JP2001501098A

JP2001501098A - 植物におけるグロビンタンパク質の発現

Info

Publication number: JP2001501098A
Application number: JP10515914A
Authority: JP
Inventors: バイリー，ジェームズ，イー．; ブロウ，レイフ
Original assignee: バイリー，ジェームズ，イー．; ブロウ，レイフ
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 2001-01-30
Also published as: US5959187A; BR9711556A; CA2266626A1; AU730663B2; HUP9904237A2; EP0955804A1; WO1998012913A1; HUP9904237A3; AU4502297A

Abstract

(57)【要約】本発明は、酸素の同化および利用を高めるための植物の遺伝子工学的操作に関する。さらに特定すると、本発明は、例えばヘモグロビン、ミオグロビン、ヘムタンパク質などのグロビンタンパク質を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック植物を作出することに関する。本発明の遺伝子操作植物はより早く発芽し、より速く成長または成熟し、より高い収穫高をもたらし、かつ／また、より高レベルの所望の植物代謝産物（特にアルカロイド）を含有する。本発明はまた、変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。

Description

【発明の詳細な説明】植物におけるグロビンタンパク質の発現１．緒言本発明は、酸素同化および利用を高めるための植物の遺伝子操作に関する。より詳しくは、本発明は、酸素結合性タンパク質、特に、例えばヘモグロビン、ミオグロビンおよびヘムタンパク質のようなグロビンを発現するように操作されたトランスジェニック植物の産生に関する。この操作された植物を用いることによって、より迅速に発芽させ、作物をより速く成長または成熟させ、作物の収穫量をより高め、および／またはより高レベルの所望の植物代謝産物、特にアルカロイドを含む植物を得ることができる。２．発明の背景トランスジェニック法による植物の遺伝子操作は、急速に、多様で前途有望な分野になってきている。植物の発達および生理機能の研究に対して、そして有利な農業上の特性を有する植物を作製しようとする試みにおいて形質転換技術が利用されている。例えば、植物を除草剤または農薬耐性遺伝子で形質転換することによって作物の生産量を向上させることに多大な努力がなされてきた。圃場条件下で成長させた場合、得られるトランスジェニック植物は、非形質転換植物を破壊する除草剤または農薬の使用に耐えて生存することができる。また、植物自体がバチルスツリンゲンシス（Bacillus thuringensis)毒素タンパク質のような天然殺虫剤として作用することが示されている産物を発現するように遺伝子操作された（1995年 1月10日に特許された米国特許第5,380,831号を参照されたい）。また、デンプン、糖質、油などの一次代謝産物の組成を変化させた植物を作製するために遺伝子操作が試みられている。例えば、細菌レバンスクラーゼ遺伝子を植物内に形質転換することにより、得られる形質転換体におけるフルクタンのレベルが高められた。別のアプローチにおいては、油の代謝合成に関与する一定の酵素の活性を、所望の特性を示す植物油を設計するためにアンチセンス技術を用いて減少させた（Knauf，1995，Curr ．Opin．Biotech. 6:165-70に概説されている）。植物の一次代謝組成物（すなわち、炭水化物、油、アミノ酸およびタンパク質）を変化させるための試みに加えて、二次代謝組成物を変化させることも望まれている。二次代謝産物は、細胞が少量要求する特殊化された植物産物（例えばホルモン）、または高度に特殊化された生体分子（例えば、ヌクレオチド、色素、毒素、抗体およびアルカロイド）である。一般的に、二次代謝産物は、細胞の基本的な生命プロセスの維持における役割は認識されていないが、生物のために全体としてその他の有利な機能を行い得る化合物と定義することができる（例えば、Bell，1981，“The Physiological Role(s)of Secondary（Natural）Products ”in The Biochemistr of Plants, v.7，p.1，Academic Press，Inc.を参照されたい）。植物および植物細胞培養物からの有用な二次代謝産物の産生は、植物技術の重要な局面である。工業化社会において用いられる処方薬の約25％は、高等植物から抽出された成分を含む（Tyler，V.E.，1988，Planta Med ．54:95-100）。医薬品に用いられる植物性物質の最も著名なグループはアルカロイドである（Nickel l，L.G.，1980，“Products, ”Plant tissue culture as a source of biochem icals ，Staba，E.J.編，Boca Raton，CRC Press Inc.，235-269）。アルカロイドは、高等生物による植食性サイトーシス（phytophagocytosis)または病原体による侵入から植物を保護する二次代謝産物である(Robins，R.J．ら，1991，Plan ta Med ．57:27-35）。植物アルカロイドは、一般的に、アセテート単位およびテルペン単位と相互作用し、芳香族ヒドロキシル化される単純アミノ酸から誘導される（Robin，上記のとおり）。植物アルカロイドとしては、例えば、ニコチン、スコポラミン、ヒヨスチアミン、アジマリシン、セルペンチン、ピペリン、ロイセノール、ミモシン、リシニン、ペレチエリン、コカイン、ヒグリン、ルピニンおよびアナギリンが挙げられる。新規代謝経路を導入するいくつかの例または二次代謝産物の生産量を増大させるために以前に示されでいる経路を再誘導するいくつかの例が記載されている（ Bailey，上記のとおり；Berlin，Ｊ.ら，1994，Stud ．Plant Sci．4:57-81;Li lius，G.，Holmberg，N.およびBulow，L.，1996，Bio/Technology 14:177−180 ）。しかしながら、これらの遺伝子操作法はすべて、明らかに、その経路における制約酵素のアップレギュレーション（例えば形質転換およびクローニングされた遺伝子の発現による）、または競合する酵素経路のダウンレギュレーションを必要とする（Robinsら，1991，Planta ．Med．57:27-35の概説を参照されたい）。植物二次代謝産物の工業的産生には、植物細胞懸濁培養がしばしば用いられている。in vitro培養中、特に大規模培養(scale-up cultures)において二次代謝産物生成に影響を及ぼす重大なパラメーターは、溶解している酸素のレベルである。例えば、カタランツスロゼウス(Catharantus roseus)バッチ培養においては、溶解酸素濃度が高い場合、アジマリシンの産生が促進されることが示されている（Schaltmann，J.E.ら，1995，Biotech ．Bioeng. 45:435-439）。同様に、ベルベリスウィルソネ(Berberis wilsonae)においては、曝気の増大とともにアルカロイドのレベルが上昇することが観察されている（Breuling，M.ら，1985，Plant Cell Rep. 4:220-223）。これらの結果から、酸素は、特に工業用大規模プロセスに対して、植物組織培養二次代謝における、ならびに一次代謝のための制約物質であることが示唆されている。しかしながら、この酸素増大の要求は、発酵バッチプロセス中の細胞外の酸素の要求であるといつも考えられていた。発酵微生物および培養哺乳動物細胞においては、Vitreoscilla(Vitreoscilla) ヘモグロビン遺伝子（ＶＨｂ）を発現するように宿主を操作することによって好気代謝がうまく高められている（Khosla，C.，Bailey，J.E.，1988，Nature 331 :633-635;Khosla，C.，Bailey，J.E.，1988，Mol ．Gen．Genet. 214:158-161;Dc Modena，上記のとおり;Chen，W.ら，1994，Biotechnol ．Prog. 10:308-313;Pend se，G.J.およびBailey，J.E.，1994，Biotechnol ．Bioeng. 44:1367-1370）。この代謝操作戦略は、例えば、酸素制限エシエリキアコリ(Escherichia coli)による全細胞タンパク質合成の増大（Khosla，C.ら，1990，Bio/Technology 8:849 -853および1991年９月17日に特許された米国特許第5,049,493号）、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の培養におけるリシン収量および力価の向上（Sander，F.ら，1994，Proc ．6th Eur．Congress Biotechn ol. ，Alberghina，L.，Frontali，L.およびSensi，P.（編）Elsevier Sci ence B.V.，アムステルダム 607-610）、ならびにステレプトミセスコエリコロア(Streptomyces coelicolor)およびアクレモニウムクリソゲナム(Acremonium chrysogenum)における、それぞれアクチノロジン(actinorhodin)およびセファロスポリンＣ産生量の増大（Magnolo，S.K.ら，1991，Bio/Technology 9:473-476; DeModena，J.A.ら，1993，Bio/Technology 11:926-929）において有効であることが示されている。ヘモグロビンおよびグロビン様タンパク質は、哺乳動物においてはいたるところに存在し、植物においてはあまり見出されない。ハウチワマメ(lupin)および大豆レグヘモグロビンを含む、記載されている少数の植物ヘモグロビン様分子は、これらの植物の窒素固定活性と関連しているものと一般に考えられているが、何人かの研究者は、ヘモグロビン様タンパク質は全ての植物の根において発生するものであると主張している。しかしながら、これらのタンパク質が植物において過剰発現している事例はない。クロロフィルおよびヘム生合成、脂肪酸デサチュレーション(desaturation)ならびにシステイン、グリシンおよびセリン生合成などのいくつかの主要な植物代謝経路は、酸素依存性であることが知られているが、酸素は無傷の(intact)植物の代謝における制約因子であるとは考えられていない。むしろ、植物組織培養の代謝において観察されている溶解酸素の作用は、大量またはバッチ培養、発酵中の大量輸送(mass transport)問題の原因であった（Schlatmannら，1991，上記を参照されたい）。したがって、本発明がなされるまで、無傷植物において細胞内酸素の使用可能なレベルを変更することの利点は認識されていなかった。３．発明の概要本発明は、細胞内酸素レベルが増大し、または酸素利用が増大するように代謝的に操作することによって農業特性または医薬特性が改良された植物の作製に関する。そのように操作された植物は、有用な二次代謝産物、特に、酸素依存性経路によって合成される代謝産物の産生量の上昇、ならびにより迅速な発芽、高レベルのクロロフィル、総合的な成長代謝の上昇、およびバイオマスの蓄積速度の上昇を示す。本発明は、遺伝子操作された植物および該植物の産生方法を包含するものである。したがって、その実施態様の一つにおいては、本発明は、酸素の細胞内レベルの上昇または酸素の細胞内利用の上昇によって植物を代謝的に操作する方法を包含するものである。本発明は、酸素結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドで植物を形質転換することによって農業特性または医薬特性が改良された植物を産生する方法を含む。特に好ましい酸素結合性タンパク質はグロビンであり、これはヘム団(heme group)によって酸素を可逆的に結合する。典型的な実施態様においては、酸素結合性タンパク質はVitreoscillaヘモグロビンである。好ましくは、酸素結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、強力な構成的に発現された植物プロモーター、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに作動可能なように(operably)連結されている。本発明の別の局面は、本発明の方法によって遺伝子操作された植物または植物細胞である。本発明は、双子葉類および単子葉類両方の植物および植物細胞を包含する。本発明のさらに別の局面は、突然変異Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにかかる突然変異タンパク質およびポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。宿主細胞は、細菌、植物、動物、菌類、または藻類であり得る。また、本発明は、突然変異Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製する方法も包含する。この方法は、Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを低忠実度(fidelity)ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅し、増幅されたポリヌクレオチドを細菌中に形質転換し、そして突然変異Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む細菌を選択することを必要とする。この方法の好ましい局面においては、突然変異Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質を含む細菌コロニーは、その色表現型によって選択される。この方法によって単離された突然変異Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに突然変異タンパク質自体、およびかかるポリヌクレオチドを含む宿主細胞も本発明の範囲に含まれる。４．図面の簡単な説明図１：図１Ａは、二次代謝産物ニコチンおよびアナバシンのタバコ(Nicotiana tabaccum)生合成における最終工程を示すものである。ニコチンシンターゼ、すなわちニコチン酸およびN-メチル-Δ'-ピロリニウム塩のニコチンへの転化を触媒する酸素依存性酵素によって触媒される反応は太字で表示される。図１Ｂは、植物におけるクロロフィルおよびヘム生合成の酸素依存工程を示すものである。クロロフィルａからクロロフィルｂへの最終的な酸化はin vitroにおいてのみ観察された（Scheer，H.（編），1991，Chloropylls CRC Press，Boca Raton，FL ，USA 421-425）。図２：VitreoscillaＶＨｂ遺伝子を含むTi-発現ベクターのＰＣＲを用いた構築。遺伝子をＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの支配下に置き、転写終結はＮＯＳ領域によって行った。ＰＣＲプライマーのおおよその位置を実線の矢印で示す。Ｔ−ＤＮＡの右境界と左境界を、それぞれＲＢとＬＢで示す。ＮＯＳ−ｐｒｏｍ、ＮＰＴ１１およびＮＯＳは、それぞれ、ノパリンシンターゼプロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子、およびノパリンシンターゼ3' 転写終結領域の略語である。図３：種々の時間間隔での乾燥重量の測定値が平均値として示されている。バーは、標準誤差に対応するものである。最初の２つの時点（15日および20日）のデータは３個１組で計量した12の植物に対応するものであり、最後の２つの時点のデータは個々に計量した８の植物のものである。この実験は２回行い、データポイントを分散の一元分析を用いる統計分析（ＡＮＯＶＡ）にかけた。図４：トランスジェニック系、Ｈｅ３およびＨｅ４、ならびに野生型系におけるニコチンおよびアナバシン産生量。ニコチン濃度はμｇ/g（生重量）で表され、アナバシン濃度はμｇ/g（凍結乾燥植物）で表される。ニコチンおよびアナバシン濃度を、それぞれ８植物および６植物において測定した。測定はすべて２回ずつ行った。標準偏差はそれぞれ１％未満および25％未満であった。図５：μｇ（クロロフィル）／ml×mg（生重量）として測定した、２つのトランスジェニックタバコ系および野生型対照におけるクロロフィル含量。バーは18 植物の平均値を示す。平均の標準誤差は、野生型タバコ、Ｈｅ３およびＨｅ４について、それぞれ10％未満、８％未満、５％未満であった。図６：コメの形質転換に用いたｐＵＣ誘導プラスミドｐＪＦＫ２の概略地図。５．発明の詳細な説明本発明は、植物において利用可能な酸素の細胞内レベルを効率的に上昇させることによる代謝的遺伝子操作に関する。本発明は、一部は、酸素結合性タンパク質、特にヘム含有グロビンを発現するように植物を形質転換すると予想外の方法で形質転換された植物の特性が向上するという発見に基づくものである。得られた植物は、その産生量が酸素感受性である二次代謝産物を高レベルで産生する。しかしながら、驚くべきことに、これらの遺伝子操作植物はより良好な成長特性、より迅速な発芽、および植物収量の向上も示す。特定の機構に限定するものではないが、これらの驚くべき結果は細胞内酸素のレベル上昇または細胞内酸素利用の効率向上のいずれかによるものであると考えられる。したがって、操作のターゲットは酸素結合に関与するタンパク質、特にグロビンのような酸素を可逆的に結合するタンパク質をコードする遺伝子である。ターゲット遺伝子としては、限定するものではないが、Vitreoscillaヘモグロビン（ＶＨｂ）、ウマ心臓ミオグロビン、E.coliヘムタンパク質、B.サブチリスヘムタンパク質、酵母フラボヘモグロビン、大豆レグヘモグロビン、ハウチワマメレグヘモグロビンおよびマッコウクジラミオグロビンをコードするものが挙げられる。実際、操作による内因性植物ヘモグロビンの発現の上昇も本発明の範囲に含まれるものである。本発明の使用に特に適しているのは、ＶＨｂなどの比較的高いｋ_off速度を有する酸素結合性タンパク質(ｋ_off5600s^-1；OriiおよびWebster，1986，J ．Biol ．Chem. 261:3544-3547)、またはウマ心臓ミオグロビンのような比較的低い酸素親和性を有する酸素結合性タンパク質（Ｋ_p 0.79μＭ；Wittenbergら，1985，in Nitrogen fixation reserch roress，H.J.Evandら編，Martinus Nijhoff Publi shers，Dordrecht，p.354）である。したがって、特に好ましい酸素結合性タンパク質は酸素に対するｋ_off速度が10s^-1以上のタンパク質か、Ｋ_pが0.5μＭ未満のタンパク質であり得るが、これらのパラメーター以外の速度定数を有する酸素結合性タンパク質も有用であることは理解されるであろう。好ましい酸素結合性タンパク質のその他の例としては、ヘモグロビン、ミオグロビンおよびレグヘモグロビンのようなグロビンが挙げられる。グロビンを含む多くの酸素結合性タンパク質の特性は、文献に開示されている。さらに、グロビンなどのタンパク質の酸素結合特性を測定するための技術は、当業者には周知であり、過度の実験をすることなく行い得る。本明細書において実施例によって記載されているように、本発明の使用に特に都合のよい酸素結合性タンパク質はVitreoscillaヘモグロビン（「ＶＨｂ」）である。ＶＨｂ遺伝子の完全な配列は上記の米国特許第5,049,493号に記載されている。また、酸素を結合するＶＨｂの突然変異体も本発明の範囲に含まれる。下記の実施例により完全に記載されているように、ＶＨｂの機能的突然変異体をコードする遺伝子はＰＣＲ突然変異誘発によって作製され、次いで簡単な表現型スクリーニングにおいてそれらの酸素結合能について試験される。これらの技術を用いることによって、本発明で使用するためのいくつかのＶＨｂ突然変異体が得られた。また、ＶＨｂ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体に高度にストリンジエントな条件（例えば、0.5ＭのNaHPO₄、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mM のＥＤＴＡ中、65℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび0.1×ＳＳＣ／0.1％ＳＤＳ中、68℃での洗浄（Ausubel F.M.ら編，1989，Curr ent Protocols in Molecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates， Inc.，およびJohn Wiley & sons，Inc.，ニューヨーク，p.2.10.3））下でハイブリダイズし、機能的に均等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列；ならびにＶＨｂ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体に中度にストリンジェントな条件などのより低度にストリンジェントな条件（例えば、0.2×ＳＳＣ／0.1％ＳＤＳ中、42℃での洗浄（Ausubelら，1989，上記のとおり））下でハイブリダイズし、さらに機能的に均等なＶＨｂ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれる。ＶＨｂの機能的均等物としては、その他の種に存在する天然ヘモグロビン遺伝子、およびＶＨｂの機能的活性（すなわち可逆的酸素結合）の少なくともいくらかを維持する天然または操作された突然変異ＶＨｂが挙げられる。ＶＨｂの機能的均等物をコードする遺伝子を含む種としては、限定するものではないが、細菌種、特に土壌、糞、およびその他の酸素接触可能であるが通気が不十分な環境において見出される細菌種が挙げられる。さらに、本発明の教示を用いることにより、当業者は、公知のタンパク質と相同な配列に依拠せずに、ヘム団によって可逆的に酸素を結合するその他の細菌タンパク質をコードする遺伝子を単離することもできる。例えば、当業者は、細菌生物を単離して培養し、培養細菌からゲノムＤＮＡを調製し、次いで周知の技術を用いてE.coliのＤＮＡにより発現ライブラリーを構築し得る。発現ライブラリーを平板培養して単離コロニーを取得する。その酸素結合ヘムタンパク質を発現するプラスミドを有するE.coliコロニーは、その赤色の表現型によって同定され得る。酸素結合性タンパク質をコードする発現ライブラリーＤＮＡクローンはさらに特性付けされ、植物発現ベクターにサブクローニングし得る。したがって、植物におけるそのような酸素結合性ヘムタンパク質の発現は、本発明に含まれるものである。また、本発明は、ＶＨｂタンパク質、ＶＨｂ突然変異体、およびＶＨｂ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＶＨｂの機能的均等物のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の縮重変異体も包含する。例えば、ヌクレオチド配列は、アミノ酸コドン使用法を選択された宿主細胞における発現に対して最適化するように変更され得る。酸素結合性タンパク質のレベルは変化させることができ、またはそれらの発現を高めたり、さもなければ変更することによって（例えば、異所性発現または組織特異的発現）所望の特性を有する植物を操作することができる。この操作は本明細書に記載された核酸構築物で植物を形質転換することによって行われる。形質転換植物またはそれらの後代を、所望のタンパク質を発現するか、酸素結合性タンパク質の発現の所望の変更、対応するｍＲＮＡの発現の変更、二次代謝産物レベルの変更、成長速度上昇、植物収量増大および／または発芽速度増大を示す植物についてスクリーニングする。所望の生理学的および／または農業的変化を示す操作植物は、植物育種に、または農業生産において直接用いることができる。また、一つの変更タンパク質を有するこれらの植物は、その他の経路における変化により操作されたその他の変化植物と交配させて（例えば、酸素結合発現植物と、別の方法で遺伝子操作された植物との交配）、さらにその交配母本と比較して生理学的および／または農業特性が増大した系統を産生させてもよい。本発明は、Vitreoscillaヘモグロビン（ＶＨｂ）の発現に対して操作された植物についての実施例によって説明される。全ての場合において、発現を示す操作された植物は、対照の野生型植物と比べてより良好な成長特性、種子発芽の速度上昇、植物収量の向上および／または二次代謝産物のレベル上昇も示す。本発明は、一部は、酸素結合性タンパク質を有する植物の形質転換がいくつかの利点をもたらすという驚くべき発見に基づくものである。乾燥耐性が増大した植物を開発しようという試みにおいて、酸素結合性タンパク質をコードする発現プラスミドで植物が形質転換された。酸素結合性タンパク質Vitreoscillaヘモグロビン（ＶＨｂ）をコードする発現構築物で形質転換するのに、モデル系として、まずタバコ(Nicotiana tabaccum，tobacco)が選択された。しかしながら、ニコチン生合成経路には酸素依存工程が存在するので、ニコチンの産生量が調べられた。ＶＨｂ遺伝子を、アグロバクテリウム(Agrobacterium)介在遺伝子導入によってタバコ(Nicotiana tabaccum，tobacco)に導入した。ＶＨｂ遺伝子およびメッセージの転写および翻訳は、それぞれ、逆転写酵素ＰＣＲおよびウェスタン免疫ブロット分析によって示された。ＶＨｂを発現するトランスジェニックタバコ植物は、ニコチン含量が野生型対照よりも平均34％高かった。また、それらは、より少量の所望のアルカロイドであるアナバシンに対して分布が変更されたニコチンを含んでいた。トランスジェニックタバコ植物の生理機能におけるＶＨｂ発現の追加的な効果も示された；これらの植物は、対照よりもクロロフィルを平均10 〜20％多く含んでいた。さらに、植物はより迅速に発芽し、より急速な乾燥重量増大を示した。したがって、追加の酸素結合性タンパク質を発現するように植物を操作することは、アルカロイドレベルの上昇およびアルカロイド分布の変更をもたらすだけでなく、植物の成長も増大させた。本発明の利点についてのさらに別の例においては、チョウセンアサガオ(Datur a)属由来の植物を、タバコ植物の形質転換に用いたものと同じ発現構築物で形質転換した。チョウセンアサガオ属は、二次代謝産物であるスコポラミンおよびヒヨスチアミンの産生のための主要な市販の供給源であり、スコポラミンおよびヒヨスチアミンは、鎮静剤およびこれらの二次代謝産物の半合成誘導体用の原料として使用されている。驚くべきことに、トランスジェニック植物におけるスコポラミンおよびヒヨスチアミンのレベルは、非形質転換植物において観察されたレベルの５〜６倍に増大していた。本発明のさらに別の例においては、イネ(Oryzae)属由来の植物を、衝撃法(bal listic method)によってＶＨｂヘモグロビン遺伝子の発現を誘導するポリヌクレオチド構築物で形質転換した。したがって、本発明は、一般的に、全ての植物型において酸素利用を変更して有利な医薬品質および農業品質を有する植物変種を得るのに応用可能である。例えば、より迅速に発芽し、より急速にバイオマスを蓄積する植物は、耕作に適した土地および／または成長の季節の長さが産生量の制約因子である農業環境において特定の用途が見出されるであろう。バイオマス生産量および／または成長速度の上昇が小さい場合でさえ、有意であることが証明されるであろう。さらに、経済的に重要な二次代謝産物のレベルを上昇させることにより、以前は経済的に実行不可能であった植物源からの代謝産物の産生を可能にし得る。さらに、本発明は、突然変異Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製する方法を包含する。この方法は、Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを低忠実度ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅し、増幅されたポリヌクレオチドを細菌に形質転換し、突然変異Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む細菌を選択することを必要とする。この方法の好ましい局面においては、突然変異Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質を含む細菌コロニーは、それらの色表現型によって選択され、赤色またはピンク色は、細菌が酸素結合性ヘムタンパク質を発現していることを示すものである。この方法によって単離された突然変異 Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに突然変異タンパク質自体、およびかかるポリヌクレオチドを含む宿主細胞は本発明の範囲に含まれるものである。宿主細胞は、細菌、植物、動物、菌類または藻類であり得る。かかる突然変異Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質は、限定するものではないが、細胞成長の増大および細胞産生量の増大などの野生型Vitreo scillaヘモグロビンタンパク質が都合がよい多くの用途において有用である。５．１．トランスジェニック植物の産生本発明によれば、本明細書に記載したように、酸素結合性タンパク質、特にグロビン、一つの実施態様においてはＶＨｂをコードする核酸で植物細胞を形質転換することによって所望の植物または植物細胞が得られ得る。いくつかの場合においては、いくつかの異なる遺伝子構築物で植物を操作することが望ましくあり得る。そのような操作は、所望の遺伝子構築物の全てで植物または植物細胞を同時に形質転換することによって行われ得る。また、その操作は、連続的に行ってもよい。すなわち、一つの遺伝子構築物で形質転換することによって選択およびスクリーニング後に所望の形質転換体を得て、その形質転換体を第２の遺伝子構築物で形質転換する、など。本発明の一つの実施態様においては、アグロバクテリウムを用いることによって遺伝子構築物が植物に導入される。そのような形質転換には、好ましくは、バイナリーアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡベクター（Bevan，1984，Nuc ．Acid Res .12 :8711-8721）および共同培養法（Horschら，1985，Science 227:1229-1231）を用いる。一般的に、アグロバクテリウム形質転換系は双子葉類植物を操作するのに用いられる（Bevanら，1982，Ann ．Rev．Genet. 16:357-384;Rogersら，198 6，Methods Enzmol. 118:627-641）。また、アグロバクテリウム形質転換系は、単子葉類植物および植物細胞を形質転換し、ＤＮＡを導入することにも使用され得る（Hernalsteenら，1984，EMBO J ．3:3039-3041;Hooykass-Van Slogterenら，1984，Nature 311:763-764;Grimsleyら，1987，Nature 325:1677-179;Boulton ら，1989，Plant Mol ．Biol．12:31-40;Gouldら，1991，Plant Physiol ．95:426 -434を参照されたい）。その他の実施態様においては、組換え核酸構築物を植物および植物細胞に導入するための種々の代替の方法も利用され得る。これらのその他の方法は、特に、ターゲットが単子葉類植物である場合に有用である。代替の遺伝子導入および形質転換法としては、限定するものではないが、裸のＤＮＡのカルシウム−、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−またはエレクトロポレーション−介在取込みによるプロトプラスト形質転換（Paszkowskiら，1984，EMBO J ．3:2717-2722;Potr ykusら，1985，Mol ．Gen．Genet．199:169-177;Frommら，1985，Proc ．Natl.Aca d．Sci．USA 82 :5824-5828;Shimamoto，1989，Nature 338:274-276を参照されたい）および植物組織のエレクトロポレーション(D'Halluinら，1992，Plant Cell 4 :1495-1505）が挙げられる。植物細胞形質転換のためのさらなる方法としては、マイクロインジェクション、シリコンカルバジド介在ＤＮＡ取込み（Kaeppler ら，1990，Plant Cell Reorter 9:415-418）およびマイクロプロジェクター衝撃法(microprojectile bombardment）(Kleinら，1988，Proc ．Natl．Acad.Sci．US A 85 :4305-4309;Gordon-Kammら，1990，Plant Cell 2:603-618を参照されたい）が挙げられる。本発明によれば、広範な種類の植物が、酸素結合性タンパク質をコードする核酸構築物および上記の種々の形質転換法を用いることにより、本明細書に記載された所望の生理学的および農業特性のために操作され得る。操作のターゲット植物としては、限定するものではないが、タバコ、チョウセンアサガオ属、メイズ、小麦、コメ、大豆、トマト、ニンジン、落花生、ジャガイモ、テンサイ、ヒマワリ、ヤマノイモ、シロイヌナズナ、菜種、ペチュニアおよびその他の鑑賞用花、芝草(tulfgrass)、大麦、アルファルファ、ジャガイモ、カッサバ、サツマイモ、レタス、サトウキビ、果樹（例えば、サクランボ、リンゴ、モモ、西洋ナシ、プラム、オレンジ、レモン）、堅果をつける木（例えば、クルミノキ、アーモンド）、バナナ、落花生、イチゴ、カリフラワー、アーティチョーク、キュウリ、メロン、ブドウ、コショウ、キャベツ、エンダイブ、ニラネギ、レタス、ホウレンソウ、クズウコン、ラディッシュ、マメ、およびエンドウが挙げられる。本発明によれば、所望の植物は、限定するものではないが、プロトプラスト、組織培養細胞、組織および器官外植体、花粉、胚ならびに全植物などの種々の植物細胞型に本明細書に記載された遺伝子構築物を導入することによって得られ得る。本発明の一つの実施態様においては、操作された植物材料は、下記のアプローチおよび方法の後に形質転換体（すなわち、導入遺伝子構築物が挿入または組み込まれたもの）について選択またはスクリーニングされる。次いで、単離された形質転換体は、植物に再生され得る。また、操作された植物材料を植物または苗木(plantlet)に再生し、その後、その誘導された植物または苗木をマーカー遺伝子トレイト(traits)についての選択またはスクリーニングにかけることもできる。マーカー遺伝子についての選択またはスクリーニングの前後いずれかに植物細胞、組織または器官から植物を再生する手順は、当業者には周知である。形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされるトレイトについて操作された植物材料を選択またはスクリーニングすることにより同定され、単離され得る。例えば、選択は、形質転換マーカー遺伝子構築物が耐性を与える抗生物質または除草剤を阻害量含む培地上で操作された植物材料を成長させることによって行われ得る。さらに、形質転換された植物および植物細胞は、本発明の組換え核酸構築物上に存在し得る肉眼で見えるマーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはCl遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによっても同定され得る。そのような選択およびスクリーニング方法論は、当業者には周知である。物理学的および生化学的方法を用いることによって本発明の遺伝子構築物を含む植物または植物細胞形質転換体を同定することもできる。これらの方法としては、限定するものではないが、１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出し、決定するためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出し、調べるためのノーザンブロット、Ｓ−１ＲＮアーゼ保護、プライマー−伸長または逆転写酵素−ＰＣＲ増幅；３）そのような遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされる場合、酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ；４）遺伝子構築産物がタンパク質である場合、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット法、免疫沈降、または酵素結合イムノアッセイ；５）導入された遺伝子構築物の発現の結果として生じる化合物の生化学的測定が挙げられる。 in situハイブリダイゼーション、酵素染色、免疫染色などのさらなる技術を用いることによって特定の植物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出することもできる。これら全てのアッセイを行うための方法は当業者には周知である。５．１．１．酸素結合性タンパク質を発現するように形質転換された植物本発明によれば、組換え酸素結合性タンパク質遺伝子を発現する植物は、植物細胞を、酸素結合性タンパク質をコードする配列と作動可能なように結合した植物プロモーターを含む遺伝子構築物で形質転換することによって誘導され得る。（作動可能なように結合したとは、本明細書で用いられる場合、その「結合した」プロモーターによって制御される転写により機能的メッセンジャーＲＮＡ（その翻訳により酵素が産生される）が産生されることを意昧するものである。）植物プロモーターは構成性または誘導性であり得る。有用な構成性プロモーターとしては、限定するものではないが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｔ−ＤＮＡマンノピンシンターゼプロモーターおよびそれらの種々の誘導体が挙げられる。有用な誘導性プロモーターとしては、限定するものではないがいくつか挙げるとすると、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子、クロロフェイルa/b結合性タンパク質（ＣＡＢ）遺伝子、心臓ショック遺伝子、防御応答遺伝子（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、創傷誘導遺伝子（例えば、ヒドロキシプロリン富化細胞壁タンパク質遺伝子）、化学誘導遺伝子（例えば、硝酸塩レダクダーゼ遺伝子、グルコナーゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子、PR-1遺伝子等）、暗誘導遺伝子（例えば、アスパラギンシンセターゼ遺伝子（CoruzziおよびTsai，米国特許第5,256,558号，1993年10月26日，Gene E ncoding Plant Asparagine Synthetase））が挙げられる。本発明のさらに別の実施態様においては、植物を、修飾または人工プロモーターを酸素結合性タンパク質をコードする配列に作動可能なように連結した遺伝子構築物で形質転換することが都合よくあり得る。典型的には、種々のプロモーターの構造エレメントを組換えることによって構築されたかかるプロモーターは、天然のプロモーターでは見られない独特の発現パターンおよび／またはレベルを有する。シス調節エレメントとプロモーターコア(promoter core)との組み合わせから構築された人工プロモーターの例については、例えば、Salinaら，1992，Plant Cell 4 :1485-1493を参照されたい。本発明の好ましい実施態様においては、結合プロモーターは、酸素結合性タンパク質がトランスジェニック植物中で過剰発現するような強力なおよび／または胚特異的植物プロモーターである。さらに、特定のプロモーターを用いることにより酸素結合性タンパク質の組織特異的発現を誘導し得る。例えば、酸素結合性タンパク質の根特異的発現が誘導され得る。さらに、酸素結合性タンパク質の組換え発現は、特異的細胞区画に誘導され得る。当業者は、細胞内の、いくつか例を挙げるとするとクロロプラストまたはミトコンドリアに、酸素結合性タンパク質の発現を誘導し得る。本発明のさらに別の好ましい実施態様においては、植物における酸素結合性タンパク質の過剰発現は、酸素結合性タンパク質遺伝子のコピー数を増大させることによって誘導され得る。そのようなトランスジェニック植物を産生するための一つのアプローチは、酸素結合性タンパク質遺伝子の発現を誘導する（すなわち、植物プロモーターに作動可能なように連結されている）植物発現構築物の多数のコピーを含む核酸構築物で形質転換することである。別のアプローチは、植物発現構築物の１以上のコピーを含む植物系を代々繰り返し形質転換することである。さらに別のアプローチは、グルタミンシンセターゼまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のような増幅選択性マーカー（ＡＳＭ）遺伝子を含む核酸構築物中に酸素結合性タンパク質発現構築物を入れることである。そのような構築物で形質転換された細胞は、酸素結合性タンパク質遺伝子のコピーが増大した細胞系を選択する培養養生法に曝される。ＧＳ遺伝子の増幅コピーを含む植物細胞系の単離に使用される選択プロトコルについては、Donnら，1984，J ．Mol．Appl．Ge net.2 :549-562を参照されたい。所望の遺伝子はＡＳＭにしっかりと連結されるので、ＡＳＭ遺伝子が増幅した細胞系は、所望の酸素結合性タンパク質遺伝子も増幅されているものと思われる。次いで、酸素結合性タンパク質遺伝子のコピーが増幅された細胞系はトランスジェニック植物に再生され得る。 5.1.2．形質転換された植物からの所望の改変特徴をもつ植物のスクリーニング所望の遺伝子操作特性を有するトランスジェニック植物を得るためには、そのような特徴をもつ形質転換された植物（すなわち、本発明の遺伝子構築物を有する植物）のスクリーニングが必要であることは当業者に認識されているところである。例えば、植物が酸素結合性タンパク質遺伝子の過剰発現について遺伝子操作されている場合、所望の濃度でおよび所望の組織・成長段階において、形質転換された植物について酸素結合性タンパク質遺伝子を発現する植物を調べる。この後つづいて所望の生理学的変更、例えば、酸素結合性タンパク質の発現を示す植物から、植物レベルでの望ましい表現型の変更（例えば、クロロフィル、ヘム、アミノ酸またはアルカロイド生合成の増加、脂肪酸脱飽和の増加、あるいは、その生合成に酸素を要するグリシン・ベタインの如きオキシモプロテクタント（ oxmoprotectants）濃度の増加）をもつ植物をスクリーニングすることができる。同じ原則は、組織特異的プロモータで駆動する発現構築物を用いることによって、ヘテロ遺伝子の組織特異的発現を有するトランスジェニック植物を得るのに適用される。あるいは、上記形質転換された植物について、望ましい構造上の変化を示す植物を直接スクリーニングしてもよい。一実施態様においては、そのようなスクリーニングは、形質転換された植物の色についてであってもよい。また他の実施態様において、形質転換された植物のスクリーニングは、様々な成長条件（例えば、異なる量の栄養素、水分含量および/または塩濃度を含有する土壌あるいは培地）の下で栽培されたとき、遺伝子操作されていない原種植物に比べて改善された耕種学上の性質（例えば、速い成育速度、高い生長または生殖率、タンパク質含量の向上）のものについて行ってもよい。本発明によれば、酸素結合性タンパク質発現構築物、特にVitreoscillaヘモグロビンで遺伝子操作された植物は、活発な成長特性の向上、クロロフィル濃度の増加、そして二次的植物代謝産物、特にアルカロイド類の濃度増加を示すことができる。このような改善された耕種学的性質をもつ遺伝子操作植物および植物株は、以下のパラメータのうちそのいずれかを調べることによって同定することができる。すなわち、1）新鮮または乾燥重量の増加量で測定した成長速度、あるいは背丈の増加率、2）新鮮または乾燥重量による成熟植物の生長速度、3）発芽率、4 ）クロロフィル量値、5）ニコチン、スコポラミン、ヒヨスチアミンのような、二次代謝産物の濃度、および6）植物の色である。これらのパラメータを調べる手順・方法は当業者には周知である。本発明において望ましい植物とは、上記パラメータの１以上において対照植物（すなわち、原種植物）に比べて改良されている植物である。一実施態様において、望ましい植物とは、対照植物と比べた場合、少なくとも一つのパラメータにおいて少なくとも5％の増加を示す植物である。好ましい一実施態様において、望ましい植物とは、対照植物と比べた場合、少なくとも一つのパラメータにおいて少なくとも20％の増加を示す植物である。最も好ましいのは、少なくとも一つのパラメータにおいて少なくとも50％の増加を示す植物である。６．実施例：タバコにおけるVitreoscillaヘモグロビンの発現広く研究されている植物アルカロイドはタバコ（Nicotiana tabaccum）に存在する主なアルカロイド、ニコチンである。タバコアルカロイド類の生合成経路は受け入れられるようになってはきたが、この経路制御は今なお完全に理解されておらず、またその酵素もすべて特徴付けられている訳ではない（Bush，L.P.，19 81，Recent Adv ．Tob．Sci. 7:75-106）。しかしながら、ニコチン生合成における最終的な酵素、ニコチンシンターゼ（この酵素はニコチン酸とＮ-メチル-Δ’ -ピロリニウムクロリドから(s)-ニコチンの生成を触媒する）は、酸素依存性であることが分かってきた（図１）（Friesen，J.B.およびLeete，E.，1990，Tetr ahedron Lett. 31:6295-6298）。そしてこの、ニコチン酸とN-メチル-Δ'-ピロリニウムクロリドからアナバシンへの競合経路は、これまで知られているところでは酸素による刺激を受けない経路である。従って、植物に酸素結合性タンパク質を与えることにより酸素利用性増強効果を調べる最初の実験として、このシステムが選択された。本実施例では、アグロバクテリウム（Agrobacterium）が媒介する遺伝子導入により、タバコをＶＨｂ発現ベクターで形質転換した。次いで（i ）ＶＨｂ遺伝子が正しくタバコに転写・翻訳されたかどうか、（ii）ＶＨｂ発現に対するニコチンとアナバシンの蓄積の反応、および、ＶＨｂ発現トランスジェニック植物に見られる他の特徴に基づいて、（iii）ＶＨｂを含む植物のクロロフィル含量と成長率を測定するアッセイを行った。 6.1．実験方法組換えＤＮＡ技法および細菌株 Sambrook，J．et al.，1990，Molecular cloning ，A laboratory manual，Col d Sptring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法に従ってプラスミド法を行った。そして標準プロトコル（上記Saiki参照）を用い、ＰＣＲを実施した。一般的技法（上記Sambrook，J.）を用い、大腸菌株TGI(F' traD361ac19Δ[lacZ]M15proA+B+/supE[hsdM-mcrB]5[r_k.m_k.McrB-]thi[lac-proAB ][lac-pro])を培養して形質転換した。メーカー推奨（GIBCO BRL，Labdesign）に従って制限酵素を使用した。Agrobacterium tumefaciens株LBA 4404（Walden ，R．et al.，1990，MMCB 1:175-194）をLB培地（トリプトン 10g/l、酵母エキス５g/l、NaCl 10g/l）で培養し、接合性プラスミドpRK 2013（Figurski，D.H. およびHelinski，D.R.，1979，Proc ．Natl．Acad．sci．U.S.A. 76:1648-1652）を有する大腸菌ＨＢ 101で形質転換した。Edwards，K．et al.，1991，Nucleic Acids Res. 19:1349に記載の通り、ＰＣＲ分析用ゲノムタバコＤＮＡの抽出を行った。ＤＮＡ-構築ＰＣＲを用いてプラスミドpINT1（Khosla，C.およびBailey J.E.，1989，J ．M ol．Biol. 210:79-90)からのＶＨｂ遺伝子を増幅した。5'プライマーＨ1（配列5 '-GCA AAC AGG ATC CCG CGT CTA GAG G3'をもつ）は複数の制限酵素部位を含む転写開始コドンの上流域に相補的であり、3'プライマーＨ2（配列5'-GCA GAT TT G TAC GCT CAA GCG GTT GAA TGA GCT CCC AAA G-3'をもつ）は停止コドン上流のＶＨｂ遺伝子のコード領域に相補的であった。プライマーはLund大学のBiomolecular Unitで合成された。停止コドンもＰＣＲによる突然変異誘発を用いて、TAAからTGA（タバコでよく使われる停止コドン）へ変更した。増幅されたＰＣＲフラグメントをpUC19に挿入し、次いでこれを大腸菌に形質転換した。ＶＨｂ遺伝子を発現する細菌はペレット化すると赤色味を帯びる。最もよく発現する大腸菌クローンの一つであるpUH4を選んで以下の実験に使用した。ＶＨｂ遺伝子のクローン化されたＰＣＲフラグメントが機能性タンパク質を発現することを確認するため、差スペクトル分析を使用した（Webster，D．A.およびLiu，C.Y.，1974，J ．Biol．Chem. 249:4257-4260）。pUH4を有する組換え大腸菌のCOスペクトル分析により、419nmで顕著なピークが認められ、これはＶＨｂ活性に特徴的である（上記Lilius）。ＶＨｂ遺伝子フラグメントをXbaIおよびSacIで切断しプラスミドpBin121:2（Jefferson，R.A.，1987，Plant Mol.Biol .Rep. 5:387-405）に連結するとpBH4（図2）が得られる。植物材料 Nicotiana tabaccum SR.植物を25℃で16時間照射し、土壌中か、あるいは無菌ジャーのMS培地に保った(Murashige，T.およびSkoog，F.，1962，Physiol ．Plan t 15:473-497）。Rogers，S.G.およびFraley，R.T.，1986，Methods enzymol. 1 18 :627-684に記載の通り、タバコ植物をアグロバクテリウム媒介性遺伝子導入によって形質転換した。すべての植物実験において、F₁世代の安定なヘテロ核形質転換体を使用した。RT-PCR を用いる転写分析 Parmacia社のQuick Prep^TMマニュアルにある通り、オリゴ（dT）-セルロースを用いて100mgの葉部からポリアデニル化ｍＲＮＡを単離した。rTth DNAポリメラーゼとPerkin Elmerの指示によるプライマーにより、ＶＨｂ遺伝子転写産物を増幅した。ウェスタン・イムノブロット分析二個のトランスジェニックタバコ株と一野生型コントロールのタンパク質抽出物を以下の方法により調製した。葉茎材料1グラムをリン酸ナトリウム0.1Ｍ、DT T５ｍＭ、およびｐＨ7.5のＥＤＴＡ緩衝液5ｍＭにホモジネートした。得られたホモジネートを1.5ｍＬの試験管中12,000rpmで15分間遠心分離した。タンパク質含有上清をデカンテーションして以後の実験に使用した。タンパク質を1.5％ SD S-PAGEゲルで分離し、ミリポア社（Millipore）のイモビロンＰ（Immobilon P）ナイロン膜にブロッティングした。電気泳動およびブロッティングは、それぞれ Laemmli（Laemmli，U.K.，1970，Nature 277:680-685）および上記Sambrookの記載に従って行った。ウサギ由来のＶＨｂ抗血清でＶＨｂモノマーを検出し、パーオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギイムノグロブリン（Dako）によって可視化した。アルカロイド分析ニコチンおよびアナバシン濃度について、トランスジェニックタバコおよび野生型植物を分析した。まず植物をMS培地で30日間成長させた後収穫し、ｐＨ9.0 の0.1Ｍ Tris-HCl緩衝液約40ｍＬにホモジネートして遠心分離後-70℃で保存した。ニコチンおよびアナバシンの濃度は、Curvall et al.，1982，J ．Chorom. 2 3 2:283-293に記載の毛細管カラムガスクロマトグラフィを使って測定した。クロロフィル分析 3週齢の実生から得た葉材料を1.5ｍｌ管中でホモジネートし、そのクロロフィルを氷冷80％アセトンで抽出した。砕片を除去して上清を回収した。クロロフィル抽出物の吸光度を645ｎｍおよび633ｎｍでモニターした。吸光度は各抽出に用いられた植物の量に対して正常化された。Amon，D.I.，1949，Plant Physiol ．2 4 :1-15に記載に従って、クロロフィルＡおよびＢの量を算定した。 6.2．結果トランスジエニックタバコの製造植物のＶＨｂ遺伝子発現用にベクターを構築した（図2）。複数のタバコ形質転換体からゲノムＤＮＡを精製してＰＣＲによって分析し、ＶＨｂ遺伝子がそのゲノムに挿入されたかどうかを調べた。分析した植物の約90％が陽性であった。二個のＰＣＲ陽性トランスジェニック植物株であるHe3とHe4および野生型コントロール株の植物葉から、ポリA＋mRNAを単離した。二個のポリヌクレオチドプライマーH 1およびＨ2（実験プロトコール参照）を逆転写酵素ＰＣＲ反応に使用してＶＨｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を増幅および検出した。トランスジエニックタバコ株は両方とも全長ＶＨｂｍＲＮＡ転写産物を示し、これらは460塩基対の理論サイズとよく一致した。タバコのＶＨｂタンパク質発現は、葉および茎のタンパク質抽出物のウェスタンブロット分析により簡単に検出することができた。ＶＨｂ抗血清と交差反応する15.7kDaタンパク質は、両方のトランスジェニックタバコ株には存在したが、野生型コントロールには存在していなかった。pBi121:2の35S CamV VHbプロモーターを用いるＶＨｂの発現レベルは総タンパク質の約0.1％であった。しかしながら、タバコ中に幾つかのチトクローム類が存在するため、ＶＨｂ活性のCO結合アッセイは使用できなかった（Saiki，et al.，1988，Science 239:487-491）。トランスジェニックタバコにおける全体的な成長の向上 F1世代と野生型コントロールから得られた、二個のトランスジェニック株He3 およびHe4のトランスジェニックタバコの種子を土壌中で発芽させ、定期的に植物を採集して肉眼でその発育を調べた。特にトランスジェニック株He4におけるＶＨｂ発現構築物で形質転換した植物の発芽は、形質転換していない植物の発芽に比べて、顕著に加速された。分析によって、発芽時期は野生型タバコが6-8日であるのに対し、形質転換された植物のそれは約3-4日であることが分かった。さらに、トランスジェニック植物では、成長率、最終収穫量ともにより高かった（図3）。例えば、乾燥重量は、35日成長後80〜100％増えた。さらに、トランスジェニック植物の発芽から開花までの期間は野生型に比べて3-5日短縮された。ＶＨｂ発現トランスジェニックタバコのアルカロイド分析 2つのＶＨｂ発現トランスジェニックタバコ植物株He3とHe4および野生型コントロールの抽出物のニコチンおよびアナバシン含量について、ガスクロマトグラフィによる分析を行った（図4）。野生型に比べ、トランスジェニック植物（He3 ）は108μｇ/g乾燥重量に相当する平均34％高いニコチン率を保っていた。同時に、アナバシン濃度はＶＨｂ発現トランスジェニック植物では実質的に減少した。収穫量が最も高いトランスジェニックタバコ植物は乾燥重量130μｇ/gのニコチンを有し、これは文献記載のタバコ中最も高いニコチン含量（140μｇ/g乾燥重量）とほぼ同じである(Sheen，S.J.，1988，J ．Food Sci. 53:1572-1573)。ＶＨｂ発現トランスジェニックタバコのクロロフィル含量ＶＨｂ発現タバコトランスジーンの目視観察から、これら植物の多くが野生型コントロール植物よりも濃い緑色に見えることが分かった。図1Bに示すように、クロロフィルおよびヘムの生合成における幾つかのステップは酸素依存性である。従って、クロロフィルおよび成長速度のアッセイは、野生型タバコおよびＶＨｂ発現クローン（He3およびHe4）から得られた幾つかのF1世代植物で行った。クロロフィル含量のアッセイにより、特にHe4植物において少量ではあるがクロロフィル量の重大な増加が見られた（図5）。また、背丈を測定しても、これらの植物は野生型より約20-40％早い成長を示した。酸素を減らした雰囲気でこれらの植物を成長させた場合には、トランスジェニック植物と野生型植物における成長速度の差は観察されなかった。 6.3．考察タバコ植物におけるＶＨｂ発現を遺伝子操作することはニコチン（およびアナバシン）産生に影響を与えたが、ＶＨｂ発現のより全体的な影響の徴候は、若いトランスジェニック植物が野生型植物よりも深い緑色昧を示すという観察で始まった。引き続きクロロフィル濃度を測定すると、He3植物では10-20％増のレベルを示し、これは植物の背丈による成長率でみると20-40％の増加に相当する。タバコのＶＨｂクローニングは、He3およびHe4に対してはやや異なる影響を及ぼした。ニコチンおよびクロロフィル濃度の増加はそれぞれHe3およびHe4植物と関連していた。クローン間のそのような差異は、組み込みベクターを用いる場合には一般的である。ＶＨｂ発現トランスジェニックタバコ植物におけるニコチンおよびアナバシン産生のこの劇的なシフトを説明する一つの仮説は、ＶＨｂの存在が酸素の有効性を増やし、これによりそのタバコ植物全体における二次代謝産物の産生の分布に影響を与えるというものである。あるいは、ＶＨｂ発現トランスジーンにおける二次代謝産物の産生のこういったシフトは、ATP合成速度および/または膜エネルギーの増加のような、ＶＨｂの他の代謝作用に起因することもある。細胞においてエネルギーの利用性が増せば、ニコチン産生の増加を含む多くの代謝機能の向上につながるであろう。 7. 実施例：チョウセンアサガオにおけるVitreoscillaヘモグロビンの発現ヒヨスチアミンとスコポラミンは植物によって産生されるトロパン・アルカロイドである。ヒヨスチアミンはラセミ体アトロピンの左旋性成分である。アトロピン、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンは副交感神経系に作用して、広範な薬理活性を示す。これらは医療分野でパーキンソン症候群の緩和、散瞳、心拍数増加、毒物中和および汗のような分泌物の抑制に使われる。スコポラミンはその望ましくない副作用がヒヨスチアミンよりも少なく、運動障害の治療および胃腸疾患の誘導体薬(derivative drug)生成用として好ましい物質である。従って、生産植物のスコポラミン濃度を上げることは長年の関心事であった。多くの熱帯および亜熱帯国で育つ薬用植物Datura innoxiaは、トロパン・アルカロイドの主要な供給源の一つである。これらアルカロイドの生合成には複数の酸素要求段階が含まれている。 7.1.実験方法タバコについて上記したように組換えＤＮＡ技術、転写分析およびウェスタン・イムノブロッティング分析を行った。タバコに用いた形質転換ベクターをチョウセンアサガオにも使用した。植物材料 Datura innoxia Millの植物を24℃で16時間光に暴露し、無菌ジャー中Murashi ge & Skoogマクロ塩、Nitsch & Nitschミクロ塩およびビタミン類を含有する基礎培地（BM）に保った（Sangwan et al.，1991，Plant Cell Rep．10:90-93）。 Sangwan et al．（1991）に記載のリーフ・ディスク法を用い、植物をAgrobacte rium媒介遺伝子導入によって形質転換した。F₀世代の形質転換体をこの実験に使用した。アルカロイド分析トランスジェニック・チョウセンアサガオと野生型植物を、そのスコポラミン濃度、ヒヨスチアミン濃度について分析した。植物が発芽するまでは土壌中で育てた。次いで、葉を収穫し乾燥した。スコポラミンおよびヒヨスチアミン濃度は、Gontier et al.，1994，Agro-Food Ind ．Hi-Tech5，26-28に記載の通り、HPLC を用いて測定した。 7.2．結果いくつかのトランスジェニック植物は、ゲノムＤＮＡのＰＣＲで測定した場合、VHb遺伝子に対して陽性であった。ポリＡ⁺ｍＲＮＡを、６つのPCR-陽性トランスジェニック植物および２つの野生型植物の葉から分離した。6個のトランスジーンはすべて、全長VHb転写産物を示した。予備的結果によれば、VHb発現構築物で形質転換されたチョウセンアサガオは、野生型植物に比べて、成長速度の向上も示した。６つのトランスジェニック植物および２つの野生型チョウセンアサガオ植物からの抽出物を、HPLCによりそのスコポラミンおよびヒヨスチアミン濃度について分析した。結果を次表に示す。表Ｉトランスジェニックスコポラミン産生ヒヨスチアミン産生植物番号 mg/100g乾燥重量 mg/100ｇ乾燥重量 1 115 47 2 148 35 3 246 20 4 86 28 5 118 17 6 70 10 対照A 26 7.1 対照B 55 8.0 7.3．考察タバコの結果と同様に、VHb遺伝子を発現する遺伝子操作チョウセンアサガオも形質転換植物を生じ、両方ともより早く成長し、所望の二次代謝産物の変更濃度を含んでいた。これらの結果から、全植物中の酸素結合性タンパク質、特に VHbのようなヘム基を介して可逆的に酸素を結合するタンパク質の発現は、改良された形質転換植物を得るために一般的に応用可能である。 8．実施例：Vitreoscillaヘモグロビン変異体の表現型スクリーニングランダムに変異されたVHbのライブラリーを作製するため、本発明者らは、テンプレートとしてVHb遺伝子をもつ、以前の構築物であるpINT1を使用した（Khos laおよびBailey，1989、上記）。テンプレートとして使用したVHb配列は、タンパク質のアミノ末端に、追加の８アミノ酸延長部（-MTMITPSF-）をもつ野生型VH bタンパク質をコードしていた。しかしながら、ここに挙げたナンバリング慣行はすべて上記米国特許第5,049,493号に記載の野生型アミノ酸配列位置に対応している。プライマーH1およびH2を用いて、概算エラー率２〜４％をもつ忠実度の低いPCRによりVHb遺伝子を増幅した（Leung et al.，1989，Technique,1,11-15 ）。 8.1．実験方法PCR 1mMのdCTP、dGTPおよびdTTP、0.2mMのdATP、各プライマーを0.45mMずつ、0.1n gのテンプレート、1%の1Mメルカプトエタノール、10% DMSO、0.5mM MnCl₂および 10 U Taq DNAポリメラーゼを用いて、低忠実度のPCRを行った。95℃で2分、Taq DNAポリメラーゼ添加中は70℃に保ち、92℃で15秒、50℃で30秒および72℃で1分を30サイクル、92℃で15秒および72℃で5分をさらに5サイクルという温度プロフィールを使用した。増幅されたPCRフラグメントをpUC19に挿入し、次いで大腸菌に形質転換した。突然変異遺伝子のシーケンシングはターミネーター化学を備えた自動シーケンサーで行った。突然変異VHbをもつコロニーに関するライブラリーのスクリーニングプラスミド・ライブラリーを大腸菌TG1に形質転換し、コロニーの色を肉眼評価することによってLB寒天上で選択した（Sambrook et al.）。野生型VHbが発現すると、赤い色のコロニーが生じる。赤色表現型は酸素化ヘムを結合できるVHb タンパク質の指標である。白色から濃い赤色の範囲にある約10,000個のコロニーを同定した。ウェスタン・イムノブロット分析一夜培養物をペレット化し、リン酸ナトリウム緩衝液（50mM，pH7.0）に再懸濁した後、超音波処理してタンパク質抽出物を得た。タンパク質は15% SDS-PAGE ゲルで分離し、ミリポア社のイモビロンP（Immobilon P）ナイロンメンブランにブロッティングした。電気泳動およびブロッティングは、それぞれLaemmli（197 0）およびSambrook et al．（1989）の記載に従って行った。VHb変異体はウサギ由来のVHb抗血清によって検出し、ペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ免疫グロブリン（Dako）によって可視化した。 8.2．結果ランダムに釣り上げた、ウェスタン・ブロッティングによって正しいサイズの VHb（15.7kDa）を示すコロニーのシーケンシングを行った。以下の改変VHbアミノ酸配列を同定した。表II PCR突然変異誘発により得られた改変VHbタンパク質分離物アミノ酸改変 A Ile¹²⁹Thr B His³⁶Arg C Lys⁷⁹Asn D Phe³¹Tyr，Gln⁵³Arg E Lys¹²⁴Glu，Phe¹³³Leu，Ile¹³⁴Thr F Gly²¹Asp，Val¹³⁶Glu，Ala¹³⁸Thr G Leu⁵¹Ser，Val⁸³Ala，Tyr¹²⁶His H Lys¹¹Glu，Lys¹⁰⁷Glu，Lys¹²⁴Stop 8.3．考察 PCR突然変異誘発法により、VHb変異体の表現型を選択することができた。これらの変異体は、その酸素化ヘム結合力によって証明されるように、VHbについて少なくとも何らかの機能的活性を保持していた。これらの変異体は8アミノ酸のアミノ末端延長部をもつVHbタンパク質において得られたが、該変異体は野生型アミノ末端をもつVHbタンパク質でも同様に有効であるだろう。さらに、このアプローチによれば、コード配列の突然変異誘発、次いで機能的活性を保持するヘム含有タンパク質をコードするクローンの選択によって、改変ヘモグロビン分子を容易に選択し生成することができるであろう。 9. 実施例：Vitreoscillaヘモグロビン発現を伴うイネの形質転換構築物本実施例は、粒子ボンバードメント（particle bombardment）を用いて、植物細胞のVitreoscillaヘモグロビン発現を指令するポリヌクレオチドによるイネの形質転換を示すものである。 9.1．実験方法プラスミドの構築 CaMV 35Sプロモーターおよびnosポリアデニル化配列の制御下にvhb遺伝子を含有するpUCの誘導体としてpJFK2を構築した。さらに、PCR媒介突然変異誘発により、vhb遺伝子の停止コドンをTAAからTGA（植物の停止コドンとして頻繁に使われる）へと変更した。トランスジェニック・イネ組織を選択するため、ハイグロマイシン耐性を賦与する大腸菌からのaphIV遺伝子を形質転換構築物に入れた。このマーカー遺伝子を、CaMV 35SプロモーターおよびCaMVポリアデニル化配列の制御下においた。pJFKの地図を図６に示す。 pJFK2プラスミドをI-SceIで切断し、vhb遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子を含む（そしてアンピシリン耐性遺伝子を欠失した）大きい方のフラグメントを分離して植物胚の後ボンバードメントに使用した。イネの形質転換ジャポニカ変種Taipei 309の未成熟イネOryza satjva胚を、受粉10〜14日後に温室植物から無菌的に分離し、3%ショ糖、2mg/l 2,4-Dおよび50mg/lセフォタキシムを含有する固形MS培地（MS1）(Murashige and Skoog，1962)の菌甲(scutulu m)サイトに置いた。４〜６日後（28℃、暗所）胚を、10%ショ糖、2mg/l 2,4-Dおよび50mg/lセフォタキシムを含有する固形MS培地(MS2)に移して、１時間以内に粒子導入銃によるマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントに付した。vhb およびaph IV遺伝子含有DNAフラグメント（5μｇ）を、Vain et al.，1993,Plan t Cell Rep ．12 :84-88に記載のように、１〜３μｍの金粒子（Aldrich）上に沈殿させた。圧力６バールにおいて粒子導入銃（Finer et al.，1992，Plant Cell Rep ．11 :323-328）で、金粒子（１回あたり400μｇ）をターゲットに向かって加速した。シリンジフィルターから16cm下に胚を置いた。ボンバードメントの24 時間後に胚を固形選択培地（20mg/ｌハイグロマイシンB含有MS1培地）で選択し、28℃の暗所でインキュベートした。 1週間後、3%ショ糖、1mg/lチアミン、1mg/l 2,4-D、50mg/lセフォタキシムおよび20mg/lハイグロマイシンBを添加した液体選択培地のR2培地（Ohira et al. ，1973，Plant Cell Physiol．14:113-121）に移した。胚を振盪しながら暗所28 ℃でインキュベートし、週に一度継代培養した。３〜６週間後発生するカルスを分離し、カルス増進培地（6%ショ糖、MSビタミン類、100mg/lイノシトール、2mg /l 2,4-D、50mg/lセフォタキシムおよび20mg/lハイグロマイシンBを添加したR2 培地）に移した。カルスを28℃暗所でこの培地にてインキュベートし、週に一度継代培養した。耐性カルスを、2%ショ糖、3%ソルビトール、20mg/lハイグロマイシンB、１mg/ lゼアチン、1mg/l IAA、MSビタミン類そして0.65%アガロースを添加した固形R2 再生培地に移した。シュート形成を促進するため、カルス組織を12時間光にあてながら28℃に保持した。次いでシュートが２〜３cmの長さになるまで3週間したホルモン不含の半濃度のMS発根培地に移した。培養２〜４週間後、苗を直接温室へ移し、土に植えた。苗は肥料を与えた土を入れた7リットルの培養ポットで、1ポットあたり苗3本を、開花し種子が付くまで育てた（昼：12時間、28℃、湿度80%；夜：12時間、21℃、湿度60%）。トランスジェニック・イネ植物の分析トランスジーンの存在、挿入物の複雑性および存在するコピー数を調べるため、以前に記載されたように（Burkhardt et al.，1997）サザン・ブロッティング分析を行った。PCR増幅DIG標識（Boehringer）されたvhbコード領域の300-bpフラグメントをプローブとして使用した。トランスジーンの発現は、上記および文献（Wunn et al.，1996，Bio/Technol ogy 14:171-176）に従って、ウェスタン・イムノブロットにより確認した。 9.2．結果形質転換した植物をザザン・ブロットにより分析したところ、トランスジーンをもっていることが分かった。ウェスタン・ブロットを行って形質転換された植物がvhbトランスジーンを発現することを示す。トランスジェニックRO植物からの種子を集め、R1植物を育てる。R1世代植物の成長は、トランスジーンをもたない対照植物に比べて、より早い。以上特定の実施形態を参考にして本発明の詳細な説明を行ったが、機能的に均等な変更は本発明の範囲に含まれるものである。実際、本明細書の記載に加えて本発明の様々な変更は、以上の記載および添付図面からそのような変更が特許請求の範囲に含まれることは当業者に明らかである。本明細書には種々の刊行物を引用したが、その開示内容をそのまま参考として本明細書に組み入れる。

【手続補正書】【提出日】平成１１年４月１５日（１９９９．４．１５）【補正内容】請求の範囲１．非植物グロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換することにより遺伝子操作された植物。２．グロビンタンパク質がVitreoscillaヘモグロビン、ウマ心臓ミオグロビン、大腸菌(E．coli)ヘムタンパク質、枯草菌(B．subtilis)ヘムタンパク質、酵母フラボヘモグロビン、およびマッコウクジラ・ミオグロビン、またはそれらの機能性均等物よりなる群から選択される、請求項１に記載の植物。３．グロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物プロモーターに機能しうる形で連結されている、請求項１または２に記載の植物。４．植物プロモーターが強力な、構成的に発現している植物プロモーターである、請求項３に記載の植物。５．強力な、構成的に発現している植物プロモーターがCaMV 35Sプロモーターである、請求項４に記載の植物。６．植物プロモーターが組織特異的な植物プロモーターである、請求項３に記載の植物。７．前記ポリヌクレオチドがマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントにより植物細胞に導入される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物。８．前記ポリヌクレオチドがTiプラスミドにより植物細胞に導入される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物。９．植物が双子葉植物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物。 10．植物がタバコ(Nicotiana)属のものである、請求項９に記載の植物。 11．植物がタバコ(Nicotiana tabaccum)である、請求項10に記載の植物。 12．植物がチョウセンアサガオ(Datura)属のものである、請求項９に記載の植物。 13．植物が単子葉植物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物。 14．植物がイネ(Oryza)属のものである、請求項13に記載の植物。 15．グロビンタンパク質が0.5μＭを越える酸素Ｋ_Dを有する、請求項１〜14のいずれか１項に記載の植物。 16．グロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドで植物または植物細胞を形質転換することを含んでなる、改良された農業特性または医薬特性を有する植物の作出方法であって、形質転換された植物が形質転換されていない植物と比べて成長速度の増加、成熟植物の栄養収穫量および／または再生産量の増加、発芽率の増加、および／またはクロロフィル含量の増加を示す、上記方法。 17．グロビンタンパク質がVitreoscillaヘモグロビン、ウマ心臓ミオグロビン、大腸菌ヘムタンパク質、枯草菌ヘムタンパク質、酵母フラボヘモグロビン、およびマッコウクジラ・ミオグロビン、またはそれらの機能性均等物よりなる群から選択される、請求項16に記載の方法。 18．グロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物プロモーターに機能しうる形で連結されている、請求項16または17に記載の方法。 19．植物プロモーターが強力な、構成的に発現している植物プロモーターである、請求項18に記載の方法。 20．強力な、構成的に発現している植物プロモーターがCaMV 35Sプロモーターである、請求項19に記載の方法。 21．植物プロモーターが組織特異的な植物プロモーターである、請求項18に記載の方法。 22．前記ポリヌクレオチドがマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントにより植物細胞に導入される、請求項16〜21のいずれか１項に記載の方法。 23．前記ポリヌクレオチドがTiプラスミドにより植物細胞に導入される、請求項 16〜21のいずれか１項に記載の方法。 24．植物が双子葉植物である、請求項16〜23のいずれか１項に記載の方法。 25．植物がタバコ(Nicotiana)属のものである、請求項24に記載の方法。 26．植物がタバコ(Nicotiana tabaccum)である、請求項25に記載の方法。 27．植物がさらにニコチンレベルの上昇を示す、請求項26に記載の方法。 28．植物がチョウセンアサガオ(Datura)属のものである、請求項24に記載の方法。 29．植物がさらにスコポラミンおよび／またはヒヨスチアミンレベルの上昇を示す、請求項28に記載の方法。 30．植物が単子葉植物である、請求項18〜23のいずれか１項に記載の方法。 31．植物がイネ(Oryza)属のものである、請求項30に記載の方法。 32．請求項16に記載の方法により作出された植物。 33．標的植物または標的植物細胞を、植物プロモーターに機能しうる形で連結された非植物グロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換することを含んでなる、植物において二次代謝産物の分布を改変する方法。 34．植物がタバコ(Nicotiana)属のものであり、ニコチンの分布がアナバシンに対して改変されている、請求項33に記載の方法。 35．植物がチョウセンアサガオ(Datura)属のものであり、スコポラミンおよび／またはヒヨスチアミンの分布が改変されている、請求項33に記載の方法。 36．Ile¹²⁹Thr;His³⁶Arg;Lys⁷⁹Asn;Phe³³Tyr，Gln⁵³Arg;Lys¹²⁴Glu，Phe¹³³Leu ，Ile¹³⁴Thr;Gly²¹Asp，Val¹³⁶Glu，Ala¹³⁸Thr;Leu⁵¹Ser，Val⁸³Ala，Tyr¹²⁶H is;およびLys¹¹Glu，Lys¹⁰⁷Glu，Lys¹²⁴Stopよりなる群から選択されるアミノ酸置換を有することにより野生型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質と異なっている、変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質。 37．配列MetThrMetIleThrProSerPheを有するアミノ末端アミノ酸延長部をさらに含む、請求項36に記載の変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質。 38．請求項36または37に記載の変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 39．請求項38に記載のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞。 40．宿主細胞が植物細胞、細菌細胞、動物細胞、真菌細胞および藻類細胞よりなる群から選択される、請求項39に記載の宿主細胞。 41．変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの作製方法であって、低忠実度のポリメラーゼ連鎖反応を用いてVitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅し、増幅したポリヌクレオチドを細菌に形質転換し、そして変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む細菌を選択する、ことを含んでなる上記方法。 42．前記選択ステップが細菌細胞の色をアッセイすることを含む、請求項41に記載の方法。 43．請求項41または42に記載の方法により単離された変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 44．請求項43に記載のポリヌクレオチドによりコードされる変異型Vitreoscilla ヘモグロビンタンパク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．グロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換することにより遺伝子操作された植物。２．グロビンタンパク質がVitreoscillaヘモグロビン、ウマ心臓ミオグロビン、大腸菌ヘムタンパク質、枯草菌ヘムタンパク質、酵母フラボヘモグロビン、ダイズ・レグヘモグロビン、ハウチワマメ・レグヘモグロビン、およびマッコウクジラ・ミオグロビン、またはそれらの機能性均等物よりなる群から選択される、請求項１に記載の植物。３．グロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物プロモーターに機能しうる形で連結されている、請求項１または２に記載の植物。４．植物プロモーターが強力な、構成的に発現している植物プロモーターである、請求項３に記載の植物。５．強力な、構成的に発現している植物プロモーターがCaMV 35Sプロモーターである、請求項４に記載の植物。６．植物プロモーターが組織特異的な植物プロモーターである、請求項３に記載の植物。７．前記ポリヌクレオチドがマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントにより植物細胞に導入される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物。８．前記ポリヌクレオチドがTiプラスミドにより植物細胞に導入される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物。９．植物が双子葉植物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物。 10．植物がNicotiana(タバコ)属のものである、請求項９に記載の植物。 11．植物がタバコ(Nicotiana tabaccum)である、請求項10に記載の植物。 12．植物がDatura(チョウセンアサガオ)属のものである、請求項９に記載の植物。 13．植物が単子葉植物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物。 14．植物がOryza(イネ)属のものである、請求項13に記載の植物。 15．グロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドで植物を形質転換することを含んでなる、改良された農業特性または医薬特性を有する植物の作出方法であって、形質転換された植物が形質転換されていない植物と比べて成長速度の増加、成熟植物の栄養収穫高の増加、発芽率の増加、および／またはクロロフィル含量の増加を示す、上記方法。 16．グロビンタンパク質がVitreoscillaヘモグロビン、ウマ心臓ミオグロビン、大腸菌ヘムタンパク質、枯草菌ヘムタンパク質、酵母フラボヘモグロビン、ダイズ・レグヘモグロビン、ハウチワマメ・レグヘモグロビン、およびマッコウクジラ・ミオグロビン、またはそれらの機能性均等物よりなる群から選択される、請求項15に記載の方法。 17．グロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物プロモーターに機能しうる形で連結されている、請求項15または16に記載の方法。 18．植物プロモーターが強力な、構成的に発現している植物プロモーターである、請求項17に記載の方法。 19．強力な、構成的に発現している植物プロモーターがCaMV 35Sプロモーターである、請求項18に記載の方法。 20．植物プロモーターが組織特異的な植物プロモーターである、請求項17に記載の方法。 21．前記ポリヌクレオチドがマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントにより植物細胞に導入される、請求項15〜20のいずれか１項に記載の方法。 22．前記ポリヌクレオチドがTiプラスミドにより植物細胞に導入される、請求項 15〜20のいずれか１項に記載の方法。 23．植物が双子葉植物である、請求項15〜22のいずれか１項に記載の方法。 24．植物がNicotiana(タバコ)属のものである、請求項23に記載の方法。 25．植物がタバコ(Nicotiana tabaccum)である、請求項24に記載の方法。 26．植物がさらにニコチンレベルの上昇を示す、請求項25に記載の方法。 27．植物がDatura(チョウセンアサガオ)属のものである、請求項23に記載の方法。 28．植物がさらにスコポラミンおよび／またはヒヨスチアミンレベルの上昇を示す、請求項27に記載の方法。 29．植物が単子葉植物である、請求項17〜22のいずれか１項に記載の方法。 30．植物がOryza(イネ)属のものである、請求項29に記載の方法。 31．請求項17に記載の方法により作出された植物。 32．標的植物または標的植物細胞を、植物プロモーターに機能しうる形で連結されたグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換することを含んでなる、植物において二次代謝産物の分布を改変する方法。 33．植物がNicotiana(タバコ)属のものであり、ニコチンの分布がアナバシンに対して改変されている、請求項32に記載の方法。 34．植物がDatura(チョウセンアサガオ)属のものであり、スコポラミンおよび／またはヒヨスチアミンの分布が改変されている、請求項32に記載の方法。 35．Ile¹²⁹Thr;His³⁶Arg;Lys⁷⁹Asn;Phe³³Tyr，Gln⁵³Arg;Lys¹²⁴Glu，Phe¹³³Leu ，Ile¹³⁴Thr;Gly²¹Asp，Val¹³⁶Glu，Ala¹³⁸Thr;Leu⁵¹Ser，Val⁸³Ala，Tyr¹²⁶H is;およびLys¹¹Glu，Lys¹⁰⁷Glu，Lys¹²⁴Stopよりなる群から選択されるアミノ酸置換を有することにより野生型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質と異なっている、変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質。 36．配列MetThrMetIleThrProSerPheを有するアミノ末端延長部をさらに含む、請求項35に記載の変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質。 37．請求項35または36に記載の変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 38．請求項37に記載のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞。 39．宿主細胞が植物細胞、細菌細胞、動物細胞、真菌細胞および藻類細胞よりなる群から選択される、請求項38に記載の宿主細胞。 40．変異型Vitreoscilhtヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの作製方法であって、低忠実度のポリメラーゼ連鎖反応を用いてVitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅し、増幅したポリヌクレオチドを細菌に形質転換し、そして変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む細菌を選択する、ことを含んでなる上記方法。 41．前記選択ステップが細菌細胞の色をアッセイすることを含む、請求項40に記載の方法。 42．請求項40または41に記載の方法により単離された変異型Vitreoscillaヘモグロビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 43．請求項42に記載のポリヌクレオチドによりコードされる変異型Vitreoscilla ヘモグロビンタンパク質。