ES2768523T3 - Método para mejorar la tolerancia a la sequía en plantas - Google Patents

Método para mejorar la tolerancia a la sequía en plantas Download PDF

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Abstract

Un método para producir una planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía que comprende: aplicar al menos un tratamiento de una cantidad efectiva de N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina dihidrato, o N-óxido de N,N-dimetildecilamina (DDAO) a una planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla, en donde la cantidad eficaz del TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es desde 0,1 a 10 g por litro de rociado o riego, o en donde el al menos un tratamiento es un tratamiento de semilla y la cantidad eficaz del TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es desde 0,1 g a 1000 g por 100 kg de semilla; y cultivar dicha planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla, en donde se produce una planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para mejorar la tolerancia a la sequía en plantas
Campo técnico
La invención se refiere a métodos para mejorar rasgos en plantas u organismos fotosintéticos, incluyendo tolerancia mejorada a la sequía.
Antecedentes
Cuando las plantas se exponen a condiciones en las que el contenido reducido de agua en el suelo debido a la escasez de lluvias o riego lleva a una absorción de agua deficiente, lo que se podría llamar condiciones de estrés por sequía, las funciones fisiológicas de las células se pueden deteriorar y de ese modo pueden surgir diversos trastornos en la planta. Cuando se someten a tal factor de estrés, las plantas presentan una variedad de respuestas mecanicistas como medidas de protección, con un efecto adverso resultante sobre el crecimiento, desarrollo, y productividad. Comúnmente se observan pérdidas significativas en la calidad y el rendimiento.
Si bien se ha sabido que las fitohormonas y algunas sustancias químicas tales como reguladores del crecimiento vegetal tienen efectos sobre las plantas en la reducción del estrés por sequía tal como estrés por sequía o estrés por humedad excesiva (véase Journal of Plant Growth Regulation (2010) 29: 366-374), esos efectos no son necesariamente satisfactorios en la práctica. Por ejemplo, los osmolitos orgánicos son pequeños solutos utilizados por las células de numerosos organismos y tejidos sometidos a estrés por agua para mantener el volumen celular. Compuestos similares son acumulados por algunos organismos sometidos a estrés anhidrobiótico, térmico y posiblemente presión. Estos solutos son aminoácidos y derivados, polioles y azúcares, metilaminas, compuestos de metilsulfonio y urea. A excepción de la urea, a menudo se llaman "solutos compatibles", un término que indica la falta de efectos perturbadores sobre macromoléculas celulares y que implica intercambiabilidad. Sin embargo, no siempre pueden existir estas características, y el uso práctico no puede darse por hecho ya que los niveles altos pueden causar la sobreestabilización de proteínas y algunas propiedades protectoras de los osmolitos son perjudiciales en ausencia de un perturbador por compensar (Yancey, PH (2005). J. Exp Biol 208 (Pt 15): 2819-30). Por ejemplo, el osmolito glicinabetaína (betaína) proporciona osmoprotección en bacterias, plantas y animales, y protege los componentes celulares contra condiciones duras in vitro, sin embargo, la manipulación genética de la producción de betaína en tres especies diferentes que carecen de ella, Arabidopsis, Brassica napus y tabaco (Nicotiana tabacum), mediante la expresión constitutiva de un gen de colina oxidasa bacteriana solo confirió una tolerancia moderada al estrés en algunas pero no todas las líneas transgénicas productoras de betaína y las respuestas al estrés tal como por salinidad, sequía, y congelación fueron variables entre las tres especies. Por otra parte, se observó un costo de adecuación en las tres especies (Jun H, Hariji et al Physiol Plant (2000) 122: 747-56). También se ha usado betaína para producir una planta tolerante a la sequía en los documentos WO 96/41532 A1, WO 95/35022 A1 y WO 97/08951 A1 y se ha ha usado cloruro de colina para el mismo fin en el documento US 6455 468 B1. El documento ES 2 347 399 A1 muestra que TMAO es útil para aumentar la resistencia al frío y el documento US 2013/130902 A1 divulga que con el fin de aumentar la biodisponibilidad de silicato, se puede formular un silicato de metal alcalino en presencia de un primer y un segundo compuesto osmolito (compuesto N-metilado) tal como TMAO, y un tercer compuesto osmolito.
En consecuencia, se necesitan estrategias alternativas para producir plantas tolerantes al estrés por sequía.
Compendio de la invención
Las siguientes realizaciones y aspectos de las mismas se describen e ilustran junto con los sistemas, herramientas y métodos, que están destinados a ser ejemplares e ilustrativos, no limitantes en su alcance.
En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para producir una planta u organismo fotosintético tolerante al estrés por sequía que comprende:
aplicar al menos un tratamiento de una cantidad efectiva de N-óxido de trimetilamina (TMAO); N-óxido de trimetilamina dihidrato, N-óxido de N,N-dimetildecilamina (DDAO) a una planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla; en donde la cantidad eficaz de TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es desde 0,1 a 10 g por litro para rociado o irrigación, o en donde el al menos un tratamiento es un tratamiento de semilla y la cantidad eficaz del TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es desde 0,1 g a 1000 g por 100 kg de semilla; y cultivar dicha planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla, en donde se produce una planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía.
Varias realizaciones se exponen en la Descripción Detallada según lo dispuesto en la presente memoria y según lo realizado en las reivindicaciones. Se debe entender, sin embargo, que este Compendio no contiene todos los aspectos y realizaciones de la presente invención, no está destinado a ser limitante o restrictivo de manera alguna, y que la/s invención/es como se describe en el presente documento la/s entenden los expertos en la materia para abarcar mejoras y modificaciones evidentes a la misma.
Las ventajas adicionales de las presentes invenciones serán fácilmente evidentes a partir del siguiente debate, particularmente cuando se toma junto con los dibujos acompañantes y las listas de secuencias.
Breve descripción de las listas de secuencias
SEQ ID NO: 1 divulga la secuencia de ácido nucleico At FMO GS-OX5 (NM_101086.4|) (At1g12140).
SEQ ID NO: 2: divulga la secuencia de aminoácidos At FMO GS-OX5 (NM_101086.4|) (At1g12140).
SEQ ID NO: 3 divulga la secuencia de ácido nucleico Br FMO GS-OX1 (FJ376070,1).
SEQ ID NO: 4 divulga la secuencia de aminoácidos Br FMO GS-OX1 (FJ376070,1).
SEQ ID NO: 5 divulga la secuencia de ácido nucleico Cs FMO GS-OX3 (XM_004150596.1) (LOC101212991).
SEQ ID NO: 6 divulga la secuencia de aminoácidos Cs FMO GS-OX3 (XM_004150596.1) (LOC101212991).
SEQ ID NO: 7 divulga la secuencia de ácido nucleico Cs FMO GS-OX3 (XM_004150602.1) (LOC101220318).
SEQ ID NO: 8 divulga la secuencia de aminoácidos Cs FMO GS-OX3 (XM_004150602.1) (LOC101220318).
SEQ ID NO: 9 divulga la secuencia de ácido nucleico Cs FMO GS-OX3 (XM_004170413.1) (LOC101220079).
SEQ ID NO: 10 divulga la secuencia de aminoácidos Cs FMO GS-OX3 (XM_004170413.1) (LOC101220079).
SEQ ID NO: 11 divulga la secuencia de ácido nucleico Cs FMO GS-OX3 (XM_004164404.1) (LOC101227975). SEQ ID NO: 12 divulga la secuencia de aminoácidos Cs FMO GS-OX3 (XM_004164404.1) (LOC101227975).
SEQ ID NO: 13 divulga la secuencia de ácido nucleico Mt FMO GS-OX5 (XM_003611223.1) (MTR_5g012130). SEQ ID NO: 14 divulga la secuencia de aminoácidos Mt FMO GS-OX5 (XM_003611223.1) (MTR_5g012130).
SEQ ID NO: 15 divulga la secuencia de ácido nucleico Os FMO (NC_008403.2).
SEQ ID NO: 16 divulga la secuencia de aminoácidos Os FMO (NP_001065338.1).
SEQ ID NO: 17 divulga la secuencia de ácido nucleico Vv FMO GS-OX3-3 (XM_003631392.1) (LOC100255688). SEQ ID NO: 18 divulga la secuencia de aminoácidos Vv FMO GS-OX3-3 (XM_003631392.1) (LOC100255688). SEQ ID NO: 19 divulga la secuencia de ácido nucleico Vv FMO GS-OX3-2 (XM_003631391.1) (LOC100255688). SEQ ID NO: 20 divulga la secuencia de aminoácidos Vv FMO GS-OX3-2 (XM_003631391.1) (LOC100255688). SEQ ID NO: 21 divulga la secuencia de ácido nucleico Vv FMO GS-OX3-2 (XM_003635084.1) (LOC100242032). SEQ ID NO: 22 divulga la secuencia de aminoácidos Vv FMO GS-OX3-2 (XM_003635084.1) (LOC100242032). SEQ ID NO: 23 divulga la secuencia de ácido nucleico Gh FMO-1 (DQ122185.1).
SEQ ID NO: 24 divulga la secuencia de aminoácidos Gh FMO-1 (DQ122185.1).
SEQ ID NO: 25 divulga la secuencia de ácido nucleico Zm FMO (NM_001157345.1).
SEQ ID NO: 26 divulga la secuencia de aminoácidos Zm FMO (NP_001150817.1).
SEQ ID NO: 27 divulga la secuencia de ácido nucleico Pt FMO GS-OX(XM_002329873.1).
SEQ ID NO: 28 divulga la secuencia de aminoácidos Pt FMO GS-OX(XM_002329873.1).
SEQ ID NO: 29 divulga la secuencia de ácido nucleico Pt FMO GS-oX (XM_002318967.1).
SEQ ID NO: 30 divulga la secuencia de aminoácidos Pt FMO GS-OX(XM_002318967.1).
SEQ ID NO: 31 divulga la secuencia de ácido nucleico Pt FMO GS-oX (XM_002329874.1).
SEQ ID NO: 32 divulga la secuencia de aminoácidos Pt FMO GS-OX(XM_002329874.1).
SEQ ID NO: 33 divulga la secuencia de ácido nucleico Gm FMO (NM_003538657.1).
SEQ ID NO: 34 divulga la secuencia de aminoácidos Gm FMO (XP_003538705.1).
SEQ ID NO: 35 divulga la secuencia de ácido nucleico Sl FMO GS-OX(XM_004241959.1) (LEFL1075CA11).
SEQ ID NO: 36 divulga la secuencia de aminoácidos Sl FMO GS-OX(XP_004242007.1) (LEFL1075CA11).
SEQ ID NO: 37 divulga la secuencia de ácido nucleico Sl FMO GS-oX (SGN-U584070) (Solyc06g060610).
SEQ ID NO: 38 divulga la secuencia de aminoácidos Sl FMO GS-OX(SGN-U584070) (Solyc06g060610).
SEQ ID NO: 39 divulga la secuencia de ácido nucleico Hs FMO-3 (NC_000001.10 (171,060,018..171,086,961)). SEQ ID NO: 40 divulga la secuencia de aminoácidos Hs FMO-3 (NP_001002294.1).
SEQ ID NO: 41 divulga la secuencia de ácido nucleico Oc FMO-3 (NC_013681.1).
SEQ ID NO: 42 divulga la secuencia de aminoácidos Oc FMO-3 (NP_001075714.1).
SEQ ID NO: 43 divulga la secuencia consenso de la SEQ ID No. de polipéptidos de 2 a 38.
SEQ ID NO: 44 divulga la 5'UTR en combinación con la secuencia de ADN de AtFMO GS.
Breve descripción de las figuras
Las figuras acompañantes, ilustran algunas, pero no las únicas o exclusivas realizaciones, y/o características de ejemplo. Se pretende que las figuras y realizaciones divulgadas en este documento se consideren ilustrativas en vez de limitantes.
La Figura 1 muestra desde la izquierda, plantas de tomate regadas con agua y a la derecha, plantas regadas con TMAO dihidrato 5,5 g/l después de la recuperación de la sequía.
La Figura 2 muestra un árbol filogenético basado en las similitudes de proteínas utilizando el algoritmo de alineamiento libre, llamado CLUSS, para agrupar familias de proteínas de las secuencias de polipéptido de FMO de Arabidopsis thaliana, vid, Populus trichocarpa, arroz, soja, melón, tomate, sorgo, maíz, trigo, cebada, conejo y ser humano.
La Figura 3 muestra, desde la parte inferior, plantas de Arabidopsis thaliana Col-0 (etiquetadas Col-0) de tipo salvaje, en el medio (etiquetas FOM X3), plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan tres copias de la secuencia At FMO GS-OX5 y en el panel superior plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana (etiquetadas FOM X8) que sobreexpresan ocho copias de la secuencia At FMO GS-OX5 después de la recuperación de la sequía.
La Figura 4a es un mapa de una construcción de ADN que puede utilizarse para obtener plantas de Arabidopsis thaliana para la sobreexpresión constitutiva de la secuencia At FMO GS-OX5, que incluye (de 5' a 3'), un promotor (PRONOS), un marcador seleccionable (NPTII), un promotor constitutivo (35S) y una secuencia que codifica la proteína FMO (RCI5) integrada de forma estable en un vector pROK2.
La Figura 4b es un segundo mapa de una construcción de ADN que puede utilizarse para obtener plantas de Arabidopsis thaliana para la sobreexpresión constitutiva de la secuencia At FMO GS-OX5, que incluye (de 5' a 3'), un promotor (PRONOS), un marcador seleccionable (NPTII), un promotor inducible por estrés (PRORD29A) y una secuencia que codifica la proteína FMO (RCI5) integrada de forma estable en un vector pROK2.
La Figura 5a es un mapa de una construcción de ADN que puede utilizarse para obtener plantas de Zea mays para la sobreexpresión constitutiva de la secuencia que codifica la proteína Zm FMO que incluye (de 5' a 3'), promotor constitutivo (Ubiquitina), una secuencia que codifica la proteína FMO (Zm FMO), un segundo promotor (35S) y un marcador seleccionable (higromicina) integrada de forma estable en un vector pCAMBIA 1300.
La Figura 5b es un mapa de una construcción de ADN que puede utilizarse para obtener plantas de Solanum lycopersicum para la sobreexpresión de la secuencia que codifica la proteína Sl FMO GS-OX1, que incluye (de 5' a 3'), un promotor inducible por estrés (PRORD29A), una secuencia que codifica la proteína FMO (SI FMO GS-OX1), un segundo promotor (35S) y un marcador seleccionable (higromicina) integrada de forma estable en un vector pCAMBIA 1300.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación incluye métodos para producir plantas u organismos fotosintéticos tolerantes al estrés por sequía, incluyendo tolerancias a, pero sin limitarse a sequía, humedad excesiva, así como uso eficiente de agua donde se producen rendimientos normales con menos aporte de agua. Estos métodos incluyen la aplicación de compuestos orgánicos, tal como N-óxido de trimetilamina (“TMAO”) o un análogo de TMAO, un derivado de TMAO, o TMAO dihidrato a plantas o semillas para producir una planta tolerante al estrés por sequía. La presente divulgación también incluye plantas u organismos fotosintéticos tolerantes al estrés por sequía, incluyendo tolerancias a, pero sin limitarse a sequía y humedad excesiva. Estas plantas y organismos fotosintéticos tolerantes al estrés por sequía pueden producirse a través de la aplicación de compuestos orgánicos, tal como N-óxido de trimetilamina (“TMAO”) o un análogo de TMAO, un derivado de TMAO, o TMAO dihidrato para inducir la tolerancia al estrés por sequía, permitiendo la producción de plantas y organismos fotosintéticos con más biomasa, fruta o semilla en comparación con plantas y organismos fotosintéticos que no han sido tratados con compuestos orgánicos para producir tolerancia al estrés por sequía.
De ese modo, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método para producir una planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía (primer método) que comprende:
aplicar al menos un tratamiento de una cantidad efectiva de trimetilamina N- (TMAO), N-óxido de trimetilamina dihidrato, o N-óxido de N,N-dimetildecilamina (DDAO) a una planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla, en donde la cantidad eficaz del TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es desde 0,1 a 10 g por litro para rociado o irrigación, o en donde el al menos un tratamiento es un tratamiento de semillas y la cantidad eficaz del TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es desde 0,1 g a 1000 g por 100 kg de semilla; y
cultivar dicha planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla, en donde se produce una planta u organismo fotosintético tolerante al estrés por sequía
Como se utiliza en la presente memoria el término "estrés por sequía" se usa indistintamente con estrés hídrico. El término "estrés por sequía" como se utiliza en la presente memoria puede ser inducido en plantas en condiciones en que un contenido de agua reducido en el suelo, debido a la escasez de lluvia o de riego, lleva al deterioro o disminución de la absorción de agua por la planta u organismo fotosintético. El estrés hídrico puede desencadenar en las plantas un deterioro de las funciones fisiológicas de las células, lo que conduce a diversos trastornos. Si bien las condiciones que inducen estrés por sequía pueden variar dependiendo del tipo de suelo donde se cultivan las plantas, los ejemplos de las condiciones incluyen pero no se limitan a: una reducción en el contenido de agua en el suelo del 15% en peso o menos, más severamente el 10% en peso o menos, y aún más severamente el 7,5% en peso o menos; o el valor pF del suelo de 2,3 o más, más severamente 2,7 o más, y aún más severamente 3,0 o más.
Como se presentó anteriormente, se divulga uno o más métodos para producir plantas u organismos fotosintéticos tolerantes al estrés hídrico, incluyendo pero sin limitarse a la tolerancia a la sequía o exceso de humedad, en las plantas en donde una aplicación de N-óxido de trimetilamina o “TMAO”, en donde TMAO incluye pero no se limita a, TMAO dihidrato, derivado químico de TMAO, o un análogo químico de TMAO, a una planta o semilla para reducir el estrés hídrico en la planta cuando la planta se expone a condiciones de estrés hídrico. Además, las metilaminas (por ejemplo, N-óxido de trimetilamina (TMAO)) pueden aumentar el plegamiento de la proteína y la unión al ligando y contrarrestar las perturbaciones por urea (por ejemplo, en elasmobranquios y riñón de mamífero), iones inorgánicos, y presión hidrostática en animales del mar profundo (Yancey, 2005, citado supra).
Según la invención, el derivado químico de TMAO es N-óxido de N,N-dimetildecilamina (DDAO). Se divulga que el análogo químico de TMAO es un compuesto N-metilado. En una divulgación, el compuesto N-metilado se selecciona del grupo que consiste en carnitina, sarcosina, ácido N-metil aspártico, N-metil taurina.
El uno o más métodos para producir una planta u organismo fotosintético tolerante a estrés hídrico es aplicable a una variedad de plantas incluyendo plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, incluyendo sin limitarse a plantas transgénicas. Como se utiliza en la presente memoria, las plantas transgénicas incluyen plantas, u organismo fotosintético, que han sido modificados genéticamente para contener construcciones de a Dn como se debatirá adicionalmente en la presente memoria. Los métodos para producir una planta o un organismo tolerante al estrés hídrico pueden ser aplicables a la planta entera u organismo o una parte de una planta, por ejemplo, en un órgano, tejido, una célula o una parte de una célula vegetal, por ejemplo, en un orgánulo, que comprende introducir en, y expresar en, la planta o célula de planta un ácido nucleico que codifica una monooxigenasa o proteína FMO, y que media un aumento en la producción de TMAO endógeno y, por tanto, la tolerancia al estrés hídrico, tal como un aumento de la tolerancia a la sequía o un aumento de la tolerancia a la humedad excesiva.
Una o más realizaciones que se describen en la presente memoria pueden proporcionar además métodos para producir una planta u organismo fotosintético tolerante al estrés hídrico que comprende aplicar una cantidad suficiente efectiva de TMAO, TMAO dihidrato o DDAO a una planta u organismo que ha sido expuesto a o que se va a exponer a condiciones de estrés hídrico.
De ese modo, en una realización preferida, el primer método para producir una planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía además comprende aplicar al menos un segundo tratamiento de una cantidad efectiva de TMAO, TMAO dihidrato, o DDAO a dicha planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía, previamente tratado con TMAO, TMAO dihidrato o DDAO.
Este método además puede incluir una aplicación de tratamiento de semilla, un tratamiento de pulverización o un tratamiento de riego del TMAO, TMAO dihidrato o DDAO. En una realización preferida, el al menos un tratamiento de una cantidad efectiva de TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es un tratamiento de semilla. Se divulga que una cantidad efectiva de tratamiento de semilla con TMAO puede incluir un tratamiento de semilla de TMAO en una cantidad de 0,1 a 1000 g por 100 kg de semillas, de 0,1 a 1000 g por 100 kg de semillas, o de 0,1 a 100 g por 100 kg de semillas, de 0,1 a 10 g por 100 kg de semillas o de 0,1 g a 5 g por 100 kg de semillas. En el método de la invención en donde el al menos un tratamiento es un tratamiento de semilla, la cantidad eficaz de TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es desde 0,1 g a 1000 g por 100 kg de semilla.
En una divulgación más preferida, dicha cantidad efectiva de TMAO en un tratamiento de semilla está entre 0,1 g a 1000 g por kg de semilla. En otra divulgación preferente, dicha cantidad efectiva de TMAO en un tratamiento de semilla está entre 1 g a 100 g por kg de semilla. En otra divulgación preferente, dicha cantidad efectiva de TMAO en un tratamiento de semilla está entre 1 g a 100 g por kg de semilla, entre 0,1 a 10 g por kg de semillas o 0,1 g a 5 g por kg de semillas
En otra divulgación preferente, el al menos un tratamiento de dicha cantidad efectiva de TMAO es un tratamiento de riego o un tratamiento de pulverización. En una divulgación preferente, la cantidad efectiva de dicho TMAO está entre 0,01 a 10000 g por litro para dicho tratamiento de riego o tratamiento de pulverización. Según la invención, la cantidad efectiva de dicho TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es de 0,1 a 10 g por litro para dicho tratamiento de riego o tratamiento de pulverización. En otra realización, la cantidad efectiva es de 0,1 a 5 g por litro para dicho tratamiento de riego.
En otra divulgación, el al menos un tratamiento de dicha cantidad efectiva de TMAO en los métodos divulgados en el presente documento comprende dos o más compuestos diferentes seleccionados del grupo que consiste en TMAO, TMAO dihidrato, un derivado químico de TMAO, tal como N-óxido de N,N-dimetildecilamina (DDAO), o un análogo químico de TMAO, tal como un compuesto N-metilado tal como carnitina, sarcosina, ácido N-metil aspártico, N-metil taurina del mismo. Según la invención, el al menos un tratamiento de dicha cantidad eficaz de TMAO, TMAO dihidrato o DDAO comprende dos o más compuestos diferentes seleccionados del grupo que consiste en TMAO, TMAO dihidrato y DDAO.
El uso de TMAO, TMAO dihidrato, un derivado o análogo químico de TMAO y sales aceptables para uso agrícola, en donde las sales aceptables para uso agrícola pueden incluir, pero no se limitan a, una mezcla de fosfato de amonio, nitrato de amonio, nitrato de potasio, y nitrato de calcio en una proporción de 2-2-1-1 para reducir el estrés hídrico en una planta.
En otra realización, dicha planta u organismo fotosintético tolerante al estrés hídrico tiene una producción de biomasa, semilla o fruta que es el 6%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, incluyendo o más que la producción de biomasa, semilla o fruta de las plantas u organismos fotosintéticos con estrés hídrico donde una cantidad efectiva de TMAO no se ha aplicado a la planta u organismo fotosintético no tolerante con estrés hídrico. En realizaciones preferentes, la producción de biomasa, semilla o fruta está entre el 6% y el 30% o más, entre el 31% y el 50% o más, entre el 51% y el 70% o más, entre el 71% y el 100% o más que la producción de biomasa, fruta o semilla de plantas u organismos fotosintéticos con estrés hídrico donde una cantidad efectiva de TMAO no se ha aplicado a la planta u organismo fotosintético no tolerante. La descripción de un intervalo debe considerarse que ha divulgado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro del intervalo.
La producción de biomasa, fruta o semilla puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica.
El estrés hídrico en plantas producido utilizando los métodos de la invención puede reconocerse o identificarse comparando un cambio en los fenotipos de la planta que se describen en más detalle posteriormente entre plantas que han estado expuestas a condiciones de estrés hídrico y las plantas que no han sido expuestas a las mismas condiciones de estrés hídrico. El estrés hídrico en una planta u organismo fotosintético puede estar indicado por un cambio en uno o más de los siguientes fenotipos de plantas, que pueden servir como indicadores del estrés hídrico en las plantas: (1) porcentaje de germinación, (2) tasa de establecimiento de plántulas, (3) número de hojas saludables, (4) longitud de la planta, (5) peso de la planta, (6) área foliar, (7) color de la hoja, (8) número o peso de semillas o frutas, (9) calidad de las cosechas, (10) tasa de formación de flores o tasa de formación de frutas, (11) rendimiento de fluorescencia de clorofila, (12) contenido de agua, (13) temperatura de la superficie de la hoja, y (14) capacidad de transpiración.
El estrés hídrico puede cuantificarse como “intensidad de estrés” donde la intensidad de estrés está representada de la siguiente manera: “Intensidad de estrés” = 100 x "cualquiera de los fenotipos de planta en plantas que no han sido expuestas a estrés hídrico” / "el fenotipo de planta en plantas que han sido expuestas a agua”.
Los métodos que se describen en la presente memoria se aplican a plantas que han sido expuestas a o van a ser expuestas a condiciones de estrés hídrico cuya intensidad de estrés representada por la ecuación anterior es de 105 a 450, preferentemente de 110 a 200, y más preferentemente de 115 a 160. La descripción de un intervalo debe considerarse que ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. En una planta expuesta a condiciones de estrés hídrico, una influencia puede constatarse en al menos uno de los fenotipos anteriores. Es decir, se observa como: (1) disminución en el porcentaje de germinación, (2) disminución de la tasa de formación de plántulas, (3) disminución en el número de hojas sanas, (4) disminución en la longitud de la planta, (5) disminución de peso de la planta, (6) disminución en la tasa de incremento del área foliar, (7) pérdida de color de la hoja, (8) disminución en el número o peso de semillas o frutas, (9) deterioro de la calidad de las cosechas, (10) disminución en la tasa de formación de flor o formación de fruta, (11) disminución en el rendimiento de fluorescencia de clorofila, (12) disminución del contenido de agua, (13) aumento de temperatura de la superficie de la hoja, o (14) disminución de la capacidad de transpiración, entre otros, y la magnitud del estrés hídrico en la planta puede medirse usando eso como indicador.
Los métodos que se describen en la presente memoria están dirigidos a métodos para reducir el estrés hídrico en una planta u organismo mediante la producción de una planta u organismo tolerante al estrés hídrico aplicando el TMAO a la planta que ha sido expuesta a o será expuesta a condiciones de estrés hídrico. El efecto de reducir el estrés hídrico de una planta puede evaluarse comparando los indicadores fenotípicos anteriores entre una planta tratada con TMAO y una planta que no ha sido tratada con TMAO después de que las plantas u organismos se expongan a condiciones de estrés hídrico. Las etapas en que las plantas u organismos tratados con TMAO pueden exponerse a las condiciones de estrés hídrico incluyen todas las etapas de crecimiento de las plantas, incluyendo un período de germinación, un período de crecimiento vegetativo, un período de crecimiento reproductivo y un período de cosecha. El período de aplicación de TMAO como se utiliza en la presente memoria puede ser cualquier etapa de crecimiento de las plantas u organismos, y los ejemplos de los mismos incluyen el período de germinación antes de la siembra, en el momento de la siembra, y después de la siembra y antes o después de la aparición; el período de crecimiento vegetativo tal como en el momento del cultivo de plántulas, en el momento del trasplante de plántula, en el momento de cortar o unir, o en el momento del cultivo después de la plantación establecida; el período de crecimiento reproductivo tal como antes de la floración, en la floración, después de la floración, inmediatamente antes de la formación de espiga o durante el período de formación de espigas; y el período de cosecha tal como antes del programa de cosecha, antes del programa de maduración, o un periodo de iniciación de coloración de frutas. Las plantas a las que se debe aplicar TMAO pueden ser plantas que han sido expuestas a o serán expuestas a las condiciones de estrés hídrico. Es decir, el compuesto también puede ser aplicado preventivamente a plantas antes de ser expuestas a las condiciones de estrés hídrico además de plantas que han sido expuestas a las condiciones de estrés hídrico.
En otra realización preferente, el método de la invención además comprende aplicar sales o cualquier otro aditivo a dicha planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla y cultivar dicha planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla en donde se produce una planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía.
El TMAO utilizado en los métodos que se describen en la presente memoria puede utilizarse solo, o en combinación con varios ingredientes inertes tal como vehículos sólidos, vehículos líquidos, y tensioactivos como se describe en adelante.
Los ejemplos de un vehículo sólido utilizado en la formulación con TMAO puede incluir polvos, polvos finos o gránulos tal como minerales tal como arcilla caolín, arcilla de atapulgita, bentonita, montmorillonita, arcilla ácida blanca, pirofilita, tale, tierra de diatomeas y calcita; materiales orgánicos naturales tal como polvo de maíz raquis y polvo de cáscara de nuez; materiales orgánicos sintéticos tal como urea; sales tal como carbonato de calcio y sulfato de amonio; y materiales inorgánicos sintéticos tal como óxido de silicio hidratado sintético.
Los ejemplos de un vehículo líquido pueden incluir hidrocarburos aromáticos tal como xileno, alquilbenceno y metilnaftaleno; alcoholes tal como 2-5 propanol, etilenglicol, propilenglicol, y éter monoetílico de etilenglicol; cetonas tal como acetona, ciclohexanona y isoforona; aceite vegetal tal como aceite de soja y aceite de semilla de algodón; e hidrocarburos alifáticos de petróleo, ésteres, dimetilsulfóxido, acetonitrilo y agua.
Ejemplos de tensioactivos incluyen tensioactivos aniónicos tal como sales de éster de sulfonato de alquilo, sales de sulfonato de alquilarilo, sales de sulfosuccinato de dialquilo, sales de éster fosfato de polioxietileno alquil aril éter, sales de lignosulfonatos y policondensados de formaldehído sulfonato de naftaleno; y tensioactivos no iónicos tal como polioxietileno alquil aril éteres, copolímeros en bloque de polixoietileno alquilpolioxipropileno y ésteres de ácidos grasos de sorbitano; y tensioactivos catiónicos tal como sales de alquiltrimetilamonio.
Los ejemplos de otros agentes auxiliares de formulación incluyen polímeros solubles en agua tal como alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona, polisacáridos tal como goma arábiga, ácido algínico y la sal del mismo, CMC (carboximetilcelulosa), goma xantana, materiales inorgánicos tal como silicato de magnesio aluminio y sol de alúmina, conservantes, agentes colorantes, y agentes de estabilización tal como PAP (fosfato ácido de isopropilo) e hidroxitolueno butilado (BHT).
Los métodos para la producción de una planta u organismo fotosintético tolerante a estrés hídrico como se describen en la presente memoria pueden llevarse a cabo aplicando una cantidad efectiva del TMAO a plantas o sitios de crecimiento de plantas. Como se utiliza en la presente memoria una cantidad efectiva de TMAO puede incluir un intervalo de 0,1 a 1.000 g por litro por 1-10 kg de semillas. Cuando se incorpora en el suelo completo, una cantidad efectiva de TMAO puede variar de 0,1 a 1.000 g o 1 a 500 g, por 1.000 m2 de suelo. Cuando el tratamiento con TMAO se utiliza como una emulsión, un polvo humectable, un agente de fluidez, o puede utilizarse una microcápsula para el tratamiento mediante pulverización de la planta después de la dilución con agua. En este caso, la concentración del TMAO puede variar de 0,01 a 10,000 ppm, o de 1 a 5,000 ppm. Puede utilizarse una formulación en polvo y un gránulo de TMAO para el tratamiento de estrés hídrico sin dilución del TMAO. En el tratamiento de semillas o el tratamiento de bulbos, un ejemplo del peso de TMAO por 100 kg de semillas puede variar de 0,1 a 1000 g, así como de 1 a 30 g. Los ejemplos de las semillas o bulbos utilizados en los métodos que se describen en la presente memoria incluyen aquellos que tienen un peso de 100 g o menos, incluyendo 20 g o menos, 0,5 g o menos, así como 50 mg o menos. En el tratamiento de plántulas, un ejemplo del peso del TMAO por plántula puede variar de 0,01 a 20 mg, incluyendo de 0,5 a 8 mg. En el tratamiento del suelo antes o después de sembrar plántulas, el peso del TMAO por 1.000 m2 puede variar de 0,1 a 1000 g, incluyendo de 10 a 100 g.
Se puede aplicar TMAO a una variedad de plantas en diversas formas o lugares, tal como follaje, brotes, flores, frutas, mazorcas o espigas, semillas, bulbos, tubérculos de tallo, raíces y plántulas. Como se utiliza en la presente memoria, bulbos significan tallo discoide, rizomas, tubérculos de raíces y rizóforos. En la presente especificación, TMAO puede aplicarse también a esquejes y esquejes de tallo de caña de azúcar.
Los siguientes son ejemplos de los sitios de crecimiento de plantas que incluyen el suelo antes o después de la siembra de las plantas. Cuando TMAO se aplica a plantas o sitios de crecimiento de plantas, TMAO se aplica a las plantas diana una vez o más. TMAO puede aplicarse como tratamiento al follaje, órganos florales o mazorcas o espigas de plantas, tal como pulverización del follaje; tratamiento de semillas, tal como esterilización de semilla, recubrimiento de semilla o inmersión de semilla; tratamiento de plántulas; tratamiento de bulbos; y tratamiento de las tierras de cultivo de plantas, tal como tratamiento del suelo. TMAO puede aplicarse sólo a sitios específicos de plantas, tal como órgano floral en la temporada de floración incluyendo antes de la floración, durante la floración y después de la floración, y la mazorca o espiga en la temporada de formación de espigas, o puede aplicarse a las plantas enteras.
TMAO puede aplicarse como un tratamiento del suelo en forma de una pulverización sobre el suelo, incorporación en el suelo, y perfusión de un líquido químico en el suelo (riego de líquido químico, inyección en el suelo, y goteo de líquido químico). La colocación de TMAO durante el tratamiento del suelo incluye, pero no se limita a un hoyo de plantación, surco, alrededor de un hoyo de plantación, alrededor de un surco, toda la superficie de tierras de cultivo, las partes entre el suelo y la planta, área entre raíces, área debajo del tronco, surco principal, caja de cultivo, bandeja de cultivo de plántula y lecho de semilla, cultivo de plántula. El tratamiento del suelo con TMAo puede ser antes de la siembra, en el momento de la siembra, inmediatamente después de la siembra, período de cultivo, antes de la plantación establecida, en el momento de la plantación establecida y período de crecimiento después de la plantación establecida.
Cuando se aplica TMAO como un tratamiento de suelo, dos o más clases de TMAO pueden aplicarse simultáneamente a la planta, por ejemplo, TMAO y TMAO dihidrato, o TMAO dihidrato y un óxido de aril amina, o puede aplicarse un fertilizante sólido tal como un fertilizante en pasta que contiene TMAO al suelo. TMAO puede mezclarse en un líquido de riego, y, los ejemplos del mismo incluyen inyectar a las instalaciones de riego (tubo de riego, tubería de riego, aspersión, etc.), mezclar en el líquido de inundación entre los surcos, mezclar en un medio hidropónico y similares.
Alternativamente, un líquido de riego se puede mezclar con TMAO de antemano y, por ejemplo, ser utilizado para el tratamiento mediante un método de riego apropiado incluyendo el método de riego mencionado anteriormente y los otros métodos tal como aspersión e inundación. TMAO también se puede aplicar enrollando un cultivo con una formulación de resina procesada generando una hoja o cordón, poniendo un cordón de la formulación de resina alrededor de un cultivo de modo que el cultivo esté rodeado por el cordón, y/o colocando una hoja de la formulación de resina en la superficie del suelo cerca de la raíz de un cultivo.
En otra realización, TMAO puede utilizarse para el tratamiento de semillas o bulbos, así como un tratamiento de pulverización de semillas con TMAO en el que se atomiza una suspensión de TMAO se atomiza y pulveriza sobre una superficie de semilla o superficie de bulbo. Un tratamiento de extensión también puede ser utilizado en donde un polvo humectable, una emulsión o un agente fluido de TMAO se aplica a semillas o bulbos con una pequeña cantidad de agua añadida o aplicada como está sin dilución. Además, puede utilizarse un tratamiento de inmersión en el que las semillas se sumergen en una solución de TMAO durante un cierto período de tiempo, tratamiento de recubrimiento con película, y tratamiento de recubrimiento con pellas.
TMAO puede utilizarse para el tratamiento de plántulas, incluyendo tratamiento de pulverización compuesto por pulverización de las plántulas completas con una dilución que tiene una concentración adecuada de ingredientes activos preparadas por dilución de TMAO con agua. Como con el tratamiento de semilla, también se puede usar un tratamiento de inmersión que está comprendido por la inmersión de plántulas en la dilución, tratamiento de recubrimiento para adherir TMAO formulado en una formulación en polvo a las plántulas completas.
TMAO se puede tratar al suelo antes o después de la siembra de plántulas incluyendo la pulverización de una dilución que tiene una concentración adecuada de ingredientes activos preparada diluyendo TMAO con agua y aplicando la mezcla a plántulas o el suelo alrededor de las plántulas después de la siembra de las plántulas. También puede ser utilizado un tratamiento de pulverización de TMAO formulado en una formulación sólida tal como un gránulo al suelo alrededor de las plántulas en la siembra de las plántulas.
TMAO puede utilizarse para el tratamiento de hidroponía. Los ejemplos pueden incluir disolver o suspender TMAO en un medio de cultivo convencionalmente utilizado para cultivos hidropónicos, en una concentración dentro de un intervalo de 0,0001 a 10 g/litro.
TMAO puede utilizarse en el momento del cultivo de tejidos o cultivo de células de una planta para fomentar la tolerancia al estrés hídrico. TMAO puede disolverse o suspenderse en un medio de cultivo convencionalmente utilizado para el cultivo de tejido de planta u otros organismos, tal como un medio de cultivo Murashige y Skoog ("MS"). Los ejemplos pueden incluir una concentración dentro de un intervalo de 0,0001 a 10 g/litro. En este caso, según un método habitual, se pueden añadir de manera apropiada sacáridos como una fuente de carbono, diversas fitohormonas y similares.
Se divulga que el método para producir una planta tolerante a la sequía comprende una primera etapa en donde la planta es pulverizada con una solución que contiene N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina dihidrato, un derivado químico de TMAO o un análogo químico de TMAO seguido por el riego con una solución que contiene N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina dihidrato, un derivado químico de TMAO o un análogo químico de TMAO. En una realización preferente, el tratamiento de pulverización inicial se lleva a cabo con una solución que contiene una cantidad efectiva de TMAO que está entre 0,01 a 10000 g por litro, más preferentemente entre 0,1 a 1000 g por litro, entre 0,1 a 100 g por litro, entre 0,1 y 10 g por litro, entre 0,1 g a 5 g por litro para dicho tratamiento de pulverización. En otra divulgación, el tratamiento de riego se lleva a cabo con una solución que contiene una cantidad efectiva de TMAO que está entre 0,01 a 10000 g por litro, más preferentemente entre 0,1 a 1000 g por litro, entre 0,1 a 100 g por litro, entre 0,1 y 10 g por litro, entre 0,1 g a 5 g por litro para dicho tratamiento de riego.
En una divulgación preferente, el método para producir una planta tolerante a la sequía comprende una primera etapa en donde la semilla es tratada con una solución que contiene N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina dihidrato, un derivado químico de TMAO o un análogo químico de TMAO seguido por el riego o pulverización de la planta con una solución que contiene N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina dihidrato, un derivado químico de TMAO o un análogo químico de TMAO. En una divulgación preferente, el tratamiento inicial de semilla se lleva a cabo con una cantidad efectiva de TMAO que está entre 0,01 a 10000 g por kg de semilla, más preferentemente entre 0,1 a 1000 g por kg de semilla, entre 0,1 a 100 g por kg de semilla, entre 0,1 y 10 g por kg de semilla o entre 0,1 g a 5 g por kg de semilla. En otra divulgación, el tratamiento de riego se lleva a cabo con una solución que contiene una cantidad efectiva de TMAO que está entre 0,01 a 10000 g por litro, más preferentemente entre 0,1 a 1000 g por litro, entre 0,1 a 100 g por litro, entre 0,1 y 10 g por litro, entre 0,1 g a 5 g por litro para dicho tratamiento de riego.
Se pueden usar una variedad de bulbos o semillas en los métodos que se describen en la presente memoria incluyendo, pero sin limitarse a las plantas en las familias Solanaceae y Cucurbitaceae, así como plantas seleccionadas de los géneros de planta Calibrachoa, Capsicum, Nicotiana, Nierembergia, Petunia, Solanum, Cucúrbita, Cucumis, Citrullus, Glycine, tal como Glycine max (soja), Calibrachoa * hybrida, Capsicum annuum (pimiento), Nicotiana tabacum (tobaco), Nierenbergia scoparia (chucho), Petunia *hybrida, Solanum lycopersicum (tomate), Solanum tuberosum (papa), Solanum melongena (berenjena), Cucurbita maxima (zapallo), Cucurbita pepo (calabaza, zucchini), Cucumis metuliferus (melón africano espinudo) Cucumis melo (melón), Cucumis sativus (pepino) y Citrullus lanatus (sandía). Varias plantas monocotiledóneas, en particular las que pertenecen a la familia Poaceae se pueden utilizar con los métodos que se describen en la presente memoria, que incluyen, pero sin limitación, plantas seleccionadas de los géneros de planta Hordeum, Avena, Secale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum, Oryza, Hordeum vulgare (cebada), Triticum aestivum (trigo), Triticum aestivum subsp. spelta (espelta), Triticale, Avena sativa (avenas), Secale cereale (centeno), Sorghum bicolor (sorgo), Zea mays (maíz), Saccharum officinarum (caña de azúcar) y Oryza sativa (arroz). Los ejemplos adicionales de plantas en que se puede producir estrés hídrico usando los métodos que se describen en la presente memoria incluyen los siguientes cultivos: trigo sarraceno, remolacha, canola, colza, girasol, caña de azúcar, tabaco y guisantes; hortalizas: hortalizas solanáceas tales como pimiento y patata, hortalizas cucurbitáceas; hortalizas crucíferas tales como, rábano japonés, nabo, rábano, colinabo, repollo chino, repollo, mostaza castaña, brócoli y coliflor, hortalizas asteráceas tales como, bardana, guirnalda crisantemo, alcaucil y lechuga; hortalizas liliáceas tales como, cebolleta, cebolla, ajo, espárragos, hortalizas amiáceas tales como zanahoria, perejil, apio y chirivía, hortalizas quenopodiáceas tales como espinaca, acelga, hortalizas lamiáceas tales como, Perilla frutescens, menta, albahaca; fresa, boniato, Dioscorea japonica, colocasia; flores; plantas de follaje; pastos; frutas: frutos de pepita (manzana, pera, pera japonesa, membrillo chino y membrillo, etc.), frutas de hueso, (melocotón, ciruela, nectarina, Prunus mume, cerezas, albaricoque y ciruelas, etc), frutas cítricas (Citrus unshiu, naranja, mandarina, limón, lima, pomelo, etc.), frutos secos (castañas, nueces, avellanas, almendras, pistachos, anacardos, nueces de macadamia, etc), bayas (zarzamoras, arándanos, moras, frambuesas, etc), uva, caqui, aceituna, níspero, plátano, café, palmera datilera, cocos, etc.; y árboles diferentes de los árboles frutales; té, morera, plantas de flores, arbolado de las carreteras (fresno, abedul, cerezo silvestre, eucalipto, Ginkgo biloba, lila, arce, Quercus, álamo, árbol de Judas, Liquidambar formosana, plátano de sombra, zelkova, tuya del Japón, abeto, cicuta, enebro, Pinus, Picea, y Taxus cuspidata). Los ejemplos de plantas en las que se puede producir tolerancia al estrés hídrico pueden incluir arroz, maíz, canola, soja y trigo.
Las “plantas” mencionadas anteriormente incluyen plantas transgénicas, que expresan otros rasgos de genes. Como se utiliza en la presente memoria, "plantas" significa todas las plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas, incluyendo, pero no se limita a plantas dicotiledónea o monocotiledónea anuales y perennes a modo de ejemplo, pero sin limitación, a los del género Glycine, Vitis, Asparagus, Populus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Saccharum y Lycopersicum. El término planta también puede incluir, pero sin limitación la clase de Liliatae (Monocotyledoneae o plantas monocotiledóneas). El término incluye plantas maduras, semillas, brotes y plántulas, y partes, material de propagación, órganos de planta, tejido, protoplastos, callos y otros cultivos, por ejemplo, cultivos celulares derivados de los anteriores y todos los otros tipos de asociaciones de células de planta que proporcionan unidades funcionales o estructurales. “Plantas maduras” significa todas las plantas en cualquier estado de desarrollo más allá del estadio de plántula. Plántula significa una planta inmadura joven en un estadio de desarrollo temprano.
Las plantas dicotiledóneas incluyen, pero sin limitación plantas maduras, semillas, brotes y plántulas, y partes, material de propagación, órganos de planta, tejido, protoplastos, callos y otros cultivos, por ejemplo, cultivos celulares derivados de los anteriores y todos los otros tipos de asociaciones de células de planta que proporcionan unidades funcionales o estructurales. Plantas maduras significa plantas en el estadio desarrollo más allá del estadio de plántula. Plántula significa una planta inmadura joven en un estadio de desarrollo temprano.
Como se utiliza en la presente memoria “organismos fotosintéticos” puede incluir, pero no se limita a organismos tal como Arthrospira spp., Spirulina spp., Synechococcus elongatus, Synechococcus spp., Synechosystis spp., Synechosystis spp., y Spirulina plantensis, Calothrix spp., Anabaena flos-aquae, Aphanizomenon spp., Anabaena spp., Gleotrichia spp., Oscillatoria spp. y Nostoc spp.; algas unicelulares eucariotas tal como pero sin limitarse a Chaetoceros spp., Chlamydomonas reinhardtii, Chlamydomonas spp., Chlorella vulgaris, Chlorella spp., Cyclotella spp., Didymosphenia spp., Dunaliella tertiolecta, Dunaliella spp., Botryococcus braunii, Botryococcus spp., Gelidium spp., Gracilaria spp., Hantzschia spp., Hematococcus spp., Isochrysis spp., Laminaria spp., Nannochloropsis spp., Navicula spp., Nereocystis luetkeana, Pleurochrysis spp., Postelsia palmaeformis, y Sargassum spp.
En otra divulgación, se proporcionan uno o más métodos para la producción de un producto que se describe en la presente memoria puede comprender: a) cultivar las plantas que se describen en la presente memoria u obtenible por los métodos que se describen en la presente memoria y b) producir el producto a partir de o por las plantas de la divulgación y/o partes, por ejemplo, semillas, de estas plantas.
También se divulga una semilla de planta tratada con una cantidad efectiva de N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina dihidrato, un derivado químico de TMAO, un derivado químico de TMAO, tal como N-óxido de N,N-dimetildecilamina (DDAO), o un análogo químico de TMAO, tal como un compuesto N-metilado tal como carnitina, sarcosina, ácido N-metil aspártico, N-metil taurina del mismo.
En una divulgación preferente la semilla de planta es tratada con una cantidad efectiva de dicho TMAO entre 0,1 a 1.000 g por kg de semillas, preferentemente entre 0,1 a 100 g por kg de semillas, más preferentemente de 0,1 a 10 g por kg de semillas y aún más preferentemente de 0,1 a 5 g por kg de semillas.
La descripción de un intervalo debe considerarse que ha específicamente divulgado todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo.
En otra realización el método puede comprender las etapas a) cultivar las plantas de la invención, b) retirar las partes cosechables como se define anteriormente de las plantas y c) producir el producto a partir de o por las partes de la planta u organismo.
También se divulga una planta tolerante al estrés hídrico producida haciendo crecer la semilla de planta divulgada en el presente documento.
Las plantas u organismos tolerantes al estrés hídrico se pueden producir en el sitio donde la planta ha crecido, las plantas y/o partes de las mismas pueden ser retiradas del sitio donde las plantas se han cultivado para producir el producto. Por lo general, la planta se cultiva, las partes cosechables deseadas se retiran de la planta, si es posible en ciclos repetidos, y el producto es elaborado a partir de las partes cosechables de la planta. La etapa de cultivar la planta se puede llevar a cabo sólo una vez cada vez que se realizan los métodos de la invención, al tiempo que permite veces repetidas de las etapas de producción de productos, por ejemplo, por retirada repetida de las partes cosechables de las plantas de la divulgación y procesamiento adicional si es necesario de estas partes para llegar al producto. Es posible que la etapa de cultivar las plantas de la divulgación se repita y las plantas o partes cosechables se almacenen hasta que entonces se realice la producción del producto una vez para las plantas o partes de plantas acumuladas. Además, las etapas de cultivar las plantas y producir el producto se pueden realizar con una superposición en el tiempo, incluso simultáneamente en gran medida o secuencialmente. Generalmente las plantas se cultivan durante algún tiempo antes de que se produzca el producto.
También se divulga una planta tolerante al estrés hídrico producida a través de la aplicación de al menos un tratamiento de una cantidad efectiva de TMAO a una planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla. En una realización preferente, la planta de estrés hídrico de la invención tiene una producción de semilla de planta que es el 6% o más que la producción de biomasa, fruta o semilla de plantas u organismos fotosintéticos con estrés hídrico no tolerantes donde una cantidad efectiva de TMAO no ha sido aplicada. En otra realización preferente la planta de estrés hídrico tiene una producción de biomasa, fruta o semilla de planta que es el 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, incluyendo o más que la producción de biomasa, fruta o semilla de plantas u organismos fotosintéticos con estrés hídrico no tolerantes donde una cantidad efectiva de TMAO no ha sido aplicada.
En una realización preferente, la producción de semilla está entre el 6% y el 30% o más, entre el 31% y el 50% o más, entre el 51% y el 70% o más, entre el 71% y el 100% o más que la producción de semilla de plantas u organismos fotosintéticos con estrés hídrico no tolerantes donde una cantidad efectiva de TMAO no ha sido aplicada.
En otra divulgación la planta tolerante al estrés hídrico producida a través de la aplicación de al menos un tratamiento de una cantidad efectiva de TMAO a una planta, parte de planta, organismo fotosintético y al menos un segundo tratamiento de una cantidad efectiva de TMAO se aplica a dicha planta u organismo fotosintético tolerante al estrés hídrico.
En otra divulgación preferente de la planta tolerante al estrés hídrico, dicho al menos un tratamiento de dicha cantidad efectiva de TMAO comprende dos o más compuestos diferentes seleccionados del grupo que consiste en TMAO dihidrato, derivado químico de TMAO, o un análogo químico de TMAO.
En otra realización preferente, la planta tolerante al estrés hídrico de la invención se produce mediante un tratamiento adicional de sales o cualquier otro aditivo a una planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla y haciendo crecer dicha planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla en donde se produce una planta u organismo fotosintético tolerante al estrés hídrico.
En otra divulgación los productos producidos por los métodos que se describen en la presente memoria son productos de plantas tal como, pero sin limitarse a, un alimento, pienso para ganado, un suplemento alimenticio, suplemento de pienso, fibra, cosmético y/o fármaco. Los productos alimenticios se consideran composiciones utilizadas para la nutrición y/o para complementar la nutrición. Los piensos para ganado y suplementos de la alimentación animal, en particular, están considerados como productos alimenticios.
En otra divulgación los métodos para la producción se utilizan para elaborar productos agrícolas tal como, pero sin limitarse a, extractos de plantas, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, grasas, aceites, polímeros, vitaminas, y similares. Sírvase tener en cuenta que es posible que el producto vegetal consista en uno o más productos agrícolas en gran medida.
También se divulgan métodos para producir plantas transgénicas u organismos fotosintéticos tolerantes al estrés hídrico que incluyen, pero no se limitan a introducir en forma estable una construcción en la planta u organismo fotosintético donde la construcción incluye un gen o genes tal como SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 2 que codifica una proteína monooxigenasa o proteína FMO tal como la proteína FMO GS-OX5. La sobreexpresión, ya sea constitutiva o inducida por estrés, de la proteína monooxigenasa media un incremento en la expresión de TMAo en una planta u organismo fotosintético a través de la catalización de la oxidación de metabolitos endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico. Divulgaciones adicionales pueden comprender una planta transgénica u organismo que sobreexpresa un gen tolerante al estrés hídrico, tal como SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 2 que codifica una proteína FMO, donde el gen está operativamente ligado a un promotor constitutivo o un promotor inducible por estrés y ha sido integrado en forma estable en el genoma de la planta u organismo en condiciones apropiadas para la sobreexpresión de una proteína con tolerancia al estrés hídrico.
También se divulga un método para producir una planta u organismo fotosintético con una tolerancia al estrés hídrico, tal como una planta monocotiledónea o dicotiledónea, que comprende introducir en y sobreexpresar en la planta u organismo fotosintético un ácido nucleico o aminoácido tal como SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 2 que codifica una proteína monooxigenasa, tal como la proteína FMO GS-OX5.
También se divulga una planta u organismo fotosintético tolerante al estrés hídrico, en donde la planta u organismo fotosintético tolerante al estrés hídrico sobreexpresa las proteínas FMO en el genoma nuclear de la planta u organismo fotosintético o el genoma de cloroplasto de la planta.
De ese modo, se divulga un método para producir una planta tolerante al estrés hídrico, en donde el método comprende transformar una planta con una secuencia que codifica una proteína FMO operativamente ligada a un promotor en condiciones apropiadas para la sobreexpresión de la proteína FMO en la planta de al menos tres veces con respecto al nivel de expresión de la proteína FMO endógena, en donde la sobreexpresión de la secuencia que codifica la proteína FMO en dicha planta tolerante al estrés hídrico cataliza la oxidación de metabolitos endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico.
En una divulgación preferente la secuencia que codifica la proteína FMO codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43.
En otra divulgación preferente el promotor es un promotor constitutivo. En otra divulgación preferente, la sobreexpresión de la secuencia que codifica la proteína FMO es sobreexpresión constitutiva. En una divulgación preferente, la proteína FMO se sobreexpresa al menos 8 veces con respecto a los niveles de expresión de la proteína FMO endógena.
En otra divulgación preferente, el promotor es un promotor inducible por estrés, más preferentemente, el estrés es estrés hídrico.
En otra divulgación, la sobreexpresión de la secuencia que codifica la proteína FMO es inducida por un estrés, preferentemente estrés hídrico.
La sobreexpresión constitutiva o sobreexpresión inducida por estrés de la monooxigenasa o proteína FMO media un incremento en la expresión de TMAO en una planta u organismo fotosintético, incrementando la tolerancia de la planta u organismo con respecto a varias formas de estrés hídrico en comparación con plantas de tipo salvaje, parte de plantas de tipo salvaje, organismos fotosintéticos de tipo salvaje o células de plantas de tipo salvaje. La monooxigenasa o proteína FMO puede sobreexpresarse en la planta u organismo fotosintético como un todo o una parte, se proporciona, por ejemplo, en un órgano, tejido, célula o una parte de una célula de planta, por ejemplo, en un orgánulo. La proteína monooxigenasa comprende una secuencia que codifica aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43, y/o la región 5'-no traducida (5'UTR). La sobreexpresión de la proteína media un aumento de la expresión en una planta u organismo fotosintético, incrementando la tolerancia de la planta o el organismo a diversas formas de estrés hídrico en comparación con las plantas de tipo salvaje. A modo de ejemplo, las proteínas humanas FMO3 y FMO1 tienen una identidad del 53% y el 84% con las proteínas FMO3 de conejo (véase Lawton et al, 1994, Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 308, 254-257).
Divulgaciones adicionales proporcionan una construcción de ADN que comprende una o más secuencias que codifican la proteína FMO operativamente ligada a un promotor constitutivo o un promotor inducible por estrés en donde las proteínas FMO están integradas de forma estable en un genoma de ADN de planta u organismo fotosintético en condiciones apropiadas para la sobreexpresión de la construcción de ADN en la planta u organismo fotosintético. El promotor constitutivo o promotor inducible por estrés en la construcción de ADN induce la sobreexpresión de las proteínas FMO en la planta u organismo fotosintético mediando de ese modo un incremento en la expresión de TMAO en una planta u organismo fotosintético, incrementando la tolerancia de la planta u organismo fotosintético a diversas formas de estrés hídrico en comparación con las plantas de tipo salvaje u organismos fotosintéticos de tipo salvaje.
Se divulgan construcciones de ADN para la sobreexpresión de proteínas FMO en plantas transgénicas u organismos fotosintéticos. Dichas construcciones de ADN pueden representarse como se muestra en las Figuras 4a, 4b, 5a, y 5b.
Como se muestra en la Figura 4a, se proporciona una construcción para la sobreexpresión de una proteína FMO en una planta de Arabidopsis thaliana, donde mirando en el extremo 5' de la construcción, una secuencia codificante del promotor constitutivo, tal como PROnos, está provista de un sitio de inicio de transcripción. Un marcador seleccionable, tal como NPTII está provisto de una región de terminación de transcripción, NOS ter en el extremo 3' del marcador seleccionable. Un promotor constitutivo, tal como el promotor CaMv35S, (35S) está provisto de un sitio de inicio de transcripción. La secuencia que codifica la proteína FMO RCI5 (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2) está provista de una región de terminación de transcripción, NOS ter en el extremo 3' de la secuencia que codifica la proteína FMO. Cada uno de estos componentes está operativamente ligado al siguiente, es decir, la secuencia de codificación del promotor constitutivo, PROnos, está operativamente ligada al extremo 5' del marcador seleccionable, NPTII, la secuencia de proteína y la secuencia de proteínas marcadoras seleccionables está s operativamente ligada al extremo 5' de la secuencia codificante del promotor constitutivo CaMv35S que está operativamente ligada al extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína FMO RCI5. Para la sobreexpresión, puede utilizarse el vector de expresión pROK2. La construcción de ADN después se integra en una planta u organismo fotosintético tal como una planta de Arabidopsis thaliana y se producen organismos fotosintéticos que sobreexpresan la proteína At FMO GS-OX5, donde el promotor constitutivo induce la sobreexpresión de la proteína FMO. La sobreexpresión de la secuencia que codifica la proteína FMO en la planta u organismo fotosintético cataliza la oxidación de metabolitos endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico.
Como se muestra en la Figura 4b, se proporciona una construcción para la sobreexpresión de una proteína FMO en una planta de Arabidopsis thaliana, donde mirando el 5' de la construcción una secuencia codificante de promotor, tal como PROnos, está provista de un sitio de inicio de transcripción. Un marcador seleccionable, tal como NPTII está provisto de una región de terminación de transcripción, el sitio NOS en el extremo 3' del marcador seleccionable. Un promotor inducible por estrés, tal como el promotor PROrd29a, con un sitio HindII en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3', está provisto de un sitio de inicio de transcripción. La secuencia que codifica la proteína FMO RCI5 (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2) está provista de una región de terminación de transcripción, el sitio NOS ter en el extremo 3' de la secuencia que codifica la proteína FMO. Cada uno de estos componentes está operativamente ligado al siguiente, es decir, la secuencia de codificación del promotor, PROnos, está operativamente ligada al extremo 5' del marcador seleccionable, NPTII, la secuencia codificante de la proteína y la secuencia codificante de la proteína marcadora seleccionable está operativamente ligada al extremo 5' de la secuencia codificante del promotor constitutivo PRORD29a que está operativamente ligada al extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína FMO RCI5. Para la sobreexpresión, puede utilizarse el vector de expresión pROK2. La construcción de ADN después se integra en una planta u organismo fotosintético tal como una planta de Arabidopsis thaliana y se producen los organismos que sobreexpresan la proteína At FMO GS-OX5, donde el promotor inducible por estrés induce la sobreexpresión de la proteína FMO. La sobreexpresión de la secuencia que codifica la proteína FMO en el organismo fotosintético cataliza la oxidación de metabolitos endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico.
Como se muestra en la Figura 5a, se proporciona una construcción para la sobreexpresión de una proteína FMO en una planta de Zea mays, donde mirando en el 5' una secuencia de codificación del promotor constitutivo, tal como el promotor de Ubiquitina, está provista de un sitio de inicio de transcripción. La secuencia que codifica la proteína FMO SI FMO GX-OX1 (SeQ ID NO: 25 o SEQ ID NO:26) está provista de una región de terminación de transcripción, el sitio NOS ter en el extremo 3' de la secuencia que codifica la proteína FMO. Un promotor constitutivo, tal como el promotor CaMv35S, (35S) está provisto de un sitio de inicio de transcripción. Un marcador seleccionable, tal como higromicina está provisto de una región de terminación de transcripción, NOS ter en el extremo 3' del marcador seleccionable. Cada uno de estos componentes está operativamente ligado al siguiente, es decir, la secuencia codificante del promotor constitutivo, Ubiquitina, está operativamente ligada al extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína FMO ZM FMO, la secuencia que codifica la proteína FMO está operativamente ligada al extremo 5' de la secuencia codificante del promotor constitutivo, tal como el promotor CaMv35S, (35S) que está operativamente ligada al extremo 5' de la secuencia codificante de la proteína marcadora seleccionable. Para la sobreexpresión, puede utilizarse el vector de expresión pCAMBIA 1300. La construcción de ADN después se integra en una planta u organismo fotosintético tal como una planta de Zea mays y se producen los organismos que sobreexpresan la proteína ZM FMO, donde el promotor constitutivo induce la sobreexpresión de la proteína FMO y la sobreexpresión de la secuencia que codifica la proteína FMO en el organismo fotosintético cataliza la oxidación de metabolitos endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico.
Como se muestra en la Figura 5b, se proporciona una construcción para la sobreexpresión de una proteína FMO en una planta de Solanum lycopersicum, donde mirando el 5' un promotor inducible por estrés, tal como el promotor PROrd293, está provisto de un sitio de inicio de transcripción. La secuencia que codifica la proteína FMO SI FMO GS-OX1 (SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38) está provista de una región de terminación de transcripción, el sitio NOS ter en el extremo 3' de la secuencia que codifica la proteína FMO. Un promotor constitutivo, tal como el promotor CaMv35S, (35S) está provisto de un sitio de inicio de transcripción. Un marcador seleccionable, tal como higromicina está provisto de una región de terminación de transcripción, NOS ter en el extremo 3' del marcador seleccionable. Cada uno de estos componentes está operativamente ligado al siguiente, es decir, la secuencia codificante del promotor inducible por estrés, promotor PROrd29a, está operativamente ligada al extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína FMO SI FMO GS-OX1, la secuencia que codifica la proteína FMO está operativamente ligada al extremo 5' del promotor constitutivo, tal como el promotor CaMv35S, secuencia codificante (35S) que está operativamente ligada al extremo 5' de la secuencia codificante de proteína marcadora seleccionable. Para la sobreexpresión, puede utilizarse el vector de expresión pCAMBIA 1300. La construcción de ADN después se integra en un organismo fotosintético tal como una planta de Solanum lycopersicum y se producen los organismos que sobreexpresan la proteína SI FMO GS-OX1, donde el promotor inducible por estrés induce la sobreexpresión de la proteína FMO y la sobreexpresión de la secuencia que codifica la proteína FMO en organismo fotosintético cataliza la oxidación de metabolitos endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico.
También se divulga una construcción de ADN para la sobreexpresión de una secuencia que codifica la proteína FMO en organismos fotosintéticos, en donde la construcción de ADN comprende un promotor y la secuencia que codifica la proteína FMO, en donde dicho promotor está operativamente ligado a dicha secuencia que codifica la proteína FMO, en donde la secuencia que codifica la proteína FMO se selecciona de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43.
Como se utiliza en la presente memoria, “ácidos nucleicos" significa biopolímeros de nucleótidos que están unidos entre sí a través de enlaces fosfodiéster (polinucleótidos, ácidos polinucleicos). Dependiendo del tipo de azúcar en los nucleótidos (ribosa o desoxirribosa), se distinguen las dos clases de los ácidos ribonucleicos (ARN) y los ácidos desoxirribonucleicos (ADN).
Como se indicó anteriormente, se divulga un método para producir plantas tolerantes al estrés hídrico, incluyendo pero sin limitarse a tolerancia a la sequía o humedad excesiva, en plantas en donde una aplicación de N-óxido de trimetilamina o “TMAO”, en donde TMAo incluye pero no se limita a, TMAO dihidrato, derivado químico de TMAO, o un análogo químico de TMAO, a una planta o semilla para reducir el estrés hídrico en la planta cuando la planta se expone a condiciones de estrés hídrico. Este método para producir una planta tolerante al estrés hídrico es aplicable a una variedad de plantas incluyendo plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, incluyendo, pero sin limitarse a plantas transgénicas. Como se utiliza en la presente memoria, las plantas transgénicas incluyen plantas, u organismo fotosintético, que han sido genéticamente modificados para que contengan construcciones de ADN foráneas tal como se debatirá después en la presente memoria. Los métodos para producir una planta u organismo tolerante al estrés hídrico pueden ser aplicables a la planta u organismo completo o una parte de una planta, por ejemplo en un órgano, tejido, una célula o una parte de una célula de planta, por ejemplo en un orgánulo, que comprende introducir en, y expresar en, la planta o células de planta un ácido nucleico que codifica una monooxigenasa o proteína FMO, y que media un incremento en la producción de TMAO endógeno y por ello una tolerancia al estrés hídrico, tal como un incremento en la tolerancia a la sequía o un incremento en la tolerancia a la humedad excesiva.
Las metilaminas (por ejemplo, N-óxido de trimetilamina (TMAO)) pueden aumentar el plegamiento de la proteína y la unión al ligando y contrarrestar las perturbaciones por urea (por ejemplo, en elasmobranquios y riñón de mamífero), iones inorgánicos, y presión hidrostática en animales del mar profundo (Yancey, 2005, citado supra).
También se divulga un método para la tolerancia al estrés hídrico en una planta, una parte de planta, o una célula de planta, donde el método comprende la etapa de incrementar la expresión y/o actividad de una proteína monooxigenasa en la planta, parte de planta, o célula de planta en comparación con la planta de tipo salvaje, parte de planta de tipo salvaje o célula de planta de tipo salvaje.
Como se debate anteriormente, los métodos que se describen en la presente memoria están dirigidos a métodos para reducir el estrés hídrico en una planta u organismo mediante la producción de una planta u organismo fotosintético tolerante al estrés hídrico mediante la sobreexpresión de FMO respecto de la planta que ha sido expuesta a o será expuesta a condiciones de estrés hídrico. El efecto de la reducción del estrés hídrico de una planta u organismo fotosintético puede evaluarse comparando los indicadores de fenotipo anteriores entre una sobreexpresión de FMO y una planta que no sobreexpresa FMO después de que las plantas u organismos fotosintéticos se exponen a condiciones de estrés hídrico. Las etapas en las que las plantas u organismo fotosintético que sobreexpresan FMO pueden exponerse a condiciones de estrés hídrico incluyen, por ejemplo, todas las etapas de crecimiento de las plantas, incluyendo un período de germinación, un período de crecimiento vegetativo, un período de crecimiento reproductivo y un período de cosecha.
Una variedad de semillas o bulbos puede utilizarse en los métodos que se describen en la presente memoria incluyendo pero sin limitarse a plantas en las familias Solanaceae y Cucurbitaceae, así como plantas seleccionadas de los géneros de planta Calibrachoa, Capsicum, Nicotiana, Nierembergia, Petunia, Solanum, Cucúrbita, Cucumis, Citrullus, Glycine, tal como Glycine max (Soja), Calibrachoa x hybrida, Capsicum annuum (pimiento), Nicotiana tabacum (tobaco), Nierenbergia scoparia (chucho), Petunia x hybrida, Solanum lycopersicum (tomate), Solanum tuberosum (papa), Solanum melongena (berenjena), Cucurbita maxima (zapallo), Cucurbita pepo (calabaza, zucchini), Cucumis metuliferus (melón africano espinudo) Cucumis melo (melón), Cucumis sativus (pepino) y Citrullus lanatus (sandía). Varias plantas monocotiledóneas, en particular las que pertenecen a la familia se pueden utilizar con los métodos que se describen en la presente memoria, que incluyen, pero sin limitación, plantas seleccionadas de los géneros de planta Hordeum, Avena, Secale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum, Oryza, Hordeum vulgare (cebada), Triticum aestivum (trigo), Triticum aestivum subsp. spelta (espelta), x Triticosecale (Triticale), Avena sativa (avenas), Secale cereale (centeno), Sorghum bicolor (sorgo), Zea mays (maíz), Saccharum officinarum (caña de azúcar) y Oryza sativa (arroz). Los ejemplos adicionales de plantas en que se puede producir estrés hídrico usando los métodos que se describen en la presente memoria incluyen los siguientes cultivos: trigo sarraceno, remolacha, canola, colza, girasol, caña de azúcar, tabaco y guisantes; hortalizas: hortalizas solanáceas tales como pimiento y patata, hortalizas cucurbitáceas; hortalizas crucíferas tales como, rábano japonés, nabo, rábano, colinabo, repollo chino, repollo, mostaza castaña, brócoli y coliflor, hortalizas asteráceas tales como, bardana, guirnalda crisantemo, alcaucil y lechuga; hortalizas liliáceas tales como, cebolleta, cebolla, ajo, espárragos, hortalizas amiáceas tales como zanahoria, perejil, apio y chirivía, hortalizas quenopodiáceas tales como espinaca, acelga, hortalizas lamiáceas tales como, Perilla frutescens, menta, albahaca; fresa, boniato, Dioscorea japonica, colocasia; flores; Plantas de follaje; pastos; frutas: frutos de pepita (manzana, pera, pera japonesa, membrillo chino y membrillo, etc), frutas de hueso, (melocotón, ciruela, nectarina, Prunus mume, cerezas, albaricoque y ciruelas, etc), frutas cítricas (Citrus unshiu, naranja, mandarina, limón, lima, pomelo, etc), frutos secos (castañas, nueces, avellanas, almendras, pistachos, anacardos, nueces de macadamia, etc), bayas (zarzamoras, arándanos, moras, frambuesas, etc), uva, caqui, aceituna, níspero, plátano, café, palmera datilera, cocos, etc.; y árboles diferentes de los árboles frutales; té, morera, plantas de flores, arbolado de las carreteras (fresno, abedul, cerezo silvestre, eucalipto, Ginkgo biloba, lila, arce, Quercus, álamo, árbol de Judas, Liquidambar formosana, plátano de sombra, zelkova, tuya del Japón, abeto, cicuta, enebro, Pinus, Picea, y Taxus cuspidata). Los ejemplos de plantas en las que se puede producir tolerancia al estrés hídrico pueden incluir arroz, maíz, canola, soja y trigo. Las “plantas” mencionadas anteriormente incluyen plantas transgénicas, que expresan otros rasgos de genes.
Como se utiliza en la presente memoria, "plantas" significa todas las plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas, incluyendo, pero sin limitarse a la clase de Liliatae (Monocotyledoneae o plantas monocotiledóneas). El término incluye las plantas maduras, semillas, brotes y plántulas, y partes, material de propagación, órganos de planta, tejido, protoplastos, callos y otros cultivos, por ejemplo, cultivos celulares derivados de los anteriores y todos los otros tipos de asociaciones de células de planta que dan unidades funcionales o estructurales. "Plantas maduras" se refiere a las plantas en cualquier etapa de desarrollo más allá de la etapa de plántula. Plántula significa una planta joven, inmadura en una etapa temprana de desarrollo.
Las plantas dicotiledóneas incluyen las plantas maduras, semillas, brotes y plántulas y partes, material de propagación, órganos de plantas, tejido, protoplastos, callos y otros cultivos, por ejemplo, cultivos celulares derivados de los anteriores y todos los otros tipos de asociaciones de células de planta que dan unidades funcionales o estructurales. Plantas maduras se refiere a las plantas en cualquier etapa de desarrollo más allá de la etapa de plántula. Plántula significa una planta joven, inmadura en una etapa temprana de desarrollo.
“Planta" también comprende plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas anuales o perennes e incluye a modo de ejemplo, pero sin limitarse a, aquellas del género Glycine, Vitis, Asparagus, Populus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Saccharum y Lycopersicum.
Como se debate anteriormente, otra divulgación proporciona un método para producir una planta u organismo fotosintético, tal como una planta monocotiledónea o dicotiledónea, con una tolerancia al estrés hídrico, que comprende introducir en y expresar en la planta u organismo fotosintético un ácido nucleico o aminoácido tal como SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 2, que codifica una proteína monooxigenasa, tal como la proteína FMO GS-OX5. Un ejemplo de la proteína monooxigenasa puede incluir pero no se limita a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43, en donde la secuencia de nucleótidos comprende al menos una molécula de ácido nucleico. La secuencia de aminoácidos puede tener una identidad porcentual del 80% o más de las secuencias enumeradas anteriormente y/o la región 5'-no traducida (5'UTR) en comparación con la secuencia original.
Los métodos que se describen en la presente memoria también incluyen a) introducir en una célula de planta u organismo fotosintético un casete de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico en una unión operable con un promotor que está activo en una planta u organismos fotosintéticos; b) regenerar una planta u organismo fotosintético a partir de la célula de planta u organismo fotosintético, y c) expresar la molécula de ácido nucleico para generar o para incrementar una tolerancia al agua en la planta u organismo fotosintético.
La divulgación también se refiere a una planta tolerante al estrés hídrico producida mediante los métodos divulgados en el presente documento.
Los métodos que se describen en la presente memoria además proporcionan organismos fotosintéticos o una planta, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína FMO (SEQ ID NOs: 1-43), un casete de expresión de ADN, o un vector que comprende el casete de expresión de ADN, o que comprende una célula que comprende la molécula de ácido nucleico tal como la proteína FMO (SEQ ID NOs: 1-43), el casete de expresión, o el vector. Los ejemplos pueden incluir generar una planta transgénica que es tolerante al estrés hídrico, que puede comprender la molécula de ácido nucleico, tal como una secuencia que codifica la proteína FMO (SEQ ID NOs: 1-43), un casete de expresión de ADN, un vector que comprende el casete de expresión, o una célula que comprende la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, o el vector. Puede generarse un material o composición de propagación de la planta que comprende una molécula de ácido nucleico tal como la secuencia que codifica la proteína FMO (tal como SEQ ID NOs: 1-43), un casete de expresión de ADN que comprende la secuencia que codifica la proteína FMO, o un vector que comprende el casete de expresión, o una célula que comprende la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, o el vector para proporcionar una planta, parte de planta, o célula de planta tolerante a la sequía.
Como se debate anteriormente y se muestra en la Figura 2, las proteínas FMO que se describen en la presente memoria pueden incluir una secuencia de nucleótidos exógena que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95% de identidad con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43, en una planta u organismo fotosintético, una parte de una planta, o una célula de planta, y expresando la secuencia de nucleótidos en la planta u organismo fotosintético, la parte de la planta, o la célula de la planta. Además, la secuencia de nucleótidos puede incrementarse en la planta u organismo fotosintético, la parte de la planta, o la célula de la planta en comparación con la planta original, o de tipo salvaje, parte de la planta, o célula de la planta.
Los métodos de sobreexpresión e incremento de una proteína FMO como se describe en la presente memoria, incluyendo una o más construcciones de ADN para su uso en la sobreexpresión de la proteína FMO, integración estable de la proteína FMO en un genoma de ADN de planta u organismo fotosintético y la sobreexpresión de la construcción de ADN en la planta u organismo fotosintético, puede utilizarse en una variedad de plantas, incluyendo pero sin limitarse a: soja, patata, algodón, colza, colza oleaginosa, canola, girasol, alfalfa, trébol, plátano, mora, arándano, fresa, frambuesa, melón cantalupo, zanahoria, coliflor, café, pepino, berenjena, uva, melón verde, lechuga, mango, melón, cebolla, papaya, pimiento, piña, calabaza, espinaca, zapallo, tabaco, tomate, tomatillo, sandía, manzana, melocotón, pera, cereza, ciruela, brócoli, col, coliflor, coles de Bruselas, colirrábano, grosellas, aguacate, naranja, limón, pomelo, mandarina, alcachofa, cereza, nuez, cacahuete, endivias, puerros, arrurruz, remolacha, yuca, nabo, rábano, boniato; guisante, judías, caña de azúcar, césped, Miscanthus, Panicum virgatum, trigo, maíz, maíz dulce, arroz, mijo, sorgo, cebada, centeno, así como varios tipos de organismos fotosintéticos incluyendo pero sin limitarse a diatomeas, algas eucariotas y cianobacterias
Como se muestra en la Figura 2, los genes con elevada identidad con respecto a FMO GS-OX5 median funciones similares. Como se muestra en la Figura 2 los genes, ácidos nucleicos utilizados o proteínas expresadas pueden tener el 40% o más de identidad, incluyendo pero sin limitarse a al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad, en comparación con la respectiva secuencia FMO GS-OX5 de Arabidopsis (At1g12140) (SEQ ID NO: 1) [secuencia de a Dnc con UTR] o la secuencia de proteínas SEQ ID NO.: 2). Los genes con las homologías más elevadas respecto a At1g12140 de Solanum lycopersicum SIFMO GS-OX1 (Solyc06g060610) (SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38), SIFMO GS-OX2 (AK324297.1), Vitis vinifera VvFMO GS-OX3-1 (SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22) (LOC100242032), VvFMO GS-OX3-2 (LOC100255688) (SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20), VvFMO GS-OX3-3 (LOC100255688) (SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18;, Populus trichocarpa PtFMOGS-OX3 (XM_002329873.1) (SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28), PtFMO GS-OX2 (XM_002318967.1) (SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30), PtFMO GS-OX1 (XP002318210,1), Oryza sativa OsFMO-OX(Os10g40570,1) (SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16), Glycine max GmFMO (Glyma11g03390,1) (SEQ ID NO: 33 y s Eq ID NO: 34), Cucumus sativus CsFMO GS-OX3-1 (LOC101227975) (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12), CsFMO GS-OX3-2 (LOC101220079) (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10), CsFMO GS-OX3-3 (LOC101220318) (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8), CsFMO GS-OX3-4 (LOC101212991) (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6), Brassica rapa subsp. pekinensis BrFMO GS-OX1 (FJ376070,1), Medicago truncatula MtFMO GS-OX5 (MTR_5g012130) (SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14), Zea mays ZmFMO (GRMZM2G089121_P01) (SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26), Gossypium hirsutum GhFMO-1 (DQ122185.1) SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24) Homo sapiens HsFMO-3 (NP_001002294.1) (SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40) y Oryctolagus cuniculus OcFMO-5 (NP_001075714.1) SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42) probablemente ejercen funciones similares en la planta u organismo fotosintético como el polipéptido FMO GS-OX5 de Arabidopsis (AtFMO GS-OX5). Como se debate anteriormente, la Figura 2 proporciona un árbol filogenético de las secuencias de polipéptidos detalladas más arriba de FMO de Arabidopsis thaliana, vid, Populus trichocarpa, arroz, soja, melón, tomate, sorgo, maíz, trigo, cebada, ser humano y conejo.
Como se muestra en la Figura 2, la expresión equivalente de proteínas FMO puede esperarse para las secuencias que tienen el 40% o más de identidad, incluyendo pero sin limitarse a al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad, en comparación con otras secuencias de FMO tal como la respectiva secuencia de FMO GS-OX5 de Arabidopsis.
Como se utiliza en la presente memoria, “proteína FMO” o “polipéptido FMO” significa una proteína con el 100% de la secuencia completa o partes de la secuencia, que media un aumento de la expresión de TMAO en una planta u organismo fotosintético a través de la catalización de la oxidación de metabolitos endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico y confiriendo tolerancia mejorada al estrés hídrico cuando se expresa en plantas u organismos fotosintéticos. "Proteína FMO" se entiende que quiere decir una secuencia que comprende un dominio N-terminal, un dominio de flavina monooxigenasa y un dominio C-terminal (Li et al., Plant Physiol. 148(3):1721-33 (2008). Por ejemplo, el polipéptido que se emplea en el método, tiene una actividad que está involucrada en las respuestas de defensa al estrés hídrico y aumenta TMAO endógeno. Un polipéptido puede ser identificado como un FMO si es capaz de catalizar la conversión de trimetilamina (TMA) a TMAO en presencia de FAD y NADPH. La actividad se puede determinar en un ensayo in vitro como se muestra, por ejemplo, en el ejemplo 2.2 de la solicitud WO20100348261.
El término "sobreexpresión", como se utiliza en la presente memoria, significa que una célula determinada produce un aumento en el número de una cierta proteína en relación con una célula normal. A los efectos de la presente divulgación, el nivel original de expresión de tipo salvaje también podría ser cero, es decir ausencia de expresión o expresión inapreciable. Se entenderá que la proteína FMO que se sobreexpresa en células según los métodos de la invención puede ser de la misma especie que la célula de planta en donde la sobreexpresión se está llevando a cabo o puede obtenerse de una especie diferente. En el caso en donde la proteína FMO endógena se sobreexpresa, los niveles de la proteína FMO son al menos tres veces con respecto al mismo polipéptido que se produce de forma endógena por la célula de la planta. En el caso en donde una proteína heteróloga FMO se sobreexpresa, los niveles de la proteína heteróloga FMO son de al menos tres veces los niveles de la proteína endógena FMO. En una divulgación preferente, la proteína FMO se sobreexpresa al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 o más veces con respecto a la proteína endógena FMO.
En una divulgación, la planta divulgada en el presente documento ha sido transformada por la introducción de una proteína FMO homóloga o heteróloga de manera que la actividad de FMO en un lisado celular de dicha planta es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o más con respecto a la actividad de FMO en la planta no transformada. La actividad FMO en el lisado celular se puede determinar como se describe en el ejemplo 2.2 de la solicitud PCT WO20100348261, en donde el extracto se pone en contacto con TMA en presencia de FAD y NADPH y se determina la producción de TMAO.
En otra divulgación, la sobreexpresión de la proteína FMO homóloga o heteróloga debe ser suficiente para incrementar los niveles de TMAO endógenos al menos 2 veces, al menos 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o más con respecto a los niveles endógenos de TMAO medidos en ausencia de estrés, en donde el estrés es estrés abiótico, incluyendo estrés por sequía, estrés salino, estrés osmótico, estrés por grumo, estrés UV y estrés por calor. Los niveles de TMAO se pueden determinar mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, el método descrito en la solicitud PCT WO20100348261 basado en la reducción de TMAO a TMA en presencia de TiCl3 y detectando la cantidad de TMA formado en la reacción.
La proteína FMO está codificada por ejemplo, por una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) molécula de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que comprende la secuencia que se muestra en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína FMO, tal como proteína FMO GS-OX5 (SEQ ID NO: 1) o las partes funcionales de la proteína, expresa y media un incremento en la tolerancia al estrés hídrico, incluyendo un incremento en la tolerancia a la sequía. Como se debate en los métodos anteriormente, la proteína FMO se introduce en y se expresa en la planta u organismo fotosintético o célula de planta o una parte de la misma, o la proteína FMO puede expresarse en forma endógena según los métodos que se describen en la presente memoria.
A modo de ejemplo la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína FMO puede seleccionarse del grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que comprende la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43; (b) una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un polinucleótido de la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44; (c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia tiene al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%, identidad con una cualquiera de las secuencias que se muestran en el párrafo (a) o (b) detallado anterioemente donde la molécula de ácido nucleico detallada en los párrafos (a) y (b) anteriormente tienen una función biológica similar o igual que una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido; (e) molécula de ácido nucleico según (a) a (d) que codifica un fragmento o un epítopo de la secuencias como se muestra en los párrafos (a) y (b), en donde el fragmento es un fragmento funcional que confiere tolerancia al estrés por sequía; (f) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es reconocido por un anticuerpo monoclonal dirigido contra un polipéptido que está codificado por las moléculas de ácidos nucleicos como se muestra en (a) a (d); (g) molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de una molécula de ácido nucleico como se muestra en (a) a (d); y (h) molécula de ácido nucleico que puede aislarse de una genoteca de ADN utilizando una molécula de ácido nucleico como se muestra en (a) a (d) o sus fragmentos-partes de al menos 15 nt, 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt o 500 nt, como sonda en condiciones de hibridación rigurosas; (i) un ácido nucleico que codifica la misma proteína FMO que las secuencias de ácidos nucleicos detalladas en los párrafos (a) a (d) anteriormente, pero que difieren de las secuencias de (a) a (d) anteriormente debido a la degeneración del código genético; o una secuencia complementaria de la misma.
Otras proteínas heterólogas codificadas por el gen quimérico incluyen polipéptidos que forman epítopos inmunológicamente activos, y enzimas que catalizan la conversión de metabolitos intracelulares, con la consiguiente acumulación de metabolitos seleccionados en las células.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “secuencia/s” se utiliza por razones de simplificación, y se refiere, dependiendo del contexto, al ácido nucleico y/o secuencias de aminoácidos descritas en este documento. El experto en la materia sabrá del contexto a qué se refieren. El término "fragmento de ADN" como se usa en el presente documento se entiende que quiere decir porciones del ADN que codifican una proteína cuando su actividad biológica consiste en la mediación de un aumento de la tolerancia al estrés por sequía. El término "fragmentos de la proteína" como se utiliza en la presente memoria se refiere a porciones de la proteína cuya actividad biológica comprende mediar un aumento en la tolerancia al estrés por sequía en las plantas.
“Cantidad de polipéptido” como se utiliza en la presente memoria significa, por ejemplo, el número de moléculas, o moles, de moléculas de polipéptido FMO en un organismo, un tejido, una célula o un tal sustrato o producto agroquímico, producto fitosanitario por compartimento celular. Incrementar la cantidad de polipéptido significa el aumento molar en el número de los respectivos polipéptidos en un organismo, un tejido, una célula o un compartimento celular. Por ejemplo, por uno de los métodos que se describen en la presente memoria más adelante, en comparación con un control adecuado, por ejemplo, la (planta control) de tipo salvaje de la misma especie y género a la que este método no ha sido aplicado, en condiciones de otra manera idénticas (tal como, por ejemplo, condiciones de cultivo, edad de las plantas y similares). El incremento en este contexto equivale a al menos el 5%, al menos el 10% o al menos el 20%, así como al menos el 40% o el 60%, al menos el 70% o el 80%, y al menos el 90%, 95%, 99%, 100%, más que el 100%, incluyendo el 150%, 200% o 300%.
La identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos se entiende que quiere decir la identidad de la secuencia de ácidos nucleicos respecto de en cada caso la longitud de secuencia completa, que se calcula mediante la comparación con la ayuda del algoritmo de programa GAP (Wisconsin Package Versión 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)), que establece los siguientes parámetros:\
Ponderación de hueco: 50 ponderación de longitud: 3
Correspondencia promedio: 10 Falta de correspondencia promedio: 0
Por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 a nivel de ácido nucleico se entiende que quiere decir una secuencia que, en la comparación con la secuencia SEQ ID NO: 1 por el algoritmo de programa anterior con el conjunto de parámetros anteriores, tiene al menos el 80% de identidad.
La identidad entre dos polipéptidos se entiende que quiere decir la identidad de la secuencia de aminoácidos respecto de en cada caso la longitud de secuencia completa que se calcula mediante la comparación con la ayuda del algoritmo de programa GAP (Wisconsin Package Versión 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA), que establece los siguientes parámetros:
Ponderación de hueco: 8 ponderación de longitud: 2
Correspondencia promedio: 2.912 Falta de correspondencia promedio: -2.003
Por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 80% de identidad a nivel de polipéptido con la secuencia SEQ ID NO: 2 se entiende que quiere decir una secuencia que, en la comparación con la secuencia SEQ ID NO: 2 por el algoritmo de programa anterior con el conjunto de parámetros anteriores, tiene al menos el 80% de identidad.
La tolerancia al estrés por sequía de una planta u organismo como se describe en la presente memoria se obtiene introduciendo y sobreexpresando una secuencia de ácido nucleico tal como pero sin limitarse a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43. Adicionalmente, es posible incrementar la sobreexpresión endógena o actividad de estas secuencias en una planta u organismo mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, un incremento en la sobreexpresión endógena puede obtenerse por la mutación de una región UTR, tal como 5'-UTR, una región promotora, una región codificante genómica para el centro activo, para sitios de unión, para señales de localización, para dominios, grupos y similar, tal como, por ejemplo, de las regiones de codificación para el N-terminal, la proteína FMO o los dominios C-terminales. La expresión o actividad endógena puede incrementarse según la divulgación por mutaciones que afectan la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de la proteína.
Las mutaciones se pueden insertar, por ejemplo, por una mutagénesis EMS. Los dominios pueden ser identificados por programas informáticos adecuados tal como, por ejemplo, SMART o InterPRO, por ejemplo, como se describe en Andersen P., The Journal of Biol. Chemistry, 279, 38 o 39053, (2004) o Mudgil, Y., Plant Physiology, 134, 59, (2004), y la bibliografía citada en los mismos. Los mutantes apropiados entonces pueden identificarse por ejemplo porTILLING (por ejemplo, según lo descrito por Henikoff, S., et al., Plant Physiol. 135: 630-6 (2004)).
La introducción y sobreexpresión de una secuencia según los métodos que se describen en la presente memoria en una planta u organismo fotosintético, o el incremento o modificación o mutación de una secuencia endógena, en su caso de una o ambas regiones no traducidas, en una planta u organismo fotosintético se combina con el incremento de la cantidad de polipéptido, función o actividad de otros factores de resistencia, tal como un inhibidor de la proteína Bax 1 (BI-1), tal como una proteína inhibidora de Bax 1 de Hordeum vulgare (No. de Acceso a GenBank: AJ290421), de, Nicotiana tabacum (No. de Acceso a GenBank: AF390556), arroz (No. de Acceso a GenBank: AB025926), Arabidopsis (No. de Acceso a GenBank: AB025927) o tobaco y aceite de semilla de colza (No. de Acceso a GenBank: AF390555, Bolduc N et al. (2003) Planta 216, 377 (2003)) o de ROR2 (por ejemplo, de cebada (No. de Acceso a GenBank: AY246906), SnAP34 (por ejemplo, de cebada (No. de Acceso a GenBank: AY247208) y/o de la proteína de unión lumenal BiP por ejemplo de arroz (No. de Acceso a GenBank AF006825). Un aumento puede lograrse, por ejemplo, por mutagénesis o la sobreexpresión de un transgén, entre otras cosas.
Una molécula de ácido nucleico, como se utiliza en la presente memoria, comprende la secuencia no traducida en el extremo terminal 3' y 5' de la región génica de codificación: al menos 500, o 200, o 100 nucleótidos de la secuencia corriente arriba del extremo terminal 5' de la región codificante y al menos 100, o 50, o 20 nucleótidos de la secuencia corriente abajo del extremo terminal 3' de la región génica codificante.
Además, las secuencias de ácido nucleico son secuencias de ácidos nucleicos aisladas. Una molécula de ácido nucleico “aislada” está separada de otras moléculas de ácidos nucleicos que están presentes en el origen natural del ácido nucleico. Un ácido nucleico “aislado” preferentemente no contiene secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico del organismo del que procede el ácido nucleico (por ejemplo, secuencias que se encuentran en el extremo terminal 5 'y 3' del ácido nucleico, sin embargo, esto no afecta las divulgaciones mencionadas anteriormente que comprenden las regiones 5'- y 3'-UTR). En diferentes divulgaciones, la molécula aislada puede comprender por ejemplo menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se origina el ácido nucleico. Todas las moléculas de ácidos nucleicos mencionados aquí pueden ser por ejemplo Ar N, ADN o ADNc.
Las moléculas de ácidos nucleicos pueden aislarse utilizando técnicas convencionales de biología molecular y la información de secuencia aquí contenida. Usando algoritmos comparativos, es posible identificar por ejemplo una secuencia homóloga, o regiones de secuencias conservadas, homólogas, a nivel de ADN o aminoácidos. Las porciones esenciales de esta secuencia o la totalidad de la secuencia homóloga se pueden utilizar como sonda de hibridación usando técnicas estándar de hibridación (tal como, por ejemplo, se describe en Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) para aislar aún más las secuencias de ácidos nucleicos que son útiles en el método de otros organismos mediante la selección de genotecas de ADNc y/o genotecas genómicas.
Por otra parte, una molécula de ácido nucleico o una parte de la misma puede aislarse por medio de la reacción en cadena de polimerasa ("PCR"), donde se utilizan cebadores de oligonucleótidos basados en las secuencias especificadas en el presente documento o partes de las mismas (por ejemplo, es posible aislar una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia completa o parte de la misma por medio de PCR utilizando cebadores de oligonucleótidos que se han generado sobre la base de la misma secuencia). Por ejemplo, el ARNm se puede aislar a partir de células (por ejemplo, mediante el método de extracción de tiocianato de guanidinio por Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)) y el ADNc preparar a partir del mismo por medio de transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa Moloney MLV, obtenible de Gibco/BRL, Bethesda, Md. o transcriptasa inversa a Mv , disponible de Seikagaku Amerika, Inc., St. Petersburg, Fla.). Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación mediante PCR se pueden generar sobre la base de las secuencias divulgadas en la presente memoria. Un ácido nucleico puede amplificarse utilizando ADNc o, alternativamente, ADN genómico como molde y cebadores de oligonucleótidos apropiados por medio de técnicas estándar de amplificación por PCR. El ácido nucleico amplificado de ese modo puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por medio de análisis de secuencia de ADN. Los oligonucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína se pueden preparar por métodos sintéticos estándar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automático.
Como se utiliza en la presente memoria “introducción” o “introducir” comprende todos los métodos, incluyendo, pero sin limitarse a transfección, transducción o transformación, que son adecuados para introducir directa o indirectamente, en una planta o una célula, compartimiento, tejido, órgano o semilla, una secuencia de ácido nucleico, o generar éste en los mismos. La introducción puede conducir a una presencia transitoria o estable de una secuencia de ácidos nucleicos.
También se describe en la presente memoria el producto obtenido de una planta u organismo fotosintético que comprende una molécula de ácido nucleico, un casete de expresión de ADN, o un vector que comprende el casete de expresión, o que comprende una célula que comprende la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, o el vector, o planta que es tolerante al estrés por sequía, obtenida por el método que comprende utilizar la molécula de ácido nucleico, un casete de expresión de ADN, un vector que comprende el casete de expresión, o una célula que comprende la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, o el vector, de una planta u organismo fotosintético producible por el método que se describe en la presente memoria o de una planta, parte de planta, semilla transgénica, organismo fotosintético o planta transgénica.
También se divulga un cultivo de tejido de células producidas a partir de la planta de la divulgación (tolerante al estrés por sequía producida por el método divulgado en el presente documento), en donde las células del cultivo de tejido se producen a partir de una parte de planta elegida de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilo, células meristemáticas, raíces, ápices de raíz, pistilos, anteras, flores, y tallos. Como entiende un experto en la materia, dichas hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilo, células meristemáticas, raíces, ápices de raíz, pistilos, anteras, flores, y tallos comprenden la proteína f Mo .
También se divulga una planta regenerada a partir del cultivo de tejido de la invención. Como puede entender un experto en la materia dicha planta regenerada comprende una proteína FMO.
También se divulga un método para producir un organismo fotosintético que sobreexpresa una o más secuencias que codifican la proteína FMO en dicho organismo fotosintético, que comprende:
cultivar una planta transformada con una secuencia que codifica una proteína FMO operativamente ligada a un promotor en donde la proteína FMO y promotor están integrados en forma estable en el genoma nuclear de dicho organismo fotosintético o genoma de cloroplasto de dicha planta en condiciones apropiadas para la sobreexpresión de la proteína FMO en el organismo fotosintético, en donde la sobreexpresión de la secuencia que codifica la proteína FMO en dicho organismo fotosintético cataliza la oxidación de metabolitos endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico.
En una divulgación preferente, una o más proteína FMO comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43
En otra divulgación preferente, una o más proteína FMO comprende al menos una variante funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95% de identidad con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43..
En otra divulgación preferente, en donde una o más proteína FMO comprende al menos una variante funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43.
En otra divulgación preferente, una o más proteína FMO comprende al menos una variante funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43.
En otra divulgación preferente, en donde una o más proteína FMO comprende al menos una variante funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43
En otra divulgación preferente, una o más proteína FMO comprende al menos una variante funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60% de identidad con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43.
En otra realización preferente, una o más proteína FMO comprende al menos una variante funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 50% de identidad con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43.
“Variante funcionalmente equivalente ", se entiende que quiere decir todas aquellas proteínas derivadas de la secuencia de FMO por la modificación, inserción y/o deleción de uno o más aminoácidos, siempre que la función se mantenga sustancialmente, en particular la capacidad de generar TMAO a partir de TMO (trimetilamina).
Otra divulgación proporciona un método para la producción de un producto, aquí el método para la producción de un producto, que comprende: a) cultivar una planta que comprende la molécula de ácido nucleico divulgada en la presente memoria, un casete de expresión de ADN como se divulga en la presente memoria, o un vector que comprende el casete de expresión, o que comprende una célula que comprende la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, o el vector o es obtenible por el método de la divulgación; b) producir el producto a partir de o por la planta y/o parte, o semillas de la planta.
Otra divulgación es el método para la producción de un producto, que comprende: a) cultivar una planta que comprende la molécula de ácido nucleico, un casete de expresión de a Dn , o un vector que comprende el casete de expresión, o que comprende una célula que comprende la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, o el vector o es obtenible por el método y retirar la planta, parte de planta, planta transgénica, o semilla transgénica ; y b) producir el producto de o por la planta, parte de planta, planta transgénica, o semilla transgénica de la planta.
Como se utiliza en la presente memoria “epítopo” se entiende que quiere decir las regiones de un antígeno que determinan la especificidad de los anticuerpos (el determinante antigénico). Por consiguiente, un epítopo es la porción de un antígeno que realmente entra en contacto con el anticuerpo.
Tales determinantes antigénicos son aquellas regiones de un antígeno contra las que los receptores de células T reaccionan y, como consecuencia, producen anticuerpos que se unen específicamente al determinante antigénico/epítopo de un antígeno. En consecuencia, los antígenos, o sus epítopos, son capaces de inducir la respuesta inmune de un organismo con la consecuencia de la formación de anticuerpos específicos que están dirigidos contra el epítopo. Los epítopos consisten por ejemplo en secuencias lineales de aminoácidos en la estructura primaria de las proteínas, o de estructuras de proteínas terciarias o secundarias complejas. Se entiende que un hapteno quiere decir un epítopo que se disocia del contexto del entorno antígeno. Aunque haptenos tienen por definición un anticuerpo dirigido contra ellos, los haptenos, bajo ciertas circunstancias, no son capaces de inducir una respuesta inmune en un organismo, por ejemplo, después de una inyección. Para este fin, los haptenos se acoplan a las moléculas portadoras. Un ejemplo que se puede mencionar es dinitrofenol (DNP), que, después del acoplamiento a BSA (albúmina de suero bovino), se ha utilizado para generar anticuerpos que se dirigen contra DNP (Bohn, A., Konig, W. (1982), Immunology 47 (2), 297).
Los haptenos son sustancias (sustancias con frecuencia de bajo peso molecular o sustancias pequeñas) que, si bien ellas mismas no activan la respuesta inmune, de hecho, desencadenarán una respuesta cuando se acopla a un vehículo molecular grande. Los anticuerpos generados de ese modo también incluyen los que pueden unirse al hapteno solo.
Otra divulgación se refiere a un anticuerpo contra un polipéptido de proteína FMO como se describe, en particular a un anticuerpo monoclonal que se une al polipéptido FMO que comprende una secuencia de aminoácidos o consiste en la misma, como se muestra en la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 3
Figure imgf000021_0001
SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43.
Estos anticuerpos pueden ser utilizados para identificar y aislar polipéptidos divulgados en el presente documento, de organismos, incluyendo plantas, tal como plantas monocotiledóneas, así como plantas dicotiledóneas. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales o sintéticos por naturaleza o además consistir en fragmentos de anticuerpo tal como fragmentos Fab, Fv o scFv, que se forman por la degradación proteolítica. Los fragmentos Fv de “cadena sencilla” (scFv) son fragmentos de cadena sencilla que, unidos a través de una secuencia enlazadora flexible, sólo comprenden las regiones variables de las cadenas de anticuerpos ligera y pesada. Tales fragmentos scFv también se pueden producir como derivados de anticuerpos recombinantes. Una presentación de tales fragmentos de anticuerpos en la superficie de fagos filamentosos hace posible la selección directa, a partir de genotecas de fagos combinatorios, de moléculas de scFv que se unen con alta afinidad. Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener según el método descrito por Kohler y Milstein in Nature 256, 495 (1975).
Cribar genotecas de ADNc o genotecas genómicas de otros organismos, incluyendo la planta y organismos fotosintéticos mencionados en la presente memoria, que son apropiados como huéspedes de transformación, utilizando las secuencias de ácidos nucleicos que se describen en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44; o partes de las mismas como sonda es también un método conocido por los expertos para identificar homólogos en otras especies. En este contexto, las sondas obtenidas de la secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: , SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44; tienen una longitud de al menos 20 bp, o al menos 50 bp, o al menos 100 bp, o al menos 200 bp, o al menos 400 bp. La sonda también puede tener una longitud de una o más kilobases, por ejemplo, 1 kb, 1,5 kb o 3 kb. Una hebra de ADN que es complementaria a las secuencias descritas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44 o un fragmento de la misma hebra con una longitud de entre 20 bp y varias kilobases también puede emplearse para el cribado de genotecas.
En una divulgación adicional, las secuencias que codifican las proteínas FMO puede hibridarse en condiciones estándar con las moléculas de ácidos nucleicos descritas por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44 ; y que codifican las proteínas FMO, con las moléculas de ácido nucleico que son complementarias a las anteriores o con partes de las anteriores y que, como las secuencias completas, codifican polipéptidos que esencialmente tienen propiedades idénticas, propiedades funcionales preferentes, respecto de los polipéptidos descritos en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43 también pueden usarse. Como se utiliza en la presente memoria "condiciones de hibridación estándar" se ha de entender en el sentido amplio y significa, dependiendo de la aplicación, condiciones de hibridación rigurosas o de lo contrario menos rigurosas. Tales condiciones de hibridación se describen, entre otras, en Sambrook J, et al. 1989, páginas 9.31 a 9.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. y. (1989), 6.3.1 a 6.3.6. Los expertos en la materia, basándose en sus conocimientos técnicos, elegirían las condiciones de hibridación que les permitan diferenciar entre hibridaciones inespecíficas y específicas.
Por ejemplo, las condiciones durante la etapa de lavado se pueden seleccionar entre condiciones de baja rigurosidad (con aproximadamente 2*SSC a 50°C) y condiciones de alta rigurosidad (con aproximadamente 0,2*SSC a 50°C, preferentemente a 65°C) (20*SSC: citrato de sodio 0,3 M, NaCl 3 M, pH 7,0). Además, la temperatura durante la etapa de lavado se puede elevar desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de mayor rigurosidad a aproximadamente 65°C. Los dos parámetros, la temperatura y la concentración de sal, se pueden variar de forma simultánea o al contrario por separado, manteniendo en cada caso el otro parámetro constante. Durante la hibridación, es posible emplear agentes desnaturalizantes tales como, por ejemplo, formamida o SDS. En presencia de formamida al 50% la hibridación se lleva a cabo preferentemente a 42°C. Algunos ejemplos de condiciones preferidas para la etapa de hibridación y de lavado se detallan en la presente memoria a continuación:
Las condiciones de hibridación pueden seleccionarse, por ejemplo, entre las siguientes condiciones:
4*SSC a 65°C,
6*SSC a 45°C,
6*SSC, 100 [mu] g/ml de ADN de esperma de pescado fragmentado desnaturalizado a 68°C,
6*SSC, SDS al 0,5%, 100 [mu]g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 68°C,
6*SSC, SDS al 0,5%, 100 [mu]g/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, formamida al 50% a 42°C,
formamida al 50%, 4*SSC a 42°C,
formamida al 50% (vol/vol), seroalbúmina bovina al 0,1%, Ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6,5, NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C,
2* o 4*SSC a 50°C (condición de baja rigurosidad),
formamida del 30 al 40%, 2* o 4*SSC a 42°C (condición de baja rigurosidad), o
tampón fosfato de sodio 500 mN pH 7,2, SDS al 7% (g/V), EDTA 1 mM, Ad N monocatenario 10 [mu]g/ml, BSA al 0,5% (g/V) (véase Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Science. U.S.A 81: 1991 (1984))
(2) Las etapas de lavado se pueden seleccionar, por ejemplo, entre las siguientes condiciones:
a) NaCl 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/SDS al 0,1% a 50°C,
b) 0,1*SSC a 65°C,
c) 0,1*SSC, SDS al 0,5% a 68°C,
d) 0,1*SSC, SDS al 0,5%, formamida al 50% a 42°C,
e) 0.2*SSC, SDS al 0,1% a 42°C, o
f) 2*SSC a 65°C (condición de baja rigurosidad).
Otros ejemplos de condiciones de hibridación se seleccionan según lo presentado a continuación:
Se elige un tampón de hibridación que comprende formamida, NaCl y PEG 6000. La presencia de formamida en el tampón de hibridación desestabiliza las moléculas de ácidos nucleicos bicatenarios, por lo cual la temperatura de hibridación se puede bajar a 42°C sin reducir de ese modo la rigurosidad. El uso de la sal en el tampón de hibridación aumenta la velocidad de renaturalización de un dúplex de ADN, en otras palabras, la eficiencia de hibridación. Si bien el PEG aumenta la viscosidad de la solución, que tiene un efecto negativo en las tasas de renaturalización, la presencia del polímero en la solución aumenta la concentración de la sonda en el medio restante, lo que aumenta la velocidad de hibridación. La composición del tampón es:
Tampón de hibridación:
tampón fosfato de sodio 250 mM pH 7,2
EDTA 1 mM
SDS al 7% (g/v)
NaCl 250 mM
ADNmc 10 [mu]g/ml
polietilenglicol (PEG) 6000 al 5%
formamida al 40%
Las hibridaciones se llevan a cabo durante aproximadamente 12 horas a 42°C, durante la noche, por ejemplo. Los filtros se lavan a continuación 3* con 2*SSC SDS al 0,1% durante en cada caso aproximadamente 10 minutos. Como se utiliza en la presente memoria la "modificación" de las secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos comprende mutarlos, o mutaciones. A los efectos que se describen en la presente memoria, se entiende que las "mutaciones" son la modificación de la secuencia de ácidos nucleicos de una variante del gen en un plásmido o en el genoma de un organismo. Las mutaciones se pueden generar por ejemplo como consecuencia de errores durante la replicación, o por medio de mutágenos. La tasa de mutación espontánea en el genoma de la célula de los organismos es muy baja, sin embargo, los expertos en la materia conocen una multiplicidad de mutágenos biológicos, químicos o físicos y métodos para la mutación de secuencias de nucleótidos de forma dirigida o al azar, y por lo tanto, en última instancia potencialmente también para la modificación de la secuencias de aminoácidos que codifican.
Las mutaciones comprenden sustituciones, adiciones, supresiones o de uno o más residuos de ácido nucleico. Se entiende que las sustituciones son el intercambio de bases de ácidos nucleicos individuales, en donde se distingue entre transiciones (sustitución de una base de purina por una base de purina, y de una base de pirimidina por una base de pirimidina) y transversiones (sustitución de una base de purina por una base de pirimidina, o viceversa). Se entiende que la adición o inserción quiere decir la incorporación de residuos de ácidos nucleicos adicionales en el ADN, lo que puede dar lugar a cambios de marco de lectura. En el caso de tales desplazamientos del marco de lectura, se distingue entre inserciones/adiciones en marco e inserciones fuera del marco. En el caso de las inserciones/adiciones en marco, el marco de lectura se conserva, y se forma un polipéptido que se alarga por el número de los aminoácidos codificados por los ácidos nucleicos insertados. En el caso de inserciones/adiciones fuera del marco, el marco de lectura original se pierde, y la formación de un polipéptido funcional y completo en muchos casos ya no es posible, lo cual por supuesto depende del sitio de la mutación.
Las deleciones describen la pérdida de uno o más pares de bases, que conduce igualmente a cambios de marco de lectura en marco o fuera del marco y las consecuencias que esto conlleva en lo que respecta a la formación de una proteína intacta.
Los expertos en la materia estarán familiarizados con los agentes mutagénicos (mutágenos) que se pueden utilizar para generar mutaciones al azar o dirigidas y tanto con los métodos como con las técnicas que se pueden emplear. Tales métodos y mutágenos se describen por ejemplo en van Harten AM ("Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido (1998)), Friedberg E., G. Walker, Siede W. ("DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing (1995)), o Sankaranarayanan K., Gentile J.M., Ferguson L.R. ("Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences (2000)).
Los métodos y procesos habituales de la biología molecular tales como, por ejemplo, el kit de mutagénesis in vitro, "LA PCR in vitro Mutagenesis Kit" (Takara Shuzo, Kyoto), o mutagénesis por PCR usando cebadores adecuados, se puede emplear para introducir mutaciones dirigidas.
Como se ha mencionado anteriormente, existe una multiplicidad de mutágenos químicos, físicos y biológicos. Los mencionados en la presente memoria a continuación se dan a modo de ejemplo, pero no por limitación.
Los mutágenos químicos se pueden dividir según su mecanismo de acción. De ese modo, existen análogos de base (por ejemplo, 5-bromouracilo, 2-aminopurina), agentes alquilantes mono y bifuncionales (agentes monofuncionales tales como etil metil sulfonato, sulfato de dimetilo, o agentes bifuncionales tales como dicloroetil sulfito, mitomicina, nitrosamina nitrosoguanidina-dialquilo, derivados de N-nitrosoguanidina) o sustancias intercalantes (por ejemplo, acridina, bromuro de etidio).
Los ejemplos de mutágenos físicos son las radiaciones ionizantes. Las radiaciones ionizantes son ondas electromagnéticas o radiaciones corpusculares que son capaces de ionizar moléculas, es decir de eliminar electrones de las mismas. Los iones que permanecen son en la mayoría de los casos altamente reactivos de manera que, en caso de que se formen en el tejido vivo, son capaces de infligir un gran daño, por ejemplo, al ADN y por lo tanto inducir mutaciones (a baja intensidad). Los ejemplos de las radiaciones ionizantes son la radiación gamma (energía de fotones de aproximadamente un megaelectronvoltio MeV), radiación de rayos X (energía de fotones de varios o muchos kiloelectronvoltios de keV) o también luz ultravioleta (luz UV, energía de fotones de más de 3,1 eV). La luz UV provoca la formación de dímeros entre bases, los dímeros de timidina son los más comunes, y estos dan lugar a las mutaciones.
Los ejemplos de la generación de mutantes mediante el tratamiento de las semillas con agentes mutagenizantes puede incluir etil metil sulfonato (EMS) (Birchler, J. A. y Schwartz, D., Biochem. Genet. 17 (11-12), 1173 (1979); Hoffmann, G. R., Mutat. Res. 75 (1), 63 (1980)) o radiación ionizante se ha añadido ahora el uso de mutágenos biológicos, por ejemplo, transposones (por ejemplo, Tn5, Tn903, Tn916, Tn1000, May B. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (20), 11541 (2003)) o métodos biológicos moleculares tal como la mutagenesis por inserción de ADN-T (Feldman, K. A., Plant Journal 1, 71 (1991), Koncz, C., et al., Plant Mol. Biol. 20: 963-76 (1992)).
Para generar variantes de genes mutados, se pueden utilizar mutágenos químicos o biológicos. Entre los agentes químicos, se prefiere especialmente generar mutantes mediante el uso de mutagénesis por EMS (etil metil sulfonato). Entre la generación de mutantes que utilizan mutágenos biológicos, se puede utilizar la mutagénesis de ADN-T o la mutagénesis de transposón.
De ese modo, por ejemplo, es posible emplear polipéptidos en los métodos que se describen en la presente memoria, que se obtienen como resultado de una mutación de una secuencia de nucleótidos tal como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44.
Como se utiliza en la presente memoria el término “recombinante” significa por ejemplo con respecto a una secuencia de ácidos nucleicos, un casete de expresión o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con la secuencia de ácidos nucleicos, casete de expresión o vector, todas aquellas construcciones u organismos que son el resultado de métodos recombinantes y en los que (a) la secuencia de ácidos nucleicos proteína FMO o (b) una secuencia de control genético, por ejemplo un promotor, que está operativamente ligado a la secuencia que codifica el ácido nucleico FMO, o (c) (a) y (b) no se encuentran en su entorno genético natural o han sido modificadas por métodos recombinantes, siendo posible que la modificación sea, por ejemplo, una sustitución, adición, eliminación o inserción de uno o más residuo/s de nucleótidos.
Medio genético natural significa el locus cromosómico natural en el organismo de origen, o la presencia en una genoteca genómica. En el caso de una genoteca genómica, el medio genético natural de la secuencia de ácido nucleico se retiene preferentemente al menos en parte. El medio flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos de un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, al menos 500 pb, al menos 1000 pb, al menos 5000 pb. Un casete de expresión de origen natural -por ejemplo, la combinación de origen natural del promotor constitutivo de proteína FMO con el gen de proteína correspondiente FMO - se convierte en un casete de expresión recombinante cuando éste se modifica por medio de métodos, sintético no naturales ("artificiales") tal como, por ejemplo, mutagenización. Se han descrito métodos adecuados (Patente Estadounidense No. 5.565.350, WO 00/15815).
Como se utiliza en la presente memoria, el término “transgénico” se refiere a un organismo, por ejemplo, una planta, célula de planta, callo, tejido de planta, o parte de planta que en forma exógena contiene el ácido nucleico, construcción recombinante, vector o casete de expresión que se describen en la presente memoria o una parte de los mismos que se introduce por procesos no esencialmente biológicos, preferentemente por transformación agrobacteriana. La construcción recombinante o parte de la misma se integra de forma estable en un cromosoma, de modo que se transmite a generaciones sucesivas por propagación clonal, propagación vegetativa o propagación sexual.
Una planta transgénica, célula de planta o tejido a los efectos de los métodos y productos aquí descritos de ese modo se entiende como que quiere significar un ácido nucleico exógeno FMO, construcción recombinante, vector o casete de expresión incluyendo uno o más ácidos nucleicos FMO es integrado en el genoma por medio de tecnología genética.
En otra preferente, dicha una o más secuencias que codifica la proteína FMO comprende al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica al menos un polipéptido que comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43.
En otra divulgación preferente dicho una o más secuencias que codifica la proteína FMO comprende una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido en donde el polipéptido tiene al menos el 90% de identidad respecto de la secuencia como se muestra en SeQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43.
En otra divulgación preferente, dicho una o más secuencias que codifica la proteína FMO comprende una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido en donde el polipéptido tiene al menos el 80% de identidad respecto de la secuencia como se muestra en SeQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43.
En otra divulgación preferente, dicha una o más secuencias que codifica la proteína FMO comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende al menos un polipéptido en donde el polipéptido tiene al menos el 70% de identidad respecto de la secuencia como se muestra en SeQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44.
El término ácido nucleico "exógeno" se refiere a un ácido nucleico que se ha introducido en una planta por medio de tecnología genética. Un ácido nucleico "exógeno" puede no estar presente en una planta en su forma natural, ser diferente del ácido nucleico en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural, o puede ser idéntico a un ácido nucleico que se encuentra en una planta en su forma natural, pero no integrado en su entorno genético natural. El significado correspondiente de "exógeno" se aplica en el contexto de la expresión de la proteína. Por ejemplo, una planta transgénica que contiene un transgén, es decir, un ácido nucleico exógeno, puede, en comparación con la expresión de los genes endógenos, encontrar un aumento sustancial de la expresión del gen respectivo o proteína en total. Una planta transgénica según los métodos y productos que se describen en la presente memoria incluye un ácido nucleico exógeno FMO integrado en cualquier sitio genético y opcionalmente la planta también puede incluir el gen endógeno en la dotación genética natural.
En una divulgación, un método para aumentar la tolerancia al estrés por sequía en una planta u organismo puede incluir incrementar los niveles de TMAO incrementando la expresión de una proteína FMO o un fragmento funcional de la misma, o una variante de ayuste de la misma en la planta u organismo fotosintético, en donde la proteína FMO está codificada por (i) un ácido nucleico exógeno que tiene al menos el 50% de identidad, al menos el 60% de identidad, al menos el 70% de identidad de secuencia, al menos el 80 %, al menos el 90%, al menos el 95 %, al menos el 98%, al menos el 99% de identidad de secuencia, o aún el 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44 ; o una variante de ayuste de las mismas; (ii) un aminoácido exógeno que codifica una proteína que tiene al menos el 50% de identidad, al menos el 60%, al menos el 70% de identidad de secuencia, al menos el 80 %, al menos el 90%, al menos el 95 %, al menos el 98%, al menos el 99% de identidad de secuencia, o aún el 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, un fragmento funcional de la misma; la proteína codificada confiere tolerancia al estrés por sequía respecto de las plantas de control; (iii) un ácido nucleico exógeno capaz de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos según (i) o (ii); que codifica una proteína FMO; en donde la molécula de aminoácido codifica un polipéptido que tiene propiedades esencialmente idénticas al polipéptido que se describe en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; la proteína codificada confiere tolerancia mejorada al estrés por sequía respecto a las plantas control; y/o por (iv) un ácido nucleico exógeno que codifica la misma proteína FMO que cualquiera de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) anteriormente, pero que difiere de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) anteriormente debido a la degeneración del código genético es una divulgación adicional.
El incremento de la tolerancia al estrés por sequía en la planta u organismo fotosintético también puede obtenerse mediante la manipulación de la expresión de la propia proteína de planta, es decir la proteína endógena, que corresponde a la proteína, o de una secuencia de nucleótidos endógena, que constituye una secuencia, y que puede comprender también la región 5'- y 3'-UTR. Es, entonces, una secuencia de nucleótidos o péptidos endógena que media un aumento de la tolerancia al estrés por sequía o es una secuencia de aminoácidos que codifica dicha proteína. Esta manipulación se puede lograr mediante cualquier modificación de la secuencia, a menudo una mutación, pero también por ejemplo mediante una modificación de la secuencia de ADN promotora del gen que codifica la proteína. Dicha modificación, que resulta en una tasa de expresión aumentada modificada del gen endógeno, se puede efectuar por medio de la deleción o inserción de secuencias de ADN. Como regla general, una modificación de la región 5'-UTR en total, y/o de la secuencia promotora de genes endógenos dará lugar a una modificación de la cantidad expresada del gen y/o la función del producto génico o gen expresado, y por lo tanto también a una modificación de la actividad que se puede detectar en la célula o en las plantas. La modificación de la región 5'-UTR en total, y/o de la secuencia promotora del gen endógeno también puede conducir a una modificación de la cantidad de, y/o la función de, una proteína en la célula. Sírvase tener en cuenta que un aumento en la función o expresión se entiende que quiere decir en el presente documento, la mejora o activación de la expresión o función de la proteína endógena, incluyendo una expresión nueva, aumento de la actividad de la proteína, y una mejora o aumento por la expresión de una proteína transgénica o un factor.
Otro método para incrementar la actividad y contenido de la proteína endógena pede incluir aumentar los factores de transcripción que están implicados en la transcripción del gen endógeno correspondiente, por ejemplo, por medio de la sobreexpresión. Los medios para sobreexpresar los factores de transcripción son conocidos por el experto en la materia y se describen también para las proteínas en el contexto de la presente divulgación.
Además, un aumento de la expresión del gen endógeno como se describe en la presente memoria se puede alcanzar por una proteína reguladora, que no está presente en el organismo no transformado, que interactúa con el promotor de estos genes. Tal regulador puede tomar la forma de una proteína quimérica que consiste en un dominio de unión a ADN y un dominio activador de la transcripción, como se describe por ejemplo en el documento WO 96/06166.
La secuencia de ADNc que codifica la proteína (o el ARNm incluyendo la/s secuencia/s UTR) para la expresión en una célula de una planta u organismo fotosintético que, tras la expresión del ADN en ARN y la transcripción del ARN para producir un péptido codificado o polipéptido, mejora la capacidad de la planta u organismo fotosintético o célula de planta para soportar un estrés biótico o abiótico, o mejora el valor o rendimiento de la planta u organismo fotosintético, o un cultivo o producto producido a partir de la planta u organismo fotosintético.
La introducción en una planta u organismo de un casete de expresión que comprende, por ejemplo, la proteína FMO (SEQ ID NO: 1-44) en un organismo fotosintético o células de planta, tejido de planta, órganos de planta tal como cloroplasto, partes o semillas de las mismas ventajosamente puede llevarse a cabo utilizando vectores que comprenden casetes de expresión. El casete de expresión puede introducirse en el vector (por ejemplo, el vector pROK2, o el vector pCAMBIA) a través de un sitio de escisión de restricción adecuado. El plásmido obtenido se introduce primero en células de E. coli. Las células de E. coli transformadas se seleccionan correctamente, se cultivan y se obtiene el plásmido recombinante usando métodos con los que el experto está familiarizado. Pueden utilizarse análisis de restricción y secuenciación para verificar la etapa de clonación.
Los vectores pueden tomar la forma de, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus o más agrobacterias y se pueden introducir por medio de vectores plásmidos. Los ejemplos de vectores son las que hacen posible una integración estable del casete de expresión en el genoma huésped.
Están disponibles una variedad de métodos (Keown et al., Métodos in Enzymology 185, 527(1990)) para la introducción de una construcción deseada en una planta u organismo, que se denomina transformación (o transducción o transfección). De ese modo, el ADN o ARN puede introducirse, por ejemplo, directamente por medio de microinyección o por bombardeo con micropartículas recubiertas con ADN. También, es posible permeabilizar químicamente la célula, por ejemplo, utilizando polietilenglicol, de manera que el ADN pueda alcanzar la célula por difusión. El ADN también puede introducirse en la célula por medio de la fusión de protoplastos con otras unidades que comprenden ADN tal como minicélulas, células, lisosomas o liposomas. Un método adecuado adicional de introducción de ADN es la electroporación, donde las células se permeabilizan en forma reversible por medio de un impulso eléctrico. Los ejemplos de dichos métodos se han descrito en Bilang et al., Gene 100, 247 (1991); Scheid et al., Mol. Gen. Genet. 228, 104 (1991); Guerche et al., Plant Science 52, 111 (1987); Neuhause et al., Theor. Appl. Genet. 75, 30 (1987); Klein et al., Nature 327, 70(1987); Howell et al., Science 208, 1265 (1980); Horsch et al., Science 227, 1229 (1985); DeBlock et al., Plant Physiology 91, 694 (1989); "Methods for Plant Molecular Biology" (Weissbach y Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); y "Methods in Plant Molecular Biology" (Schuler y Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989).
En las plantas, los métodos anteriormente descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejido de planta o células de planta se explotan para los fines de transformación transitoria o estable. Los métodos adecuados son principalmente transformación de protoplastos por medio de absorción de ADN inducida por polietilenglicol, el método biolístico con cañón de genes, conocido como el método de bombardeo de partículas, electroporación, incubación de embriones secos en solución que comprende ADN y microinyección.
La transformación también se puede efectuar por infección bacteriana por medio de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Los métodos se describen por ejemplo en Horsch et al. Science 225, 1229 (1985).
Si se utilizan agrobacterias para la transformación, el casete de expresión puede estar integrado en plásmidos específicos, que pueden ser o bien un servicio de transporte o un vector intermedio o un vector binario. Si se utiliza un plásmido Ti o Ri para la transformación, al menos el borde derecho, pero en la mayoría de los casos tanto el borde derecho como el izquierdo, del ADN-T de plásmido Ti o Ri como región flanqueante está vinculado con el casete de expresión a ser introducido.
Los vectores binarios son capaces de replicarse en una variedad de organismos incluyendo, pero sin limitarse a E. coli y en Agrobacterium. Como regla general, comprenden un gen marcador de selección y un enlazador o polienlazador flanqueado por la secuencia de borde de ADN-T derecho e izquierdo. Se pueden transformar directamente en Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978)). El gen marcador de selección, por ejemplo, el gen nptII, que media la resistencia a kanamicina, permite que la agrocbacteria se seleccione. El Agrobacterium que, en el presente caso, actúa como el organismo huésped ya debe comprender un plásmido Ti auxiliar con la región vir, que es necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula de la planta. Un agrobacterium transformado de ese modo puede ser utilizado para transformar las células de planta. Se ha estudiado el uso de ADN-T para la transformación de las células de planta y se describe en gran detalle (documento EP 120 516; Hoekema, in “The Binary Plant Vector System”, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Capítulo V; An et al. EMBO J. 4, 277 (1985)). Se conocen varios vectores binarios y en algunos casos están disponibles en el mercado, tal como, por ejemplo, pBI101.2 o pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
En el caso de que el ADN o ARN se inyecte o someta a electroporación en las células de planta, no es necesario que el plásmido utilizado cumpla requisitos particulares. Pueden utilizarse plásmidos sencillos tal como los de la serie pUC. Si se deben regenerar plantas intactas a partir de células transformadas, es necesario que un gen marcador de selección adicional esté ubicado en el plásmido.
Las células transformadas de forma estable, es decir aquellas que comprenden el ADN introducido integrado en el ADN de la célula huésped, se pueden distinguir de las células no transformadas cuando un marcador de selección es constituyente del a Dn introducido (McCormick et al, Plant Cell Reports 5, 81 (1986)). Por ejemplo, cualquier gen que sea capaz de mediar una resistencia a antibióticos o herbicidas (tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina) puede actuar como un marcador. Las células transformadas que expresan dicho gen marcador son capaces de sobrevivir en presencia de concentraciones de un antibiótico o herbicida adecuado que destruye un tipo salvaje no transformado. Los ejemplos incluyen el gen bar, que media la resistencia al herbicida fosfinotricina (Rathore et al., Plant Mol. Biol. 21 (5), 871 (1993)), el gen nptII, que media la resistencia a kanamicina, el gen hpt, que media la resistencia a higromicina, o el gen EPSP, que media la resistencia al herbicida glifosato. Las plantas resultantes se pueden reproducir e hibridar de la forma usual. Dos generaciones o más deben cultivarse con el fin de asegurar que la integración genómica es estable y hereditaria.
Métodos adicionales pueden describirse en Jones et al. ("Techniques for Gene Transfer", in “Plantas transgénicas”, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por Kung S. D. y Wu R., Academic Press, páginas 128-143 (1993), y en Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991)). Es preferible clonar la construcción que debe expresarse en un vector que sea apropiado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, en pBin 19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)).
Cuando se ha generado una célula de planta transformada, se puede obtener una planta intacta usando métodos conocidos para un experto en la materia. Un ejemplo de un material de partida usado aquí son cultivos de callos. La formación de brotes y raíces a partir de esto como biomasa celular aún no diferenciada puede ser inducida de una manera conocida. Las plántulas obtenidas pueden ser plantadas y reproducirse.
Un experto en la materia también conoce métodos para regenerar parte de plantas y plantas intactas a partir de células de planta. Por ejemplo, se utilizan para este fin los métodos descritos por Fennell et al., Plant Cell Rep, 11, 567 (1992); Stoeger et al., Plant Cell Rep. 14, 273 (1995); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89, 525 (1994).
Las moléculas recombinantes de ácido nucleico que se describen en la presente memoria comprenden los siguientes elementos en la orientación 5'-3': secuencias reguladoras de un promotor de que está activo en las células de planta, una secuencia de ADN en enlace operativo con la misma, en su caso, secuencias reguladoras que, en la célula de planta, pueden actuar como señales de transcripción, terminación y/o poliadenilación en vinculación operable con la misma.
En las construcciones de expresión/casetes de expresión recombinantes, una molécula de ácido nucleico cuya expresión (transcripción y, en su caso, traducción) genera una proteína FMO está en unión operativa con al menos un elemento de control genético (por ejemplo, un promotor) que asegura la sobreexpresión en las plantas. Si la construcción de expresión debe ser introducida directamente en la planta u organismo fotosintético y la proteína FMO generada en la misma en plantas u organismos fotosintéticos, entonces se prefieren elementos de control genético específicos de plantas (por ejemplo, promotores). Sin embargo, la proteína FMO también puede generarse en otros organismos o in vitro y entonces se introduce en la planta. En este contexto, se da preferencia a todos los elementos de control genético eucariotas o procariotas (por ejemplo, promotores) que permiten la sobreexpresión en la planta seleccionada en cada caso para la producción.
Se proporciona una construcción de vector recombinante o construcción/casete de expresión que comprende: (i) un ácido nucleico que tiene al menos el 50% de identidad, al menos el 60% de identidad, al menos el 70% identidad de secuencia, al menos el 80 %, al menos el 90%, al menos el 95 %, al menos el 98%, al menos el 99% identidad de secuencia, o incluso el 100% identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44 ; o una variante de ayuste de las mismas; (ii) un aminoácido que codifica una proteína que tiene al menos el 50% de identidad, al menos el 60% de identidad, al menos el 70% de identidad de secuencia, al menos el 80 %, al menos el 90%, al menos el 95 %, al menos el el 98%, al menos 99% de identidad de secuencia, o incluso el 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 39 o 41; la proteína codificada confiere tolerancia mejorada al estrés por sequía respecto de las plantas control; (iii) un ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos según (i) o (ii); que codifica una proteína FMO; en donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene propiedades esencialmente idénticas respecto al polipéptido que se describe en SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 39 o 41; la proteína codificada confiere tolerancia mejorada al estrés por sequía respecto a las plantas control; y/o (iv) un ácido nucleico que codifica la misma proteína FMO que cualquiera de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) anteriormente, pero que difieren de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) anteriormente debido a la degeneración del código genético, operativamente ligado a (b) un promotor y (c) una secuencia de terminación de transcripción.
Las disposiciones son aquellas en las que la secuencia de ácido nucleico que se expresa de forma recombinante se coloca después de la secuencia que actúa como promotor, de modo que las dos secuencias están unidas covalentemente entre sí. En este contexto, la distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácidos nucleicos que debe expresarse de forma recombinante es menor que 200 pares de base, o menos de 100 pares de base, o menos de 50 pares de base.
La generación de un enlace funcional y la generación de un casete de expresión puede llevarse a cabo por medio de recombinación habitual y técnicas de clonación como se describe por ejemplo in Sambrook J. (1989), en Silhavy T.
J., Berman M. L. y Enquist L. W. "Experiments with Gene Fusions", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (N.Y.) (1984), en Ausubel F. M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience (1987) y en Gelvin et al., en “Plant Molecular Biology Manual’ (1990). Sin embargo, es posible posicionar, entre las dos secuencias, además secuencias que ejercen por ejemplo la función de un enlazador con sitios específicos de escisión de enzimas de restricción, o de un péptido de señal. La inserción de secuencias también puede llevar a la expresión de proteínas de fusión. Es preferible que el casete de expresión, que consiste en una unión de la secuencia promotora y secuencia de ácidos nucleicos que debe expresarse, pueda estar presente en forma de vector integrado y insertado en un genoma de planta genoma por, por ejemplo, transformación.
El método que se describe en la presente memoria ventajosamente se puede combinar con otros métodos que implican una resistencia a patógenos (por ejemplo, contra insectos, hongos, bacterias, nematodos y similares), tolerancia al estrés u otra mejora de las características de las plantas. Los ejemplos se mencionan entre otros en Dunwell J. M., J. Exp. Bot. 51, (Spec No) 487 (2000).
Las moléculas de ácidos nucleicos que se describen en la presente memoria pueden comprender moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas FMO GS-OX5 de Arabidopsis según los polinucleótidos SEQ ID NO: 1, y las secuencias de ácidos nucleicos que son complementarias a la misma como se muestra en la Figura 2, y las secuencias que se obtienen debido a la degeneración del código genético, donde las moléculas de ácidos nucleicos no consisten en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44. Las moléculas nucleicas que se describen en la presente memoria pueden comprender moléculas de ácidos nucleicos que codifican las proteínas FMO GS-OX3 de plantas de pepino según los polinucleótidos SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, y las secuencias de ácidos nucleicos que son complementarias a la misma, y la secuencias que se obtienen debido a la degeneración del código genético, donde las moléculas de ácidos nucleicos no consisten en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44.
Los casetes de expresión transgénicos también pueden desarrollarse para la expresión de proteínas FMO donde los casetes pueden comprender una de las secuencia de ácidos nucleicos molécula de ácido nucleico incluyendo pero sin limitarse a SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44; o un fragmento de las mismas. En los casetes de expresión transgénicos, la secuencia de ácidos nucleicos que codifican las proteínas FMO de Arabidopsis está ligada a al menos un elemento de control genético como se define anteriormente de tal manera que la expresión (transcripción y, si corresponde, traducción) puede efectuarse en cualquier organismo, habitualmente en plantas dicotiledóneas. Los elementos de control genético que son apropiados para este fin se describen más arriba. Los casetes de expresión transgénicos también pueden comprender otros elementos funcionales como se define anteriormente.
Dichos casetes de expresión pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que esencialmente idéntica a una molécula de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID No.:1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 44; o un fragmento de las mismas, donde la secuencia de ácido nucleico está en orientación sentido o en orientación antisentido respecto a un promotor y, por tanto, puede dar lugar a la expresión de ARN sentido o antisentido, siendo el promotor un promotor que está activo en plantas, habitualmente un promotor que puede ser inducido por el ataque de patógenos. También se proporcionan en el presente documento vectores transgénicos que abarcan los casetes de expresión transgénicos.
Un promotor es una región de ADN, que incluye secuencias suficientes para causar la transcripción de una secuencia asociada (posterior). El promotor puede estar regulado, es decir, no actuar constitutivamente para causar la transcripción de la secuencia asociada. Si es inducible, existen secuencias presentes en el mismo que median la regulación de la expresión de modo que la secuencia asociada se transcriba solo cuando una molécula inductora esté presente. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en las células de planta elegidas, parte de plantas, o plantas. El promotor puede ser inducible o constitutivo. Puede ser de origen natural, puede estar compuesto por porciones de diferentes promotores de origen natural, o puede ser parcial o totalmente sintético. Además, la ubicación del promotor con relación al inicio de la transcripción se puede optimizar. Muchos promotores adecuados para su uso en plantas u organismos fotosintéticos son bien conocidos en la técnica, como lo son las secuencias de nucleótidos, que mejoran la expresión de una secuencia expresable asociada.
Una variedad de promotores puede utilizarse en los métodos que se describen en la presente memoria incluyendo un promotor inducible por sequía, un promotor de epidermis, un promotor específico de mesófilo, o un promotor inducido por estrés (por ejemplo, RD29 (Singh et al. Plant Cell Rep 30:1019-1028(2011)). El promotor puede seleccionarse del grupo que consiste en un promotor inducido por: estrés osmótico, estrés por sequía, estrés por frío, estrés por calor, estrés oxidativo, deficiencia de nutrientes, infección por un hongo, infección por un oomiceto, infección por un virus, infección por una bacteria, infestación de nematodos, infestación de plagas, infestación de malezas, herbivoría.
Los promotores se pueden seleccionar basándose en el resultado deseado. Es decir, los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, preferentes de los tejidos o de otros promotores para la expresión en la célula huésped de interés. El promotor puede ser inducible o constitutivo. Puede ser de origen natural, puede estar compuesto por porciones de diferentes promotores de origen natural, o puede ser parcialmente o totalmente sintético. La guía para el diseño de los promotores es comúnmente conocida en la técnica. Además, la ubicación del promotor con relación al inicio de la transcripción se puede optimizar. Muchos promotores adecuados para uso en plantas son bien conocidos en la técnica, como lo son las secuencias de nucleótidos, que mejoran la expresión de una secuencia expresable asociada. Un ejemplo de una construcción de ADN con un promotor adecuado puede incluir una secuencia de nucleótidos en unión operativa con un promotor inducible por estrés o un promotor específico de la epidermis y/o mesófilo.
Promotores específicos de plantas significa, en principio, cualquier promotor que sea capaz de controlar la expresión de genes, en particular los genes foráneos en plantas o parte de plantas, células de planta, tejido de plantas, cultivos de plantas. Aquí, la expresión puede ser por ejemplo constitucional, inducible o dependiente del desarrollo.
En una divulgación preferente, el promotor es un promotor constitutivo, preferentemente un promotor inducible por estrés, más preferentemente un promotor inducible por estrés hídrico.
Como se utiliza en la presente memoria promotor “constitutivo” significa aquellos promotores que aseguran la sobreexpresión en numerosos tejidos durante un periodo de desarrollo de la planta relativamente largo, en todo momento durante el desarrollo de la planta. En particular, un promotor vegetal o un promotor obtenido de un virus de planta con los métodos que se describen en la presente memoria incluyendo, pero sin limitarse a la transcripción 35S del virus mosaico de la coliflor CaMV (Franck et al. Cell 21, 285 (1980); Odell et al. Nature 313, 810 (1985); Shewmaker et al. Virology 140, 281 (1985); Gardner et al. Plant Mol Biol 6, 221 (1986)) o el promotor 19S CaMV (Patente Estadounidense No. 5.352.606; WO 84/02913; Benfey et al. EMBO J. 8, 2195-2202 (1989)). Un promotor constitutivo apropiado adicional es el promotor de la subunidad pequeña rubisco (SSU) (Patente Estadounidense No. 4.962.028), el promotor de Agrobacterium nopaline sintasa, el promotor doble TR, el promotor Agrobacterium OCS (octopina sintasa), el promotor Ubiquitina (Holtorf S et al. Plant Mol Biol 29, 637 (1995)), el promotor Ubiquitina 1 (Christensen et al. Plant Mol Biol 18, 675 (1992); Bruce et al. Proc Natl Acad Sci USA 86, 9692 (1989)), el promotor Smas, el promotor cinamil-alcohol dehidrogenasa (Patente Estadounidense No. 5.683.439), los promotores de subunidades vacuolar ATPase o el promotor de una proteína enriquecida en prolina de trigo (documento WO 91/13991), y otros promotores de genes cuya expresión constitutiva en plantas es conocida para los expertos incluyendo el promotor del gen nitrilasa-1 (nit1) de A. thaliana (No. de Acceso a GenBank: Y07648.2, Nucleotide 2456-4340, Hillebrand et al. Gene 170, 197 (1996)).
De ese modo, en una divulgación preferente, la sobreexpresión de una o más secuencias que codifican la proteína FMO en los métodos de la divulgación es una sobreexpresión constitutiva.
Los promotores específicos de semilla son, por ejemplo, el promotor de faseolina (Patente Estadounidense No.
5.504.200; Bustos et al. Plant Cell 1(9), 839 (1989)), del gen 2S albúmina (Joseffson et al. J Biol Chem 262, 12196 (1987)), de legumina (Shirsat et al. Mol Gen Genet 215(2), 326 (1989)), del USP (proteína de semilla desconocida; Baumlein et al. Mol Gen Genet 225(3), 459 (1991)), del gen napin (Patente Estadounidense No. 5,608,152; Stalberg et al. L Planta 199, 515 (1996)), del gene que codifica la proteína de unión a sacarosa (documento WO 00/26388) o el promotor de legumina B4 (LeB4; Baumlein et al. Mol Gen Genet 225, 121 (1991); Baumlein et al. Plant Journal 2(2), 233 (1992); Fiedler et al. Biotechnology (NY) 13(10), 1090 (1995)), el promotor de oleosina de Arabidopsis (documento WO 98/45461), el promotor Bce4 de Brassica (documento WO 91/13980). Otros promotores específicos de semillas apropiados son los de los genes que codifican la glutenina de alto peso molecular (G-APM), gliadina, enzima de ramificación, ADP glucosa pirofosfatasa (AGPasa) o sintasa de almidón. Otros promotores pueden incluir aquellos que permiten la expresión específica de las semillas en monocotiledones tal como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Es posible y ventajoso emplear el promotor del gen Ipt2 o Ipt1 (documentos WO 95/15389, WO 95/23230) o los promotores que se describen en el documento WO 99/16890 (promotores del gen hordeína, del gen glutelina, del gen orizina, del gen prolamina, del gen gliadina, del gen zeína, del gen kasirina o del gen secalina). Los promotores específicos de raíces, raíces de almacenamiento, o tubérculos, por ejemplo, el promotor clase I de patatina (B33) o el promotor del inhibidor de la catepsina D de patata
Los promotores específicos de hojas son, por ejemplo, el promotor de la FBPase citosólica de la patata (documento WO 97/05900), el promotor SSU (subunidad pequeña) del rubisco (ribulosa-1.5-bisfosfato carboxilasa) o el promotor ST-LSI de la patata (Stockhaus et al. EMBO J. 8, 2445 (1989)). Los promotores específicos de la epidermis son, por ejemplo, el promotor del gen OXLP (“proteína similar a oxalato oxidasa”; Wei et al. Plant Mol. Biol. 36, 101 (1998)) y un promotor que consiste en el promotor GSTA1 y el intron WIR1a (documento WO 2005/035766) y el promotor GLP4 (documento WO 2006/1288832 PCT/EP 2006/062747).
Los ejemplos de otros promotores específicos de tejido son: promotores específicos de flores, por ejemplo, el promotor fitoeno sintasa (documento WO 92/16635) o el promotor del gen Prr (documento WO 98/22593) y promotores específicos de anteras, por ejemplo, el promotor 5126 (Patente Estadounidense No. 5.689.049, 5.689.051), el promotor glob-I y el promotor [gamma]-zeina.
Los casetes de expresión también pueden comprender un promotor químicamente inducible (artículo de revisión: Gatz et al Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol 48, 89 (1997)) a través del cual la expresión del gen exógeno en la planta puede ser controlado en un punto particular en el tiempo. De la misma manera también pueden utilizarse promotores de este tipo, tal como por ejemplo, el promotor PRP1 (Ward et al. Plant Mol Biol 22, 361 (1993)), un promotor inducible por ácido salicílico (documento WO 95/19443), un promotor inducible por bencenosulfonamida (documento EP 0388 186), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. Plant J 2, 397 (1992)), un promotor inducible por ácido abscisico (documento EP 0 335 528) y un promotor inducible por etanol o ciclohexanona (documento WO 93/21334).
Los promotores inducibles por patógenos que hacen posible una expresión sólo cuando sea necesario (es decir en el caso de un ataque por patógenos). En una divulgación, el método por lo tanto utiliza promotores que están activos en plantas que son promotores inducibles por patógenos. Los promotores inducibles por patógenos comprenden los promotores de genes que se inducen como resultado del ataque de patógenos, tal como por ejemplo, genes de proteínas PR, proteínas SAR, [beta] -1,3-glucanasa, quitinasa, etc. (por ejemplo Redolfi et al. Neth J Plant Pathol 89, 245 (1983); Uknes, et al. Plant Cell 4, 645 (1992); Van Loon Plant Mol Viral 4, 111 (1985); Marineau et al. Plant Mol Bid 9, 335 (1987); Matton et al. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 325 (1987); Somssich et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 2427 (1986); Somssich et al. Mol Gen Genetics 2, 93 (1988); Chen et al. Plant J 10, 955 (1996); Zhang y Sing Proc Natl Acad Sci USA 91, 2507 (1994); Warner, et al. Plant J 3, 191 (1993); Siebertz et al. Plant Cell 1, 961 (1989)).
Un promotor adicional para la sobreexpresión de las proteínas FMO como se describe en la presente memoria puede incluir promotores inducibles por lesión tal como el del gen pinlI (Ryan Ann Rev Phytopath 28, 425 (1990); Duan et al. Nat Biotech 14, 494 (1996)), del gen wun1 y wun2 (Patente Estadounidense No. 5.428.148), del gen win1 y win2 (Stanford et al. Mol Gen Genet 215, 200 (1989)), del gen systemin (McGurl et al. Science 225, 1570 (1992)), del gen WIP1 (Rohmeier et al. Plant Mol Biol 22, 783 (1993); Eckelkamp et al. FEBS Letters 323, 73 (1993)), del gen MPI (Corderok et al. Plant J 6(2), 141 (1994)) y similar.
Una fuente de otros promotores inducibles por patógenos puede incluir la familia de genes relacionados con la patogénesis (PR). Una serie de elementos en estos promotores han demostrado ser ventajosos. De ese modo, la región de nucleótidos del nucleótido -364 al nucleótido -288 en el promotor de PR-2d media la especificidad de salicilato (Buchel et al. Plant Mol Biol 30, 493 (1996)). En el tabaco, esta región se une a una proteína nuclear cuya abundancia se incrementa por salicilato. Los promotores PR-1 de tabaco y Arabidopsis (documentos EP-A 0 332 104, WO 98/03536) también son adecuados como promotores inducibles por patógenos. También son útiles, ya que son particularmente específicamente inducidos por patógenos, los promotores “PR-5 ácido" (aPR5) de cebada (Schweizer et al. Plant Physiol 114, 79 (1997)) y trigo (Rebmann et al. Plant Mol Biol 16, 329 (1991)). Las proteínas PR5 se acumulan en aproximadamente 4 a 6 horas después del ataque de patógenos y sólo muestran muy poca expresión de fondo (documento WO 99/66057). Un enfoque para obtener un incremento en la especificidad inducida por patógenos es la generación de promotores sintéticos a partir de combinaciones de elementos sensibles a patógenos conocidos (Rushton et al. Plant Cell 14, 749 (2002); documentos WO 00/01830; WO 99/66057). Otros promotores inducibles por patógenos de diferentes especies son conocidos para el experto (documentos EP-A 1165 794; EP-A 1062356; EP-A 1041 148; EP-A 1032684).
Otros promotores inducibles por patógenos comprenden el promotor Flachs Fis1 (documento WO 96/34949), el promotor Vst1 (Schubert et al. Plant Mol Biol 34, 417 (1997)) y el promotor sesquiterpeno ciclasa EAS4 de tabaco (Patente Estadounidense No. 6.100.451).
Otros promotores son los que son inducidos por estrés abiótico o biótico, tal como, por ejemplo, el promotor inducible por patógenos del gen PRP1 (o promotor gst1), por ejemplo, procedente de la patata (documento WO 96128561; Ward et al Plant Mol Biol 22, 361 (1993)), el promotor hsp70 o hsp80 inducible por calor del tomate (Patente Estadounidense No. 5.187.267), el promotor alfa-amilasa inducible por frío de la patata (documento WO 96/12814) y el promotor PPDK inducible por la luz o el promotor pinlI inducible por lesión (docuimento EP-A 0375 091).
En una divulgación, los métodos que se describen en la presente memoria emplean promotores específicos del tejido mesófilo tal como, por ejemplo, el promotor del gen germen de trigo 9f-3.8 (No. de Acceso a GenBank: M63224) o el promotor de cebada GerUn (documento WO 02/057412). Los promotores son particularmente ventajosos ya que ambos son inducibles por patógenos y específicos del tejido mesófilo. También es adecuado el promotor de Arabidopsis CAB-2 específico del tejido mesófilo (No. de Acceso a GenBank: X15222), y el promotor de Zea mays PPCZml (No. de Acceso a GenBank: X63869) u homólogos de los mismos. Específico de tejido mesófilo significa que la transcripción de un gen está limitada a tan pocos tejidos de plantas como sea posible que comprenden el tejido mesófilo como resultado de la interacción específica de elementos en cis presentes en los factores de transcripción y la secuencia promotora que se unen a estos elementos; preferentemente, significa una transcripción que está limitada al tejido mesófilo.
Promotores específicos de mesófilo adicionales incluyen PPCZm1 (=PEPC; Kausch, Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001)); OsrbcS (Kyozuka et al., Plant Phys. 102, 991- (1993)); OsPPDK, acc. AC099041; TaGF-2.8, acc. M63223 (Schweizer, Plant J. 20, 541 (1999)); TaFBPase, acc. X53957;TaWIS1, acc. AF467542 (documento US 20021115849); HvBIS1, acc. AF467539 (documento US 2002/115849); ZmMIS1, acc. AF467514 (documento US 2002/115849); HvPR1a, acc. X74939 (Bryngelsson et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 7 (2), 267 (1994); HvPR1b, acc. X74940 (Bryngelsson et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 7 (2), 267 (1994)); HvB1.3gluc; acc. AF479647; HvPrx8, acc. AJ276227 (Kristensen et al., Molecular Plant Pathology 2 (6), 311(2001)); y HvPAL, acc. X97313 (Wei, Plant Molecular Biology 36, 101 (1998)).
Los ejemplos de promotores específicos de la epidermis son, por ejemplo, WIR5 (=GstA1), acc. X56012 (Dudler & Schweizer, no publicado); GLP4, acc. AJ310534 (Wei, Plant Molecular Biology 36, 101 (1998)); GLP2a, acc. AJ237942 (Schweizer, Plant J. 20, 541 (1999).); Prx7, acc. AJ003141 (Kristensen, Molecular Plant Pathology 2 (6), 311(2001)); GerA, acc. AF250933 (Wu, Plant Phys. Biochem. 38 o 685 (2000)); OsROC1, acc. AP004656; RTBV, acc. AAV62708, AAV62707 (Kloti, PMB 40, 249 (1999)) y Cer3 (Hannoufa, Plant J. 10 (3), 459 (1996)).
Los ejemplos de promotores adicionales adecuados para la expresión de las proteínas FMO incluyen promotores específicos de la maduración de la fruta tales como, por ejemplo, el promotor específico de la maduración de la fruta del tomate (documentos WO 94/21794, EP 409625). Los promotores dependientes del desarrollo incluyen algunos de los promotores específicos de tejido debido a que el desarrollo de los tejidos individuales se produce naturalmente de una manera dependiente del desarrollo.
Los promotores constitutivos y específicos de hoja y/o tallo, inducible por patógeno, específico de raíz, específicos del tejido mesófilo se pueden usar con promotores constitutivos, inducibles por patógeno, específicos del tejido mesófilo y específicos de raíz.
Otra posibilidad para promotores adicionales que posibilitan la expresión en tejidos de plantas adicionales o en otros organismos tales como, por ejemplo, bacterias E. coli que están operativamente ligados a la secuencia de ácidos nucleicos por expresar o sobreexpresar. Todos los promotores descritos anteriormente en principio son adecuados como promotores de planta u organismo fotosintético.
Se describen otros promotores que son adecuados para la expresión en las plantas (Rogers et al. Meth in Enzymol 153, 253 (1987); Schardl et al. Gene 61, 1 (1987); Berger et al. Proc Natl Acad Sci USA 86, 8402 (1989)).
Por otra parte, los expertos en la materia son capaces de aislar promotores adecuados adicionales por medio de métodos de rutina. De ese modo, los expertos en la técnica pueden identificar, por ejemplo, otros elementos de ácido nucleico regulatorio específico de la epidermis, con la ayuda de métodos habituales de biología molecular, por ejemplo, con experimentos de hibridación o con estudios de unión ADN-proteína. En la presente, una primera etapa implica, por ejemplo, el aislamiento del tejido deseado en el organismo deseado de las que se aíslan las secuencias regulatorias, a partir de la cual se aísla el ARN poli (A)+ total y se establece una genoteca de ADNc. En una segunda etapa, los clones de la primera genoteca cuyas correspondientes moléculas de ARN poli(A)+ solo se acumulan en el tejido deseado se identifican por medio de la hibridación con la ayuda de los clones de ADNc que se basan en las moléculas de ARN poli(A)+ provenientes de otro tejido. Luego, los promotores con elementos reguladores específicos de tejidos se aíslan con la ayuda de estos ADNc así identificados. Por otra parte, los expertos en la materia cuentan con otros métodos basados en PCR disponibles para el aislamiento de promotores específicos de tejido adecuados.
Las secuencias de ácidos nucleicos presentes en los vectores o casetes de expresión que se describen en la presente memoria pueden estar operativamente ligadas a otras secuencias de control genético además de un promotor. El término secuencias de control genético tiene un significado amplio y significa todas las secuencias que tiene una influencia en la aparición o la función de la molécula de ácido nucleico recombinante de la divulgación. Por ejemplo, las secuencias de control genético modifican la transcripción y traducción en los organismos procarióticos o eucarióticos. Los casetes de expresión también pueden comprender un promotor con una especificidad 5'-anterior mencionada anteriormente a partir de la secuencia de ácidos nucleicos particular que se va a expresar en forma transgénica, y una secuencia terminadora como secuencia de control genético adicional 3'-posterior, y si es apropiado otros elementos regulatorios convencionales, en cada caso operativamente ligados a la secuencia de ácidos nucleicos para expresar en forma transgénica.
Las secuencias de control genéticas también comprenden, otros promotores, elementos promotores o promotores mínimos capaces de modificar las propiedades de control de la expresión. En consecuencia, es posible, por ejemplo, a través de las secuencias de control genético que se produzca adicionalmente la expresión específica de tejido en forma dependiente de determinados factores de estrés adicionalmente. Los elementos correspondientes se describen, por ejemplo, para estrés hídrico, ácido abscísico (Lam E y Chua N H, J Biol Chem 266(26): 17131(1991)) y estrés por calor (Schoffl. F et al., Molecular & General Genetics 217(2-3): 246, 1989).
Es posible en principio usar todos los promotores naturales con sus secuencias regulatorias similares a las mencionadas anteriormente para el método de la divulgación. En forma adicional también es posible usar de modo ventajoso promotores sintéticos.
Las secuencias de control genético también comprenden las regiones no traducidas 5' (5'-UTR), intrones o región 3' no codificadora de genes tales como, por ejemplo, el intrón de actina 1, o los intrones de Adh1-S 1, 2 y 6 (generalmente: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Se ha demostrado que estos pueden cumplir una función significativa en la regulación de la expresión génica. En consecuencia, se ha mostrado que las secuencias no traducidas 5' son capaces de aumentar la expresión transitoria de los genes heterólogos. Un ejemplo de un potenciador de la traducción que se puede mencionar es la secuencia líder 5' del virus del mosaico del tabaco (Gallie et al. Nucl Acids Res 15, 8693 (1987)) y similares. Además, se puede fomentar la especificidad del tejido (Rouster J et al. Plant J 15, 435 (1998)). Por ejemplo, es la 5'-UTR natural del gen AtFMO GS-OX5 o ZmFMO, sin embargo el uso del promotor de los métodos que se describen en la presente memoria induce los niveles de expresión más altos, por ejemplo, el estrés por sequía induce un aumento de tres veces en el nivel de expresión, en particular respecto de la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 25, o una secuencia con al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o en particular el 99% o más identidad con esta. La molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender de modo ventajoso una o más de las llamadas secuencias potenciadoras en unión operable con los promotores, lo que hace posible el aumento de la expresión transgénica de la secuencia de ácidos nucleicos. Las secuencias ventajosas adicionales tales como elementos regulatorios adicionales o terminadores también se pueden insertar en el extremo 3' de las secuencias de ácidos nucleicos para expresar en forma recombinante. Las secuencias de ácidos nucleicos para expresar en forma recombinante pueden estar presentes en una o más copias en la construcción del gen.
Las señales de poliadenilación adecuadas como secuencias de control son señales de poliadenilación de plantas puede incluir las que corresponden esencialmente a las señales de poliadenilación de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, en particular al gen 3 del T-ADN (octopina sintasa) del plásmido Ti pTiACHS (Gielen et al. EMBO J 3: 835 (1984)) o equivalentes funcionales de los mismos. Ejemplos de secuencias de terminación particularmente adecuados son el terminador OCS (octopina sintasa) y el terminador NOS (nopalina sintasa).
Las secuencias de control significan las secuencias que hacen la recombinación homóloga o inserción en el genoma de un organismo huésped posible o permiten la supresión del genoma. En la recombinación homóloga, por ejemplo, el promotor natural de un gen particular puede ser sustituido específicamente por un promotor con especificidad para la epidermis embrionaria y/o la flor.
Una molécula de ácido nucleico recombinante y un vector de la molécula pueden comprender otros elementos funcionales. El término elemento funcional tiene un significado amplio y significan todos los elementos que tienen una influencia sobre la producción, replicación o función de las moléculas de ácidos nucleicos, los vectores o los organismos transgénicos de la divulgación. Los ejemplos no restrictivos que se pueden mencionar son los marcadores de selección que confieren una resistencia a un inhibidor del metabolismo tal como 2-desoxiglucosa 6-fosfato (documento WO 98/45456), antibióticos o biocidas, herbicidas, por ejemplo, kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina. Los ejemplos que se pueden mencionar son: secuencias de ADN que codifican las fosfinotricina acetiltransferasas (PAT), que inactivan inhibidores de la glutamina sintasa (gen de bar y pat), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (genes de la EPSP sintasa) que confieren resistencia a glifosato (R) (N (fosfonometil) glicina), el gen gox, que codifica la enzima degradadota de glifosato (R) (glifosato oxidorreductasa), el gen deh (que codifican una deshalogenasa que inactiva dalapon), y genes bxn que codifican las enzimas nitrilasa que degradan bromoxinilo, el gen aasa, que confiere una resistencia al antibiótico espectinomicina, el gen de estreptomicina fosfotransferasa (SPT), que hace posible una resistencia a la estreptomicina, el gen de la neomicina fosfotransferasa (NPTII), que confiere una resistencia a la kanamicina o geneticidina, el gen de higromicina fosfotransferasa (HPT), que media una resistencia a higromicina, el gen de acetolactato sintasa (ALS), que media la resistencia a herbicidas de sulfonilurea (por ejemplo, variantes de ALS mutadas con, por ejemplo, la mutación S4 y/o Hra), y el gen acetolactato sintasa (ALS), que media la resistencia a herbicidas de imidazolinona.
Los genes indicadores o marcadores seleccionables son genes que codifican proteínas fácilmente cuantificables y aseguran a través de un color intrínseco o actividad enzimática una evaluación de la eficiencia de transformación o la ubicación o tiempo de expresión incluyendo pero sin limitarse a proteínas indicadoras (Schenborn E. y Groskreutz D. Mol Biotechnol.; 13(1):29 (1999) tal como la proteína de fluorescencia verde (GFP) (Sheen et al. Plant Journal 8(5):777 (1995); Haselhoff et alProc Natl Acad Sci USA 94(6):2122 (1997); Reichel et al. Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888 (1996); Tian et al. Plant Cell Rep 16:267 (1997); WO 97/41228; Chui et al. Curr Biol 6:325 (1996); Leffel et al. Biotechniques. 23(5):912-8 (1997)), la cloranfenicoltransferasa, una luciferasa (Ow et al. Science 234:856 (1986); Millar et al. Plant Mol Biol Rep 10:324 (1992)), el gen aequorina (Prasher et al. Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259 (1985)), la [beta]-galactosidasa, el gen del locus R (codifica una proteína que regula la producción de pigmentos antocianina (coloración roja) en el tejido de planta y de ese modo hace posible el análisis directo de la actividad promotora sin la adición de los adyuvantes adicionales o sustratos cromogénicos; Dellaporta et al., IEn: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18a Stadler Genetics Symposium, 11:263, (1988), con [beta]-glucuronidasa (Jefferson et al., EMBO J., 6, 3901, 1987).
Los orígenes de replicación (ORI) que aseguran la replicación de los casetes o vectores de expresión pueden incluir por ejemplo E. coli. Los ejemplos que pueden mencionarse son ORI (origen de replicación del a Dn ), el ori de pBR322 o el ori de P15A (Sambrook et al.: 1989).
Los elementos que son necesarios para la transformación de la planta mediada por Agrobacterium, tal como, por ejemplo, el borde derecho o izquierdo del ADN-T o la región vir.
Para seleccionar las células transformadas con éxito, se requiere generalmente introducir un marcador de selección o seleccionable que confiere a las células transformadas con éxito una resistencia a un biocida (por ejemplo, un herbicida), un inhibidor del metabolismo tal como 2-desoxiglucosa 6-fosfato (documento WO 98/45456) o un antibiótico. El marcador de selección permite la selección de las células transformadas de las células no transformadas (McCormick et al Cell. Planta Reports 5:81 (1969)).
También se divulga una planta producida por el método de la divulgación. Como entiende el experto en la materia, dicha planta comprende la proteína FMO,
También se divulga un cultivo de tejido de células producidas a partir de la planta de la reivindicación 45, en donde dichas células del cultivo de tejido se producen a partir de una parte de planta elegida de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilo, células meristemáticas, raíces, ápices de raíz, pistilos, anteras, flores, y tallos. Como entiende el experto en la materia, dichas hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilo, células meristemáticas, raíces, ápices de raíz, pistilos, anteras, flores, y tallos comprenden la proteína FMO.
En una divulgación preferente, dicha planta es una planta monocotiledónea o dicotiledónea.
Una divulgación adicional de la presente divulgación se refiere a plantas que, como resultado de procesos naturales o inducción artificial, comprenden una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 44, donde la mutación produce un incremento de la actividad, función o cantidad de polipéptido de uno de los polipéptido codificado por las moléculas de ácidos nucleicos como se muestra en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 44. Por ejemplo una mutación generada, e identificada, porTILLING.
Como consecuencia, otra divulgación puede incluir una planta que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una mutación que produce, en las plantas o partes de la misma, un incremento de la actividad de una de las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos de la divulgación. Por ejemplo, las mutaciones involucran uno o más residuos de aminoácidos que son identificados en la secuencia de consenso en las figuras como conservados o muy conservados.
En consecuencia, una divulgación que se describe en la presente memoria proporciona una planta transgénica, parte de planta transgénica, o célula de planta transgénica que sobreexpresa una FMO exógena, incluyendo la proteína FMO sobreexpresada en la planta, parte de planta o célula de planta está codificada por (i) un ácido nucleico exógeno que tiene al menos el 50% de identidad con SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 o 40, o una variante de ayuste de la misma; o por (ii) un aminoácido exógeno que codifica una proteína que tiene al menos el 50% de identidad con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42, la proteína codificada confiere tolerancia mejorada al estrés por sequía respecto a las plantas control; (iii) un ácido nucleico exógeno capaz de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos según (i) o (ii); que codifica una proteína FMO; en donde la molécula de aminoácido codifica un polipéptido que tiene propiedades esencialmente idénticas al polipéptido que se describe en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42; la proteína codificada confiere tolerancia mejorada al estrés por sequía respecto a las plantas control; y/o por (iv) un ácido nucleico exógeno que codifica la misma proteína FMO que cualquiera de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) anteriormente, pero que difiere de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) anteriormente debido a la degeneración del código genético.
También se proporcionan en la presente memoria plantas transgénicas transformadas con al menos a) una secuencia de ácido nucleico que comprende las moléculas de ácidos nucleicos como se muestra en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 44; las secuencias de ácidos nucleicos que son complementarias a la misma, o la molécula de aminoácidos que codifica los polipéptidos como se muestra en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 43; b) un casete de expresión transgénico que comprende una de las secuencias de ácidos nucleicos, o un vector, y células, cultivos celulares, tejido, partes - tal como por ejemplo hojas, raíces y similar o material de propagación en el caso de organismos de plantas - obtenidos de dichos organismos. Debe notarse que esta divulgación también puede incluir una planta distinta de Arabidopsis thaliana.
Los organismos huésped o microorganismos de partida, en el presente documento "organismos transgénicos" son plantas como se define anteriormente. En una divulgación, el organismo transgénico es una planta madura, semilla, brote y plántula, y partes, material de propagación y cultivos derivados de los mismos, cultivos de células, por ejemplo. Como se utiliza en la presente memoria, "planta madura" significa plantas en cualquier etapa de desarrollo más allá de la etapa de plántula. "Plántula" significa una planta inmadura joven en una etapa temprana de desarrollo. Las plantas que son particularmente preferidas como organismos huésped son plantas a las que puede aplicarse el método para obtener una tolerancia al estrés por sequía según los criterios mencionados anteriormente. En una divulgación, la planta es una planta dicotiledónea como se debate anteriormente. En otra divulgación, la planta es una planta monocotiledónea como se debate anteriormente. Los organismos transgénicos se pueden generar con los métodos que se describen anteriormente para la transformación o transfección de los organismos.
Otras divulgaciones que se describen en la presente memoria incluyen el uso de organismos transgénicos y células, cultivos celulares, partes - tal como, por ejemplo, raíces, hojas y similares, en el caso de los organismos transgénicos de plantas, y material de propagación transgénico tal como semillas o frutas para la preparación de alimentos o piensos para ganado, productos farmacéuticos o productos químicos finos. También se incluyen variedades de apilamiento en las que se combinan una pluralidad de rasgos ventajosos tal como rasgos clásicos de herbicidas mencionados anteriormente o genes con tolerancia a herbicidas, genes de resistencia a insectos dañinos, genes productores de sustancia antipatógena, rasgos mejorados en los ingredientes oleaginosos o rasgos que tienen contenido de aminoácidos de refuerzo.
Las partes de la planta transgénica también se proporcionan en el presente documento y comprenden el ácido nucleico FMO o proteína FMO. Las mismas pueden ser semillas, raíces, hojas y/o flores que comprenden el ácido nucleico FMO o proteína FMO o partes de los mismos. Las partes preferidas de plantas de soja son las habas de soja que comprenden el ácido nucleico FMO o proteína FMO. También se proporcionan productos derivados de plantas transgénicas como se describen en la presente memoria, sus partes o partes cosechables de las mismas, incluyendo harina o aceite, tal como harina de soja o aceite de soja, que comprende el ácido nucleico FMO o proteína FMO. Una divulgación es el método para la producción de un producto, en donde el producto es harina o aceite, preferentemente, harina de soja o aceite de soja.
En una divulgación que se describe en la presente memoria, el método para la producción de un producto comprende: a) cultivar las plantas que se describen en la presente memoria o son obtenibles por los métodos que se describen en la presente memoria y b) producir el producto a partir de o mediante las plantas de la divulgación y/o partes, por ejemplo, semillas, de estas plantas.
En otra divulgación los productos producidos por los métodos que se describen en la presente memoria son productos de plantas tal como, pero sin limitarse a, alimento, pienso para ganado, un suplemento alimenticio, suplemento de pienso para ganado, fibra, cosmético y/o fármaco. Los productos alimenticios se consideran composiciones utilizadas para la nutrición y/o para complementar la nutrición. Los piensos para ganado y suplementos de la alimentación animal, en particular, están considerados como productos alimenticios.
En otra divulgación el método comprende las etapas a) cultivar las plantas de la divulgación, b) retirar las partes cosechables como se define anteriormente de las plantas y c) producir el producto a partir de o por las partes de la planta transgénica u organismo.
El producto puede ser producido en el lugar donde la planta ha sido cultivada, las plantas y/o sus partes pueden ser retiradas del sitio donde las plantas se han cultivado para producir el producto. Por lo general, la planta se cultiva, las partes cosechables deseadas se retiran de la planta, si es posible en ciclos repetidos, y el producto se elabora a partir de las partes cosechables de la planta. La etapa de cultivar la planta puede ser llevada a cabo sólo una vez cada vez que se realizan los métodos divulgados en el presente documento, al tiempo que permite veces repetidas de las etapas de producción de productos, por ejemplo, por retirada repetida de las partes cosechables de las plantas de la divulgación y procesamiento adicional si es necesario de estas partes para llegar al producto. Es posible que la etapa de cultivar las plantas de la divulgación se repita y las plantas o partes cosechables se almacenen hasta que entonces se realice la producción del producto una vez para las plantas acumuladas o parte de plantas. Además, las etapas de cultivar las plantas y producir el producto se pueden realizar con una superposición en el tiempo, incluso simultáneamente en gran medida o secuencialmente. Generalmente las plantas se cultivan durante algún tiempo antes de que se produzca el producto.
En otra divulgación los métodos para la producción se utilizan para elaborar productos agrícolas tal como, pero sin limitarse a, extractos de plantas, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, grasas, aceites, polímeros, vitaminas, y similares. Téngase en cuenta que es posible que un producto de planta consista en uno o más productos agrícolas en gran medida.
Las plantas transgénicas producidas como se describe en la presente memoria pueden cruzarse con plantas transgénicas similares o con plantas transgénicas que carecen de ácidos nucleicos de la divulgación o con plantas no transgénicas, utilizando métodos conocidos de reproducción de plantas, para preparar semillas. Además, las células de planta transgénicas o plantas que se describen en la presente memoria pueden comprender, y/o cruzarse con otra planta transgénica que comprende uno o más ácidos nucleicos exógenos, creando de ese modo un “apilamento” de transgenes en la planta y/o su progenie. La semilla entonces se planta para obtener una planta transgénica fértil cruzada que comprende el ácido nucleico FMO. La planta transgénica fértil cruzada puede tener el casete de expresión particular heredado a través de un progenitor hembra o de un progenitor macho. La segunda planta puede ser una planta endogámica. El transgénico fértil cruzado puede ser un híbrido. También se divulgan en el presente documento semillas de cualquiera de estas plantas transgénicas fértiles cruzadas. Las semillas divulgadas en el presente documento pueden ser cosechadas de plantas transgénicas fértiles y pueden ser usadas para cultivar generaciones de progenie de plantas transformadas de esta divulgación incluyendo líneas de plantas híbridas que comprenden el ácido nucleico exógeno.
Por ello otra divulgación puede incluir un método para reproducir una planta tolerante al estrés por sequía que comprende las etapas de: (a) cruzar una planta transgénica que se describe en la presente memoria o una planta obtenible por un método que se describe en la presente memoria con una segunda planta; (b) obtener una semilla o semillas resultantes de la etapa de cruzamiento que se describe en (a); (c) plantar la semilla o semillas y cultivar la semilla o semillas para generar plantas; y (d) seleccionar de las plantas las plantas que expresan una proteína FMO, codificada por (i) un ácido nucleico exógeno que tiene al menos el 60% de identidad con SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 44, o una variante de atuste de las mismas; (ii) un ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que tiene al menos el 60% de identidad con SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 43; la proteína codificada confiere tolerancia mejorada al agua respecto de las plantas control; (iii) un ácido nucleico exógeno capaz de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos según (i) o (ii); que codifica una proteína FMO; en donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene propiedades esencialmente idénticas al polipéptido que se describe en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 43; preferentemente la proteína codificada confiere tolerancia mejorada al estrés hídrico respecto a las plantas control; y/o por (iv) un ácido nucleico exógeno que codifica la misma proteína FMO que cualquiera de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) anteriormente, pero que difiere de los ácidos nucleicos de (i) a (iii) anteriormente debido a la degeneración del código genético.
Otra divulgación proporcionada en la presente memoria es un método para la mejora de la planta que comprende (a) obtener una planta transgénica mediante cualquiera de los métodos de la presente divulgación; (b) combinar dentro de una célula de planta el material genético de al menos una célula de planta de la planta de (a) con el material genético de al menos una célula que difiere en uno o más genes de las células de planta de las plantas de (a) o cruzar la planta transgénica de (a) con una segunda planta; (c) obtener la semilla de al menos una planta generada a partir de una célula de planta de (b) o la planta del cruzamiento de la etapa (b); (d) plantar las semillas y cultivar las semillas para generar plantas; y (e) seleccionar de las plantas, plantas que expresan el ácido nucleico que codifica la proteína FMO GS-OX5; y opcionalmente (f) producir el material de propagación a partir de las plantas que expresan el ácido nucleico que codifica la proteína FMO GS-OX5. Las plantas transgénicas pueden seleccionarse mediante métodos conocidos como se describe anteriormente (por ejemplo, por la detección de la presencia de uno o más marcadores que están codificados por los genes expresables en plantas co-transferidos con el gen FMO o por cribado del ácido nucleico de FMO mismo), la expresión de un gen estructural puede, por supuesto, también efectuarse, o estar influida, independientemente de los métodos que se describen en la presente memoria o el uso del objeto que se describe en la presente memoria.
La práctica que se describe en la presente memoria emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, genética, inmunología, biología celular, cultivo celular y biología transgénica, que están dentro del alcance de la técnica. (Véase, por ejemplo, Maniatis, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1982); Sambrook, et al., (1989); Sambrook y Russell, Molecular Cloning, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (incluyendo actualizaciones periódicas) (1992); Glover, DNA Cloning, IRL Press, Oxford (1985); Russell, Molecular biology of plants: a laboratory course manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, Academic Press, NY (1992); Guthrie y Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, NY (1991); Harlow y Lane, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Nucleic Acid Hybridization, B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984); Transcription and Translation, B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R.I. Freshney, A.R. Liss, Inc. (1987); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., NY); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155, Wu, et al., eds.; Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology, Mayer y Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds. (1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1988); Fire, et al., RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge (2005); Schepers, RNA Interference in Practice, Wiley VCH (2005); Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology, DNA Press (2003); Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowa, NJ (2004); y Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application, CRC (2004)).
Todos los términos y realizaciones descritas anteriormente son igualmente aplicables a este aspecto de la invención.
La invención se describirá por medio de los siguientes ejemplos que han de considerarse como meramente ilustrativos y no limitantes del ámbito de la invención.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente varias aplicaciones y no están destinados a limitar la invención más allá de las limitaciones expuestas en las reivindicaciones anexas.
Métodos generales
Material biológico y condiciones de cultivo
Para la sobreexpresión de la proteína FMO, se obtuvieron plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan el gen FMO GS-OX5 (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2) y se describen como RCI5-OE (documento ES 2347399B1) (genotipos FMOX3 y FMOX8 que se muestra en la Figura 3) y semillas de tipo salvaje (Col-0) de Arabidopsis thaliana usando el siguiente método.
El ADNc de RCI5 se ligó en el sitio SmaI, después del promotor CaMv35S en el vector pROK2 (Baulcombe et al., 1986) (que se muestra en la construcción de la Figura 4a), para obtener el X3 y X8. Una vez que se verificó la presencia de la construcción (tal como la construcción que se describe en Figura 4a y Figura 4b) en el plásmido recombinante por secuenciación del ADN, se introdujo en la cepa C58C1 de Agrobacterium tumefaciens (Deblaere et al., 1985). La transformación de Arabidopsis Col se realizó siguiendo el método de inmersión floral (Clough y Bent 1998). Las plantas se sembraron en macetas de plástico que contienen la misma cantidad de sustrato saturado en agua. Las placas que contienen 16 macetas con 5 plantas por maceta se colocaron en una cámara de cultivo en condiciones de luz de día corto hasta que se desarrollaron 12 hojas. Luego, las placas se transfirieron al invernadero en condiciones de luz de día largo y las macetas se colocaron individualmente en vasos de plástico transparentes con el fin de evitar derrame de agua durante los riegos. Las plantas regadas normales para cada genotipo también se colocaron en las placas como controles. Se utilizaron un total de 4 placas, con genotipos distribuidos de manera diferente dentro de cada placa. No se observaron diferencias fenotípicas entre los genotipos.
A fin de determinar el análisis de biomasa de la planta, las plantas de Arabidopsis se cultivaron durante tres (3) semanas en condiciones de día corto (10 horas luz, 14 horas de oscuridad, 21°C luz y 20°C por la noche, 65% de humedad). Se obtuvo el peso fresco de las rosetas individuales, Col-0 (n=10) y RCI5-OE (documento ES 2347399B1) (genotipos FMOX3 y FMOX8) dos semanas después de la siembra (n=10). Se registró el rendimiento de las semillas de plantas completamente crecidas que se cultivaron durante 3 semanas en condiciones de día corto y luego se transfirieron durante 3 semanas adicionales en condiciones de día largo. Las semillas se recolectaron 4 semanas después de las plantas individuales (n=10).
Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN))
Se determinó el contenido de TMAO en las plantas mediante la recolección de tres hojas por tratamiento y congelándolas en nitrógeno líquido antes de la determinación de RMN. Se trataron al menos tres plantas independientes por experimento.
Material biológico y condiciones de cultivo para el invernadero
En cada uno de los experimentos de marchitamiento o agua limitada se sembraron 480 semillas (de pimiento, cebada, tomate, pepino o maíz), que producen 384 plantas en macetas de 512 cm3 (4 plantas por maceta). Las plantas se cultivaron en condiciones de cámara a 21°C durante 3 semanas. Luego, las plantas se trasladaron a un invernadero, donde la temperatura promedio fue de 25°C a 28°C. Los tratamientos que se describen en la presente memoria se realizaron cuando las plantas tuvieron dos hojas extendidas y apareció el siguiente par de hojas.
Tratamientos: Doce macetas (12) (que contienen 48 plantas) se regaron con 40 ml de: agua, solución de TMAO dihidrato 0,1 g/l, solución de TMAO dihidrato 1,0 g/l, o solución de TMAO dihidrato 5,5 g/l. Otro conjunto de 12 macetas que contienen 48 plantas se pulverizó con 40 ml de agua (3,3 ml en promedio por maceta), una solución que contiene solución de TmAO dihidrado 0,1 g/l, TMAO dihidrato 1,0 g/l, o TMAO dihidrato 5,5 g/l. Todas las macetas también se regaron con 40 ml de agua. Las plantas pulverizadas se regaron con el mismo volumen de agua que las "plantas irrigadas). Las macetas se colocaron en vasos de plástico para mantener la humedad constante y para evitar el derrame de líquido durante el riego. Las placas que contienen las macetas se ubicaron en las mesas del invernadero. La distribución de las placas sobre la mesa y la posición de las macetas en la placa se cambió cada semana para evitar los efectos de posición.
Después de los tratamientos descritos anteriormente, las plantas no se regaron hasta que las macetas perdieron completamente su humedad, lo que tarda aproximadamente 4 a 8 días dependiendo de la estación, en este momento las plantas estaban extremadamente marchitas en los experimentos de sequía extrema. Luego las plantas se regaron una vez con soluciones que contienen diferentes cantidades de TMAO dihidrato descritas anteriormente (0,1 g/l, 1,0 g/l o 5,5 g/l) o simplemente agua, después de lo cual, se dejó que las plantas pierdan su humedad completamente de nuevo durante tres ciclos consecutivos de riego después del marchitamiento. En los experimentos de "agua limitada" se regaron con 20 ml de agua o solución en lugar de 40 ml cuando las primeras plantas comenzaron a marchitarse. La tasa de supervivencia de la planta fue registrada y analizada para los experimentos "sequía extrema" en los que se permitió que las plantas se marchiten gravemente antes del riego, mientras que se registró la longitud del tallo como analizada para los experimentos de agua limitada en que las plantas se riegan con un 30% de lo que la planta necesita.
Fresas, puerro, lechuga, brócoli, apio o colinabo
A fin de determinar la productividad del rendimiento de las plantas en condiciones normales, se cultivaron la variedad 'Sabrina', 'Candonga' y 'Fortuna' de fresa, puerro, lechuga, la variedad “Iceberg”, variedad “Parthenon” de brócoli, plantas de apio o colinabo en condiciones de producción estándares y se analizaron 120 plantas de cada variedad por tratamiento (donde el tratamiento fue un control que comprende riego estándar o 1 g/l de la pulverización de TMAO cada cuatro semanas). Las plantas se ubicaron en cuatro (4) posiciones diferentes para cada grupo de 30 plantas del mismo tratamiento. Se recolectaron frutas, hojas o raíces de plantas individuales y se determinó el peso total para cada planta.
Tomates
A fin de determinar la tolerancia a la sequía o estrés hídrico después del tratamiento de las semillas con TMAO dihidrato y germinación en presencia de TMAO dihidrato, las semillas de tomate 'Moneymaker' se esterilizaron en superficie durante 3 minutos en etanol al 70%, luego se lavaron dos veces y finalmente se incluyeron en una solución de pretratamiento de solución de TMAO dihidrato 0,1 g/l (o solo agua) con agitación durante 3 horas. Luego, se lavaron e incluyeron en las placas de germinación en condiciones estériles. Se añadió polietilenglicol (PEG-6000) al medio de germinación (medio de sales de Murashige y Skoog) a 152 y 182 g/l. La cantidad creciente de PEG reduce los valores de ^ (potencial hídrico), que simula las condiciones de sequía para la germinación. Cada placa de germinación tenía al menos 30 semillas, y cada placa de tratamiento/pretratamiento se replicó cinco veces (150 semillas por tratamiento/pretratamiento). Las semillas se dejaron germinar durante 10 días en condiciones de oscuridad en una cámara de cultivo (21°C luz y 20°C noche, 65% de humedad). Luego, las semillas germinadas se registraron por inspección visual y se realizó el análisis de datos usando software Statgraphics.
Ensayos de campo de maíz, cebada y girasol
Con el fin de determinar la tolerancia a la sequía o estrés hídrico después del tratamiento de semillas con TMAO dihidrato y germinación en presencia de TMAO dihidrato, semillas de cebada "Hispanic" o semillas de maíz "FAO700", o semillas de girasol "Sambro" se esterilizaron en superficie durante 3 minutos en etanol al 70%, luego se lavaron dos veces y finalmente se incluyeron en una solución de pre-tratamiento de solución de TMAO dihidrato 1 g/l (o solo agua) con agitación durante 3 horas a una dosis de 1 litro por kg de semillas. Luego, se sembraron las semillas en parcelas aleatorizadas de 10 sqm en una superficie de 2.000 sqm. El contenido de clorofila se midió 1 mes antes de la cosecha. En el maíz, se aplicó el riego a la mitad de las parcelas, mientras que la otra mitad solo recibió un riego de establecimiento inicial. Las parcelas de cebada recibieron 200 l de lluvia por m2 durante la estación de crecimiento. Algunas de las parcelas recibieron un segundo tratamiento de pulverización con 1 g/litro de TMAO.
Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)
Se determinó el contenido de TMAO en las plantas mediante la recolección de tres hojas por tratamiento y su congelación en nitrógeno líquido antes de la determinación de RMN. Se trataron al menos tres plantas independientes por experimento.
Ejemplo 1: TMAO se acumula en pimiento y cebada después del tratamiento por sequía de 1 semana. Se sembraron semillas de pimiento 'Murano' y cebada 'Bomi' y se cultivaron como se describe anteriormente. Las plantas control (de seis semanas) se regaron con 40 ml de agua dos veces en la semana, mientras las plantas tratadas por “sequía” no se regaron. Se cosecharon las hojas y se determinó TMAO por RMN como se describe. Como se muestra en la Tabla 1, los niveles de TMAO aumentaron casi tres veces en comparación con el control tanto en pimiento como en cebada después del tratamiento por sequía.
Tabla 1. Acumulación de TMAO des ués de 1 semana de se uía
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Como se muestra en la Tabla 1, en la fila 1, el pimiento control muestra 446,68 pM of TMAO, mientras en la fila 2 se muestra que 7 días de tratamiento por sequía aumenta niveles de TMAO en el pimiento 2,74 veces hasta 1224,23 pM. De forma análoga en la fila 3 la cebada control muestra 422,10 pM de TMAo mientras en la fila 4 se muestra que 7 días de tratamiento por sequía aumenta los niveles de TMAO en la cebada 2,97 veces hasta 1252,73 pM. Ejemplo 2: TMAO se acumula en pimiento y cebada cuando se aplica de forma exógena. Se sembraron semillas de pimiento 'Murano' y cebada 'Bomi' y se cultivaron como se describe anteriormente. Las plantas control (de seis semanas) se pulverizaron con agua y las plantas de pimiento tratadas se pulverizaron con 1g/l de TMAO mientras las plantas de cebada se pulverizaron con 1g/l de TMAO formulado con el 0,1% de alquilpolisacárido C8-C10. Se cosecharon las hojas y se determinó TMAO por RMN. El porcentaje de aumento de TMAO en comparación con los controles no tratados se determinó para cada punto de tiempo. Los niveles de TMAO aumentaron en pimiento y cebada con el tratamiento exógeno de TMAO a 1g/l a niveles mayores que el tratamiento por sequía y además, los niveles de TMAO son elevados hasta 40 días posteriores a la pulverización en pimiento.
Tabla 2. Acum l i n TMA l r mi n l riz i n n TMAO dihidrato
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Como se muestra en la Tabla 2, en la fila 1, el pimiento pulverizado con TMAO aumenta su nivel de TMAO 5,29 veces 1 día posterior a la pulverización en comparación con el control pulverizado con agua. El nivel disminuye después de 10 días a 3,73 veces del control (fila 2), después de 20 días a 2,86 veces del control (fila 3), después de 30 días a 1,35 veces del control no pulverizado (fila 4), permaneciendo por encima del control pulverizado con agua incluso 40 días después de la pulverización (fila 5). De forma análoga en la fila 6, la cebada pulverizada con TMAO y un alquilpolisacárido, aumenta su nivel de TMAO 8,22 veces 1 día posterior a la pulverización en comparación con el control pulverizado con solo el alquilpolisacárido debido a la mejor penetración del TMAO formulado con el alquilpolisacárido.
Ejemplo 3: La aplicación exógena de TMAO dihidrato no tiene compensaciones en fresa. El rendimiento de la fruta se determinó en plantas de fresa 'Sabrina', 'Candonga' y 'Fortuna' tratadas con 1g/l de TMAO dihidrato o agua como se describe anteriormente para evaluar los costos de compensación del tratamiento sin estrés hídrico. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa en la producción de fruta que fue siempre levemente más elevada en las plantas tratadas con TMAO dihidrato.
Tabla 3. Producción de fruta de fresa después de los tratamientos de pulverización con TMAO dihidrato cada 4 semanas durante 3 meses
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La Tabla 3 muestra que TMAO puede aplicarse en forma exógena durante tres meses sin costo de adaptabilidad. En la fila 1 el peso de producción total de las plantas de variedad Sabrina tratadas con TMAO dihidrato produjeron el 106% en comparación con controles tratados con agua, en la fila 2 el peso de producción total de las plantas de variedad Candonga tratadas con TMAO dihidrato produjeron el 102% en comparación con los controles, en la fila 3 el peso de producción total de las plantas de variedad Fortuna tratadas con TMAO dihidrato produjeron el 101% en comparación con los controles, mientras en la fila 4 el peso de producción total de las plantas de tres variedades tratadas con TMAO dihidrato produjeron el 105% en comparación con los controles tratados con agua de las tres variedades.
Ejemplo 4: TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la germinación tanto en pretratamiento de las semillas y como un aditivo al medio. Se sembraron semillas de tomate 'Moneymaker', se cultivaron y se trataron como se describe anteriormente.
Tabla 4. Tasas de germinación de semillas de tomate ± E.E. y valores P de ANOVA para los dos experimentos independientes donde se evaluó el efecto de TMAO dihidrato en la germinación de semillas en condiciones de í n r ñ i n P li il n li l PE - l m i rmin i n
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Los asteriscos (*) indican las diferencias significativas estadísticas entre el control y las semillas tratadas (a=0,05) Este ejemplo muestra que TMAO puede aplicarse de forma exógena en el tratamiento de semillas para mejorar la germinación en condiciones de sequía antes de que se produzca el estrés hídrico. Se germinan las semillas en presencia de PEG para inducir estrés hídrico. Se utilizan dos concentraciones en las primeras 3 filas 152 g/l (que corresponde a un valor y de -0,2564) y una dosis superior 182 g/l (que corresponde a un valor y de -0,3676) para mostrar que a valores crecientes de estrés hídrico la germinación disminuye. En la primera y en la cuarta filas no se aplica ningún tratamiento a las semillas que se germinan directamente en presencia de PEG. Se muestra que en efecto el estrés hídrico afecta la germinación que es solamente del 25,80% para 152 g/l de PEG (fila 1) y el 15,37% para 182 g/l de PEG (fila 4). El pretratamiento de las semillas durante 3 horas con solución de TMAO dihidrato 0,1g/l aumenta significativamente las tasas de germinación hasta el 70,62% para 152 g/l de PEG (fila 2), y el 18,53% para 182 g/l de PEG (fila 5) en comparación con los controles no tratados. Además, si se añade TMAO dihidrato 0,1g/l al medio de germinación, las tasas de germinación aumentan significativamente incluso más altas hasta el 71,09% para 152 g/l de PEG (fila 3), y especialmente hasta el 45,00% para la condición de mayor estrés hídrico de182 g/l de PEG (fila 6) en comparación con los controles no tratados.
Ejemplo 5: El TMAO dihidrato aplicado en forma exógena aumenta la supervivencia de las plantas en pimiento en condiciones de sequía extrema. Las semillas de pimiento 'Murano' se sembraron, cultivaron y trataron como se describe anteriormente. La pulverización de 10 g/l y 1 g/l de TMAO dihidrato fue el mejor tratamiento cuando se realizó el riego con agua, con el 83,3% de supervivencia de plantas mientras que se observó una tasa de supervivencia de plantas del 100% cuando las plantas se pulverizaron con 0,1 g/l o 1 g/l y se regaron con 5 g/l. Tabla 5. La tasa de supervivencia promedio y análisis ANOVA para plantas de pimiento tratadas con TMAO dihidrato en condiciones de crecimiento con sequía.
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La tabla 5 muestra que TMAO puede aplicarse de forma exógena mediante pulverización y/o riego antes de que se produzca el estrés hídrico e incrementar la tasa de supervivencia de plantas en condiciones de estrés hídrico extremo en una especie de cultivo de hortalizas. En las filas 1-4 los tratamientos de pulverización se comparan combinados de manera independiente de los tratamientos de riego. La tasa de supervivencia después de la sequía aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO, la más baja es en la fila 1 sin TMAO (42,7%) y la más alta en la fila 4 con 10 g/l de TMAO (71,8%). En las filas 5-8 los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se irrigan solo con agua. De forma análoga la tasa de supervivencia después de la sequía aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO, la más baja es en la fila 5 sin TMAO (45,8%) y la más alta en la fila 8 con 10 g/l de t Ma O (79,1%). En las filas 9-12 los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se irrigan con 0,1 g/l de TMAO. La tasa de supervivencia después de la sequía aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO, la más baja es en la fila 9 sin t Ma O (29,1%) y la más alta en la fila 12 con 10 g/l de TmAo (83,3%). En las filas 13-16 los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se irrigan con 1 g/l de TMAO. La tasa de supervivencia después de la sequía también aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO la más baja es en la fila 13 sin TMAO (0%) y la más alta en la fila 16 con 10 g/l de TMAO (37,5%). Los mejores resultados se obtienen cuando las plantas se irrigan con TMAO a 5 g/l (filas 17-20). Incluso sin tratamiento de pulverización, la tasa de supervivencia es el 95,8% (fila 17), que aumenta hasta el 100% de supervivencia con 0,1 g/l y 1 g/l de los tratamientos de pulverización (filas 18-19). La combinación de las dosis más altas de la pulverización de 10 g/l y riego de 5 g/l reduce la tasa de supervivencia al 87,5% (fila 20) debido a la sobredosis de TMAO.
Ejemplo 6: El TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la supervivencia del tomate en condiciones de sequía extrema. Las semillas de tomate Moneymaker se sembraron, se cultivaron y trataron como se describe. No se observaron diferencias estadísticas entre los modos de aplicación (TMAO dihidrato pulverizado o regado) en este experimento. 5 g/l de TMAO dihidrato pulverizado fue el mejor tratamiento cuando se realizó el riego con agua, con el 74,2% de supervivencia de plantas. A tasas de prueba más altas, ambos tratamientos mostraron un aumento claro de la masa seca de brotes en comparación con las plantas no tratadas. Adicionalmente, las plantas tratadas con TMAO se comportaron de manera extremadamente sana en comparación con el control no tratado, aunque las plantas resistieron la sequía mucho mejor después del tratamiento por sequía (Figura 1). Adicionalmente, como se muestra en la Figura 1, las plantas tratadas con TMAO se comportaron de manera extremadamente sana en comparación con el control no tratado, aunque las plantas resistieron la sequía mucho mejor después del tratamiento por sequía. En la Figura 1, en el lado izquierdo las plantas de control irrigadas con agua y en el lado derecho las plantas tratadas irrigadas con 5,5 g/l de t Ma O dihidrato después de la recuperación de la sequía.
Tabla 6. Tasa de supervivencia promedio y análisis de ANOVA para plantas de tomate tratadas con TMAO dihidrato en condiciones de se uía.
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La Tabla 6 muestra que TMAO se puede aplicar en forma exógena mediante pulverización y/o riego antes de que ocurra el estrés hídrico, y así aumentar la tasa de supervivencia de la planta en la familia Solanaceae, en condiciones de estrés hídrico extremo. En las filas 1-4 los tratamientos de pulverización se comparan combinados de forma independiente de los tratamientos de riego. La tasa de supervivencia después de la sequía aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO, la más baja es en la fila 1 sin TMAO (12,5%) y la más alta en la fila 4 con 5 g/l de TMAO (56,6%). En las filas 5-8 los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se irrigan solo con agua. En forma análoga, la tasa de supervivencia después de la sequía aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO, la más baja es en la fila 5 sin TMAO 16,6%) y la más alta en la fila 8 con 5 g/l de TMAO (74,2%). En las filas 9-12, los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se irrigan con 0,1 g/l de TMAO. La tasa de supervivencia después de la sequía aumenta significativamente con las concentraciones más altas de la pulverización de TMAO, la más baja es en las filas 9 y 10, sin TMAO (16,6%) y 0,1 g/l pulverización de TMAO (12,5%) respectivamente, y la más alta en la fila 12 con 5 g/l de TMAO (68,9%). En las filas 13-16, los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se irrigan con 1 g/l de TMAO. La tasa de supervivencia después de la sequía también aumenta significativamente con las concentraciones más altas de la pulverización de TMAo , la más baja es en las filas 13 y 14, sin TMAO (4,1%) y 0,1 g/l pulverización de TMAO (0%) respectivamente, y la más alta en la fila 16 con 5 g/l de TMAO (33,3%). El aumento del tratamiento de riego con TMAO a 5 g/l (filas 17-20) mejora las tasas de supervivencia en comparación con los tratamientos de riego de dosis baja combinados con los tratamientos de pulverización, pero en el tomate no es tan bueno como con los tratamientos de pulverización solo, probablemente debido a una sobredosis de TMAO, aunque el aumento de las concentraciones de pulverización de TMAO también aumentarán la tasa de supervivencia global. La combinación de las dosis más altas de pulverización 5 g/l y riego 5 g/l produce una tasa de supervivencia del 50% (fila 20).
Ejemplo 7: El TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la supervivencia de la planta de pepino en condiciones de sequía extrema. Las semillas de pepino 'Marketer' se sembraron, se cultivaron y trataron como se describe. Las aplicaciones de riego parecen producir mejor rendimiento sobre la tasa de supervivencia (valor P 0,05). 5 g/l de TMAO pulverizado fue el mejor tratamiento cuando se realizó el riego con 5 g/l de TMAO, con el 95,8% de supervivencia de plantas.
Tabla 7. Tasa de supervivencia promedio y análisis de ANOVA para plantas de pepino tratadas con TMAO en condiciones de crecimiento con sequía.
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La Tabla 7 muestra que TMAO puede aplicarse en forma exógena mediante pulverización y/o riego antes de que ocurra el estrés hídrico, e incrementar la tasa de supervivencia de la planta en la familia Cucurbitaceae, en condiciones de estrés hídrico extremo. En las filas 1-4 los tratamientos de pulverización se comparan combinados de forma independiente de los tratamientos de riego. La tasa de supervivencia después de la sequía aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO, la más baja es en la fila 1 sin TMAO (66,6%) y la más alta en la fila 4 con 5 g/l de TMAO (94,7%). En las filas 5-8, los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se irrigan solo con agua. En forma análoga, la tasa de supervivencia después de la sequía aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO, la más baja es en la fila 5 sin TMAO (54,1%) y la más alta en la fila 8 con 5 g/l de TMAO (95,8 %). En las filas 9-12, los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se irrigan con 0,1 g/l de TMAO. La tasa de supervivencia después de la sequía aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO, la más baja es en la fila 9 sin TMAO (45,8%) y la más alta en la fila 12 con 5 g/l de TMAO (95,8%). En las filas 13-16 los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se irrigan con 1 g/l de TMAO. La tasa de supervivencia después de la sequía también aumenta significativamente con cualquiera de los tratamientos de pulverización con TMAO, la más baja es en la fila 13 sin TMAO (87,5%) y la más alta en las filas 14-16 con 0,1, 1 o 5 g/l de TMAO, lo que da la misma tasa de supervivencia del 91,6%. Los mejores resultados se obtienen cuando las plantas se irrigan con TMAO a 5 g/l (filas 17-20). Incluso sin el tratamiento de pulverización, la tasa de supervivencia es el 66,6% (fila 17), que aumenta hasta el 95,8% de supervivencia con tratamiento de pulverización de 5 g/l (filas 20).
Ejemplo 8: TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la supervivencia de la planta en el tomate con riego con agua limitado. Se sembraron semillas de tomate 'Moneymaker', se cultivaron y se trataron como se describe. Los tratamientos de pulverización y riego con TMAO aumentaron significativamente el tamaño de la planta.
Tabla 8. Tamaño de tallo promedio y análisis ANOVA para plantas de tomate regadas con agua y TMAO en condiciones de crecimiento con a ua limitada.
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La Tabla 8 muestra que TMAO puede aplicarse de forma exógena por pulverización y riego antes de que se produzca el estrés hídrico incrementando la biomasa de brotes en la familia Solanaceae, en condiciones de estrés hídrico limitado. En las filas 1-2 los tratamientos de riego se comparan combinados independientemente del tratamiento de pulverizaciones. La longitud de brotes aumenta significativamente después del riego limitado con 1 g/l de pulverización con TMAO la más baja es en la fila 1 sin TMAO (10,57 cm) y la más alta en la fila 2 con 1 g/l de pulverización TMAO (12,97 cm). En las filas 1, 3, 5 y 7 los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se riegan solamente con agua. La longitud de los brotes después del riego con agua limitada aumenta significativamente con la concentración de la pulverización de TMAO la más baja es en la fila 1 sin TMAO (10,57 cm) y la más alta en la fila 7 con 5 g/l de TMAO (14,2 cm). En las filas 2, 4, 6 y 8 los tratamientos de pulverización se comparan cuando las plantas se riegan con 1 g/l de TMAO. Nuevamente la longitud de brote aumenta significativamente después del riego con agua limitada con las concentraciones crecientes de la pulverización de TMAO la más baja es en la fila 2, sin pulverización de TMAO (12,97 cm) y la más alta en la fila 8 cuando ambos tratamientos se combinan con 5 g/l de tratamiento de pulverización de TMAO y 1 g/l de tratamiento de riego (14,6 cm).
Ejemplo 9: TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la producción de la planta en tomate en riego con agua limitada. Se sembraron semillas de tomate 'Río Grande', se cultivaron y se trataron como se describe. El tratamiento de pulverizaciones con 1 g/l de TMAO aumentó la producción de la planta.
Tabla 9. Producción de fruta promedio y análisis ANOVA para plantas de tomate tratadas con pulverización con TMAO^ en condiciones^ de crecimiento con a ua limitada.
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La Tabla 9 muestra que se puede aplicar TMAO de forma exógena por medio de aspersión antes de que se produzca el estrés hídrico para incrementar la producción en la familia Solanaceae, en condiciones de estrés hídrico limitado. En la fila 2 se muestra que el 30% de riego con agua disminuye en forma significativa la producción de plantas (52,9 g/fruta) cuando se compara con las plantas en la fila 1 con riego con agua normal (73,85 g/fruta). Sin embargo, como se muestra en la fila 3, el tratamiento de pulverización con 1 g/l de TMAO dihidrato aplicado de forma exógena cada 4 semanas restaura la producción de plantas, con un aumento de la producción de frutas del 45%, incluso en condiciones de riego con agua limitada (76,73 g/fruta) sobre las plantas no tratadas con riego del 30%.
Ejemplo 10: El TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la supervivencia de las plantas y la biomasa en la cebada con riego con agua limitada. Se sembraron semillas de cebada 'Bomi', se cultivaron y se trataron como se ha descrito.
Tabla 10. Peso seco promedio ± E.E. y análisis ANOVA para TMAO dihidrato y plantas de cebada regadas con agua en condiciones de cultivo con se uía.
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La Tabla 10 muestra que el TMAO se puede aplicar de forma exógena por medio de aspersión y riego antes de que se produzca el estrés hídrico para incrementar la tasa de supervivencia de las plantas y la biomasa de los brotes en plantas monocotiledóneas, en condiciones extremas de estrés hídrico. En las tres primeras filas, los tratamientos iniciales se comparan, tanto los tratamientos con aerosol de 1 g/l de TMAO dihidrato (fila 2) como con riego de 1 g/l de TMAO dihidrato (fila 3) aumentaron en forma significativa la biomasa seca promedio por planta, en condiciones extremas de sequía, a 1205,4 mg y 1371,4 respectivamente en comparación con agua tratada de plantas control en la fila 1 (1017,7 mg). Además, se pueden obtener resultados análogos cuando las plantas sólo se riegan con TMAO dihidrato 1 g/l (fila 5: 1216,1 mg por planta) en comparación con la misma cantidad de riego limitado con agua sin TMAO en la fila 4 (1109,3 mg).
Ejemplo 11: TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la producción de plantas en maíz con riego con agua limitada. Se sembraron semillas de maíz “FAO700”, se cultivaron y se trataron de acuerdo con lo descrito. Los tratamientos de pulverización con TMAO 1 g/l aumentaron el número de hojas de color verde de las plantas, el contenido de clorofila total y la producción de granos.
Tabla 11. Número promedio de hojas verdes y análisis de ANOVA para las plantas de maíz tratadas con TMAO en aerosol o de semillas en condiciones de cultivo con a ua limitada.
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La Tabla 11 muestra que se puede aplicar TMAO en forma exógena por medio de aspersión antes de que se produzca el estrés hídrico, o por incubación de semillas, incrementando la producción de biomasa en las plantas monocotiledóneas, en condiciones de estrés hídrico limitado. En la fila 2 se muestra que el 30% de riego con agua reduce de forma significativa el número de hojas verdes en comparación con las plantas en la fila 1 con riego con agua normal. Sin embargo, como se muestra en las filas 3 y 4, el tratamiento de pulverización con 1 g/l de TMAO dihidrato cuando se aplica de forma exógena cada 4 semanas restaura en forma significativa el número de hojas verdes bajo riego con agua limitada con un aumento del 47% en la producción de biomasa, que se muestra en la producción de hojas verdes sobre las plantas no tratadas con un riego del 30%.
Ejemplo 12: El TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la producción de plantas en el maíz con riego con agua limitada. Se sembraron semillas de maíz “FAO700”, se cultivaron y se trataron de acuerdo con lo descrito anteriormente. Como se muestra en la Tabla 12, los tratamientos de pulverización con TMAO 1 g/l aumentaron el contenido total de clorofila en las plantas.
Tabla 12. Contenido de clorofila promedio y análisis de ANOVA para las plantas de maíz tratadas con TMAO en aerosol o de semillas en condiciones de cultivo con a ua limitada
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La Tabla 12 muestra que se puede aplicar TMAO de forma exógena por medio de aspersión antes de que se produzca el estrés hídrico, o por medio de incubación de semillas, para incrementar la producción de biomasa en las plantas monocotiledóneas, en condiciones de estrés hídrico limitado. En la fila 2 se muestra que el 30% de riego con agua disminuye de forma significativa el contenido total de clorofila en comparación con las plantas de la fila 1 con riego con agua normal. Sin embargo, de acuerdo con lo mostrado en las filas 3 y 4, el tratamiento de pulverización con 1 g/l de TMAO dihidrato cuando se aplica de forma exógena cada 4 semanas restaura en forma significativa el contenido de clorofila bajo riego con agua limitada, con un incremento en la producción de biomasa entre el 40% y el 72%, que se muestra en el contenido de clorofila por sobre las plantas no tratadas con un riego del 30%.
Ejemplo 13: El TMAO dihidrato aplicado en forma exógena aumenta la producción de las plantas en el maíz con riego con agua limitada. Se sembraron semillas de maíz “FAO700”, se cultivaron y se trataron como se describe. Los tratamientos de pulverización con TMAO 1 g/l aumentaron la producción de granos de la planta.
Tabla 13. Número promedio de granos por mazorca y análisis de ANOVA para las plantas de maíz tratadas con TMAO en aerosol o de semillas en condiciones de cultivo con a ua limitada.
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La Tabla 13 muestra que se puede aplicar TMAO de forma exógena por medio de aspersión antes de que se produzca el estrés hídrico, o por medio de incubación de semillas, para incrementar la producción de biomasa en las plantas monocotiledóneas, en condiciones de estrés hídrico limitado. En la fila 2 se muestra que el 30% de riego con agua disminuye de forma significativa el número total de granos por mazorca de maíz en comparación con las plantas de la fila 1 con riego con agua normal. Sin embargo, como se muestra en las filas 3 y 4, el tratamiento de pulverización con 1 g/l de TMAO dihidrato cuando se aplica de forma exógena cada 4 semanas restaura de forma significativa el número total de granos por mazorca de maíz con riego con agua limitada con un aumento en la producción de biomasa entre el 19% y el 27%, que se muestra en el contenido de clorofila en las plantas no tratadas con un riego del 30%. Es de destacar que la fila 4 en realidad muestra un aumento del 2% en el número total de granos por mazorca de maíz para las plantas de maíz con un 30% de riego con agua con un tratamiento de pulverización de 1 g/l de TMAO dihidrato en comparación con las plantas de maíz sin estrés hídrico o el 100% de riego.
Ejemplo 14: La aplicación exógena de TMAO dihidrato no tiene compensaciones en el puerro, la lechuga, el brócoli, el apio o el colinabo. La producción de raíces u hojas se determinó en las plantas tratadas con 1 g/l de TMAO dihidrato o agua de como se ha descrito anteriormente con el fin de evaluar los costos de compensación del tratamiento sin estrés hídrico. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa en la producción de rendimiento que en la mayoría de los casos era ligeramente mayor en las plantas tratadas con TMAO dihidrato. Tabla 14 Rendimiento de producción después de los tratamientos de pulverización con TMAO dihidrato cada 4 semanas durante 3 meses
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La Tabla 14 muestra que se puede aplicar TMAO en forma exógena durante tres meses sin un costo de adaptabilidad. En la fila 1 el peso de producción total de las plantas de puerro tratadas con TMAO dihidrato produjo el 102% en comparación con los controles tratados con agua, en la fila 2 el peso de producción total de las plantas de lechuga tratadas con TMAO dihidrato produjo el 112% en comparación con los controles, en la fila 3 el peso de producción total de plantas de brócoli tratadas con TMAO dihidrato produjo un 120% en comparación con los controles, mientras que en la fila 4 el peso de producción total de las plantas de apio tratadas con TMAO dihidrato produjo lo mismo que los controles tratados con agua, y finalmente en la fila 5 plantas colinabo produjeron el 103% en comparación con los controles tratados con agua.
Ejemplo 15: El TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la producción de plantas en el brócoli en riego con agua limitada. Se sembraron semillas de brócoli 'Parthenon', se cultivaron y se trataron como se describe. Los tratamientos de pulverización y riego con 1 g/l de TMAO aumentaron la producción de las plantas.
Tabla 15. Producción de inflorescencia promedio y análisis de ANOVA para plantas de brócoli tratadas con TMAO en aerosol en condiciones de cultivo con a ua limitada.
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La Tabla 15 muestra que se puede aplicar TMAO de forma exógena por medio de aspersión antes de que se produzca el estrés hídrico para incrementar la producción en la familia Brassicaceae, en condiciones de estrés hídrico limitado. En la fila 2 se muestra que el 30% de riego con agua disminuye de forma significativa la producción de plantas (80,5 g/planta) en comparación con las plantas de la fila 1 con riego con agua normal (202,8 g/planta). Sin embargo, como se muestra en las filas 3 y 4, el tratamiento de pulverización o riego con 1 g/l de TMAO dihidrato aplicado de forma exógena cada 4 semanas restaura parcialmente la producción de las plantas, con un aumento de la producción de inflorescencia del 8% o el 6%, respectivamente, incluso con riego con agua limitada (87,3 g/planta y 85,2 g/planta) sobre las plantas no tratadas con riego del 30%.
Ejemplo 16: El TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la producción de plantas en la cebada cultivada en el campo y sin riego. Se sembraron semillas de cebada “Hispanic”, se cultivaron y se trataron como se describe. Ambos tratamientos, el de semilla (1 g/l/kg de TMAO) y una combinación de semilla y de pulverización con 1 g/l de TMAO aumentaron la producción de granos de la planta.
Tabla 16. Producción de semillas promedio en gramos por metro cuadrado análisis de ANOVA para las plantas de cebada tratadas con TMAO en la semilla o en semilla y pulverización cultivadas en el campo y sin riego externo y con 200 l/m2 de a ua de lluvia en total a lo lar o de la tem orada.
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La Tabla 16 muestra que se puede aplicar TMAO de forma exógena por medio de aspersión antes de que se produzca el estrés hídrico, o por medio de incubación de semillas, para incrementar la producción de semillas en las plantas de cereales cultivadas en el campo abierto y sin riego adicional. En la fila 2 se muestra que el tratamiento de semillas con 1 g de TMAO por cada 1 kg de semillas aumenta de forma significativa hasta un 18% el rendimiento en comparación con las plantas de la fila 1 sin tratamiento. Además, como se muestra en la fila 4, un tratamiento de pulverización adicional con 1 g/l de TMAO dihidrato aplicado de forma exógena cada 4 semanas aumenta en forma significativa el rendimiento total por metro cuadrado hasta un 35% en comparación con el control no tratado.
Ejemplo 17: El TMAO dihidrato aplicado de forma exógena aumenta la producción de plantas en girasol cultivado en el campo sin riego externo. Se sembraron semillas de girasol “Sambra”, se cultivaron y se trataron como se describe. El tratamiento de semillas (1 g/l/kg de TMAO) aumentó el contenido de clorofila de las plantas y la producción de semillas.
Tabla 16. Efectos del tratamiento de semillas con TMAO sobre la adaptabillidad en girasol en condiciones de estrés naturales. La tabla muestra el contenido de clorofila, el peso de las semillas y los valores de P para la prueba de ANOVA. Tanto las diferencias de peso como de clorofila entre los grupos control y TMAO son estadísticamente significativas. Los valores del contenido relativo de clorofila se obtienen por absorbancia óptica en dos bandas de fr n i if r n nm l r fil 1nm i Infr -R
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La Tabla 17 muestra que se puede aplicar TMAO de forma exógena por medio de un tratamiento de semillas antes de que se produzca el estrés hídrico, para incrementar la producción de semillas en las plantas oleaginosas de cultivo tales como girasol cultivadas en campo abierto y sin riego adicional. En la columna 5 se muestra que el tratamiento de semillas con 1 g de TMAO por cada 1 kg de semillas aumenta en forma significativa hasta un 30% el contenido de clorofila y el rendimiento hasta un 77% en comparación con plantas control sin tratamiento.
Ejemplo 18: DDAO aplicado de forma exógena aumenta la supervivencia de las plantas en pimiento en condiciones de sequía extrema. Se sembraron semillas de pimiento “Murano”, se cultivaron y se trataron como se describe anteriormente. DDAO 0,5 g/l aplicado como tratamiento de semillas, riego o pulverización mejoraró la tasa de supervivencia en comparación con los controles no tratados. DDAO 0,5 g/l pulverizado fue el mejor tratamiento, con un 83,3% de supervivencia de las plantas.
Tabla 18. Tasa promedio de supervivencia y análisis de ANOVA para plantas de pimiento tratadas con DDAO en condiciones de cultivo con se uía.
Figure imgf000047_0001
La Tabla 18 muestra que el DDAO se puede aplicar de forma exógena por medio de semillas y/o pulverización y/o riego antes de que se produzca el estrés hídrico, para incrementar la tasa de supervivencia de las plantas en condiciones extremas de estrés hídrico en una especie cultivo vegetal. En las filas 1 y 2, se comparan los tratamientos de semillas y el tratamiento con DDAO aumenta la supervivencia del 22,9% al 76,1%. La tasa de supervivencia después de la sequía también aumenta en forma significativa al 35,4% cuando se aplica DDAO en el riego como se muestra en la fila 6, mientras que la supervivencia más baja fue en la fila 5 del control de riego sin DDAO (8,3%). Los mejores resultados se obtienen cuando las plantas se riegan con DDAO a 0,5 g/l (fila 4).
Ejemplo comparativo 19:
Según lo mostrado en la Tabla 19 y la Tabla 20 a continuación, la sobreexpresión de FMO GS-OX5 para incrementar la producción endógena de TMAO dihidrato no tiene compensaciones en Arabidopsis. La biomasa de las plantas y el rendimiento de semillas se determinó en semillas transgénicas (genotipos X3 y X8) y de tipo salvaje (Col-0) de Arabidopsis thaliana que se sembraron, se cultivaron y se trataron como se describe anteriormente con el fin de evaluar los costos de compensación del aumento de la producción endógena de TMAO sin estrés hídrico. Sin embargo, como se muestra en la Tablas 19 y 20, no se observó ninguna diferencia significativa en la biomasa de las plantas o el peso de las semillas o el rendimiento. El peso vegetativo medio incrementó con el número de copias de la FMO GS-OX5, fue mayor de forma significativa cuando estaban presentes 8 copias del gen en comparación con el genotipo de 3 copias. El peso promedio de las semillas aumentó con el número de copias de FMO GS-OX5, que fue mayor cuando estaban presentes 8 copias del gen en comparación con el genotipo de 3 copias.
Tabla 19. Se evaluó la biomasa de las plantas como el valor de peso promedio (en gramos) ± E.E. para tres grupos diferentes de plantas cultivadas sin condiciones de estrés: plantas de tipo salvaje (Col-0) y transgénicas (X3 y X8) de Arabidopsis thaliana.
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Tabla 20. El peso o el rendimiento de las semillas de las plantas se evaluó como el valor de peso promedio (en mg) ± E.E. para tres grupos diferentes de semillas y silicuas de las plantas Arabidopsis cultivadas sin condiciones de estrés: plan i l l- r n ni Ar i i h li n
Figure imgf000047_0003
Ejemplo comparativo 20:
Como se muestra en la Tabla 21 a continuación, la sobreexpresión de FMO GS-OX5 aumenta la supervivencia de plantas en Arabidopsis con riego de agua limitada: las plantas control (de seis semanas) se regaron con 40 ml de agua dos veces a la semana, mientras que las plantas tratadas con " riego con agua limitada" se regaron con 30 ml de agua una vez por semana. Se sembraron semillas transgénicas (genotipos X3 y X8) y de tipo salvaje (Col-0) de Arabidopsis thaliana, se cultivaron y se trataron como se describe. El valor de adaptabilidad aumentó con el número de copias de FMO GS-OX5, que era mayor cuando estaban presentes 8 copias del gen en comparación con el genotipo de 3 copias. Los valores de adaptabilidad se asignaron usando los siguientes criterios: 0: Planta muerta; 1: síntomas de planta críticamente dañada; 2: síntomas de planta moderadamente dañada; 3: síntomas de planta ligeramente dañada; 4: planta sana. Como se muestra en la Tabla 20, las plantas transgénicas tuvieron un valor de adaptabilidad mayor de forma significativa que las plantas no transgénicas.
Tabla 21 Valor promedio de desempeño ± E.E. para tres genotipos diferentes cultivados con riego con agua limitada: pl n i l l- r n ni X X Ar i i h li n
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Ejemplo comparativo 21
La sobreexpresión de FMO GS-OX5 aumenta la supervivencia de las plantas en Arabidopsis en condiciones de sequía: las plantas control (de seis semanas) se regaron con 40 ml de agua dos veces a la semana; mientras que las plantas tratadas por "sequía" no se regaron hasta que estaban marchitas todas las plantas. (El TMAO dihidrato aplicado en forma exógena es capaz de recuperar la supervivencia de las plantas en plantas estresadas por sequía de tipo salvaje. Se sembraron semillas transgénicas (genotipos FMOX3 y FMOX8) y de tipo salvaje (Col-0) de Arabidopsis thaliana, se cultivaron y se trataron como se ha descrito. Después del primer ciclo de marchitamiento las plantas de tipo salvaje se pulverizaron con 1 g/l de TMAO dihidrato para determinar si las plantas de tipo salvaje marchitas se podían recuperar y desarrollar, así como también las plantas transgénicas en los siguientes ciclos de marchitamiento con la aplicación exógena. Los valores de adaptabilidad se asignaron usando los siguientes criterios: 0: Planta muerta; 1: síntomas de planta críticamente dañada; 2: síntomas de planta moderadamente dañada; 3: síntomas de planta ligeramente dañada; 4: planta sana. Como se muestra en la Tabla 21, las plantas transgénicas tratadas con TMAO tuvieron un valor de adaptabilidad significativamente mayor que las plantas no transgénicas tratadas con TMAO.
Tabla 22 Valor promedio de desempeño ± E.E. para tres genotipos diferentes cultivados en condiciones de sequía: pl n i l l- r n ni X X Ar i i h li n
Figure imgf000048_0002
Si bien anteriormente se ha discutido un número de aspectos y realizaciones representativas, los expertos en la materia reconocerán ciertas modificaciones, permutaciones, adiciones y subcombinaciones de las mismas. Por lo tanto, se pretende que las siguientes reivindicaciones adjuntas y las reivindicaciones introducidas en adelante se interpreten para incluir todas dichas modificaciones, permutaciones, adiciones, y subcombinaciones.
La discusión anterior de la divulgación se ha presentado con fines de ilustración y descripción. Lo anterior no pretende limitar la divulgación a la forma o formas divulgadas en la presente memoria. En la Descripción Detallada anterior, por ejemplo, diversas características de la divulgación se agrupan en una o más realizaciones para el propósito de racionalizar la divulgación. Este método de divulgación no se debe interpretar como el reflejo de una intención de que la divulgación reivindicada requiere más características que las que se recitan en forma expresa en cada reivindicación. Más bien, como reflejan las siguientes reivindicaciones, los aspectos inventivos se encuentran en menos de todas las características de una sola realización anterior divulgada. De ese modo, las siguientes reivindicaciones se incorporan a esta Descripción Detallada, en donde cada reivindicación por sí misma es una realización preferida separada de la divulgación.
Como se utiliza en la presente memoria, "expresión génica" y "expresión" se han de entender como sinónimos y significan la realización de la información que está almacenada en una molécula de ácido nucleico. Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan aquí de manera intercambiable.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir una planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía que comprende:
aplicar al menos un tratamiento de una cantidad efectiva de N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina dihidrato, o N-óxido de N,N-dimetildecilamina (DDAO) a una planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla, en donde la cantidad eficaz del TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es desde 0,1 a 10 g por litro de rociado o riego, o en donde el al menos un tratamiento es un tratamiento de semilla y la cantidad eficaz del TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es desde 0,1 g a 1000 g por 100 kg de semilla; y
cultivar dicha planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla, en donde se produce una planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía
2. El método de la reivindicación 1, y que además comprende:
aplicar al menos un segundo tratamiento de una cantidad eficaz de TMAO, TMAO dihidrato o DDAO a dicha planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía, previamente tratada con TMAO, TMAO dihidrato o DDAO.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho al menos un tratamiento de dicha cantidad eficaz de TMAO, TMAO dihidrato o DDAO es un tratamiento de riego o un tratamiento de rociado.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho al menos un tratamiento de dicha cantidad eficaz de TMAO, TMAO dihidrato o DDAO comprende dos o más compuestos diferentes seleccionados del grupo que consiste en TMAO, TMAO dihidrato, y DDAO.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía tiene una producción de biomasa, fruta o semilla que es entre el 6% y el 30% o entre el 31% y el 50% más que la producción de biomasa, fruta o semilla de plantas u organismos fotosintéticos estresados por sequía donde una cantidad efectiva de TMAO, TMAO dihidrato o DDAO no se ha aplicado a la planta u organismo fotosintético con estrés hídrico no tolerante.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende aplicar sales o cualquier otro aditivo a dicha planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla y cultivar dicha planta, parte de planta, organismo fotosintético o semilla en donde se produce una planta u organismo fotosintético tolerante a la sequía.
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