JPH05153978A - 調節遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 特定の塩基配列で表されるエンドウのフェニ
ルアラニンアンモニアリアーゼ調節遺伝子、及び該調節
遺伝子と、エンドウのフェニルアラニンアンモニアリア
ーゼ構造遺伝子を含む、特定の塩基配列で表されるエン
ドウのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子。 【効果】 本発明の調節遺伝子は、植物の構造遺伝子の
転写を人為的に促進又は抑制することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、広く植物の遺伝子の転
写の調節が可能な新規の調節遺伝子、さらに詳細には、
本来、エンドウ (Pisum sativum L.) のフェニルアラニ
ンアンモニアリアーゼ (Phenylalanine Ammonia Lyase
、以下「PAL」と略記する。) 遺伝子の転写を調節する
機能を有する調節遺伝子、並びにかかる調節遺伝子およ
びPALの構造遺伝子を含むエンドウのPAL遺伝子に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年の植物分子生物学の進歩に伴い、有
用物質含量の高い品種や病害抵抗性の品種等の目的を持
った植物の育種において、その目的の形質を備えた遺伝
子を植物体へ導入する技術の利用が可能となってきた。
例えば、タバコモザイクウイルス(TMV) の外被タンパク
遺伝子や、Bacillus thuringiensis由来の鱗翅目昆虫に
対する殺虫性BT毒素遺伝子を植物体へ導入した例が報告
されている (P.P.Abel等、Science, vol.232, p.738-74
3, 1986 ； D.A.Fischhoff等、Bio/Technology,vol.5,
p.807-813, 1987) 。これらは、カリフラワーモザイク
ウイルス (CaMV)遺伝子の調節遺伝子である 35Sプロモ
ーターを用い、その下流に構造遺伝子として TMV外被タ
ンパク質遺伝子やBT毒素遺伝子をそれぞれ連結し、アグ
ロバクテリウム ツメファシエンス (Agrobacterium tu
mefaciens)を介して、又はエレクトロポレーション法を
用いて植物に導入したものであり、導入した遺伝子の発
現、及び導入による新規な形質の獲得も確認されてい
る。

【０００３】しかしながら、前記したCaMVの35Sプロモ
ーターは、遺伝子導入技術において現在最も多く用いら
れているものの、強力な遺伝子転写促進作用を有するた
め、その下流に連結した構造遺伝子の性質によっては、
その遺伝子を導入した植物体自体に成長の段階で代謝異
常や成育阻害等の悪影響を及ぼす可能性がある。また、
果実成熟期や開花期等の特定の時期にのみ形成を発現さ
せたい場合には使用することができない。よって、遺伝
子の転写を促進するだけでなく、抑制することもできる
ような、人為的調節因子の出現が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の主な
目的は、遺伝子の転写の促進及び抑制を人為的に調節す
ることができ、遺伝子導入技術に大いに貢献することが
できるような新規な調節遺伝子を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
ついて鋭意検討を重ねた結果、エンドウのPAL遺伝子の
転写を調節する調節遺伝子を、上記に述べた調節遺伝子
として用いることでかかる課題を解決し得ることを見出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、配列番号
１に示される塩基配列を有する調節遺伝子、配列番号２
に示される塩基配列を有するエンドウのフェニルアラニ
ンアンモニアリアーゼ遺伝子、及び配列番号１に示され
る塩基配列を有する調節遺伝子の下流に配列番号２に示
されるエンドウのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ
遺伝子の構造遺伝子部分の全部又は一部が付加されてい
ることを特徴とする調節遺伝子を提供するものである。

【０００６】PALは、植物及びある種の微生物に存在
し、フェニルアラニンを脱アミノしてtrans-ケイ皮酸を
生成する反応を活性化する酵素である。この反応は、植
物にとって重要な二次代謝物の生合成経路の最初の反応
であるフェニルプロパノイド・イソフラボノイド合成経
路の最初の反応であり、 PALは、この合成経路の律速酵
素となっていることが知られている (Edith L.Camm等、
Phytochemistry, vol.12, p.961-973, 1973)。

【０００７】従来より、多くの植物について、光や薬剤
等によりこのPALの活性を高める方法が提案されており
(D.C.Loschke等、Physiolosical Plant Pathology, vo
l.23, p.163-173, 1983；D.H.Jones等、Eur.J.Bioche
m., vol.116, p.117-125, 1981；N.F.Haard等、Physiol
osical Plant Pathology, vol.8，p.207-213, 1976 ；
W.Noe等、Planta, vol.154, p.454-458, 1982) 、実際
に、これらの方法を用いて植物中のフェニルプロパノイ
ド・イソフラボノイド系のいくつかの有用物質の含量を
高める試みが行われている (H.Mohr等、Planta, vol.14
6, p.369-376, 1979；C.Sander等、 Biochem. Biophys.
Acta, vol.563, p.278-292, 1979)。

【０００８】エンドウPALは、例えば、エンドウ中のフ
ァイトアレキシンの一つであるピサチンの含量調節に関
していることが知られており、寄生菌の侵入による病気
に対する耐性を示す品種の開発を行う際にその利用が大
いに期待されるものである。本発明遺伝子は、以下の手
順によって提供される。 (１) エンドウゲノムDNAの単離精製 (２) エンドウゲノムDNAライブラリーの作成 (３) エンドウPAL調節遺伝子を含むPAL遺伝子の選抜 (４) 選抜した遺伝子の塩基配列の決定及び調節遺伝子
領域の推定 (５) 発現調節活性を確認するための組み換えプラスミ
ドの構築 (６) 発現調節活性の確認 以下、各手順のそれぞれについて詳細に説明する。

【０００９】(１) エンドウゲノムDNAの単離精製 本発明においてエンドウゲノムDNAの材料となるエンド
ウは、特に限定されず、例えばエンドウアラスカ種等を
広く用いることができる。さらに、エンドウの植物体に
おいて用いる部位も特に限定されないが、ゲノムDNAの
単離の手順等の容易性を考慮すれば、当該種子部を用い
るのが好ましい。

【００１０】エンドウゲノムDNAは、例えば上記種子を
培養に適した公知の条件に従い、一週間程度培養して得
られる胚軸を液体窒素下で磨砕し、例えば、E.Richards
等の方法 (Current Protocols in Molecular Biology,
2.3.1,〜2.3.3 Green Publishing Associates and Wile
y-Interscince, 1987)等常法を用いて行なうことができ
る。この際可能な限りDNAが物理的剪断を受けないよう
に留意して単離精製するのが好ましい。

【００１１】(２) エンドウゲノムDNAライブラリーの作
成 上記により得られたゲノムDNAを、通常は粘着末端を与
える制限酵素を用いて部分消化を行なう。粘着末端を与
える制限酵素としては、例えば、 Sau3AＩ、BamHI 等幅
広く用いることができる。なお、平滑末端を生ずる制限
酵素を用いる場合においても、事後的に合成リンカーを
末端部に接合するか、平滑末端同士を接着可能なT4 DNA
リガーゼ等を用いてエンドウゲノムライブラリーの作成
に供することができる。部分消化後、ショ糖密度勾配遠
心分離法等の方法を用いて、ベクターに挿入するのに適
した長さの DNA断片に分画する。かかる DNA断片は、通
常10〜25kb程度、好ましくは20kb程度の長さのものを選
択する。当該 DNA断片をクローニング用ベクターに DNA
リガーゼの存在下で連結する。クローニングベクターと
しては、プラスミド、ファージ、コスミド等広く用いる
ことができるが、ゲノムDNA用クローニングベクターと
して確立しているものを用いるのが好ましい。かかるゲ
ノムDNA用クローニングベクターとしては、例えば置換
型ファージベクターEMBL3 DNA (STRATAGENE社製) を挙
げることができる。

【００１２】次に、上記組換えDNAを宿主に組み込むこ
とが必要である。宿主としては、原核生物、酵母、真核
生物を問わず、具体的には、上記で用いたクローニング
ベクターによって規定される。原核生物としては、代表
的なものとして大腸菌、枯草菌等を；酵母としては、サ
ッカロミセス・セルビシアエ等を；真核生物としては、
タバコ等の大量培養可能な植物細胞を用いることができ
る。なお、上記クローニングベクターは、各々の宿主を
外来遺伝子を取り込みやすい状態で宿主に導入される。
例えば宿主として大腸菌を用いる場合には、主に対数増
殖期にある細胞を集め、マグネシウムイオンで処理した
ものを宿主として用いるのが好ましい。さらにクローニ
ングベクターの導入に際しては、上記の他、電気パルス
を用いる方法、例えば宿主として植物細胞を用いる場合
には、M. Fromm等の方法 (Proc.Nat. Acad. Sci. U.S.
A., vol.82, p.5824, 1985) を採ることも可能である。

【００１３】(３) 調節遺伝子を含むPAL遺伝子の選抜 上記により得られたエンドウゲノムDNAライブラリーよ
り、エンドウPAL遺伝子を有する株を選別することが必
要である。選別法は導入に用いたベクターの種類に応じ
て、通常公知の方法を用いて行なうことができる。例え
ば、ベクターとしてλファージを用いる場合には、通常
プラークハイブリダイゼーション法と称される方法が採
用される。すなわち、シャーレ上に組換えλファージの
プラークを形成させ、その表面にニトロセルロース膜又
はナイロン膜をのせて組換え体ファージを吸着させ、当
該膜をアルカリ処理しファージの外被タンパクを変性さ
せると同時に二本鎖DNAを一本鎖に解離させた後、別に
調製したエンドウPALcDNA遺伝子をプローブとしてハイ
ブリダイゼーションを行ない、エンドウPAL遺伝子を含
む DNA断片を保持する組換えλファージを陽性プラーク
として得ることができる。

【００１４】得られた陽性プラークの由来する組換えフ
ァージから、常法によりDNAを回収し、適当な制限酵素
を用いることにより、大腸菌形質転換株に組み込まれた
挿入DNA断片を切り出すことができる。なお、上記 (２)
(３) に示した方法の他、エンドウPALcDNA遺伝子の一部
をプローブとしてPCR法 (R.K. Saiki等、Science, vol.
239, p487-491, 1988) を用いて、所望の DNA断片を特
異的に増幅させ、かかる DNA断片を直接クローニングベ
クターを介して宿主に導入して、調節遺伝子を含むPAL
遺伝子をクローニングすることも可能である。

【００１５】(４) 選抜した遺伝子の塩基配列の決定及
び調節遺伝子領域の推定 上記 (３) において確認されたエンドウPAL遺伝子を含
む DNA断片の構造は、例えばダイデオキシヌクレオチド
鎖終結法 (Smith A.J.H., Meth. Enzym., vol.65, p.56
0-580, 1980)等の常法を用いて決定することができる。
決定した塩基配列は、エンドウPALcDNAの塩基配列との
比較、又はCAATボックスやTATAボックス等の普遍的調節
遺伝子特異的配列の検索によって、調節遺伝子領域を推
定することができる。

【００１６】(５) 発現調節活性を確認するための組換
えプラスミドの構築 上記 (４) によって、推定された領域が調節遺伝子であ
ることを確認するには、特定植物の構造遺伝子を予め組
み込んだプラスミドにおいて、かかる構造遺伝子の上流
に調節遺伝子と推定される配列を組み込み直接遺伝子の
発現を確認する方法も採ることができるが、その発現を
高感度で検出できるレポーター遺伝子である、例えばク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)
やβ−グルクロニダーゼ(GUS) 遺伝子を有する植物形質
転換用ベクター、具体例を挙げれば、 p35SCAT-N (農林
水産省農業生物資源研究所、広近洋彦氏より譲渡され
る)や pBI101 (Clontech社製) 等に組み換えた、組換え
プラスミドを用いて発現調節活性を確認するため組換え
プラスミドを構築するのが好ましい。

【００１７】なお、かかる組換えプラスミドの構築は、
通常の公知の方法により行なうことができる。 (６) 発現調節活性の確認 前記 (５) により得られた組換えプラスミドを、先に従
来の技術の欄に記載したアグロバクテリウム法やエレク
トロポレーション法により植物に導入し、レポーター遺
伝子の発現を検出すれば、本発明調節遺伝子の発現調節
活性を確認することができる。

【００１８】又、組換えプラスミドにより遺伝子を導入
する際に、その植物の細胞に、ＰＡＬの発現誘導又は抑
制手段として知られている処理を行うことにより遺伝子
の発現を人為的に調節することができる。かかる発現誘
導処理としては、例えば、エンドウ褐紋病菌の胞子発芽
液中に存在する高分子糖蛋白 (H.Oku等、 Naturwissens
chaften, vol.63, p.643-644, 1977 及び T.Shiraishi
等、Ann. Phytopath. Soc. Japan, vol.44, p.659-665,
1978)のような生物的エリシター; アクチノマイシン
Ｄ、グルタチオンのような代謝阻害剤；パラコートのよ
うな農薬；Cu⁺ のような重金属イオン等による処理、あ
るいはＵＶ照射のような普遍的ストレスの供与等を挙げ
ることができ、又発現抑制処理としては、K252a(和光純
薬工業株式会社製；堀直裕ら、日本植物病理学会大会講
演要旨予稿集、29頁、1990 (平成２年４月３〜５日、愛
媛大学教養部にて発表))、バナジン酸 (吉岡博文ら、日
本植物病理学会大会講演要旨予稿集、23頁、1989 (平成
１年６月７〜９日、北海道大学学術交流会館にて発表))
のようなATPアーゼ活性阻害剤による処理を挙げること
ができる。これらの処理を行った後に、前記したレポー
ター遺伝子の発現を検出すれば、この人為的調節を確認
することができる。

【００１９】このようにして確認された調節遺伝子は、
エンドウのPAL遺伝子の調節を行ない得ることをもちろ
んであるが、例えばタバコ、イネ等、広く他の植物遺伝
子の発現を調節することが可能である。なお、発現効率
の向上のために、上記調節遺伝子としては、純然たる調
節領域の他、エンドウのPALの構造遺伝子を上記調節領
域の下流に一部又は全部を含むものをも採用できる。な
お、ここでいう構造遺伝子の全部とは、本来の構造遺伝
子部分より終止コドン部分を除いたものをいう。かかる
構造遺伝子部分の本来の調節遺伝子の下流域への付加
は、前記の通り本来の構造遺伝子部分の終止コドンに相
当する部分を除いて特にその長さが限定されるものでは
ない。

【００２０】本発明調節遺伝子は、前記のごとくエンド
ウから調製できることはもちろんであるが、通常の方
法、例えばホスファイトトリエステル法 (M. Hunkapill
er等、Nature, vol.310, p105-111, (1984))等に従って
化学合成をすることもできる。本発明調節遺伝子を用い
て、植物構造遺伝子を発現させる場合には、本発明調節
遺伝子の下流に所望の植物構造遺伝子を組み込んだベク
ターを通常公知の方法により構築し、これを、ベクター
の種類に応じた宿主に導入して、発現を行なうことがで
きる。

【００２１】発現の詳細な条件は、植物構造遺伝子、ベ
クター、又は宿主の種類に応じて個別に決定される。ま
た発現した植物物質の単離・精製も常法を用いて行なう
ことができる。

【００２２】

【発明の効果】本発明により、植物の構造遺伝子の転写
を人為的に促進又は抑制することが可能な調節遺伝子の
提供が可能となった。

【００２３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれはに限定されるものではない。

【００２４】

【実施例１】 (１) エンドウゲノムDNAの単離精製 エンドウアラスカ種の種子をバーミキュライトに播種
し、暗黒下20℃で７日間培養して平均７cmの実生を得
た。この実生の胚軸部分を液体窒素下で磨砕し、E.Rich
ardsらの方法 (Current Protocols in Molecular Biolo
gy, ２.3.1〜2.3.3,Green Publishing Associates and
Wiley-Interscience, 1987)に従って可能な限り無傷の
エンドウゲノムDNAを抽出精製した。40ｇの実生から約
７mgのエンドウゲノムDNAが得られ、アガロースゲル電
気泳動で分析した結果、得られたエンドウゲノムDNAは
比較的無傷であることが確認された。

【００２５】(２) エンドウゲノムDNAライブラリーの作
成 得られたエンドウゲノムDNAを用いて、制限酵素 Sau3A
Ｉ（東洋紡績株式会社製) による部分消化反応を行っ
た。まず、予備実験として、１μg のエンドウゲノムDN
Aを用いて、約20kbの断片が最も多く得られる部分消化
反応の条件を決定した。すなわち、１μg のエンドウゲ
ノムDNAに Tris-Cl緩衝液 (pH7.5)10mM、塩化マグネシ
ウム10mM及び食塩100mM を加えたチューブを７本用意
し、各々のチューブにSau3AＩを1.５、1.５^-2、1.
５^-4、1.５^-8、1.５^-16、1.５^-32、1.5^-64 ユニット添
加して37℃で正確に１時間反応させた後、エチレンジア
ミン四酢酸 (EDTA) 50mM、ドデシル硫酸ナトリウム (SD
S) 0.5％を加えて反応を停止した。これらについてアガ
ロースゲル電気泳動で分析し、最適と思われる条件を検
討した結果、1.５^-4ユニット添加したものが最適であっ
たので、本実験として、15μgのエンドウゲノムDNAを用
いてこの条件で部分消化反応を行った。

【００２６】次いで、ショ糖密度勾配遠心分離により、
部分消化反応を行ったエンドウゲノムDNA の中から約20
kbの DNA断片を分画した。20分画した各画分の一部を用
いてそのサイズをアガロースゲル電気泳動で分析した結
果、第５画分を選びだし、この画分をエタノール沈澱
(約2.５倍容量のエタノールを加えて約−20℃に冷却
後、遠心分離を行い沈澱を得る) により濃縮精製した。

【００２７】上記部分消化反応の結果、ベクターに連結
可能なエンドウゲノムDNAが10μg得られ、そのうち3.０
μg を用いて置換型ファージベクターEMBL3 DNA (STRAT
AGENE社製) との連結反応を行った。２本のチューブ各
々に1.５μgのエンドウゲノムDNA 及び10μg のEMBL3 D
NA を加えて混和し、これに Tris-Cl緩衝液 (pH7.５) 1
0mM、塩化マグネシウム10mM、ジチオトレイトール (DT
T) 10mM 、アデノシン三リン酸 (ATP)１mM及びT4 DNAリ
ガーゼ (Boehringer Mannhrim社製) ２ユニットを加え2
0℃で１時間、次いで４℃で16時間反応させた後、68℃
で５分間熱処理を行い反応を停止した。

【００２８】次に、得られた組換えDNAをλファージの
外被タンパク (in vitro packagingkit^TM (Amersham社
製))と混和して20℃で２時間放置することにより、組換
え DNAを持つ組換えλファージを得た。一方、大腸菌7
118株を20mlのLBMM培地 (トリプトン１％、食塩１％、
酵母エキス0.５％、硫酸マグネシウム10mM及びマルトー
ス0.４％を含有する培地) に接種し、30℃で10時間振と
う培養した。培養後、菌体を遠心分離により集め、あら
かじめ４℃に冷却しておいた10mlの硫酸マグネシウム10
mMに懸濁して、ファージが感染しやすい状態とした。こ
うして得られた大腸菌に上記組換えλファージを混和
後、37℃で25分間放置して組み込ませ、0.７％の寒天を
含むLBMM培地に懸濁した。次いで、1.５％の寒天を含む
LBMM培地上に広げ、37℃で12時間培養した。

【００２９】(３) 調節遺伝子を含むPAL遺伝子の選抜 上記の結果、１μg のエンドウゲノムDNA当たり3.５×1
0⁵ 個のプラークが得られ、これを用いてプラークハイ
ブリダイゼーションによりエンドウPAL遺伝子を有する
組換えλファージの選択を行った。まず、プラークが現
れたLBMM寒天培地上にナイロン膜 (Hybond-N (Amersham
社製))を載せ１分間放置した後、プラーク吸着面を上側
にして変性溶液 (食塩1.5M、水酸化ナトリウム0.5M) を
浸透させた濾紙 (3MM ペーパー (Whatman社製))上に置
き７分間放置した。次いで中和溶液 (食塩1.5M、Tris-C
l緩衝液 (pH7.2) 0.5M)を浸透させた濾紙上に同様に置
き７分間放置した。この中和処理を更に１回行った後、
２倍 SSC溶液 (食塩300mM、クエン酸ナトリウム30mM)
でナイロン膜を洗浄し、80℃で２時間放置して組換えDN
Aの固定を行った。

【００３０】得られたナイロン膜を用いて、ラジオアイ
ソトープでラベルしたエンドウPALcDNAをプローブとし
たハイブリダイゼーションを行った。プローブのラベル
反応にはDNA labeling kit (Boehringer Mannhrim社製)
を用いランダムプライマーラベリング法 (J.Sambrook
等編、Molecular Cloning a laboratory manual, 10.13
〜10.15, Cold Spring Harbor, 1989)で行った。また、
ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook等編、 Molecul
ar Cloning a laboratory manual, 2.114 〜2.117, Col
d Spring Harbor, 1989記載の方法に従った。

【００３１】1.１×10⁶ 個のプラークから、最終的に４
個の陽性プラーク (♯１, ♯７, ♯11, ♯12と識別し
た。) が得られた。このものから常法に従って組換えλ
ファージのDNAを回収し、制限酵素 SalＩ (東洋粉績株
式会社製) により消化反応を行った後、アガロースゲル
電気泳動で分析した結果、11.7Kb、12Kb、13Kb、及び13
Kbの挿入 DNA断片が含まれていた。この挿入 DNA断片に
ついて数種類の制限酵素で消化反応を行い制限酵素地図
を作成したところ、得られた４個のクローンは２種のク
ローンであることかわかり、その一方をgPALlと名付け
た。なお、得られた制限酵素地図を図１に示した。

【００３２】(４) 選抜した遺伝子の塩基配列の決定及
び調節遺伝子領域の推定 gPALl DNA断片に含まれるエンドウPAL構造遺伝子とその
5'上流域の塩基配列を、ダイデオキシヌクレオチド鎖終
結法の原理に基づくSEQENASE^TM version2.０(U.S.B.社
製) を用いてその説明書に従って決定した。その配列を
配列番号２に示す。

【００３３】決定した塩基配列について検索したとこ
ろ、5'上流域には、転写開始点を＋１とした時、真核生
物の調節遺伝子に共通するTATAボックスが−34塩基目
に、CATAボックスが−64塩基目にそれぞれ存在してい
た。又、真核生物の転写を調節する重要な働きを持つと
考えられているSV40のエンハンサーに相当する配列や、
フェニルプロパノイド代謝に関与する遺伝子の調節領域
に見出される共通の配列も存在することが明らかとなっ
た。更に、gPALl DNA断片に含まれるエンドウPAL遺伝子
は、先に出願した明細書 (特願平３-97697号) に記載さ
れているエリシターで発現を誘導した PALcDNAの塩基配
列と相同であった。このことから、 gPALl DNA断片の5'
上流域のDNAは、エリシターによる誘導を受ける調節遺
伝子であることが推定された。推定された領域の配列を
配列番号１に示す。

【００３４】なお、 gPALlを常法により、大腸菌7118株
に組み込んだ当該形質転換体Escherichia coli 7118 (p
11E11)は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第12608号 (FERM P-12608) として寄託されている。 (５) 発現調節活性を確認するための組換えプラスミド
の構築 推定された gPALl DNA断片の5'上流域の DNAに、レポー
ター遺伝子としてクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ(CAT) 遺伝子を組み込むために、該遺伝子
を有する植物形質転換用ベクターである p35SCAT-N DNA
(農林水産省生物資源研究所、広近洋彦氏より譲渡され
たもの) 中に連結されているCaMV 35Sプロモーターを g
PALl DNA断片の5'上流域の DNAに置換して、組換えプラ
スミドpPALl(1-5)を作成した。すなわち、制限酵素 Sph
ＩとBamHIにより切断したp35SCAT-N DNA 30ngと、 gPAL
l DNA断片の5'上流域の1392塩基目の転写開始点を＋１
とした時の−340塩基目から＋140塩基目の間の DNA断片
100ngを混和し、 Tris-Cl緩衝液 (pH7.５) 10mM、塩化
マグネシウム10mM、DTT 10mM、 ATP１mM及びT4 DNAリガ
ーゼ (Boehringer Mannhrim社製) ２ユニットを加えて1
6℃で８時間反応させることにより両者を接続した。

【００３５】得られた組換えプラスミドpPALl(1-5)を、
コンピテント・ハイE.coli DH5 (東洋紡紡績株式会社)
を用いてその説明書に従い大腸菌DH５株に組み込み、形
質転換体を得た。この形質転換体を２リットルのLB培地
(トリプトン１％、食塩１％及び酵母0.５％を含有する
培地) で培養し、常法に従ってプラスミドDNA を単離精
製して１mgのpPALl(1-5)DNA を得た。かかるpPALl(1-5)
の構築図を図２に示す。

【００３６】一方、エンドウの液体振とう培養細胞よ
り、イネ・プロトプラスト培養系 (大槻義昭、農林水産
技術情報協会) に従ってエンドウのプロトプラスト (原
形質体) を調製した。このプロトプラスト約１×10⁶ 個
をエレクトロポレーション緩衝液 (マンニトール0.5M、
硫酸マグネシウム0.1M) に懸濁し、pPALl(1-5)DNA 50μ
g 及び低分子キャリヤーDNA (J.Sambrook 等編 Molecul
ar Cloning a laboratory manual, B.15, Cold Spring
Harbor, 1989に従って調製したサケ精子DNA) 50gを加
え、遺伝子導入装置GTE-10 (島津製作所株式会社製) を
用いて電界強度１kV／cm、パルス幅2.０ms、パルス回数
５回の条件で電気パルスを与えてエンドウ細胞中にpPAL
l(1-5)DNA を導入した。遠心分離によりプロトプラスト
を回収し、LP培地 (Arnold V.S. 等、Physiol. Plant,
vol.39, p257-260, 1977) に再度懸濁して、遺伝子発現
誘導処理としてエンドウ褐紋病菌から得たエリシターを
加え、また、遺伝子発現抑制処理として更にバナジン酸
を加え暗黒下22℃で９〜12時間放置後、Gormanらの方法
(Mol. Cell Biol., vol.2, p.1044-1051, 1982)に従っ
て CATアッセイを行った。この結果、無処理のものに対
してエリシター処理を行ったものは明らかな CAT遺伝子
の発現誘導が確認され、エリシター処理に次いでバナジ
ン酸処理を行ったものは CAT遺伝子の発現が顕著に抑制
されていることが確認された。

【００３７】このことにより、本発明の遺伝子は、エリ
シター処理やバナジン酸処理等の人為的処理によって、
導入する遺伝子の発現の誘導及び抑制を調節することが
できるものであることが証明された。

【００３８】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１５０８ 配列の型：DNA 配列の種類：ゲノムDNA 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 起源：エンドウ 配列の特徴：エンドウフェニルアラニンアンモニアリア
ーゼ調節遺伝子 配列： AAAAATGTACTTGGGACATTAGAGATCATTACGAAATTAAGGAACTTTTTTACTCGAGATGTGATGTCTACC TTTTTGACACACTTGGGGGTGCTATAATTACTTGGATTAGAAAATGATCACGTTCCTGTTGGATATGTGAAG ATATATTTCAAGAGCTTATTGTTTATTAAAATTCTGATAACTTTAAGCAAATATCTGGAGAAAAAAAAACAT AAAGCATCTAAAGTTGGCGGCTGCAACTACGCATCATTAAGTATTAATGTTGTTGAGGTTAGCCCGAAGGAT TGTAAATTTATTTATTTTTTAATTAAATTTTTATTTAGATTTTAGATTAATTAAATATAATTATTATTTTTA ATTATGTTTTCATTTAATTAGCGTGAAGACCGGAGTATAATTCTGTTTCTTAATGAGATCCATGCGGAGACT CATATCAAGAAAAATAAGGAGTATGTACAAGAAAAAATAAAGCATGTTCTTTTGATATTTAGTTATTTTTTG ACAAACCTAATTTATTTAAATTATGATAATATCTTCTTTTTTATAGGAGAAGTATGATAAAGAACTCCCCAT TTATCTATCAGAGAATCCTAGATTACATGCACCGCCACCAAGATATCCTACTTTCTAGTGTGTCATTCAAGA CTTATTATGGTGTATCATACGGAAAGAAGAAAAATAGGAGAGTGTATGGTGTTGAATTATTGACCATACAAA ACAAAATGAGGTTAGATTTGCGAAGGATAAAACCTTTGACAATTACCAATGCGATAAATCCCTCACGAATAT TTATTTTGTGATGAATTTTTGCACTTGTGAGAGATTTAACCCTCACAAAAGAGTCTTATAGTGTTATTTTTA TATTAATTTGTTAATTAATATGTAGGAATGTAGTATAATTAAAAAGGTGTAGTCATTTATCCTATTACTTAC AATATTGTGATTTGAGACACTCTTTAAGTAAATGATGATTGATAAGTATAGTAGTATAAAAATTTATAAATA ATATAATGTATGCATTGGGTTGACCGACATTTAGAGTTGAATCTAAAGTCATGGTCATGCATGGTTGCTTCC ACCATATTTCTTGCCAACTACCTCGTGTTTCTCTTAGTCTATTGCCATCCACCCATATGCATCTATCTACCA ACCCAAAAACAAAGAAAACCAAAACCCTAGATTGCCACGTTACAAAATCTTAACTGTTCATTAGTAAGTGAT GATCAAACGGCCATAATTAATATTCAACAAACCACTTTTCTTTTTTTCTACTTGTGCAACTTGTCTTTCCTC ACCTACCAAACTCACATATCACACCAACACACATGCAATGCACAATACTACATTTCAAAGTCTCTATATAAA GCTTAACCACTCTTCCTTCACATCTCAGGAAACTCATAACTCTTTCATTTTCTTTCATAATCATTTGAGTTT CCATTCTCTTGAAATTCTTGCAACCAATTCTCAACAAAGAAACATTAGTTACTTTAGTATCAATTAAA 配列番号：２ 配列の長さ：４４１５ 配列の型：DNA 配列の種類：ゲノムDNA 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 起源：エンドウ 配列の特徴：エンドウフェニルアラニンアンモニアリア
ーゼ遺伝子 配列： AAAAATGTACTTGGGACATTAGAGATCATTACGAAATTAAGGAACTTTTTTACTCGAGATGTGATGTCTACC TTTTTGACACACTTGGGGGTGCTATAATTACTTGGATTAGAAAATGATCACGTTCCTGTTGGATATGTGAAG ATATATTTCAAGAGCTTATTGTTTATTAAAATTCTGATAACTTTAAGCAAATATCTGGAGAAAAAAAAACAT AAAGCATCTAAAGTTGGCGGCTGCAACTACGCATCATTAAGTATTAATGTTGTTGAGGTTAGCCCGAAGGAT TGTAAATTTATTTATTTTTTAATTAAATTTTTATTTAGATTTTAGATTAATTAAATATAATTATTATTTTTA ATTATGTTTTCATTTAATTAGCGTGAAGACCGGAGTATAATTCTGTTTCTTAATGAGATCCATGCGGAGACT CATATCAAGAAAAATAAGGAGTATGTACAAGAAAAAATAAAGCATGTTCTTTTGATATTTAGTTATTTTTTG ACAAACCTAATTTATTTAAATTATGATAATATCTTCTTTTTTATAGGAGAAGTATGATAAAGAACTCCCCAT TTATCTATCAGAGAATCCTAGATTACATGCACCGCCACCAAGATATCCTACTTTCTAGTGTGTCATTCAAGA CTTATTATGGTGTATCATACGGAAAGAAGAAAAATAGGAGAGTGTATGGTGTTGAATTATTGACCATACAAA ACAAAATGAGGTTAGATTTGCGAAGGATAAAACCTTTGACAATTACCAATGCGATAAATCCCTCACGAATAT TTATTTTGTGATGAATTTTTGCACTTGTGAGAGATTTAACCCTCACAAAAGAGTCTTATAGTGTTATTTTTA TATTAATTTGTTAATTAATATGTAGGAATGTAGTATAATTAAAAAGGTGTAGTCATTTATCCTATTACTTAC AATATTGTGATTTGAGACACTCTTTAAGTAAATGATGATTGATAAGTATAGTAGTATAAAAATTTATAAATA ATATAATGTATGCATTGGGTTGACCGACATTTAGAGTTGAATCTAAAGTCATGGTCATGCATGGTTGCTTCC ACCATATTTCTTGCCAACTACCTCGTGTTTCTCTTAGTCTATTGCCATCCACCCATATGCATCTATCTACCA ACCCAAAAACAAAGAAAACCAAAACCCTAGATTGCCACGTTACAAAATCTTAACTGTTCATTAGTAAGTGAT GATCAAACGGCCATAATTAATATTCAACAAACCACTTTTCTTTTTTTCTACTTGTGCAACTTGTCTTTCCTC ACCTACCAAACTCACATATCACACCAACACACATGCAATGCACAATACTACATTTCAAAGTCTCTATATAAA GCTTAACCACTCTTCCTTCACATCTCAGGAAACTCATAACTCTTTCATTTTCTTTCATAATCATTTGAGTTT CCATTCTCTTGAAATTCTTGCAACCAATTCTCAACAAAGAAACATTAGTTACTTTAGTATCAATTAAAATGG AAACAGTAGCAGCAGCCATAACAAAAAACAACGGTTACGAGTCATTTTGCGTGACAAATGCTAAGAATAATA ACATGAAAGTTAACAGTGCTGATCCTTTGAATTGGGGTGTTGCCGCCGAGGCAATGAAAGGGAGTCACTTGG ATGAGGTGAAGCGTATGGTGGAGGAGTACAGGAAGCCGGTGGTCCGCCTTGGTGGCGAGACACTGACGATTT CTCAGGTGGCTGCCATTGCCGCACATGATCATGGTGTTAAGGTGGAGTTGTCAGAATCTGCTAGGGCTGGCG TTAAGGCGAGCAGTGACTGGGTGATGGAGAGTATGAACAAAGGCACAGACAGTTACGGTGTTACTACCGGTT TCGGCGCCACCTCTCACCGGAGAACCAAACAAGGTGGTGCTTTGCAGAAAGAACTCATCAGGTAATGTATAC TTTTTTTCTTTCTTAATTTGCATATAAGTATCTCCTTATAGATAAATATCATGGATTTATTATTAAAGCCAA CTATTTTAATTATTTAGCCACAAATAAAAATTCTTTGCATGTATATAAATTAAATCCATTCAATATATATAT TTCTAAAAAATTTCCTTATTGTTATGAGTACATTAAATATTTGATAATTTTTTTGTTGTTTTGGTACAGCTA TTTGAAACTTTTTTAATTAGTTAATACATATTAAAGTGTTTTTTTTTCAACGCAGTACTCAAAAATAAAAAC AAGCGGTAGGGTATTCTAACCACTACTGATAAATACCATAAAGTGCGTTTTATTTTGTGGAATGTTATGAAT TTTTCAAGTTTACTTAAAGCTTCAACTAATTATTAAGTAACATTTTTTTATGAGTAAACATTTGTTAACTTA CATTTTTTAGTTTATTCAATAAAAAAACTTTTTTTGTAGTGTATGGGTAACAAAAAATATATTTTTAAATTT TTTTTAATTACTTACTCTACTTAATTCTTGATTTCAGGTTTTTGAATGCTGGAATATTTGGAAATGGAACTG AGTCAAGCCATACACTACCACACACAGCAACAAGAGCTGCCATGCTTGTGAGAATCAACACACTTCTCCAAG GTTATTCAGGAATTAGATTTGAAATCTTGGAAGCTATAACCAAACTCATTAACAACAACGTCACCCCATGTT TACTCCGTGGTACAATCACAGCTTCCGGAGATTTAGTCCCTCTTTCTTATATTGCTGGTTTACTAACGGGAA GACCAAATTCAAAAGCTCATGGGACCTCTGGGGAAATTCTTAATGCAAAAGAAGCTTTTCAGTCAGCTGAAA TCAATGATGGTTTCTTTGAATTGCAACCAAAAGAAGGTCTTGCACTTGTTAATGGAACTGCTGTTGGTTCTG GTTTAGCTTCTATTGTTCTATTTGAAGCTAACATATTGGCTGTCTTGTCTGAAGTCCTATCCGCTATTTTTG CTGAAGTTATGCAAGGGAAACCTGAGTTTACTGATCATTTGACACATAAATTGAAGCACCATCCTGGTCAAA TTGAGGCTGCTGCTATTATGGAACACATTTTGGATGGAAGTGCTTATGTCAAAGCAGCTAAGAAGTTGCATG AGATGGATCCTTTGCAGAAACCAAAACAAGATAGATATGCACTTAGAACTTCACCGCAATGGCTTGGTCCTC TTATTGAAGTCATTAGATTCTCTACTAAGTCAATTGAGAGGGAGATCAACTCTGTTAATGATAACCCTTTGA TTGATGTTTCAAGAAACAAGGCTTTGCATGGTGGAAACTTTCAAGGAACACCTATTGGTGTATCCATGGATA ATACACGTTTGGCTCTTGCGTCAATTGGTAAACTCTTGTTTGCTCAATTCTCTGAACTCGTCAATGATTTTT ACAACAACGGGTTGCCTTCGAATCTCTCAGCTAGTAGAAATCCCAGCTTGGATTATGGATTCAAGGGATCCG AAATTGCCATGGCTTCTTATTGTTCTGAGTTACAATATCTTGCAAACCCAGTTACAACTCATGTTCAAAGTG CTGAGCAACACAACCAAGATGTGAACTCTTTGGGTTTGATATCTTCTAGGAAAACATATGAAGCCATTGAGA TCCTTCAACTCATGTCTTCCACATTCTTGATTGCACTTTGCCAAGCAGTTGACTTAAGACATTTGGAGGAGA ATTTGAAAAACTCAGTTAAGAACATTGTAAGCCAAGTTGCTAAAAGGACCCTTACAACAGGTGTGAATGGAG AACTTCATCCTTCAAGGTTTTGTGAAAAGGACTTGTTGAGAGTGGTTGATAGGGAGCATGTGTTTGCCTATA TTGATGATCCTTGTAGTGCTACATATCCATTGATGCAAAAATTGAGGCAGGTGTTAGTGGATCATGCATTAG TAAATGGTGAATCTGAGAAGAATTTGAACACATCAATCTTCCAAAAGATTGCAACATTTGAGGATGAGTTAA AGACCCTTTTGCCAAAAGAGGTAGAAAGTACTAGGGCTGCATATGAGAGTGGAAATCCAACAGTTCCAAACA AGATAAATGGATGCAGATCTTATCCACTTTATAGGTTTGTGAGACAAGAGTTGGGAACTGGTTTGCTAACAG GAGAAAAGGTCATTTCACCAGGTGAGGAGTGTGATAAGTTGTTCACAGCTATATGTCAAGGAAAGATCATCG ATCCTCTTCTTCAATGCTTGGGAGACTGGAACGGTGCTCCTCTTCCAATTTCTTAACTTTAGGTTATTTTAA GAAAAATTATTTGTATCTATATATGCATGTATTGCAATAATCACTAGGTTTGTCATGCTTTTAACAATTAAT ATGGAAATCTCCATTTCAATTTCTTTTAATGTCAATGTGAAACTTGTAATTTACTTTTATAATAGAACTTCA TTTGTTTGACATAGCTTTTAATA

【図面の簡単な説明】

【図１】エンドウフェニルアラニンアンモニアリアーゼ
遺伝子の制限酵素地図である。

【図２】プラスミドpPAL 1 (1-5)の構築図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 一瀬 勇規 岡山県岡山市津島東４−18−Ｈ２−205

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示される塩基配列を有する
   調節遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号２に示される塩基配列を有する
   エンドウのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝
   子。
3. 【請求項３】 請求項１の調節遺伝子の下流に請求項２
   のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子の構造遺
   伝子部分の全部又は一部が付加されていることを特徴と
   する調節遺伝子。