JPH07508419A - アミノ酸輸送体，プラスミド，細菌，酵母菌および輸送体を有する植物のｄｎａ配列およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

アミノ酸輸送体、プラスミド、細菌、酵母菌および輸送体を有する植物のＤＮＡ 配列およびその使用ｌ旦立欠亙 本発明は、アミノ酸輸送体のコーディング領域を有するＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配 列の植物ゲノム中への導入が、形質転換された植物、プラスミド、細菌、酵母菌 および該ＤＮＡ配列を有する植物中の代謝物の輸送を改善するＤＮＡ配列、並び にその使用に関する。 多くの植物種について、細胞壁を通過して師部へ、エネルギーの豊富な化合物を 運搬することが、細胞中いたるところで行われることは知られている。植物細胞 壁を通過してアミノ酸を浸透させる輸送体分子は、知られていない。 細菌の場合、多数のアミノ酸輸送系が特徴付けられていた。芳香族アミノ酸につ いては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファ／の１つを輸送するこ とができ、他方、他のものは、個々のアミノ酸について特異性である５個の異な る輸送体が記載されていた。　（Ｓａｒｓｅｒｏ他、１９９１年、ｊ　Ｂｇｃ＋ ｃ＋ｉｏｌ　第１７３巻　第３２３１〜３２３４頁を見よ）。一定速度の輸送過 程は、特異的輸送がより少ない効率であることを示している。多数の輸送体蛋白 質については、相応する遺伝子がクローン化されていた。このことは、発現ベク ター中での挿入断片としてのＤＮＡフラグメントを朋いる形質転換後にその輸送 能力のために選択されていた輸送欠失突然変異体を用いて達成された。（ワラー ス（Ｗａｌｌｉｃｔ）他、１９９０年、Ｊ　Ｂｘｃｌｅ＋ｉｏｌ　第１７２巻　 第３２１４〜３２２０頁を見よ）、前記突然変異体は、該突然変異体が、アミノ 酸の毒性類似体を取り込むことはできず、従って傷つけられることはないので、 該アミノ酸の毒性類似体の存在下での成長のためのその能力に応じて選択されて いた。 相応する相補性研究は、真核性の酵母菌、サツカロミセス°ｔレビシｘ　−（Ｓ ａｃｃｈ３＋ｏ＋ｎｙｃｅ＋　ｃｅ＋ｅｙｉ＋１ａｅ）を用いて実施されていた 。タナ力（Ｔｍｎｉｋｓ）およびロイシン（Ｆｉｎｋ）　（１９８５年、Ｇｅｎ ｅ　第３８巻°第２０５〜２１４頁）は、突然変異体の相補性によって同定され たヒスチジン輸送体を記載している。パンデンボル（Ｖａｎｄｅｎｂｏｌ）他（ １９８９年、Ｇｅｎｅ　第８３巻　第１５３−１５９頁）は、サツカロミセス・ セレビシエーのためのプロリン輸送体を記載している。該酵母菌は、プロリンの ための２つの異なる輸送体を有する。１つの輸送体は、低い効串を有し、かつ他 のアミノ酸のために使用することもでき、もう１つの輸送体は、プロリン特異性 であり、高い親和性をもって作用する。プロリン特異性の輸送体は、ｐｕＮ遺伝 子からコードされていた。該輸送体は、６　ｋＤａの分子量を有するペプチドの ためのオープンリ特表千７−５０８４１９　（５） −デイングフレーム（ｏｐｅｎ　＋ｅｓｄｉｎ（ｆｌａｍｅ）を有する。 該蛋白質は、１２個の膜透過領域を有するが、しかし、分泌のための如何なるＮ −末端信号配列をも有していない、これは、内在性膜蛋白質の典型的な性質であ る。 該輸送体は、酵母菌からのアルギニンおよびヒスチジン輸送体の同族を有するが 、しかし、大腸菌（Ｅ＋ｃｂｅ＋１ｃｈｉｓ　ｅｏｌｉ）からのプロリン輸送体 の同族を有してはいない。 植物細胞については、タバコＩｌ！ｉ濁液培養基についての研究によって、アル ギニン、アスパラギン、フェニルアラニンおよびヒスチジンの輸送が、ｐＨおよ びエネルギーに左右されることが見出された。ロイシンの１０００倍の過剰量は 、他のアミノ酸の輸送を阻害するので、従って、全てが同じ輸送体であると仮定 することができる（ＭｅＤａｎｉｅｌ他、　１９８２年、Ｐｌｓｎｌ　Ｐｈｙｓ ｉｏ第６９巻　第２４Ｆ＋−２４９Ｎ）　、　ＬｉおよびＢｕｓｈ　（１９９１ 年、Ｐｌｓ＋ＮＰｈ７ｓｉｏｌ第９６巻　第Ｈ３８−１３４４頁）は、脂肪族の 、中性アミノ酸について、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ　ｖｕ１ｇｘ＋ｉ＋） からの原形質膜小胞中での２つの輸送系を決定した。一方で、アラニン、メチオ ニン、グルタミンおよびロイシンは、それぞれ互いに輸送体蛋白質の上で置き代 わり、他方、イソロイシン、バリンおよびトレオニンは、相互に拮抗的な作用を 有する。拮抗速度論的研究（Ｌｉ　＆　Ｂｕｓｈ、　１９９０年、Ｐｌｉｎｌ　 Ｐｈｙ＋ｉｏｌ　第９４巻　第２６８〜２７７頁）の場合、４つの異なる輸送系 が分類された。低い親和性をもって作用する全ての中性アミノ酸のための輸送体 以外に、高い親和性のタイプが存在するが、しかし、インロイシン、トレオニン 、バリンおよびプロリンに対する低い親和性を有する。他の輸送体は、塩基性ア ミノ酸のためと同様に酸のために存在する。 植物輸送体重白質のための輸送体分子または遺伝子は、知られていない。 ところで、植物アミノ酸輸送体のコーディング領域を有し、かつ該ＤＮＡ配列の ヌクレオチド配列中に含まれた情報を植物ゲノム中へ組み込むことによって、新 しいアミノ酸の輸送活性が、植物細胞中に導入できるかまたは内在性アミノ酸輸 送活性が発現できるＲＮＡを形成できるようにするＤＮＡ配列が記載されている 。 アミン輸送体という用語は、例えばアラビドプシス・クリアーナ（Ａ日ｂｉｄｏ ｐ＋ｉ＋　１ｈａｌｉａｎａ）からのアミノ輸送体をコードするｃＤＮＡ配列の ことである。 アミノ酸輸送体のコーディング領域の同定は、酵母菌サツカロミセス・セレビシ ェ−の特異性突然変異体中での５１．現を用いて輸送体分子をコードする植物Ｄ ＮＡ配列を単離させる方法によって実施される。このためには、適当な酵母菌突 然変異体が提供されなければならず、該酵母菌突然変異体は、輸送体分子のコー ディング領域が植物遺伝子ライブラリーから１１１１Ｉ！されなければならない 物質を取り込むことはできない。 唯一の窒素源としてのプロリンまたはシトルリンを有する培地中で成長できない 突然変異体は、ｌ１ｕｎｉｓｕｘ他（（１９８７年）　、Ｅｕ＋　Ｊ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ第１６４巻、第６０１〜６０６頁）によって記載されている。 植物アミノ酸輸送体を同定するために使用することができる酵母菌菌株の製造の ために、唯一の窒素源としてのプロリンおよび／またはシトルリンを有する培地 中で成長することができない酵母菌突然変異体は、例えば挿入断片として、アラ ビドプシス・タリアーナからのｅＤＮ＾ＤＮＡラリーからのｅＤＮＡフラグメン トを有するｐＦＬ６１プラスミドを用いて形質転換される。 更に、ヒスチジン合成（ｈｉｓ　４）の場合およびヒスチジン取り込み（ｈｉｐ 　ｌ）の場合の欠失を有する二重突然変異体ＪＴＩ６　（Ｔｍｎｉｋｓ　＆　Ｆ ｉｎｋ、　１９８５年、Ｇｅｎｅ第３８巻　２０５〜２１４頁）は、記載された ｐＦＬ６１プラスミドを用いて形質転換され、かつヒスチジンの添加により培地 中で培養される。 ところで、驚異的なことに、酵母菌細胞の形質転換の場合に、特定の植物ｃＤＮ ＾が、酵母菌突然変異を補足できることが見出された。　ｅＤＮＡからのコード された蛋白質の性質の分析によって、該突然変異の補足について、コーディング 領域により、広い固有のスペクトルを有する植物アミノ酸輸送体をコードするこ とを示すことができる。（例３を見よ）。 この種のアミノ酸輸送体のコーディング領域は、例えば以下のヌクレオチド配列 の１つによって示される１、配列（Ｓｅｑ、ＩＯＮｏ、Ｉ）　：ＣＴＴＡＡＡＡ ＣＡＴ　ＴＴＡＴＴ！ＴＡＴＣＴｒＣ？Ｉ’ＣＴＴＧＴ　ＴααＣＴＩＩＴＣＴ ＣＴＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＡＣ？　５６ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＴＴＣＭＣＡ ＣＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＣＣＡＣＧ　ＧＣＧ　ＧＡＡ　１ ０１ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　ＴＡＴ 　ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　ＧＧＧ　ＧＴＣ４６１ＧＣＣＴＡＴ　ＧＣ Ｔ　ＴＡＴ　ＧＣＣＡＣＧ　ＧＴＴ　Ｃ１”Ｃ’ＡＴＣＧＡＧ　ＡＴＴ　ＣＡＧ 　ＧＡＴ　ＡＣＡ　ＣＴＡ　８６６ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＣＣ（、ＡＴＡ　ＴＴＣＣ ＡＧ　’Ｍ’Ｔ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＴＧＣＡＡＣＡＧＡ　ＡＡ Ｃ１１３６ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＴＴ　ＡＴＡ　ＡＣＣ ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＡＴＡ　ＴＴＣ１２７１Ａｒｑ　Ｔ ｈｒ　Ａｌａ　’ｒｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 Ｖａｎ　入１ａ　Ｍａｔ　工１ｅ　Ｐｈａｃｃ’ｒ　’ｒＴｃ　’ｒｒｃ　ＡＡ ＣＧＣＧ　ＡＴＣＴＴＡ　ＧＧＴ　ＣＴＴ　ＡＴＣＧＧＡ　ＧＣＡ　ＧｃＴ　Ｔ ＣＣＴＴＣ１コ１６Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ａｈａ　工ｌａ　Ｌｅｌ ｌ　ＧＩＹ　Ｌａｕ　工１ａ　Ｇｌｙ　Ａｈａ　Ａｈａ　Ｓ＠ｒ　ＰｈｅＴＧＧ 　ＣＣＴ　ＴＴＡ　ＡＣに　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴＣＣＣＴ　ＧＴに　ＧＡＧ　 ＡＴＧ　ＣＡＣ入ＴＴ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　１３６１Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　ＶａＩＴｙｒ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｈ１ｓ工１ａ 　Ａｌａ　Ｇ１ｎ４２５　４コｏ　４３５ ＡＣＣＡＡＧ　ＡＴ’ｒ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＴＡＣＴＣｒ　ＧＣＴ　ＡＧＡ　Ｔ ＧＧ　ＡＴｒ　Ｇｃに　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　１４０６Ｔｈｒ　Ｌｙｓ工１ ｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ工１ａ　Ａｌａ 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　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　ＩＩｓ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ｐｈ＠３６０　 コロ５　３１０ ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＴＣＡ　ＧＴＣＧＣＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＴＡＴ　Ｃ ＣＡ　ＧＡＣＡＡＴ　ＧＡＣＴＴＣＣＴＣ１２０４工１ａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓ ｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｑ　Ｔ′Ｘ！ｒＰｒｏ　Ａｓｐ　ｘｓｎ　 Ａｓｐ　Ｐｈａ　ＬａｕＡＧＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＡＴＣＡＧＡ 　ＡＴＣＣＣＣＧＧＡ　ＴＴＴ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＴＡＣ１２４９Ｓｅ ｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ工１ａ　Ａｒｇ工１ａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ｐｈｉ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ３９０　コ９５　４００ ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＡＡＣＧＴＴ　ＴＴＣＡＧＧ　ＡＴＧ　ＧＴＴ　ＴＡＣＡＧＧ 　ＡＧＴ　ＧＧＣＴＴＴ　ＧＴＣＧＴＴ　１２９４Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖ ａｌ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐ ｈａ　Ｖａｌ　Ｖａ１ＡＣＡ　ＡＣＣＡＣＣＧＴＧ　ＡＴＡ　ＴＣＧ　ＡＴＧ　 ＣｒＧ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＴＩＴ　ＴＴＴ　ＡＡＣＧＡＣＧＴＧ　ｌ：１３９Ｔ ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　工１ａ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｉ、ａｕ　Ｍａｔ　 Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｖａ１ＧＴＣＧＧＧ　ＡＴＣＴＴＡ 　ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＴＴＡ　ＧＧＧ　Ｔｌ’ｒ　ＴＧＧ　ＣＣＣ’ＩＴＧ　ＡＣ Ｇ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　１３８４Ｖａｌ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　Ｔｙｒ ＴＴＴ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　 ＡＧＧ　ＡＡＧ　Ｇ’ＩＴ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＴＧＧ　１４Q９ ＰｈｅＰｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ工ｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒ ｇ　Ｌｙｓ　ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＴｒｐＡＧＣＡＣＧ　ＡＧＡ　ＴＧＧ　 ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＴｒＡ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴｒＡＧＴ　Ｇ’］’Ｔ　ＧＣＴ 　ＴＧＴ　Ｃ’ＩＴ　１４V４ Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｍａｔ　 Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　ＬｅｕＧＴＧ　ＡＴＣＴＣＧ　ＧＴ Ｇ　ＧＴＣＧＣＣＧＧＧ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＴＣＡ　ＡＴＣＧＣＣＧＧＡ　ＧＴ 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ために、少量の窒素を含有するような器官、例えば、澱粉の生産のために成長さ せられるジャガイモを質的に改善させる。この他にも、個々の組織、例えば葉の 成長を緩慢にし、他方、収穫された部分の成長を増大させることによる完全植物 の変性がある。これについては、１つは、貯蔵物質の増大された形成を生じる栽 培植物の栄養期の延長が想像できる。 双子葉植物および単子葉植物の遺伝子変性の過程は既に知られている（例えば、 Ｇ５５ｓｓ＋、Ｃ，Ｓ、、Ｆｒａｌｃ７．Ｒ。 Ｔ、１９８９年、５ｃｉｅｎｃｅ第２４４巻°第１２９３〜＋２９９頁；　Ｐｏ ｔ＋ｙｋｕｓ、　１９９１年、Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｐｌｉｎ＋　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ 　Ｐｌａ＋＋＋　Ｐｈｙｓｉｏｌ　第４２巻　第２０５〜２２５頁を見よ）。植 物中での発現のためには、コーディング配列は、転写調節要素と結合しなければ ならない。プロモーターと呼称されるこの穐の要素は、公知である（欧州特許第 ３７５０９１号明細書）。 更に、このコーディング領域は、正しく転写させることができる転写終結信号を 提供しなければならない。 また、この種の要素は記載されている（Ｇｉｅｌｅｎ他、１９８９年、ＥＭＢＯ Ｊ　第８巻　第２３〜２９頁を見よ）。転写開始領域は、異種および／または異 型であると同様に天然および／または同類の双方であることができる。望ましい 場合には、終結領域は、互いに交換可能である。 転写開始領域および終結領域のＤＮＡ配列は、合成により製造できるかまたは天 然により得ることができるかまたは合成りＮＡおよび天然ＤＮＡ成分の混合物か ら得るここができる。より高度な植物中への異種遺伝子の導入のだめには、Ｅ、 ｃｏｌｉのための複製信号および形質転換された細胞を選択できるようにする遺 伝マーカーを含有する多数のクローニングベクターが利用できる。こノ糧ノヘク ターノ例は、ｐＢＲ３２２，ｐｕｃ−列、ＭＨｍｐ−列、ｐＡｃＹｃ１８４等で ある。植物中への望ましい遺伝子の導入方法に応じて、他のＤＮＡ配列は適当で ある。Ｔｉ−プラスミドおよびＲ１−プラスミドが、例えば植物細胞の形質転換 に使用されなければならない場合には、Ｔ１−プラスミドおよびＲ１−プラスミ ドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側境界で、しかししばしば、右側境界および左側境 界の双方で、フランキング領域として、導入されるべき遺伝子に結び付けられて いる。植物細胞の形質転換のためのＴ　−ＤＮＡの使用は、集中的に研究され、 欧州特許第１２０５１６号明細書；　Ｈｏｅｋｓｍａ　：　Ｔｈｅ　Ｂｉｎａ＋ ７　Ｐｌａｎｔ　Ｖｅｃｈａｔ　Ｓ７＋１ｃｍ、　０１ｌｓｅｌ−ｄ＋ｕｋｋｅ ＋ｉｉ　Ｋ１ｎ１ｅ＋ｓ　Ｂ、Ｖ、Ａｌｂｌａｘｓｅｆｄａｍ、　（１９８５年 ）、第Ｖ章：　Ｆ＋１ｌｃ７他、Ｃｒ目、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、第４ 巻　第１〜４６頁およびＡｎ他、（１９８５年）ＥＭＢＯＪ、第４巻　第２７７ 〜２８７頁に詳細に記載されている。一度、導入されたＤＮＡは、ゲノム中に組 み込まれ、規定通りに、該ゲノム中に安定し、かつまた原型の形質転換細胞の子 孫中に残る。一般に、形質転換された植物細胞中での生物致死剤または抗生物質 、例えばカナマイシン、６４１８、プレオマイシン、ハイグロマイシンまたはホ スフィノトリシン等に抗する耐性を誘導する選択マーカーを有する。従って、採 用された個々の諸表子７−５０８４１９　（９） マーカーは、導入されたＤＮＡを欠失する細胞から形質転換された細胞を選択で きるようにしなければならない。 植物宿主細胞中へのＤＮＡの導入のために、アゲロバクチリア（へｇｔｏｂｓｃ ｌｅ目りを用いる形質転換以外に、多くの他の技術が利用できる。前記の技術に は、衝撃法（ｂａｌｌｉｕｉｃ　ｍｅ＋ｈｏｄｓ）およびウィルス注射法と同様 に原形質体の融合法、ＤＮＡの微量注射法（ｍｉｃ＋ｏｉｎｉ＠ｃ１ｉｏｎ）お よび電気穿孔法（ｅｌｅｅ＋＋ｏｐｏ＋ａ＋１ｏｎ）が含まれる。形質転換され た材料から、完全な植物が、選択だめの抗生物質または生物致死剤を含有する適 当な媒体中で再生することができる０次に、生じた植物は。 導入されたＤＮＡの存在について試験することができる。 注射法および電気穿孔法の場合のプラスミドに、特別な要求はされていない。単 純プラスミド、例えばｐＵＣ−誘導体を使用することができる。しかしながら、 完全な植物が、この種の形質転換された細胞から再生されなければならない場合 には、選択可能なマーカー遺伝子の存在が必要である。該形質転換された細胞は 、植物中で常法により成長する（ＭｃＣｏ＋＋ｏｉｃｋ他、（１９８６年）　Ｐ ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏ＋＋＋　第５巻　第８１〜８４頁も見よ）。前記 植物は、正常に成長でき、かつ同じかまたは異なる形質転換された遺伝子を有す る植物と交配されて成長できる。生じたハイブリッドの個々のものは、相応する 表現型の能力を有する。 また、本発明のＤＮＡ配列は、プラスミド中に導入することができ、このことに よって、原核性細胞中での発現のための舵取り要素と結び付けることができる。 細菌からの真核性アミノ酸輸送体の翻訳可能なＲＮＡ配列の形成は、原核生物お よび真核生物の膜構造における重大な相違にもかかわらず、更に驚轟的に原核生 物が、特定の基質のための特異性を有する真核性のアミノ酸輸送体を使用するこ とができることを意味する。 このことは、細菌菌株の基質と同様に、輸送体の性質の研究のために使用するこ とができ、細菌菌株の生産を可能にする。 また、本発明は、本発明のプラスミドを有する細菌にも関する。 また、本発明のＤＮＡ配列は、原核性系または真核性系中でのＤＮＡ配列の組換 えにより、突然変異または配列変性できるようにするプラスミド中に導入するこ ともできる。こうして、アミノ酸輸送体の特異性は、変性することができる。従 って、該輸送体の特異性は、変更することができる。 また、本発明は、本発明のＤＮＡ配列を有し、かつ原核性細胞および真核性細胞 の形質転換に使用することができるプラスミドの誘導体またはプラスミドの一部 分に関する。 標準的な方法を用いる場合（Ｓａｍｂｔｏｏｋ他、１９８９年、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａ＋　ＣＩｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版 ・Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ＋ｉｎｌ　Ｉ（ａ＋ｂｏ＋　Ｌａｂｏ＋ａｔｏ＋７　Ｐ

【ｅｓ ｓ、　ＮＹ、　ＵＳＡを見よ）。塩基交換は実施できるかまたは天然または合成 の配列は添加することができる。１つの別のアダプターまたはリンカ−との結合 ＤＮＡフラグメントについては、フラグメント上に導入することができる。更に 、適当な制限分割側面が得られるかまたは過剰量のＤＮＡまたは制限分割部位を 除去する操作が実施できる。挿入、欠失または置換、例えばトランジションまた はトランスバージョンが実施される場合、試験管内突然変異、プライマー修復、 制限または連鎖反応を使用することができる。分析の方法については、一般に、 配列分析、制限分析および他の生化学の分子生物学的方法を使用することができ る。それぞれの操作後に、使用されたＤＮＡ配列は、分割することができ、かつ 別のＤＮＡ配列と結合させることができる。それぞれのプラスミド配列は、同じ プラスミドまたは異なるプラスミド中でクローン化することができる。 また、本発明のＤＮＡ配列およびプラスミドの誘導体または一部は、原核性細胞 および真核性細胞の形質転換に使用することもできる。更に、本発明のＤＮＡ配 列は、標準的な方法により、種々の種の植物のゲノム上の同じ配列の単離のため に使用することができ、該配列は、アミノ酸または他のオリゴ糖輸送体分子のた めにもコードする。前記配列を用いて、形質転換のための構造体を得ることがで き、該構造体は、形質転換された植物中の植物細胞の輸送過程を変更する。 記載されたＤＮＡ配列を特異性にするために、まず、植物型の遺伝子中の内容ま たは植物型中での遺伝子の発現を代表する遺伝子ライブラリーが得られなければ ならない。前者はゲノムライブラリーであり、他方、後者は、ｃＤＮ＾ＤＮＡラ リーである。これらから、記載された配列は、試料としての本発明のＤＮＡ配列 を用いて単離するとができる。一度、記載された遺伝子は、同定され、かつ単離 され、前記配列の決定およびこの配列からコードされた蛋白質の性質の分析は可 能である。 本発明の基礎を形成する実施例を理解するために、前記試験のために必要かつそ れ自体知られている全ての方法は、まず第一に記載される １、クローニング過程 Ｅ、ｃｏｌｉ中でのクローニングのために、ベクターｐＢｌｕｅ＋ｅ＋１ｐｌｓ Ｋ　（Ｓｈｏａｌ他、１９８８年、Ｎｕｃｌ　ＡＣｉｄ＋　Ｒｅｓ第１６巻　第 ７５８３〜７６００頁）を使用した。 酵母菌の形質転換のために、ベクターｐＦＬ６１　（Ｍｉｎｅｌ＆　Ｌａｃ＋ｏ ｕｌｅ、　１９９０年、Ｃｕｚ　Ｇｓｎｅｌ　第１８巻　第２８７−２９１頁） を使用した。 植物形質転換のために、二分ベクターｐＢＩＮ−８７（中の遺伝子構造体をクロ ーン化した。 ２　細菌菌株および酵母菌菌株 ｐＢｌｕｅｓｃ＋１ｐｌｓＫベクター並びにＰＢｉｎＡＲ構造体のため諸表平７ −５０８４１９　（１０） に、Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＸＬｌｂｌｕｃ　（Ｂｕｌｌｏｃｋ他、１９８７年、Ｂｉ ｏｌｅｃｈｎｉｑｕｅ＋、第５巻、第３７６〜３７８頁）を使用した。 酵母菌中のｃＤＮ＾ＤＮＡラリーの発現のための出発菌株として、酵母菌菌株２ ２５７４ｄ　（］＊ｕｎｉａｕｘ他、１９８７年、Ｅｕ＋　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｍ第 】６４巻、第６０１〜６０６頁）を使用した。 ジャガイモ植物中のプラスミドの形質転換を、アグロバクテリウム・ツメファシ ェンス（＾ｇ＋ｏｂ＊ｃ＋ｅ＋ｉｕｍ　＋ｕｍｅｌｉｃｉｅｎｓ）菌株ＬＢ＾４ ４０４　（Ｂｃｖａｎ　（１９８４年）　Ｎｕｅｌ、＾ｅｉｄｈ　Ｒｅｓ　第１ ２巻　第８７１１〜Ｂ７２０頁）を用いて実施した。 アゲロバクチリア中のＤＮＡの転移を、Ｈｏｅｌｇｅｎ　＆　Ｗ目１＋ｏｉｌ＋ ｅ＋の方法（＋９Ｈ年、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　第１６巻′第９ ８７７Ｍ）による直接的な形質転換によって実施した。 形質転換されたアグロバクテリウムのプラスミドＤＮＡを、Ｂｉｔｎｂｏｉｍお よびＤＯＩＦの方法（１９７９年）　（Ｎｕｅｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　第７巻 　第１５１３−１５２３頁）により単離し、かつ適当な制限分割後にゲル電気泳 動によって分析した。 ４、里！亙Ｕ烹 滅菌されたジャガイモ培養基の、メスで傷つけられた１０枚の小さな葉を、選択 しながら一晩培契基を成長させたアグロバクテリウム・ツメファシェンス３０〜 ５０ｐ１を含有し、２％のスクロースを有するＭＳ培地１０ｍ１中に置いた。３ 〜５分間の穏和な振盪後に、葉を、１６％のグルコース、ゼアチン　リボース２ 　ｍ　ｇ　／　ｌ　、酢酸ナフチル０．０２ｍｇ／ｌ、ジベレリン酸０．０２ｍ ｇ／１．クラホラン（ｃｌ＊ｌｏ＋５ｎ）５００　ｍ　ｇ　／　］　、カナマイ シン５０．ｍ　ｇ　／　ｌおよび０゜８％のバクト寒天（ｂａｃｌｏ　Ｂｉｔ） のＭＳ培地の上に置いた。２５℃および３０００ルクスで一週間の培養後に、培 地中のクラホラン濃度は、半減した。 寄託物 次のプラスミドおよび酵母菌菌株は、１９９２年１２月６日にドイツ連邦共和国 のブラウンシュバイク（Ｂ＋ｍｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）在のドイツチェン　ザンム ルング　フオンミクロオルガニスメン（Ｄｃｕｌ＋ｃｈｅｎ　Ｓａｅ＋ｍｌｕｎ ｇ　ｖａｎ　Ｍｉｋ＋ｏｏＢａｎｉ＋＋ａｅｎ）　（ＤＳＩ４）に寄託されてい た（寄託番号）プラスミド　ＰＰＰＩ−２０（ＤＳＭ　７１２９）プラスミド　 ｐＢｉｎＰＰＰｌ−２０（ＤＳＭ　７１３０）図面について 図１は、配列５ｅｑ−ＩＤ　Ｎｏ、Ｉを有するプラスミドｐＰＰｌ−２０を示す 。細く描かれた線は、ｐＢｌｕｅｓＣ目ｐ＋ｓＫからの配列に相応する。太く描 かれた線は、ｃＤＮ＾ＤＮＡを表わす。該挿入物の分割位置が示されている。 図２は、培地からの”Ｃ−プロリンの取り込みを示す。 なし　＝　競合体（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を用いない取り込みの期間 プロリン　＝　標識されていないプロリンの４倍の過剰量を用いる期間 シトルリン＝　標識されていないシトルリンの４倍の過剰量を用いる期間 ＧＡ’ＢＡ　＝　γ−アミノブチル酸の４倍の過剰量を用いる期間 時間　＝　秒での時間 ｃｐｍ　”　毎分の計数された崩壊 図３は、配列５ｅｑ−ＩＤ　Ｎｏ、２を有するプラスミドル＾へＰ２を示す、細 く描かれた線は、ｐＢｌｕｅｓｃ＋１ｐｌｓＫからの配列に相応する。太く描か れた線は、ｃＤＮＡ挿入物を表わす、該挿入物の分割位置が示されている。 図４は、酵母菌列２２５７４　＾ＡＰ２を用いる競合試験を示し、この場合、培 地からの１″ｃｍ識されたＬ−プロリンの取り込みは、他のアミノ酸またはその 類縁物の４倍の過剰量の存在下に測定される。三文字コードでのアミノ酸の標準 的な略号の代わりに、以下のものも使用される Ｃ目　＝　シー・ルリン：Ｄ−Ｐｒｏ　＝　Ｄ−プロリン；　０Ｈ−Ｐτ０　＝ 　ヒドロキシプロリンおよびＡ２Ｃ＝アゼチジンー２−カルボン酸図５は、酵母 菌列ｌＴ１６　；　ｌ　ＡＡＰ２を用いる競合試験を示し、この場合、培地から の１４０標識されたし一ヒスチジンの取り込みは、他のアミノ酸またはその類縁 物の１０倍の存在下に測定される。 三文字コードでのアミノ酸の標準的な略号の代わりに、以下のものも使用される ： Ｃ自　＝　シトルリン；ｏ＋ｎ　＝　オルニチン。 Ｃａｎ　＝　カナパニン、およびＮＨ４＝アンモニウム 以下の実施例は、植物アミノ酸輸送体のクローニングおよび同定並びに機能およ び使用を記載する。 例　１ 植物アミノ酸輸送体のｃＤＮＡのクローニング酵母菌菌株２２５７４ｄ　（Ｊａ ｕｎｉｉｕｘ他、１９８７年、Ｅｕ＋　］　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｏ第１６４巻　第６ ０１〜６０６頁）のプロリン輸送突然変異および／またはヒスチジン合成および 菌株３丁１６（Ｔｉｎｓｋｓ　Ａ　Ｆｉｎｋ、１９８５年、　Ｇｅｎｅ　第３８ 頁　第２０５〜２１４頁）の輸送突然変異の相補性について、アラビドプシス・ クリアーナ（２葉段階）からの若い生殖系列のｃＤＮＡが、１ｌｉｎｅｌ　（Ｍ ｉｎｅｌ他、１９９２年、Ｐｌｉｌ　Ｊ第２巻　第４１７〜４２２頁）によって 利用できるようにされた酵母菌発現ベクターｐＦＬ６１　（Ｍｉｎｅ＋　＆　Ｌ ａｃ＋ｏｕｌｅ、　１９９０年、Ｃｕｒｔ　Ｇｅｎｅｌ　第１８巻　第２８７〜 ２９１頁）中で使用された。ｃＤＮＡ−挿入物を有するベクター約１ｊＪｇを、 酵母菌菌株２２５７４ｄおよび／または１Ｔ１６中で、Ｄｏｈｍｅｎ他の方法（ １９９１年、Ｙｅａｓｔ　第７巻　第６９１〜６９２頁）によって形質転換され た。ゾル状窒素源としてのプロリン４ｍＭを有する培地中またはヒスチジン６ｍ Ｍを有する培地中で成諸表千７−５０８４１９　（１？） 長させることができた酵母菌形質転換細胞を繁殖させた。この線から、プラスミ ド−ＤＮＡを、標準的方法によって得た。特殊な突然変異を補足することができ たクローン化は、ｃＤＮ＾ＤＮＡの同じ制限型を有するプラスミドを有していた 。これは１．６〜１．７ｋｂの間の大きさで変動した。 例　２ プラスミドＦＬ６１−１−２ＯのｃＤＮＡ　入物の配列　析２２５７４ｄ突然変 異は、唯一の窒素源としてのプロリンを用いて成長させることができたとしても 、例１と同様の方法で得られた酵母菌列ＰＰＰＩ−２０から、プラスミドｐＦＬ ６１−ＰＰＰＩ−２０を単離し、そのｅＤＮ＾ＤＮＡをＮｏｌ＋フラグメントと して得、かつベクターｐＢｌｕｅｓｅ＋１ｐｔｓＫ中にクローン化した。こうし て、プラスミドｐＰＰＰＩ−２０が得られた（図１を見よ）０合成オリゴヌクレ オチドを用いた場合、該挿入物を、Ｓｓｎｇｔｔ他の方法（１９７７年、Ｐｔｏ ｃ　Ｎａ１ｌ　Ａｃ１ｄ　Ｓｅｉ　ＵＳ＾第７４巻　第５４６３−５４６７頁） によって配列させた。この配列は、上記しである。 同様の方法で、ｈｉｓ　４／ｂｉｐ　に重突然変異ではあるが、ヒスチジン添加 物を有する培地中で成長させることができた酵母菌列から、プラスミドｐＦＬ６ １−ｉＡＰ２を、単離し、その挿入物も、Ｎｏ＋ＩフラグメントとしてｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐＩｓＫ中にクローン化した。生じたプラスミドＰ＾へＰ２を、配列 させ、かつこの配列（Ｓｅｑ　ＩＤ−Ｎｏ、２）は、上記しである。該プラスミ ドｐＡＡＰ２は、ｐＰＰＰｌ−２０（図１を見よ）と同様の構造を有するが、挿 入物５ｅｑ−Ｎｏ、］の代わりに、挿入物５ｅｑ−Ｎｏ、２を有する（図３を見 よ）。 例　３ １４Ｃ標識された蛋白　を用いる酵母　列ＰＰＰＩ−２０および＾へＰ２中への 取り込み試験 例１と同様の方法で得られた酵母菌列２２５７４ｄ　：　＋　ＰＰＰＩ−２０を 、液体培地中で、培養基が対数期に達するまで成長させた。この培養基を遠心分 離後に、該細胞を洗浄し、かつ１００　ｍ　ｍのトリス／Ｈｅ１ｐＨ４，５，２ ｍ　ＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　ｔおよび０．６Ｍのソルビトール中に取り込んだ。懸濁 成約１００μｒを、０．５ｍＭのし一プロリンと、同じ緩衝液１００μ■中の１ ＰＣ＋の１１Ｃ標識されたし一プロリンとの溶液に添加した。 標識されたアミノ酸の取り込みを、Ｃｉ＋１ｌｌｏによって記載された方法（１ ９８９年、Ｍｅｌｈ　Ｅｎｘｙｍｏｌ第１７４巻　第６１７〜６２２頁）によっ て測定した。標識されたアミノ酸の取り込みは、一方で、蛋白質修飾物質、ベー タ・ブルガリスからの膜小胞中でのアミノ酸輸送の阻害剤であるジエチルピロカ ルボネートと一緒の同時恒温保持の場合および他方で、他の蛋白質修飾物質と一 緒の同時恒温保持の場合を比較した。計算された還元は、表Ｉおよび／またはＩ ＩＩ中に示されている。輸送体の特異性が種々のアミノ酸およびその類縁物を用 いて読み取ることができた競合試験は、ＰＰＰＩ−２０については表ＩＩ中に、 ＾ＡＰ２については図４に示されている。列ＪＴＩ６八八Ｐ２中へのヒスチジン 取り込みについての競合が試験された同様の試験は、例５中に記載されている。 ＰＰＰＩ−２０についての期間は、図２中に示されている。 例　４ アミノ酸輸送体のコーディング　域の過剰発　（０マｅ＋−ｅｘｒｅｆｆｓＩｏ ｎ　のための構造を有する植物の形　転挿入物として、アラビドプシスからのア ミノ酸輸送体のためのｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＰＰＰＩ−２０から挿入 物の内在性フラグメントを、Ｂｓｍ旧分割後に単離し、まず、酵素Ｂａｍ旧を朋 いて線状にされたＰＡＪからの分割位置中にクローン化した。次に、該ｃＤＮ＾ を、ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントとしてｐ＾７から製造し、かつベ クターｐＢＩＮ−ＨＹＧ中にクローン化した。アゲロバクチリアによる形質転換 後に、これをタバコおよびジャガイモの葉セグメントの感染のために挿入した。 手を付けずに転位していないキメラ遺伝子の存在をサザンブロシト分析を用いて 証明された１０個の独立に得られた形質転換細胞をアミノ酸の変更および窒素含 量について試験した。この他に、アミノ酸合成、光合成率および輸送を試験した 。 例　５ 酵母菌列ＡＡＰ２中への１ＮＣｔｌ！されたヒスチジンの取り込みの研究 例１と同様の方法で得られた酵母菌列］Ｔ１６　八ＡＰ２を、液体培地中で、培 養基が対数期に達するまで成長させた。この培養基を遠心分離後に、該細胞を洗 浄し、かつ１００ｍｍのトリス／ＨＣｌｐＨ４，５，２ｍ　ｍのＭ　ｇ　Ｃｌ　 ２および０．６Ｍのソルビトール込んだ．＠濁液約１　０　０　ｍ　ｌを、０． ５ｍｍのＬ−ヒスチジンと、同じ緩衝液１００μＩ中の１μＣ１のＩＩＣ標識さ れたし一ヒスチジンとの溶液に添加した．標識されたアミノ酸の取り込みを、Ｃ １目１１ｏによって記載された方法（１９８９年．　Ｍｅｌｈ　Ｅｎ！ｙｏｏｌ 第１７４巻　第６１７〜６２２頁）によって測定した．標識されたアミノ酸の取 り込みを、競合試験の場合に、１０倍の過剰量での異なるアミノ酸および類縁物 からのものと比較した。 この関係は、図５中に示されている。 表　■ 蛋白質修飾物質による酵母菌株２２５７４ｄ　：　＋　ＰＰＰＩ−２０中でのア ミノ酸輸送の阻害 阻害剤なして の　送の００ （ジエチルピロカルボネート） １０μＭのＣＣＣＰ　＜３ （カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン）１０μＭの２．　４ＤＮ Ｐ　＜３ （ジニトロフェノール） １ｍＭの砒酸ナトリウム　３５ １０μＭのアンチマイシンＡ　２９ ５００μＭのＰ　ＣＭＢ　Ｓ　７　８ （ｐ−クロロメルクリベンゼンスルホン酸）諸表千７−５０８４１９　（１２） 表　Ｉ＋ 酵母菌株２２５７４ｄ　：　：　ＰＰＰＩ−２０中でのアミノ酸および練物の１ 　、４倍および１０　の通　量による　合過剰量　ＩＸ　４Ｘ　ＩＯＸ 残留する輸送体の活量％： グルタミ：４　６４　２７　３０ アスパラギン酸　７８　２７ リジン　８６　８３ ヒスチジン　８１　７９　５８ アルギニン　８５　８８　７４ トレオニン　−　５０　− Ｌ−プロリン　４９　２１　１４ Ｄ−プロリン　９８　９５ ３、４−ジ−ＯＨプロリフ　８６　４９アゼチジン− ２−カルボン酸　９１　４８ ０Ｈ−プロリン　８１　４５ アスパラギン　６４　５７ メチオニン　２８　８ グリシン　６９　１６ アラニン　５５　２９　２３ トリプトフアン　８２　７１　４８ フエニルアラニン　４５　１６ シトルリン　４４ γ−アミノ酪酸　９０ 表　Ｉｌ＋ 蛋白質修飾物　による酵母菌株ＴＩ６　：　：　ＡＡＰ２中でのアミノ酸輸送の 阻害 阻害剤なしで の輸送の％ １ｍＭのＤＥＰＣ　３．１±１．６ （ジエチルピロカルボネート） １０ＤＭのＣＣＣＰ　１５．６±２．１（カルボニルシアニド ｍ−クロロフェニルヒドラゾン） １０μＭの２．４ＤＮＰ　７．６±１．６（ジニトロフェノール） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｉ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸輸送体のコーディング領域を有するＤＮＡ配列において、ヌクレオ チド配列中に含まれた情報により、植物ゲノム中への組み込みによってＲＮＡが 形成されていてもよく、かつこのＲＮＡを用いて、新しいアミノ酸輸送活量が植 物細胞中に導入されていてよいかまたは内在性アミノ酸輸送体活量が発現されて いてよいことを特徴とする、ＤＮＡ配列。
2. ２．ＤＮＡ配列が、以下のヌクレオチド配列（Ｓｅｑ−ＩＤ　Ｎｏ．１）： 【配列があります】【配列があります】を有する、請求項１に記載のＤＮＡ配列 。
3. ３．ＤＮＡ配列が、以下のヌクレオチド配列（Ｓｅｑ−ＩＤＮｏ．２）： 【配列があります】【配列があります】を有する、請求項１に記載のＤＮＡ配列 。
4. ４．プラスミドにおいて、請求項１から３までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配 列を有することを特徴とする、プラスミド。
5. ５．プラスミドが、ｐＰＰＰ１−２０（ＤＳＭ　７１２９）である、プラスミド 。
6. ６．プラスミドが、実施例２により得られたｐＡＡＰ２である、プラスミド。
7. ７．プラスミドが、ｐＢｉｎ　ＰＰＰ１−２０（ＤＳＭ　７１３０）である、プ ラスミド。
8. ８．原核細胞および真核細胞の形質転換のための、請求項４から７までのいずれ か１項に記載のプラスミドまたはその誘導体またはその一部分の使用。
9. ９．植物において、請求項１から３までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を有 することを特徴とする、植物。
10. １０．細菌において、請求項１から３までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を 有することを特徴とする、細菌。
11. １１．輸送体の変化した特異性を有するプラスミドを得るための、請求項１から ３までのいずれか１項に記載のアミノ酸輪送体のＤＮＡ配列の使用。
12. １２．植物のゲノムからの同様の配列を単離するための、請求項１から３までの いずれか１項に記載のアミノ酸輸送体のＤＮＡ配列の使用。
13. １３．原核細胞および真核細胞中でのアミノ酸輸送体の合成を可能にする翻訳可 能なｍＲＮＡの発現のための、請求項１から３までのいずれか１項に記載のアミ ノ酸輸送体のＤＮＡ配列の使用。
14. １４．原核細胞および真核細胞中でのアミノ酸輸送体の合成を阻害する翻訳不可 能なｍＲＮＡの発現のための、請求項１から３までのいずれか１項に記載のアミ ノ酸輸送体のＤＮＡ配列の使用。
15. １５．原核細胞および真核細胞中での発現のための舵取り要素との組合わせ物中 の、請求項１から３までのいずれか１項に記載のアミノ酸輸送体のＤＮＡ配列の 使用。
16. １６．酵母菌菌株において、請求項１から３までのいずれか１項に記載のＤＮＡ 配列を有することを特徴とする、酵母菌菌株。
17. １７．植物アミノ酸輸送体の同定のための、請求項１６に記載のＤＮＡ配列を有 する酵母菌菌株の使用。
18. １８．変化したアミノ酸および窒素代謝物を有する植物を得るための、請求項１ から３までのいずれか１項に記載のアミノ酸輸送体のＤＮＡ配列の使用。
19. １９．増大した収量を有する農作物を得るための、請求項１から３までのいずれ か１項に記載のアミノ酸輸送体のＤＮＡ配列の使用。
20. ２０．原核細胞および真核細胞中での化合物の輸送のための、請求項１から３ま でのいずれか１項に記載のアミノ酸輸送体のＤＮＡ配列の使用。