ES2347399B1

ES2347399B1 - Planta transgenica rc15 resistente al frio y estres salino productorade tmao, elementos necesarios para su obtencion y uso de composiciones que contienen tmao para inducir tolerancia al frio y estres salino.

Info

Publication number: ES2347399B1
Application number: ES200802652A
Authority: ES
Inventors: Rafael Catala Rodriguez; Rosa Lopez Cobollo; Julio Salinas Muñoz
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Priority date: 2008-09-18
Filing date: 2008-09-18
Publication date: 2011-09-15
Anticipated expiration: 2028-09-18
Also published as: WO2010034862A1; ES2347399A1

Abstract

Planta transgénica RC15 resistente al frío y estrés salino productora de TMAO, elementos necesarios para su obtención y uso de composiciones que contienen TMAO para inducir tolerancia al frío y estrés salino.

La presente invención describe una planta transgénica resistente al frío y al estrés salino basada en el uso de un nuevo gen, el gen RC15, codificante de una enzima monoxigenasa que induce la aparición de TMAO. Además la invención proporciona secuencia de nucleótidos, vectores y células necesarias para llevar a cabo el procedimiento para obtener dichas plantas transgénicas. Finalmente, se añade el uso de composiciones que contienen TMAO para la mejora de la tolerancia al estrés salino de las plantas afectadas mediante la aplicación exógena de dichas soluciones sobre la planta o semilla, por ejemplo pulverización o inyección.

Description

Planta transgénica RCI5 resistente al frío y estrés salino productora de TMAO, elementos necesarios para su obtención y uso de composiciones que contienen TMAO para inducir tolerancia al frío y estrés salino.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un método para aumentar la tolerancia al frío y al estrés salino de una planta alterando la expresión del gen RCI5. En particular, la presente invención proporciona una planta transgénica que tiene un mayor nivel de la proteína RCI5 en relación con una planta no transgénica, y el uso de composiciones que contienen TMAO para la mejora de la tolerancia al estrés salino de las plantas afectadas, mediante la aplicación de las soluciones que contengan dicho compuesto por cualquier vía que ponga en contacto la composición de la invención con cualquier parte de la planta y/o semillas.

Estado de la técnica

Las temperaturas de congelación constituyen uno de los principales factores ambientales que limitan el crecimiento, productividad y distribución geográfica de las plantas (Boyer, 1982). Muchas especies de climas templados han adquirido a lo largo de la evolución una respuesta adaptativa que les permite enfrentarse a las temperaturas de congelación. Por medio de esta respuesta, conocida como aclimatación al frío (Levitt, 1980), las plantas adquieren una tolerancia a las temperaturas de congelación después de un tiempo de exposición a temperaturas bajas no congelantes. La aclimatación a frío constituye un ejemplo representativo de la interacción de las plantas con su entorno y de como esta interacción ha condicionado la evolución de algunas especies. El esclarecimiento de los mecanismos moleculares que controlan este proceso adaptativo no es solo interesante desde el punto de vista básico, para entender como crecen y se desarrollan las plantas, sino que además tiene un gran potencial biotecnológico en la obtención de herramientas moleculares para mejorar la tolerancia a la congelación de cultivos muy importantes. Hay que resaltar que, diferentes trabajos han mostrado que la aclimatación a las temperaturas bajas también aumenta la tolerancia de las plantas a otros estreses abióticos como deshidratación y estrés salino. Por tanto, el estudio de la aclimatación a frío debería aportar información esencial de como las plantas responden de manera coordinada a diferentes condiciones ambientales adversas.

El proceso de aclimatación a frío es muy complejo y conlleva numerosos cambios a nivel bioquímico y fisiológico, incluyendo cambios en la membrana lipídica (Uemura et al., 1995), síntesis de nuevas proteínas (Kawamura y Uemura, 2003), incremento del contenido endógenos de ABA (Lang et al., 1994), y la acumulación de solutos compatibles (Wanner y Junttila, 1999). Cada vez hay mas pruebas que muestran que la mayoría de estos cambios son controlados a través de una extensa reprogramación de la expresión génica (Salinas 2002; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 2006; Welling y Palva, 2006). De hecho, estudios recientes usando la tecnología de microarrays han revelado que la expresión de cientos de genes cambia en respuesta a las temperaturas bajas, indicando que la aclimatación a frío esta mediada por múltiples rutas (Fowler y Thomashow, 2002; Kreps et al., 2002; Seki et al., 2002; Maruyama et al., 2004; Vogel et al., 2005; Lee et al., 2005; Oono et al., 2006; Matsui et al., 2008; Chawade et al., 2007). Muchos de estos genes también son regulados por deshidratación y salinidad (Matsui et al., 2008), confirmando a nivel molecular la estrecha relación existente en las repuestas de la planta a estos estreses abióticos. Como ejemplo de esto sirve un grupo de genes que contienen el motivo CCGAC en su promotor, que es la secuencia central del elemento de regulación en cis CRT/DRE (C-repeat/dehydration-responsive element) (Baker et al., 1994; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994). El motivo CCGAC es suficiente para mediar la respuesta de la expresión génica a frío, deshidratación y estrés salino (Baker et al., 1994; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994), e interacciona específicamente con la familia de factores transcripcionales denominados CBF/DREB (C-repeat Binding Factor/DRE Binding protein) (Stockinger et al., 1997; Liu et al., 1998). Tres genes correspondientes a miembros de esta familia (CBF1/DREB1B, CBF2/DREB1C, CBF3/DREB1A) son inducidos rápidamente por temperaturas bajas (Gilmour et al., 1998; Liu et al., 1998; Medina et al., 1999), mientras que la expresión de otros dos (DREB2A, DREB2B) responde principalmente a deshidratación y estrés salino (Liu et al., 1998).

Desafortunadamente, sin embargo, a pesar del gran número de genes que se han identificado cuya expresión es regulada por frío, las funciones celulares y metabólicas de la mayoría de los mismos, así como su implicación en la aclimatación a frío, son todavía desconocidos. El análisis de las secuencias de algunos de estos genes sugiere que deben estar implicados en la protección de la célula produciendo proteínas funcionales, mientras que otros genes codificarían proteínas con alguna función en la regulación de la expresión génica y en la transmisión de la señal (Fowler y Thomashow, 2002; Kreps et al., 2002; Seki et al., 2002; Maruyama et al., 2004; Vogel et al., 2005; Lee et al., 2005; Oono et al., 2006; Matsui et al., 2008; Chawade et al., 2008). Las proteínas funcionales incluyen enzimas para la producción de osmolitos compatibles, enzimas relacionadas con el quenching de especies reactivas de oxigeno (ROS), chaperonas que protegerían las proteínas y las membranas, y canales iónicos y de agua para el mantenimiento de la homeostasis iónica y del agua. Entre las proteínas reguladoras, además de los factores de transcripción, se encuentran proteínas de unión a RNA, de unión a calcio, proteínas kinasas y fosfatasas, encimas implicadas en el reciclaje de fosfoinositoles y otras moléculas señalizadoras (Matsui et al., 2008). La caracterización de la función de los genes regulados por frío y de su implicación en el proceso de aclimatación debería contribuir al entendimiento de los mecanismos que gobiernan este proceso adaptativo.

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Estreses abioticos ambientales, como las temperaturas de congelación y el estrés salino, se encuentran entre los problemas más importantes para una agricultura sostenible a nivel mundial. En los últimos años, se han realizado grandes esfuerzos para entender la respuesta a nivel molecular a estos estreses, lo cual a facilitado la identificación de genes implicados en la tolerancia a las temperaturas de congelación y al estrés salino (Hasegawa et al., 2000; Zhu et al., 2007). Sin embargo, aun se ha de aclarar como son percibidas las señales físicas y como son convertidas en señales bioquímicas.

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Descripción de la invención Descripción breve

Un aspecto de la invención lo constituye una planta transgénica tolerante al frío y al estrés salino, en adelante planta transgénica RCI5 de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos que permite la expresión de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

i.- la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; y

ii.- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a).

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Un aspecto particular de la presente invención lo constituye una planta transgénica de la presente invención en la que la secuencia de nucleótidos, que permite la expresión de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), es el gen RCI5 de SEQ ID NO: 1. Una realización particular de ésta es la planta transgénica de Arabidopsis RCI5-OE generada en la presente invención (ver Ejemplo 1.2 y Materiales y Métodos).

Otro aspecto de la invención lo constituye un procedimiento de obtención de la planta transgénica RCI5, en adelante procedimiento de obtención de una planta transgénica de la invención, que consiste en la introducción en una planta de una secuencia de nucleótidos constituida por:

i.- una secuencia de nucleótidos codificante de proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

- la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), y

ii.- una secuencia de nucleótidos promotora que permite y regula la expresión de la secuencia de i.- y la aparición de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la célula.

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Una realización particular de la presente invención lo constituye un procedimiento de obtención de plantas de la invención que comprende los siguientes pasos:

a) obtención de un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos del gen RCI5 SEQ ID NO: 1,

b) obtención de microorganismos portadores del vector a), y

c) transformación de las plantas con el vector de a) o con el microorganismo de b).

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Otro aspecto de la presente invención lo constituye una secuencia de nucleótidos, en adelante secuencia de la presente invención, que permite la expresión de una proteína con actividad monooxigenasa en las células de planta y que está constituida por una de las posibilidades siguientes:

a) una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo: la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), con o sin

b) una secuencia de nucleótidos promotora que permite y regula la expresión de la secuencia de a) y la aparición de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la célula.

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Otro aspecto particular de la presente invención lo constituye una secuencia de nucleótidos de la invención en la que la secuencia de nucleótidos codificante de una proteína con actividad monooxigenasa está constituida por la secuencia de nucleótidos RCI5 de SEQ ID NO: 1, un fragmento de la misma o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definidas anteriormente.

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Otro aspecto particular de la presente invención lo constituye una secuencia de nucleótidos de la invención en la que la secuencia de nucleótidos promotora es cualquier secuencia de nucleótidos promotora capaz de regular la expresión génica en plantas como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, un promotor fuerte constitutivo, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, o un promotor que se exprese en respuesta a distintos tipos de estrés abiótico, como por ejemplo el del gen RD29A (Kasuga et al, 1999).

La invención también se refiere a un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos RCI5 de la invención, en adelante vector de expresión de la presente invención, y que permite la transformación o transfección de microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas transgénicas de la invención. Como realizaciones particulares del vector de expresión de la invención se han generado los vectores GST::RCI5 (ver Ejemplo 1) y el vector 35S::RCI5 (ver ejemplo 2).

Otro aspecto de la invención lo constituye un microorganismo o célula, en adelante célula de la invención, que contiene la secuencia de nucleótidos RCI5 de la invención o el vector de expresión de la invención.

Otro aspecto más particular de la invención lo constituye una semilla de una planta que comprende una secuencia de nucleótidos, codificante de una proteína con actividad monooxigenasa, constituida por la secuencia de nucleótidos RCI5 de SEQ ID NO: 1, un fragmento de la misma o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definidas anteriormente.

Finalmente, otro aspecto de la presente invención es el uso de las secuencias de nucleótidos, vectores de expresión, células transformadas, y del procedimiento de la presente invención para la obtención de plantas transgénicas de interés comercial.

Además, otro aspecto de la invención se basa en el uso de una composición por ejemplo, acuosa, que comprende el compuesto óxido de trimetilamina (TMAO) o un derivado del mismo, en adelante uso de una composición de la invención, para inducir tolerancia al estrés salino y al frío en las plantas y/o semillas.

Otro aspecto particular de la presente invención se basa en el uso de una composición de la invención donde la composición acuosa comprende el compuesto TMAO en una concentración comprendida entre 1 \muM y 100 mM, preferentemente entre 50 \muM y 1 mM, y más preferentemente a 100 \muM.

Una realización particular de la presente invención lo constituye el uso de una composición de la invención en el que la concentración de TMAO es de 100 \muM.

La concentración de los componentes activos de las composiciones dependerá del tipo de planta, fase de desarrollo de la misma, así como de la frecuencia y forma de aplicación de las composiciones.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el uso de una composición de la invención para inducir tolerancia al estrés salino en las plantas mediante su aplicación a la parte aérea mediante pulverización.

Los principios fisiológicos del transporte de los compuestos absorbidos por las hojas mediante pulverización, son similares a los que ingresan en las plantas por la absorción vía radicular, sin embargo, el movimiento de los compuestos aplicados sobre las hojas no es el mismo en tiempo y forma que el que se realiza desde las raíces al resto de la planta. La absorción foliar es más efectiva cuando las condiciones de absorción desde el suelo son adversas como por ejemplo en caso de sequía, estrés salino, temperaturas extremas u otros estreses. Además, es mucho más fácil obtener una distribución uniforme, a diferencia de la aplicación de granulados o en mezclas físicas.

Otro aspecto particular de la presente invención lo constituye el uso de una composición de la invención para inducir tolerancia al estrés salino y al frió en las plantas mediante su aplicación al tallo por inyección.

Otro aspecto particular de la presente invención lo constituye el uso de una composición de la invención que se aplica al suelo u otro sustrato de cultivo, al agua de riego (o solución de cultivo) o por inmersión del sistema radicular de las plantas y/o de semillas.

La aplicación de las composiciones acuosas por medio de la inmersión de la parte radicular de la planta así como de semillas se realiza por un tiempo y con una concentración que depende del tipo de planta, estado de desarrollo así como de la frecuencia y forma de aplicación de las composiciones. En el caso de semillas que requieran un tratamiento especial de escarificación o eliminación de determinadas cubiertas para facilitar su germinación, el proceso de inmersión en las composiciones acuosas de la presente invención, se podrá realizar de forma más efectiva después de la eliminación de las cubiertas para facilitar la absorción de los compuestos activos. Asimismo, también se podrán sumergir las semillas en cualquier estadio de germinación.

Las formas de aplicación que se han citado hasta ahora no limitan otro tipo de aplicaciones de las composiciones que contienen TMAO a las plantas.

Los usos de una composición de TMAO descritos anteriormente pueden comprender además un aditivo seleccionado de entre fertilizantes orgánicos o inorgánicos, insecticidas, nematocidas, fungicidas, bactericidas o herbicidas. De esta manera, al aplicar las composiciones que contienen TMAO junto con aditivos, ya sea para aportar nutrientes o para tratar determinadas infecciones o plagas, se consigue no aumentar los costos de los tratamientos al hacerlo de forma coordinada.

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Descripción detallada

La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su tolerancia al estrés salino y al frío, así como a la necesidad de aportar nuevas composiciones para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés.

La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han aislado, identificado y caracterizado un nuevo gen que codifica una flavina monooxigenasa (FMO), en adelante RCI5 (SEQ ID NO: 1), es decir, un nuevo gen RCI, que es inducido por estrés salino y el frío. La sobreexpresión constitutiva de la proteína RCI5 (SEQ ID NO: 2 en Arabidopsis condujo a la expresión incrementada de diferentes genes inducibles por estrés, incluyendo el regulon CBF y genes codificantes de proteínas implicadas en la eliminación de especies reactivas de oxigeno, con lo que se provoca una mejora de la tolerancia a la congelación y al estrés salino.

En animales, la monooxigenasas (FMOs) están implicadas en la síntesis de óxido de trimetilamina (TMAO) que funciona como un importante osmoprotector (Yancey et al., 2004). Además, los datos presentados demuestran, por primera vez, que las plantas también contienen TMAO y proteína RCI5 endógenos involucrados en la biosíntesis de TMAO. De acuerdo con esto, los niveles de TMAO en Arabidopsis se incrementan cuando la proteína RCI5 es sobreexpresada en respuesta a las temperaturas bajas y al NaCl, la cual es capaz de oxidar el metabolito endógeno TMA a TMAO.

El gen RCI5 se identificó buscando nuevos genes en Arabidopsis implicados en la aclimatación al frío. Al igual que otros genes inducidos por frío, el gen RCI5 está sometido a una compleja regulación. Bajo condiciones controladas, durante estadios tempranas del desarrollo de Arabidopsis, su expresión es muy baja y se encuentra limitada al tejido vascular de todos los tejidos. En plantas adultas, sin embargo, RCI5 únicamente se expresa, y en niveles muy bajos, en las venas de las hojas. En respuesta a temperaturas bajas, los niveles de expresión de RCI5 se inducen de forma intensa, principalmente en la vasculatura de las hojas. Esta inducción no se ve afectada en mutantes deficientes en ABA ni en plantas que no expresan CBFs, indicando que la regulación de RCI5 por frío se lleva a cabo mediante vías de transducción de señales independientes de ABA y los CBFs. RCI5 es además inducido por el tratamiento con NaCl a través de una vía independiente de ABA. Los niveles de expresión inducidas por NaCl son idénticos al los causados por las temperaturas bajas. Es interesante el hecho de que el efecto del NaCl no es debido a su componente osmótico sino que es específico del iónico. La deshidratación, sin embargo, no tiene efecto alguno en la expresión de RCI5. El genoma de Arabidopsis contiene mas de 50 genes cuya expresión es regulada, al igual que RCI5, por las temperaturas bajas y por NaCl pero no por deshidratación (Fowler y Thomashow, 2002; Kreps et al., 2002; Seki et al., 2002; Maruyama et al., 2004; Vogel et al., 2005; Lee et al., 2005; Oono et al., 2006; Matsui et al., 2008), poniendo de manifiesto la existencia de una importante interacción entre las vías de señalización de frío y sal.

La sobreexpresión constitutiva de RCI5 incrementa de forma significativa la tolerancia a la congelación en Arabidopsis, antes y después de la aclimatización al frío, lo que sugiere fuertemente que RCI5 regula de forma positiva tanto la respuesta a la aclimatización al frío como la tolerancia a la congelación. Más aún, plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan la proteína RCI5 son significativamente más tolerantes a altas concentraciones de NaCl y LiCl que las plantas salvajes originales, demostrando que RCI5 actúa como un regulador positivo en la tolerancia al estrés salino en Arabidopsis. Por el contrario, la proteína RCI5 parece que no está implicado en la tolerancia de esta especie al estrés producido por la deshidratación y por el tratamiento con manitol. Por lo tanto, los resultados de la presente invención indican que RCI5 no juega un papel general en el desarrollo de tolerancia en plantas a estrés abiótico, sino que presenta una función más específica en la tolerancia al frío y al estrés salino, lo que se corresponde con el hecho que la expresión de la proteína RCI5 se induce como respuesta a bajas temperaturas, NaCl y LiCl, pero no por deshidratación ni por manitol.

Además, los datos de la presente invención demuestran que la proteína RCI5 regula positivamente la expresión génica inducida por estrés. De hecho, bajo condiciones control y/o de estrés (frío y estrés salino), las plantas RCI5-OE muestran niveles altos de transcritos correspondientes a diferentes genes inducibles por estrés, entre los que se encuentran los CBFs, KIN1, LTI78, COR15A, COR47, CAT2 y SOD2. Por contra, la expresión de RAB18 y RCI1A no esta alterada en las líneas RCI5-OE, evidenciando de nuevo que la proteína RCI5 no opera como un regulador positivo general de la expresión génica inducida por estrés. Por otro lado, es importante destacar que se ha descrito que la expresión de CBFs, KIN1, LTI78, COR15A, COR47, CAT2 y SOD2 es capaz de mejorar la supervivencia a estrés abiótico (Jaglo-Ottosen et al., 1998; Liu et al., 1998; Kasuga et al., 1999; Gilmour et al., 2000; Catala et al., 2003; Maruyama et al., 2004; Gilmour et al., 2004; Novillo et al., 2004; McKersie et al., 1996; Van Breusegem et al., 1998; Apel y Hirt, 2004). Por tanto, el incremento de la tolerancia a las temperaturas de congelación, antes y después de la aclimatación a frío, y al estrés salino mostrado por las plantas RCI5-OE debe ser atribuido a la alta expresión de estos genes.

El gen RCI5 codifica una proteína con actividad monooxygenasa como se evidencia por la caracterización de la proteína recombinante obtenida y el análisis de la oxidación de NADPH en extractos de las plantas transgénicas RCI5-OE. Sin embargo, esta proteína contiene todos los motivos típicos característicos de las enzimas FMO, incluyendo un punto de unión a FAD, un motivo identificativo de FMO, y un dominio de unión a NADPH (Cashman, 1994). Los motivos FMOs se han descrito en distintos organismos, desde bacterias a humanos, siendo los de origen eucariota los mejor caracterizados. Este motivo FMO se une al cofactor FAD y cataliza la oxigenación de metabolitos endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico, fósforo, azufre, o selenio a expensas de NADPH. En plantas, se ha descrito que las proteínas FMOs juegan un papel en la biosíntesis de auxinas en petunia y Arabidopsis (Zhao et al., 2001; Tobeña-Santamaria et al., 2002; Cheng et al., 2007). Además, en Arabidopsis, las FMOs son requeridas en la respuesta de defensa frente a patógenos (Bartsch et al., 2006; Koch et al., 2006; Mishina y Zeier, 2006) y se han implicado en la biosíntesis de glucosinolatos (Hansen et al., 2007). Los resultados descritos en esta invención indican claramente que estos dominios FMOs de la proteína de la invención RCI5 en plantas presentan una función en respuestas al estrés abiótico, principalmente en respuestas al estrés por frío o estrés salino. Finalmente, RCI5 presenta una propiedad funcional en las respuestas de la planta a patógenos aunque deberá ser investigado en un futuro.

Por último, la aplicación exógena del compuesto TMAO reproduce parcialmente los perfiles de expresión génica inducida por bajas temperaturas y estrés salino, así como los fenotipos originados por la sobreexpresión de RCI5 (ver Ejemplo 3), indicando que el TMAO es una nueva molécula señalizadora en plantas que media la tolerancia a frío y al estrés salino mediante la regulación positiva de la expresión de genes inducidos por estrés. Hay que señalar que los fenotipos de tolerancia inducidos por el TMAO son muy similares a los manifestados por las plantas transgénicas RCI5-OE, como cabria esperar de estar RCI5 implicado en la biosíntesis de TMAO.

En resumen, los resultados presentados en la presente invención son la primera evidencia de que las plantas también contienen el metabolito TMAO, cuya síntesis está inducida por la proteína RCI5 y que las plantas transgénicas RCI5-OE que contienen mayores niveles de RCI5 son mas tolerantes al frío y al estrés salino que las plantas silvestres; y que la aplicación exógena en plantas del compuesto TMAO las protege del frío y del estrés salino.

Por lo tanto, un aspecto de la invención lo constituye una planta transgénica tolerante al frío y al estrés salino, en adelante planta transgénica RCI5 de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos que permite la expresión de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

i.- la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; y

ii.- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a).

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En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID N01, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia.

En general, una secuencia de nucleótidos análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos identificada como la SEQ ID NO: 1. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de mejora de la tolerancia de plantas a salinidad y frío mediante ingeniería genética de plantas. La técnica ha sido desarrollada en la planta modelo Arabidopsis thaliana y puede ser aplicada a plantas de interés agronómico y comercial -entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, tabaco, judía, así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero, etc.)- mediante distintas técnicas de ingeniería genética conocidas por un experto en la materia. Ello es posible porque las secuencias de nucleótidos ortólogas u homologas de la secuencia descrita en la presente invención (SEQ ID NO: 1) están conservados en plantas de interés agronómico y existe tecnología adecuada para su aislamiento y uso en ingeniería genética de plantas.

Secuencias de nucleótidos homologas a la descrita en la presente invención (SEQ ID NO: 1) pueden encontrarse como formas homologas en otras especies de plantas superiores de interés comercial donde pueden estar de forma natural o en otro caso, también podrían estar como resultado de un proceso de transformación génica en el que el organismo transformado reproduzca dichas moléculas de ADN. Estas formas homologas de la invención pueden ser aisladas, mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier planta que las contengas y mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos, preparados gracias a la información de las secuencias de nucleótidos de dichas moléculas de ADN proporcionadas en esta invención, por cualquier experto en la materia.

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Así, otro aspecto de la invención lo constituye un procedimiento de obtención de la planta transgénica RCI5, en adelante procedimiento de obtención de una planta transgénica de la invención, que consiste en la introducción en una planta de una secuencia de nucleótidos constituida por:

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b) obtención de microorganismos portadores del vector a), y

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Las secuencias de nucleótidos, vectores de expresión y células o microorganismos transformados, desarrollados y necesarios para la puesta en práctica del procedimiento de obtención de las plantas transgénicas de la presente invención, así como su empleo para la producción de dichas plantas, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

Así, otro aspecto de la presente invención lo constituye una secuencia de nucleótidos, en adelante secuencia de la presente invención, que permite la expresión de una proteína con actividad monooxigenasa en las células de planta y que está constituida por una de las posibilidades siguientes:

b) una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo: la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), con o sin

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La secuencia de nucleótidos RCI5 de la invención puede ser utilizada, en general, en la generación de un vector de expresión que permite la expresión de estas proteínas en una amplia gama de células huésped.

Por lo tanto, la invención también se refiere a un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos RCI5 de la invención, en adelante vector de expresión de la presente invención, y que permite la transformación o transfección de microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas transgénicas de la invención. Como realizaciones particulares del vector de expresión de la invención se han generado los vectores GST::RCI5 (ver Ejemplo 1) y el vector 35S::RCI5 (ver ejemplo 2).

En general, el vector de expresión de la presente invención comprende, al menos, una secuencia de la invención y, al menos, un promotor que dirige la transcripción del gen de interés (en este caso se indica el cDNA del gen como secuencia de nucleótidos codificante representativa del propio gen) al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción del gen de interés y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión de plantas (Rothstein et al, 1987; Potrykus, I, 1991), virus ("Plant Virology Protocols" From Virus Isolation to Transgenic Resistance Edited by: Gary D. Foster University of Bristol, Bristol, UKPublished: 1998), que pueden contener, además, un origen bacteriano o de levadura de replicación para que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras, así como un marcador utilizable para seleccionar las células transfectadas diferente al gen o genes de interés. Para la transformación de las plantas se pueden utilizar diferentes métodos - vectores plasmidicos, liposomas, electroporación, microinyección, etc - descritos en diversos manuales (ver por ejemplo: (Plant Gene Transfer and Expression Protocols Jones, Heddwyn University of Hertfordshire, Hatfield, UK. Human Press Publishers). La elección del vector dependerá de la célula hospedadora y de la planta en la que se va a introducir posteriormente.

Otro aspecto más particular de la invención lo constituye una semilla de una planta que comprende una secuencia de nucleótidos, codificante de una proteína con actividad monooxigenasa, constituida por la secuencia de nucleótidos RCI5 de SEQ ID NO: 1, un fragmento de la misma o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definidas anteriormente.

Finalmente, otro objeto de la presente invención es el uso de las secuencias de nucleótidos, vectores de expresión, células transformadas, y del procedimiento de la presente invención para la obtención de plantas transgénicas de interés comercial.

Descripción de las figuras

Figura 1

RCI5 es regulado transcripcionalmente por frío y NaCl en hojas y flores por una vía independiente de ABA y los CBFs

En las hibridaciones de tipo Northern se utilizó la sonda de RCI5 y GUS. Cada carril contiene 20 \mug de RNA total. Como controles de tratamiento y carga se emplearon las sondas correspondientes a los genes KIN1 y 18S rRNA, respectivamente.

a) RNAs procedentes de plantas de 3 semanas crecidas a 20ºC (C), o expuestas adicionalmente a 4ºC los tiempos indicados.

b) RNAs procedentes de raíces, hojas, tallos, flores y silicuas de plantas de 8 semanas crecidas a 20ºC (C), o expuestas 1 día adicional a 4ºC.

c) RNAs procedentes de plantas Ler, aba1-1, Col, cbf2, CBF1-AS3 de 3 semanas crecidas a 20ºC (C), expuestas 1 día adicional a 4ºC (4ºC), o tratadas con NaCl 250 mM recogiendo el material un día mas tarde (NaCl).

d) RNAs procedentes de plantas de 3 semanas crecidas a 20ºC (C), expuestas un día adicional a 4ºC (4ºC), regadas con NaCl 250 mM recogiendo el material 24 h después (NaCl), deshidratadas hasta perder el 50% de su peso fresco (D), regadas con LiCl 20 mM (LiCl) o manitol 500 mM (Manitol) recogiendo el material a las 24 h.

e) RNAs procedentes de plantas transgénicas RCI5::GUS de 3 semanas crecidas a 20ºC (C), expuestas 1 día adicional a 4ºC (4ºC) o regadas con NaCl 250 mM (NaCl) recogiendo el material a las 24 h.

f) Localización histoquímica de la actividad GUS en semillas, plántulas y distintos órganos de plantas transgénicas RCI5::GUS de 8 semanas crecidas a 20ºC (C), o expuestas un día adicional a 4ºC (4ºC). En la respuesta a deshidratación se obtuvo el mismo patrón de actividad GUS que las plantas control (C). En el caso de tratamiento con NaCl se obtuvo el mismo patrón que el mostrado en las plantas expuestas a 4ºC (4ºC).

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Figura 2

RCI5 tiene actividad monooxigenasa

a) Tinción con Coomassie de un gel SDS-PAGE al 12% conteniendo las distintas fracciones obtenidas al purificar RCI5. El primer carril incluye un extracto de bacterias conteniendo el vector de expresión de proteínas (pGEX), el segundo carril incluye un extracto de bacterias conteniendo el plásmido de expresión pGEX::RCI5 (pGEX-RCI5), el tercer carril incluye la proteína de fusión GST::RCI5 después de ser purificada por medio de una columna de glutation sepharosa 4B (GST-RCI5), y el ultimo carril contiene la proteína RCI5 purificada a partir de GST::RCI5 mediante digestión con trombina (RCI5). Cada carril contiene 20 \mug de proteína.

b) Medidas de actividad monooxigenasa de las fracciones proteicas que se muestran en el panel (a). La gráfica muestra los \mumoles de NADPH consumidos por hora a 24ºC. En todos los casos, los experimentos se realizaron con 100 ug de proteína. Los datos corresponden a medias \pmSE de tres experimentos independientes.

c) Niveles de mRNAs de RCI5 en plantas transgénicas 35S::RCI5. Las hibridaciones de tipo Northern fueron realizadas con RNA total (20 \mug) aislado de plantas de Arabidopsis de 3 semanas y cuatro líneas transgénicas independientes (1T-4T) conteniendo la fusión 35S::RCI5 (RCI5-OE) crecidas en condiciones control. Como control de carga se empleó la sondas correspondiente a al gen 18S rRNA.

d) La gráfica muestra el NADPH consumido por hora a 24ºC en plantas de Arabidopsis control (WT) y en las cuatro líneas transgénicas (1T-4T) que contienen la fusión 35S::RCI5 (RCI5-OE) crecidas en condiciones control.

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Figura 3

Las plantas 35S::RCI5 tienen mayor tolerancia a la congelación y al estrés salino que Col

a) Porcentaje de plantas Col y transgénicas 35S::RCI5 (linea 1T1) crecidas durante 2 semanas a 20ºC que sobreviven tras ser expuestas 6 h a distintas temperaturas de congelación. Los datos corresponden a medias \pmSE de tres experimentos independientes, con un número mínimo de 50 plantas de cada genotipo por experimento.

b) Porcentaje de plantas Col y transgénicas 35S::RCI5 (linea 1T1) crecidas durante 2 semanas a 20ºC y aclimatadas durante 7 días a 4ºC, que sobreviven tras ser expuestas 6 h a distintas temperaturas de congelación. Los datos corresponden a medias \pmSE de tres experimentos independientes, con un número mínimo de 50 plantas de cada genotipo por experimento.

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c) Plantas Col y transgénicas 35S::RCI5 (Línea 1T1) crecidas 2 semanas a 20ºC, después de ser congeladas a -6ºC durante 6 h.

d) Plantas Col y transgénicas 35S::RCI5 (Línea 1T1) crecidas 2 semanas a 20ºC y aclimatadas durante 7 días a 4ºC, después de ser congeladas a -8ºC durante 6 h.

e) Tolerancia a NaCl, LiCl y Manitol. Número de hojas verdes y porcentaje de peso fresco inicial en plantas Col y transgénicas 35S::RCI5 (línea 1T1) expuestas a concentraciones crecientes de NaCl (50 mM-200 mM), LiCl (5 mM-20 mM) o manitol (100 mM-400 mM), durante 2 días a cada concentración, respecto a los mismos parámetros en plantas Col a las que no se les ha aplicado el tratamiento. Los datos corresponden a medias \pmSE de tres experimentos independientes, con un número mínimo de 20 plantas de cada genotipo por experimento.

f) Plantas Col y transgénicas 35S::RCI5 (linea 1T1) después de ser expuestas a concentraciones crecientes de NaCl (50 mM-200 mM), LiCl (5 mM-20 mM) o manitol (100 mM-400 mM), durante 2 días a cada concentración.

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Figura 4

RCI5 está implicado en la biosíntesis de TMAO en Arabidopsis

Las gráficas muestran los \mumoles de TMAO por cada kg de peso fresco. Los datos corresponden a medias \pmSE de cinco experimentos independientes y en cada experimento se incluyeron un mínimo de 50 plantas.

a) Plantas Col crecidas a 20ºC durante 3 semanas y expuestas 1 día adicional a 4ºC, regadas con NaCl 250 mM recogiendo el material al cabo de 1 día, o deshidratadas hasta perder el 50% de su peso fresco.

b) Plantas Col y transgénicas 35S::RCI5 crecidas a 20ºC durante 3 semanas.

c) Plantas col y transgénicas 35S::RCI5 crecidas a 20ºC durante 3 semanas y expuestas 1 día a 4ºC o regadas con NaCl 250 mM recogiendo el material al cabo de un día.

d) \mumoles de TMAO obtenidos mediante una reacción in vitro usando diferentes concentraciones (50, 100 y 200 \muM) de RCI5 purificado de E. coli.

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Figura 5

El TMAO media la respuesta de la expresión génica a las temperaturas bajas

Hibridaciones de tipo Northern utilizando sondas específicas para (a y c) KIN1, LTI78, COR15A, COR47, RAB18, RCI1A, CAT2, SOD2 y RCI5 (esta último solo en c); (b y d) CBF1, CBF2 y CBF3 y GUS. Cada carril contiene 20 \mug de RNA total. En todos los casos se usaron sondas específicas para cada gen. Como control de la carga se empleó la sonda correspondiente a 18S rRNA.

a) Hibridaciones tipo Northern con las sondas anteriormente mencionadas de muestras procedentes de plantas Col (WT) y transgénicas 35::RCI5 (RCI5-OE) crecidas durante 3 semanas a 20ºC (C), expuestas 1 día adicional a 4ºC o tratadas con NaCl 250 mM recogiendo el material al cabo de 1 día.

b) Hibridaciones tipo Northern con las sondas anteriormente mencionadas de muestras procedentes de plantas Col (WT) y transgénicas 35::RCI5 (RCI5-OE) crecidas durante 3 semanas a 20ºC (C), expuestas 3 horas adicionales a 4ºC o tratadas con NaCl 250 mM recogiendo el material al cabo de 3 horas.

c) Hibridaciones tipo Northern con las sondas anteriormente mencionadas de muestras procedentes de plantas Col crecidas durante 3 semanas a 20ºC (C), tratadas con TMAO 100 \muM (TMAO), expuestas a 4ºC o tratadas con NaCl 250 mM recogiendo el material al cabo de 1 día.

d) Hibridaciones tipo Northern con las sondas anteriormente mencionadas de muestras procedentes de plantas Col crecidas durante 3 semanas a 20ºC (C), tratadas con TMAO 100 \muM (TMAO), expuestas a 4ºC o tratadas con NaCl 250 mM recogiendo el material al cabo de 3 horas.

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Figura 6

El TMAO aumenta la tolerancia a la congelación y al estrés salino

a) Porcentaje de plantas Col crecidas a 20ºC (C) y tratadas con TMAO 100 \muM 3 días antes de la congelación (TMAO), no aclimatadas (NA) y aclimatadas 7 días a 4ºC (A), que sobreviven tras ser expuestas 6 horas a -6ºC o -8ºC, respectivamente. Los datos corresponden a medias \pmSE de tres experimentos independientes, con un número mínimo de 50 plantas de cada genotipo por experimento.

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b) Porcentaje de número de hojas verdes en plantas Col crecidas en MS (C) y Col crecidas en MS suplementado con TMAO 100 \muM (TMAO), expuestas posteriormente a concentraciones crecientes de NaCl (50 mM-200 mM), LiCl (5 mM-20 mM) o manitol (100 mM-400 mM) durante 2 días a cada concentración, respecto al número de hojas verdes en plantas Col a las que no se les ha aplicado el tratamiento. Los datos corresponden a medias \pmSE de tres experimentos independientes, con un número mínimo de 20 plantas de cada genotipo por experimento.

c) Plantas Col crecidas a 20ºC (C) y tratadas con TMAO 100 \muM 3 días antes de la congelación (TMAO), no aclimatadas (NA) y aclimatadas 7 días a 4ºC (A), que sobreviven tras ser expuestas 6 horas a -6ºC o -8ºC, respectivamente.

d) Plantas Col crecidas en MS (C) o en MS suplementado TMAO 100 \muM (TMAO) después de ser expuestas a concentraciones crecientes de NaCl (50 mM-200 mM), LiCl (5 mM-20 mM) o manitol (100 mM-400 mM) durante 2 días a cada concentración.

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Figura 7

Organización genómica de RCI5

a) Mapa de restricción del fragmento de DNA genómico que contiene el gen RCI5. Se indican los sitios de corte de las enzimas de restricción EcoRI (E), XbaI (X) y HindIII (H). ATG indica el inicio de la traducción de RCI5 y los rectángulos grises sus regiones codificantes. La línea de puntos marca la región utilizada como sonda.

b) Hibridación de tipo Southern con 5 \mug de DNA genómico de Arabidopsis digerido con EcoRI (E), XbaI (X) y HindIII (H), utilizando la sonda de RCI5. A la derecha se indican los tamaños (en kpb) de las bandas obtenidas.

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Figura 8

Medidas de TMAO en plantas de Arabidopsis expuestas a frío o estrés salino

Gráficas representativas que muestran \mumoles de TMAO por Kg de peso fresco de plantas de Col de tres semanas crecidas a 20ºC y expuestas a 4ºC durante diferentes tiempos (0, 6, 12, 24, 48 y 72 horas) (a) o expuestas a diferentes concentraciones de NaCl (50, 100, 150, 200, 250 y 300 mM) durante 1 día (b).

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Figura 9

Medidas de TMAO en plantas tratadas con TMAO

Gráficas representativas que muestran \mumoles de TMAO por Kg de peso fresco de plantas de Col de tres semanas crecidas a 20ºC y tratadas con diferentes concentraciones de TMAO durante 1 día (0, 10, 50, 100 y 200 \muM) (a) o tratadas con 100 \muM TMAO durante diferentes tiempos (0, 6, 12, 24, 48, y 76 horas).

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Ejemplos de la invención Ejemplo 1 Aislamiento e identificación de gen y de la proteína de la invención RCI5 1.1.- Identificación de un cDNA codificante de la proteína RCI5 inducido en respuesta a bajas temperaturas y a estrés salino

RCI5 (At1g12140) fue aislado mediante el rastreo de una biblioteca de cDNAs preparada a partir de plántulas etioladas de Arabidopsis aclimatadas a frío (4ºC, durante 3 días) con una sonda substractiva enriquecida en transcritos inducidos por frío. La comparación de este cDNA (SEQ ID NO: 1), denominado RCI5, con otras secuencias genómicas reveló que el gen RCI5 contiene 5 exones y 4 intrones (SEQ ID NO: 3). El análisis de la expresión de este gen en plántulas etioladas de Arabidopsis mediante hibridaciones de tipo Northern con una sonda especifica confirmó que, de hecho, su expresión se induce en respuesta a temperaturas bajas (Fig. 1a). Los transcritos de RCI5 se acumulan de manera transitoria durante la exposición a 4ºC, alcanzando el nivel máximo a las 12 h del comienzo del tratamiento. En plántulas crecidas en condiciones control, los niveles de transcritos de RCI5 son muy bajos (Fig. 1a). La especificidad de la sonda fue determinada por hibridaciones de tipo Southern (Fig. 7b). Cuando se estudió la expresión de RCI5 en plantas adultas (Fig. 1b), la inducción por frío se detectó principalmente en hojas aunque se observó una pequeña inducción en flores. La acumulación de mensajeros RCI5 no experimentaba cambios aparentes ni en raíces, ni en tallos ni en silicuas expuestas a frío (Fig. 1b). En condiciones no estresantes, se detectaron niveles muy bajos de transcritos RCI5 en todos los órganos, excepto en silicuas (Fig. 1b). La inducción de RCI5 en respuesta a las temperaturas bajas no se veía afectada en aba1-1, un mutante deficiente en ABA (Koornneef et al., 1982), cbf2-1, un mutante nulo para el gen CBF2 (Novillo et al. 2004), y CBF1-AS3, una línea transgénica de Arabidopsis que no presenta inducción por frío de CBF1 o CBF3 (Novillo et al., 2007) (Fig. 1c), sugiriendo fuertemente que RCI5 es regulado por las temperaturas bajas a través de una vía de señalizaron independiente de ABA y de los CBFs.

Ya que, como se ha mencionado anteriormente, muchos genes inducibles por frío responden también a otros estreses abióticos, se examinó el efecto de la deshidratación y del estrés salino en la expresión de RCI5. Únicamente se observó acumulación de mRNAs de RCI5 después del tratamiento con NaCl (Fig. 1d). Para determinar si esta acumulación era causada por el componente iónico u osmótico del tratamiento con NaCl, se estudió la expresión de RCI5 en plantas de Arabidopsis expuestas a LiCl, ya que Li^{+} es un catión tóxico muy relacionado con el ión Na^{+}, y manitol, que mimetiza el estrés osmótico sin la toxicidad del estrés iónico. Los resultados obtenidos revelaron que RCI5 se inducía por LiCl pero no por manitol (Fig. 1d), indicando que el componente iónico era el responsable de la acumulación de transcritos de RCI5 en respuesta a estrés salino. Como en el caso de las temperaturas bajas, la inducción de RCI5 en respuesta a NaCl parece estar mediada a través de una vía independiente de ABA (Fig. 1c). KIN1 fue usado como control positivo de todos los experimentos.

La expresión de RCI5 a nivel tisular durante el desarrollo de la planta y en respuesta a diferentes tratamientos fue estudiada mediante el análisis de plantas de Arabidopsis que contienen una fusión de un fragmento de 782 pb del promotor de RCI5 (de -770 a +12 desde el ATG) al gen reportador uidA (GUS). Se examinaron cinco líneas transgénicas independientes que contenían una única copia en homocigosis del transgén. En todos los casos, la acumulación de mRNAs de GUS en hojas expuestas a 4ºC o NaCl presentaban un patrón muy similar al observado para los transcritos endógenos de RCI5 (Fig. 1e). Estos resultados sugieren que el fragmento de promotor aislado contenía los elementos de regulación en cis implicados en la inducción de RCI5 en respuesta a las temperaturas bajas y a estrés salino, y que esta inducción está regulada a nivel transcripcional. El análisis histoquímico de la actividad GUS no mostró tinción en las semillas transgénicas (Fig. 1f). Bajo condiciones no estresantes sólo se pudieron detector niveles muy bajos de tinción GUS durante la germinación y en los primeros estadios del desarrollo en los haces vasculares de raíces, hipocotilos, cotiledones y hojas (Fig. 1f). En plantas desarrolladas completamente, la tinción GUS fue ligeramente apreciable en las venas de las hojas (Fig. 1f). Cuando se expusieron plantas transgénicas en germinación a temperaturas bajas o NaCl, la tinción GUS fue como en plantas no estresadas pero significativamente más fuerte (Fig. 1f). Las plantas transgénicas adultas únicamente mostraban niveles altos de actividad GUS en el tejido vascular, aunque se podía observar una ligera tinción en las flores (base y venas de los sépalos) y en las silicuas (zona de abscisión) (Fig. 1f). En las líneas transgénicas sometidas a deshidratación, el patrón de actividad GUS era, en todos los casos, como el obtenido en condiciones control (Fig. 1f). En conjunto, todos estos datos demuestran que la expresión de RCI5 se encuentra regulada durante el desarrollo de Arabidopsis y se induce en respuesta a frío y estrés salino, principalmente en el tejido vascular de las hojas.

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1.2.- El gen RCI5 codifica para una proteína con actividad monooxigenasa de tipo flavina

La secuencia del cDNA RCI5 (SEQ ID NO: 1) codifica para un polipéptido de 459 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), con un peso molecular estimado de 52 kDa y un pl de 6.1. Búsquedas en bases de datos reveló que dicho polipéptido o proteína RCI5 contiene los típicos motivos de una enzima flavina monooxigenasa (FMO) (Cashman, 1994). De hecho, RCI5 posee un sitio altamente conservado de unión a FAD, un domino de identificación de FMO y un dominio de unión a NADPH que son característicos de las enzimas FMO.

Esta proteína RCI5 es una enzima con actividad FMO que fue analizada en primer lugar investigando su capacidad para oxidar NADPH, tras haber sido expresada y purificada en Escherechia coli (Fig. 2a). Los resultados mostraron que, de hecho, RCI5 tiene actividad monooxigenasa. La proteína de fusión GST::RCI5 purificada y, sobre todo, la misma proteína RCI5 exhibió una mayor capacidad para oxidar NADPH (2 y 8 veces, respectivamente) que los extractos de E. coli conteniendo el plásmido vacío o con el cDNA de RCI5 (fig. 2b). Posteriormente, se analizó la actividad monooxigenasa de RCI5 in vivo utilizando plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan de forma constitutiva la proteína RCI5 (plantas transgénicas RCI5-OE). Para determinar la actividad monooxigenasa se seleccionaron cuatro líneas independientes, homocigotas para una copia única del transgén y que mostraban niveles altos de expresión de RCI5 en condiciones control (Fig. 2c). Las plantas sobreexpresoras de RCI5 crecieron y se desarrollaron de manera idéntica a las plantas silvestres en condiciones normales de crecimiento. En todos los casos, extractos de estas líneas transgénicas RCI5-OE presentaron una capacidad para oxidar NADPH significativamente mayor que los extractos de plantas silvestres (Fig. 2d). Así, se concluye que la proteína RCI5 es una enzima con actividad FMO.

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Ejemplo 2 Las plantas transgénicas RCI5 de la invención presentan una mayor tolerancia al frío y al estrés salino la cual está mediatizada por mayores niveles de TMAO producidos por la proteína RCI5 2.1.- La sobreexpresión de la proteína RCI5 incrementa la tolerancia de las plantas, Arabidopsis, al estrés por frío y al salino

La tolerancia a la congelación de plantas transgénicas RCI5-OE y silvestres de dos semanas, antes y después de aclimatarlas al frío (4ºC, 7d), fue cuantificada como el porcentaje de plantas supervivientes después de haber sido expuestas 6 h a diferentes temperaturas de congelación. La deshidratación fue inducida manteniendo plántulas transgénicas y silvestres de 10 días en un papel de filtro durante 2 días. La tolerancia a este estrés fue cuantificada como el porcentaje de peso freso inicial (FW) remanente tras el tratamiento. Por último, la tolerancia al estrés salino fue estimada determinando el peso fresco y el número de hojas de plantas transgénicas RCI5-OE y silvestres de 10 días cultivadas durante 8 días en medios con concentraciones crecientes de NaCl (de 50 a 200 mM). La sobreexpresión de RCI5 incrementó significativamente la tolerancia de Arabidopsis a la congelación tanto de plantas no aclimatadas como aclimatadas 7 días a 4ºC, siendo este incremento muy similar en ambos casos. Como todas las líneas transgénicas RCI5-OE mostraron fenotipos de tolerancia similares, únicamente se presentan los resultados de la línea 1T (Figs. 3a, b). Los valores de LT_{50} (temperatura que causa un 50% de mortalidad) de plantas no aclimatadas silvestres y transgénicas RCI5-OE estimados fueron -5,4 y -6,5ºC, respectivamente (Fig. 3a). Los valores de LT50 de plantas silvestres y RCI5-OE aclimatadas a frío fueron -7,5 y -8,7ºC, respectivamente (Fig. 3b). El incremento en la tolerancia de las líneas RCI5-OE, antes y después de la aclimatación, era muy evidente a nivel fenotípico (Figs. 3c, d). No se observó ninguna diferencia entre las plantas silvestres y RCI5-OE cuando se analizó la tolerancia a la deshidratación (datos no mostrados). Sin embargo, todas las líneas sobreexpresoras de RCI5 presentaron una mayor tolerancia al estrés salino que las plantas silvestres. Los fenotipos de tolerancia mostrados por las diferentes líneas RCI5-OE eran casi indistinguibles por lo que solamente se presentan los resultados correspondientes a la línea 1T (Fig. 3e). Las plantas transgénicas RCI5-OE expuestas a estrés salino tenían mayor numero de hojas verdes y de FW que las plantas silvestres no estresadas (p.e., alrededor de 120% en ambos casos; Fig. 3e), indicando que la sobreexpresión del gen RCI5 es suficiente para superar el estrés producido por el tratamiento de NaCl. Además, las plantas silvestres sólo tuvieron un 80 y 70% de hojas verdes y peso fresco del que presentan en condiciones control (Fig. 3e). Los mismos resultados se obtuvieron cuando se expusieron plantas silvestres y transgénicas RCI5-OE a concentraciones crecientes de LiCl (5 mM-20 mM; Fig 3e). Por el contrario, plantas silvestres y transgénicas RCI5-OE expuestas a concentraciones crecientes de manitol (100 mM-400 mM) mostraron valores de número de hojas verdes y FW muy similares (Fig 3e). Las diferencias encontradas entre la tolerancia de las plantas transgénicas RCI5-OE y de las plantas silvestres a los tratamientos con NaCl y LiCl fueron muy claras a nivel fenotípico (Fig. 3f). En conjunto, estos resultados demuestran que la sobreexpresión constitutiva del gen RCI5 incrementa la tolerancia de Arabidopsis a la congelación y al estrés salino, debido a su componente iónico, sugiriendo que la proteína RCI5 actúa como un regulador positivo de la respuesta de Arabidopsis a frío y estrés salino.

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2.2.- La proteína de la invención RCI5 (SEQ ID NO: 2) participa en la biosíntesis del óxido trimetilamina (TMAO)

La pregunta resultante era como la proteína RCI5 podría regular en Arabidopsis las respuestas al estrés por frío o salino. Numerosos estudios indican que una de las funciones fisiológicas de las FMO podría ser la osmoregulación, ya que en animales se ha demostrado que estas encimas oxidan el metabolito endógeno trimetilamina (TMA) a TMAO (Ziegler, 1993; Larsen y Schelenk, 2001), un potente osmolito que facilita la adaptación de diferentes organismos marinos a entornos salinos y con temperaturas de congelación (Yancey et al., 1982; Larsen y Schelenk, 2001; Seibel y Walsh, 2002; Treberg et al., 2005; Strambini y Gonnelli, 2008). Por lo tanto, se decidió investigar si la proteína RCI5 estaba implicada en la biosíntesis de TMAO. Así, se trató de detectar TMAO en plantas de Arabidopsis creciendo en condiciones controladas. Los resultados revelaron que, de hecho, plantas de Arabidopsis no estresadas tienen niveles muy bajos, pero detectables (\sim5 \mumol Kg^{-1} FW) de TMAO (Fig. 4a). Es destacable, sin embargo, que cuando las plantas fueron expuestas a temperaturas bajas o estrés salino, los dos tratamientos que inducen la expresión del gen RCI5 (Fig. 1d), el contenido de TMAO se incrementa significativamente. Así pues, la exposición a 4ºC ó 250 mM durante 24 h produce una acumulación de TMAO hasta valores cercanos a 25 y 35 \mumol Kg^{-1} FW, respectivamente (Fig. 4a), que son los niveles máximos de TMAO endógeno que se detectaron en las condiciones de estrés (Fig. 8). La deshidratación como estrés, que no tiene ningún efecto en la expresión de RCI5 (Fig. 1d), tampoco afecta los niveles de TMAO (Fig. 4a).

La identificación de TMAO endógeno en Arabidopsis y la existencia de una correlación entre la expresión de la proteína RCI5 y el contenido en TMAO llevó a analizar el contenido de esta molécula en las líneas transgénicas RCI5-OE. De forma clara, todas las plantas que sobreexpresaban el gen RCI5 (RCI5-OE) manifestaron niveles significativamente más elevados de TMAO (\sim2 veces) que las plantas silvestres originales (Figura 4b), indicando que la proteína RCI5 está involucrada en la biosíntesis de TMAO. Estos niveles, sin embargo, eran menores (3-4 veces) que los determinados en plantas silvestres expuestas a frío o a el tratamiento con sal (Figura 4a), lo que sugiere fuertemente que otras enzimas FMO, además de RCI5, tienen que estar implicadas en la biosíntesis de TMAO en respuesta a estos estreses. De igual forma, las plantas transgénicas RCI5-OE sometidas a 4ºC ó a 250 mM de NaCl durante 24 horas exhibieron mayores (\sim2 veces) cantidades de TMAO que las plantas silvestres expuestas al mismo tratamiento (Figura 4c).

Una evidencia completa y definitiva de la implicación de la proteína RCI5 en la biosíntesis de TMAO se obtuvo mediante ensayos in vitro donde se analizó la capacidad de RCI5 para oxidar TMA a TMAO. Los resultados confirmaron que la proteína RCI5 de la invención purificada de E. coli fue capaz de oxidar TMA de una manera dosis dependiente, generando cantidades sustanciales de TMAO (Figura 4d). Estos datos demuestran que las plantas Arabidopsis contienen niveles constitutivos de TMAO, que dichos niveles se incrementan significativamente en respuesta a estrés por bajas temperaturas y salino, y que dicho incremento se debe en parte, por la inducción de la expresión de RCI5.

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3.- El compuesto TMAO media la tolerancia a frío y sal en Arabidopsis 3.1.- El compuesto TMAO media la tolerancia a frío y sal en Arabidopsis mediante la regulación positiva de la expresión de genes que responden a estrés

Los resultados descritos hasta ahora sugieren una función de la proteína RCI5 en la osmoregulación a través de la biosíntesis de TMAO. Sin embargo, la mayor acumulación de TMAO en plantas de Arabidopsis sujetas a estrés por frío o sal (25-35 \mumol Kg^{-1} FW) parece ser baja para mediar un reajuste osmótico en estas condiciones. De hecho, esta concentración es del orden de tres veces de magnitud menor que la descrita para el TMAO en animales (Larsen y Schlenk, 2001; Seibel y Walsh, 2002) y para diferentes osmolitos, como la prolina y la glicinabetaina, en plantas (Wood et al., 1996; Russell et al., 1998; Sakamoto y Murata, 2000). Se ha propuesto que, en bajas concentraciones, algunos osmolitos pueden ejercer su papel protector frente a estrés abiótico por medio de mecanismos diferentes a la osmoprotección (Chen y Murata, 2002). Por ejemplo, se ha sugerido que la prolina y la glicina botaina podrían regular la expresión génica (Rajendrakumar et al., 1997; Iyer y Caplan, 1998; Kavi Kishor et al., 2005; Mattioli et al., 2008). Por tanto, se examinó la posibilidad de que el TMAO pudiese actuar como una molécula señalizadora mediando la inducción de la expresión génica en respuesta a estrés.

Ya que la proteína RCI5 esta implicado en la síntesis de TMAO (ver mas arriba), primero se estudiaron los niveles de transcritos de diferentes genes cuya expresión se induce por estrés en las líneas transgénicas RCI5-OE crecidas en condiciones control o expuestas a temperaturas bajas o estrés salino. Entre los genes estudiados se incluyeron KIN1, LTI78, COR15A y COR47, que son inducidos en respuesta a diferentes estreses abióticos a través de las rutas dependientes e independientes de los CBFs (Gilmour et al., 2004; Maruyama et al., 2004), RAB18 y RCI1A, que son regulados positivamente por frío por una vía independiente de los CFBs (Lang y Palva, 1992; Jarillo et al., 1994; Gilmour et al., 2004; Maruyama et al., 2004; López-Cobollo y Salinas, unpublished results), y CAT2 y SOD2, dos genes cuya expresión aumenta en respuesta a diferentes estreses y codifican proteínas implicadas en la detoxificacion de ROS (Refs; Kliebestein et al., 1998; Chevalier et al., 1992). Además, se estudiaron los niveles de los genes CBFs (CBF1-3), cuya expresión es promovida específicamente por las temperaturas bajas (Gilmour et al., 1998; Liu et al., 1998; Medina et al., 1999). Como los patrones de expresión de todas las líneas transgénicas RCI5-OE analizadas fueron muy similares solo se muestran los resultados obtenidos con la línea 1T (Figs. 5a, b). En condiciones control, la acumulación de transcritos correspondientes a KIN1, COR15A, COR47, y principalmente los de CAT2 y SOD2 fueron considerablemente superiores en las plantas sobreexpresoras de RCI5 que en las silvestres (Fig. 5a). La expresión de los otros genes analizados no se vio afectada en la líneas transgénicas RCI5-OE (Figs. 5a, b). La inducción de todos los genes, excepto RAB18 y RCI1A, en respuesta a frío era mayor en las plantas que sobreexpresaban RCI5 (Fig. 5a, b). En condiciones de estrés salino, todos los genes que responden a NaCl (p.e., KIN1, LTI78, COR15A, COR47, CAT2 y SOD2, ver estos genes en la Fig 5a) mostraban una mayor inducción en las plantas RCI5-OE (Fig. 5a, b). Estos patrones de expresión justifican completamente el incremento de la tolerancia a la congelación, antes y después de la aclimatación a frío y a estrés salino de las líneas RCI5-OE (Fig. 3). Por tanto, se concluye que la proteína RCI5 regula positivamente la respuesta de la expresión génica a estrés, lo cual sugiere que el TMAO podría, de hecho, mediar la inducción por estrés de la expresión génica y, por tanto, la tolerancia de Arabidopsis a la congelación y al estrés salino.

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3.2.- La aplicación externa mediante pulverización de TMAO induce tolerancia al frío y al estrés salino

Si el TMAO actúa como una molécula señalizadora y media la inducción de la expresión génica por estrés, su aplicación exógena a plantas de Arabidopsis en condiciones control debería inducir la expresión génica regulada por estrés. Esta hipótesis se verificó examinando la acumulación de los transcritos correspondientes a los genes analizados anteriormente in plantas silvestres de Arabidopsis pulverizadas con 100 \muM TMAO, una concentración que, tras 24 h de tratamiento, provoca una acumulación de TMAO endógeno en el mismo rango detectado en plantas expuestas a temperaturas bajas o estrés salino (30-35 \mumol Kg^{-1} FW; Fig. 9). Excepto en el caso de RAB18 y RCI1A, el TMAO exógeno activó la expresión de todos los genes hasta niveles similares a los alcanzados tras la exposición a 4ºC y NaCl (Figs. 5c, d), confirmando que el TMAO media la inducción de la expresión génica por estrés. También se estudió La acumulación de mRNA de RCI5 en respuesta a TMAO. Los resultados obtenidos indican que la inducción por frío y sal del gen RCI5 no está mediada por TMAO (Fig. 5c).

Por último, se estudió si el TMAO también mediaba la tolerancia de Arabidopsis a la congelación y al estrés salino. Para ello, plantas silvestres de Arabidopsis fueron pulverizadas con 100 \muM TMAO y se determinó su tolerancia a la congelación, antes y después de la aclimatación a frío, así como su tolerancia a deshidratación y estrés salino. De manera consistente con lo descrito anteriormente, la aplicación exógena de TMAO aumentó de manera significativa la tolerancia de Arabidopsis a la congelación, tanto de plantas aclimatadas como no aclimatadas, y a estrés salino (Figs. 6a, b), pero no tuvo ningún efecto en la capacidad de Arabidopsis para tolerar la deshidratación. También de estudió la tolerancia a LiCl y manitol de plantas de Arabidopsis tratadas con TMAO. El TMAO incrementó la tolerancia de Arabidopsis a LiCl pero no a manitol (Fig. 6b), indicando que, como la proteína RCI5, está implicado de manera específica en la tolerancia al componente iónico del estrés salino. Las diferencias fenotípicas de las plantas tratadas con TMAO y las no tratadas son muy evidentes (Figs. 6c, d). En conjunto, todos estos resultados indican que el TMAO actúa como una molécula señalizadota mediando la tolerancia de Arabidopsis a la congelación y al estrés salino regulando positivamente la inducción de la expresión génica.

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Materiales y métodos Material vegetal, condiciones de crecimiento y tratamientos

En este estudio se utilizó como material vegetal Arabidopsis thaliana (L.) ecotipos Columbia (Col) y Landsberg erecta (Ler), los mutantes aba1-1 (ref) y cbf2-1 (Novillo et al., 2004), así como CBF1-AS3, una línea transgénica de Arabidopsis en la cual CBF1 y CBF3 no son inducidos por frío (Novillo et al., 2007). Para la obtención de plántulas, las semillas eran sembradas en condiciones estériles en cajas Petri con medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 250 mg/l MES, solidificado con agar al 0,8% (w/v). Las plantas eran cultivadas en macetas que contenían una mezcla de sustrato orgánico con vermiculita (3:1, v/v), y se regaban con agua y una solución mineral (Haughn y Sommerville, 1986). Ambas, plántulas y plantas, se crecían a 21\pm1ºC en condiciones de día largo (16 horas de luz blanca fluorescente, flujo de fotones de de 70-90 \mumol m^{-2} sec^{-1}).

Los análisis de expresión se realizaron con plantas de tres semanas, excepto en el análisis en diferentes órganos donde se utilizaron plantas de 8 semanas. El tratamiento de bajas temperaturas se realizó transfiriendo las plantas a una cámara de crecimiento a 4\pm1ºC durante diferentes periodos bajo las condiciones de luz y fotoperiodo descritas a anteriormente. Para los tratamientos con NaCl, LiCl y manitol las plantas fueron regadas con 250 mM NaCl, 20 mM LiCl y 500 mM manitol respectivamente, y recolectadas un día mas tarde. La deshidratación fue inducida dejando las plantas, previamente separadas de su sistema radicular, perder un 50% de su FW. Para los tratamientos de TMAO, las plantas fueron pulverizadas con 100 \muM TMAO y recolectadas un día mas tarde. El control del tratamiento de TMAO se obtuvo pulverizando plantas con agua. En todos los casos, las plantas fueron congeladas inmediatamente con N_{2} después de los tratamientos y guardadas a -80ºC hasta su uso.

El TMAO endógeno se midió siempre en plantas de 3 semanas. Se utilizaron plantas pulverizadas con 100 \muM TMAO y recogidas tras diferentes tiempos de tratamiento, o pulverizadas con diferentes concentraciones (10, 50, 100 y 200 \muM) de TMAO y recogidas un día después. También se regaron plantas con diferentes concentraciones (50, 100, 150, 200, 250 y 300 mM) de NaCl y se recogieron un día después. El efecto de las temperaturas bajas en el contenido de TMAO endógeno se estudio exponiendo plantas a 4ºC durante diferentes tiempos. Después de recogerlas, las plantas siempre fueron congeladas en N_{2} y usadas inmediatamente.

Los experimentos de congelación se llevaron a cabo con plantas de 2 semanas como se ha descrito previamente (Novillo et al., 2004). La tolerancia fue establecía como la capacidad de las plantas de crecer tras 14 días de recuperación en condiciones control. La tolerancia a sal se analizo transfiriendo plántulas de 1º días a placas nuevas medio suplementado con concentraciones crecientes de NaCl (50, 100, 150 y 200 mM) o LiCl (5, 10, 15 y 20 mM). El estrés osmótico se impuso transfiriendo plántulas de 10 días a placas con medios suplementados con concentraciones crecientes de manitol (100, 200, 300 y 400 mM). En todos los casos, las plantas se mantuvieron 2 días a cada concentración. La tolerancia a estos tratamientos se evaluó determinando el peso fresco y el número de hojas verdes al final del tratamiento. La deshidratación fue inducida retirando las plántulas de 10 días del medio de crecimiento, situándolas en un papel de filtro húmedo, y se dejaron que crecieran durante 2 días sin agua. La deshidratación se estimo como el porcentaje de FW inicial después del tratamiento. Para analizar el efecto del TMAO en la tolerancia a la congelación, se pulverizaron plantas de 2 semanas con 100 \muM TMAO 1 h antes de ser congeladas o aclimatadas a frío como se ha descrito previamente. El efecto del TMAO en la tolerancia de Arabidopsis a NaCl, LiCl, manitol y deshidratación se estudió germinando semillas en placas con medio suplementado con 100 \muM TMAO. A continuación, las plántulas de 10 días se procesaron como se ha descrito anteriormente.

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Métodos de Biología Molecular

RCI5 se aisló rastreando una biblioteca de cDNA, preparada a partir de plántulas etioladas de Arabidopsis aclimatadas a frío, con una sonda substractiva enriquecida en transcritos inducibles por frío siguiendo protocolos descritos previamente (Jarillo et al. 1994). Para los análisis de similitud de secuencia se usó el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) del National Centre for Biotechnology Information (Altschul et al., 1997). Las digestiones con encimas de restricción, los clonajes, la extracción de proteínas totales de plantas, y las hibridaciones de DNA y RNA se realizaron de acuerdo a procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989). El RNA total se aisló como se ha sido reportado previamente (Logemann et al., 1987).

El cDNA completo de RCI5 fue obtenido por RT-PCR de RNA total de plantas de Arabidopsis ecotipo Col expuestas a 4ºC durante 24 h, usando los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. El fragmento resultante se rellenó con Klenow y se ligó en el sito SmaI del plásmido pBluescript SK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, USA) para obtener el plásmido pBSRCI5. Para obtener la fusión GST::RCI5, el plásmido pBSRCI5 fue digerido con BamHI y SalI. Entonces, el fragmento conteniendo el cDNA de RCI5 se rellenó con Klenow y se ligó en el sitio SmaI del vector pGEX-4T1 (GE Healthcare, Bio-Sciences, Piscataway, NJ).

Para expresar RCI5 en E. coli, se transformó la cepa BL21(DE3) pLysS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) con el vector pGEX-4T1 que contiene la fusión GST::RCI5. La purificación de RCI5 de E. coli se realizó de acuerdo al protocolo de la casa comercial, induciendo la expresión en el cultivo durante 4 horas a 28ºC con 0.1 mM IPTG. El vector pGEX-4T1 se usó como control.

La sonda específica para RCI5 se generó mediante PCR sobre cDNA de Arabidopsis ecotipo Col usando los cebadores SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7. Las sondas específicas para KIN1, LTI78, COR47, COR15A, RCI1A, RAB18, CBF1, CBF2, CBF3, GUS y SOD2 fueron obtenidas como se ha sido descrito previamente (Kliebenstein et al., 1998; Novillo et al., 2007;). La sonda específica para CAT2 se obtuvo mediante PCR sobre DNA genómico de Arabidopsis con los cebadores SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9. Como control de carga se usó un fragmento EcoRI del 18S rRNA (Tremousaygue et al., 1992). Las muestras de RNA de cada experimento se analizaron en al menos dos membranas independientes, y cada experimento se repitió al menos 3 veces.

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Obtención de las Plantas Transgénicas

Mediante PCR se amplifico un fragmento de 0.77 kb inmediatamente anterior al ATG de la región codificante de RCI5, usando como molde DNA genómico de Arabidopsis ecotipo Col y los cebadores SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11. El fragmento de promotor se clonó en el sitio SmaI del vector pBluescript SK{+). Posteriormente, el plásmido fue digerido con SalI y BamHI, y el fragmento obtenido se ligó en los correspondientes sitios de restricción del plásmido pBI101 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) para obtener la fusión RCI5::GUS. El plásmido pBSRCI5 (ver anterior) fue digerido con SmaI y el cDNA de RCI5 resultante se ligó en el sitio SmaI del vector pROK2 bajo el control del promotor CaMv35S (Baulcombe et al., 1986), para obtener la construcción 35S::RCI5.

Los plásmidos recombinantes, una vez verificada la construcción mediante secuenciación, se introdujeron en la cepa de Agrobacterium tumefaciens C58C1 (Deblaere et al., 1985). Para transformar las plantas de Arabidopsis ecotipo Col se siguió el método de inmersión floral (Clough y Bent, 1998).

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Localización Histoquímica de la Actividad GUS

El análisis histoquímico de la actividad GUS en las plantas transgénicas de Arabidopsis que contienen la fusión RCI5::GUS se realizó siguiendo protocolos descritos anteriormente (Medina et al., 2001).

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Cuantificación de la Actividad Monooxigenasa

La cuantificación de la actividad monooxigenasa se realizó siguiendo esencialmente protocolos publicados previamente con modificaciones (Agustsson y Strom, 1981); (Lang et al., 1998). Resumidamente, 100 \mul de tampón PBS (pH 7.4) conteniendo 100 \mug de proteínas procedentes de extractos bacterianos, 100 \mug de proteínas purificadas de E. coli, o 100 \mug de proteínas totales de plantas de 3 semanas se añadieron a 2 ml de una mezcla de reacción estándar consistente en 2.5 nmol FAD, 600 nmol NADPH, 6 \mumol MgCl_{2} y 40 \mumol de pirofosfato potásico (pH 8.2). La reacción se inició con 300 nmol TMA. Después de 20 min a 24ºC, la reacción se paró añadiendo HClO_{4} a una concentración final del 1%. La actividad monooxigenasa se cuantificó como la cantidad de NADPH consumido por hora a 24ºC.

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Determinación del Contenido en TMAO

El contenido de TMAO fue cuantificado reduciendo el TMAO a TMA con TiCl_{3}, siguiendo el protocolo descrito previamente (Bystedt et al., 1959) con algunas modificaciones. Diez gramos de tejido verde congelado se homogeneizó con 7,5%. TCA. Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron 15 min a 20ºC y el sobrenadante se filtró a través de papel Whatman nº 1. El contenido en TMA se estimó añadiendo 1 ml de formaldehído al 20%, 3 ml de KOH al 30% y 10 ml de tolueno a 1 ml de sobrenadante filtrado. Esta mezcla se agitó vigorosamente durante 15 s y se dejó reposar 5 min, la fase de tolueno que contenía el TMA se recuperó y se transfirió a un tubo nuevo que contenía 1 mg de Na_{2}SO_{4}. Mediante agitación suave se obtuvo una fase acuosa libre de tolueno que se usó en el análisis espectrofotométrico. Cinco ml del extracto con tolueno se incubó con 5 ml de ácido pícrico 0,02% durante 30 s a temperatura ambiente. Tras esta incubación, en presencia de TMA se desarrollo un color amarillo cuya concentración era proporcional a la concentración de TMA, y que era directamente proporcional a la absorbancia a 410 nm. El TMAO se redujo añadiendo 132 \mul de 15% TiCl_{3} a 4 ml del sobrenadante filtrado. La mezcla se incubó a 80ºC durante 90 s y se enfrió inmediatamente. El contenido en TMA en la mezcla, después de la reducción del TMAO, se determinó como en las muestras de TMA. Los valores obtenidos se refirieron a una curva de calibración generada con varias soluciones con distintas concentraciones de TMA comercial (Sigma, St. Louis, MO). El contenido en TMAO se calculó como la diferencia de TMA antes y después de la reducción.

Para evaluar la capacidad de RCI5 para generar TMAO, se cuantificó la actividad monooxigenasa, usando 0, 50, 100 y 200 \mug de proteína purificada de E. coli, como se ha descrito anteriormente (Cuantificación de la Actividad Monooxigenasa). A continuación, la determinación de TMAO se realizó como se ha descrito anteriormente cogiendo 1 ml de reacción final para medir el TMA y 1 ml para reducir el TMAO a TMA.

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<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

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Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria

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<120> PLANTA TRANSGÉNICA RCI5 RESISTENTE AL FRIO Y ESTRES SALINO PRODUCTORA DE TMAO, ELEMENTOS NECESARIOS PARA SU OBTENCIÓN Y USO DE COMPOSICIONES QUE CONTIENEN TMAO PARA INDUCIR TOLERANCIA AL FRIO Y ESTRÉS SALINO

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<130> RCI5

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<160> 11

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<170> PatentIn versión 3.5

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<210> 1

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<211> 2146

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> CDS

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<222> (18)..(1397)

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<223> Secuencia de nucleótidos codificante del cDNA del gen RCI5

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<400> 1

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1

2

3

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<210> 2

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<211> 459

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 2

4

5

6

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<210> 3

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<211> 3227

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 3

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7

8

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<210> 4

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 4

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cgcggatcca cagagcatca tcatcatcac

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30

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<210> 5

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 5

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tcccccgggc aacacacaga caggtc

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26

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<210> 6

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<211> 17

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 6

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gcaagtgggt ggctgca

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17

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<210> 7

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<211> 17

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 7

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caacacacag acaggtc

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17

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<210> 8

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 8

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caggtcttgg tcacatcgag

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20

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<210> 9

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 9

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cagtcaagtt ctacaccag

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19

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<210> 10

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 10

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gcggaacaat gtggttgctc g

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21

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<210> 11

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgctggtgcg atcttttttg tgtg

\hfill

24

Claims

1. Planta transgénica tolerante al frío y al estrés salino caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que permite la expresión de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

ii.- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a).

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2. Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 1.

3. Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque la planta es Arabidopsis, preferentemente la planta transgénica RCI5-OE, que contiene la SEQ ID NO: 1.

4. Procedimiento de obtención de la planta transgénica según las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque consiste en la introducción en una planta de una secuencia de nucleótidos constituida por:

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5. Procedimiento según la reivindicación 4 caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

b) obtención de microorganismos portadores del vector a), y

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6. Una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

a) la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), con o sin

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7. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6 caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de a) está constituida por la secuencia de nucleótidos RCI5 de SEQ ID NO: 1.

8. Vector de expresión génica caracterizado porque comprende la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 6 y 7 y que permite la transformación o transfección de microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas transgénicas de la invención.

9. Vector de expresión según la reivindicación 8 caracterizado porque es el vector 35S::RCI5.

10. Microorganismo o célula caracterizado porque contiene la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 6 y 7 o el vector de expresión según las reivindicaciones 8 y 9.

11. Semilla de una planta caracterizada porque contiene la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 6 y 7 o el vector de expresión según las reivindicaciones 8 y 9.

12. Uso de una composición acuosa que comprende el compuesto óxido de trimetilamina (TMAO) o un derivado del mismo para inducir tolerancia al estrés salino y al frío en las plantas y/o semillas.

13. Uso de una composición según la reivindicación 12 caracterizado porque la composición acuosa comprende el compuesto TMAO en una concentración comprendida entre 1 \muM y 100 mM, preferentemente entre 50 \muM y 1 mM, y más preferentemente a 100 \muM.

14. Uso de una composición según la reivindicación 12 caracterizado porque la composición acuosa de TMAO es de 100 \muM.

15. Uso de una composición según las reivindicaciones 12 a la 14 caracterizado porque la composición acuosa se aplica mediante pulverización a la parte aérea.

16. Uso de una composición según las reivindicaciones 12 a la 14 caracterizado porque la composición acuosa se aplica al tallo por inyección.

17. Uso de una composición según las reivindicaciones 12 a la 14 caracterizado porque la composición acuosa se aplica al suelo u otro sustrato de cultivo, al agua de riego (o solución de cultivo) o por inmersión del sistema radicular de las plantas y/o de semillas.