részére is.
A növényi transzporterproteinekhez transzportermolekula vagy -gén nem ismert.
Vannak leírt DNS-szekvenciák, melyek tartalmazzák egy növényi aminosavtranszporter kódolórégióját, és melynek a nukleotidszekvenciában tartalmazott információja lehetővé teszi a növényi genomba való integrálódás révén RNS képződését, melynek révén egy új aminosavtranszport-aktivitás adható a növényi sejteknek, vagy egy endogén aminosavtranszporter-aktivitás expresszálható.
Az aminotranszporter fogalma alatt például egy olyan cDNS-szekvenciát kell érteni, mely az Arabidopsis thalianaból származó aminotranszportert kódol.
Az aminotranszporter kódolórégiójának azonosításához egy olyan folyamatot végeztünk el, mely lehetővé teszi a transzportermolekulákat kódoló növényi DNS-szekvenciák izolálását, a Saccharomyces cerevisiae élesztőgomba specifikus mutánsaiban való expreszszálás eszközével. Ehhez megfelelő élesztőgomba-mutánsokat kell biztosítani, melyek nem képesek felvenni egy olyan anyagot, melyhez egy növényi génkönyvtárból kell izolálni a transzportermolekula kódolórégióját.
Egy olyan mutánst írnak le Jauniaux és munkatársai (1987, Eur. J. Biochem. 164 : 601-606), mely egyedüli nitrogénforrásként prolint vagy citrullint tartalmazó tápközegben nem képes szaporodni.
Egy olyan élesztőgombatörzs előállításához, mely növényi aminosavtranszporterek azonosításához használható, egy élesztőgomba-mutánst - mely nem képes egyedüli nitrogénforrásként prolint és/vagy citrullint tartalmazó tápközegben szaporodni - transzformálunk pFL 61 plazmiddal, mely hordozza inszertként az Arabidopsis thalianaból származó cDNS-könyvtár cDNS-fragmentjeit.
Továbbá egy kettős mutánst, a JT16-ot (Tanaka and Fink, Gene 38:205-214) - mely a hisztidinszintézisben (his4) és a hisztidinfelvételben (hipl) hiányos - a leírt pFL 61 plazmiddal transzformáljuk és hisztidin hozzáadása mellett tápközegben szaporítjuk.
Ekkor meglepetésre azt találtuk, hogy az élesztógombasejtek transzformálásában bizonyos növényi cDNS-fragmentek kiegészíthetik az élesztőgombamutációt. A cDNS-ből kódolt proteinek tulajdonságainak analízisével ki lehet mutatni, hogy a mutáció kiegé2
HU 220 252 Β szításéért egy széles specifitású spektrummal rendelke- Egy ilyen aminosavtranszporter egy kódolórégióját ző növényi aminosavtranszportert kódoló kódolórégió mutatja be például a következő nukleotidszekvenciák a felelős (lásd a 3. példát). egyike: 1. szekvencia (1. számú szekvencia):
CTTAAAACAT TTATTTTATC TTCTTCTTGT TCTCTCTTTC TCTTTCTCTC ATCACT 56
ATG AAG AGT TTC AAC ACA GAA GGA CAC AAC CAC TCC ACG GCG GAA 101
Me t 1 Ly s Ser Phe Asn 5 Thr Glu Gly Hi s Asn 10 Hi s Ser Thr Al a Glu 15
TCC GGC GAT GCC TAC ACC GTG TCG GAC CCG ACA AAG AAC GTC GAT 146
Ser Gly Asp Al a Tyr 20 Thr Val Ser Asp Pro 25 Thr Lys Asn Val As p 30
GAA GAT GGT CGA GAG AAG CGT ACC GGG ACG TGG CTT ACG GCG AGT 191
Glu Asp Gly Arg G1 u 35 Lys Arg Thr Gly Thr 40 Trp Leu Thr Al a Ser 45
GCG CAT ATT ATC ACG GCG GTG ATA GGC TCC GGA GTG TTG TCT TTA 236
Al a Hi s Ile Ile Thr 50 Al a Val Ile Gly Ser 55 Gly Va 1 Leu Ser Leu 60
GCA TGG GCT ATA GCT CAG CTT GGT TGG ATC GCA GGG ACA TCG ATC 281
Al a Trp Al a Ile Al a 65 Gin Leu Gly Trp Ile 70 Al a Gly Thr Ser Ile 75
TTA CTC ATT TTC TCG TTC ATT ACT TAC TTC ACC TCC ACC ATG CTT 326
Leu Le u Ile Phe Se r 80 Phe Ile Thr Tyr Phe 85 Thr Ser Thr Me t Leu 90
GCC GAT TGC TAC CGT GCG CCG GAT CCC GTC ACC GGA AAA CGG AAT 371
Al a Asp Cys Tyr Arg 95 Al a Pro Asp Pro Va 1 100 Thr Gly Lys Arg Asn 105
TAC ACT TAC ATG GAC GTT GTT CGA TCT TAC CTC GGT GGT AGG AAA 416
Tyr Thr Tyr Me t Asp 110 Val Val Arg Ser Tyr 115 Leu Gly Gly Arg Lys 120
GTG CAG CTC TGT GGA GTG GCA CAA TAT GGG AAT CTG ATT GGG GTC 461
Val Gin Leu Cy s Gly 125 Val Al a Gin Tyr Gly 130 Asn Leu Ile G1 y Val 135
ACT GTT GGT TAC ACC ATC ACT GCT TCT ATT AGT TTG GTA GCG GTA 506
Thr Val Gly Tyr Thr 140 Ile Thr Al a Ser Ile 145 Ser Leu Val Al a Val 150
GGG AAA TCG AAC TGC TTC CAC GAT AAA GGG CAC ACT GCG GAT TGT 551
Gly Lys Ser Asn Cy s 155 Phe Hi s Asp Lys Gly 160 Hi s Thr Al a Asp Cys 165
ACT ATA TCG AAT TAT CCG TAT ATG GCG GTT TTT GGT ATC ATT CAA 596
Thr Ile Ser Asn Tyr 170 Pro Tyr Me t Al a Val 175 Phe Gly Ile Ile Gin 180
GTT ATT CTT AGC CAG ATC CCA AAT TTC CAC AAG CTC TCT TTT CTT 641
Val Ile Leu Ser Gin 185 Ile Pro Asn Phe Hi s 190 Ly s Leu Ser Phe Leu 195
TCC ATT ATG GCC GCA GTC ATG TCC TTT ACT TAT GCA ACT ATT GGA 686
Se r Ile Me t Al a Al a 200 Va 1 Me t Ser Phe Thr 205 Tyr Al a Thr I 1 e Gly 210
HU 220 252 Β
ATC GGT CTA GCC ATC Ile 215 GCA ACC GTC GCA GGT GGG AAA GTG GGT AAG 731
Ile Gly Leu Al a Al a Thr Val Al a Gly 220 Gly Ly s Val Gly Ly s 225
ACG AGT ATG ACG GGC ACA GCG GTT GGA GTA GAT GTA ACC GCA GCT 776
Thr Ser Me t Thr Gly 230 Thr Al a Val Gly Val 235 As p Val Thr Al a Al a 240
CAA AAG ATA TGG AGA TCG TTT CAA GCG GTT GGG GAC ATA GCG TTC 821
Gin Ly s Ile Trp Arg 245 Ser Phe Gin Al a Val 250 Gly Asp Ile Al a Phe 255
GCC TAT GCT TAT GCC ACG GTT CTC ATC GAG ATT CAG GAT ACA CTA 866
Al a Tyr Al a Tyr Al a 260 Thr Val Leu Ile Glu 265 Ile Gin Asp Thr Leu 270
AGA TCT AGC CCA GCT GAG AAC AAA GCC ATG AAA AGA GCA AGT CTT 911
Arg Ser Ser Pro Al a 275 Glu Asn Ly s Al a Me t 280 Ly s Arg Al a Ser Leu 285
GTG GGA GTA TCA ACC ACC ACT TTT TTC TAC ATC TTA TGT GGA TGC 956
Val Gly Val Ser Thr 290 Thr Thr Phe Phe Tyr 295 Ile Leu Cys Gly Cys 300
ATC GGC TAT GCT GCA TTT GGA AAC AAT GCC CCT GGA GAT TTC CTC 1001
Ile Gly Tyr Al a Al a 305 Phe Gly Asn Asn Al a 310 Pro Gly Asp Phe Leu 315
ACA GAT TTC GGG TTT TTC GAG CCC TTT TGG CTC ATT GAC TTT GCA 1046
Thr Asp Phe Gly Phe 320 Phe Glu Pro Phe Trp 325 Leu Ile Asp Phe Al a 330
AAC GCT TGC ATC GCT GTC CAC CTT ATT GGT GCC TAT CAG GTG TTC 1091
Asn Al a Cys Ile Al a 335 Val Hi s Leu Ile Gly 340 Al a Tyr Gin Val Phe 345
GCG CAG CCG ATA TTC CAG TTT GTT GAG AAA AAA TGC AAC AGA AAC 1136
Al a Gin Pro Ile Phe 350 Gin Phe Val Glu Ly s 355 Ly s Cy s Asn Arg Asn 360
TAT CCA GAC AAC AAG TTC ATC ACT TCT GAA TAT TCA GTA AAC GTA 1181
Tyr Pro Asp Asn Lys 365 Phe Ile Thr Ser Glu 370 Tyr Ser Va 1 Asn Val 375
CCT TTC CTT GGA AAA TTC AAC ATT AGC CTC TTC AGA TTG GTG TGG 1226
Pro Phe Leu Gly Lys 380 Phe Asn Ile Ser Leu 335 Phe Arg Leu Va 1 Trp 390
AGG ACA GCT TAT GTG GTT ATA ACC ACT GTT GTA GCT ATG ATA TTC 1271
Arg Thr Al a Tyr Val 395 Val Ile Thr Thr Val 400 Val Al a Me t Ile Phe 405
CCT TTC TTC AAC GCG ATC TTA GGT CTT ATC GGA GCA GCT TCC TTC 1316
Pro Phe Phe Asn Al a 410 Ile Leu Gly Leu Ile 415 Gly Al a Al a Ser Phe 420
TGG CCT TTA ACG GTT TAT TTC CCT GTG GAG ATG CAC ATT GCA CAA 1361
Trp Pro Leu Thr Val 425 Tyr Phe Pro Val Glu 430 Me t Hi s Ile Al a Gin 435
HU 220 252 Β
ACC Thr AAG Ly s ATT Ile AAG Ly s AAG Lys 440 TAC Tyr TCT GCT AGA TGG ATT GCG CTG AAA AGG 1406
Ser Al a Arg Trp 445 Ile Al a Leu Ly s Thr 450
ATG TGC TAT GTT TGC TTG ATC GTC TCG CTC TTA GCT GCA GCC GGA 1451
Me t Cy s Tyr Val Cy s Leu Ile Val Ser Leu Leu Al a Al a Al a Gly
455 460 465
TCC ATC GCA GGA CTT ATA AGT AGT GTC AAA ACC TAC AAG CCC TTC 1496
Ser Ile Al a Gly Leu Ile Ser Ser Va 1 Lys Thr Tyr Lys Pro Phe
470 475 480
CGG ACT ATG CAT GAG TGAGTTTGAG ATCCTCAAGA GAGTCAAAAA 1541
Arg Thr Met His Glu
485
TATATGTAGT AGTTTGGTCT TTCTGTTAAA CTATCTGGTG TCTAAATCCA 1591
ATGAGAATGC TTTATTGCTA AAACTTCATG AATCTCTCTG TATCTACATC 1641
TTTCAATCTA ATACATATGA GCTCTTCCAA AAAAAAAAAA AAAA 1685
2. szekvencia (2. számú szekvencia):
CTATTTTAT AATTCCTCTT CTTTTTGTTC ATAGCTTTGT AATTATAGTC TTATTTCTCT TTAAGGCTCA ATAAGAGGAG 29 79 124
ATG GGT GAA ACC GCT GCC GCC AAT AAC Asn Asn CAC Hi s 10 CGT Arg CAC Hi s CAC Hi s CAC Hi s CAT Hi s 15
Me t 1 Gly Glu Thr Al a 5 Al a Al a
CAC GGC CAC CAG GTC TTT GAC GTG GCC AGC CAC GAT TTC GTC CCT 169
Hi s Gly Hi s Gin Va 1 20 Phe Asp Val Alá Ser 25 Hi s Asp Phe Va 1 Pro 30
CCA CAA CCG GCT TTT AAA TGC TTC GAT GAT GAT GGC CGC CTC AAA 214
Pro Gin Pro Al a Phe 35 Ly s Cys Phe Asp Asp 40 Asp Gly Arg Leu Ly s 45
AGA ACT GGG ACT GTT TGG ACC GCG AGC GCT CAT ATA ATA ACT GCG 259
Arg Thr Gly Thr Val 50 Trp Thr Alá Ser Alá 55 H i s Ile Ile Thr Al a 60
GTT ATC GGA TCC GGC GTT TTG TCA TTG GCG TGG GCG ATT GCA CAG 304
Val Ile Gly Ser Gly 65 Val Leu Ser Leu Al a 70 Trp Al a Ile Alá Gin 75
CTC GGA TGG ATC GCT GGC CCT GCT GTG ATG CTA TTG TTC TCT CTT 349
Leu Gly Trp Ile Al a 80 Gly Pro Alá Val Me t 85 Leu Leu Phe Ser Leu 90
GTT ACT CTT TAC TCC TCC ACA CTT CTT AGC GAC TGC TAC AGA ACC 394
Val Thr Leu Tyr Ser 95 Ser Thr Leu Leu Ser 100 As p Cys Tyr Arg Thr 105
GGC GAT GCA GTG TCT GGC AAG AGA AAC TAC ACT TAC ATG GAT GCC 439
Gly As p Al a Val Ser 110 Gly Ly s Arg Asn Tyr 115 Thr Tyr Me t As p Al a 120
GTT CGA TCA ATT CTC GGT GGG TTC AAG TTC AAG ATT TGT GGG TTG 434
Val Arg Ser Ile Leu 125 Gly Gly Phe Lys Phe 130 Ly s Ile Cy s Gly Leu 135
HU 220 252 Β
ATT Ile CAA Gin TAC Tyr TTG Leu AAT Asn 140 CTC Leu TTT Phe GGT Gly ATC GCA ATT GGA Gly TAC Tyr ACG Thr ATA Ile 150 529
Ile Al a 145 Ile
GCA GCT TCC ATA AGC ATG ATG GCG ATC AAG AGA TCC AAC TGC TTC 574
Al a Al a Ser Ile Ser 155 Me t Me t Al a Ile Ly s 160 Arg Ser Asn Cy s Phe 165
CAC AAG AGT GGA GGA AAA GAC CCA TGT CAC ATG TCC AGT AAT CCT 619
Hi s Lys Ser Gly Gly 170 Lys Asp Pro Cys Hi s 175 Me t Ser Ser Asn Pro 180
TAC ATG ATC GTA TTT GGT GTG GCA GAG ATC TTG CTC TCT CAG GTT 664
Tyr Me t Ile Val Phe 185 Gly Val Al a G1 u Ile 190 Leu Leu Ser Gin Val 200
CCT GAT TTC GAT CAG ATT TGG TGG ATC TCC ATT GTT GCA GCT GTT 709
Pro Asp Phe Asp Gin 205 Ile Trp Trp Ile Ser 210 Ile Val Al a Al a Val 220
ATG TCC TTC ACT TAC TCT GCC ATT GGT CTA GCT CTT GGA ATC GTT 754
Me t Ser Phe Thr Tyr 225 Ser Al a Ile Gly Leu 230 Al a Leu Gly Ile Va 1 235
CAA GTT GCA GCG AAT GGA GTT TTC AAA GGA AGT CTC ACT GGA ATA 799
Gin Val Al a Al a Asn 240 Gly Val Phe Ly s Gly 245 Ser Leu Thr Gly Ile 250
AGC ATC GGA ACA GTG ACT CAA ACA CAG AAG ATA TGG AGA ACC TTC 844
Ser Ile Gly Thr Val 255 Thr Gin Thr Gin Lys 260 Ile Trp Arg Thr Phe 265
CAA GCA CTT GGA GAC ATT GCC TTT GCG TAC TCA TAC TCT GTT GTC 889
Gin Al a Leu Gly As p 270 Ile Al a Phe Al a Tyr 275 Ser Tyr Ser Val Val 280
CTA ATC GAG ATT CAG GAT ACT GTA AGA TCC CCA CCG GCG GAA TCG 934
Leu Ile Glu Ile Gin 285 Asp Thr Va 1 Arg Ser 290 Pro Pro Al a Glu Ser 295
AAA ACG ATG AAG AAA GCA ACA AAA ATC AGT ATT GCC GTC ACA ACT 979
Lys Thr Me t Ly s Ly s 300 Al a Thr Ly s Ile Ser 305 Ile Al a Va 1 Thr Thr 310
ATC TTC TAC ATG CTA TGT GGC TCA ATG GGT TAT GCC GCT TTT GGA 1024
Ile Phe Tyr Me t Leu 315 Cy s Gly Ser Me t Gly 320 Tyr Al a Al a Phe Gly 325
GAT GCA GCA CCG GGA AAC CTC CTC ACC GGT TTT GGA TTC TAC AAC 1069
As p Al a Al a Pro Gly 330 Asn Leu Leu Thr Gly 335 Phe Gly Phe Tyr Asn 340
CCG TTT TGG CTC CTT GAC ATA GCT AAC GCC GCC ATT GTT GTC CAC 1114
Pro Phe Trp Leu Leu 245 Asp Ile Al a Asn Al a 350 Al a Ile Val Val Hi s 355
CTC GTT GGA GCT TAC CAA GTC TTT GCT CAG CCC ATC TTT GCC TTT 1159
Leu Va 1 Gly Al a Tyr 360 Gin Val Phe Al a Gin 365 Pro Ile Phe Al a Phe 370
HU 220 252 Β
ATT Ile GAA AAA TCA GTC GCA GAG AGA TAT CCA GAC AAT GAC TTC CTC Leu 385 1204
Glu Lys Ser Val 375 Al a Glu Arg Tyr Pro 330 As p Asn Asp Phe
AGC AAG GAA TTT GAA ATC AGA ATC CCC GGA TTT AAG TCT CCT TAC 1249
Ser Lys Glu Phe Glu Ile Arg Ile Pro Gly Phe Ly s Ser Pro Tyr
390 395 400
AAA GTA AAC GTT TTC AGG ATG GTT TAC AGG AGT GGC TTT GTC GTT 1294
Lys Val Asn Val Phe Arg Met Val Tyr Arg Ser Gly Phe Val Val
405 410 415
ACA ACC ACC GTG ATA TCG ATG CTG ATG CCG TTT TTT AAC GAC GTG 1339
Thr Thr Thr Val Ile Ser Met Leu Me t Pro Phe Phe Asn As p Val
420 425 430
GTC GGG ATC TTA GGG GCG TTA GGG TTT TGG CCC TTG ACG GTT TAT 1334
Va 1 Gly Ile Leu Gly Al a Leu Gly Phe Trp Pro Leu Thr Val Tyr
435 440 445
TTT CCG GTG GAG ATG TAT ATT AAG CAG AGG AAG GTT GAG AAA TGG 1429
Phe Pro Val Glu Me t Tyr Ile Lys Gin Arg Ly s Val Gl u Ly s Trp
450 455 460
AGC ACG AGA TGG GTG TGT TTA CAG ATG CTT AGT GTT GCT TGT CTT 1474
Ser Thr Arg Trp Val Cys Leu Gin Me t Leu Ser Val Al a Cy s Leu
465 470 475
GTG ATC TCG GTG GTC GCC GGG GTT GGA TCA ATC GCC GGA GTG ATG 1519
Val Ile Ser Val Val Al a Gly Val Gly Ser Ile Al a Gly Val Me t
480 485 490
CTT GAT CTT AAG GTC TAT AAG CCA TTC AAG TCT ACA TAT 1558
Leu Asp Leu Lys Val Tyr Lys Pro Phe Lys Ser Thr Tyr
495 500
TGATGATTAT GGACCATGAA CAACAGAGAG AGTTGGTGTG TAAAGTTTAC 1608
CATTTCAAAG AAACTCCAA AAATGTGTAT ATTGTATGTT GTTCTCATTT 1658
CGTATGGTCT CATCTTTGTA ATAAAATTTA AAACTTATGT TATAAATTAT 1708
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 1740
A találmány transzformált élesztőgombatörzsek segítségével azonosított DNS-szekvenciáit - például az
1. és a 2. számú szekvenciákat - plazmidokba lehet bejuttatni, így vezető elemekkel lehet egyesíteni az eukarióta sejtekben való expresszióhoz (lásd a 4. példát). Ezek az irányító elemek egyrészt a transzkripciós promotereken, másrészt a transzkripciós terminátorokon találhatók. A plazmidokkal eukarióta sejtek transzformálhatok a transzlálható mRNS expresszálásának céljával, mely lehetővé teszi egy aminosavtranszporter sejtekben való szintézisét, vagy egy nem transzlálható RNS expresszálásának céljával, mely kivédi egy endogén aminosavtranszporter sejtekben való szintézisét. A növényi aminosavtranszporterek szekvenciáinak megfelelő RNS expresszálásával a növényi aminosavmetabolizmus, valamint a teljes nitrogénmetabolizmus módosítása válik lehetségessé, melynek gazdasági jelentősége egyértelmű. A nitrogén az a tápanyag, mely a növekedés korlátozásáért felelős. A csíravonalak, valamint a magok csírázási kapacitása közvetlenül a raktározó szövet nitrogéntartalmától függ. A magas értékű, magas fehérjetartalmú élelmiszer-alapanyagok létrehozása a megfelelő nitrogénellátástól függ. A nitrogén alapvetően aminosavak formájában szállítódik. Az aminosavak a növények learatott részeihez való szállításában elért növekedése ezért a mezőgazdasági növények hozamában elért növekedést eredményez. Az egyes szervek aminosavfelvételének megvalósítási lehetősége az ilyen szervek minőségi fejlődését teszi lehetővé, mely a hasznosítási feldolgozás követelményei miatt kevés nitrogént tartalmaznak, például a burgonya, melyet a keményítőtermeléshez termesztenek. Ezenkívül a teljes növény módosítható, aminek következtében az egyes szövetek, például a levelek növekedését lelassítjuk, míg a learatott részekét meggyorsítjuk. Ehhez elképzelhető a növények vegetatív fázisának meghosszabbítása, mely a raktározó anyagok fokozott képződéséhez vezethet. A kétszikű és az egyszikű növények genetikai módosítá7
HU 220 252 Β si eljárásai már ismertek (lásd például Gasser, C. S., Fraley, R. T., 1989, Science 244:1293-1299; Potrykus, 1991, Ann. Rév. Plánt Mól. Bioi. Plánt Physiol. 42:205-225). A növényekben való expresszióhoz a kódolószekvenciákat a transzkripciós szabályozó elemekhez kell párosítani. Az ilyen, promotereknek nevezett elemek ismertek (EP 375091).
Továbbá a kódolórégiókat el kell látni transzkripciós terminációs jelekkel, melyekkel helyesen írhatók át. Ilyen elemeket szintén leírtak már (lásd Gielen et al., 1989, EMBO J. 8:23-29). A transzkripciós startrégió lehet natív és/vagy homológ, lehet idegen és/vagy heterológ a gazdanövénnyel. Ha kívánatos, a terminációs régiók egymással felcserélhetők. A transzkripciós start- és terminációs régiók DNS-szekvenciája előállítható szintetikus úton, vagy beszerezhető természetes fonásból, vagy beszerezhető szintetikus és természetes DNS-alkotórészek keverékéből. A magasabb rendű növényekben az idegen gének bejuttatásához számos klónozó vektor áll rendelkezésre, melyek magukba foglalnak egy replikációs jelet az E. colihoz, és egy markért, mely lehetővé teszi a transzformált sejtek szelekcióját. Ilyen vektorokra példák a pBR 322, a pUCsorozat, az Ml3 mp-sorozat, a pACYC 184 stb. A kívánt gén növényekbe való bejuttatásának módszerétől függően más DNS-szekvenciák lehetnek megfelelőek. Ha a Ti- vagy Ri-plazmid kerül felhasználásra például a növényi sejt transzformálásához, legalább a jobb szél, gyakran azonban a Ti- és a Ri-plazmid T-DNS-ének a jobb és a bal széle is hozzá van kapcsolva szomszédos régióként a bejuttatandó génhez. A növényi sejtek transzformálásához a T-DNS használatát intenzív kutatásoknak vetették alá, és részletesen leírták az EP 120 516 számú szabadalomban, Hoekama, In: The Binary Plánt Vector System Offset-drukkerij Kantéra Β. V. Alblasserdam, (1985), Chapter V.; Fraley et al., Crit. Rév. Plánt. Sci., 4:1-46 és An et al., (1985) EMBO J. 4:27287. Ha a DNS-t egyszer bejuttatták a genomba, mindig stabil lesz és az eredeti transzformált sejtek utódaiban is megmarad. Normális esetben tartalmaz egy szelekciós markert, mely rezisztenciát indukál a transzformált növényi sejtekben egy biociddal vagy antibiotikummal szemben, mint például a kanamycin, a G 418, bleomycin, hygromycin vagy phosphinotricin stb. Az egyes használt markerek lehetővé kell tegyék a transzformált sejtek olyan sejtek közül való szelektálását, melyekből hiányzik a bejuttatott DNS.
A DNS egy növényi gazdasejtbe való bejuttatásához az Agrobacteriumokat használó transzformálás mellett számos más technikák is felhasználhatók. Ezen technikák közé tartoznak a protoplasztfűzió, a DNS mikroinjektálása és az elektroporáció, valamint ballisztikus módszerek és virális fertőzések. A transzformált növényi anyagból egész növények regenerálhatok megfelelő tápközegben, melyek a szelektáláshoz tartalmaznak antibiotikumokat vagy biocideket. A kapott növények ezután tesztelhetők a bejuttatott DNS jelenlétére. Az injektálási és elektroporációs technikákban nincs különleges követelmény a plazmidokkal szemben. Egyszerű plazmidok, mint például a pUC-származékok használhatók. Ha azonban ilyen transzformált sejtekből regenerálunk teljes növényeket, szükség van a szelektálható markergén jelenlétére. A transzformált sejtek a szokásos módon növekednek a növényen belül (lásd McCormick et al., (1986) Plánt Cell Reports 5:81-84). Ezek a növények normálisan szaporíthatok és keresztezhetők az ugyanilyen transzformált géneket vagy más géneket tartalmazó növényekkel. A kapott hibrid utód rendelkezik a megfelelő fenotipikus tulajdonságokkal.
A találmány DNS-szekvenciái bejuttathatok plazmidokba is, és így vezető elemekkel egyesíthetők a prokarióta sejtekben való expresszióhoz. Az eukarióta aminosavtranszporter transzlálható, RNS-szekvenciájának baktériumokból való előállítása ahhoz vezet, és a prokarióták és eukarióták membránszerkezetei között lévő jelentős eltérések ellenére azt jelenti, meglepően, hogy a prokarióták most már képesek hasznosítani egy bizonyos szubsztrátokkal szemben specifitással rendelkező eukarióta-aminosavtranszportert. Ez lehetővé teszi olyan baktériumtörzsek termelését, melyek a transzporter és szubsztrátjának tulajdonságaira vonatkozó vizsgálatokhoz használhatók.
A találmány kapcsolatos olyan baktériumokkal is, melyek tartalmazzák a találmány plazmidjait.
A találmány DNS-szekvenciái bejuttathatok olyan plazmidokba is, melyek lehetővé teszik a mutagenezist vagy egy szekvenciamódosítást a prokarióta vagy eukarióta rendszerekben lévő DNS-szekvenciák rekombinálásán keresztül. Ily módon az aminosavtranszporter specifitása megváltoztatható, így megváltoztatható a transzporter specifitása is.
A találmány vonatkozik olyan plazmidok származékaira vagy részeire is, melyek tartalmazzák a találmány DNS-szekvenciáit, és melyek felhasználhatók prokarióta vagy eukarióta sejtek transzformálásához.
Standard eljárásokat alkalmazva (lásd Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) báziscserék végezhetők el, vagy természetes vagy szintetikus szekvenciák csatolhatok. A DNS-fragmentek egymáshoz való kötéséhez adapterok vagy kötők juttathatók be a fragmentekbe. Továbbá olyan manipulációk végezhetők el, melyek megfelelő restrikciós hasítási helyeket hoznak létre, vagy melyek eltávolítják a feleslegben lévő DNS-t vagy restrikciós hasítási helyeket. Ahol inszertációkat, deléciókat vagy szubsztitúciókat, mint amilyen például a tranzíció és transzverzió, elvégzése a cél, ott in vitro mutagenezis, primer javítás, restrikció vagy ligálás alkalmazható. Az analízis módszereihez általában szekvenciaanalízis, restrikciós analízis és más biokémiai molekuláris biológiai módszerek alkalmazhatók. Az egyes manipulációk után az alkalmazott DNSszekvencia hasítható és kapcsolható egy másik DNSszekvenciához. Az egyes plazmidszekvenciák ugyanabban vagy különböző plazmidokban klónozhatok.
A találmány DNS-szekvenciáinak és plazmidjainak származékai vagy részei szintén felhasználhatók prokarióta és eukarióta sejtek transzformálásához. Továbbá a találmány DNS-szekvenciái a standard eljárásoknak megfelelően felhasználhatók a különböző növény8
HU 220 252 Β fajok genomjában lévő hasonló szekvenciák izolálásához, melyek szintén aminosav vagy más oligoszacharid transzportermolekulákat kódolnak. Ezekkel a szekvenciákkal a növényi sejtek transzformálásához lehet szerkezeteket előállítani, melyek módosítják a transzportfolyamatokat a transzgenikus növényekben.
A rokon DNS-szekvenciák részletezéséhez először DNS-könyvtárakat kell készíteni, melyek jellemzőek egy növénytípus génjének tartalmára, vagy egy növénytípusban a gének expressziójára. A korábbiak a genomkönyvtárak, míg az utóbbiak a cDNS-könyvtárak. Ezekből a rokon szekvenciák izolálhatok a találmány DNSszekvenciáit használva próbákként. Ha a rokon gént azonosítottuk és izoláltuk, lehetővé válik az ezen szekvencia által kódolt proteinek tulajdonságainak analízise és szekvenciájának meghatározása.
A találmány alapját képező példák megértéséhez, a tesztek elvégzéséhez szükséges és önmagában ismert összes eljárást felsoroljuk:
1. Klónozási eljárás
Az E. coliban való klónozáshoz a pBluescriptSK vektort (Short et al., 1988, Nucl. Acids Rés. 16:7583-7600) alkalmaztuk.
Az élesztőgombák transzformálásához a pFL61 vektort (Minet and Lacroute, 1990 Curr Génét 18:287-291) alkalmaztuk.
A növényi transzformáláshoz a génszerkezeteket a pBIN-Hyg bináris vektorban klónoztuk.
2. Bakteriális és élesztőgombatörzsek
A pBluescript vektorhoz, valamint a pBinAR szerkezetekhez az E. coli XLblue törzset (Bullock et al., 1987, Biotechniques, 5, 376-378) alkalmaztuk.
A cDNS-könyvtár élesztőgombában való expreszszálásához kiindulási törzsként az élesztőgomba 22574d törzset (Jauniaux et al., 1987, Eur. J. Biochem. 164:601-606) használtuk.
A burgonyában történő plazmidtranszformációhoz az Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzset használtuk (Bevan (1984) Nucl. Acids Rés. 12:8711-8720).
3. Az Agrobacterium tumefaciens transzformációja
A DNS Agrobacteriumokban való transzferálását közvetlen transzformációval végeztük Höfgen and Willmitzer (1988, Nucl. Acids Rés. 16:9877) módszerét használva. A transzformált Agrobacterium plazmid DNS-ét Bimbóim és Doly módszerével összhangban izoláltuk (1979, Nucl. Acids Rés. 7:1513-1523) és gélelektroforézissel analizáltuk megfelelő restrikciós hasítás után.
4. Növénytranszformáció
Steril burgonyatenyészet tíz kis, szikével megsértett levelét helyeztük 10 ml 2% aminosavat tartalmazó MS tápközegbe, mely 30-50 μΐ Agrobacterium tumefaciens szelekció alatt szaporított egyéjszakás tenyészetét tartalmazta. Három - öt percig tartó enyhe rázatás után a leveleket 1,6% glükózt, 2 mg/1 zeatinribózt 0,02 mg/1 naftilecetsav, 0,02 mg/1 giberellinsav, 500 mg/1 klaforán, 50 mg/1 kanamicin és 0,8% bacto-agar-tartalmú MS tápközegre helyeztük. Egyhetes, 25 °C hőmérsékletű, 3000 lux megvilágítású inkubálás után a tápközeg klaforán koncentrációját a felére csökkentettük.
Letétek
A következő plazmidokat és élesztőgombatörzseket deponáltuk a Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) törzsgyűjteményben (Braunschweig, Germany) 1992. június 12-én (törzsgyűjteményszámok):
Plazmid pPPPl-20 (DSM 7129)
Plazmid pBinPPPl-20 (DSM 7130)
Az ábrák leírása
1. ábra a pPPPl-20 plazmidot mutatja, mely tartalmazza az 1. számú szekvenciát. A vékonyan húzott vonal a pBluescriptSK-ból származó szekvenciának felel meg. A vastagabb vonal a cDNS-inszertet képviseli. Az inszertek hasítási helyeit jelöltük.
2. ábra a tápközegből való 14C-prolin-felvételt mutatja. no=a felvétel időtartama vetélytárs nélkül prolin=a jelöletlen prolin négyszeres feleslegű időtartama citrullin=a jelöletlen citrullin négyszeres feleslegű időtartama
GABA=a gamma-aminobutirinsav négyszeres feleslegű időtartama idő=az idő másodpercekben cpm=a percenként számolt lebomlás
3. ábra a pAAP2 plazmidot mutatja, mely tartalmazza a
2. számú szekvenciát. A vékonyan húzott vonal a pBluescriptSK-ból származó szekvenciának felel meg. A vastagabb vonal a cDNS-inszertet képviseli. Az inszertek hasítási helyeit bemutattuk.
4. ábra a kompetíciós kísérletet mutatja a 22574d: :AAP2 élesztőgomba-vonallal, melyben mérjük a l4C-jelölésű L-prolin tápközegből való felvételét más aminosavak vagy analógjaik négyszeres feleslegben való jelenléte mellett. Az aminosavak esetében használt standard rövidítések mellett a következőket is használtuk:
Cit=citrullin; D-Pro=D-prolin; OH-Pro=hidroxi-prolin és A2C=acetidin-2-karboxiles sav.
4. ábra a kompetíciós kísérletet mutatja a JT16: :AAP2 élesztőgomba-vonallal, melyben mérjük a 14C-jelölésű L-hisztidin tápközegből való felvételét más aminosavak vagy analógjaik tízszeres feleslegben való jelenléte mellett. Az aminosavak esetében használt standard rövidítések mellett a következőket is használtuk:
Cit=citrullin; Om=omitin; Can=canavanin; és NH4= =ammónium.
A következő példák a klónozást és az azonosítást írják le, valamint a növényi aminosavtranszporterek funkcióit és alkalmazását.
1. példa
Egy növényi aminosavtranszporter cDNS-ének klónozása
A 22574d élesztőgombatörzs proteintranszport mutációjának elvégzéséhez (Jauniaux et al., 1987, Eur. J. Biochem. 164: 601 -606) és/vagy a JT16 törzs hisztidinszintézisének és transzportmutációjának elvégzéséhez (Tanaka and Fink, 1985, Gene, 38: 205-214) az Arabidopsis thalianából származó fiatal csíravonal cDNS-ét használtuk (kétleveles állapot) a pFL61 élesztőgomba
HU 220 252 Β expressziós vektorban (Minet and Lacroute, 1990, Curr Génét 18: 287-291), melyet Minet (Minet et al., 1992, Plánt J. 2:417-422) tett beszerezhetővé. A cDNS-inszerttel rendelkező körülbelül 1 pg vektort transzformáltuk a 22574d és/vagy JT16 élesztőgombatörzsekbe Dohmen et al., (1991, Yeast 7:691-692) módszerével. Az élesztőgomba-transzformánsokat, melyek egyedüli nitrogénforrásként 4 mM prolint vagy 6 mM hisztidont tartalmazó tápközegben képesek voltak szaporodni, tenyésztettük. A DNS-vonalakból plazmid DNS-t állítottunk elő standard módszerekkel. Azok a kiónok, melyek az adott mutációt elvégezték, a cDNS-inszert hasonló restrikciós típusait tartalmazó plazmidokat tartalmaztak. Ezek mérete az 1,6-1,7 kb között változott.
2. példa
A pFL61-pppl-20 plazmid cDNS inszertjének szekvenciaanalízise
Az 1. példához hasonló módon nyert PPP1-20 élesztőgomba-vonalból, mely a 22574d mutáció ellenére képes volt egyedüli nitrogénforrásként prolin mellett szaporodni, a pFL61-pppl-20 plazmidot inszertáltuk, és a cDNS-inszertet az 1. példa szerint állítottuk elő.
Szintetikus oligonukleotidokat használva az inszertet Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467) módszerét használva szekvenáltuk. A szekvenciát fent adtuk meg.
Hasonlóképpen egy olyan élesztőgomba-vonalból, mely a his4/hipl kettős mutáció ellenére képes szaporodni hisztidintartalmú tápközegben, a pFL61-aap2 plazmidot izoláltuk, melynek inszertjét szintén egy NotI fragmentként klónoztuk a pBluesc-riptSK-ban. A kapott pAAP2 plazmidot szekvenáltuk, és a szekvenciát (2. számú szekvencia) fent adtuk meg. A pAAP2 plazmid a pPPPl-20 plazmid szerkezetéhez (lásd 1. ábra) hasonló szerkezettel rendelkezik, azonban az 1. számú szekvencia inszertje helyett a 2. számú szekvencia inszertjét hordozza (lásd a 3. ábrát).
3. példa
Az élesztőgomba PPP1-20 vonal és AAP2 vonal 14Cjelölésű proteinfelvételi vizsgálatai
A 22574d::PPPl-20 és 22574d::AAP2 élesztőgomba-vonalakat, melyeket az 1. példához hasonló módon nyertünk, folyékony tápközegben szaporítottuk, míg a tenyészetek elérték a logaritmikus fázist. A tenyészet centrifugálása után a sejteket mostuk és 100 mm tris/HCl pH 4,5, 2 mM MgCl2 és 0,6 M szorbit elegyében vettük fel. A szuszpenzió körülbelül 100 μΐ értékét hozzáadtuk 0,5 mM L-prolin+14C-jelölésű L-prolin ugyanazon puffer 100 μΐ mennyiségében lévő elegyéhez. A jelölt aminosav felvételét a Cirillo által leírt eljárás szerint mértük (1989, Meth. Enzymol. 174:617-622). Egyrészt a jelölt aminosav felvételét összehasonlítottuk a proteinmódosító dietil pirokarbonát anyaggal való koinkubálással, mely anyag inhibitora az aminosavtranszportnak a Béta vulgárisból származó membránvezikulumokban, másrészt pedig más proteinmódosító anyagokkal való koinkubálással. A számított redukciót az I. és II. táblázatokban mutatjuk be. A kompetíciós vizsgálat, melyben a transzporter különböző aminosavakkal és analógokkal való specifitása leolvasható, a II. táblázatban került bemutatásra a PPP1 -20 esetében és a 4. ábrán az AAP2 esetében. Egy analóg vizsgálatot irtunk le az 5. példában, melyben a JT16::AAP2 vonal hisztidinfelvételi kompetíciót teszteltük. A PPP1-20 időtartamát a 2. ábrán mutatjuk be.
4. példa
Növények transzformálása aminosavtranszporterek kódolórégiójának túlexpresszálására szolgáló szerkezettel.
Az Arabidopsisból származó aminosavtranszporterhez való cDNS-t inzertként tartalmazó pPPPl-20 plazmidból az inzert egy belső fragmentjét izoláltuk BamHI-gyel való hasítás után, és a pAJ-ból származó BamHl hasítási helyre klónoztuk, melyet először a BamHl enzimmel linearizáltunk. Ezután a cDNS-t a pA7-ből származó EcoRI/HindlII fragmentként állítottuk elő, és a pBIN-HYG vektorba klónoztuk. Az Agrobacteriumokkal való transzformáció után ezt dohányés burgonyalevél-szegmentek fertőzéséhez inzertáltuk.
A függetlenül nyert transzformánsokat, melyekben az intact nem újrarendezett kiméra gén jelenlétét bemutattuk Southern lenyomatanalízissel, teszteltük az aminosav- és a nitrogéntartalomban bekövetkezett módosulásokra. Ezenkívül teszteltük az aminosavszintézis, a fotoszintézis mértékét és a transzportációt.
5. példa
Az AAP2 élesztőgomba-vonalban a 14C-jelölésű hisztidinfelvétel vizsgálatai
Az 1. példához hasonló módon nyert JT16: :AAP2 élesztőgomba-vonalat folyékony tápközegben szaporítottuk a logaritmikus fázis eléréséig. A tenyészet centrifugálása után a sejteket mostuk, és 10 mm tris/HCl pH 4,5, 2 mm MgCl2 és 0,6 M szorbit elegyében vettük fel. Megközelítően 100 ml szuszpenziót adtunk 100 μΐ ugyanilyen pufferben lévő 0,5 mm L-hisztidin+1 pCi 14C-jelölésű L-hisztidin oldatában. Ajelölt aminosav felvételét a Cirillo (1989, Meth. Enzymol. 174:617-622) által leírtakkal alapjában véve egyező módon mértük. A jelölt aminosav felvételét egy kompetíciós vizsgálatban összehasonlítottuk a különböző aminosavak és analógok tízszeres feleslegben való felvételével. A kapcsolatot az 5. ábrán mutatjuk be.
I. táblázat
Az aminosavtranszportálás proteinmódosító anyagokkal való gátlása 22574d: :PPP1-2O élesztőgombatörzsekben
0,1 mM DEPC (dietil-pirokarbonát) 65
10 μΜ CCCP (karbonil-cianid-mklorofenilhidrazon) <3
10 μΜ 2,4 DNP (dinitrofenol) <3
1 mM nátrium-arzenát 35
10 μΜ antimicin A 29
500 μΜ PCMBS (p-kloromerkurybenzénszulfonsav) 78
HU 220 252 Β
11. táblázat
Az. egyszeres, négyszeres, tízszeres feleslegben lévő aminosavak és analógok kompetíciója 22574d: :PPP1-2O élesztőgombatörzsben
Felesleg % fennmaradó transzport lx 4x ΙΟχ
aktivitás
glutaminsav 64 27 30
aszparaginsav 78 27
lizin 86 83
hisztidin 81 79 58
arginin 85 88 74
threonin - 50 -
L-prolin 49 21 14
D-prolin 98 95
3,4-di-OH-prolin 86 49
acetidin-2-karboxilsav 91 48
OH-prolin 81 45
valin - 77 47
izoleucin - 67 -
aszparagin 64 57
glutamin - 27 -
Felesleg % fennmaradó transzport lx 4x 10x
szerin 53 18
cisztein - 21 -
metionin 28 8
glicin 69 16
alanin 55 29 23
leucin - -
tirozin - -
triptofán 82 71 48
fenilalanin 45 16
citrullin 44
gamma-aminobutirinsav 90
111. táblázat
Az aminosavtranszportok proteinmódosító anyagokkal való gátlása JT16:: AAP2 élesztőgombatörzsben
%-os transzport inhibitor nélkül
1 mM DEPC (dietilpirokarbonát) 3,1 + 1,6
10 μΜ CCCP (karbonil-cianidm-klorofenilhidrazon) 15,6+2,1
10 μΜ 2,4 DNP (dinitrofenol) 7,6+1,6
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (20)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Aminosav membrán transzportra alkalmas transzporter kódolórégióját tartalmazó, növényből származó DNS-szekvencia, amely a nukleotidszekvenciában a növényi genomba integrálódva a növényi sejtekbe új aminosavtranszport aktivitást bevezető RNS-képződést, vagy egy endogén transzporteraktivitás represszálódását biztosító információval rendelkezik.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely a következő nukleotidszekvenciát (1. számú szekvencia) tartalmazza:
    CTTAAAACAT TTATTTTATC TTCTTCTTGT TCTCTCTTTC TCTTTCTCTC ATCACT 56
    ATG AAG AGT TTC AAC ACA GAA GGA CAC Me t 1 Ly s Ser Phe Asn 5 Thr Glu Gly Hi s TCC GGC GAT GCC TAC ACC GTG TCG GAC Ser Gly Asp Al a Tyr 20 Thr Val Se r Asp GAA GAT GGT CGA GAG AAG CGT ACC GGG Glu Asp Gly Arg Glu 35 Lys Arg Thr Gly GCG CAT ATT ATC ACG GCG GTG ATA GGC Al a Hi s Ile Ile Thr 50 Al a Val Ile Gly GCA TGG GCT ATA GCT CAG CTT GGT TGG Al a Trp Al a Ile Al a Gin Leu Gly Trp
    AAC CAC TCC ACG GCG GAA 101
    Asn His Ser Thr Alá Glu 10 15
    CCG ACA AAG AAC GTC GAT 146
    Pro Thr Lys Asn Val Asp 25 30
    ACG TGG CTT AGG GCG AGT 191
    Thr Trp Leu Thr Alá Ser 40 45
    TCC GGA GTG TTG TCT TTA 236
    Ser Gly Val Leu Ser Leu 55 60
    ATC GCA GGG ACA TCG ATC 281
    Ile Alá Gly Thr Ser Ile
    70 75
    HU 220 252 Β
    TTA Leu CTC Leu ATT Ile TTC Phe TCG Ser 80 TTC ATT ACT Thr TAC TTC ACC TCC ACC ATG CTT Leu 90 326 Phe Ile Tyr Phe 85 Thr Ser Thr Me t GCC GAT TGC TAC CGT GCG CCG GAT CCC GTC ACC GGA AAA CGG AAT 371 Al a Asp Cys Tyr Arg 95 Al a Pro As p Pro Val 100 Thr Gly Lys Arg Asn 105 TAC ACT TAC ATG GAC GTT GTT CGA TCT TAC CTC GGT GGT AGG AAA 416 Tyr Thr Tyr Me t As p 110 Val Va 1 Arg Ser Tyr 115 Leu Gly Gly Arg Lys 120 GTG CAG CTC TGT GGA GTG GCA CAA TAT GGG AAT CTG ATT GGG GTC 461 Val Gin Leu Cys Gly 125 Val Al a Gin Tyr Gly 130 Asn Leu Ile Gly Val 135 ACT GTT GGT TAC ACC ATC ACT GCT TCT ATT AGT TTG GTA GCG GTA 506 Thr Val Gly Tyr Thr 140 Ile Thr Al a Ser Ile 145 Ser Leu Val Al a Va 1 150 GGG AAA TCG AAC TGC TTC CAC GAT AAA GGG CAC ACT GCG GAT TGT 551 Gly Ly s Ser Asn Cy s 155 Phe Hi s As p Ly s Gly 160 Hi s Thr Al a As p Cy s 165 ACT ATA TCG AAT TAT CCG TAT ATG GCG GTT TTT GGT ATC ATT CAA 596 Thr Ile Ser Asn Tyr 170 Pro Tyr Me t Al a Val 175 Phe Gly Ile Ile Gin 180 GTT ATT CTT AGC CAG ATC CCA AAT TTC CAC AAG CTC TCT TTT CTT 641 Val Ile Leu Ser Gin 185 Ile Pro Asn Phe Hi s 190 Ly s Leu Ser Phe Leu 195 TCC ATT ATG GCC GCA GTC ATG TCC TTT ACT TAT GCA ACT ATT GGA 686 Ser Ile Me t Al a Al a 200 Val Me t Ser Phe Thr 205 Tyr Al a Thr Ile Gly 210 ATC GGT CTA GCC ATC GCA ACC GTC GCA GGT GGG AAA GTG GGT AAG 731 Ile Gly Leu Al a Ile 215 Al a Thr Va 1 Al a Gly 220 Gly Ly s Val Gly Ly s 225 ACG AGT ATG ACG GGC ACA GCG GTT GGA GTA GAT GTA ACC GCA GCT 776 Thr Ser Me t Thr Gly 230 Thr Al a Va 1 Gly Val 235 As p Val Thr Al a Al a 240 CAA AAG ATA TGG AGA TCG TTT CAA GCG GTT GGG GAC ATA GCG TTC 821 Gin Ly s Ile Trp Arg 245 Ser Phe Gin Al a Va 1 250 Gly As p Ile Al a Phe 255 GCC TAT GCT TAT GCC ACG GTT CTC ATC GAG ATT CAG GAT ACA CTA 866 Al a Tyr Al a Tyr Al a 260 Thr Val Leu Ile Glu 265 Ile Gin Asp Thr Leu 270 AGA TCT AGC CCA GCT GAG AAC AAA GCC ATG AAA AGA GCA AGT CTT 911 Arg Ser Ser Pro Al a 275 Glu Asn Ly s Al a Me t 280 Ly s Arg Al a Ser Leu 285 GTG GGA GTA TCA ACC ACC ACT TTT TTC TAC ATC TTA TGT GGA TGC 956 Val Gly Val Ser Thr 290 Thr Thr Phe Phe Tyr 295 Ile Leu Cys Gly Cy s 300
    HU 220 252 Β
    ATC GGC TAT GCT Al a GCA Al a 305 TTT Phe GGA Gly AAC AAT GCC CCT GGA Gly GAT Asp TTC CTC 1001 Ile Gly Tyr Asn Asn Al a 310 Pro Phe Leu 315 ACA GAT TTC GGG TTT TTC GAG CCC TTT TGG CTC ATT GAC TTT GCA 1046 Thr As p Phe Gly Phe 320 Phe Glu Pro Phe Trp 325 Leu Ile Asp Phe Al a 330 AAC GCT TGC ATC GCT GTC CAC CTT ATT GGT GCC TAT CAG GTG TTC 1091 Asn Al a Cys Ile Al a 335 Val Hi s Leu Ile Gly 340 Al a Tyr Gin Va 1 Phe 345 GCG CAG CCG ATA TTC CAG TTT GTT GAG AAA AAA TGC AAC AGA AAC 1136 Al a Gin Pro Ile Phe 350 Gin Phe Val Glu Lys 355 Ly s Cy s Asn Arg Asn 360 TAT CCA GAC AAC AAG TTC ATC ACT TCT GAA TAT TCA GTA AAC GTA 1181 Tyr Pro Asp Asn Lys 365 Phe lle Thr Ser Glu 370 Tyr Ser Va 1 Asn Va 1 375 CCT TTC CTT GGA AAA TTC AAC ATT AGC CTC TTC AGA TTG GTG TGG 1226 Pro Phe Leu Gly Ly s 380 Phe Asn Ile Ser Leu 385 Phe Arg Leu Val Trp 390 AGG ACA GCT TAT GTG GTT ATA ACC ACT GTT GTA GCT ATG ATA TTC 1271 Arg Thr Al a Tyr Val 395 Val Ile Thr Thr Val 400 Val Al a Me t Ile Phe 405 CCT TTC TTC AAC GCG ATC TTA GGT CTT ATC GGA GCA GCT TCC TTC 1316 Pro Phe Phe Asn Al a 410 Ile Leu Gly Leu Ile 415 Gly Al a Al a Ser Phe 420 TGG CCT TTA ACG GTT TAT TTC CCT GTG GAG ATG CAC ATT GCA CAA 1361 Trp Pro Leu Thr Val 425 Tyr Phe Pro Val Glu 430 Me t Hi s Ile Al a Gi n 435 ACC AAG ATT AAG AAG TAC TCT GCT AGA TGG ATT GCG CTG AAA ACG 1406 Thr Ly s Ile Ly s Lys 440 Tyr Ser Alá Arg Trp 445 Ile Al a Leu Ly s Thr 450 ATG TGC TAT GTT TGC TTG ATC GTC TCG CTC TTA GCT GCA GCC GGA 1451 Me t Cy s Tyr Val Cys 455 Leu Ile Val Ser Leu 460 Leu Al a Al a Al a Gly 465 TCC ATC GCA GGA CTT ATA AGT AGT GTC AAA ACC TAC AAG CCC TTC 1496 Ser Ile Al a Gly Leu 470 Ile Ser Ser Val Lys 475 Thr Tyr Ly s Pro Phe 480 CGG Arg ACT Thr ATG Me t CAT Hi s GAG Glu 485 TGAGTTTGAG ATCCTCAAGA GAGTCAAAAA 1541 TATATGTAGT AGTTTGGTCT TTCTGTTAAA CTATCTGGTG TCTAAATCCA 1591 ATGAGAATGC TTTATTGCTA AAACTTCATG AATCTCTCTG TTTCAATCTA ATACATATGA GCTCTTCCAA AAAAAAAAAA TATCTACATC AAAA 1641 1685
    HU 220 252 Β
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely a következő nukleotidszekvenciát (2. számú szekvencia) tartalmazza:
    CTATTTTAT AATTCCTCTT CTTTTTGTTC ATAGCTTTGT AATTATAGTC TTATTTCTCT TTAAGGCTCA ATAAGAGGAG 29 79 124 ATG GGT GAA Glu ACC Thr GCT Al a 15 GCC Al a GCC AAT AAC Asn CAC Hi s 10 CGT CAC CAC Hi s CAC Hi s CAT Hi s 15 Me t Gly Al a Asn Arg Hi s CAC GGC CAC CAG GTC TTT GAC GTG GCC AGC CAC GAT TTC GTC CCT 169 Hi s Gly Hi s Gin Val 20 Phe Asp Val Al a Ser 25 Hi s Asp Phe Val Pro 30 CCA CAA CCG GCT TTT AAA TGC TTC GAT GAT GAT GGC CGC CTC AAA 214 Pro Gin Pro Al a Phe 35 Lys Cy s Phe Asp Asp 40 As p Gly Arg Leu Ly s 45 AGA ACT GGG ACT GTT TGG ACC GCG AGC GCT CAT ATA ATA ACT GCG 259 Arg Thr Gly Thr Val 50 Trp Thr Al a Ser Al a 55 Hi s Ile Ile Thr Al a 60 GTT ATC GGA TCC GGC GTT TTG TCA TTG GCG TGG GCG ATT GCA CAG 304 Val Ile Gly Ser Gly 65 Val Leu Ser Leu Al a 70 Trp Al a Ile Al a Gin 75 CTC GGA TGG ATC GCT GGC CCT GCT GTG ATG CTA TTG TTC TCT CTT 349 Leu Gl y Trp Ile Al a 80 Gly Pro Al a Val Me t 85 Leu Leu Phe Ser Leu 90 GTT ACT CTT TAC TCC TCC ACA CTT CTT AGC GAC TGC TAC AGA ACC 394 Val Thr Leu Tyr Ser 95 Ser Thr Leu Leu Ser 100 As p Cys Tyr Arg Thr 105 GGC GAT GCA GTG TCT GGC AAG AGA AAC TAC ACT TAC ATG GAT GCC 439 Gly As p Al a Val Se r 110 Gly Lys Arg Asn Tyr 115 Thr Tyr Me t Asp Al a 120 GTT CGA TCA ATT CTC GGT GGG TTC AAG TTC AAG ATT TGT GGG TTG 484 Val Arg Ser Ile Leu 125 Gly Gly Phe Lys Phe 130 Ly s Ile Cys Gly Leu 135 ATT CAA TAG TTG AAT CTG TTT GGT ATC GCA ATT GGA TAC ACG ATA 529 Ile Gl n Tyr Leu Asn 140 Leu Phe Gly Ile Al a 145 Ile Gly Tyr Thr Ile 150 GCA GCT TCC ATA AGC ATG ATG GCG ATC AAG AGA TCC AAC TGC TTC 574 Al a Al a Ser Ile Ser 155 Me t Me t Al a Ile Lys 160 Arg Ser Asn Cy s Phe 165 CAC AAG AGT GGA GGA AAA GAC CCA TGT CAC ATG TCC AGT AAT CCT 619 Hi s Ly s Ser Gly Gly 170 Lys As p Pro Cy s Hi s 175 Me t Ser Ser Asn Pro 180 TAC ATG ATC GTA TTT GGT GTG GCA GAG ATC TTG CTC TCT CAG GTT 664 Tyr Me t Ile Val Phe 185 Gly Val Al a Glu Ile 190 Leu Leu Ser Gin Val 200
    HU 220 252 Β
    CCT GAT TTC GAT CAG ATT TGG TGG ATC TCC ATT GTT GCA GCT GTT Pro As p Phe Asp Gin 205 Ile Trp Trp Ile Ser 210 Ile Val Al a Al a Val 220 ATG TCC TTC ACT TAC TCT GCC ATT GGT CTA GCT CTT GGA ATC GTT Me t Ser Phe Thr Tyr 225 Ser Al a Ile Gly Leu 230 Al a Leu Gly Ile Val 235 CAA GTT GCA GCG AAT GGA GTT TTC AAA GGA AGT CTG ACT GGA ATA Gin Va 1 Al a Alá Asn 240 Gly Val Phe Lys Gly 245 Ser Leu Thr Gly Ile 250 AGC ATC GGA ACA GTG ACT CAA ACA CAG AAG ATA TGG AGA AGG TTC Ser Ile Gl y Thr Val 255 Thr Gin Thr Gin Lys 260 Ile Trp Arg Thr Phe 265 CAA GCA CTT GGA GAC ATT GCC TTT GCG TAC TCA TAC TCT GTT GTC Gin Al a Leu Gly Asp 270 Ile Al a Phe Al a Tyr 275 Ser Tyr Ser Va 1 Val 280 CTA ATC GAG ATT CAG GAT ACT GTA AGA TCC CCA CCG GCG GAA TCG Leu Ile Glu Ile Gin 285 Asp Thr Va 1 Arg Ser 290 Pro Pro Al a Glu Ser 295 AAA ACG ATG AAG AAA GCA ACA AAA ATC AGT ATT GCC GTC ACA ACT Lys Thr Me t Lys Ly s 300 Al a Thr Ly s Ile Ser 305 Ile Al a Val Thr Thr 310 ATC TTC TAC ATG CTA TGT GGC TCA ATG GGT TAT GCC GCT TTT GGA Ile Phe Tyr Me t Leu 315 Cys Gly Ser Me t Gly 320 Tyr Al a Al a Phe Gly 325 GAT GCA GCA CCG GGA AAC CTC CTC ACC GGT TTT GGA TTC TAC AAC Asp Al a Al a Pro Gly 330 Asn Leu Leu Thr Gly 335 Phe Gly Phe Tyr Asn 340 CCG TTT TGG CTC CTT GAC ATA GCT AAC GCC GCC ATT GTT GTC CAC Pro Phe Trp Leu Leu 245 Asp Ile Al a Asn Al a 350 Al a Ile Va 1 Va 1 Hi s 355 CTC GTT GGA GCT TAC CAA GTC TTT GCT CAG CCC ATC TTT GCC TTT Leu Val Gly Al a Tyr 360 Gin Val Phe Al a Gin 365 Pro Ile Phe Al a Phe 370 ATT GAA AAA TCA GTC GCA GAG AGA TAT CCA GAC AAT GAC TTC CTC He Glu Ly s Ser Va 1 375 Al a Glu Arg Tyr Pro 380 Asp As n As p Phe Leu 385 AGC AAG GAA TTT GAA ATC AGA ATC CCC GGA TTT AAG TCT CCT TAC Ser Ly s Glu Phe Glu 390 Ile Arg Ile Pro Gly 395 Phe Lys Ser Pro Tyr 400 AAA GTA AAC GTT TTC AGG ATG GTT TAC AGG AGT GGC TTT GTC GTT Lys Val Asn Val Phe 405 Arg Me t Va 1 Tyr Arg 410 Ser Gly Phe Va 1 Val 415 ACA ACC ACC GTG ATA TCG ATG CTG ATG CCG TTT TTT AAC GAC GTG Thr Thr Thr Va 1 Ile Ser Me t Leu Me t Pro Phe Phe Asn As p Va 1
    420 425 430
    709
    754
    799
    844
    889
    934
    979
    1024
    1069
    1114
    1159
    1204
    1249
    1294
    1339
    HU 220 252 Β
    GTC GGG ATC TTA GGG GCG Leu Gly Alá 435 TTA GGG TTT TGG CCC TTG ACG GTT TAT 1384 Val Gly Ile Leu Gly Phe Trp 440 Pro Leu Thr Val Tyr 445 TTT CCG GTG GAG ATG TAT ATT AAG CAG AGG AAG GTT GAG AAA TGG 1429 Phe Pro Val G1u Me t Tyr Ile Lys Gin Arg Ly s Val Glu Ly s Trp 450 455 460 AGC ACG AGA TGG GTG TGT TTA CAG ATG CTT AGT GTT GCT TGT CTT 1474 Ser Thr Arg Trp Val Cys Leu Gin Me t Leu Ser Va 1 Al a Cy s Leu 465 470 475 GTG ATC TCG GTG GTC GCC GGG GTT GGA TCA ATC GCC GGA GTG ATG 1519 Val Ile Ser Val Val Alá Gly Val Gly Ser Ile Al a Gly Va 1 Me t 480 485 490 CTT GAT CTT AAG GTC TAT AAG CCA TTC AAG TCT ACA TAT 1558 Leu As p Leu Lys Val Tyr Lys Pro Phe Ly s Ser Thr Tyr 495 500 TGATGATTAT GGACCATGAA CAACAGAGAG AGTTGGTGTG TAAAGTTTAC 1608 CATTTCAAAG AAACTCCAA AAATGTGTAT ATTGTATGTT GTTCTCATTT 1658 CGTATGGTCT CATCTTTGTA ATAAAATTTA AAACTTATGT TATAAATTAT 1708 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 1740
  4. 4. Plazmid, amely egy, az 1 -3. igénypontok valamelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmazza.
  5. 5. A pPPPl-20 plazmid (DSM 7129).
  6. 6. A pAAP2 plazmid, mely a pPPPl-20 plazmid szerkezetével megegyező, azonban az 1. számú szekvencia helyett a 2. számú szekvenciát tartalmazza.
  7. 7. A pBin PPP1-20 plazmid (DSM 7130).
  8. 8. A 4-7. igénypontok bármelyike szerinti plazmid vagy származékai, vagy részei alkalmazása prokarióta és eukarióta sejtek transzformálására.
  9. 9. Növények, melyek az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát vagy azok származékait, vagy részeit tartalmazzák.
  10. 10. Baktériumok, melyek az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmazzák.
  11. 11. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti aminosavtranszporter DNS-szekvencia alkalmazása módosított transzporterspecificitású plazmidok előállítására.
  12. 12. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti aminosavtranszporter DNS-szekvencia alkalmazása aminosavtranszporter molekulákat is kódoló, hasonló szekvenciák izolálására növényi genomból.
  13. 13. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti aminosavtranszporter DNS-szekvencia alkalmazása egy aminosavtranszportemek prokarióta és eukarióta sejtben történő szintézisét lehetővé tevő átírható mRNS kifejezésére.
  14. 14. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti aminosavtranszporter DNS-szekvencia alkalmazása egy aminosavtranszporter prokarióta és eukarióta sejtben történő szintézisét gátló nem átírható mRNS kifejezésére.
  15. 15. Az 1 -3. igénypontok bármelyike szerinti aminosavtranszporter DNS-szekvencia alkalmazása vezető elemekkel kombinálva prokarióta és eukarióta sejtben történő kifejezésre.
  16. 16. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvenciát tartalmazó élesztőtörzsek.
  17. 17. Aminosavfelvevő rendszer hiányos élesztőtörzsek alkalmazása egy növényi aminosavtranszporter azonosítására az élesztőmutáció komplementálásával.
  18. 18. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti aminosavtranszporter DNS-szekvencia alkalmazása megváltoztatott aminosav- és nitrogénmetabolizmussal rendelkező növények előállításánál.
  19. 19. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti aminosavtranszporter DNS-szekvencia alkalmazása megnövelt terméshozamú haszonnövények előállításánál.
  20. 20. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti aminosavtranszporter DNS-szekvencia alkalmazása vegyületek transzponálására prokarióta és eukarióta sejtekben.
HU9500030A 1992-07-05 1993-07-01 Aminosav-transzporter DNS-szekvenciák, transzportert tartalmazó plazmidok, baktériumok, élesztők és növények és azok alkalmazása HU220252B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4222315A DE4222315A1 (de) 1992-07-05 1992-07-05 DNA-Sequenzen für Aminosäuretransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend einen Transporter
PCT/EP1993/001736 WO1994001559A2 (en) 1992-07-05 1993-07-01 Dna sequences for an amino acid transporter, plasmids, bacteria, yeasts and plants containing a transporter and their use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9500030D0 HU9500030D0 (en) 1995-03-28
HUT68809A HUT68809A (en) 1995-07-28
HU220252B true HU220252B (hu) 2001-11-28

Family

ID=6462691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9500030A HU220252B (hu) 1992-07-05 1993-07-01 Aminosav-transzporter DNS-szekvenciák, transzportert tartalmazó plazmidok, baktériumok, élesztők és növények és azok alkalmazása

Country Status (15)

Country Link
US (3) US5719043A (hu)
EP (2) EP0924300A3 (hu)
JP (1) JP3516682B2 (hu)
KR (1) KR100290499B1 (hu)
AT (1) ATE185603T1 (hu)
AU (1) AU667942B2 (hu)
CA (1) CA2137242A1 (hu)
DE (2) DE4222315A1 (hu)
DK (1) DK0652955T3 (hu)
ES (1) ES2139665T3 (hu)
GR (1) GR3032223T3 (hu)
HU (1) HU220252B (hu)
IL (1) IL106153A (hu)
RU (1) RU94046362A (hu)
WO (1) WO1994001559A2 (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4420782C1 (de) * 1994-06-15 1995-08-17 Fluegge Ulf Ingo Prof Dr DNA-Sequenz, kodierend einen 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter
DE4222315A1 (de) * 1992-07-05 1994-01-13 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenzen für Aminosäuretransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend einen Transporter
DE4343527A1 (de) * 1993-12-16 1995-06-22 Schering Ag Verfahren zur Identifizierung von Stoffen mit potentieller herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung mittels pflanzlicher Transporterproteine, Verwendung der Transporterproteine sowie Substanzen mit herbizider und wachstumsregulatorischer Wirkung
US5689039A (en) * 1994-03-16 1997-11-18 The University Of Tennessee Research Corporation Plant peptide transport gene
DE19907209A1 (de) * 1999-02-19 2000-08-24 Frommer Wolf Bernd Pflanzlicher Nukleobasentransporter
US6630615B1 (en) 1999-08-18 2003-10-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Defense-related signaling genes and methods of use
DE60034954D1 (de) * 1999-09-14 2007-07-05 Xenoport Inc Substrate und screeningverfahren für transportproteine
US6770750B2 (en) * 1999-11-18 2004-08-03 Korea Kumho Petrochemical Co., Ltd. Small and cysteine rich antifungal defensin and thionin-like protein genes highly expressed in the incompatible interaction
US7741049B2 (en) * 2001-03-15 2010-06-22 Sumitomo Chemical Company, Limited Analysis of agonist-activity and antagonist-activity to cytokinin receptor
EP1576171A4 (en) * 2002-02-01 2007-03-21 Monsanto Technology Llc AMINO ACID TRANSPORTER
DE10221224A1 (de) * 2002-05-13 2003-12-04 Frommer Wolf Bernd Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verändertem Stofftransport
US20050035264A1 (en) * 2003-01-03 2005-02-17 Joel Marks Anchor device for weak substrates
GB0510928D0 (en) 2005-05-27 2005-07-06 Swetree Technologies Ab Altered amino acid uptake in plants

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4204103A1 (de) * 1992-02-12 1993-08-19 Hoechst Ag Expression cytotoxischer gaba-permeasegene, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung
DE4222315A1 (de) * 1992-07-05 1994-01-13 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenzen für Aminosäuretransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend einen Transporter

Also Published As

Publication number Publication date
US6245970B1 (en) 2001-06-12
RU94046362A (ru) 1996-10-20
HU9500030D0 (en) 1995-03-28
GR3032223T3 (en) 2000-04-27
ATE185603T1 (de) 1999-10-15
IL106153A0 (en) 1993-10-20
JP3516682B2 (ja) 2004-04-05
HUT68809A (en) 1995-07-28
CA2137242A1 (en) 1994-01-20
US6809233B2 (en) 2004-10-26
DE4222315A1 (de) 1994-01-13
EP0652955A1 (en) 1995-05-17
EP0924300A3 (en) 1999-12-08
WO1994001559A2 (en) 1994-01-20
AU4564293A (en) 1994-01-31
JPH07508419A (ja) 1995-09-21
US5719043A (en) 1998-02-17
KR950702630A (ko) 1995-07-29
EP0924300A2 (en) 1999-06-23
IL106153A (en) 2000-09-28
WO1994001559A3 (en) 1994-03-17
KR100290499B1 (ko) 2001-06-01
DK0652955T3 (da) 2000-04-17
AU667942B2 (en) 1996-04-18
DE69326770T2 (de) 2000-09-07
ES2139665T3 (es) 2000-02-16
DE69326770D1 (de) 1999-11-18
EP0652955B1 (en) 1999-10-13
US20030051271A1 (en) 2003-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6225526B1 (en) DNA molecules which code for a plastid 2-oxoglutarate/malate
Ishiwatari et al. Thioredoxin h is one of the major proteins in rice phloem sap
EP1056864B1 (en) Constitutive maize promoters
JP2001501098A (ja) 植物におけるグロビンタンパク質の発現
JPH07509123A (ja) オリゴ糖輸送体を有するｄｎａ配列，該輸送体を含有するプラスミド，細菌および植物，ならびに該輸送体を同定するための酵母株の製造および形質転換方法
US6245970B1 (en) DNA sequences for an arabidopsis amino acid transporter, plasmids, bacteria, yeasts and plants containing a transporter and their use
US6620610B2 (en) DNA sequence from Arabidopsis thaliana encoding ammonium transporter, and plasmids, bacteria and yeast comprising the DNA sequence
Bush Amino acid transport
CN108395473B (zh) 植物类胡萝卜素合成相关蛋白及其编码基因与应用
US6630616B1 (en) Arabidopsis MPC1 gene and methods for controlling flowering time
JP2006014659A (ja) 植物を用いた有用物質の生産方法
EP1462522B1 (en) Maize Met-1 promoter
Beech Structure/function analysis of amino acid permeases in higher plants
CN118028304A (zh) 调控作物氮肥利用效率和产量的基因及其应用
US20040137438A1 (en) Nucleic acids, by means of which plants with altered metabolite content can be produced
CA2363816A1 (en) Dna sequence of a protein that is similar to fkbp
MXPA97009724A (en) Fiber transcription factors of something

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: HOECHST SCHERING AGREVO GMBH, DE

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: PROF. DR. FROMMER, WOLF-BERND, DE

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees