RO114979B1 - Oxalat oxidaza avand capacitatea de a degrada acidul oxalic si procedeu pentru obtinerea oxalat oxidazei in plante - Google Patents
Oxalat oxidaza avand capacitatea de a degrada acidul oxalic si procedeu pentru obtinerea oxalat oxidazei in plante Download PDFInfo
- Publication number
- RO114979B1 RO114979B1 RO93-01143A RO9301143A RO114979B1 RO 114979 B1 RO114979 B1 RO 114979B1 RO 9301143 A RO9301143 A RO 9301143A RO 114979 B1 RO114979 B1 RO 114979B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- plant
- oxalic acid
- oxalate oxidase
- oxalate
- enzyme
- Prior art date
Links
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 207
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 title description 11
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 title description 10
- 108010063734 Oxalate oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 111
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 18
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 14
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 claims description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 8
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 3
- 241000235819 Cytospora Species 0.000 claims description 3
- 241000131430 Mycena Species 0.000 claims description 3
- 241000222543 Paxillus Species 0.000 claims description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 3
- 241000233639 Pythium Species 0.000 claims description 3
- 241000222480 Schizophyllum Species 0.000 claims description 3
- 241001558929 Sclerotium <basidiomycota> Species 0.000 claims description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 3
- 241001361634 Rhizoctonia Species 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 2
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 30
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 41
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 27
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 14
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 6
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 3
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 238000010960 commercial process Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 3-diaminopropionic acid compound Chemical class 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 244000124209 Crocus sativus Species 0.000 description 1
- 235000015655 Crocus sativus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101710129170 Extensin Proteins 0.000 description 1
- 208000008852 Hyperoxaluria Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-L Oxalate Chemical compound [O-]C(=O)C([O-])=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010068005 Oxalate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004460 Tanacetum coccineum Species 0.000 description 1
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 1
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)=CNC2=C1 LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- ROVGZAWFACYCSP-MQBLHHJJSA-N [2-methyl-4-oxo-3-[(2z)-penta-2,4-dienyl]cyclopent-2-en-1-yl] (1r,3r)-2,2-dimethyl-3-(2-methylprop-1-enyl)cyclopropane-1-carboxylate Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)OC1C(C)=C(C\C=C/C=C)C(=O)C1 ROVGZAWFACYCSP-MQBLHHJJSA-N 0.000 description 1
- 230000009858 acid secretion Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- QXDMQSPYEZFLGF-UHFFFAOYSA-L calcium oxalate Chemical compound [Ca+2].[O-]C(=O)C([O-])=O QXDMQSPYEZFLGF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001254 nonsecretory effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 150000003891 oxalate salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010525 oxidative degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012794 pre-harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 229940015367 pyrethrum Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 1
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 1
- 239000004248 saffron Substances 0.000 description 1
- 235000013974 saffron Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M sodium;2-[[(4r)-4-[(3r,5r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonate Chemical class [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N taurodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008354 tissue degradation Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011240 wet gel Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/03—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with oxygen as acceptor (1.2.3)
- C12Y102/03004—Oxalate oxidase (1.2.3.4)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Prezenta invenție se referă la oxalat oxidaza având capacitatea de a degrada acidul oxalic și la un procedeu pentru obținerea oxalat oxidazei într-o plantă, prin folosirea tehnicilor ADN-ului recombinant. Planta recombinantă obținută prezintă toleranță la bolile produse de fungi.
De la începuturile agriculturii, oamenii au fost confruntați cu problema bolilor la plante, în decursul istoriei, au fost făcute multe progrese împotriva bolilor la plante, exemplificate prin utilizarea hibrizilor plantelor, pesticidelor și realizarea practicilor agricole. Totuși, orice fermier, grădinar sau cultivator pasionat de plante în seră poate atesta că problemele bolilor la plante sunt permanente și constante. Necesitatea pentru astfel de enzime care degradează oxalatul este cunoscută în diverse domenii care includ necesarul pentru utilizarea lor în truse de cercetare pentru determinarea prezenței și/sau cantității de acid oxalic și pentru utilizare în degradarea acidului oxalic prezent în alimente, băuturi și procese comerciale. De exemplu, oxalat decarboxilaza bacteriană a fost folosită de către industria berii (US 4652452] și așa cum se expune aici, oxalatul poate fi degradat folosind oxalat oxidaza.
Tehnicile de recombinare genetică, adică de introducere a genei care codifică oxalat oxidaza într-o plantă, sunt cele cunoscute și sunt prezentate în Huynh, T., et al., (1985) DNA Cloning Techniques: A Practicai Approach”, D.GIover, ed.lRL Press, Oxford, Produsul ADNc donat în vectorul lambda gt 22 se recuperează folosind metodele standard PCR, cum este exemplificat în Ausubel, F.M. et al., ads., (1988). “The Polymerase Chain Reaction”, în Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing Associates and Wiley Intrescience, New York, pp.15.0.1-15.4.6. Promotorul utilizat este caracterizat în Liang, X. et al., (1989), PNAS, USA, 8:9284-9288. Expresia genei oxalat oxidazei în celule gazde bacteriene poate fi realizată prin folosirea promotorilor obținuți din surse bacteriene. Exemple de astfel de promotori includ promotorul trp pentru expresie în bacterii, precum E. Coli ,cum este exemplificat în Amann, E., et al., (1983) “Gene”, 25: 167-178, sau promotorul pentru expresia în drojdii al gliceraldehidfosfat dehidrogenazei (GAPO), așa cum este exemplificat în Edens.L., et al., (1984) “Synthesis and Processing of the Plant Protein Thumatin in Yeast”, “Cell” 37: 629-633. Pot fi folosite pentru a atașa regiunea terminator în spatele sau la capătul 3’ al genei, metode standard cunoscute în domeniu (de exemplu, T.Maniatis, et al., supra, pp. 104-106). Un exemplu de secvență terminator de poliadenilare pentru expresie în plante ar putea fi cea de la gena octopin sintază de la o plasmidă Ti de Agrobacterium tumefaciens, cum s-a enunțat în H. De Greve et al., (1982), “Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciensTi plasmid encoded octopine synthase gene”, J.Mol.Appl.Genet.,1: 499511. Un exemplu de astfel de terminator pentru expresia în celulele gazdă bacteriene este secvența terminator de transcripție rho-independentă de la Salmonella typhimurium (de exemplu, M.E.Winkler, (1987)), “Escherichia Coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology”, F.C.Neidhardt, ed-in-chief; American Society for Microbiology. Secvențele terminator pot fi de asemenea derivate parțial sau în întregime de la secvențele terminator găsite în celule diferite de cele ale celulei gazdă, secvențe diferite ca lungime, dacă ele îndeplinesc condițiile de mai sus terminarea transcripției și poliadenilare, necesare celulei gazdă. Alt tip de element regulator care trebuie atașat la gena pentru oxalat oxidază este o secvență ADN care codifică pentru o peptidă semnal. Pentru a atașa secvența ADN pentru peptida semnal pot fi folosite metode standard cunoscute în domeniu (de exemplu, Maniatis, T., et al., pp. 104-106). Exemple de astfel de secvențe semnal includ peptida semnal de la o genă de lungime a plantelor (Chen, J. and Varner, J.E., “An extracellular matrix
RO 114979 Bl protein in plante: Characterization of a genomic clone for carrot extension”, EMBO J. 50 4: 2145-2151, (1985), de la gena bacteriană pe 1B (pectatliază) de Erwinia carotovora (Lei, S.P. et al., (1987), J.Bacteriol. 169 4379) și de la factorul prepro de drojdie (Smith, R.A., etal., Science 229: 1219-1229, 1985).
Prezenta invenție se referă la caracterizarea enzimei oxalat oxidaza și la un procedeu pentru obținerea oxalat oxidazei într-o plantă, cu rol de a degrada acidul 55 oxalic produs de fungi.
Oxalat oxidaza având capacitatea de a degrada acidul oxalic, conform invenției, are secvența de aminoacizi arătată în fig.2, are un pH optim de 3,5, o stabilitate termică pozitivă, o subunitate de 25 kDalton și stabilitate proteazică.
Procedeul de obținere a oxalat oxidazei într-o plantă, conform invenției, cu- 60 prinde încorporarea stabilă în genomul din celula plantei a genei care codifică enzima oxalat oxidaza, reprezentată prin secvența de ADN din fig.1. Prin transformare genetică, genomul plantei este transformat printr-un construct genetic care conține o secvență promotor, o peptidă de tranzit, o secvență structurală de genă care codifică enzima oxalat oxidaza și o secvență terminator de genă, astfel încât planta poate 65 elibera enzima pentru degradarea acidului oxalic.
Această invenție constituie un mare pas înainte în rezolvarea problemei bolilor la plante, prin cercetarea unui fapt cunoscut de mult privind metoda prin care anumiți microbi, în special fungi, atacă plantele. Specific, această invenție consacră un mijloc prin care agentul etiologic (cauzator de boală) este redus sau se previne intrarea 70 acestuia în țesutul plantei îndepărtând astfel boala. Alternativ, în situațiile în care invazia completă nu a fost evitată, prezenta invenție conferă plantelor un mijloc pentru reducerea efectelor infecției, reducând sau prevenind astfel mortalitatea datorată bolii.
în scopul infectării unei plante, un patogen de plantă trebuie să fie capabil să intre în plantă și apoi să străbată planta. Patogenii de plantă realizează aceasta pe 75 diferite căi. în general, aceasta se realizează prin secreția de substanțe chimice care realizează diferite componente și/sau mecanisme metabolice ale plantei pentru a fi atacate, de exemplu, gazda patogenului. Principalele grupuri de compuși care sunt secretați de patogenii plantelor și care sunt în legătură cu mecanismul cauzator de boală sunt toxine, enzime, polizaharide și/sau alți agenți de creștere. Un astfel de compus 80 chimic este acidul oxalic sau oxalatul care poate fi degradat de către enzima oxalat oxidază. Deși reacția catalizată de către oxalat oxidază este binecunoscută, calitățile fizico-chimice ale enzimei, așa cum s-a exemplificat prin oxalat oxidaza de la orz, sunt incorect descrise în literatură. Secreția acidului oxalic ca un mijloc prin care patogenii plantelor atacă plantele gazdă se găsește de obicei la numeroase genuri de fungi și, 85 în special, la genurile Streptomyces, Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillus, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Rhizoctonia și Schizophyllum. Aceste genuri de fungi, în special acei fungi ai genului Sclerotinia, sunt cunoscuți a cauza boli distructive și fatale la numeroase plante superioare cultivate, incluzând recolte din câmp, precum floarea-soarelui, soia, fasole în general, rapiță/canola, lucernă, in, șofran, 90 arahide și trifoi, culturi de legume, precum lăptuca, tomatele, castraveții, cartofii, morcovii, ridichile, mazărea, lintea, varza, conopida italiană și varza de Bruxelles, flori, precum petunia și piretrum și specii de arbori, precum piersicul. Bolile includ nu numai bolile anterioare recoltării din câmp, ci și bolile după recoltare din timpul transportului și depozitării. 95
Simptomele cauzate de către genurile fungice menționate anterior variază în funcție de planta gazdă și de părțile plantei gazdă atinse de boală și sunt dependente de condițiile de mediu din momentul atacului patogen. De exemplu, o trăsătură a
RO 114979 Bl tuturor bolilor cauzate de Sclerotinia este vestejirea și colapsul frunzelor,după care fungii invadează rapid “inima” plantei și pătrund în stern. Boala este fatală.
în culturile lichide de Sclerotinia, nivelurile de acid oxalic variază de la 1000 lalOOOO ppm, depinzând de mediul de creștere, vârsta culturii și alți parametri observați. Anumite țesuturi de plantă, precum frunze de fasole și de floarea-soarelui, expuse la concentrații scăzute de acid oxalic, arată rapid semne de ofilire și moarte a celulelor, sugerând importanța acidului oxalic în stadiile mai târzii ale bolii. Mecanismul precis al funcției acidului oxalic care produce boala după infecție nu este cunoscut, deși gama teoriilor variază de la chelarea metalelor divalente care interferează cu pereții celulari ai plantei și/sau enzimele metabolice de bază până la asigurarea unui microclimat optim pentru acțiunea enzimelor hidrolitice secretate de către acești fungi. Oricum, este clar din evidența existentă că acidul oxalic este un component integral al atacului patogen. Evidența pentru această concluzie a fost obținută prin câteva studii care includ investigări asupra mutantelor Sclerotinia fără oxalat, care par să posede complementul normal al enzimei hidrolitice și alți factori, dar nu produc simptomatologia bolii.Revertanții acestor mutante oxalat minus au demonstrat dezvoltarea caracteristicilor normale ale bolii. Gradul ridicat de virulență a bolilor asociate cu genurile fungice menționate anterior este bine cunoscut. De exemplu, frunzele plantelor de floarea-soarelui crescute în seră, infectate cu Sclerotinia sclerotorum, prezintă frecvent ofilire și necroze între nervuri la 3-5 zile după inoculare. Studiul acestor plante a arătat o substanță care induce ofilirea în extractele apoase ale hipocotiledoanelor afectate (partea axei embrionare sau partea seminței de sub cotiledon). Teste chimice care includ cromatografia în strat subțire și cromatografia gaz-lichid au demonstrat că această substanță care induce ofilirea conține acid oxalic și că frunzele ofilite de la plante infectate conțin de peste 15 ori mai mult acid oxalic decât frunzele de la plante sănătoase. Așa cum s-a arătat deja, acidul oxalic se circulă sistematic prin plantă pentru a cauza simptomele bolii în țesuturi care sunt la distanță de punctul inițial al infecției și nu sunt în mod necesar infectate cu hifele fungice.
Cu această prezentare, inventatorii au înțeles că identificarea adecvată, izolarea și expresia unei enzime care degradează oxalatul, cum ar fi o oxalat oxidază, oxalat decarboxilază sau o enzîmă similară drintr-o plantă diminuează puternic patogenitatea fungilor care secretă acid oxalic ca un component cheie al patogenității. Deci, inventatorii au definit și atins obiectivul identificării și izolării complete a unei gene pentru o proteină care este adecvată pentru introducerea activității oxalat oxidazei în plante și bacterii folosind tehnicile ingineriei genetice.
De asemenea, oxalații se întâlnesc de obicei în câteva specii de plante ca produse naturale ale plantelor înseși. Oxalatul întâlnit natural se acumulează în unele frunze verzi de legume, precum spanac și revent și în unele legume furajere.
Deși astfel de specii cultivate sunt surse potențiale de vitamine și minerale în dietă, ingestia de cantități mari este toxică pentru oameni, ele legându-se cu ionii de calciu și precipită ca oxalat de calciu insolubil, în rinichi, conducând la hiperoxalurie și degradare a țesutului renal.
De asemenea, este cunoscut că acidul oxalic poate reacționa cu alți metaboliți ai plantelor pentru a forma derivați de oxalat care sunt foarte toxici. într-un exemplu, se formează compusul acid p-N-oxalil-L-a,|3-diaminopropionic care este o neurotoxină.
Astfel, prezența acidului oxalic în unele specii de plante exclude folosirea lor ca alimente pentru om sau animale.
în particular, inventatorii au caracterizat o enzimă folositoare pentru stoparea
RO 114979 Bl patogenității care cuprinde acidul oxalic. Această enzimă oxalat oxidază, caracterizată în mod unic, catalizează sau, altfel spus, contribuie la o reacție care implică degradarea oxidativă a oxalatului pentru a produce dioxid de carbon și apă oxigenată. Formula generală a acestei reacții este:
Oxalat + 02 oxa,at oxidaza 2C02 + H202
Studiul acestei enzime a avut ca rezultat nu numai identificarea, izolarea și expresia sa, dar și caracterizarea și donarea sa, astfel încât o genă existentă pentru expresia enzimei poate fi introdusă în plantă și exprimată prin plante cărora le conferă rezistență la boli produse de fungi în care acidul oxalic este un component critic. Astfel, transformarea plantei va proteja plantele transformate împotriva efectelor dăunătoare ale bolii produse de acidul oxalic.
Se apreciază că aplicațiile invenției de mai sus nu se limitează la patogeneza plantei. încă un alt beneficiu al acestei invenții este introducerea într-o plantă a unei gene oxalat oxidază pentru a produce o plantă cu conținut scăzut de acid oxalic. Aceasta poate fi avantajoasă în special în plante bogate în oxalat, cum ar fi arahide, sfeclă, spanac, revent, orz, cacao și numeroase ierburi. Vezi Libert and Franceschi (1987), J.Agrc. Food Chem., 35: 926-938. De asemenea, invenția are aplicare pentru producerea pe scară largă a enzimelor care degradează oxalatul. Necesitatea pentru astfel de enzime care degradează oxalatul este cunoscută în diverse domenii care includ necesarul pentru utilizarea lor în truse de cercetare pentru determinarea prezenței și/sau cantității de acid oxalic și pentru utilizare în degradarea acidului oxalic prezent în alimente, băuturi și procese comerciale. De exemplu, oxalat decarboxilaza bacteriană a fost folosită de către industria berii (US 4652452) și așa cum se expune aici, oxalatul, de asemenea, poate fi degradat folosind oxalat oxidaza.
Un obiect al prezentei invenții este asigurarea mijloacelor pentru degradarea acidului oxalic din plante.
Conform prezentei invenții, aici se asigură un ADNc derivat de la ARN-ul care codifică o enzimă oxalat oxidază și care are secvența ADN din fig.1, variațiile din aceasta permise prin degenerarea codului genetic și ADN-ului genomic la care numitul ADNc hibridizează.
Invenția prezintă o enzimă care are capacitatea de a degrada oxalatul, caracterizată printr-o subunitate unică de aproximativ 25 kilodaltoni și,în special, o oxalat oxidază substanțial pură pentru folosire în tratamentul plantelor pentru a degrada acidul oxalic, de aici numita oxalat oxidază având secvența de aminoacizi arătată în fig.2 și caracterizată printr-un pH optim de 3,5 , o stabilitate termică pozitivă, o subunitate unică de aproximativ 25 kilodaltoni și stabilitate proteazică.
Numita oxalat oxidază poate fi formulată cu un purtător agronomic potrivit pentru eliberarea numitei oxalat oxidază către o plantă.
Prezenta invenție, de asemenea, asigură un procedeu pentru degradarea acidului oxalic dintr-o plantă, procedeu care cuprinde eliberarea către numita plantă a unei enzime care degradează acidul oxalic astfel încât să protejeze numita plantă de numitul acid oxalic.
De preferință, enzimă este oxalat oxidaza.
Eliberarea numitei enzime care degradează acidul oxalic poate fi efectuată prin aplicarea la plantă sau la locul de cultură a plantei, a numitei enzime în combinație cu un purtător agricol acceptabil, sau, alternativ, prin transformare genetică a genomului plantei cu o genă care codifică numita oxalat oxidază.
în continuare, invenția asigură o metodă pentru reducerea oxalatului în țesutul plantei, metodă care cuprinde încorporarea stabilă în genomul plantei a unei gene
150
155
160
165
170
175
180
185
190
195
RO 114979 Bl care codifică enzima oxalat oxidază, de exemplu, prin transformare genetică.
Un construct genetic potrivit pentru acest scop poate cuprinde o secvență promotor, o peptidă de tranzit, o secvență structurală de genă care codifică numita enzimă oxalat oxidază și o secvență terminator de genă.
De asemenea, prezenta invenție asigură o celulă transformată de plantă care cuprinde o genă pentru expresia oxalat oxidazei. Numita genă poate avea secvența din fig.1. Mai mult, invenția asigură o metodă de combatere a patogenezei plantelor infectate cu un fung care secretă acid oxalic, metodă care cuprinde încorporarea stabilă în genomul numitei plante, prin transformare, a unei gene care codifică oxalat oxidaza.
Exemple de genuri fungice care secretă acid oxalic sunt: Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Rhizoctonia, Whetzelinia și Schizophyllum.
Un fung de interes special în această invenție care infectează, de exemplu, floarea- soarelui (Helianthus Annuus] este Sclerotinia sclerotorum.
Astfel, în termeni generali, prezenta invenție este, în linii mari, direcționată spre înțelegerea și aprecierea folosirii unei enzime care degradează oxalatul, exemplificată prin oxalat oxidază pentru folosiri comerciale, cum ar fi, industria berii sau pentru folosiri agronomice cum ar fi, reducerea susceptibilității unei plante la acidul oxalic sau pentru a reduce concentrația endogenă a secreției de acid oxalic într-o plantă.
Inventatorii au apreciat și cunoscut în cele de față, în special pentru aplicarea agronomică, folosirea enzimelor care degradează oxalatul pentru a reduce mortalitatea plantelor sau distrugerea prin boli sau alt fenomen în care acidul oxalic joacă un rol invaziv critic. De asemenea, inventatorii au apreciat că folosirea acestei inevnții poate avea ca rezultat prevenirea mortalității și infecției plantei în bolile în care acidul oxalic este critic. Astfel de boli sunt cauzate în special, printre altele, de către genuri specifice de fungi menționate deja.
Aprecierea noilor folosiri ale enzimelor care degradează oxalatul este mărită în special prin inventarea și realizarea de către inventatori a faptului că proprietățile fizico-chimice ale oxalat oxidazei de orz, așa cum au fost prezentate în literatură, au fost inexacte. în conformitate, inventatorii au caracterizat și purificat substanțial o enzimă oxalat oxidază care nu a fost încă descrisă. într-adevăr, purificările substanțiale au arătat că enzima, așa cum este menționată în literatură, aici este prezentată a fi incorectă. Specific, inventatorii prezintă o enzimă oxalat oxidază substanțial pură, care are o compoziție aminoacidă totală specială, prezentată în fig. 2, un pH optim de 3,5, un punct izoelectric neutru, stabilitate termică pozitivă, stabilitate proteazică și o subunitate unică de aproximativ 25 kilodaltoni.
De asemenea, aici se menționează că invenția este a unei gene substanțial pure care codifică o enzimă oxalat oxidază, cu o secvență ADN specifică, așa cum se arată în fig. 1. Gena codifică enzima oxalat oxidază care are caracteristicile menționate mai sus. în particular, gena codifică o enzimă care prezintă activitate oxalat oxidazică având o subunitate unică de aproximativ 25 kilodaltoni, care reacționează specific cu anticorpii produși împotriva oxalat oxidazei de orz purificată și are o secvență de aminoacizi prezentată în fig.2.
De asemenea, invenția prezintă compuși pentru folosire în combaterea patogenezelor vegetale, compuși care includ produse chimice prezentând activitate de degradare a acidului oxalic în special activitate oxalat oxidazică. Specific, compusul are activitate oxalat oxidazică într-o cantitate suficientă pentru a distruge acidul oxalic produs de către patogeni.
RO 114979 Bl
250
Se va aprecia că altă folosire agronomică pentru un astfel de compus este de a combina compușii cu un purtător corespunzător,care este agronomic acceptabil, permițând eliberarea compusului direct către plantă sau în sol.
Aici, este de asemenea prezentată o celulă transformată de plantă, celulă care este transformată printr-o genă care codifică expresia oxalat oxidazei sau altei enzime care degradează oxalatul. Gena care codifică o astfel de enzimă poate să includă secvența ADN menționată în fig. 1, care corespunde substanțial enzimei oxalat oxidază ce a fost substanțial purificată de către inventator.
Aici se prezintă o metodă pentru asigurarea protecției împotriva acidului oxalic pentru o plantă care necesită protecție față de un astfel de acid oxalic. Metoda include asigurarea unei enzime care degradează acidul oxalic într-o cantitate suficientă pentru a proteja planta de acidul oxalic la o plantă care are nevoie de o astfel de protecție. De preferință, enzima care degradează acidul oxalic este oxalat oxidaza codificată printr-o genă având structura din fig. 1. Metodologia pentru asigurarea unei astfel de protecții poate lua o mulțime de forme,incluzând transformarea unei plante cu o genă care codifică o enzimă care degradează acidul oxalic și în particular codifică oxalat oxidaza. Alternativ, metoda poate include asigurarea unei enzime care degradează acidul oxalic în combinație cu un purtător agronomic acceptabil pentru aplicare direct la o plantă sau pe solul pe care crește planta.
Oxalat oxidaza purificată a acestei invenții, folosirea sa ca agent pentru combaterea patogenezelor și folosirea sa în transformarea celulelor plantelor asigură o soluție inovativă și unică pentru combaterea bolilor plantelor în care acidul oxalic este un component critic în timpul patogenezei sau în stadiul de invazie. Desigur, este binecunoscut că activitatea enzimei oxalat oxidază este cea prin care ea contribuie la degradarea acidului oxalic. Pe de altă parte, au fost inventatori care au apreciat de la început că prin atacarea acidului oxalic prin degradare, de exemplu, prin degradare enzimatică, ar putea rezulta un avantaj agricol semnificativ în conferirea rezistenței la boală împotriva acelor boli în care acidul oxalic joacă un rol critic. Această invenție aduce o speranță deosebită, deoarece o mare pierdere în cultivarea comercială a plantelor agronomice importante, ca de exemplu, floarea-soarelui, este produsă prin specii fungice precum Sclerotinia care secretă acidul oxalic.
Avantajele intuiției inventatorilor pot fi exploatate fie prin transformarea plantei, fie prin aplicarea oxalat oxidazei ca un pesticid tradițional, cel mai probabil în combinație cu un purtător adecvat care este acceptat din punct de vedere agricol. Unul din cele mai importante avantaje ale utilizării oxalat oxidazei ca pesticid este faptul că prezintă calități ecologice, nu poluează și nu este dăunător plantei.
Dacă se va folosi o aplicare externă a enzimei pentru a proteja o plantă sau o parte a plantei împotriva patogenilor, ar fi de așteptat ca enzima să fie diluată pentru a forma o soluție sau suspensie lichidă sau să fie amestecată cu un diluent solid pentru a se aplica ca pulbere. Natura precisă a aplicării va depinde în parte de patogenul (patogenii) și planta (plantele) vizate. Metode detaliate pentru adaptarea metodelor generale de aplicare la recolte și patogeni specifici pot fi găsite în “Methods for evaluation pesticides for control of plant pathogens”, K.D.Hicky, ed., The American Phytopathological Society, 1986. Adjuvanți care pot fi adăugați la formulare includ agenți de ajutor pentru solubilizare, agenți de udare și stabilizatori, sau agenți pentru microîncapsulare. Astfel de adjuvanți sunt binecunoscuți în domeniu.
Aplicările externe pot folosi de asemenea microorganisme recombinante, fie în formă viabilă, fie într-o convertire într-o formă neviabilă printr-o metodă care să nu inactiveze enzima.
255
260
265
270
275
280
285
290
RO 114979 Bl
Deși stadiul tehnicii raportează oxalat oxidaza purificată și caracterizată, inventatorii au descoperit că astfel de lucrări din literatură au fost incorecte și că, de fapt, enzima nu a fost niciodată caracterizată și purificată propriu-zis. Se va aprecia că așa cum se folosește aici, “oxalat oxidază” se referă la forma purificată și caracterizată a enzimei, așa cum s-a menționat aici, cu excepția cazurilor când s-a specificat expres altfel. Diferențele existente între lucrările existente în literatură și enzima purificată și caracterizată în invenția de față sunt menționate aici în detaliu și pot fi pe scurt observate în tabelul 1.
Impuritatea preparatelor de oxalat oxidază accesibile comercial,precum și caracterizarea improprie a enzimei în literatură au fost evidente atunci când inventatorii au purificat pentru prima oară oxalat oxidază din semințe de orz germinate. S-au folosit două proceduri. într-un caz, purificarea oxalat oxidazei din semințe de orz germinate a cuprins omogenizarea țesutului înghețat în 1...4 volume de apă și purificarea din extractul apos folosind filtrarea prin tifon pentru îndepărtarea sfărâmăturilor. Soluția a fost în continuare purificată prin centrifugare la 18000 g pentru 30 min, urmată de tratament termic la 80°C pentru 3 min, cu îndepărtarea precipitatelor în ambele etape; precipitarea proteinei din supernatantul saturat între 30% și 70% considerând că sulfatul de amoniu (NH4)2S04 s-a colectat prin centrifugare și a fost dializat față de apă. Etapa de resolubilizare a proteinei din precipitatul de sulfat de amoniu s-a fracționat pe un sistem Pharmacia FPLC folosind o coloană Mono S 10/10 echilibrată cu 25 mM acetat de potasiu, pH 4,8, eluată cu un gradient de 0,0 până la 0,4 M NaCI în același tampon. Activitatea oxalat oxidazei s-a măsurat prin metoda Sugiura, et al (1979), Clem. Pharma. Bull. 27(9); 2003. Fracțiunile vârf ale oxalat oxidazei au fost combinate, echilibrate cu tamponul slab de sare de acetat de potasiu cu pH 4,8 și re-cromatografiate pe FPLC folosind o coloană Mono S 5/5 eluată cu tampoanele și gradientul NaCI ca mai sus. Fracțiunile de vârf de la etapa Mono S 5/5 s-au combinat, s-au echilibrat cu 25 mM Tris-CI, pH 7,6 , s-au aplicat pe o coloană Mono Q 5/5 și s-au eluat cu un gradient NaCI de la 0,0 la 0,4 m. Electroforeze în gel de poliacrilamidă-dodecilsulfat de sodiu ale fracțiunilor de vârf ale activității oxalat oxidazei au arătat benzi proteice proeminente pe colorații cu argint la aproximativ 25 și 38-40 kilodaltoni.
Următoarea mărime fracționată a proteinei native pe o coloană de filtrare în gel Superose-12 (echilibrată cu 50 mM acetat de potasiu, pH 4,8) pe FPLC a arătat vârf de activitate bine definit cu greutate moleculară de aproape 25000 care eluează la un timp corespondent. Nu s-a găsit nici o activitate oxalat oxidazică care eluează în orice alte fracțiuni asociate cu alte greutăți moleculare.
O a doua metodă cuprinde folosirea extracției cu detergent. Semințe de orz germinate de 4...7 zile s-au pulverizat în prezență de azot lichid și s-au depozitat la 80°C. Păstrarea în aceste condiții nu a condus aparent la nici o pierdere de activitate. Țesutul depozitat s-a omogenizat cu apă distilată care conține 0,5% sare de taurodeoxicolat de sodiu, s-a filtrat și s-a centrifugat. Proba de oxalat oxidază din două fracțiuni (supernatant și depunere) arată că ambele fracțiuni posedă activitate. în conformitate, depunerea s-a extras cu apă distilată care conține 0,5% taurodeoxicolat. După dialize exhaustive față de apă distilată,s-a adăugat sulfat de amoniu pentru a concentra și fracționa proba de supernatant solubilă. Proteinele precipitate (fracțiunile 30...70% sulfat de amoniu) au fost apoi resuspendate într-un volum mic de apă distilată care conține detergent și au fost desalinizate pe o coloană mică de gel de permeație (Sephadex G25). Fracția activă s-a aplicat pe o coloană schimbătoare de anion (DEAE) folosind un tampon Tris-BC1, pH 7,5 și eluarea proteinei legate s-a efectuat folosind
RO 114979 Bl
345 un gradient de clorură de sodiu. Fracția enzimatic activă a fost concentrată, desalinizată și apoi s-a aplicat pe o coloană Mono-Q (Pharmacia). S-a folosit din nou un gradient de clorură de sodiu pentru a elua proteinele. Probele de activitate au arătat că oxalat oxidaza s-a concentrat în trei fracțiuni. După analize ale acestor fracțiuni prin electroforeze pe gel de SDS-poliacrilamidă, activitatea s-a determinat a fi asociată cu o polipeptidă de greutate moleculară de aproape 25 kilodaltoni.
După purificarea, caracterizarea oxalat oxidazei purificată, s-au efectuat preparate omogene de oxalat oxidază. Așa cum deja s-a indicat și se arată în tabelul 1, proprietățile proteinei rezultată din această purificare diferă în totalitate de cele descrise în literatură. Aceasta sugerează că în ciuda așteptărilor altor specialiști în domeniu, până în prezent nu au fost încercări ale inventatorilor pentru a purifica enzima oxalat oxidază astfel încât această enzimă să fie descrisă propriu-zis pentru elucidarea proprietăților ei fizico-chimice.
Rezultatele caracterizării fizico-chimice experimentată de inventatori sunt expuse în tabelul 1. Pentru comparare, este expusă de asemenea caracterizarea enzimei raportată la literatura existentă.
Tabelul 1
350
355
360
Proprietățile oxalat oxidazei
| Prnnrietate | Literatură | Invenție |
| pH optim | 3,5 | 3,5 |
| Stabilitate termică | + | + |
| Număr de subunități | 2 | 1 |
| Mărime | 75 k | 25 k |
| pH | 2,8 | aprox. 7 |
| Cofactori | - | - |
| Stabilitate proteazică | necunoscută | + |
| Memb. Asoc. | neclar | + |
365
370 în tabelul 2 poate fi văzută distinctivitatea enzimei care prezintă activitate oxalat oxidazică stabilită în continuare de inventatori. Tabelul 2 evidențiază în totalitate că această invenție stabilește o compoziție de aminoacizi diferită de cea raportată în literatură. Vezi, Chiribiga, J.(1966) Archives of Biochemistry and Biophysics 116, 516-523.
Tabeul 2
375
| Aminoacid | Invenție | Literatură |
| Ăsp | 12,53 | 8,44 |
| Ser | 8,65 | 6,50 |
| Gly | 13,31 | 10,75 |
| Glu | 7,42 | 6,80 |
| Thr | 8,10 | 5,18 |
| Ala | 7,93 | 7,85 |
| Val | 8,41 | 6,40 |
| Met | 2,85 | 0 |
| Tyr | 0,98 | 0,93 |
| lle | 2,15 | 6,39 |
380
385
RO 114979 Bl
Tabelul 2 [continuare]
| Leu | 9,36 | - |
| Phe | 6,89 | - |
| His | 1,79 | 1,68 |
| Lys | 5,98 | 4,90 |
| Trp | - | - |
| Arg | 3,65 | 3,48 |
Oxalat oxidaza din semințe germinate de orz parțial purificată s-a solubilizat, s-a supus cromatografiei pe schimbătoar de cationi, folosind o coloană Mono S (acetat de potasiu 25 mM, pH 4,8 și s-a eluat cu gradient de clorură de potasiu de la O la 400 mM în același tampon). Proteina enzimatică activă recuperată a fost în continuare purificată prin electroforeze preparative în gel de poliacrilamidă-SDS. S-a detectat o singură bandă proteică de greutate moleculară de aproximativ 25 kilodaltoni și în continuare s-a tăiat din gel.
Bucățile de gel umed s-au fragmentat, s-au amestecat cu adjuvanți Freund și s-au injectat intramuscular în partea din spate a mușchiului coapsei lângă șold, la iepuri. Iepurii au fost asigurați cu cantități suplimentare de proteină și s-au urmărit probe din sânge pentru a se asigura producția de anticorpi specifici oxalat oxidază. După aproximativ 4 luni, animalele au fost exsanguinate. Titrul anticorpilor policlonali de iepure produși a fost foarte ridicat.
Gena care codifică pentru oxalat oxidaza derivată de la orz care are structura arătată în fig.1 s-a donat cum se prezintă în fig.4, folosind un stoc de ADNc construită de la orz încolțit. S-a preparat ARN-ul total din orz încolțit. ARN-ul poliadenilat s-a recuperat apoi din ARN-ul total și s-a folosit pentru sintezele ADNc-ului. Atât ARNul total, cât și cel poliadenilat s-au preparat folosind extracte de ARN accesibile comercial și truse pentru purificarea ARNm conform instrucțiunilor standard asigurate cu aceste truse. (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.). Construcția de stocuri a fost procurată din comerț (Clontech Laboratories). Vectorul ales pentru stoc a fost lambda gt 22. Folosirea acestui vector de expresie a fost aleasă pe baza titrului înalt și specificității antiserului oxalat oxidază. Oricare vector de expresie ales pentru folosire cu această conversie este avantajos pentru vector să permită folosirea unei cercetări imunologice a clonelor ADNc de oxalat oxidază. Pe baza mărimii medii a insertului de 1,8 kilobaze pentru stocul ADNc și o bună reprezentare ca număr a clonelor independente (1,7x106), s-a dedus că stocul ar conține o clonă ADNc pentru proteina oxalat oxidază în mărime de aproximativ 25 kilodaltoni.
Cercetarea inițială a stocului s-a realizat cu antiser pentru oxalat oxidază conform procedurilor standard, ca cele menționate de exemplu în Huynh, T., et al., (1985) DNA Cloning Techniques: A Practicai Approach”, D.GIover, ed.lRL Press, □xford. De atunci încoace, s-au obținut informații despre secvența aminoacizilor Nterminali a proteinei mature oxalat oxidază (exceptând restul N-terminal), secvența Nterminală fiind de asemenea folosită pentru a confirma identitatea oricăror clone ADNc recuperate ca pozitive în cercetarea imunologică inițială. S-au cercetat cu antiser 1,2 x 106 plăci din stocul ADNc. S-au obținut 14 semnale potențial pozitive, dintre care unul a fost mai puternic decât altele. S-au realizat două runde secvențiale de re-cercetare cu antiser asupra acestor 14 clone în scopul obținerii confirmării pozitive a singurei plăci izolate care va fi caracterizată la nivel molecular. Placa numărul 12 a dat din nou cel mai puternic semnal prin aceste cercetări succesive.
RO 114979 Bl
440
Placa numărul 12a fost apoi folosită pentru a purifica anticorpul oxalat oxidază ca test al specificității semnalului de placă conform procedurii standard descrisă deja, de exemplu, în Hunyh.T. et al., supra. Anticorpul purificat din placa 12 s-a folosit ca probă pe o analiza Western a unui gel acrilamidic al proteinei oxalat oxidază. Anticorpul de placă purificat a reacționat specific cu oxalat oxidaza,prezentând o origine identică cu cea observată pentru anticorpul probă purificat.
Insertul (produsul ADNc donat în vectorul lambda gt 22) de pe placa 12 s-a recuperat folosind metodele standard PCR cum este exemplificat în Ausubel, F.M. et al., ads., (1988). “The Polymerase Chain Reaction”, în “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing Associates and Wiley Intrescience, New York, pp.15.0.115.4.6. Insertul în placa numărul 12 s-a estimat a fi 650...750 perechi de baze. Mărimea insertului în placa 12a fost compatibilă cu o proteină de aproximativ 25 kilodaltoni. Bazat pe mărimea estimată inițial pentru insertul ADNc și rezultatul purificării anticorpului de pe placă, placa numărul 12 a fost considerată cea mai bună pentru analizele moleculare ulterioare. Insertul numărul 12 preparat prin PCR a fost apoi reclonat într-o plasmidă vector mai adecvată pentru analiză. Insertul ADNc din clona numărul 12 a fost folosit de asemenea pentru o analiză Northern a ARN-ului de orz încolțit pentru a estima mărimea ARNm pentru oxalat oxidază. S-au efectuat electroforeze în gel de formaldehidă și transferul pe o membrană de nylon conform procedurilor recomandate de către furnizorul comercial al membranelor, firma Schleicher-Schuell. Proba numărul 12 a hibridizat la o singură specie ARNm cu lungimea de aproximativ 800-850 baze.
S-a realizat secvențierea dideoxinucleotidelor asupra insertului reclonat în placa numărul 12. S-a folosit o trusă de secvențiere T7 procurată din comerț (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) și s-a lucrat conform procedurii recomandate. Insertul ADNc de orz s-a determinat a fi de o lungime de aproximativ 90 baze cu câteva incertitudini în două mici regiuni care nu acoperă mai mult de 10 perechi de baze fiecare, terminația C și identitatea a trei baze N-terminale. Secvența nucleotidică a insertului clonei numărul 12 este prezentată schematic în fig. 1. Secvența parțială a proteinei a fost apoi anticipată din secvența nucleotidică a clonei 12 și s-a comparat cu secvența aminoacidică N-terminală obținută direct de la oxalat oxidaza purificată. Această comparație este arătată în fig.3.
Gena care are structura arătată în fig. 1 conține secvența de codificare pentru enzimă oxalat oxidază matură ce va fi atașată la elementele genetice regulatoare care sunt necesare pentru expresia genei structurale într-o celulă gazdă definită. Primul tip de element regulator necesar este o regiune promotor de genă, regiune care conține secvențe ADN recunoscute de către celula plantei și care induce transcripția secvenței ADN în ARN mesager (ARNm). ARN-ul mesager este apoi translat într-o proteină producătoare a codului pentru regiunea genei structurale. Promotorul este atașat în fața terminației 5’ a genei pentru oxalat oxidază care pote fi realizată conform metodelor standard cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, T.Maniatis, et al., (1982) “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 104-106. Regiunile promotor care pot fi folosite pentru expresia genei oxalat oxidazei în celulele plantei includ promotori care sunt activi într-o gamă largă de țesuturi diferite de plante. De exemplu, pentru acest scop poate fi adecvat promotorul 35S de la virusul mozaicului conopidei. Alt tip de promotor ce ar putea fi folosit în celulele plantelor este unul care exprimă sub mai multe condiții restrictive. Incluși în această clasă ar putea fi promotori activi numai într-un anumit țesut sau țesuturi ale plantei și/sau indus prin anumiți stimuli, cum ar fi rănirea. Un exemplu de acest tip de promotor ar fi regiunea
445
450
455
460
465
470
475
480
485
RO 114979 Bl regulatoare 5’ de la gene pentru fenilalaninamonilliaza (PAL). Acest tip de promotor este discutat în Liang, X. etal., (1989), PNAS, USA, 8:9284-9288. Expresia genei oxalat oxidazei în gazde bacteriene poate fi realizată prin folosirea promotorilor obținuți din surse bacteriene. Exemple de astfel de promotori ar include promotorul trp pentru expresie în bacterii precum E. Coli, cum este exemplificat în Amann, E., et al., (1983) Gene”, 25: 167-178, sau promotorul pentru expresia în drojdii al gliceraldehidfosfat dehidrogenazei (GAPO), așa cum este exemplificat în Edens.L., et al., (1984) Synthesis and Processing of the Plant Protein Thumatin in Yeast”, “Cell”, 37: 629633. Secvențele promotor de genă pot fi de asemenea derivate parțial sau în întregime de la secvențe promotor găsite în celule diferite de cele ale celulei gazdă, secvențe diferite ca lungime dacă ele îndeplinesc condițiile de transcripție și translație de mai sus.
Un al doilea element genetic regulator care este de dorit să fie atașat la gena oxalat oxidază, dar nu în mod necesar, este o secvență terminator sau de poliadenilare care promovează terminarea efectivă a transcripției genei și, la eucariote, promovează de asemenea poliadenilarea, prin adiția unui număr de adenozinnucleotide la capătul 3’ al ARNm. Pot fi folosite pentru a atașa regiunea terminator în spatele sau la capătul 3’ al genei metode standard cunoscute în domeniu (vezi, de exemplu, T.Maniatis, et al., pp. 104-106). Un exemplu de o astfel de secvență terminator poliadenilare pentru expresie în plante ar putea fi cea de la gena octopin sintază de la o plasmidă Ti de Agrobacterium tumefaciens cum s-a enunțat în H. De Greve et al., (1982), “Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid encoded octopine synthase gene”, J.Mol.AppI.Genet., 1: 499-511. Un exemplu de astfel de terminator pentru expresie în gazde bacteriene este secvența terminator de transcripție rho-independentă de la Salmonella typhi murium (de exemplu, M.E.Winkler, (1987), “Escherichia Coli and Salmonella typhi murium: Cellular and Molecular Biology”, F.C.Neidhardt, ed-in-chief; American Societyfor Microbiology. Secvențele terminator pot fi de asemenea derivate parțial sau în întregime de la secvențele terminator găsite în celule diferite de cele ale celulei gazdă, secvențe diferite ca lungime, dacă ele îndeplinesc condițiile de mai sus, terminarea transcripției și poliadenilare, necesare celulei gazdă.
Alt tip de element regulator care trebuie atașat la gena pentru oxalat oxidază este o secvență ADN care codifică pentru o peptidă semnal. Peptida semnal este atașată la terminația amino a proteinei și permite localizarea proteinei la peretele celular sau secreția ei din celula gazdă. în timpul acestui proces de localizare, peptida semnal se desprinde, producând un produs proteic cu secvența proteinei mature. Secvența ADN pentru secvența semnal este plasată între promotor și regiunea codificatoare. Pentru a atașa secvența ADN pentru peptida semnal pot fi folosite metode standard cunoscute în domeniu (vezi, de exemplu, Maniatis, T., et al., supra, pp. 104-1D6). Exemple de astfel de secvențe semnal includ peptida semnal de la o genă de lungime a plantelor (Chen, J. and Varner, J.E., “An extracellular matrix protein in plants: Characterization of a genomic clone for carrot extension”, EMBO J. 4: 2145-2151, (1985), de la gena bacteriană pe 1B (pectatliază) de Erwinia carotovora (Lei, S.P. et al., (1987), J.Bacteriol. 169 4379) și de la factorul prepro de drojdie (Smith, R.A., et al., Science 229: 1219-1229, 1985). Secvențele de peptidă semnal pot fi de asemenea derivate în întregime sau parțial de la secvențe terminator găsite în celule diferite de cele ale celulei gazdă, secvențe diferite ca lungime, dacă ele îndeplinesc condițiile de mai sus pentru producerea și localizarea proteinei în celula gazdă.
RO 114979 Bl
540
Pentru inserția genei oxalat oxidază într-o plantă gazdă pot fi folosite orice metode cunoscute pentru introducerea genelor străine în plante. Metodologia aleasă pentru a realiza transformarea plantei cu gena oxalat oxidazei va fi diferită în funcție de planta gazdă. Pe calea unui exemplu, se caracterizează metodologia ce ar putea fi folosită pentru transformarea plantei cu gena oxalat oxidazei prin intermediul transformării cu Agrobacterium.
Agrobacterium mediază transformarea folosind gena oxidazei conform procedurilor binecunoscute pentru această metodologie. Pentru început, se introduce într-o tulpină inofensivă de Agrobacterium tumefaciens, ca gazdă intermediară, o casetă genetică corespunzătoare pentru expresia în plante. Caseta genei oxalat oxidazei se introduce în regiunea T-ADN a unei plasmide recombinante care conține un marker de genă selectabil, precum o genă care codifică pentru neomicinfosfotransferaza II fosfocitrinacetil transferază «au altele asemănătoare. Această metodologie este menționată în multe publicații din literatură care includ Horsch, et al., (1985), “A Simple and General Method for Transferring Genes Into Plant”, Science, 227: 1229-1231. Bucăți de țesut de plantă, de exemplu frunză, cotiledon sau hipocotil, sunt incubate împreună cu bacteriile 2-3 zile, bacteriile fiind omorâte înainte cu antibiotice, precum carbenicilină. Suplimentar, s-au folosit antibiotice corespunzătoare pentru markerul selectabil incluse în mediul de cultură pentru țesutul plantei, astfel încât să crească numai celulele de plante transformate.
Plantele regenerate de la celulele transformate sunt apoi testate pentru prezența și expresia genei oxalat oxidazei. Pentru a identifica transformanții individuali pot fi folosite analize imuno și testul pentru activitatea oxalat oxidazei. Se poate folosi, de asemenea, toleranța la acid oxalic exogen, precum și un test funcțional al țesuturilor intacte.
Alte câteva metodologii aparținând transformării cu Agrobacterium sunt corespunzătoare pentru transformarea plantei. Exemple din aceste alte metode de eliberare DMA includ electroporarea, ca inducerea eliberării chimice în protoplaste, microinjectarea, precum și altele. Un exemplu de tipuri de plante care în mod deosebit nu sunt corespunzătoare transformării mediate de Agrobacterium sunt soia și câteva cereale incluzând porumbul. Aceste plante ar putea să beneficieze de transformare folosind alte metodologii decât tansformarea mediată de Agrobacterium.
Invenția prezintă avantajul utilizării enzimei oxalat oxidaza ca pesticid, conferind o metodă de degradare a acidului oxalic produs de fungi, ecologică, și care nu este dăunătoare plantei.
în continuare se prezintă exemplele de realizare a invenției, în conformitate cu figurile, care reprezintă:
- fig. 1, o secvență ADNc reversă obținută prin inginerie genetică de la ARNm, care codifică pentru oxalat oxidaza de la orz încolțit;
- fig. 2, secvența de aminoacizi translată de la ADNc din fig1.;
- fig.3, diagrama strategiei de donare folosită pentru a clona gena oxalat oxidază și descrisă în detaliu în exemplele 1 și 2 de mai jos;
- fig.4, diagrama stategiei de donare descrisă în exemplele 3 și 4 de mai jos;
-fig.5, structura plasmidei pVB1, și,
-fig.6, structura plasmidei pBin 191;
- fig.7, structura plasmidei p 19HYGA.
Exemplul 1. Construcția unui vector oxalat oxidază, nesecretor, pentu transformaea tomatelor (a) Reconstrucția unei oxalat oxidaze de lungime completă, având un cadru deschis de citire (ORF).
545
550
555
560
565
570
575
580
585
RO 114979 Bl
Se desemnează și sintetizează oligonucleotidele 1219901A și 1219901A (compl) pentru a forma un linker cu un sit Hind III la capătul 5’ și un sit Bsa I la capătul 3’;
oligonucleotida 1219901 A: 5’-AGCTTGATGGGTACCTCGGACCCAGACCCACTCCAGGACTTCTGCGTCGCGGACCTCG ATGGCAAGGCGGTCTCG-3' oligonucleotida 1219901A (COMPL) 5’-TCACCGAGACCGCCTTGCCATCGAGGTCCGCGACGCAGAAGTCCTGGAGTGGGTCTGG GTCCGAGGTACCCATCA-3’
Oligonucleotidele se normalizează și se, care conține oxalat oxidaza ORF matură, așa cum arată secvențierea peptidei.
După donarea Hind lll/Bsa I lincată în clona #22, se confirmă integritatea oxalat oxidazei ORF mature prin secvențierea And-ului.
(b) Inserția oxalat oxidazei ORF într-un vector de expresie.
Regiunea care codifică oxalat oxidaza matură se izolează de pe agaroză ca un fragment Hind III BamHI de 700 bp și se teșesc extremitățile cu ADN polimeraza T4. Se taie pNB33A cu Xbal și Pstl, se izolează de pe agaroză fagmentul vector și se teșesc extremitățile cu polimeraza T4.
Aceste două fragmente cu extremități teșite sunt ligate între ele pentru a produce clona pNBOXOXI. Orientarea corectă a regiunii care codifică oxalat oxidaza în interiorul pNOXOXI se confirmă prin secvențierea And-ului.
(c) Transferul casetei de expresie a oxalat oxidazei în pBin19Ri.
Se taie pBNOXOXI cu Hind III și parțial cu EcoRI. Se izolează de pe agaroză caseta de expresie de 1,9 kb și se donează în pNin19Ri (figura 6) tăiat cu EcoRI și Hind III pentru a da clona pN0X1.
Exemplul 2. Construcția unui vector oxalat oxidază, nesecretor, pentru transformarea florii -soarelui (a) Transferul casetei de expresie a oxalat oxidazei în pVB1.
Fragmentul EcoRI/Hind III de 2,1 kb, care conține caseta de expresie a oxalat oxidazei izolată de la pNBOXOXI, descris în exemplul 1 de mai sus, se donează în pVB1 (fig.5) tăiat cu EcoRI și Hind III pentru a dona pVBOXI.
Prezența casetei de expresie a oxalat oxidazei în clona pVBOXI se confirmă prin restricția ADN-ului plasmidei cu EcoRI și Hind III.
(b) Inserția genei rezistenței la higromicină în pVBOXI.
Un fragment Hind III de 2,3 kb care conține caseta rezistenței la higromicină se izolează de la p19HYG și se donează în pVBOXI tăiat cu Hind, III pentru a da clona pH0X1.
Prezența și orientarea casetei higromicinei în dona pH0X1 se confirmă prin digestia ADN-ului plasmidei cu EcoRI.
Exemplul 3. Construcția unui vector oxalat oxidază, secretor, pentru transformarea tomatelor (a) Producerea prin PCR a unei fuziuni peptidă extensivă de tranzit oxalat oxidază.
în scopul fuzionării oxalat oxidazei mature la o peptidă extensivă de tranzit se desemnează și sintetizează oligonucleotidele EXTOX-5 și EXTOX-3;
EXTOX-5: 5’-TTCAACTGGTACCATTTGTTTCAAAGATGGGAAAAATGGCTTCTCTATTTGCCACATTTTTA GTGGTTTTAGTGTCACTTAGCTTAGCTTCTGAAACCGACCCAGACCCACTCCAGGACTTC-3’
ETOX-3:
RO 114979 Bl
5'-CTATTAAATTCGCGGTACCTGGATATATAGAATTAC-3'.
Oligonucleotidele se folosesc ca primeri PCR cu pNBOXI ca matriță. Produsul rezultat EXTOX PCR de 771 bp conținând o peptidă extensivă de tranzit din 23 aminoacizi fuzionează în cadu la regiunea care codifică oxalat oxidaza matură și se taie cu Kpnl.
(b) Inserția produsului EXTOX PCR în pJR1 (pUC).
Produsul EXTOX PC supus digestiei Kpnl descris mai sus se donează în pJR1 (pUC) se taie cu Kpnl pentru a da clona pJEXTOXI. Orientarea și secvența produsului EXTOX PCR în pJEXTOXI se confirmă prin secvențierea ADN-ului.
(c) Transferul casetei de expresie EXTOX în pBin19i.
Caseta de expresie extensivă oxalat oxidază se izolează din pJEXTOXI ca un fragment EcoRI Hind lllde 1,5 kb și se donează în pBinl 9i tăiat cu EcoRI și Hind III pentru a produce clona pNEXTOXI.
Prezența casetei de expresie în pNEXTOXI se confirmă prin digestia ADN-ului plasmidei cu EcoRI și Hind III.
Exemplul 4. Construcția unui vector pentru oxalat oxidază, secretor, pentru transformarea florii-soarelui [a] Izolarea casetei de expresie pentru secreția și inserția în pVB1.
Se izolează caseta de expesie extensină/oxalat oxidază ca un fragment EcoRI/Hind III de 1,5 kb, de la pJEXTOXI și se donează în pVB1 tăiată cu EcoRI și Hind III pentru a produce dona pVEXTOXI.
Prezența casetei de expresie în pVEXTOXI se confirmă prin digestia ADN-ului plasmidei cu EcoRI și Hind III.
(b) Inserția genei de rezistență la higromicină în pVEXTOXI.
Un fragment Hind III de 2,3 kb care conține caseta de rezistență de la higromicină se izolează de la p19HYGș\ se donează în pVEXTOXI tăiat cu Hind III pentru a da clona pHEXTOXI. Prezența și orientarea casetei higromicinei în clona pHEXTOXI se confirmă prin digestia ADN-ului plasmidei cu EcoRI.
Claims (6)
1. Oxalat oxidază, având capacitatea de a degrada acidul oxalic, caracterizată prin aceea că, are secvența de aminoacizi din fig.2, un pH optim de 3,5, o stabilitate termică pozitivă, o subunitate de 25 kDalton și stabilitate proteazică.
2. Oxalat oxidază, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, poate fi folosită în tratamentul plantelor pentru a degrada acidul oxalic, prin administrarea unei formulări ce conține enzimă oxalat oxidaza, în combinație cu un purtător agricol acceptabil.
3. Procedeu de obținere a oxalat oxidazei într-o plantă, caracterizat prin aceea că, cuprinde încorporarea stabilă în genomul din celula plantei a genei care codifică enzimă oxalat oxidaza, reprezentată prin secvența de ADN din fig.1, prin transformare genetică, genomul plantei este transformat printr-un construct genetic care conține o secvență promotor, o peptidă de tranzit, o secvență structurală de genă care codifică enzimă oxalat oxidaza și o secvență terminator de genă, astfel încât planta poate elibera enzimă pentru degradarea acidului oxalic.
4. Procedeu, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, acidul oxalic poate fi produs de următorii fungi: Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Rhizoctonia, și Schizophyllum.
5. Procedeu, conform revendicării 4, caracterizat prin aceea că, acidul oxalic este secretat de fungul Sclerotinia sclerotorum.
6. Procedeu, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, planta este floarea-soarelui [Helianthus annuus).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65943491A | 1991-02-25 | 1991-02-25 | |
| PCT/GB1992/000331 WO1992014824A1 (en) | 1991-02-25 | 1992-02-24 | Newly characterised oxalate oxidase and uses therefor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO114979B1 true RO114979B1 (ro) | 1999-09-30 |
Family
ID=24645390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO93-01143A RO114979B1 (ro) | 1991-02-25 | 1992-02-24 | Oxalat oxidaza avand capacitatea de a degrada acidul oxalic si procedeu pentru obtinerea oxalat oxidazei in plante |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5866778A (ro) |
| EP (1) | EP0636181B1 (ro) |
| JP (1) | JPH06504914A (ro) |
| AT (1) | ATE197814T1 (ro) |
| AU (1) | AU656761B2 (ro) |
| BG (1) | BG61614B1 (ro) |
| BR (1) | BR9205664A (ro) |
| CA (1) | CA2107804C (ro) |
| DE (1) | DE69231588T2 (ro) |
| DK (1) | DK0636181T3 (ro) |
| ES (1) | ES2152225T3 (ro) |
| FI (1) | FI112800B (ro) |
| GB (1) | GB9203929D0 (ro) |
| GR (1) | GR3035217T3 (ro) |
| HU (1) | HU214357B (ro) |
| RO (1) | RO114979B1 (ro) |
| RU (1) | RU2136755C1 (ro) |
| WO (1) | WO1992014824A1 (ro) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2673644A1 (fr) * | 1991-03-05 | 1992-09-11 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn codant pour une oxalate oxydase et plantes transformees contenant cette sequence et resistantes au sclerotinia. |
| US6229065B1 (en) * | 1991-03-05 | 2001-05-08 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of plants resistant to attacks by Sclerotinia sclerotiorum by the introduction of a gene encoding an oxalate oxidase |
| JPH08503851A (ja) * | 1992-11-30 | 1996-04-30 | ゼネカ・リミテッド | シュウ酸脱炭酸酵素 |
| DE69332148T2 (de) * | 1992-12-07 | 2003-03-27 | Biogemma, Paris | Verwendung einer dna sequenz, kodierende für ein protein mit der fäligkeit oxalsäure abzubauen, zur genselektion |
| AUPM379294A0 (en) * | 1994-02-10 | 1994-03-03 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms |
| US6072050A (en) * | 1996-06-11 | 2000-06-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Synthetic promoters |
| US6297425B1 (en) | 1997-03-21 | 2001-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Gene encoding oxalate decarboxylase from aspergillus phoenices |
| US6166291A (en) * | 1997-07-18 | 2000-12-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Production of pathogen resistant plants |
| ZA986308B (en) * | 1997-07-18 | 1999-11-24 | Pioneer Hi Bred Int | The induction of stress-related factors in plants. |
| US7256325B1 (en) * | 1998-12-08 | 2007-08-14 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Methods for transforming plants |
| GB9828201D0 (en) * | 1998-12-21 | 1999-02-17 | Zenco No 4 Ltd | Genetic modification of compositae |
| US7456335B2 (en) * | 2001-09-03 | 2008-11-25 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants |
| FR2844142B1 (fr) * | 2002-09-11 | 2007-08-17 | Bayer Cropscience Sa | Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree |
| FR2848064B1 (fr) * | 2002-12-06 | 2006-01-13 | Bayer Cropscience Sa | Plantes legumineuses transplastomiques fertiles |
| FR2848570B1 (fr) | 2002-12-12 | 2005-04-01 | Bayer Cropscience Sa | Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant |
| US20070154565A1 (en) * | 2004-07-13 | 2007-07-05 | Zaghmout Ousama M | Method for control of insects on plants and plant tissue |
| JP5199077B2 (ja) | 2005-06-10 | 2013-05-15 | アルタス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | シュウ酸オキシダーゼ結晶の投与による、シュウ酸塩濃度を低下させるための方法 |
| CN103272225B (zh) | 2006-08-02 | 2018-05-22 | 味之素阿尔西亚有限公司 | 结晶化的草酸脱羧酶和使用方法 |
| AR074941A1 (es) | 2009-01-07 | 2011-02-23 | Bayer Cropscience Sa | Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion |
| US20110191903A1 (en) | 2009-12-31 | 2011-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Engineering plant resistance to diseases caused by pathogens |
| US9714456B2 (en) | 2013-01-18 | 2017-07-25 | Allena Pharmaceuticals, Inc. | Crystallized oxalate decarboxylase and methods of use |
| JP6574414B2 (ja) | 2013-06-07 | 2019-09-11 | アレナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 透析のための組成物、方法、および器具 |
| WO2016161455A2 (en) | 2015-04-02 | 2016-10-06 | Captozyme, Llc | High efficiency oxalate-degrading enzymes for degradation of insoluble and soluble oxalate |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4143486A (en) * | 1977-09-15 | 1979-03-13 | Research Corporation | Hybrid wheat |
| US4455371A (en) * | 1982-03-03 | 1984-06-19 | The Ohio State University Research Foundation | Oxalate oxidase composition for assay of oxalate |
| US4956282A (en) * | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
| WO1988008450A1 (en) * | 1987-05-01 | 1988-11-03 | Birdwell Finlayson | Gene therapy for metabolite disorders |
| FR2673644A1 (fr) * | 1991-03-05 | 1992-09-11 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn codant pour une oxalate oxydase et plantes transformees contenant cette sequence et resistantes au sclerotinia. |
-
1992
- 1992-02-24 CA CA002107804A patent/CA2107804C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-24 BR BR9205664A patent/BR9205664A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-02-24 DK DK92905348T patent/DK0636181T3/da active
- 1992-02-24 EP EP92905348A patent/EP0636181B1/en not_active Revoked
- 1992-02-24 HU HU9302252A patent/HU214357B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-02-24 RU RU93053766A patent/RU2136755C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1992-02-24 JP JP4504691A patent/JPH06504914A/ja active Pending
- 1992-02-24 DE DE69231588T patent/DE69231588T2/de not_active Revoked
- 1992-02-24 WO PCT/GB1992/000331 patent/WO1992014824A1/en active IP Right Grant
- 1992-02-24 RO RO93-01143A patent/RO114979B1/ro unknown
- 1992-02-24 AT AT92905348T patent/ATE197814T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-02-24 AU AU12074/92A patent/AU656761B2/en not_active Ceased
- 1992-02-24 ES ES92905348T patent/ES2152225T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-25 GB GB929203929A patent/GB9203929D0/en active Pending
-
1993
- 1993-08-24 FI FI933718A patent/FI112800B/fi not_active IP Right Cessation
- 1993-08-25 BG BG98069A patent/BG61614B1/bg unknown
-
1994
- 1994-07-11 US US08/272,514 patent/US5866778A/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-01-11 GR GR20010400033T patent/GR3035217T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BG98069A (bg) | 1994-06-30 |
| EP0636181A1 (en) | 1995-02-01 |
| BG61614B1 (bg) | 1998-01-30 |
| GR3035217T3 (en) | 2001-04-30 |
| WO1992014824A1 (en) | 1992-09-03 |
| CA2107804C (en) | 2002-04-30 |
| ATE197814T1 (de) | 2000-12-15 |
| DE69231588D1 (de) | 2001-01-04 |
| FI933718A0 (fi) | 1993-08-24 |
| DE69231588T2 (de) | 2001-03-29 |
| RU2136755C1 (ru) | 1999-09-10 |
| AU656761B2 (en) | 1995-02-16 |
| BR9205664A (pt) | 1994-06-07 |
| HUT67049A (en) | 1995-01-30 |
| JPH06504914A (ja) | 1994-06-09 |
| HU214357B (hu) | 1998-03-30 |
| DK0636181T3 (da) | 2000-12-27 |
| EP0636181B1 (en) | 2000-11-29 |
| ES2152225T3 (es) | 2001-02-01 |
| GB9203929D0 (en) | 1992-04-08 |
| AU1207492A (en) | 1992-09-15 |
| CA2107804A1 (en) | 1992-08-26 |
| HU9302252D0 (en) | 1993-11-29 |
| US5866778A (en) | 1999-02-02 |
| FI933718L (fi) | 1993-08-24 |
| FI112800B (fi) | 2004-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RO114979B1 (ro) | Oxalat oxidaza avand capacitatea de a degrada acidul oxalic si procedeu pentru obtinerea oxalat oxidazei in plante | |
| JP6675332B2 (ja) | ナス科に属するフィトフトラ抵抗性植物 | |
| Le Deunff et al. | Oxidative burst and expression of germin/oxo genes during wounding of ryegrass leaf blades: comparison with senescence of leaf sheaths | |
| ES2768523T3 (es) | Método para mejorar la tolerancia a la sequía en plantas | |
| WO1995021924A1 (en) | Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms | |
| US8889949B2 (en) | Method for increasing resistance of monocot plants against abiotic stresses, TPSP fusion enzyme gene constructs, and transformants | |
| Fan et al. | Transformation of LTP gene into Brassica napus to enhance its resistance to Sclerotinia sclerotiorum | |
| JPH08503851A (ja) | シュウ酸脱炭酸酵素 | |
| US20230031657A1 (en) | Compositions and methods for deterring feeding by psyllids | |
| JP2001502525A (ja) | 抗真菌タンパク質、これをコードするこのｄｎａ、およびこのｄｎａを組込む宿主 | |
| US20130305411A1 (en) | Method for conferring disease resistance to plant | |
| WO2005068625A1 (en) | Plants transformed for elevated levels of gallic acid and methods of producing said plants | |
| Meir et al. | Transforming a NEP1 toxin gene into two Fusarium spp. to enhance mycoherbicide activity on Orobanche—failure and success | |
| CZ289646B6 (cs) | Antimikrobiální proteiny, rekombinantní DNA, které je kódují, antimikrobiální prostředek, který je obsahuje, a způsob boje proti houbám či bakteriím | |
| CN119462877B (zh) | 砂梨中核糖体蛋白PpRPL12及其在提高植物抗病能力中的应用 | |
| KR20040003855A (ko) | 고추 한별 품종 (Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ.ｃｖ. Ｈａｎｂｙｕｌ)으로부터 유래한리피드트랜스퍼단백질 ＣＡＬＴＰ Ⅰ·ＣＡＬＴＰⅡ·ＣＡＬＴＰⅢ을 코딩하는 유전자 및 마커로서의 활용 | |
| CA2253245A1 (en) | Fungus resistant transgenic plants | |
| El-Habbak | Overexpression/silencing of selected soybean genes alters resistance to pathogens | |
| Ilett | The characterisation of barley and wheat oxalate oxidases expressed in transgenic plants | |
| Mugnozza et al. | Where do we go from this point | |
| CA2426948A1 (en) | Enhancement of freezing tolerance in transgenic plants |