BR112016003150B1 - Método para produzir uma planta ou organismo fotossintético tolerante à seca - Google Patents

Método para produzir uma planta ou organismo fotossintético tolerante à seca Download PDF

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Abstract

métodos para melhorar tolerância à seca em plantas. um método para melhorar tolerância à seca em uma planta ou organismo fotossintético é fornecido, onde a tolerância é aumentada aplicando uma quantidade eficaz de n-óxido de trimetilamina (tmao), n-óxido de trimetilamina di-hidratado, um derivado químico de tmao ou um análogo químico de tmao a uma planta, parte de planta, organismo fotossintético ou semente, ou introduzindo sequências de ácido nucleico codificando polipeptídeos com atividade de monooxigenase flavina, de modo que a atividade é aumentada três, preferencialmente oito ou mais vezes pela modificação de sequências de ácido nucleico endógeno que aumenta o teor de tmao endógeno em plantas três, preferencialmente oito ou mais vezes, adicionalmente, a invenção diz respeito a plantas tolerantes à seca ou organismos fotossintéticos ou suas partes produzidas pelos métodos da invenção.

Description

CAMPO TÉCNICO
[0001] A invenção refere-se a métodos para melhorar características de plantas ou organismos fotossintéticos, incluindo tolerância à seca melhorada.
FUNDAMENTOS
[0002] Quando as plantas estão expostas a condições onde a redução do teor de água no solo devido a uma escassez de chuva ou irrigação leva à absorção de água prejudicada, o que poderia ser chamado de condições de estresse hídrico, as funções fisiológicas das células podem deteriorar-se e, assim, várias doenças podem surgir na planta. Quando submetida a tal estresse fator de plantas exibem uma variedade de respostas mecanísticas como medidas de proteção, com um efeito adverso resultante no crescimento, desenvolvimento, e da produtividade. Perdas significativas na qualidade e rendimento são comumente observados.
[0003] Apesar de ter sido conhecido que fitormônios e algumas substâncias químicas, tais como reguladores de crescimento de plantas têm efeitos sobre as plantas na redução do estresse à seca, como estresse hídrico ou estresse excessivo de umidade (ver Journal of Plant Growth Regulation (2010) 29: 366-374), os efeitos não são necessariamente satisfatórios na prática. Por exemplo, osmólitos orgânicos são pequenos solutos utilizados pelas células de numerosos organismos e tecidos com escassez de água para manter o volume celular. Compostos similares são acumulados por alguns organismos em estresses anidrobióticos, térmicos e possivelmente de pressão. Estes solutos estão os aminoácidos e seus derivados, polióis e açúcares, metilamina, compostos metilsulfônio e ureia. Exceto para a ureia, são muitas vezes chamados de "solutos compatíveis", um termo indica a falta de efeitos de perturbação sobre macromoléculas celulares e implica na permutabilidade. No entanto, esses recursos não podem sempre existir, e a utilização prática não pode ser tida como certa vez que os níveis elevados podem causar sobreestabilização de proteínas e algumas propriedades protetoras do osmólitos são prejudiciais na ausência de um perturbador para compensar (Yancey, PH (2005). J. Exp. Biol 208 (Pt 15):2819-30). Por exemplo, o osmólito de glicinabetaína (betaína) proporciona osmoproteção em bactérias, plantas e animais, e protege os componentes celulares contra condições adversas, in vitro, no entanto, a engenharia de produção de betaína em três espécies diferentes sem, Arabidopsis, Brassica napus, e tabaco (Nicotiana tabacum), através da expressão constitutiva de um gene colina oxidase bacteriana única conferiu uma tolerância ao estresse moderado em algumas, mas não todas as linhagens transgênicas de produção de betaína e as respostas ao estresse, tais como salinidade, seca, e congelamento foram variáveis entre as três espécies. Além disso, um custo de capacidade foi observado nas três espécies (Jun H, Hariji et al (2000) Plant Physiol 122:747-56).
[0004] Portanto, são necessárias estratégias alternativas para a produção de seca estresse plantas tolerantes.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[0005] As seguintes modalidades e aspectos dos mesmos são descritos e ilustrados em conjunto com os sistemas, métodos e ferramentas, que se destinam a ser exemplar e ilustrativa, não limitando no seu escopo.
[0006] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método para produzir uma planta tolerante a seca ou organismo fotossintético compreendendo:
[0007] aplicação de pelo menos um tratamento de uma quantidade eficaz de N-óxido de trimetilamina (TMAO); N- óxido de Trimetilamina di-hidratado, um derivado químico de TMAO ou um análogo químico de TMAO para uma planta, parte da planta, organismo fotossintético ou de sementes; e crescer dita planta, parte da planta, organismo fotossintético ou semente, em que uma planta tolerante ao estresse da seca ou organismo fotossintético é produzida.
[0008] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a uma semente de planta tratada com uma quantidade eficaz de N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido trimetilamina di-hidratado, um derivado químico de TMAO, ou um análogo químico de TMAO.
[0009] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a uma planta tolerante a seca produzida por crescimento de uma semente da planta da invenção.
[0010] Em um quarto aspecto, a invenção diz respeito a uma planta tolerante a seca produzida através da aplicação de pelo menos um tratamento de uma quantidade eficaz de N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina di-hidratado, um derivado químico de TMAO ou análogo químico de TMAO para uma planta, parte da planta, semente ou organismo fotossintético.
[0011] Em um quinto aspecto, a invenção refere- se a um método de produzir uma planta tolerante a seca, em que o método compreende a transformação de uma planta com uma sequência que codifica uma proteína FMO operativamente ligada a um promotor, sob condições adequadas para a sobre- expressão da proteína FMO na planta de pelo menos três vezes em relação à expressão da proteína endógena FMO, em que a sobre-expressão da sequência de codificação de proteína FMO de dita planta tolerante ao estresse da seca catalisa a oxidação de metabólitos endógenos, contendo nitrogênio nucleofílico.
[0012] Em um sexto aspecto, a invenção refere- se a uma planta tolerante a seca produzida pelo método da invenção.
[0013] Em um sétimo aspecto, a invenção refere- se a uma cultura de tecidos de células produzidas a partir da planta da invenção.
[0014] Em um aspecto de oito, a invenção refere- se a uma planta regenerada a partir da cultura de tecidos da invenção, em que a planta compreende a proteína FMO.
[0015] Em um nono aspecto, a invenção refere-se a um método para produzir um organismo fotossintético que sobre-expressa, pelo menos, três vezes uma ou mais proteínas que codificam sequências de FMO no dito organismo fotossintético, que compreende:
[0016] cultivar uma planta transformada com uma sequência que codifica uma proteína FMO operativamente ligada a um promotor, em que a proteína FMO e o promotor são integrados de forma estável no dito genoma nuclear fotossintético do organismo ou do dito genoma do cloroplasto da planta sob condições adequadas para a sobre-expressão da proteína FMO de pelo menos três vezes no que diz respeito aos níveis de expressão da proteína endógena FMO, no organismo fotossintético, em que a sobre-expressão da sequência de codificação de proteína FMO no dito organismo fotossintético catalisa a oxidação de metabólitos endógenos, contendo nitrogênio nucleofílico.
[0017] Em um décimo aspecto, a invenção refere- se a uma planta produzida pelo método da invenção, em que a planta compreende a proteína FMO.
[0018] Em um décimo primeiro aspecto, a invenção refere-se a uma cultura de tecidos de células produzidas a partir da planta da invenção, em que as ditas células de cultura de tecido são produzidas a partir de uma parte da planta escolhida a partir de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, células meristemáticas, raízes, pontas de raiz, pistilos, anteras, flores e caules.
[0019] Em um décimo segundo aspecto, a invenção refere-se a uma planta regenerada a partir da cultura de tecidos da invenção.
[0020] Várias modalidades são apresentadas na Descrição Detalhada como aqui proporcionado e como incorporada pelas reivindicações. Deve ser entendido, no entanto, que este resumo não contém todos os aspectos e modalidades da presente invenção, não se destina a ser limitativo ou restritivo de qualquer modo, e que a invenção(s), tal como aqui descrito é/são entendidas por aqueles peritos na arte para abranger melhorias óbvias e modificações das mesmas.
[0021] As vantagens adicionais da presente invenção irão tornar-se facilmente evidentes a partir da discussão que se segue, especialmente quando feita em conjunto com os desenhos em anexo e listagem de sequências.
BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0022] SEQ ID NO: 1 divulga a sequência de ácido nucleico At FMO GS-OX5 (NM_101086.4|) (At1g12140).
[0023] SEQ ID NO: 2: divulga a sequência de aminoácido At FMO GS-OX5 (NM_101086.4 |) (At1g12140).
[0024] SEQ ID NO: 3 divulga a sequência de ácido nucleico Br FMO GS-OX1 (FJ376070.1).
[0025] SEQ ID NO: 4 divulga a sequência de aminoácidos Br FMO GS-OX1 (FJ376070.1).
[0026] SEQ ID NO: 5 divulga a sequência de ácido nucleico Cs FMO GS-OX3 (XM_004.150.596,1) (LOC101212991).
[0027] SEQ ID NO: 6 divulga a sequência de aminoácido Cs FMO GS-OX3 (XM_004.150.596,1) (LOC101212991).
[0028] SEQ ID NO: 7 divulga a sequência de ácido nucleico Cs FMO GS-OX3 (XM_004.150.602,1) (LOC101220318).
[0029] SEQ ID NO: 8 divulga sequência de aminoácidos a Cs FMO GS-OX3 (XM_004.150.602,1) (LOC 101220318).
[0030] SEQ ID NO: 9 divulga a sequência de ácido nucleico Cs FMO GS-OX3 (XM_004.170.413,1) (LOC101220079).
[0031] SEQ ID NO: 10 divulga a sequência de aminoácidos Cs FMO GS-OX3 (XM_004.170.413,1) (LOC101220079).
[0032] SEQ ID NO: 11 divulga a sequência de ácido nucleico Cs FMO GS-OX3 (XM_004.164.404,1) (LOC101227975).
[0033] SEQ ID NO: 12 divulga a sequência de aminoácido Cs FMO GS-OX3 (XM_004164404.1) (LOC101227975).
[0034] SEQ ID NO: 13 divulga a sequência de ácido nucleico Mt FMO GS-OX5 (XM_003.611.223,1) (MTR_5g012130).
[0035] SEQ ID NO: 14 divulga a sequência de aminoácidos Mt FMO GS-OX5 (XM_003.611.223,1) (MTR_5g012130).
[0036] SEQ ID NO: 15 divulga a sequência de ácido nucleico Os FMO (NC_008.403,2).
[0037] SEQ ID NO: 16 divulga a sequência de aminoácidos Ss FMO (NP 001.065.338,1).
[0038] SEQ ID NO: 17 divulga a sequência de ácido nucleico Vv FMO GS-OX3-3 (XM_003.631.392,1) (LOC100255688).
[0039] SEQ ID NO: 18 divulga a sequência de aminoácidos Vv FMO GS-OX3-3 (XM_003.631.392,1) (LOC100255688).
[0040] SEQ ID NO: 19 divulga a sequência de ácido nucleico Vv FMO GS-OX3-2 (XM_003.631.391,1) (LOC100255688).
[0041] SEQ ID NO: 20 divulga a sequência de aminoácidos Vv FMO GS-OX3-2 (XM_003.631.391,1) (LOC100255688).
[0042] SEQ ID NO: 21 divulga a sequência de ácido nucleico Vv FMO GS-OX3-2 (XM_003.635.084,1) (LOC100242032).
[0043] SEQ ID NO: 22 divulga a sequência de aminoácidos Vv FMO GS-OX3-2 (XM_003.635.084,1) (LOC100.242.032).
[0044] SEQ ID NO: 23 revela a FMO-Gh uma sequência de ácido nucleico (DQ 122185,1).
[0045] SEQ ID NO: 24 revela a FMO-Gh uma sequência de aminoácidos (DQ122185.1).
[0046] SEQ ID NO: 25 divulga a sequência de ácido nucleico Zm FMO (NM_001 157345,1).
[0047] SEQ ID NO: 26 divulga a sequência de aminoácidos Zm FMO (NP 001.150.817,1).
[0048] SEQ ID NO: 27 divulga a GS-OX sequência de ácido nucleico Pt FMO (XM_002329873.1).
[0049] SEQ ID NO: 28 divulga a sequência de aminoácidos Pt FMO GS-OX (XM_002329873.1).
[0050] SEQ ID NO: 29 revela a Pt FMO GS-OX sequência de ácido nucleico (XM_002.318.967,1).
[0051] SEQ ID NO: 30 revela a GS-OX sequência de aminoácido Pt FMO (XM_002318967.1).
[0052] SEQ ID NO: 31 revela a GS-OX sequência de ácido nucleico Pt FMO (XM_002329874.1).
[0053] SEQ ID NO: 32 revela a GS-OX sequência de amino ácido Pt FMO (XM_002329874.1).
[0054] SEQ ID NO: 33 divulga a sequência de ácido nucleico Gm FMO (NM_003538657.1).
[0055] SEQ ID NO: 34 divulga a sequência de aminoácidos Gm FMO (XP 003.538.705,1).
[0056] SEQ ID NO: 35 divulga a sequência de ácido nucleico GS-OX SI FMO (XM_004.241.959,1) (LEFL1075CA11).
[0057] SEQ ID NO: 36 revela a GS-OX sequência SI FMO aminoácidos (XP 004.242.007,1) (LEFL1075CA11).
[0058] SEQ ID NO: 37 divulga a sequência de ácido nucleico SI FMO GS-OX (SGN-U584070) (Solyc06g060610).
[0059] SEQ ID NO: 38 divulga a sequência de aminoácidos SI FMO GS-OX (SGN-U584070) (Solyc06g060610).
[0060] SEQ ID NO: 39 divulga a sequência de ácido nucleico Hs FMO-3 (NC 000.001,10(171,060,018.171,086,961)).
[0061] SEQ ID NO: 40 divulga a sequência de aminoácidos Hs FMO-3 (NP 001.002.294,1).
[0062] SEQ ID NO: 41 divulga a sequência de ácido nucleico Oc FMO-3 (013.681,1 NC).
[0063] SEQ ID NO: 42 divulga a sequência de aminoácidos Oc FMO-3 (NP_001075714.1).
[0064] SEQ ID NO: 43 divulga a sequência de consenso do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2-38.
[0065] SEQ ID NO: 44 revela a 5’UTR em combinação com a sequência de DNA de AtFMO GS
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0066] As figuras que a acompanham, ilustram algumas, mas não as únicas ou exclusivas, como por exemplo modalidades e/ou características. Pretende-se que as modalidades e figuras aqui descritas são para serem consideradas ilustrativos e não limitativas.
[0067] A Figura 1 mostra a partir da esquerda, tomateiros irrigados com água e, à direita, plantas irrigadas com 5,5g/L TMAO di-hidratado após a recuperação seca.
[0068] A Figura 2 mostra uma árvore filogenética com base em semelhanças de proteína utilizando o algoritmo livre de alinhamento, com o nome CLUSS, para famílias de proteínas de agrupamento das sequências de polipeptídeos de FMO de Arabidopsis thaliana, vinha, Populus trichocarpa, arroz, soja, melão, tomate, sorgo, milho, trigo, cevada, humana e de coelho.
[0069] A Figura 3 mostra, a partir do fundo, tipo selvagem Col-0 (rotulado Col-0) plantas de Arabidopsis thaliana, no meio (etiquetas FOM X3), plantas de Arabidopsis thaliana transgênicas com superexpressão de três cópias da sequência At FMO GS-OX5 e no painel superior (marcado X8 FOM) plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana com sobre- expressão de oito cópias da sequência At FMO GS-OX5 após a recuperação seca.
[0070] A Figura 4a é um mapa de um construto de DNA que pode ser utilizado para obter as plantas de Arabidopsis thaliana para a sobre-expressão constitutiva dos, pelo FMO sequência GS-OX5, que inclui (a partir de 5' para 3'), um promotor (PRONOS), um marcador selecionável (NPTII), um promotor constitutivo (35S) e uma sequência codificadora da proteína FMO (RCI5) estavelmente integrada em um vetor PROK2.
[0071] A Figura 4b é um segundo mapa de um construto de DNA que pode ser utilizado para obter as plantas de Arabidopsis thaliana para a sobre-expressão constitutiva da sequência de At FMO GS-OX5, que inclui (a partir de 5' para 3'), um promotor (PRONOS), um marcador selecionável (NPTII), um promotor de estresse indutível (PRORD29A) e uma sequência codificadora da proteína FMO (RCI5) estavelmente integrado em um vetor PROK2.
[0072] A Figura 5a é um mapa de um construto de DNA que pode ser usado para obter plantas as Zea mays para a sobre-expressão constitutiva da sequência de codificação da proteína Zm FMO que inclui (a partir de 5 'para 3'), promotor constitutivo (ubiquitina), uma sequência codificando proteína FMO (Zm FMO), um segundo promotor (35S) e um marcador selecionável (higromicina) estavelmente integrado em um vetor pCAMBIA 1300.
[0073] A Figura 5b é um mapa de um construto de DNA que pode ser utilizado para obter as plantas Solanum lycopersicum para a sobre-expressão da sequência codificando proteína SI FMO GS-OX1, que inclui (a partir de 5' para 3'), um promotor indutível de estresse (PRORD29A), uma sequência de codificação da proteína FMO (SI FMO GS-OX 1), um segundo promotor (35S) e um marcador selecionável (higromicina) estavelmente integrado em um vetor pCAMBIA 1300.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0074] Modalidades da presente descrição incluem métodos para a produção de plantas ou organismos fotossintéticos tolerantes ao estresse de seca, incluindo as tolerâncias para, mas não limitados a seca, excesso de umidade, bem como o uso eficiente da água onde os rendimentos normais são produzidos com menos de entrada de água. Estes métodos incluem a aplicação de compostos orgânicos, tais como N-óxido de trimetilamina ("TMAO") ou um análogo de TMAO, um derivado de TMAO, ou TMAO di-hidratado para as plantas ou sementes para produzir uma planta tolerante ao estresse de seca. A presente divulgação também inclui plantas ou organismos fotossintéticos tolerantes ao estresse à seca, incluindo tolerâncias a mas não se limitando à seca e umidade excessiva. Estas plantas tolerantes ao estresse de seca e organismos fotossintéticos podem ser produzidos através da aplicação de compostos orgânicos, tais como N-óxido de trimetilamina ("TMAO") ou um análogo de TMAO, um derivado de TMAO, ou TMAO di-hidratado para induzir tolerância de estresse à seca, permitindo a produção de plantas e organismos fotossintéticos com mais uma biomassa, frutas ou sementes quando comparado com plantas e organismos fotossintéticos que não foram tratados com compostos orgânicos para produzir tolerância ao estresse de seca.
[0075] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método para produzir uma planta tolerante ao estresse de seca ou organismo fotossintético (primeiro método) que compreende:
[0076] aplicação de pelo menos um tratamento de uma quantidade eficaz de N-trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina di-hidratado, um derivado químico de TMAO ou análogo químico de TMAO para uma planta, parte da planta, semente ou organismo fotossintético; e crescendo dita planta, parte da planta, organismo fotossintético ou semente, em que uma planta tolerante ao estresse da seca ou organismo fotossintético é produzido.
[0077] Tal como aqui utilizado, o termo "estresse à seca" é utilizado de forma intercambiável com o estresse à água. O termo "estresse à seca" tal como aqui utilizado pode ser induzido nas plantas sob condições onde a redução do teor de água no solo, devido a uma falta de chuva ou irrigação, leva a absorção de água prejudicada ou reduzida pela planta ou organismo fotossintético. O estresse hídrico pode desencadear em plantas uma deterioração das funções fisiológicas das células, conduzindo assim a várias desordens. Embora as condições que induzem estresse hídrico podem variar dependendo do tipo de solo em que as plantas são cultivadas, os exemplos de condições incluem, mas não estão limitados a: a redução do teor de água no solo, de 15% em peso ou menos, mais severamente 10% em peso ou menos, e ainda mais severamente 7,5% em peso ou menos; ou o valor de pF do solo de 2,3 ou mais, mais severamente 2,7 ou mais, e ainda mais severamente 3,0 ou mais.
[0078] Como apresentado acima, uma modalidade da presente invenção proporciona um ou mais métodos para produzir plantas ou organismos fotossintéticos tolerantes ao estresse à água, incluindo mas não se limitando a tolerância à seca ou à umidade excessiva, em plantas, em que uma aplicação de N-óxido de trimetilamina ou "TMAO ", em que TMAO inclui, mas não está limitado a, TMAO di-hidratado, derivado químico de TMAO, ou análogo químico de TMAO, a uma planta ou semente para reduzir o estresse da água na planta quando a planta é exposta a condições de estresse de água. Metilamina adicional (por exemplo, N-óxido de trimetilamina (TMAO)) pode melhorar o dobramento de proteínas e ligação do ligante e combater perturbações por ureia (por exemplo, em elasmobrânquios e rim de mamífero), íons inorgânicos e pressão hidrostática em animais de águas profundas (Yancey, 2005, citado supra).
[0079] Em uma modalidade preferida, o derivado químico de TMAO é N-óxido de N,N-Dimetildecilamina (DDAO). Em uma outra modalidade, o análogo químico de TMAO é um composto N-metilado. Em uma modalidade ainda mais preferida, o composto N-metilado é selecionado a partir do grupo que consiste em carnitina taurina, sarcosina, ácido N-metil aspártico, N-metila.
[0080] O um ou mais métodos de produção de uma planta ou organismo fotossintético tolerante ao estresse de água é aplicável a uma variedade de plantas, incluindo plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas, incluindo, mas não limitado a plantas transgênicas. Tal como aqui utilizado, as plantas transgênicas incluem plantas, ou organismo fotossintético, que foram geneticamente modificados para conter construções de DNA como será discutido mais adiante. Os métodos para a produção de uma planta ou organismo tolerante ao estresse de água podem ser aplicáveis para toda a planta ou organismo ou uma parte de uma planta, por exemplo, em um órgão, tecido, uma célula ou uma parte de uma célula de planta, por exemplo, em uma organela, que compreende a introdução, e que expressa em, a planta ou célula vegetal de um ácido nucleico que codifica uma mono- oxigenase ou proteína FMO, e que medeia um aumento da produção de TMAO endógeno e, consequentemente, uma tolerância ao estresse de água, tal como uma maior tolerância às secas ou um aumento da tolerância à umidade excessiva.
[0081] Uma ou mais modalidades aqui descritas podem fornecer ainda métodos para a produção de uma planta tolerantes a estresse de água ou organismo fotossintético que compreende a aplicação de uma quantidade suficiente eficaz de TMAO a uma planta ou organismo que foi exposto a ou a ser exposto condições de estresse de água.
[0082] Assim, em uma modalidade preferida, o primeiro método para a produção de uma planta tolerante ao estresse da seca ou organismo fotossintético compreende ainda aplicar pelo menos um segundo tratamento de uma quantidade eficaz de TMAO, TMAO di-hidratado, um derivado químico de TMAO ou um análogo químico de TMAO a dita planta ou organismo fotossintético tolerante a estresse hídrico, previamente tratados com TMAO.
[0083] Este método pode incluir ainda uma aplicação de tratamento de sementes, um tratamento de pulverização ou tratamento de uma irrigação do TMAO. Em uma modalidade preferida, o pelo menos um tratamento de uma quantidade eficaz de TMAO é um tratamento de semente. Como um exemplo de uma quantidade eficaz o tratamento de sementes TMAO pode incluir um tratamento de sementes de TMAO em uma quantidade compreendida entre 0,1 e 1000 g por 100 kg de sementes, de 0,1 a 1000 g por 100 kg de sementes, ou entre 0,1 e 100 g por 100 kg de sementes, 0,1 a 10 g por 100 kg de sementes ou de 0,1 g a 5 g por 100 kg de sementes.
[0084] Em uma modalidade mais preferida, a dita quantidade eficaz de TMAO no tratamento de sementes é entre 0,1 g até 1000 g por kg de sementes. Em uma outra modalidade preferida, a dita quantidade eficaz de TMAO no tratamento de sementes é entre 1 e 100 g por kg de sementes. Em uma outra modalidade preferida, a dita quantidade eficaz de TMAO no tratamento de sementes é entre 1 e 100 g por kg de semente, entre 0,1 a 10 g por kg de sementes ou de 0,1 g a 5 g por kg de sementes
[0085] Em uma outra modalidade preferida, o pelo menos, um tratamento da dita quantidade eficaz de TMAO é um tratamento de irrigação ou um tratamento por pulverização. Em uma modalidade preferida, a quantidade eficaz do dito TMAO é entre 0,01 até 10000 g de por litro para o dito tratamento de irrigação ou tratamento por pulverização. Em uma outra modalidade preferida, a quantidade eficaz do dito TMAO é de 0,1 a 10 gramas por litro para o dito tratamento de irrigação ou tratamento por pulverização. Em uma outra modalidade, a quantidade eficaz é de 0,1 a 5 g por litro para o dito tratamento de irrigação.
[0086] Em uma outra modalidade, a pelo menos um tratamento da dita quantidade eficaz de TMAO nos métodos da invenção compreende dois ou mais compostos diferentes selecionados do grupo que consiste de TMAO, TMAO di- hidratado, um derivado químico do TMAO, tal como N-óxido de N,N-Dimetildecilamina (DDAO), ou um análogo químico de TMAO, tal como um composto N-metilado, tal como carnitina, sarcosina, ácido aspártico N-metil, N-metil taurina dos mesmos.
[0087] O uso de TMAO, TMAO di-hidratado, um análogo químico ou derivado de TMAO e os seus sais agricolamente aceitáveis, em que sais agricolamente aceitáveis podem incluir, mas não está limitado a uma mistura de fosfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato de potássio e nitrato de cálcio em uma proporção 2-2-1-1 para redução de estresse hídrico em uma planta.
[0088] Em uma outra modalidade, a dita planta ou organismo fotossintético tolerante ao estresse de água tem uma produção de biomassa, de sementes ou frutos, que é de 6%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, incluindo ou mais do que a biomassa, sementes e frutos, produção de plantas estressadas de água ou organismos fotossintéticos, onde uma quantidade eficaz de TMAO não foi aplicada à planta ou organismo fotossintético estressado não-tolerante. Em modalidades preferidas, a produção de biomassa, de sementes ou de frutas é entre 6% e 30% ou mais, entre 31% e 50% ou mais, entre 51% e 70% ou mais, entre 71% e 100% ou mais de uma biomassa, de frutos ou sementes de produção de plantas estressadas ou organismos fotossintéticos, onde não tenha sido aplicada uma quantidade eficaz de TMAO à planta não tolerante ou organismo fotossintético. A descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo especificamente divulgadas todos os possíveis sub-intervalos, bem como valores numéricos individuais dentro dessa faixa.
[0089] A produção de biomassa, frutos ou sementes pode ser medida por qualquer método conhecido na arte.
[0090] O estresse hídrico em plantas produzidas utilizando os métodos da invenção pode ser reconhecido ou identificado por comparação de uma alteração no fenótipo da planta descritos em mais detalhe a seguir entre as plantas que tenham sido expostas a condições de estresse hídrico e plantas que não foram expostas às mesmas condições estresse hídrico. O estresse hídrico em uma planta ou organismo fotossintético pode ser indicado por uma mudança em um ou mais dos seguintes fenótipos das plantas, o que podem servir como indicadores do estresse hídrico em plantas: (1) a percentagem de germinação, (2) taxa de estabelecimento de plântulas, (3) o número de folhas saudáveis, (4) o comprimento da planta, (5) peso da planta, (6) de área foliar, (7) a cor da folha, (8) o número ou o peso de sementes ou frutos (9), qualidade das colheitas, (10) taxa de definição flor ou taxa de produção de frutos (11), rendimento de fluorescência da clorofila (12), teor de água, temperatura da superfície da folha (13), e capacidade de transpiração (14).
[0091] O estresse hídrico pode ser quantificado como a "intensidade de estresse" onde a intensidade do estresse é representada como se segue: "A intensidade do estresse" = 100 x "qualquer um de fenótipos das plantas em plantas que não foram expostas ao estresse hídrico"/"o fenótipo de planta em plantas que tenham sido expostas à água ".
[0092] Os métodos aqui descritos são aplicados a plantas que tenham sido expostas a ou serão expostas a condições de estresse de água, cuja intensidade de estresse representada pela equação acima é 105-450, preferivelmente 110-200 e mais preferivelmente 115-160. A descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo especificamente divulgadas todas as possíveis sub-faixas, bem como valores numéricos individuais dentro dessa faixa. Em uma planta exposta a condições de estresse hídrico, uma influência pode ser reconhecida em, pelo menos, um dos fenótipos acima. Isto é, observada como: (1) diminuição na percentagem de germinação, (2) redução da taxa de estabelecimento de plântulas, (3) diminuição do número de folhas saudáveis, (4) diminuição do comprimento da planta, (5) diminuição de peso da planta, (6) diminuição na taxa de aumento de área foliar, (7) o desbotamento da cor da folha, (8) diminuição em número ou em peso de sementes ou frutos (9), a deterioração da qualidade das colheitas (10), diminuição na taxa de definição flor ou taxa de produção de frutos, (11) diminuição no rendimento de fluorescência da clorofila, (12) diminuição em termos de conteúdo de água, (13) aumento em temperatura da superfície da folha, ou (14) diminuição da capacidade de transpiração, entre outros, e a magnitude do estresse da água em que a planta pode ser medida utilizando isso como um indicador.
[0093] Os métodos aqui descritos são dirigidos a métodos para reduzir o estresse da água em uma planta ou organismo de produção de uma planta ou organismo tolerante ao estresse de água através da aplicação de ao TMAO à planta que tenha sido exposta ou vai ser exposta a condições de estresse de água. O efeito de reduzir o estresse da água de uma planta pode ser avaliado comparando os indicadores fenotípicos acima entre uma planta tratada com TMAO e uma planta que não tenha sido tratada com TMAO depois de as plantas ou organismos estarem expostos a condições de estresse de água. Estágios em que as plantas ou organismos tratados com TMAO podem ser expostos a condições de estresse hídrico incluem todas as fases de crescimento de plantas, incluindo um período de germinação, um período de crescimento vegetativo, um período de crescimento reprodutivo e um período de colheita. O período de aplicação do TMAO como aqui utilizado pode ser qualquer fase de crescimento de plantas ou organismos, e os seus exemplos incluem o período de germinação, tal como antes da semeadura, o tempo de semeadura e após semeadura e antes ou após a emergência; o período de crescimento vegetativo, tal como no tempo de elevação de plântulas, no momento da transplantação de plântulas, no momento do corte ou colagem, ou no momento da plantação após crescimento assentado; o período de crescimento reprodutivo, como antes de florescer, durante a floração, após a floração, imediatamente antes da marca auricular ou durante o período de formação da marca auricular; e o período de colheita, como antes plano de colheita, antes de plano de maturação, ou um período de iniciação de coloração das frutas. Plantas nas quais TMAO deve ser aplicada podem ser plantas que foram expostas ou serão expostas às condições de estresse hídrico. Isto é, o composto também pode ser aplicado a plantas preventivamente antes de serem expostas às condições de estresse de água, além de plantas que tenham sido expostas a condições de estresse de água.
[0094] Em uma outra modalidade preferida, o método da invenção também compreende a aplicação de sais ou qualquer outro aditivo para a dita planta, parte da planta, organismo fotossintético ou sementes e crescimento da dita planta, parte da planta, organismo fotossintético ou semente, em que uma planta tolerante a seca ou organismo fotossintético é produzida.
[0095] O TMAO utilizado nos métodos aqui descritos podem ser utilizados sozinhos, ou em combinação com diversos ingredientes inertes, tais como veículos sólidos, veículos líquidos, tensoativos e como descrito a seguir.
[0096] Os exemplos de um veículo sólido utilizado na formulação com TMAO podem incluir pós, pós finos ou grânulos, tais como minerais, tais como argila de caulino, argila de atapulgita, bentonita, montmorilonita, argila branca ácida, pirofilita, conto, terra de diatomáceas e calcita; materiais orgânicos naturais, como pó raque de milho e pó de casca de noz; materiais orgânicos sintéticos, tais como ureia; sais, tais como carbonato de cálcio e sulfato de amônio; e materiais inorgânicos sintéticos, tais como óxido de silício hidratado sintético.
[0097] Os exemplos de um veículo líquido podem incluir hidrocarbonetos aromáticos tais como xileno, alquilbenzeno e metilnaftaleno; álcoois, tais como 2-5 propanol, etilenoglicol, propilenoglicol, e éter monoetílico de etileno-glicol; cetonas, tais como acetona, ciclo- hexanona e isoforona; óleo vegetal tal como óleo de soja e óleo de semente de algodão; e hidrocarbonetos de petróleo alifáticos, ésteres, dimetilsulfóxido, acetonitrila e água.
[0098] Exemplos de um agente tensoativo incluem tensoativos aniônicos tais como sais de éstr sulfonato de alquila, sais de sulfonato de alquilarila, sais de sulfosucinato de dialquila, sais de éter fosfato éter aril alquil polioxietileno, sais de lignosulfonato e policondensados de formaldeído de sulfonato de naftaleno; e tensoativos não iônicos tais como éteres de alquil aril polioxietileno, copolímeros de bloco de polioxietileno alquilpolioxipropileno e ésteres de ácidos graxos de sorbitano; e tensoativos catiônicos tais como sais de alquiltrimetilamônio.
[0099] Exemplos de outros agentes auxiliares de formulação incluem polímeros solúveis em água tais como álcool polivinílico e polivinilpirrolidona, polissacarídeos tais como goma arábica, ácido algínico e o seu sal, a CMC (carboximetilcelulose), goma xantana, materiais inorgânicos tais como silicato de alumínio e magnésio e sol de alumina, conservantes, agentes corantes e agentes de estabilização tais como PAP (fosfato de ácido isopropílico) e hidroxitolueno butilado (BHT).
[0100] Os métodos para a produção de uma planta ou organismo fotossintético tolerante ao estresse de água como aqui descrito, podem ser realizados por aplicação de uma quantidade eficaz do TMAO em plantas ou locais crescendo plantas. Tal como aqui utilizado uma quantidade eficaz de TMAO podem incluir uma faixa de 0,1 a 1,000 g por litro por 1-10 kg de sementes. Quando incorporado em todo o solo, de uma quantidade eficaz de TMAO pode variar de 0,1 a 1,000 g, ou 1 a 500 g por 1.000 m2 de solo. Quando o tratamento com TMAO é usado como uma emulsão, um pó molhável, um agente escoável, ou uma microcápsula podem ser utilizados para o tratamento por pulverização da planta, após a diluição com água. Neste caso, a concentração do TMAO pode variar de 0,01 a 10000 ppm, ou desde 1 a 5000 ppm. Uma formulação em pó e um grânulo de TMAO podem ser utilizados para o tratamento de estresse hídrico sem diluição do TMAO. No tratamento das sementes ou o tratamento de bulbos, um exemplo do peso da TMAO por 100 kg de sementes pode variar de 0,1 a 1000 g, assim como de 1 a 30 g. Exemplos das sementes ou bulbos utilizados nos métodos aqui descritos incluem os que possuem um peso de 100 g ou menos, incluindo 20 g ou menos, de 0,5 g ou menos, bem como de 50 mg ou menos. No tratamento de sementes, um exemplo do peso da TMAO por muda pode variar de 0,01 a 20 mg, incluindo de 0,5 a 8 mg. No tratamento do solo, antes ou depois do semeio de mudas, o peso do TMAO por 1,000 m2 podem variar de 0,1 a 1000 g, incluindo de 10 a 100 g.
[0101] TMAO pode ser aplicada a uma variedade de plantas em várias formas ou locais, tais como a folha, botões, flores, frutos, orelhas ou espigas, sementes, bulbos, tubérculos do caule, raízes e plântulas. Como aqui usado, bulbos significa caule discóide, rizomas, tubérculos de raiz, e rizóforos. Na presente especificação, TMAO também pode ser aplicado a cortes e estacas de caule de cana de açúcar.
[0102] Os seguintes são exemplos de locais de crescimento de plantas incluem solo antes ou após a semeadura de plantas. Quando o TMAO é aplicado às plantas e locais de crescimento das plantas, o TMAO é aplicado às plantas alvo uma vez ou mais. TMAO pode ser aplicado como um tratamento à folhagem, órgãos florais ou orelhas ou picos de plantas, tais como a pulverização da folhagem; tratamento de sementes, tais como a esterilização de sementes, imersão de sementes ou revestimento de sementes; tratamento de plântulas; tratamento de bulbos; e tratamento de terras de cultivo de plantas, tais como o tratamento do solo. O TMAO só pode ser aplicado a locais específicos de plantas, tais como órgão floral na época de floração incluindo antes de florescer, durante a floração e após a floração, e o auricular ou espiga na temporada de auricular, ou pode ser aplicada às plantas inteiras.
[0103] TMAO pode ser aplicado como um tratamento de solo sob a forma de pulverização sobre o solo, a incorporação no solo, e a perfusão de um líquido químico no solo (irrigação de líquido químico, injeção de solo, e o gotejamento de líquido químico). A colocação de TMAO durante o tratamento do solo inclui, mas não se limita a cova de plantio, sulco, em torno de um buraco de plantio, em torno de um sulco, toda a superfície das terras de cultivo, as peças entre o solo e a planta, a área entre as raízes, a área sob o tronco, sulco principal, caixa de crescimento, tabuleiro de germinação sensibilização e semeio, a criação de mudas. O tratamento do solo com TMAO pode ser antes da semeadura, no momento da semeadura, imediatamente após a semeadura, período de levante, antes do período de assentamento, no momento da plantação constante, e período de crescimento após plantação assentada.
[0104] Ao aplicar TMAO como um tratamento do solo, dois ou mais tipos de TMAOs podem ser aplicados simultaneamente com a planta, por exemplo, TMAO e TMAO di- hidratado, ou TMAO di-hidratado e um óxido de aril amina, ou um fertilizante sólido, tal como uma pasta de fertilizante contendo o TMAO pode ser aplicada ao solo. TMAO pode ser misturado em um líquido de irrigação, e, os seus exemplos incluem a injeção de instalações de irrigação (tubo de irrigação, canos de irrigação, aspersor, etc.), a mistura para o líquido entre os sulcos de inundações, misturando em um meio hidropônico e semelhantes.
[0105] Alternativamente, um líquido de irrigação pode ser misturado com o TMAO antecipadamente e, por exemplo, usado para o tratamento através de um método de irrigação apropriado, incluindo o método de irrigação mencionado acima e outros métodos, tais como aspersão e inundações. TMAO também pode ser aplicado por enrolamento de uma cultura com uma formulação de resina processada para formar uma folha ou uma corda, colocando uma série de formulação de resina em torno de uma cultura de modo a que a cultura seja rodeada pela cadeia, e/ou assentando uma folha de formulação de resina na superfície do solo perto da raiz de uma cultura.
[0106] Em uma outra modalidade, TMAO pode ser utilizado para o tratamento de sementes ou bulbos, bem como um tratamento por pulverização de TMAO para sementes em que uma suspensão de TMAO é atomizada e pulverizada sobre uma superfície de sementes ou superfície de bulbo. Um tratamento de manchas também pode ser utilizado em que um pó molhável, uma emulsão ou um agente escoável do TMAO é aplicado a sementes ou bulbos com uma pequena quantidade de água adicionada ou aplicada como é, sem diluição. Além disso, um tratamento de imersão pode ser utilizado no qual as sementes são imersas em uma solução do TMAO durante um certo período de tempo, o tratamento de revestimento com película, e tratamento de revestimento de pelotas.
[0107] TMAO pode ser utilizado para o tratamento das plântulas, incluindo tratamento por pulverização compreendendo pulverização das plântulas inteiras com uma diluição adequada com uma concentração de ingredientes ativos preparados diluindo o TMAO com água. Tal como acontece com o tratamento de sementes, um tratamento de imersão pode também ser utilizado compreendido de imersão de mudas na diluição, e tratamento de revestimento aderindo o TMAO formulado em uma formulação em pó para todas as mudas.
[0108] TMAO pode ser tratado para o solo antes ou depois das mudas incluindo a pulverização de uma diluição adequada com uma concentração de ingredientes ativos preparados diluindo TMAO com água e a aplicando a mistura de mudas ou o solo em torno plântulas após as mudas semearem. Pode também ser utilizado um tratamento de pulverização de TMAO formulado em uma formulação sólida tal como um grânulo para o solo em torno de mudas em mudas semeadas.
[0109] TMAO pode ser utilizado para o tratamento de hidropônicos. Exemplos podem incluir uma solução ou suspensão TMAO em um meio de cultura convencional utilizado para hidropônicos, a uma concentração dentro de uma faixa de 0,0001 a 10g/litro.
[0110] TMAO pode ser utilizado no momento da cultura de tecidos ou cultura de células de uma planta para promover a tolerância para estresse a água. TMAO pode ser dissolvido ou suspenso em um meio de cultura convencional utilizado para a cultura de tecidos de plantas ou outros organismos, tais como um meio de cultura Murashige e Skoog ("MS"). Os exemplos podem incluir uma concentração dentro de um intervalo entre 0,0001 e 10 g/litro. Neste caso, de acordo com um método usual, sacarídeos como fonte de carbono, vários fito-hormônios e semelhantes podem ser adicionados apropriadamente.
[0111] Em uma modalidade preferida, o método para produzir uma planta tolerante à seca compreende uma primeira etapa em que a planta é pulverizada com uma solução contendo N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina di-hidratado, um derivado químico de TMAO ou um análogo químico de TMAO seguido de irrigação com uma solução contendo N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina di-hidratado, um derivado químico de TMAO ou um análogo químico de TMAO. Em uma modalidade preferida, o tratamento de pulverização inicial é realizado com uma solução contendo uma quantidade eficaz de TMAO que é entre 0,01 até 10000 g de por litro, mais preferencialmente entre 0,1 e 1000 g por litro, entre 0,1 a 100 g por litro, entre 0,1 e 10 g por litro, entre 0,1 g e 5 g por litro para o dito tratamento por pulverização. Em uma outra modalidade, o tratamento de irrigação é realizado com uma solução contendo uma quantidade eficaz de TMAO que é entre 0,01 até 10000 g de por litro, mais preferencialmente entre 0,1 e 1000 g por litro, entre 0,1 a 100 g por litro, entre 0,1 e 10 g por litro, entre 0,1 g e 5 g por litro para o dito tratamento de irrigação.
[0112] Em uma modalidade preferida, o método para produzir uma planta tolerante a seca compreende uma primeira etapa em que a semente é tratada com uma solução contendo N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina di-hidratado, um derivado químico de TMAO ou um análogo químico de TMAO seguido de irrigação ou pulverização da planta com uma solução contendo N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina di-hidratado, um derivado químico de TMAO ou análogo químico de TMAO. Em uma modalidade preferida, o tratamento inicial da semente é realizado com uma quantidade eficaz de TMAO que é entre 0,0110.000 g por kg de semente, mais preferencialmente entre 0,1 e 1000 g por kg de semente, entre 0,1 a 100 g por kg de sementes, entre 0,1 e 10 g por kg de sementes ou entre 0,1 g e 5 g por kg de sementes. Em uma outra modalidade, o tratamento de irrigação é realizado com uma solução contendo uma quantidade eficaz de TMAO que é entre 0,01 até 10000 g de por litro, mais preferencialmente entre 0,1 e 1000 g por litro, entre 0,1 a 100 g por litro, entre 0,1 e 10 g por litro, entre 0,1 g e 5 g por litro para o dito tratamento de irrigação.
[0113] Uma variedade de sementes ou bulbos podem ser usadas nos métodos aqui descritos, incluindo, mas não estão limitadas a plantas nas famílias Solanaceae e Cucurbitaceae, bem como plantas selecionadas a partir dos gêneros de plantas Calibrachoa, Capsicum, Nicotiana, Nierembergia, Petúnia, Solário, Cucurbita, Cucumis, Citrullus, Glycine, como Glycine max (soja), Calibrachoa x hybrida, Capsicum annuum (pimenta), Nicotiana tabacum (tabaco), Nierenbergia scoparia (nierembergia), Petunia xhybrida, Solanum lycopersicum (tomate), Solanum tuberosum (batata), Solanum melongena (berinjela), Cucurbita maxima (polpa), Cucurbita pepo (abóbora, abobrinha), Cucumis metuliferus (pepino africano) Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino) e Citrullus lanatus (melancia). Várias plantas monocotiledôneas, em particular as que pertencem à família das Poaceae, podem ser usadas com os métodos aqui descritos, incluindo, mas não limitado a, plantas selecionadas a partir dos gêneros de plantas Hordeum, Avena, Secale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum, Oryza , Hordeum vulgare (cevada), Triticum aestivum (trigo), Triticum aestivum subsp. spelta (spelt), Triticale, Avena sativa (aveia), Secale cereale (centeio), Sorghum bicolor (sorgo), Zea mays (milho), Saccharum officinarum (cana de açúcar) e Oryza sativa (arroz). Exemplos adicionais de plantas nas quais o estresse de água pode ser produzido usando os métodos aqui descritos incluem os seguintes. culturas: trigo mourisco, beterraba, canola, colza, girassol, cana-de- açúcar, tabaco e ervilha, etc .; legumes: legumes solanáceos como o colorau e batata; vegetais cucurbitáceos; vegetais crucíferos, como rabanete japonês, nabo branco, rábano, couve-rábano, couve chinesa, couve, mostarda folha, brócolis e couve-flor, legumes Asteraceae como bardana, coroa margarida, alcachofra, e alface; vegetais liliaceous como cebolinha, cebola, alho e espargos; vegetais amiáceos tais como cenoura, salsa, aipo e pastinaga; vegetais quenopodiáceos, como espinafre, acelga; vegetais lamiáceos como frutescens Perilla, hortelã, manjericão; morango, batata-doce, Dioscorea japonica, colocasia; flores; folhagem de plantas; gramíneas; frutas: pomáceas (maçã, pêra, pêra japonesa, marmelo chinês, Marmelo, etc.), frutos de pedra carnudos (pêssego, ameixa, nectarina, damasqueiro da china, fruto cereja, damasco, ameixa seca, etc.), frutas cítricas (trapoeraba , laranja, tangerina, limão, lima, toranja, etc.), nozes (castanhas, nozes, avelãs, amêndoas, pistache, castanha de caju, macadâmia, etc.), bagas (mirtilo, oxicoco, amora, framboesa, etc.) , uva, fruta caqui, azeitona, ameixa japonesa, banana, café, palma, coco, etc.; e outros do que as árvores de fruto; chá, amoreira, planta de florescência, árvores na estrada (cinzas, vidoeiro, cornizo, Eucalyptus, Ginkgo biloba, lilás, bordo, Quercus, álamo, árvore de Judas, Liquidambar formosana, plátano, zelkova, arborvitae japonês, madeira abeta, cicuta, zimbro, Pinus, Picea, e Taxus cuspidata). Exemplos de plantas em que tolerância ao estresse de água podem ser produzidas podem incluem arroz, milho, canola, soja e trigo. As "plantas" acima mencionadas incluem plantas transgênicas, expressando outras características genéticas.
[0114] Tal como aqui utilizado, "plantas" significa todas as plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas, incluindo, mas não está limitado a plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas anuais e perenes e inclui a título de exemplo, mas não por limitação, os do gênero Glicina, Vitis, espargos, Populus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Saccharum e Lycopersicum. O termo planta pode também incluir, mas não se limitando à classe do Liliatae (Monocotyledoneae ou plantas monocotiledôneas). O termo inclui as plantas maduras, sementes, brotos e mudas, e peças, material de propagação, órgãos vegetais, tecidos, protoplastos, calos e outras culturas, para culturas de exemplo de células derivadas do acima exposto, e todos os outros tipos de associações de células vegetais que dar unidades funcionais ou estruturais. "As plantas maduras", significam plantas em qualquer estágio de desenvolvimento além do estágio de plântula. Mudas significam uma planta jovem, imaturo em um estágio inicial de desenvolvimento.
[0115] Plantas dicotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às plantas maduras, sementes, brotos e plântulas, e suas partes, materiais de propagação, órgãos de plantas, tecidos, protoplastos, calos e outras culturas, para as culturas exemplo de células derivadas a partir do acima, e todos os outros tipos de associações de células de plantas que dão unidades funcionais ou estruturais. As plantas maduras significam plantas em qualquer estágio de desenvolvimento além do estágio de plântula. Mudas significam uma planta jovem, imatura em um estágio de desenvolvimento mais cedo.
[0116] Como aqui utilizado, "organismos fotossintéticos" podem incluir, mas não estão limitados a organismos, tais como Arthrospira spp., Spirulina spp., Synechococcus elongatus, Synechococcus sp., Synechosystis spp., Synechosystis spp., E Spirulina plantensis, Calothrix spp., Flos Anabaena -aquae, Aphanizomenon spp., Anabaena spp., Gleotrichia spp., Oscillatoria spp. e Nostoc sp .; algas unicelulares eucarióticas, tais como, mas não se limitando a Chaetoceros spp., Chlamydomonas reinhardtii, Chlamydomonas spp., Chlorella vulgaris, Chlorella spp., Cyclotella spp., Didymosphenia spp., Dunaliella tertiolecta, Dunaliella spp., Botryococcus braunii, Botryococcus spp., Gelidium spp., Gracilaria spp., Hantzschia spp., Hematococcus spp., Isochrysis spp., Laminaria spp., Nannochloropsis spp., Navicula spp., Nereocystis luetkeana, Pleurochrysis spp., palmaeformis Postelsia, e Sargassum spp.
[0117] Em uma outra modalidade, um ou mais métodos são proporcionados para a produção de um produto aqui descrito pode compreender: a) o crescimento das plantas aqui descrito ou obtenível pelos métodos aqui descritos e b) produzir o produto a partir de ou pelas plantas da invenção e/ou partes, p.ex. sementes, destas plantas.
[0118] Assim, em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma semente de planta tratada com uma quantidade eficaz de N-óxido de trimetilamina (TMAO), N-óxido de trimetilamina di-hidratado, um derivado químico do TMAO, um derivado químico do TMAO, tal como N-óxido de N,N - Dimetildecilamina (DDAO), ou um análogo químico de TMAO, tal como um composto N-metilado, tal como carnitina, sarcosina, ácido aspártico N-metil, N-metil taurina dos mesmos.
[0119] Em uma modalidade preferida, a semente de planta é tratada com uma quantidade eficaz do dito TMAO entre 0,1-1,000 g por kg de sementes, de preferência entre 0,1 a 100 g por kg de sementes, de um modo mais preferido de 0,1 a 10 g por kg de sementes e ainda mais preferivelmente de 0,1 a 5 g por kg de sementes.
[0120] A descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo especificamente divulgadas todas as possíveis sub-faixas, bem como valores numéricos individuais dentro dessa faixa.
[0121] Em uma outra modalidade, o método pode compreender os passos a) o crescimento das plantas da invenção, b) remoção das partes que podem ser abatidas como definido acima das plantas e c) a produção do produto a partir de ou pelas partes da planta ou organismo.
[0122] Assim, em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma planta tolerante a estresse de água produzida pelo crescimento da semente de planta da invenção.
[0123] As plantas ou organismos tolerantes ao estresse hídrico podem ser produzidas no local onde a planta foi cultivada, as plantas e/ou partes dos mesmos, podem ser removidas do local onde as plantas foram cultivadas para produzir o produto. Tipicamente, a planta é cultivada, as partes podem ser abatidas desejadas são removidas da planta, se possível, em ciclos repetidos, e o produto produzido a partir das partes que podem ser abatidas da planta. O passo de crescimento da planta pode ser realizado apenas uma vez cada vez que os métodos da invenção são realizados, ao mesmo tempo permitindo repetidas vezes os passos de produção do produto, por exemplo, por remoção repetida de partes das plantas que podem ser abatidas da invenção e, se necessário posterior processamento dessas peças para chegar ao produto. É também possível que o passo de cultivar as plantas da invenção é repetido e plantas ou partes que podem ser abatidas são armazenadas até que a produção do produto seja então executada uma vez para as plantas ou partes de plantas acumuladas. Além disso, as etapas de cultivo das plantas e a produção do produto pode ser realizada com uma sobreposição no tempo, até mesmo simultaneamente a uma grande extensão ou sequencialmente. Geralmente, as plantas são cultivadas durante algum tempo antes que o produto seja produzido.
[0124] Em um outro aspecto, a invenção refere- se a uma planta tolerante a estresse de água produzida através da aplicação de pelo menos um tratamento de uma quantidade eficaz de TMAO a uma planta, parte da planta, semente ou organismo fotossintético.
[0125] Em uma modalidade preferida, a planta de estresse de água da invenção tem uma produção de sementes de plantas que é de 6% ou mais do que a biomassa, de frutos ou sementes de plantas estressadas hídrica não tolerantes, onde uma quantidade eficaz de TMAO não foi aplicada. Em uma outra modalidade preferida, a planta estressada hídrica tem uma produção de biomassa de plantas, frutos ou sementes que é 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140), 150%, incluindo ou mais do que a produção de biomassa, frutos ou sementes de plantas estressadas com água não-tolerantes ou organismos fotossintéticos onde não tenha sido aplicada uma quantidade eficaz de TMAO.
[0126] Em uma modalidade preferida, a produção de sementes é de 6% e 30% ou mais, entre 31% e 50% ou mais, entre 51% e 70% ou mais, entre 71% e 100% ou mais do que o a produção de sementes de plantas ou organismos fotossintéticos estressados a água não tolerantes, onde não foi aplicada uma quantidade eficaz de TMAO.
[0127] Em uma outra modalidade a planta tolerante estresse de água produzida através da aplicação de pelo menos um tratamento de uma quantidade eficaz de TMAO a uma planta, parte da planta, organismo fotossintético e, pelo menos, um segundo tratamento de uma quantidade eficaz de TMAO é aplicada a dita planta ou organismo fotossintético tolerante ao estresse com água.
[0128] Em uma outra modalidade preferida da planta tolerante ao estresse hídrico da invenção, o dito, pelo menos, um tratamento da dita quantidade eficaz de TMAO compreende dois ou mais compostos diferentes selecionados do grupo que consiste de TMAO di-hidratado, derivado químico de TMAO, ou um análogo químico de TMAO.
[0129] Em uma outra modalidade preferida, a planta tolerante a estresse de água da invenção é produzida por um tratamento posterior de sais ou qualquer outro aditivo a uma planta, parte da planta, organismo fotossintético ou de sementes e crescimento da dita planta, parte da planta, organismo fotossintético ou semente, em que uma planta tolerante ao estresse hídrico ou organismo fotossintético é produzido.
[0130] Em uma outra modalidade os produtos produzidos pelos processos aqui descritos são produtos vegetais, tais como, mas não limitado a um produto alimentar, ração, um suplemento alimentar, suplemento alimentar, fibras, cosmética e/ou farmacêutica. Os gêneros alimentícios são considerados como composições utilizadas para a nutrição e/ou como complemento nutricional. Alimentos para animais e suplementos para alimentação animal, em particular, são considerados como produtos alimentares.
[0131] Em outra modalidade, os métodos para a produção são usados para fazer produtos agrícolas, tais como, mas não limitados a extratos de plantas, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas, e outros semelhantes. Tenha em atenção que é possível que um produto vegetal ser constituído por um ou mais produtos agrícolas, em grande medida.
[0132] Uma ou mais modalidades descritas na presente invenção incluem métodos para a produção de plantas transgênicas ou organismos fotossintéticos tolerantes ao estresse de água, que incluem, mas não estão limitados a introdução de forma estável de um construto para a planta ou organismo fotossintético, onde o construto inclui um gene ou genes, tais como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 que codifica uma proteína mono-oxigenase ou proteína FMO, tais como a proteína FMO GS-OX5. A sobre-expressão, quer constitutiva ou induzida por estresse, da proteína mono-oxigenase medeia um aumento na expressão de TMAO em uma planta ou organismo fotossintético através da catalisação da oxidação de metabólitos endógenos, contendo nitrogênio nucleofílico. Modalidades adicionais podem compreender uma planta transgênica ou organismo que sobre-expressa um gene tolerante a estresse hídrico, tal como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 que codifica uma proteína de FMO, em que o gene está operacionalmente ligado a um promotor constitutivo ou um promotor indutível a estresse e foi estavelmente integrado no genoma da planta ou do organismo sob condições adequadas para a sobre-expressão de uma proteína de tolerância ao estresse de água.
[0133] Em uma outra modalidade, um método é aqui proporcionado para a produção de uma planta ou organismo fotossintético, com uma tolerância ao estresse de água, tal como uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, que compreende introduzir e sobre-expressar na planta ou organismo fotossintético um ácido nucleico ou aminoácidos, tais como SEQ ID nO: 1 ou SEQ ID nO: 2, que codifica para uma proteína mono-oxigenase, tal como a proteína FMO GS-OX5.
[0134] Uma modalidade da presente invenção pode compreender uma planta tolerante ao estresse hídrico ou organismo fotossintético, em que planta tolerante a estresse hídrico ou organismo fotossintético sobre-expressa proteínas FMO no genoma nuclear de organismo fotossintético ou planta ou o genoma de cloroplasto de planta.
[0135] Assim, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta tolerante a estresse hídrico, em que o método compreende a transformação de uma planta com uma sequência que codifica uma proteína FMO operativamente ligada a um promotor, sob condições adequadas para a sobre- expressão da proteína FMO na planta de pelo menos três vezes em relação ao nível de expressão da proteína endógena FMO, em que a sobre-expressão da sequência codificando proteína FMO na dita planta tolerante a estresse hídrico catalisa a oxidação de metabólitos endógenos, contendo nitrogênio nucleofílico.
[0136] Em uma modalidade preferida, a sequência de codificação da proteína FMO codifica uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0137] Em uma outra modalidade preferida, o promotor é um promotor constitutivo. Em uma outra modalidade preferida, a sobre-expressão da sequência de codificação de proteína FMO é a sobre-expressão constitutiva. Em uma modalidade preferida, a proteína FMO é sobre-expressa, pelo menos, 8 vezes em relação aos níveis de expressão da proteína de FMO endógeno de.
[0138] Em uma outra modalidade preferida, o promotor é um promotor indutível a estresse, mais preferencialmente, o estresse é estresse hídrico.
[0139] Em uma outra modalidade, a sobre- expressão da sequência de codificação de proteína FMO é induzida por um estresse, de preferência estresse hídrico.
[0140] A sobre-expressão constitutiva ou sobre- expressão induzida por estresse da mono-oxigenase ou proteína FMO medeia uma expressão TMAO aumentada em uma planta ou organismo fotossintético, aumentando a planta ou a tolerância do organismo para diversas formas de estresse de água quando em comparação com plantas de tipo selvagem, de tipo partes de plantas selvagens, organismos fotossintéticos do tipo selvagem ou células vegetais de tipo selvagem. A mono-oxigenase ou proteína FMO pode ser sobre- expressa em planta ou organismo fotossintético, como um todo ou uma parte, é fornecida, por exemplo, em um órgão, tecido, uma célula, ou de uma parte de uma célula de planta, por exemplo, em uma organela. A proteína mono-oxigenase compreende uma sequência que codifica aminoácidos possuindo identidade de pelo menos 80% com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 43, e/ou a região 5 'não traduzida (5'UTR). A sobre-expressão da proteína medeia um aumento da expressão de TMAO em um organismo ou planta fotossintética, aumenta a tolerância das plantas ou do organismo a diversas formas de estresse hídrico, quando em comparação com plantas de tipo selvagem. A título de exemplo, proteínas FMO1 e FMO3 humanas têm uma identidade de 53% e 84% com as proteínas FMO3 de coelho (ver Lawton et al, 1994, Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 308, 254-257).
[0141] Outras modalidades, como aqui revelado prevêem um construto de DNA compreendendo uma ou mais sequências codificantes de proteínas FMO operativamente ligadas a um promotor constitutivo ou um promotor indutível por estresse, em que as proteínas FMO são integradas de forma estável em uma planta ou genoma de DNA de organismo fotossintético sob condições adequadas para a sobre- expressão do construto de DNA na planta ou organismo fotossintético. O promotor constitutivo ou promotor de estresse indutível no construto de DNA induz a sobre- expressão das proteínas FMO na planta ou organismo fotossintético mediando assim uma expressão TMAO aumentado em uma planta ou organismo fotossintético, aumentando a tolerância do organismo vegetal ou fotossintético para diversas formas de estresse hídrico quando em comparação com plantas de tipo selvagem ou organismos fotossintéticos tipo selvagem.
[0142] Uma modalidade da presente invenção pode compreender construtos de DNA para a sobre-expressão de proteínas FMO nas plantas transgênicas ou organismos fotossintéticos. Tais construtos de DNA podem ser representados como se mostra nas Figuras 4a, 4b, 5a, e 5b.
[0143] Tal como mostrado na Figura 4a, um construto para a sobre-expressão de uma proteína de FMO em uma planta Arabidopsis thaliana é fornecida, onde olhando para a extremidade 5' do construto, uma sequência de codificação promotor constitutivo, tal como PRONOS, é fornecida com um local de início da transcrição. Um marcador selecionável, tal como NPTII é fornecido com uma região de terminação da transcrição, NOS ter na extremidade 3' do marcador selecionável. Um promotor constitutivo, tal como o promotor CaMV35S, (35S) é fornecido com um local de início da transcrição. A sequência de codificação da proteína FMO RCI5 (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) é fornecida com uma região de terminação da transcrição, NOS Ter na extremidade 3' da sequência de codificação de proteína FMO. Cada um destes componentes é operativamente ligado ao lado, isto é, a sequência de codificação do promotor constitutivo, PRONOS, está operacionalmente ligada à extremidade 5' do marcador selecionável, NPTII, sequência da proteína e a sequência de proteína de marcador selecionável está operativamente ligado ao terminal 5' da sequência de codificação do promotor constitutivo CaMv35S que está operativamente ligado à extremidade 5' da sequência de codificação da proteína FMO RCI5. Para a sobre-expressão, pode ser utilizado o vetor de expressão PROK2. O construto de DNA é então integrado em uma planta ou organismo fotossintético, como uma planta Arabidopsis thaliana e os organismos fotossintéticos que sobre-expressam a proteína At FMO GS-OX5 são produzidos, em que o promotor constitutivo induz a sobre-expressão da proteína FMO. A sobre-expressão da sequência de codificação de proteína FMO em planta ou organismo fotossintético catalisa a oxidação de metabólitos endógenos, contendo nitrogênio nucleofílico.
[0144] Como se mostra na Figura 4b, um construto para a sobre-expressão de uma proteína de FMO em uma planta Arabidopsis thaliana é fornecido, onde fixamente na extremidade 5' do construto de uma sequência de promotor, tal como pronos de codificação, é fornecido com um local de início da transcrição. Um marcador selecionável, tal como NPTII é fornecido com uma região de terminação da transcrição, local de NOS sobre a extremidade 3' do marcador selecionável. Um promotor indutível de estresse, tal como o promotor PRORD29A, com um local HindII na extremidade 5’ e local BamHI na extremidade 3', é fornecida com um local de início da transcrição. Sequência de codificação de proteína FMO RCI5 (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) é proporcionada com uma região de terminação da transcrição, local NOS ter sobre a extremidade 3' da sequência de codificação de proteína FMO. Cada um destes componentes é operativamente ligado ao lado, isto é, a sequência do promotor de codificação, pronos, está operacionalmente ligada à extremidade 5 'do marcador selecionável, NPTII, a sequência de codificação da proteína e a sequência da proteína do marcador de codificação selecionável é operativamente ligado à extremidade 5' da sequência de codificação de promotor constitutivo PRORD29A que está operativamente ligada à extremidade 5' da sequência de codificação da proteína RCI5 FMO. Para a sobre-expressão, pode ser utilizado o vetor de expressão PROK2. O construto de DNA é então integrado em uma planta ou organismo fotossintético tal como Arabidopsis thaliana e organismos que sobre-expressam a proteína At FMO GS-OX5 são produzidos, em que o promotor indutível de estresse induz a sobre- expressão da proteína FMO. A sobre-expressão da sequência de codificação da proteína FMO no organismo fotossintético catalisa a oxidação de metabólitos endógenos, contendo nitrogênio nucleofílico.
[0145] Como mostrado na Figura 5A, um construto para a sobre-expressão de uma proteína de FMO em uma planta Zea mays é fornecido, onde olhando para a sequência de codificação 5' de um promotor constitutivo, tal como o promotor da ubiquitina, é fornecido com um local de início da transcrição. Sequência de codificação de proteína FMO SI FMO GX-OX1 (SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26) é proporcionada com uma região de terminação da transcrição, local NOS ter sobre a extremidade 3' da sequência de codificação de proteína FMO. Um promotor constitutivo, tal como o promotor CaMV35S, (35S) é fornecido com um local de início da transcrição. Um marcador selecionável, tal como higromicina é fornecido com uma região de terminação da transcrição, NOS ter na extremidade 3' do marcador selecionável. Cada um destes componentes é operativamente ligado ao lado, isto é, a sequência do promotor constitutivo de codificação, Ubiquitina, está operativamente ligado à extremidade 5' da sequência de codificação proteína FMO ZM FMO, a sequência da proteína FMO codificante está operacionalmente ligada à extremidade 5' final do promotor constitutivo, tal como o promotor CaMv35S, (35S) sequência codificadora que está operacionalmente ligada à extremidade 5' da sequência de codificação de proteína marcadora selecionável. Para a sobre-expressão, pode ser utilizado o vetor de expressão de pCAMBIA 1300. A construto de DNA é então integrado numa planta ou organismo fotossintético, tais como plantas e organismos que sobre-expressam a proteína ZM FMO mays Zea são produzidos, em que o promotor constitutivo induz a sobre- expressão da proteína FMO e a sobre-expressão da sequência de codificação de proteína FMO em organismo fotossintéticao catalisa a oxidação de metabólitos endógenos, contendo nitrogênio nucleofílico.
[0146] Como mostrado na figura 5b, um construto para a sobre-expressão de uma proteína de FMO em uma planta Solanum lycopersicum é fornecido, onde começando de um promotor indutível de estresse 5’, tal como o promotor PRORD29A, é fornecido com um local de início da transcrição. Sequência de codificação de proteína FMO SI FMO GS-OX 1 (SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38) é proporcionada com uma região de terminação da transcrição, local NOS ter sobre a extremidade 3' da proteína de sequência de codificação de FMO. Um promotor constitutivo, tal como o promotor CaMV35S, (35S) é fornecido com um local de início da transcrição. Um marcador selecionável, tal como higromicina é fornecido com uma região de terminação da transcrição, NOS ter na extremidade 3' do marcador selecionável. Cada um destes componentes é operativamente ligado ao lado, isto é, a sequência de promotor de estresse indutível de codificação, promotor PRORD29A, está operacionalmente ligada à extremidade 5' da sequência de codificação da proteína FMO SI FMO GS-oXL, a sequência de codificação da proteína FMO é operativamente ligada à extremidade 5' do promotor constitutivo, tal como o promotor CaMV35S, (35S) sequência codificadora que está operacionalmente ligada à extremidade 5' da sequência de codificação de proteína marcadora selecionável. Para a sobre-expressão, pode ser utilizado o vetor de expressão de pCAMBIA 1300. A construto de DNA é então integrado em um organismo fotossintético, tal como uma planta lycopersicum Solanum e organismos que sobre-expressam a proteína SI FMO GS-OXI são produzidos, em que o promotor indutível de estresse induz a sobre-expressão da proteína FMO e a sobre- expressão da sequência de codificação da proteína FMO no organismo fotossintético catalisa a oxidação de metabólitos endógenos, contendo nitrogênio nucleofílico.
[0147] Uma modalidade da presente invenção pode compreender uma construto de DNA para a sobre-expressão de uma proteína de FMO sequências de codificação em organismos fotossintéticos, em que o construto de DNA compreende um promotor e a sequência de codificação de proteína FMO, em que o dito promotor está operacionalmente ligado à dita proteína FMO sequência de codificação, em que a proteína FMO sequência de codificação é selecionada a partir de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 , SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0148] Tal como aqui usado, "ácidos nucleicos" significa biopolímeros de nucleotídeos que estão ligados entre si através de ligações de fosfodiéster (polinucleotídeos, ácidos polinucleicos). Dependendo do tipo de açúcar nos nucleotídeos (ribose ou desoxirribose), distingue-se as duas classes dos ácidos ribonucleicos (RNA) e os ácidos desoxirribonucleico (DNA).
[0149] Como apresentado acima, uma modalidade da presente invenção proporciona um método para a produção de plantas tolerantes ao estresse de água, incluindo mas não se limitando a tolerância à seca ou à umidade excessiva, em plantas, em que uma aplicação de N-óxido de trimetilamina ou "TMAO", em que TMAO inclui mas não está limitado a, TMAO di- hidratado, derivado químico de TMAO, ou análogo químico de TMAO, a uma planta ou semente para reduzir o estresse da água na planta quando a planta é exposta a condições de estresse de água. Este método de produção de uma planta tolerante ao estresse de água é aplicável a uma variedade de plantas, incluindo plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas, incluindo, mas não limitado a plantas transgênicas. Tal como aqui utilizado, as plantas transgênicas incluem plantas, ou organismo fotossintético, que foram geneticamente modificados para conter construtos de DNA estranhos, como será discutido mais adiante. Os métodos para a produção de uma planta ou organismo tolerante ao estresse de água podem ser aplicáveis para toda a planta ou organismo ou uma parte de uma planta, por exemplo, em um órgão, tecido, uma célula ou uma parte de uma célula de planta, por exemplo, numa organela, que compreende a introdução, e que expressa na planta ou célula vegetal de um ácido nucleico que codifica uma mono-oxigenase ou proteína FMO, e que medeia um aumento da produção de TMAO endógena e, consequentemente, uma tolerância ao estresse de água, tal como uma maior tolerância ao secas ou um aumento da tolerância à umidade excessiva.
[0150] Metilaminas (por exemplo, N-óxido de trimetilamina (TMAO)) pode melhorar o dobramento de proteínas e ligação do ligante e combater perturbações por ureia (por exemplo, em elasmobrânquios e rim de mamífero), íons inorgânicos e pressão hidrostática em animais de águas profundas (Yancey, 2005, supra citado).
[0151] Outra modalidade aqui descrita e tal como será descrito em mais detalhe é fornecido um método para a tolerância ao estresse de água em uma planta, uma parte da planta, ou uma célula de planta, em que o método compreende o passo de aumentar a expressão e/ou atividade de uma proteína mono-oxigenase na planta, parte da planta ou célula vegetal, em comparação com uma planta de tipo selvagem, parte de planta tipo selvagem ou célula de planta tipo selvagem.
[0152] Como discutido acima, os métodos aqui descritos são dirigidos a métodos para reduzir o estresse da água em uma planta ou organismo de produção de uma planta ou organismo fotossintético tolerante ao estresse de água por sobre-expressão de FMO para a planta que tenha sido exposta ou vai ser exposta a condições de estresse hídrico. O efeito de reduzir o estresse da água de uma planta ou organismo fotossintético pode ser avaliado comparando os indicadores fenotípicos acima entre uma FMO de sobre-expressão e uma planta que não sobre-expressa FMO depois das plantas ou organismo fotossintético estarem expostos a condições de estresse de água. Estágios em que as plantas ou organismo fotossintético sobre-expressam FMO podem ser expostos a condições de estresse hídrico incluem, por exemplo, todos os estágios de crescimento de plantas, incluindo um período de germinação, um período de crescimento vegetativo, um período de crescimento reprodutivo e um período de colheita.
[0153] Uma variedade de sementes ou bulbos podem ser usados nos métodos aqui descritos, incluindo, mas não estão limitadas a plantas nas famílias Solanaceae e cucurbitáceas, assim como plantas selecionadas a partir dos gêneros de plantas Calibrachoa, Capsicum, Nicotiana, Nierembergia, Petúnia, Solário, Cucurbita, Cucumis, Citrullus, Glycine, como Glycine max (soja), Calibrachoa x hybrida, Capsicum annuum (pimenta), Nicotiana tabacum (tabaco), Nierenbergia scoparia (nierembergia), Petunia xhybrida, Solanum lycopersicum (tomate), Solanum tuberosum (batata), Solanum melongena (berinjela), Cucurbita maxima (polpa), Cucurbita pepo (abóbora, abobrinha), Cucumis metuliferus (pepino africano) Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino) e Citrullus lanatus (melancia). Várias plantas monocotiledôneas, em particular as que pertencem à família das Poaceae, podem ser usadas com os métodos aqui descritos, incluindo, mas não limitado a, plantas selecionadas a partir dos gêneros de plantas Hordeum, Avena, Secale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum, Oryza , Hordeum vulgare (cevada), Triticum aestivum (trigo), Triticum aestivum subsp. spelta (spelt), Triticale, Avena sativa (aveia), Secale cereale (centeio), Sorghum bicolor (sorgo), Zea mays (milho), Saccharum officinarum (cana de açúcar) e Oryza sativa (arroz). Exemplos adicionais de plantas nas quais o estresse de água pode ser produzido usando os métodos aqui descritos incluem os seguintes. culturas: trigo mourisco, beterraba, canola, colza, girassol, cana-de- açúcar, tabaco e ervilha, etc .; legumes: legumes solanáceos como o colorau e batata; vegetais cucurbitáceos; vegetais crucíferos, como rabanete japonês, nabo branco, rábano, couve-rábano, couve chinesa, couve, mostarda folha, brócolis e couve-flor, legumes Asteraceae como bardana, coroa margarida, alcachofra, e alface; vegetais liliaceous como cebolinha, cebola, alho e espargos; vegetais amiáceos tais como cenoura, salsa, aipo e pastinaga; vegetais quenopodiáceos, como espinafre, acelga; vegetais lamiáceos como frutescens Perilla, hortelã, manjericão; morango, batata-doce, Dioscorea japonica, colocasia; flores; folhagem de plantas; gramíneas; frutas: pomáceas (maçã, pêra, pêra japonesa, marmelo chinês, Marmelo, etc.), frutos de pedra carnudos (pêssego, ameixa, nectarina, damasqueiro da china, fruto cereja, damasco, ameixa seca, etc.), frutas cítricas (trapoeraba , laranja, tangerina, limão, lima, toranja, etc.), nozes (castanhas, nozes, avelãs, amêndoas, pistache, castanha de caju, macadâmia, etc.), bagas (mirtilo, oxicoco, amora, framboesa, etc.) , uva, fruta caqui, azeitona, ameixa japonesa, banana, café, palma, coco, etc.; e outros do que as árvores de fruto; chá, amoreira, planta de florescência, árvores na estrada (cinzas, vidoeiro, cornizo, Eucalyptus, Ginkgo biloba, lilás, bordo, Quercus, álamo, árvore de Judas, Liquidambar formosana, plátano, zelkova, arborvitae japonês, madeira abeta, cicuta, zimbro, Pinus, Picea, e Taxus cuspidata). Exemplos de plantas em que tolerância ao estresse de água podem ser produzidas podem incluem arroz, milho, canola, soja e trigo. As "plantas" acima mencionadas incluem plantas transgênicas, expressando outras características genéticas.
[0154] Tal como aqui utilizado, "plantas" significam todas as plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas, incluindo mas não limitado à classe do Liliatae (Monocotyledoneae ou plantas monocotiledôneas). O termo inclui as plantas maduras, sementes, brotos e mudas, e peças, material de propagação, órgãos vegetais, tecidos, protoplastos, calos e outras culturas, para culturas de exemplo de células derivadas do acima exposto, e todos os outros tipos de associações de células vegetais que dar unidades funcionais ou estruturais. "As plantas maduras", significam em qualquer estágio de desenvolvimento além do estágio de plântula. Mudas significam uma planta jovem,imatura em um estágio de desenvolvimento cedo.
[0155] Dicotiledôneas inclui as plantas maduras, sementes, brotos e mudas, e peças, material de propagação, órgãos vegetais, tecidos, protoplastos, calos e outras culturas, para culturas exemplo de células derivadas do acima exposto, e todos os outros tipos de associações de células vegetais que dar unidades funcionais ou estruturais. As plantas maduras, plantas, em qualquer estágio de desenvolvimento além do estágio de plântula. De mudas, uma unidade jovem, imaturo em um estágio inicial de desenvolvimento.
[0156] "Planta" compreende também as plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas anuais e perenes e inclui a título de exemplo, mas não por limitação, aquelas dos gêneros Glycine, Vitis, Espargo, Populus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Saccharum e Lycopersicum.
[0157] Como discutido acima, uma outra modalidade proporciona um método para a produção de uma planta ou organismo fotossintético, tal como uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, com uma tolerância ao estresse de água, o qual compreende introduzir e expressar na planta ou organismo fotossintético um ácido nucleico ou aminoácido ácido tal como SEQ ID nO: 1 ou SEQ ID nO: 2, que codifica para uma proteína mono-oxigenase, tais como a proteína GS-OX5 FMO. Um exemplo da proteína mono-oxigenase pode incluir, mas não está limitado a uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 43, em que a sequência nucleotídica compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico. A sequência de aminoácidos pode ter uma percentagem de identidade de 80% ou mais das sequências acima e ou região 5’ não traduzida (5'UTR), em comparação com a sequência original.
[0158] Os métodos aqui descritos, também incluem: a) introduzir numa planta ou organismo fotossintético celular um cassete de expressão recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico numa ligação operacional com um promotor que é ativo em uma planta ou organismos fotossintéticos; b) regeneração de uma planta ou organismo fotossintético a partir da célula ou organismo vegetal fotossintético, e c) expressar a molécula de ácido nucleico para gerar ou aumentar uma tolerância de água na planta ou organismo fotossintético.
[0159] Em um outro aspecto, a invenção refere- se a uma planta tolerante a estresse de água produzida pelos métodos da invenção.
[0160] Os métodos aqui descritos proporcionam ainda organismos fotossintéticos transgênicos ou uma planta, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de FMO (SEQ ID NOs: 1-43), um cassete de expressão de DNA, ou um vetor que compreende o cassete de expressão de DNA, ou que compreende uma célula que compreende a molécula de ácido nucleico tal como a proteína FMO (SEQ ID NOs: 1-43), o cassete de expressão, ou o vetor. Os exemplos podem incluir a geração de uma planta transgênica que é tolerante ao estresse de água, que pode compreender a molécula de ácido nucleico, tal como uma sequência de codificação de proteína FMO (SEQ ID NOs: 1-43), um cassete de expressão de DNA, um vetor que compreende o cassete de expressão , ou uma célula que compreende a molécula de ácido nucleico, o cassete de expressão, ou o vetor. Um material de propagação vegetal ou composição pode ser gerado que compreende uma molécula de ácido nucleico tal como a sequência de codificação da proteína FMO (tal como SEQ ID NOs: 1-43), um cassete de expressão de DNA compreendendo a sequência de codificação de proteína FMO, ou um vetor que compreende o cassete de expressão, ou uma célula que compreende a molécula de ácido nucleico, o cassete de expressão, ou o vetor para fornecer uma planta tolerante a secas, parte da planta ou célula de planta.
[0161] Tal como discutido acima e mostrado na Figura 2, as proteínas FMO aqui descritos pode incluir uma sequência de nucleotídeos exógena que codifica uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 43, em uma planta ou organismo fotossintético, uma parte de uma planta, ou uma célula de planta, e expressando as sequências de nucleotídeos da sequência na planta ou organismo fotossintético, a parte da planta ou da célula vegetal. Além disso, a sequência de nucleotídeos pode ser aumentada na planta ou organismo fotossintético, parte da planta ou célula da planta, quando comparado com o original, ou tipo selvagem da planta, parte da planta ou célula de planta.
[0162] Os métodos de sobre-expressão e aumento de uma proteína FMO, tal como aqui descrito, incluindo um ou mais construtos de DNA para utilização na sobre-expressão da proteína FMO, de integração estável da proteína FMO em um genoma de DNA organismo fotossintético ou planta e a sobre-expressão do construto de DNA na planta ou fotossintética organismo, pode ser usada em uma variedade de plantas, incluindo mas não se limitando a: soja, batata, algodão, colza, nabo, canola, girassol, alfalfa, trevo, banana, amora preta, mirtilo, morango, framboesa , melão, cenoura, couve- flor, café, pepino, berinjela, uva, melão, alface, manga, melão, cebola, mamão, pimenta, abacaxi, abóbora, espinafre, abóbora, tabaco, tomate, tomatillo, melancia, maçã, pêssego, pêra , cereja, ameixa, brócolis, repolho, couve-flor, couve de Bruxelas, couve-rábano, groselha, abacate, laranja, limão, toranja, tangerina, alcachofra, cereja, noz, amendoim, endívias, alho-poró, de araruta e de beterraba, mandioca, nabo, rabanete, inhame, batata-doce; ervilha, feijão, cana de açúcar, gramado, Miscanthus, switchgrass, trigo, milho, doce milho, arroz, milho, sorgo, cevada e centeio, bem como vários tipos de organismos fotossintéticos incluindo, mas não limitados a diatomáceas, algas eucarióticas e cianobactérias
[0163] Como mostrado na Figura 2, os genes com elevada identidade de FMO GS-OX5 mediam funções semelhantes. Como mostrado na Figura 2, os genes, ácidos nucleicos utilizados ou proteínas expressas podem ter 40% ou mais de identidade, incluindo mas não se limitando a, pelo menos, 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85 %, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade, em comparação com a respectiva sequência de FMO GS-OX5 de Arabidopsis (At1g12140) (SEQ ID NO: 1) [com a sequência de cDNA UTR] ou a sequência de proteína de SEQ ID NO: 2). Os genes com maior homologia para At1g12140 de Solatium lycopersicum SIFMO GS-OX1 (Solyc06g060610) (SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38), SIFMO GS-OX2 (AK324297.1), Vitis vinifera VvFMO GS-OX3-1 (SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22) (LOC100242032), VvFMO GS- OX3-2 (LOC100255688) (SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 20), VvFMO GS-OX3-3 (LOC100255688) (SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: IS), Populus trichocarpa PtFMO-GS-(OX3 XM 002.329.873,1) (SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28), PtFMO GS- OX2 (XM_002.318.967,1) (SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30), PtFMO GS-OX1 (XP002318210.1), Oryza sativa OsFMO-OX (Osl0g40570.1) (SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16), Glycine max GmFMO (Glymal11g03390.1) (SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34), Cucumus sativus CsFMO GS -OX3-1 (LOC101227975) (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12), CsFMO GS-OX3-2 (LOCI 01220079) (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10), CsFMO GS-OX3- 3 (LOCI 01220318) (SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8), CsFMO GS-OX3-4 (LOCI 01212991) (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6), Brassica rapa ssp. Pekinensis BrFMO GS-OX1 (FJ376070.1), Medicago truncatula MtFMO GS-OX5 (MTR_5g012130) (SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14), Zea mays ZmFMO GRMZm2G089121_P01) (SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26), Gossypium hirsutum GhFMO-1 (DQ 122185,1) SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24) de Homo sapiens HsFMO-3 (NP 001.002.294,1) (SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40) e Oryctolagus cuniculus OcFMO -5 (NP 001.075.714,1) SEQ ID nO: 41 e SEQ ID nO: 42), provavelmente, exercem funções similares na planta ou organismo fotossintético, como polipeptídeo GS-FMO OX5 de Arabidopsis (AtFMO GS-OX5). Como discutido acima, a Figura 2 apresenta uma árvore filogenética de sequências de polipeptídeo listados acima de FMO de Arabidopsis thaliana, vinha, Populus trichocarpa, arroz, soja, melão, tomate, sorgo, milho, trigo, cevada, humana e de coelho.
[0164] Como mostrado na Figura 2, a expressão equivalente de proteínas FMO pode ser esperada para sequências com 40% ou mais de identidade, incluindo mas não se limitando a, pelo menos, 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), pelo menos, 97%, pelo menos, 98%, pelo menos, 99% ou mais de identidade, em comparação com outras sequências de FMO, tais como a respectiva sequência FMO GS- OX5 de Arabidopsis.
[0165] Tal como aqui utilizado, "proteína FMO" ou "polipeptídeo FMO" significa uma proteína com 100% da totalidade ou partes da sequência, que medeia uma expressão de TMAO aumentada em uma planta ou organismo fotossintético através da catalisação da oxidação de metabólitos endógenos que contêm nitrogênio nucleofílico e conferindo tolerância ao estresse de água melhorada quando expressos em plantas ou organismos fotossintéticos. "Proteína FMO" é entendida como significando uma sequência que compreende um domínio N- terminal, um domínio de flavina-mono-oxigenase e um domínio C-terminal (Li et al, Plant Physiol 148 (3):1721-1733 (2008) Por exemplo, o polipeptídeo que é empregue no método, tem uma atividade que está envolvida nas respostas de defesa de estresse de água e aumenta TMAO endógena. Um polipeptídeo pode ser identificado como uma FMO se é capaz de catalisar a conversão de trimetilamina (TMA) a TMAO na presença de FAD e NADPH. A atividade pode ser determinada em um ensaio in vitro, como mostrado, por exemplo, no exemplo de 2,2 WO20100348261 pedido PCT.
[0166] O termo "sobre-expressão", tal como aqui utilizado, significa que uma dada célula produz um aumento do número de uma determinada proteína em relação a uma célula normal. Para os fins desta invenção, o nível de expressão de tipo selvagem original pode também ser igual a zero, isto é, ausência de expressão ou expressão incomensurável. Deve entender-se que a proteína FMO que é sobre-expressa nas células de acordo com os métodos da invenção pode ser da mesma espécie que a célula da planta em que a sobre-expressão está sendo realizada, ou pode derivar a partir de uma espécie diferente. No caso em que a proteína FMO endógena é sobre- expressa, os níveis da proteína FMO são, pelo menos, três vezes, com respeito ao mesmo polipeptídeo que é produzido endogenamente pela célula de planta. No caso em que uma proteína heteróloga FMO é sobre-expressa, os níveis da proteína heteróloga FMO são de pelo menos três vezes os níveis da proteína endógena FMO. Em uma modalidade preferida, a proteína FMO é sobre-expressa, pelo menos, quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos, 10 ou mais vezes em relação à proteína endógena FMO.
[0167] Em uma modalidade, a planta de acordo com a invenção tenha sido transformada pela introdução de uma proteína heteróloga ou homóloga FMO de modo que a atividade de FMO em um lisado celular a partir da dita planta é pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou mais no que diz respeito à atividade de FMO na planta não transformada. A atividade de FMO no lisado celular pode ser determinada como descrito no Exemplo 2.2 do pedido PCT WO20100348261, em que o extrato é posto em contato com TMA na presença de FAD e NADPH e a produção de TMAO é determinada.
[0168] Em uma outra modalidade, a sobre- expressão da proteína FMO homóloga ou heteróloga deve ser suficiente para aumentar os níveis de TMAO endógenos no mínimo, pelo menos de 2 vezes. 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou mais em relação aos níveis de TMAO endógenos medidos na ausência de estresse, em que o estresse é estresse abiótico, incluindo o estresse de seca, o estresse salino, o estresse osmótico, estresse do solo, estresse UV e estresse por calor. Os níveis de TMAO podem ser determinados por qualquer método conhecido na arte, incluindo, por exemplo, o método descrito no pedido PCT WO20100348261 baseado na redução de TMAO a TMA na presença de TiCl3 e detectando a quantidade de TMA formada na reação.
[0169] A proteína FMO é codificada, por exemplo, por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma molécula de ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) a molécula de ácido nucleico que codifica pelo menos um polipeptídeo que compreende a sequência apresentada na sequência de ácido nucleico que codifica a proteína FMO, tais como FMO proteína GS-OX5 (SEQ ID NO: 1) ou as partes funcionais da proteína, expressam e medeiam um aumento da tolerância ao estresse de água, incluindo um aumento da tolerância à seca. Como discutido nos métodos acima, a proteína FMO é introduzida e expressa na célula da planta ou organismo fotossintético ou planta ou uma parte da mesma, ou a proteína de FMO pode ser expressa endogenamente de acordo com os métodos aqui descritos.
[0170] A título de exemplo, a sequência de ácido nucleico que codifica para a proteína FMO pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica pelo menos um polipeptídeo que compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 43; (b) uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos um polinucleotídeo da sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44; (c) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo cuja sequências de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98 % ou pelo menos 99%, de identidade com qualquer uma das sequências apresentadas no item(a) ou (b) acima indicados, onde a molécula de ácido nucleico listadas nos itens (a) e (b) acima têm a mesma ou uma função biológica similar como uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo; (e) moléculas de ácido nucleico de acordo com (a) a (d) que codificam um fragmento ou um epitopo das sequências como apresentado nos parágrafos (a) e (b), em que o fragmento é um fragmento funcional, que confere tolerância de estresse à seca; (f) uma molécula de ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo monoclonal direcionado contra um polipeptídeo que é codificado pelas moléculas de ácidos nucleicos como mostrado em (a) a (d); (g) molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas com o complemento de uma molécula de ácido nucleico tal como mostrado em (a) a (d); e (h) a molécula de ácido nucleico que pode ser isolada a partir de uma biblioteca de DNA utilizando uma molécula de ácido nucleico tal como mostrado em (a) a (d) ou os seus períodos de fragmentos de pelo menos 15 nt, 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt ou 500 nt, como sonda sob condições rigorosas de hibridização; (i) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína FMO como as sequências de ácidos nucleicos indicadas nas alíneas (a) a (d) acima, mas diferindo as sequências de (a) a (d) acima devido à degenerescência do código genético; ou uma sua sequência complementar.
[0171] Outras proteínas heterólogas codificadas pelo gene quimérico incluem polipeptídeos que formam epitopos imunologicamente ativos, e as enzimas que catalisam a conversão de metabólitos intracelulares, com a consequente acumulação de metabólitos nas células selecionadas.
[0172] Tal como aqui utilizado, o termo "sequência(s)" é usado por motivo de simplificação, e refere- se, dependendo do contexto, com o ácido nucleico e/ou sequências de aminoácidos aqui divulgadas. O trabalhador qualificado vai saber a partir do contexto que eles se referem. O termo "fragmento de DNA", tal como usado aqui em porções é entendido como significado do DNA que codificam para uma proteína quando esta atividade biológica consiste em mediar um aumento da tolerância de estresse à seca. O termo "fragmentos de proteína", tal como aqui utilizado refere-se a porções da proteína cuja atividade biológica compreende mediar um aumento da tolerância à seca de estresse em plantas.
[0173] "Quantidade Polipeptídeo" tal como aqui utilizado significa, por exemplo, o número de moléculas, ou moles, de moléculas de polipeptídeo FMO em um organismo, um tecido, uma célula ou uma célula de compartimento. Aumentando a quantidade de polipeptídeo significa que o aumento no número molar dos respectivos polipeptídeos em um organismo, um tecido, uma célula ou uma célula de compartimento. Por exemplo, por um dos métodos descritos aqui a seguir, em comparação com um controle adequado, por exemplo, do tipo selvagem (planta de controle) do mesmo gênero e espécie para a qual este método não tem sido aplicado, sob condições de outro modo idênticas (tais como, por exemplo, condições de cultura, idade das plantas e similares). O aumento, neste contexto, eleva-se a pelo menos 5%, pelo menos 10% ou pelo menos 20%, bem como, pelo menos, 40% ou 60%, pelo menos 70% ou 80%, e, pelo menos, 90%, 95%, 99%, 100%, mais do que 100%, incluindo 150%, 200% ou 300%.
[0174] A identidade entre duas sequências de ácidos nucleicos que é compreendida como significando a identidade da sequência de ácido nucleico ao longo de cada caso todo o comprimento da sequência, a qual é calculada por comparação com o auxílio do GAP algoritmo do programa (Wisconsin Package Versão 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, EUA; Altschul et al, Nucleic Acids Res 25, 3389 (1997)), dando os seguintes parâmetros:\ Peso de Gap: 50 Peso de Comprimento: 3 Combinação média: 10 Desencontro médio: 0
[0175] Por exemplo, uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 1 ao nível do ácido nucleico é entendida como significando uma sequência que, após comparação com a sequência de SEQ ID NO: 1 pelo algoritmo do programa acima com o conjunto de parâmetros acima, tem pelo menos 80% de identidade.
[0176] A identidade entre dois polipeptídeos é entendida como significando a identidade da sequência de aminoácidos ao longo de cada caso todo o comprimento da sequência a qual é calculada por comparação com o auxílio do GAP algoritmo do programa (Wisconsin Package Versão 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, EUA), definindo os seguintes parâmetros: Peso de Gap: 8 Peso de Comprimento: 2 Combinação média: 2,912 Desencontro médio: -2,003
[0177] Por exemplo, uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade ao nível de polipeptídeo com a sequência de SEQ ID NO: 2 é entendido como significando uma sequência que, após comparação com a sequência de SEQ ID NO: 2 pelo algoritmo do programa acima com o acima conjunto de parâmetros, tem pelo menos 80% de identidade.
[0178] A tolerância de estresse à seca de uma planta ou organismo, tal como aqui descrito é obtido através da introdução e que sobre-expressam uma sequência de ácido nucleico, tais como, mas não se limitando a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 43. Além disso, também é possível aumentar a sobre-expressão endógena ou a atividade destas sequências de uma planta ou organismo por métodos conhecidos de um perito na arte. Por exemplo, um aumento na sobre-expressão endógena pode ser obtido por mutação de uma região UTR, tais como o 5 -UTR, uma região de promotor, uma região de codificação genômica para o centro ativo, por locais de ligação, para sinais de localização, para domínios, agregados e como, tal como, por exemplo, de regiões de codificação para o N- terminal, a proteína FMO ou os domínios C-terminais. A expressão endógena ou atividade pode ser aumentada em conformidade com a invenção por mutações que afetam a estrutura secundária, terciária ou quaternária da proteína.
[0179] As mutações podem ser inseridas por exemplo, por uma mutagênese EMS. Os domínios podem ser identificados por programas de computador adequados, tais como, por exemplo, inteligente ou InterPro, por exemplo, como descrito em Andersen P., The Journal of Biol. Chemistry, 279, 38 ou 39053, (2004) ou Mudgil, Y., Fisiologia Vegetal, 134, 59, (2004), e da literatura aí citada. Os mutantes adequados podem então ser identificados, por exemplo, lavrando (por exemplo, tal como descrito por Henikoff, S., et al, Plant Physiol 135:630-6 (2004)).
[0180] A introdução e a sobre-expressão de uma sequência de acordo com os métodos aqui descritos em uma planta ou organismo fotossintético, ou o aumento ou a modificação ou mutação de uma sequência endógena, se for caso disso de uma ou ambas as regiões não traduzidas, em uma planta ou fotossintética organismo é combinada com o aumento do polipeptídeo quantidade, atividade ou função de outros fatores de resistência, tais como um inibidor de proteína Quadro I (BI-1), tal como um inibidor de uma proteína Bax de Hordeum vulgare (GenBank Acc.-No .: AJ290421), a partir de, Nicotiana tabacum ( GenBank Acc.-No .: AF390556), arroz (GenBank Acc.-No: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No: AB025927) ou tabaco e colza (GenBank Acc.-No .: AF390555, Bolduc N et al. (2003) Planta 216, 377 (2003)) ou de ROR2 (por exemplo a partir de cevada (GenBank Acc.-No:AY246906), SnAP34 (por exemplo, a partir de cevada (GenBank Acc.-No: AY247208) e/ou a ligação de proteínas BiP por exemplo a partir de arroz (GenBank AF006825 Acc.-No.). Um aumento do lúmen pode ser conseguido, por exemplo, através de mutagênese ou a sobre-expressão de um transgene, inter alia.
[0181] Uma molécula de ácido nucleico, tal como aqui utilizado, compreende a sequência não traduzida na extremidade 3' e no terminal 5' da região do gene que codifica: pelo menos 500, ou 200, ou 100 nucleotídeos da sequência a montante do terminal 5’ da região de codificação e, pelo menos, 100, ou 50, ou 20 nucleotídeos da sequência a jusante do terminal 3' da região de codificação do gene.
[0182] Além disso, as sequências de ácido nucleico são sequências de ácidos nucleicos isolados. Uma molécula de ácido nucleico "Isolada" que está separado de outras moléculas de ácidos nucleicos, que estão presentes na origem natural do ácido nucleico. Um ácido nucleico "isolado" contém de preferência nenhuma sequência que naturalmente flanqueia o ácido nucleico no DNA genômico do organismo a partir do qual se origina o ácido nucleico (por exemplo, sequências que são localizadas nas extremidades 5' e 3' terminais do ácido nucleico, no entanto, isto não afeta as modalidades acima ditas regiões compreendendo 5'- e 3'- UTR). Em diferentes modalidades, a molécula isolada pode compreender, por exemplo, menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico se origina. Todas as moléculas de ácido nucleico mencionadas aqui podem ser, por exemplo, RNA, DNA ou cDNA.
[0183] As moléculas de ácido nucleico podem ser isoladas utilizando técnicas padrão de biologia molecular e a informação de sequência aqui proporcionada. Utilizando algoritmos de comparação, é possível identificar, por exemplo, uma sequência homóloga, ou homóloga, regiões de sequências conservadas, ao nível do ácido DNA ou amino. Porções essenciais desta sequência ou a sequência homóloga inteira podem ser usadas como sonda de hibridação, utilizando técnicas de hibridação convencionais (tais como, por exemplo, descrito em Sambrook et al:Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold. Spring Harbor, NY, 1989) para o isolamento de outras sequências de ácidos nucleicos que são úteis no método de outros organismos por rastreio de bibliotecas de cDNA e/ou bibliotecas genômicas.
[0184] Além disso, uma molécula de ácido nucleico ou uma parte da mesma pode ser isolada por meio de reação em cadeia da polimerase ("PCR"), em que os iniciadores de oligonucleotídeos com base nas sequências aqui especificadas ou parte dele é usado (por exemplo, é possível isolar uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência completa ou uma parte do mesmo, por meio de PCR utilizando iniciadores de oligonucleotídeos que tenham sido gerados com base na sequência do mesmo). Por exemplo, o mRNA pode ser isolado a partir de células (por exemplo, pelo método de extração de guanidina tiocianato de Chirgwin et al, Biochemistry 18, 5294 (1979)) e o cDNA preparado a partir dele por meio de transcriptase inversa (por exemplo Moloney MLV de transcriptase reversa, obtidas a partir de Gibco/BRL, Bethesda, Md., ou transcriptase AMV, disponível a partir de Seikagaku Amerika, Inc., St. Petersburg, na Flórida inversa.). Iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos para a amplificação por meio de PCR podem ser gerados com base nas sequências aqui reveladas. Um ácido nucleico pode ser amplificado usando cDNA ou, alternativamente, DNA genômico como molde e iniciadores oligonucleotídicos adequados, por meio de técnicas convencionais de amplificação por PCR. O ácido nucleico amplificado deste modo pode ser clonado em um vetor adequado e caracterizado por meio de análise da sequência de DNA. Os oligonucleotídeos que correspondem a uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma proteína pode ser preparado por métodos sintéticos convencionais, por exemplo, utilizando um sintetizador de DNA automatizado.
[0185] Tal como aqui utilizado "introdução" ou "introduzir" compreende todos os métodos, incluindo mas não limitado a, transfecção, transdução ou transformação, que são adequados para, direta ou indiretamente, introduzir, em uma planta ou uma célula, compartimento, tecido, órgão ou semente, uma sequência de ácido nucleico, ou gerá-la no mesmo. A introdução pode levar a um transiente ou estável a uma presença de uma sequência de ácido nucleico.
[0186] Uma modalidade aqui descrita é o produto derivado de uma planta ou organismo fotossintético que compreende uma molécula de ácido nucleico, um cassete de expressão de DNA, ou um vetor que compreende o cassete de expressão, ou que compreende uma célula que compreende a molécula de ácido nucleico, o cassete de expressão, ou o vetor , ou uma planta que é tolerante ao estresse de seca, obtida pelo método compreendendo a utilização da molécula de ácido nucleico, um cassete de expressão de DNA, um vetor que compreende o cassete de expressão, ou uma célula que compreende a molécula de ácido nucleico, o cassete de expressão, ou o vetor, a partir de uma planta ou organismo fotossintético produzível pelo método aqui descrito ou a partir de uma planta, parte da planta, semente transgênica, organismo fotossintético ou planta transgênica descrita.
[0187] Em um outro aspecto, a invenção refere- se a uma cultura de tecidos de células produzidas a partir da planta da invenção (o estresse tolerante à seca produzida pelo método da invenção), em que as células da cultura de tecidos são produzidos a partir de uma parte da planta escolhida a partir de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilo, células meristemáticas, raízes, pontas de raiz, pistilos, anteras, flores e caules. Como uma pessoa de habilidade entende, ditas folhas, embriões de pólen, cotilédones, hipocótilo, células meristemáticas, raízes, pontas de raiz, pistilos, anteras, flores, e caules compreendem a proteína FMO.
[0188] Em um outro aspecto, a invenção refere- se a uma planta regenerada a partir da cultura de tecidos da invenção. Como uma pessoa de habilidade pode entender que a dita planta regenerada compreende uma proteína FMO.
[0189] Em um outro aspecto, a invenção refere- se a um método para produzir um organismo fotossintético que sobre-expressa uma ou mais proteínas que codificam sequências de FMO no dito organismo fotossintético, que compreende:
[0190] cultivar uma planta transformada com uma sequência que codifica uma proteína de FMO operativamente ligada a um promotor, em que a proteína FMO e o promotor são integrados de forma estável o dito genoma nuclear fotossintético do organismo ou do dito genoma do cloroplasto da planta sob condições adequadas para a sobre-expressão da proteína FMO no organismo fotossintético, em que a sobre- expressão da sequência de codificação de proteína FMO no dito organismo fotossintético catalisa a oxidação de metabólitos endógenos, contendo nitrogênio nucleofílico.
[0191] Em uma modalidade preferida, a uma ou mais proteína de FMO compreende uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir das SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43
[0192] Em uma outra modalidade preferida, a uma ou mais proteína de FMO compreende, pelo menos, uma variante funcionalmente equivalente a uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0193] Em uma outra modalidade preferida, em que a uma ou mais proteína de FMO compreende, pelo menos, uma variante funcionalmente equivalente a uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0194] Em uma outra modalidade preferida, a uma ou mais proteína de FMO compreende, pelo menos, uma variante funcionalmente equivalente a uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0195] Em uma outra modalidade preferida, em que a uma ou mais proteína de FMO compreende, pelo menos, uma variante funcionalmente equivalente a uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43
[0196] Em uma outra modalidade preferida, a uma ou mais proteína de FMO compreende, pelo menos, uma variante funcionalmente equivalente a uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0197] Em uma outra modalidade preferida, a uma ou mais proteína de FMO compreende, pelo menos, uma variante funcionalmente equivalente a uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0198] "Variante funcionalmente equivalente", entende-se todas as proteínas derivadas da sequência de FMO por modificação, inserção e/ou deleção, ou um ou mais aminoácidos, sempre que a função é substancialmente mantida, particularmente a capacidade de gerar TMAO de TMO (trimetilamina).
[0199] Outra modalidade proporciona um método para a produção de um produto, em anexo o método para a produção de um produto, compreendendo: a) crescimento de uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico aqui divulgado, um cassete de expressão de DNA, tal como aqui divulgado, ou um vetor compreendendo o cassete de expressão, ou que compreende uma célula que compreende a molécula de ácido nucleico, o cassete de expressão, ou o vetor ou pode ser obtido pelo método da invenção; b) produzir o produto de ou pela planta e/ou parte, ou sementes da planta.
[0200] Outra modalidade é o método para a produção de um produto, que compreende: a) crescimento de uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico, um cassete de expressão de DNA, ou um vetor que compreende o cassete de expressão, ou que compreende uma célula que compreende a molécula de ácido nucleico, o cassete de expressão, ou o vetor ou pode ser obtido pelo método e removendo a planta, parte de planta, planta transgênica ou semente transgênica; e b) a produção do produto a partir de ou pela planta, parte de planta, planta transgênica ou semente transgênica da planta.
[0201] Tal como aqui utilizado "epitopo" é entendido como significando que as regiões de um antígeno que determinam a especificidade dos anticorpos (o determinante antigênico). Consequentemente, um epitopo representa a parte de um antígeno que realmente entra em contato com o anticorpo.
[0202] Esses determinantes antigênicos são aquelas regiões de um antígeno ao qual os receptores de células T reagem e, como consequência, produzem anticorpos que se ligam especificamente a determinante antigênico/epitopo de um antígeno. Consequentemente, os antígenos, ou os seus epítopos, são capazes de induzir a resposta imune de um organismo com a consequência de a formação de anticorpos específicos que são dirigidos contra o epítopo. Os epitopos consistem por exemplo de sequências lineares de aminoácidos na estrutura primária das proteínas, ou de estruturas de proteínas secundárias ou terciárias complexos. Um hapteno é entendido como significando um epitopo que é dissociado do contexto do ambiente antígeno. Embora haptenos tenham, por definição, um anticorpo dirigido contra eles, os haptenos, sob certas circunstâncias, não são capazes de induzir uma resposta imune em um organismo, por exemplo, depois de uma injeção. Para este fim, os haptenos são acoplados com moléculas portadoras. Um exemplo que pode ser mencionado é o dinitrofenol (DNP), que, após o acoplamento com BSA (albumina de soro de bovino), foi usado para a geração de anticorpos que são dirigidos contra DNP (Bohn, A., Konig, W. (1982), Immunology 47 (2), 297).
[0203] Haptenos são substâncias (frequentemente substâncias de baixo peso molecular ou substâncias pequenas) que, quando eles mesmos não provocam resposta imune, de fato desencadearão tal resposta quando ligadas a um veículo molecular grande. Os anticorpos gerados deste modo também incluem aqueles que podem se ligar ao hapteno sozinho.
[0204] Outra modalidade aqui descrita refere-se a um anticorpo contra um polipeptídeo de proteína FMO, tal como descrito, em particular, a um anticorpo monoclonal que se liga a um polipeptídeo FMO que compreende uma sequência de aminoácidos ou é constituído da mesma, como mostrado nas sequências mostradas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 43.
[0205] Estes anticorpos podem ser utilizados para identificar e isolar polipeptídeos divulgados de acordo com a invenção, a partir de organismos, incluindo plantas, tais como plantas monocotiledôneas, bem como plantas dicotiledôneas. Os anticorpos podem ser monoclonais, policlonais ou sintético na natureza ou consistir de fragmentos de anticorpos tais como Fab, Fv ou scFv, fragmentos que são formadas pela degradação proteolítica. Fv (scFv) de cadeia simples "fragmentos" são fragmentos de cadeia simples, que, ligadas através de uma sequência ligante flexível, única compreendem as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpo. Tais fragmentos scFv também podem ser produzidos como derivados de anticorpos recombinantes. Uma apresentação de tais fragmentos de anticorpo na superfície de fagos filamentosos torna possível a seleção direta, a partir de bibliotecas de fagos combinatória, moléculas de scFv que se ligam com elevada afinidade. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos em conformidade com o método descrito por Kohler e Milstein em Nature 256, 495 (1975).
[0206] Pesquisa de bibliotecas de cDNA ou bibliotecas genômicas de outros organismos, incluindo os organismos vegetais e fotossintéticos aqui mencionados, que são adequados como hospedeiros de transformação, utilizando as sequências de ácido nucleico descritas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44; ou partes do mesmo como sonda também é um método conhecido do especialista para a identificação de homólogos de outras espécies. Neste contexto, as sondas derivadas da sequência de ácido nucleico tal como mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44; tem um comprimento de pelo menos 20 bp, ou, pelo menos, 50 bp, ou pelo menos 100 bp, ou pelo menos 200 bp, ou pelo menos 400 bp. A sonda também pode ser uma ou mais quilobases de comprimento, por exemplo, 1 kb, 1,5 kb ou 3 kb. A cadeia de DNA que é complementar para as sequências descritas na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 , SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44 ou um fragmento da mesma cadeia com um comprimento de 20 bp entre várias quilobases e podem também ser empregues para o rastreio de bibliotecas.
[0207] Em uma modalidade adicional, as sequências de codificação de proteína de FMO podem hibridizar sob condições padrão com as moléculas de ácido nucleico descritas por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44; e que codificam para proteínas de FMO, com as moléculas de ácido nucleico que são complementares com o acima ou com partes do acima e que, como sequências completas, codificam polipeptídeos que têm essencialmente propriedades idênticas, propriedades funcionais preferidas, aos polipeptídeos descritos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO 42 ou SEQ ID NO: 43 podem também ser utilizados.
[0208] Como aqui utilizado, "condições de hibridização padrão" é para ser entendido no sentido amplo e significa, dependendo da aplicação, as condições de hibridação menos rigorosas ou mais rigorosas. Tais condições de hibridação estão descritas, inter alia, em Sambrook J. et al. 1989, páginas 9.31-9.57 ou em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.16.3.6. Um perito na arte, com base no seu conhecimento técnico, se escolher condições de hibridação que lhe permitem diferenciar entre as hibridações específicas e não específicas.
[0209] Por exemplo, as condições durante o passo de lavagem podem ser selecionadas de entre as condições de baixa restringência (com aproximadamente 2*SSC a 50 °C.) e condições de elevado rigor (com cerca de 0,2* SSC a 50 °C, de preferência a 65 °C) (20 * SSC: citrato de sódio 0,3 M, NaCl 3 M, pH 7,0). Além disso, a temperatura durante o passo de lavagem pode ser aumentada de condições de baixo rigor à temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, para condições de alto rigor a cerca de 65 °C. Os dois parâmetros, concentração de sal e temperatura, podem ser variadas em simultâneo ou então individualmente, tendo em cada caso, o outro parâmetro constante. Durante a hibridação, é também possível empregar agentes desnaturantes, tais como, por exemplo, formamida ou SDS. Na presença de 50% de formamida, a hibridação é realizada, de preferência a 42 °C. Alguns exemplos de condições preferidas para hibridação e de lavagem são passo aqui detalhado abaixo:
[0210] As condições de hibridação podem ser selecionadas, por exemplo, entre as seguintes condições: 4* SSC a 65 °C, 6* SSC a 45 °C, 6* SSC, 100 [mu] g/ml de DNA de esperma de peixe fragmentado desnaturado a 68 °C, 6* SSC, SDS 0,5%, 100 [mu] g/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado a 68 °C, 6* SSC, SDS 0,5%, 100 [mu] g/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado fragmentada, 50% de formamida a 42 °C, Formamida a 50%, 4 * SSC a 42 °C, Formamida a 50% (vol/vol), 0,1% de albumina de soro bovino, 0,1% de Ficoll, 0,1% polivinilpirrolidona, 50 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6,5, NaCl 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42 °C, 2* ou 4* SSC a 50 °C (condição de baixo rigor), 30 a 40% de formamida, 2* ou 4* SSC a 42 °C (condições de baixo rigor) ou a 500 mN tampão de fosfato de sódio pH 7,2, SDS a 7% (G/V), EDTA 1 mM, 10 [mu] g/ml de DNA de cadeia simples, BSA a 0,5% (g/V) (ver Church e Gilbert, Proc Natl Acad Sci EUA 81:1991 (1984)) (2) Os passos de lavagem podem ser selecionados, por exemplo, entre as seguintes condições: a) 0,015 M NaCl/0,0015 M citrato de sódio/0,1% SDS a 50 °C, b) 0,1* SSC a 65 °C, c) 0,1* SSC, 0,5% SDS a 68 °C, d) 0,1* SSC, 0,5% SDS, 50% de formamida a 42 °C, e) 0,2* SSC, 0,1% SDS a 42 °C, ou f) 2* SSC a 65 °C (condições de baixo rigor).
[0211] Outros exemplos de condições de hibridação são selecionados da seguinte forma:
[0212] Um tampão de hibridação contendo formamida, NaCl e PEG 6000 é escolhido.
[0213] A presença de formamida no tampão de hibridação desestabiliza moléculas de ácido nucleico de cadeia dupla, em que a temperatura de hibridação pode ser reduzida a 42 °C sem reduzindo assim o rigor. A utilização de sal no tampão de hibridação aumenta a taxa de renaturação de um DNA em cadeia dupla, em outras palavras, a eficiência de hibridação. Embora o PEG aumenta a viscosidade da solução, que tem um efeito negativo sobre as taxas de renaturação, a presença do polímero na solução aumenta a concentração da sonda na forma restante, o que aumenta a taxa de hibridação. A composição do tampão é: Tampão de hibridação: 250 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,2 1 mM de EDTA SDS a 7% (g/v) 250 mM de NaCl 10 [mu] g/ml de ssDNA 5% de polietileno glicol (PEG) 6000 40% de formamida
[0214] As hibridações são realizadas durante aproximadamente 12 horas a 42 °C, por exemplo durante a noite. Os filtros são então lavados 3* com 2* SSC + 0,1% SDS para em cada caso cerca de 10 minutos.
[0215] Tal como aqui usado a "modificação" de sequências de nucleotídeos ou sequências de aminoácidos compreende mutá-los, ou mutações. Para os fins aqui descritos, "mutações" significa a modificação da sequência de ácido nucleico de uma variante do gene em um plasmídeo ou no genoma de um organismo. As mutações podem ser geradas, por exemplo, como consequência de erros durante a replicação, ou por agentes mutagênicos. A taxa de mutação espontânea no genoma da célula de organismos é muito baixa; no entanto, o perito na arte conhece uma multiplicidade de mutagenes físicos e métodos de mutação de sequências de nucleotídeos de uma forma aleatória ou dirigida biológica, química ou, e, portanto, em última análise, também, potencialmente, para modificar as sequências de aminoácidos que eles codificam.
[0216] Mutações compreendem substituições, adições, deleções de um ou mais resíduos de ácido nucleico. As substituições são entendidas como significando a permuta de bases de ácido nucleico individuais, onde um distingue entre as transições (substituição de uma base de purina para uma base de purina, e de uma base pirimidina para uma base de pirimidina) e transversões (substituição de uma base de purina para uma pirimidina base, ou vice-versa).
[0217] A adição ou inserção é entendida como significando a incorporação de resíduos de ácidos nucleicos complementares do DNA, que pode resultar em mudanças de quadro de leitura. No caso de tais deslocamentos de quadro de leitura, distingue-se entre em-quadro inserções/adições e inserções de fora do quadro. No caso das inserções/adições em-quadro, a estrutura de leitura é retida, e um polipeptídeo que é alongado ao número dos aminoácidos codificados pelos ácidos nucleicos inseridos é formado. No caso de inserções/adições fora-do-quadro, o quadro de leitura original é perdido, e a formação de um polipeptídeo funcional e completo, em muitos casos já não é possível, o que, claro, depende do local da mutação.
[0218] Deleções descreve a perda de um ou mais pares de bases, o que também leva a mudanças de quadro de leitura no quadro ou fora do quadro e as consequências que tal implica que diz respeito à formação de uma proteína intacta.
[0219] Um perito na arte estaria familiarizado com os agentes mutagênicos (mutagênicos) que podem ser utilizados para gerar mutações aleatórias ou segmentados e ambos os métodos e técnicas que podem ser empregues. Tais métodos e mutagênicos são descritos por exemplo na van Harten AM (“Mutation breeding: theory and practical applications”, Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido (1998)), Friedberg E., Walker G., Siede W. ("DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing (1995)), ou Sankaranarayanan K., Gentile JM, Ferguson LR (" Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences (2000)).
[0220] Métodos habituais e processos de biologia molecular, tais como, por exemplo, o kit de mutagênese in vitro, "LA PCR Kit de Mutagênese in vitro" (Takara Shuzo, Kyoto), ou mutagênese por PCR, utilizando iniciadores adequados, podem ser empregues para a introdução de mutações alvejadas.
[0221] Como mencionado acima, uma multiplicidade de produtos químicos, físicos e biológicos mutagênicos existe. Os mencionados aqui a seguir são dados a título de exemplo, mas não por limitação.
[0222] Mutagenes químicos podem ser divididos de acordo com o seu mecanismo de ação. Assim, não são análogos de base (por exemplo, 5-bromouracilo, 2- aminopurina), agentes de alquilação de mono e bifuncionais (por exemplo mono agentes funcionais, tais como sulfonato de acetato de metila, sulfato de dimetila, ou agentes bifuncionais, tais como sulfito de dicloroetila, mitomicina, nitrosoguanidina dialquil nitrosamina, derivados de N- nitrosoguanidina) ou substâncias intercalantes (por exemplo, acridina, brometo de etídio).
[0223] Exemplos de agentes mutagênicos físicos são radiações ionizantes. As radiações ionizantes são ondas eletromagnéticas ou radiações corpusculares que são capazes de ionização, isto é, moléculas de remoção de eletrões a partir deles. Os íons que permanecem são na maioria dos casos altamente reativos de modo que, no caso em que eles são formados em tecido vivo, são capazes de causar grandes danos, por exemplo, para ao DNA e, assim, induzir mutações (de baixa intensidade). Exemplos de radiações ionizantes são radiação gama(energia dos fótons de cerca de um mega-elétron volt MeV), radiação de raios-X (energia dos fótons de vários ou muitos elétrons quilo keV volts) ou então a luz ultravioleta (luz UV, a energia de fótons de mais de 3,1 eV) . Luz UV provoca a formação de dímeros entre as bases, os dímeros de timidina são as mais comuns, e estes dão origem a mutações.
[0224] Exemplos da geração de mutantes pelo tratamento das sementes com os agentes de mutagênese podem incluir sulfonato de metil acetato (EMS) (Birchler, JA e Schwartz, D., Biochem Genet 17 (11-12), 1173 (1979); Hoffmann, GR, Mutat. Res. 75 (1), 63 (1980)) ou a radiação ionizante foi agora adicionada à utilização de agentes mutagênicos biológicos, por exemplo, os transposons (por exemplo Tn5, Tn903, Tn916, Tn1000, Maio PA et al, Proc. Natl. Acad Sci. EUA. 100 (20), 11541 (2003)), ou métodos de biologia molecular, tais como a mutagênese por inserção de T-DNA (Feldman, KA, Plant Journal 1, 71 (1991), Koncz, C, et al., Plant Mol. Biol 20: 963-76 (1992)).
[0225] Para gerar variantes de gene mutado, mutagenes químicos ou biológicos podem ser utilizados. Entre os agentes químicos, é especialmente preferido para gerar mutantes por mutagênese utilizando EMS (etil-metil- sulfonato). Entre a geração de mutantes utilizando agentes mutagênicos biológicos, pode ser utilizada a mutagênese de DNA-T ou a mutagênese de transposon.
[0226] Assim, por exemplo, também é possível empregar polipeptídeos nos métodos aqui descritos, que são obtidos como resultado de uma mutação de uma sequência de nucleotídeos, tais como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44.
[0227] Tal como aqui utilizado, o termo "recombinante" significa, por exemplo no que diz respeito a uma sequência de ácido nucleico, um cassete de expressão ou um vetor que compreende a sequência de ácido nucleico ou um organismo transformados com a sequência de ácido nucleico, cassete de expressão ou vetor, todos esses construtos ou organismos que são o resultado de métodos recombinantes e em que ou (a) a sequência de ácido nucleico de proteína FMO ou (b) uma sequência de controle genético, por exemplo, um promotor, o qual é operacionalmente ligado com a sequência de ácido nucleico que codifica a FMO, ou (c) (a) e (b) não se encontram no seu ambiente genético natural ou que tenham sido modificados por métodos recombinantes, sendo possível para a alteração a ser, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, ou inserção de um ou mais nucleotídeos resíduo (s).
[0228] Ambiente genético natural o locus cromossômico natural no organismo de origem, ou a presença de uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucleico é preferencialmente retido pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimento de sequência de pelo menos 50 bp, 500 bp, pelo menos, pelo menos, de 1000 bp, pelo menos 5000 bp. Um exemplo cassete de expressão que ocorre naturalmente, a combinação de ocorrência natural do promotor constitutivo de proteína FMO com a proteína FMO correspondente de gene torna-se um cassete de expressão recombinante, quando este último é modificado por meio não- natural, ("artificial") métodos sintéticos tais como, por exemplo, mutagenização. Os métodos adequados foram descritos (Pat EUA N ° 5.565.350;. WO 00/15815).
[0229] Tal como aqui utilizado, o termo "transgênico" refere-se a um organismo, por exemplo, uma planta, célula de planta, calo, tecido de planta, ou parte da planta que contém exogenamente o ácido nucleico, construto recombinante, vetor ou cassete de expressão aqui descrito ou uma parte da mesma o qual é introduzido através de processos não-biológicos, essencialmente, de um modo preferido por transformação de agrobactéria. O construto recombinante, ou uma parte do mesmo é estavelmente integrado em um cromossomo, de forma que ele é passado a gerações sucessivas por propagação clonal, ou propagação vegetativa a propagação sexuada.
[0230] Uma planta transgênica, célula de planta ou tecido para os fins dos métodos e produtos aqui descrito é, portanto, entendido no sentido de que um ácido nucleico exógeno FMO, construto recombinante, vetor ou cassete de expressão incluindo um ou mais ácidos nucleicos FMO é integrado no genoma por meios de tecnologia genética.
[0231] Em outra preferida a dita uma ou mais sequências de codificação de proteína FMO compreende, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica para pelo menos um polipeptídeo que compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40 , SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0232] Em uma outra modalidade preferida, a dita uma ou mais sequências de codificação de proteína FMO compreende uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica para um polipeptídeo, em que o polipeptídeo tem pelo menos 90% de identidade com a sequência como apresentado na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0233] Em uma outra modalidade preferida, a dita uma ou mais sequências de codificação de proteína FMO compreende uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica para um polipeptídeo, em que o polipeptídeo tem pelo menos 80% de identidade com a sequência como apresentado na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 38 a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43.
[0234] Em uma outra modalidade preferida, a dita uma ou mais sequências de codificação de proteína FMO compreende uma molécula de ácido nucleico exógeno que compreende pelo menos um polipeptídeo, em que o polipeptídeo tem pelo menos 70% de identidade com a sequência como apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 , SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44.
[0235] O termo ácido nucleico "exógeno" refere- se a um ácido nucleico que foi introduzido em uma planta por meio de tecnologia genética. Um ácido nucleico "exógeno" pode ou não ocorrer em numa unidade na sua forma natural, ser diferente do ácido nucleico em causa, conforme se encontra em uma planta na sua forma natural, ou pode ser idêntico a um ácido nucleico encontrado em uma planta na sua forma natural, mas não integrado no seu ambiente de genética natural. O significado correspondente de "exógeno" é aplicado no contexto da expressão da proteína. Por exemplo, uma planta transgênica que contém um transgene, ou seja, um ácido nucleico exógeno, pode, quando comparado com a expressão do gene endógeno, encontrar um aumento substancial da expressão do respectivo gene ou proteína no total. Uma planta transgênica de acordo com os métodos aqui descritos e produtos inclui um ácido nucleico exógeno integrado FMO em quaisquer loci genéticos e, opcionalmente, a planta também pode incluir o gene endógeno no fundo genético natural.
[0236] Em uma modalidade, um método para aumentar a tolerância ao estresse de seca em uma planta ou organismo podem incluir o aumento dos níveis de TMAO, aumentando a expressão de uma proteína FMO ou um seu fragmento funcional, ou uma variante de junção dos mesmos na planta ou organismo fotossintético, em que a proteína FMO é codificada por (i) um ácido nucleico exógeno possuindo pelo menos 50% de identidade, pelo menos 60% de identidade, pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44; ou uma variante de junção dos mesmos; (ii) um aminoácido endógeno que codifica uma proteína possuindo pelo menos 50% de identidade de, pelo menos, 60%, pelo menos, 70% de identidade de sequência, pelo menos, 80%, pelo menos, 90%, pelo menos, 95%, em menos, 98%, pelo menos, 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, um seu fragmento funcional ; a proteína codificada confere tolerância ao estresse hídrico em relação ao controle de plantas; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar sob condições rigorosas com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); que codifica uma proteína FMO; em que os códigos de moléculas de aminoácidos de um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; a proteína codificada confere reforçada tolerância ao estresse hídrico em relação ao controle de plantas; e/ou por (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína FMO como qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas diferindo dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degenerescência do código genético é uma outra modalidade da invenção.
[0237] O aumento da tolerância de estresse à seca na planta ou organismo fotossintético também pode ser obtido através da manipulação da expressão da própria proteína da planta, isto é, a proteína endógena, que corresponde à proteína, ou de uma sequência de nucleotídeos endógena, que constitui uma sequência, e o qual pode também compreender a região 5' e/ou 3'-UTR. É, então, uma sequência de nucleotídeo ou peptídeo endógeno, a qual medeia um aumento da tolerância de estresse à seca ou é uma sequência de aminoácidos que codifica uma tal proteína. Esta manipulação pode ser conseguida por qualquer modificação da sequência, frequentemente uma mutação, mas também, por exemplo, através de uma modificação da sequência de DNA do promotor do gene que codifica a proteína. Uma tal modificação, o que resulta em um aumento, a taxa de expressão modificada, do gene endógeno, pode ser efetuada por meio de deleção ou inserção de sequências de DNA. Como regra geral, uma modificação da região 5'-UTR no total e/ou da sequência de promotor de genes endógenos vai conduzir a uma modificação da quantidade expressa do gene e/ou a função do gene ou produto de gene expresso, e, portanto, também a uma modificação da atividade que possa ser detectada na célula ou nas plantas. A modificação da região 5'-UTR no total e/ou sequência do promotor do gene endógeno pode também conduzir a uma alteração da quantidade de, e/ou a função de uma proteína na célula. Por favor note que um aumento na expressão ou função é entendido como significando aqui tanto a ativação ou aumento da expressão ou função da proteína endógena, incluindo uma expressão de novo, o aumento da atividade da proteína, e um aumento ou melhoria de expressão de proteínas transgênicas ou fator.
[0238] Outro método de aumentar a atividade e o teor da proteína endógena pode incluir regular a fatores de transcrição, que estão envolvidos na transcrição do gene endógeno correspondente, por exemplo, por meio de sobre- expressão. Os meios para sobre-expressar fatores de transcrição são conhecidos dos especialistas e são também descritos para proteínas dentro do contexto da presente invenção.
[0239] Além disso, um aumento da expressão do gene endógeno, tal como aqui descrito pode ser conseguido por uma proteína reguladora, que não está presente no organismo não transformado, interagindo com o promotor destes genes. Um tal regulador pode assumir a forma de uma proteína quimérica que consiste de um domínio de ligação ao DNA e um domínio ativador de transcrição, tal como descrito por exemplo em WO 96/06166.
[0240] O cDNA que codifica a proteína (ou o mRNA incluindo a sequência (s) UTR) sequência para a expressão numa célula de uma planta ou organismo fotossintético que, após a expressão do DNA para o RNA e a transcrição do RNA para produzir um peptídeo ou polipeptídeo codificado , aumenta a capacidade da planta ou organismo fotossintético ou célula de planta para resistir a um estresse abiótico ou biótico, ou aumenta o rendimento ou o valor da planta ou organismo fotossintético, ou uma cultura ou do produto produzido a partir da planta ou organismo fotossintético.
[0241] A introdução de uma planta ou organismo de um cassete de expressão compreendendo, por exemplo, a proteína FMO (SEQ ID NO: 1-44) em um organismo fotossintético ou células de planta, tecido de planta, partes da planta, tais como cloroplastos, peças ou sementes do mesmo pode vantajosamente ser realizada utilizando vetores que compreendem os cassetes de expressão. O cassete de expressão pode ser introduzido no vetor (por exemplo o vetor PROK2, ou o vetor pCAMBIA) através de um sítio de clivagem de restrição adequada. O plasmídeo obtido é primeiro introduzido em células de E. coli. Células de E. coli transformadas são selecionadas corretamente, cultivadas, e o plasmídeo recombinante é obtido utilizando os métodos com que uma pessoa versada na técnica está familiarizada. A análise de restrição e sequenciação podem ser utilizados para verificar o passo de clonagem.
[0242] Os vetores podem tomar a forma de, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus ou então agrobactérias e podem ser introduzidos por meio de vetores plasmídicos. Exemplos de vetores são aqueles que tornam possível uma integração estável do cassete de expressão no genoma do hospedeiro.
[0243] Uma variedade de métodos (Keown et al, Methods in Enzymology 185, 527 (1990)) estão disponíveis para a introdução de um construto desejado em uma planta ou organismo, que é dita como transformação (ou transdução ou transfecção). Assim, o DNA ou o RNA pode ser introduzido, por exemplo, diretamente por meio de micro-injeção ou por bombardeamento com micropartículas revestidas com DNA. Além disso, é possível quimicamente permeabilizar a célula, por exemplo, utilizando polietileno-glicol, de modo que o DNA possa chegar a célula por difusão. O DNA também pode ser introduzido na célula por meio de fusão de protoplastos com outras unidades que compreendem DNA, tais como, células minicélulas, lisossomas ou lipossomas. Um outro método adequado de DNA é a introdução de eletroporação, em que as células são reversivelmente permeabilizadas por meio de um impulso elétrico. Exemplos de tais métodos têm sido descritos em Bilang et al, Gene 100, 247 (1991); Scheid et al, Mol. Gen. Genet. 228, 104 (1991); Guerche et al, Plant Science 52, 111 (1987); Neuhause et al, Theor. Appl. Genet. 75, 30 (1987); Klein et al, Nature 327, 70 (1987); Howell et al, Science 208, 1265 (1980); Horsch et al, Science 227, 1229 (1985); DeBlock et al, Plant Physiology 91, 694 (1989); "Methods for Plant Molecular Biology" (Weissbach e Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); e "Métodos em Biologia Molecular de Plantas" (Schuler e Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989).
[0244] Em plantas, os métodos acima descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de células de tecido de planta ou planta são exploradas para fins de transformação transitória ou estável. Métodos adequados são, principalmente, transformação de protoplastos por meio de incorporação de DNA induzidO por Polietileno- glicol, o método biolístico com a pistola de genes, conhecido como o método de bombardeamento de partículas, a eletroporação, a incubação de embriões secos em solução compreendendo DNA, e microinjeção.
[0245] A transformação pode também ser efetuada por infecção bacteriana, por meio de agrobactéria tumefaciens ou agrobactéria rhizogenes. Os métodos são descritos por exemplo em Horsch et al. Ciência 225, 1229 (1985).
[0246] Se Agrobactérias são usadas para transformação, o cassete de expressão pode ser integrado em plasmídeos específicos, o que pode ser um serviço de transporte ou vetor intermediário ou um vetor binário. Se um plasmídeo Ti ou Ri for utilizado para a transformação, pelo menos, a fronteira direita, mas na maioria dos casos, tanto a fronteira direita e a esquerda, do plasmídeo Ti ou Ri de T-DNA que flanqueia a região está ligada com o cassete de expressão a ser introduzido.
[0247] Os vetores binários são capazes de se replicar em uma variedade de organismos, incluindo mas não se limitando a E. coli e em agrobactéria. Como uma regra, que compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante flanqueado pela direita e a sequência de fronteira de T-DNA esquerda. Eles podem ser transformados diretamente em agrobactéria (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978)). O gene marcador de seleção, por exemplo, o gene nptII, que medeia a resistência a canamicina, permite agrobactéria transformada para ser selecionada. A agrobactéria que, no presente caso, atua como o organismo hospedeiro já deve compreender um ajudante de plasmídeo Ti com a região vir, que é necessária para a transferência do T-DNA para a célula da planta. Uma agrobactéria transformada deste modo pode ser utilizada para transformar células de plantas. A utilização de T-DNA para a transformação de células de plantas tem sido estudada e descrita em grande detalhe (EP 120 516; Hoekema, em "The Binary Planta Vetor System", Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Capítulo V; An et al EMBO J. 4, 277 (1985)). Vários vetores binários são conhecidos e, em alguns casos comercialmente disponíveis, tais como, por exemplo, bpI101.2 ou bpIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
[0248] No caso de que DNA ou RNA é injetado ou eletroporado em células de plantas, o plasmídeo utilizado não necessita satisfazer as exigências particulares. Podem ser utilizados plasmídeos simples tais como os da série pUC. Se as plantas intactas devem ser regeneradas a partir das células transformadas, é necessário que um gene marcador de seleção adicional seja localizado no plasmídeo.
[0249] As células transformadas de forma estável, ou seja, aquelas que compreendem o DNA introduzido integrado no DNA da célula hospedeira, podem ser distinguidas das células não transformadas, quando um marcador de seleção é constitutivo do DNA introduzido (McCormick et al, Plant Cell Reports 5, 81 (1986)). Por exemplo, qualquer gene que é capaz de mediar uma resistência a antibióticos ou a herbicidas (tais como canamicina, G 418, bleomicina, higromicina ou fosfinotricina) pode atuar como um marcador. As células transformadas que expressam um gene marcador tal são capazes de sobreviver na presença de concentrações de um antibiótico ou herbicida adequado que destroem um tipo selvagem não transformado. Exemplos incluem o gene bar, que medeia a resistência ao herbicida fosfinotricina (Rathore et al, Plant Mol Biol. (5), 871 (1993). 21), o gene nptII, que medeia a resistência à canamicina, o gene hpt, que medeia resistência à higromicina, ou o gene EPSP, que medeia a resistência ao herbicida glifosato. As plantas resultantes podem ser criadas e hibridizadas no modo habitual. Dois ou mais gerações deve ser cultivada, a fim de assegurar que a integração genômica estável e hereditária.
[0250] Métodos adicionais podem ser descritos em Jones et al. ("Techniques for Gene Transfer", em "Transgenic Plants", Vol. 1, Engenharia e utilização, editado por Kung SD e Wu R., Academic Press, p. 128-143 (1993), e em Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Planta Moles. Biol. 42, 205 (1991)). É preferível clonar o construto para ser expresso em um vetor que é adequado para a transformação de agrobactéria tumefaciens, por exemplo, em bpin 19 (Bevan et al, Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)).
[0251] Quando tiver sido gerada uma célula de planta transformada, uma planta intacta pode ser obtida utilizando métodos conhecidos de um perito na arte. Um exemplo de um material de partida utilizado aqui estão calos. A formação de raiz de rebentos e a partir desta biomassa celular ainda indiferenciada pode ser induzida de uma forma conhecida. As mudas obtidas podem ser plantadas e criadas.
[0252] Um perito na arte conhece também os métodos para a regeneração de partes de plantas e plantas intactas a partir de células de plantas. Por exemplo, os métodos descritos por Fennell et al, Plant Cell Rep, 11, 567 (1992); Stoeger et al, Plant Cell Rep 14, 273 (1995).; Jahne et al, Theor. Appl. Genet. 89, 525 (1994), são utilizados para esta finalidade.
[0253] As moléculas de ácido nucleico recombinantes aqui descritas compreendem os seguintes elementos em orientação 5’-3': sequências reguladoras de um promotor que é ativo em células de plantas, uma sequência de DNA em tais ligações operativas, se for caso disso, sequências reguladoras, que, na célula da planta, podem agir como transcrição, terminação e/ou sinais de poliadenilação em tais ligações operacionais.
[0254] Na expressão recombinante constrói/cassetes de expressão, uma molécula de ácido nucleico cuja expressão (transcrição e, se for caso disso, a tradução) gera uma proteína FMO está em ligação operável com, pelo menos, um elemento genético de controle (por exemplo, um promotor) que assegura a sobre-expressão em plantas. Se o construto de expressão é para ser introduzido diretamente no organismo vegetal ou fotossintético e a proteína FMO que nele se acumula em plantas ou organismos fotossintéticos, elementos de controle genético, em seguida, específico da planta (por exemplo, promotores) são preferidos. No entanto, a proteína FMO também pode ser gerada em outros organismos ou in vitro e, em seguida, introduzida na planta. Neste contexto, a preferência é dada a todos os elementos de controle genético procariotas ou eucariotas (por exemplo, promotores) que permitem a sobre-expressão na planta selecionada em cada caso para a produção.
[0255] O construto de vetor recombinante ou construto de expressão/cassete é fornecido compreendendo: (i) um ácido nucleico possuindo pelo menos 50% de identidade, pelo menos 60% de identidade, pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 , SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44; ou uma variante de junção dos mesmos; (ii) um aminoácido que codifica para uma proteína possuindo pelo menos 50% de identidade, pelo menos 60% de identidade de, pelo menos, 70% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 90%), pelo menos 95%, pelo menos 98 %, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 , 32, 34, 36, 38, 39 ou 41; a proteína codificada confere reforçada tolerância ao estresse hídrico em relação ao controle de plantas; (iii) um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições rigorosas com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); que codifica uma proteína de FMO; em que os nucleicos códigos molécula de ácido para um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idêntico ao polipeptídeo descrito na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, 34, 36, 38, 39 ou 41; a proteína codificada confere reforçada tolerância ao estresse hídrico em relação ao controle de plantas; e/ou (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína FMO como qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas diferenciando-se dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degenerescência o código genético, operacionalmente ligado com (b) um promotor e (c) uma sequência de terminação da transcrição.
[0256] Arranjos são aqueles em que a sequência de ácido nucleico a ser expressa de forma recombinante é posicionada após a sequência que atua como promotor, de modo a que as duas sequências estão ligadas covalentemente umas com as outras. Neste contexto, é a distância entre a sequência promotora e a sequência de ácido nucleico a ser expressa de forma recombinante é menos do que 200 pares de bases, ou menos do que 100 pares de bases, ou menos do que 50 pares de bases.
[0257] A geração de uma ligação funcional e a geração de um cassete de expressão pode ser realizado por meio de técnicas de recombinação e clonagem usuais, como descrito por exemplo em Sambrook J. (1989), em Silhavy TJ, Berman ML e LW Enquist "Experiments witg Gene Fusions", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (Nova Iorque) (1984), em Ausubel FM et al,"Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience (1987) e em Gelvin et al, em "Plant Molecular Biology manual" (1990). No entanto, também é possível posicionar, entre as duas sequências, sequências adicionais que exercem por exemplo a função de um ligante, com sítios específicos de clivagem por enzimas de restrição, ou de um peptídeo de sinal. A inserção de sequências pode também conduzir à expressão de proteínas de fusão. Prefere-se que o cassete de expressão, consistindo de uma ligação do promotor e a sequência de ácido nucleico a ser expressa, pode estar presente na forma integrada no vetor e inserido no genoma de uma planta por, por exemplo, transformação.
[0258] O método aqui descrito pode ser vantajosamente combinado com outros métodos que produzem uma resistência ao agente patogênico (por exemplo, contra insetos, fungos, bactérias, nematoides e semelhantes), tolerância ao estresse ou outra melhoria das características da planta. São mencionados exemplos, nomeadamente, no Dunwell J. M., J. Exp. Bot. 51, (Spec n) 487 (2000).
[0259] As moléculas de ácido nucleico aqui descritas podem compreender moléculas de ácidos nucleicos que codificam para proteínas GS-FMO OX5 de Arabidopsis de acordo com os polinucleotídeos da SEQ. ID NO: 1, e as sequências de ácidos nucleicos que são complementares à mesma, conforme mostrado na Figura 2, e as sequências que são derivados, devido à degenerescência do código genético, em que as moléculas de ácido nucleico que não consistem em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44. As moléculas nucleicas aqui descritas podem compreender moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas GS-FMO OX3 de plantas de pepino de acordo com os polinucleotídeos das SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, e as sequências de ácidos nucleicos que são complementares das mesmas, e as sequências que são derivadas, devido à degenerescência do código genético, em que as moléculas de ácido nucleico não consistem em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44.
[0260] Cassetes de expressão transgênica também pode ser desenvolvidos para a expressão de proteínas FMO onde os cassetes podem compreender uma das sequências de ácido nucleico da molécula de ácido nucleico incluindo mas não se limitando a SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 , SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 44; ou um fragmento do mesmo. Nos cassetes de expressão transgênica, a sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas FMO de Arabidopsis está ligada com pelo menos um elemento de controle genético, tal como definido acima, de tal maneira que a expressão (transcrição e, se for caso disso, a tradução) podem ser efetuadas em qualquer organismo, geralmente em plantas dicotiledôneas. Elementos de controle genético que são adequados para esta finalidade são descritos acima. Os cassetes de expressão transgênicos podem também compreender elementos funcionais adicionais, tal como definidos acima.
[0261] Tais cassetes de expressão podem compreender uma sequência de ácido nucleico que é essencialmente idêntica a uma molécula de ácido nucleico tal como mostrada em SEQ ID No .: G SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO : 44; ou um fragmento do mesmo, em que a sequência de ácido nucleico está na orientação de sentido ou em anti-sentido de orientação em relação a um promotor e pode, consequentemente, levar a expressão do RNA do sentido ou anti-sentido, o promotor sendo um promotor que é ativo em plantas, normalmente um promotor que pode ser induzido por um ataque de agentes patogênicos. São também aqui proporcionados vetores transgênicos que compreendem os cassetes de expressão transgênicos.
[0262] Um promotor é uma região de DNA, que inclui as sequências suficientes para causar a transcrição de uma sequência associada (a jusante). O promotor pode ser regulado, p.ex., não atuando constitutivamente para causar a transcrição da sequência associada. Se indutível, existem sequências nele presentes que medeiam a regulação da expressão de modo a que a sequência associada é transcrita apenas quando uma molécula de indutor estiver presente. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA que mostra atividade transcricional escolhidas nas células de plantas, partes de plantas, ou plantas. O promotor pode ser constitutivo ou indutível. Ele pode ser de ocorrência natural, pode ser composto por porções de vários promotores que ocorrem naturalmente, ou podem ser parcialmente ou totalmente sintético. Além disso, a localização do promotor em relação ao início da transcrição pode ser otimizada. Muitos promotores adequados para utilização em plantas ou organismos fotossintéticos são bem conhecidos na arte, como são sequências de nucleotídeos, que aumentam a expressão de uma sequência associada expressável.
[0263] Uma variedade de promotores pode ser utilizada nos métodos aqui descritos, incluindo um promotor indutível de seca, um promotor de epiderme, um promotor específico de mesófilo, ou um promotor induzido por estresse (por exemplo RD29 (Singh et al Plant Cell Rep. 30: 1019-1028 (2011)). O promotor pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de um promotor induzido por: estresse osmótico, estresse de seca, estresse de frio, estresse de calor, estresse oxidativo, deficiência de nutrientes, infecção por fungos, infecção por um oomiceto, infecção por um vírus, infecção por uma bactéria, infestação de nematódeos, infestação de pragas, infestação de plantas daninhas, e herbivoria.
[0264] Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Isto é, os ácidos nucleicos podem ser combinados com constitutivos, preferível em tecidos, ou outros promotores para a expressão na célula hospedeira de interesse. O promotor pode ser constitutivo ou indutível. Ele pode ser de ocorrência natural, pode ser composto por porções de vários promotores que ocorrem naturalmente, ou podem ser parcialmente ou totalmente sintético. Orientações para a concepção de promotores é comumente conhecido na técnica. Além disso, a localização do promotor em relação ao início da transcrição pode ser optimizada. Muitos promotores adequados para utilização em plantas são bem conhecidos na arte, como são sequências de nucleotídeos, que aumentam a expressão de uma sequência associada expressável. Um exemplo de um construto de DNA com um promotor adequado pode incluir uma sequência de nucleotídeos em ligação operativa com um promotor indutível por estresse ou um promotor específico de epiderme e/ou mesófilo.
[0265] Promotores específicos de plantas significam, em princípio, qualquer promotor que seja capaz de controlar a expressão de genes, em particular genes estranhos em plantas ou partes de plantas, células vegetais, tecidos vegetais, culturas de plantas. Aqui, a expressão pode ser, por exemplo constitucional, indutível ou dependente do desenvolvimento.
[0266] Em uma modalidade preferida, o promotor é um promotor constitutivo, de preferência um promotor indutível de estresse, mais preferencialmente um promotor indutível de estresse hídrico.
[0267] Tal como aqui utilizado promotor "constitutivo" significa aqueles promotores que asseguram a sobre-expressão em vários tecidos ao longo de um período relativamente grande do desenvolvimento da planta, em todos os momentos durante o desenvolvimento da planta. Em particular, um promotor de planta ou um promotor derivado de um vírus de planta com os métodos aqui descritos, incluindo mas não se limitando a transcrição 35S do vírus do mosaico da couve flor CaMV (Franck et al, Cell 21, 285 (1980); Odell et al. Nature 313, 810 (1985); Shewmaker et al, Virology 140, 281 (1985); Gardner et al. Plant Mol Biol 6, 221 (1986)) ou o promotor de CaMV 19S (Patente US N ° 5352606; WO 84/02913; Benfey et al, EMBO J. 8, 2195-2202 (1989)). Um promotor constitutivo ainda mais adequado é o promotor da subunidade pequena da Rubisco (SSU) (Pat. U.S. No. 4962028), o promotor da nopalina sintase de agrobactéria, o promotor duplo TR, a agrobactéria OCS (octopina sintetase), o promotor de ubiquitina (Holtorf S et al. Plant Mol Biol 29, 637 (1995)), o promotor da ubiquitina 1 (Christensen et al Plant Mol Biol 18, 675 (1992); Bruce et al Proc Natl Acad Sci EUA 86, 9692 (1989)), o promotor Smas, o promotor da álcool- desidrogenase-cinamilo (Patente US N ° 5683439), os promotores de subunidades ATPase vacuolar ou o promotor de uma proteína rica em prolina de trigo (WO 91/13991), e outros promotores de genes cuja expressão constitutiva em plantas é conhecida do especialista, incluindo o promotor do gene nitrilase-1 (nitl) o de A. thaliana (GenBank Acc.- No.:Y07648.2, Nucleotídeo 2.456-4.340, Hillebrand et al. gene 170, 197 (1996)).
[0268] Assim, em uma modalidade preferida, a sobre-expressão da proteína de uma ou mais sequências de codificação de FMO em métodos da invenção é uma sobre- expressão constitutiva. Em outra
[0269] Promotores específicos de sementes são, por exemplo, o promotor de faseolina (Patente US N ° 5.504,200.; Celular Bustos et al Planta 1 (9), 839 (1989)) do gene de albumina 2S (Joseffson et al. J Biol Chem 262, 12196 (1987)), de legumina (Shirsat et al Mol Gen Genet 215 (2)., 326 (1989)), da USP (proteína de semente desconhecida; Baumlein et al Mol Gen Genet 225 3), 459 (1991)), o gene da napina (Patente US N ° 5.608.152; Stalberg et al. L Planta 199, 515 (1996)), do gene que codifica para a proteína de ligação de sacarose (documento WO 00/26388) ou o promotor de legumina B4 (LeB4;. Baumlein et al Mol Gen Genet 225, 121 (1991); Baumlein et al Plant Journal 2 (2), 233 (1992); Fiedler et al. Biotechnology (NY), 13 (10), 1090 (1995)), o promotor da oleosina de Arabidopsis (documento WO 98/45461), o promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980). Além disso os promotores específicos de sementes adequados são os dos genes que codificam glutenina de alto peso molecular (HMWG), gliadina, ramificação de enzima, pirofosfatase ADP glicose (AGPase) ou amido sintase. Outros promotores podem incluir aquela expressão específica de semente que permita, em monocotiledôneas tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. É possível e vantajoso utilizar o promotor do gene Ipt2 ou Ipt1 (WO 95/15389, WO 95/23230) ou os promotores descritos em WO 99/16890 (promotores do gene hordeína, do gene glutelina, do gene orizina, do gene prolamina, do gene gliadina, do gene da zeína, do gene ou do gene Kasirin secalina).
[0270] Promotores específicos de tubérculo, raíz armazenda ou raíz são, por exemplo, o promotor de patatina classe I (B33) ou o promotor do inibidor da catepsina D de batata.
[0271] Promotores específicos de folha são, por exemplo, o promotor da FBPase citosólica de batata (WO 97/05900), o promotor SSU (subunidade pequena) de Rubisco (carboxilase de ribulose-1,5-bisfosfato) ou o promotor ST- LSI de batata (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)). Promotores de epiderme específicos são, por exemplo, o promotor do gene OXLP ( "oxalato oxidase como proteína"; Wei et al Plant Mol Biol 36, 101 (1998)) e um promotor que consiste no promotor GSTA1 e o intrão WIRla (documento WO 2005/035766) e o promotor GLP4 (WO 2006/062747 2006/1288832 PCT/EP).
[0272] Exemplos de outros promotores específicos de tecido são os seguintes: promotores específicos de flor, por exemplo, o promotor da fitoeno- sintetase (documento WO 92/16635) ou o promotor do gene Prr (documento WO 98/22593) e promotores específicos das anteras, por exemplo, o promotor de 5126 (US Pat. No. 5.689.049, 5.689.051), o promotor glob-I e o promotor [gamma]-zein.
[0273] Os cassetes de expressão podem também compreender um promotor quimicamente indutivel (Artigo de revisão: Gatz et al, Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol 48, 89 (1997)) através do qual a expressão do gene exógeno, em que a planta pode ser controlada em um ponto particular no tempo. Promotores deste tipo, tais como, por exemplo, o promotor PRP1 (Ward et al., Plant Mol Biol 22, 361 (1993)), um promotor indutível por ácido salicílico (documento WO 95/19443), um promotor indutível por benzenossulfonamida (EP 0 388 186), um promotor indutível por tetraciclina (Gatz et al. Planta J2, 397 (1992)), um promotor indutível por ácido abscísico (EP 0 335 528) e um promotor indutível por etanol ou ciclo-hexanona (WO 93/21334) podem igualmente ser utilizados.
[0274] Promotores indutíveis patogênicos que tornam possível apenas uma expressão quando requerido (isto é, no caso de ataque por agentes patogênicos). Em uma modalidade, o método utiliza, consequentemente, os promotores que são ativos em plantas que são promotores indutíveis por organismos patogênicos. Promotores indutíveis patogênicos compreendem os promotores de genes que são induzidos como resultado do ataque de agentes patogênicos, tais como, por exemplo, os genes de proteínas PR, proteínas de SAR, [beta] -1,3-glucanase, quitinase, etc. (por exemplo Redolfi et al. Neth J Planta Pathol 89, 245 (1983); Uknes et al Plant Cell 4, 645 (1992); Van Loon. Plant Mol viral 4, 111 (1985); Marineau et al Plant Mol Bid 9, 335 (1987); Matton et al Molecular Plant-Microbe Interations 2, 325 (1987); Somssich et al Proc Natl Acad Sci EUA 83, 2427 (1986);. Somssich et al Mol Gen Genetics 2, 93 (1988); Chen et al. Plant J 10, 955 (1996); Zhang and Sing Proc Natl Acad Sci EUA 91, 2507 (1994); Warner, et al Planta J 3, 191 (1993);. Siebertz et al Plant Cell 1, 961 (. 1989)).
[0275] Um promotor adicional para a sobre- expressão das proteínas FMO, tal como aqui descrito pode incluir promotores indutíveis a ferimentos tais como os do gene de pinII (Ryan Ann Rev. Phytopath 28, 425 (1990); Duan et al. Nat Biotech 14, 494 (1996)), do gene wun2 e wun2 (Pat. N ° 5428148), do gene e win1 win2 (Stanford et al., Mol Gen Genet 215, 200 (1989)), da Systemin gene (McGurl et al, Science 225, 1570 (1992)), do gene WIP1 (Rohmeier et al. Plant Mol Biol 22, 783 (1993); Eckelkamp et al. FEBS Letters 323, 73 (1993)), do gene MPI (Corderok et al. Planta J 6 (2), 141 (1994)) e semelhantes.
[0276] Uma fonte de novos promotores indutíveis de patógeno podem incluir a (PR) família de genes relacionada com patogênese. Uma série de elementos estes promotores têm- se revelado vantajosa. Assim, a região de nucleotídeos do nucleotídeo -364 ao nucleotídeo -288 no promotor de PR-2d medeia especificidade a salicilato (Buchel et al. Plant Mol Biol 30, 493 (1996)). Em tabaco, esta região se liga uma proteína nuclear cuja abundância é aumentada por salicilato. Os promotores PR-1 de tabaco e de Arabidopsis (EP-A 0 332 104, WO 98/03536) são também adequados como promotores indutíveis por patógeno. Também é útil, uma vez que particularmente especificamente induzido por agentes patogênicos, são os promotores de "ácido PR-5" (aPR5) a partir de cevada (Schweizer et al Plant Physiol 114, 79 (1997)) e trigo (Rebman et al Plant Mol Biol 16., 329 (1991)). A proteínas PR5 acumulam dentro de aproximadamente 4 a 6 horas após o ataque de patógenos e só mostram muito pouca expressão de fundo (WO 99/66057). Uma abordagem para a obtenção de uma especificidade aumentada induzida pelo agente patogênico, é a geração de promotores sintéticos a partir de combinações de elementos responsivos de agentes patogênicos conhecidos (Rushton et al Plant Cell 14, 749 (2002); WO 00/01830; WO 99/66057). Outros promotores de agentes patogênicos indutível de diferentes espécies são conhecidos do especialista (EP-A 1 165 794; EP-A 1 062 356; EP-A 1 041 148; EP-A 1 032 684).
[0277] Outros promotores indutíveis por patógeno compreendem o promotor Flachs Fisl (documento WO 96/34949), o promotor Vst1 (Schubert et al., Plant Mol Biol 34, 417 (1997)) e o promotor EAS4 tabaco sesquiterpeno ciclase (Pat. No. 6.100.451).
[0278] Outros promotores são aqueles que são induzidos pelo estresse biótico ou abiótico, tais como, por exemplo, o promotor indutível por patógeno do gene PRPR1 (ou promotor gst1), por exemplo de batata (WO 96128561; Ward et al Plant Mol Biol 22, 361 (1993)), o promotor de hsp70 ou hsp80 induzido pelo calor de tomate (Pat. N ° 5187267), o promotor de alfa-amilase indutível por frio de batata (WO 96/12814) e o promotor PPDK indutível por luz ou o promotor indutível por ferimento pinII (EP-A 0 375 091).
[0279] Em uma modalidade, os métodos aqui descritos empregam promotores mesofilo-específicos de tecidos, tais como, por exemplo, o promotor da germina trigo 9F-3,8 gene (GenBank Acc.-No.: M63224) ou o promotor de cevada Gera (WO 02/057412). Os promotores são particularmente vantajosos, uma vez que são ambos mesofilo- específicos de tecido e indutível a patógeno. Também adequado é o promotor específico do tecido de Arabidopsis CAB-2- mesofilo (GenBank Acc.-No.: 5222 XI), e o promotor PPCZml Zea mays (GenBank Acc.-No.: X63869) ou homólogos dos mesmos. Mesofilo-tecido específico significa que a transcrição de um gene é limitada para o menor número possível tecidos de plantas que compreendem o tecido mesofilo como o resultado da interação específica de elementos cis presentes na sequência de promotor e os fatores de transcrição que se ligam a estes elementos; preferivelmente, significa uma transcrição que está limitada ao tecido mesófilo.
[0280] Outros promotores específicos de mesófilo incluem PPCZml (= PEPC; Kausch, Plant Mol Biol 45, 1 (2001)); OsrbcS (Kyozuka et al, Planta Phys 102, 991(1993)); OsPPDK, acc. AC099041; TaGF-2.8, acc. M63223 (Schweizer, Plant J. 20, 541 (1999)); TaFBPase, acc. X53957; TaWISl, acc. AF467542 (US 20021 115849); HvBISl, acc. AF467539 (US 2002/115849); ZmMISl, acc. AF467514 (US 2002/115849); HvPRla, acc. X74939 (Bryngelsson et al, Molecular Plant-Microbe Interactions 7 (2), 267 (1994); HvPRlb, ACC X74940 (Bryngelsson et al, Molecular PlantMicrobe Interactions 7 (2), 267 (1994)); HvB1.3gluc ; acc AF479647; HvPrx8, acc AJ276227 (Kristensen et al, Molecular Plant Pathology (6) 2, 311 (2001));. e HvPAL, acc X97313 (Biologia Wei, Plant Molecular 36, 101 (1998)).
[0281] Exemplos de promotores específicos de epiderme são, por exemplo, WIR5 (= GstA1), acc. X56012 (Dudler & Schweizer, não publicado); GLP4, acc. AJ310534 (Wei, Biologia Molecular de Plantas 36, 101 (1998)); GLP2a, acc. AJ237942 (Schweizer, Plant J. 20, 541 (1999)); Prx7, acc. AJ003141 (Kristensen, Molecular Plant Pathology 2 (6), 311 (2001)); Gera, acc. AF250933 (Wu, Flora Phys Biochem 38 ou 685 (2000)); OsROCl, acc. AP004656; RTBV, acc. AAV62708, AAV62707 (Kloti, PMB 40, 249 (1999)) e Cer3 (Hannoufa, Plant J. 10 (3), 459 (1996)).
[0282] Exemplos de promotores adequados adicionais para a expressão de proteínas FMO incluem promotores específicos de amadurecimento de frutos, tais como, por exemplo, o promotor específico de amadurecimento de tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Promotores dependente de desenvolvimento incluem alguns dos promotores específicos de tecido, porque o desenvolvimento dos tecidos individuais, naturalmente, ocorre de um modo dependente do desenvolvimento.
[0283] Promotores específicos de mesófilo- tecido, específico de raíz, indutível por patógeno, específico de caule e/ou folha pode ser utilizado com promotores específicos de raíz e específicos de mesófilo- tecido, indutível por patógeno, constitutivo.
[0284] Uma outra possibilidade de mais promotores que tornam possível a expressão em outros tecidos vegetais ou em outros organismos como, por exemplo, bactérias de E. coli para ser operativamente ligado à sequência de ácido nucleico a ser expresso ou sobre-expresso. Todos os promotores descritos acima são, em princípio, adequados como planta ou promotores de organismos fotossintéticos.
[0285] Outros promotores que são adequados para a expressão em plantas são descritos (Rogers et al. Meth in Enzymol 153, 253 (1987); Schardl et al Gene 61, 1 (1987); Berger et al, Proc Natl Acad Sci EUA 86, 8402 (1989)).
[0286] Além disso, uma pessoa versada na técnica é capaz de isolar ainda mais promotores adequados por meio de métodos de rotina. Assim, o perito na técnica pode identificar outros elementos, por exemplo, ácidos nucleicos reguladores específicos de epiderme, com o auxílio de métodos usuais de biologia molecular, por exemplo com experiências de hibridação ou com estudos de ligação de DNA- proteína. Aqui, um primeiro passo envolve, por exemplo, o isolamento do tecido pretendido a partir do organismo desejado, a partir do qual as sequências reguladoras estão a ser isolado, de onde o total de poli(A) + RNA é isolado e uma biblioteca de cDNA é estabelecida. Em um segundo passo, os clones a partir da primeira biblioteca cujas moléculas poli(A) + RNA correspondentes únicas acumulam no tecido desejado são identificados por meio de hibridação com a ajuda de clones de cDNA que são baseados em moléculas de poli(A) + RNA de outro tecido. Em seguida, os promotores com elementos reguladores específicos de tecido são isolados com o auxílio destes cDNA assim identificados. Além disso, um perito na técnica tem métodos baseados em PCR mais disponíveis para o isolamento de promotores específicos de tecido adequados.
[0287] As sequências de ácidos nucleicos presentes nos cassetes de expressão ou vetores aqui descritos podem ser ligadas operacionalmente a outras sequências de controle genético além de um promotor. O termo de sequências de controle genético tem um significado amplo e significa todas as sequências que têm uma influência sobre a entrada em vigor ou a função da molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção. Por exemplo, sequências de controle genético modificam a transcrição e tradução em organismos procariotas ou eucariotas. Os cassetes de expressão podem ainda compreender um promotor com uma especificidade 5’- a montante a partir da sequência de ácido nucleico particular, que é para ser expressa transgenicamente, e uma sequência de terminador como sequência adicional de controle genético 3' - a jusante, e se outros elementos reguladores convencionais apropriados, em cada caso, ligado operativamente à sequência de ácido nucleico a ser expressa transgenicamente.
[0288] Sequências de controle genético também compreendem outros promotores, elementos promotores ou promotores mínimos capazes de modificar as propriedades de controle da expressão. É assim possível, por exemplo, através de sequências de controle genético para expressão específica de tecido para ocorrer adicionalmente dependente de fatores de estresse particulares. Os elementos correspondentes são descritos, por exemplo, para o estresse hídrico, ácido abscísico (Lam E Chua NH, J Biol Chem 266 (26): 17131 (1991)) e estresse por calor (Schoffl F et al., Molecular e Genética 217 ( 2-3): 246, 1989).
[0289] É possível, em princípio, a todos os promotores naturais com as suas sequências reguladoras, como os mencionados acima para serem utilizados para o método da invenção. É adicionalmente possível para os promotores sintéticos também serem utilizados com vantagem.
[0290] Sequências de controle genético ainda compreendem também regiões 5’-não traduzidas (5’- UTR), íntrons ou região não codificadoras 3’ dos genes, tais como, por exemplo, o íntron 1-atina, ou os íntrons Adh1-S 1, 2 e 6 (geralmente: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds, Springer, Nova Iorque (1994)). Tem sido demonstrado que estas podem desempenhar um papel significativo na regulação da expressão do gene. Tem sido assim demonstrado que as sequências 5’-não traduzidas são capazes de aumentar a expressão transitória de genes heterólogos. Um exemplo de um intensificador de tradução que pode ser mencionado é a sequência de comando 5' do vírus do mosaico do tabaco (Gallie et al. Nucl Acids Res 15, 8693 (1987)) e semelhantes. Eles podem, além disso promover a especificidade dos tecidos (Rouster J et al., Planta J. 15, 435 (1998)). Por exemplo, é a 5'-UTR natural do gene GS- AtFMO OX5 ou ZmFMO, no entanto, a utilização do promotor de um dos métodos aqui descritos induz os níveis de expressão mais elevados, por exemplo o estresse à seca induz um aumento de três vezes na expressão nível, em particular, que com a sequência de SEQ ID NO: 1, 25, ou uma sequência com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou, em particular 99% ou mais identidade da mesma. A molécula de ácido nucleico recombinante pode, vantajosamente, compreender uma ou mais das chamadas sequências estimuladoras em ligação operável com os promotores, o que torna o aumento de expressão transgênica da sequência de ácido nucleico possível. Sequências vantajosas adicionais, como outros elementos reguladores ou terminadores também podem ser inseridas na extremidade 3' das sequências de ácidos nucleicos a serem expressas de forma recombinante. As sequências de ácido nucleico a serem expressas de forma recombinante podem estar presentes em uma ou mais cópias do construto do gene.
[0291] Os sinais de poliadenilação adequadas como sequências de controle são sinais de poliadenilação de plantas podem incluir os que correspondem essencialmente aos sinais de poliadenilação de T-DNA de agrobactéria tumefaciens, em particular a do gene 3 do T-DNA (sintase de octopina) do plasmídeo Ti pTiACHS (Gielen et al. EMBO J. 3: 835 (1984)) ou equivalentes funcionais dos mesmos. Exemplos de sequências de terminação particularmente adequados são o terminador OCS (sintase de octopina) e terminador NOS (sintase de nopalina).
[0292] As sequências de controle significam as sequências que tornam recombinação homóloga ou de inserção no genoma de um possível organismo hospedeiro ou permite a eliminação a partir do genoma. Na recombinação homóloga, por exemplo, o promotor natural de um determinado gene pode ser especificamente substituído por um promotor com especificidade para a epiderme embrionária e/ou a flor.
[0293] Uma molécula de ácido nucleico recombinante e um vetor derivado a partir da molécula pode compreender elementos funcionais adicionais. O termo elemento funcional tem um significado amplo e significa todos os elementos que têm uma influência sobre a produção, a replicação ou a função das moléculas de ácidos nucleicos, os vetores ou os organismos transgênicos da invenção. Exemplos não restritivos que podem ser mencionados são os marcadores de seleção que conferem resistência a um inibidor do metabolismo como o 2-desoxiglucose-6-fosfato (WO 98/45456), antibióticos ou biocidas, herbicidas, por exemplo, canamicina, G 418, bleomicina, higromicina ou fosfinotricina. Exemplos que podem ser mencionados são os seguintes: As sequências de DNA que codificam para acetiltransferases fosfinotricina (PAT), que inativam os inibidores da glutamina sintase (bar e do gene PAT), 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (genes de EPSP sintase) que conferem resistência ao glifosato (R) (N- (fosfonometil)glicina), o gene gox, que codifica a glifosato (R)-degradando enzima (glifosato oxido-redutase), o gene deh (que codifica para uma desalogenase que inativa o dalapon), e genes bxn que codificam para bromoxinil -degradando enzimas nitrilase, o gene AASA, que confere uma resistência ao antibiótico espectinomicina, o gene fosfotransferase de estreptomicina (SPT), o que torna possível uma resistência a estreptomicina, o gene de neomicina-fosfotransferase (NPTII), o que confere uma resistência a canamicina ou geneticidina, o gene de higromicina fosfotransferase (HPT), que medeia uma resistência à higromicina, o gene de acetolactato sintase (ALS), que medeia a resistência a herbicidas de sulfonilureia (por exemplo mutado ALS variantes com, por exemplo, a S4 e/ou mutação Hra) e o gene de acetolactato sintase (ALS), que medeia a resistência a herbicidas de imidazolinona.
[0294] Os genes repórter ou marcadores selecionáveis são genes que codificam proteínas facilmente quantificáveis e garantir por meio de uma cor intrínseca ou atividade enzimática de uma avaliação da eficiência de transformação ou do local ou do momento de expressão, incluindo mas não se limitando a proteínas repórter (Schenborn e. Groskreutz D Mol. Biotechnol; 13 (1): 29 (1999), tais como a proteína de fluorescência verde (GFP) (Sheen et al Plant Journal 8 (5): 777 (1995); Hasselhoff et al Proc Natl Acad Sci EUA 94 ( 6): 2122 (1997); Reichel et al Proc Natl Acad Sci EUA 93 (12): 5888 (1996); Tian et al Plant Cell Rep 16: 267 (1997); WO 97/41228; Chui et al. Curr Biol 6: 325 (1996); Leffel et al, Biotechniques 23 (5): 9128 (1997)), a cloranfenicol transferase, uma luciferase (Ow et al, Science 234: 856 (1986); Millar et al. Plant Mol Biol Rep 10: 324 (1992)), o gene de aequorina (Prasher et al, Biochem Biophys Res Commun 126 (3.): 1259 (1985)), o [beta]- galactosidase, o gene de R-locus de códigos (por uma proteína que regula a produção de pigmentos antocianinas (coloração vermelha) em tecidos vegetais e, assim, torna possível a análise direta da atividade do promotor sem a adição de adjuvantes adicionais ou substratos cromogênicos; Dellaporta et al, In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263, (1988), com o [beta] -glucuronidase (Jefferson et al, EMBO J., 6, 3901, 1987) .
[0295] As origens de replicação (ori), que asseguram a replicação dos cassetes de expressão ou vetores podem incluir, por exemplo, E. coli. Os exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem de replicao de DNA), o bpR322 ori ou a ori p15A (Sambrook et al, 1989).
[0296] Os elementos que são necessários para a transformação de plantas mediadas por agrobactéria, tal como, por exemplo, à direita ou à esquerda da fronteira de T-DNA ou a região vir.
[0297] Para selecionar as células transformadas com sucesso, é geralmente necessário a introdução de um marcador de seleção ou selecionável que confere às células transformadas com sucesso uma resistência a um biocida (por exemplo um herbicida), um inibidor do metabolismo, tais como 2-desoxiglucose-6-fosfato (WO 98/45456) ou um antibiótico. O marcador de seleção permite a seleção das células transformadas a partir de células não transformadas (McCormick et al celular. Planta Reports 5:81 (1969)).
[0298] Em um outro aspecto, a invenção refere- se a uma planta produzida pelo método da invenção. Como uma pessoa versada entende, a dita planta compreende a proteína FMO.
[0299] Em um outro aspecto, a invenção refere- se a uma cultura de tecidos de células produzidas a partir da planta de acordo com a reivindicação 45, em que as ditas células de cultura de tecido são produzidas a partir de uma parte da planta escolhida a partir de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, células meristemáticas, raízes, pontas de raiz, pistilos, anteras, flores e caules. Como a pessoa habilidade entende, disse folhas, embriões pólen, cotilédones, hipocótilo, células meristemáticas, raízes, pontas de raiz, pistilos, anteras, flores, e caules compreendem a proteína FMO.
[0300] Em uma modalidade preferida, a dita planta é uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea.
[0301] Uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a plantas que, como resultado de processos naturais ou por indução artificial, compreendem uma ou mais mutações em uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de ácidos nucleicos tal como apresentada em SEQ ID NOs: 1, 3, 5 , 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 44, em que a mutação provoca um aumento da atividade, função ou quantidade de polipeptídeo de um do polipeptídeo codificado pelas moléculas de ácidos nucleicos como mostrado em SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 44. Por exemplo, uma mutação gerada, e identificada, por TILLING.
[0302] Como consequência, uma outra modalidade pode incluir uma planta compreendendo uma sequência de ácido nucleico que compreende uma mutação que provoca, nas plantas ou partes das mesmas, um aumento da atividade de uma das proteínas codificadas pelas moléculas de ácido nucleico da presente invenção. Por exemplo, a mutação refere-se um ou mais resíduos de aminoácidos os quais são identificados na sequência de consenso nas figuras como sendo conservadas ou altamente conservadas.
[0303] Consequentemente, uma modalidade aqui descrita proporciona uma planta transgênica, parte da planta transgênica ou célula de planta transgênica que sobre- expressam uma FMO exógeno, incluindo a proteína de FMO sobre- expressq na planta, parte da planta ou célula da planta é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno possuindo pelo menos identidade de 50% com SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 ou 40, ou uma variante de junção dos mesmos; ou por (ii) um aminoácido endógeno que codifica uma proteína possuindo% de identidade de pelo menos 50 com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, 34, 36, 38, 40 ou 42, a proteína codificada confere reforçada tolerância de estresse à seca em relação ao controle de plantas; (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar sob condições rigorosas com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); que codifica uma proteína FMO; em que os códigos de moléculas de aminoácidos de um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idêntico ao polipeptídeo descrito na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, 34, 36, 38, 40 ou 42; a proteína codificada confere reforçada tolerância ao estresse hídrico em relação ao controle de plantas; e/ou por (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína FMO como qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas diferenciando-se dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, devido ao degenerescência do código genético.
[0304] Além disso proporcionam-se aqui plantas transgênicas transformadas com, pelo menos, a) uma sequência de ácido nucleico que compreende as moléculas de ácido nucleico como mostrada na SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 44; as sequências de ácidos nucleicos que são ao mesmo complementar, ou as moléculas de aminoácidos que codificam os polipeptídeos como mostrado na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 ou 43; b) um cassete de expressão transgênica que compreende uma das sequências de ácido nucleico, ou um vetor, e as células, culturas de células, tecidos, partes, tais como, por folhas exemplo, raízes e materiais semelhantes ou propagação no caso de plantas organismos derivado a partir de tais organismos. É de notar que esta modalidade pode também incluir uma planta que não seja Arabidopsis thaliana.
[0305] Organismos hospedeiros ou organismos de partida, aqui chamadas de "organismos transgênicos" são plantas como definidas acima. Em uma modalidade, o organismo transgênico é uma planta madura, sementes, rebentos e plântulas, e suas partes, materiais de propagação e as culturas dela derivadas, por exemplo culturas celulares. Como aqui utilizado, "planta madura", significa plantas em qualquer estágio de desenvolvimento além do estágio de plântula. “Mudas” significam uma planta imatura jovem em um estágio de desenvolvimento mais cedo. As plantas que são particularmente preferidas como organismos hospedeiros são as plantas às quais pode ser aplicado o método para a obtenção de uma tolerância à seca de estresse de acordo com os critérios acima ditos. Em uma modalidade, a planta é uma planta dicotiledônea, como discutido acima. Em outra modalidade da presente invenção, a planta é uma planta monocotiledônea, como discutido acima. Os organismos transgênicos podem ser gerados com os métodos acima descritos para a transformação ou transfecção de organismos.
[0306] Outras modalidades aqui descritas incluem o uso de organismos transgênicos e das células, culturas celulares, partes, tais como, por exemplo, raízes, folhas e semelhantes, no caso de organismos de plantas transgênicas, e material de propagação de transgênicos, tais como sementes ou frutos para a preparação de alimentos ou rações para, medicamentos ou produtos químicos finos. Variedades de pilhas também estão incluídas em que uma pluralidade de caracteres vantajosos, tais como as personagens clássicos herbicidas acima mencionados ou genes de tolerância a herbicidas, genes de resistência a insetos prejudiciais, substância antipatológica que produza genes, caracteres melhorados em ingredientes material de óleo ou caracteres tendo reforçado conteúdo de aminoácidos são combinados.
[0307] As partes da planta transgênica estão também aqui proporcionadas e compreendem o ácido nucleico FMO ou proteína FMO. Podem ser sementes, raízes, folhas e/ou flores que compreendem o ácido nucleico FMO ou proteína FMO ou suas partes. Partes preferidas de plantas de soja são grãos de soja que compreendem o ácido nucleico FMO ou proteína FMO. Produtos derivados de plantas transgênicas, tal como aqui descrito, suas partes ou partes dos mesmos que podem ser abatidas também estão previstas, incluindo a farinha ou o óleo, tais como farinha de soja ou óleo de soja, que compreende o ácido nucleico FMO ou proteína FMO. Uma modalidade é o método para a produção de um produto, em que o produto é a farinha ou o óleo, de um modo preferido, farinha de soja ou óleo de soja.
[0308] Em uma modalidade aqui descrita, o método para a produção de um produto constituído por: a) crescimento das plantas descritos aqui ou obtenível pelos métodos aqui descritos e b) a produção do produto a partir de ou pelas plantas da invenção e/ou partes, por exemplo sementes, destas plantas.
[0309] Em uma outra modalidade os produtos produzidos pelos processos aqui descritos são produtos vegetais, tais como, mas não limitados a um produto alimentar, ração, um suplemento alimentar, suplemento alimentar, fibras, cosmética e/ou farmacêutica. Os gêneros alimentícios são considerados como composições utilizadas para a nutrição e/ou para complementar a nutrição. Alimentos para animais e suplementos para alimentação animal, em particular, são considerados como produtos alimentares.
[0310] Em uma outra modalidade o método compreende os passos de a) o crescimento das plantas da invenção, b) remover as partes que podem ser abatidas como definido acima das plantas e c) a produção do produto a partir de ou pelas partes da planta transgênica ou organismo.
[0311] O produto pode ser produzido no local onde a planta foi cultivada, as plantas e/ou partes das mesmas, podem ser removidos do local onde as plantas foram cultivadas para produzir o produto. Tipicamente, a planta é cultivada, as partes podem ser abatidas desejadas são removidas da planta, se possível, em ciclos repetidos, e o produto produzido a partir das partes que podem ser abatidas da planta. O passo de crescimento da planta pode ser realizado apenas uma vez cada vez que os métodos da invenção são realizados, ao mesmo tempo permitindo repetidas vezes os passos de produção do produto, por exemplo, por remoção repetida de partes das plantas que podem ser abatidas da invenção e, se necessário posterior processamento dessas peças para chegar ao produto. É também possível que o passo de cultivar as plantas da invenção é repetido e plantas ou partes que podem ser abatidas são armazenadas até que a produção do produto é então executada uma vez para as plantas ou partes de plantas acumuladas. Além disso, as etapas de cultivo das plantas e a produção do produto pode ser realizada com uma sobreposição no tempo, até mesmo simultaneamente a um grande estresse ou sequencialmente. Geralmente, as plantas são cultivadas durante algum tempo antes que o produto é produzido.
[0312] Em outra modalidade, os métodos para a produção são usados para fazer produtos agrícolas, tais como, mas não limitados a extratos de plantas, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas, e outros semelhantes. Tenha em atenção que é possível que um produto de planta é constituído por um ou mais produtos agrícolas, em grande medida.
[0313] As plantas transgênicas produzidas como aqui descrito, podem ser cruzadas com plantas transgênicas semelhantes ou com plantas transgênicas que faltam os ácidos nucleicos da invenção ou com as plantas não transgênicas, usando métodos conhecidos de melhoramento de plantas, para preparar sementes. Além disso, as células de plantas transgênicas ou plantas aqui descritas podem compreender, e/ou ser cruzadas para outra planta transgênica que compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos, criando assim uma "pilha" de transgenes na planta e/ou a sua progenitura. A semente é plantada em seguida, para se obter uma planta transgênica fértil cruzada compreendendo o ácido nucleico FMO. A planta transgênica fértil atravessada pode ter o cassete de expressão particular herdada através de um progenitor feminino ou através de um progenitor masculino. A segunda planta pode ser uma planta pura. O transgênico fértil cruzado pode ser um híbrido. Também incluídos dentro da presente invenção estão as sementes de qualquer uma dessas plantas transgênicas férteis cruzadas. As sementes desta invenção podem ser colhidas a partir de plantas transgênicas férteis e ser utilizado para cultivar as gerações progenitura de plantas transformadas desta invenção incluindo linhas de plantas híbridas que compreendem o ácido nucleico exógeno.
[0314] Portanto, outra modalidade pode incluir um método para a criação de uma planta tolerante a seca compreendendo os passos de: (a) cruzamento de uma planta transgênica aqui descrita ou de uma planta que pode ser obtida por um método aqui descrito, com uma segunda planta; (B) a obtenção de uma semente ou sementes resultantes da etapa de cruzamento descrita em (a); (c) o plantio das sementes ou sementes e crescimento da semente ou sementes das plantas; e (d) seleção das plantas de plantas que expressam uma proteína de FMO, codificada por (i) um ácido nucleico exógeno possuindo identidade de pelo menos 60% com a SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 44, ou uma variante de processamento dos mesmos;
[0315] (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína possuindo pelo menos 60% de identidade com SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 , 32, 34, 36, 38, 40, 42 ou 43; a proteína codificada confere reforçada tolerância a água relativa para controlar plantas;
[0316] (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridar sob condições rigorosas com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); que codifica uma proteína FMO; em que os molécula de ácido nucleicos codificam um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 ou 43; de preferência, a proteína codificada confere tolerância ao estresse relativo de água para controlar plantas reforçada; e/ou por (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína FMO como qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas diferenciando-se dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, devido ao degenerescência do código genético.
[0317] Outra modalidade fornecida aqui é um método para o melhoramento de plantas compreendendo (a) a obtenção de uma planta transgênica por qualquer um dos métodos da presente invenção; (B) combinar dentro de uma célula vegetal o material genético de, pelo menos, uma célula vegetal da planta de (a) com o material genético de, pelo menos, uma célula diferindo em um ou mais genes a partir das células de plantas de plantas de (a) ou cruzar a planta transgênica de (a) com uma segunda planta; (C) obtenção de sementes a partir de pelo menos uma planta gerada a partir da célula de uma planta de (b) ou da planta do cruzamento do passo (b); (d) plantando as sementes e crescer as sementes das plantas; e (e) seleção das plantas, plantas que expressam o ácido nucleico que codifica a proteína GS-OX5 FMO; e,opcionalmente, (f) produção de material de propagação das plantas que expressam o ácido nucleico que codifica a proteína GS-FMO OX5. As plantas transgênicas podem ser selecionadas por métodos conhecidos tal como descrito acima (por exemplo, por rastreio quanto à presença de um ou mais marcadores que são codificadas por genes de plantas expressável co-transferidas com o gene FMO ou rastreio para o próprio ácido nucleico FMO), a expressão de um gene estrutural pode, é claro, ser também efetuada, ou influenciadas, independentemente da modalidade dos métodos aqui descritos ou a utilização do assunto aqui descrito.
[0318] A prática aqui descrita emprega, a menos que indicado de outro modo, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante, genética, imunologia, biologia celular, cultura celular e biologia transgênica, que estão dentro da perícia na técnica. (Ver, por exemplo, Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1982); Sambrook, et al, (1989); Sambrook e Russell, Molecular Cloning, 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (2001); Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (incluindo atualizações periódicas) (1992); Glover, DNA Cloning, IRL Press, Oxford (1985); Russell, biologia molecular de plantas: um manual de curso de laboratório, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1984); Anand, técnicas de análise de genomas complexos, Academic Press, Nova Iorque (1992); Guthrie e Fink, Guia para Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, Nova Iorque (1991); Harlow e Lane, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1988); hibridização de ácido nucleico, BD Hames & SJ Higgins eds (1984) ; transcrição e tradução, BD Hames & SJ Higgins eds (1984); Cultura de células de Animais, RI Freshney, AR Liss, Inc. (1987); Células imobilizadas e enzimas, IRL Press (1986); B. Perbal, um guia prático para clonagem Molecular (1984); Tratado, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Nova Iorque); Methods in Enzymology, Vols. 154 e 155, Wu, et al, eds .; Métodos imunoquímicos em biologia celular e molecular, Mayer e Walker, eds, Academic Press, Londres (1987). Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds. (1986); Riott, Imunologia Essential, 6a Edição, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1988); Fogo, et al, RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge (2005); Schepers, RNA interference in practice, Wiley VCH (2005); Engelke, RNA de interfeence (RNAi): As Nuts & Bolts de siRNA Tecnologia, DNA Imprensa (2003); Gott, interferência de RNA, Edição e Modificação: métodos e protocolos (Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowa, NJ (2004); e Sohail, silenciamento gênico por interferência de RNA: Tecnologia e Aplicação, CRC (2004)).
[0319] Todos os termos e as modalidades anteriormente descritas são igualmente aplicáveis a este aspecto da invenção.
[0320] A invenção será descrita por meio dos exemplos seguintes que devem ser considerados como meramente ilustrativos e não limitativos do escopo da invenção
EXEMPLOS
[0321] Os exemplos seguintes são proporcionados para melhor ilustrar as várias aplicações e não se destinam a limitar a invenção para além das limitações definidas nas reivindicações anexas.
Métodos gerais
[0322] Condições materiais e crescimento biológico
[0323] Para a sobre-expressão da proteína FMO, as plantas transgênicas de Arabidopsis que sobre-expressam o gene FMO GS-OX5 (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) e descritas como RCI5-OE (ES 2347399B1) (genótipos FMOX3 e FMOX8 mostrados na Figura 3) e sementes do tipo selvagem (Col-0) de Arabidopsis thaliana foram obtidos utilizando o seguinte método.
[0324] RCI5 cDNA foi ligado no local de SmaI, a jusante do promotor CaMV35S no vetor PROK2 (Baulcombe et al, 1986) (mostrado no construto da Figura 4a), para se obter o X3 e X8. Uma vez que a presença do construto (tal como a construto descrita na Figura 4a e a Figura 4b) foi verificada no plasmídeo recombinante por sequenciação de DNA, foram introduzidos na cepa de agrobactéria tumefaciens C58C1 (Deblaere et al, 1985). Transformação de Arabidopsis CoI foi realizada seguindo o método de mergulho floral (Clough e Bent, 1998). As plantas foram semeadas em vasos de plástico contendo a mesma quantidade de substrato de água saturada. Bandejas contendo 16 vasos com 5 plantas por vaso foram colocadas em uma câmara de crescer sob condições de luz de dia curto até que as plantas desenvolveram 12 folhas. Em seguida, os tabuleiros foram transferidos para a estufa sob condições de luz de dia longo e os vasos foram colocados individualmente em copos de plástico transparentes de modo a evitar o derramamento de água durante a irrigação. Plantas irrigadas normal para cada genótipo também foram colocadas nas bandejas, como controles. Um total de 4 tabuleiros foram usados, com genótipos diferentes distribuídos dentro de cada bandeja. Não foram observadas diferenças fenotípicas entre os genótipos.
[0325] A fim de determinar a análise de biomassa de plantas, plantas de Arabidopsis foram cultivadas durante três (3) semanas, sob dias curtos (10 horas de luz e 14 horas de escuro, 21 °C luz e 20 °C durante a noite, 65% de umidade) condições. O peso fresco de rosetas individuais foi obtido, Col-0 (n = 10) e RCI5-OE (ES 2347399B1) (FMOX3 e FMOX8 genótipos) duas semanas após a semeadura (n = 10). Rendimento de sementes de plantas totalmente crescidas que foram cultivadas durante 3 semanas sob condições de dias curtos e, em seguida, transferidas para 3 semanas adicionais para condições de dias longos foram registradas. As sementes foram colhidas 4 semanas mais tarde a partir de plantas individuais (n = 10).
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR)
[0326] Teor de TMAO em plantas foi determinado pela colheita de três folhas por tratamento e congelamento em nitrogênio líquido, antes da determinação por NMR. Pelo menos três plantas independentes foram tratadas por experiência.
Condições de crescimento e material biológico para estufa
[0327] Para cada experimento murcho ou limito de água 480 sementes (de qualquer pimenta, cevada, tomate, pepino e milho) foram semeadas, produzindo 384 plantas em vasos de 512 cm3 (4 plantas por vaso). As plantas foram cultivadas sob condições da câmara a 21 °C durante 3 semanas. Em seguida, as plantas foram transferidas para uma estufa, onde a temperatura média era de 25 °C a 28 °C.
[0328] Tratamentos como aqui descritos foram feitos quando as plantas tinham duas folhas estendidas e no próximo par de folhas foram chegando.
[0329] Tratamentos: Doze (12) panelas (contendo 48 plantas) foram irrigados com 40 ml de: água, 0,1 g/L de solução de TMAO di-hidratado, 1,0g/L de solução de TMAO di- hidratado, ou 5,5 g/L TMAO di-hidratado. Outro conjunto de 12 vasos com 48 plantas foram pulverizadas com 40 ml de água (3,3 ml em média por vaso), uma solução contendo 0,1 g/L de Solução de TMAO di-hidratado, 1,0g/L de TMAO di-hidratado, ou 5,5 g/L de TMAO di-hidratado. Todos os potes também foram regados com 40 ml de água. As plantas pulverizadas foram regadas com o mesmo volume de água como as "plantas irrigadas). Os potes foram localizados no copo de plástico para manter a umidade constante e para evitar o derramamento de líquido durante a rega. Bandejas contendo os vasos foram localizadas em tabelas de efeito estufa. A distribuição de as bandejas sobre a mesa e a posição sobre as panelas na bandeja foi trocado a cada semana para evitar os efeitos da posição.
[0330] Após os tratamentos acima descrito, as plantas não foram regadas, até os vasos perdido completamente a sua umidade, tendo cerca de 4 a 8 dias, dependendo da estação do ano, altura em que as plantas foram extremamente murchadas para as experiências de seca extrema. As plantas foram, em seguida, uma vez revestidas com soluções contendo diferentes quantidades de TMAO di-hidratado descrita acima (0,1g/L, 1,0 g/L ou 5,5 g/L) ou simplesmente água, após o que as plantas foram deixadas a perder a sua umidade completamente novamente por três ciclos consecutivos de regar depois murcharam. Para os experimentos "de água limitada" elas foram regadas com 20 ml de água ou solução, em vez de 40 ml quando as primeiras plantas começaram a murchar. A taxa de sobrevivência das plantas foi registrada e analisada para os experimentos de "seca extrema" em que as plantas foram deixadas a murchar severamente antes de molhar, enquanto o comprimento do caule foi registrado como analisado para os experimentos hídricos limitados em que as plantas são regadas com 30% da água que a planta requer.
Morangos, alho francês, alface, brócolis, aipo ou couve-rábano
[0331] A fim de determinar o rendimento da produtividade da planta, sob condições normais, variedades de morango 'Sabrina', 'Candonga' e 'Fortuna', variedades de alho-poró, alface, "Iceberg", Variedades de brócolis "Partenon", aipo ou couve-rábano, foram cultivadas sob condições de produção padrão e 120 plantas de cada variedade por tratamento (onde o tratamento foi um controle compreendendo rega padrão ou 1g/L de TMAO pulverizado a cada quatro semanas) foram analisados. As plantas foram localizadas em quatro (4) posições diferentes para cada grupo de 30 plantas a partir do mesmo tratamento. Frutos, folhas ou raízes foram colhidas a partir de plantas individuais e o peso total foi determinado para cada planta.
Tomates
[0332] A fim de determinar a tolerância de estresse à seca ou a água após os tratamentos de sementes com TMAO di-hidratado e germinação na presença de TMAO di- hidratado, sementes de tomate 'Moneymaker' foram esterilizadas à superfície durante 3 minutos em etanol a 70%, depois lavadas duas vezes e finalmente incluídas em uma solução de pré-tratamento de 0,1 g/L de solução de TMAO di- hidratado (ou apenas água), sob agitação durante 3 horas. Em seguida, elas foram lavadas e incluídas nas placas de germinação sob condições estéreis. O polietileno glicol (PEG-6000) foi adicionado ao meio de germinação (meio de Murashige e Skoog Sais) a 152 e 182 g/L. O aumento da quantidade de PEG reduz valores ip (potencial hídrico), simulando as condições de seca para a germinação. Cada placa germinação teve, pelo menos, 30 sementes, e cada placa de tratamento/pré-tratamento foi repetido cinco vezes (150 sementes por tratamento/pré-tratamento). As sementes foram deixadas germinar em 10 dias, no escuro, em uma câmara de cultura (21 °C luz e 20 °C da noite, 65% de umidade). Em seguida, as sementes germinadas foram gravadas por análise de inspeção e dados visuais foi realizada utilizando software Statgraphics.
Ensaios de campo de milho, cevada e girassol
[0333] A fim de determinar a tolerância de estresse à seca ou a água depois de tratamentos de sementes com TMAO di-hidratado e germinação na presença de TMAO di- hidratado, sementes de cevada "hispânica" ou sementes de milho "FAO700" ou sementes de girassol "Sambro" foram esterilizadas à superfície durante 3 minutos em etanol a 70%, depois lavadas duas vezes e, finalmente, incluída numa solução de pré-tratamento de uma solução de 1 g/L TMAO di- hidratado (ou apenas água), sob agitação durante 3 horas a uma dose de 1 litro por cada quilograma de sementes. Em seguida, as sementes foram semeadas em parcelas randomizados de 10 metros quadrados em uma área de 2.000 metros quadrados. O teor de clorofila foi medido um mês antes da colheita. Na irrigação de milho foi aplicado em metade dos terrenos enquanto a ordem de metade recebeu apenas uma rega estabelecimento inicial. As parcelas de cevada receberam 2001 de chuva por m2 através da estação de crescimento. Algumas das parcelas receberam um segundo tratamento de pulverização com 1g/litro de TMAO.
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR)
[0334] Teor de TMAO em plantas foi determinado pela colheita de três folhas por tratamento e congelamento em nitrogênio líquido, antes da determinação NMR. Pelo menos três plantas independentes foram tratadas por experiência.
[0335] Exemplo 1: TMAO acumula na pimenta e cevada após o tratamento seca 1 semana. Pimenta 'Murano' e sementes de cevada 'Bomi' foram semeadas e cultivadas como descrito acima. As plantas de controle (seis semanas de idade) foram irrigadas com 40 ml de água duas vezes na semana, enquanto "seca" tratados plantas não foram irrigadas. As folhas foram colhidas e TMAO foi determinado por NMR, tal como descrito. Como mostrado na Tabela 1, os níveis de TMAO aumentar quase três vezes quando comparada ao controle, tanto pimenta e cevada seca após o tratamento.Tabela 1. TMAO acumulação após 1 semana de seca
Figure img0001
[0336] Como mostrado na Tabela 1, na linha 1, o controle mostra pimenta 446,68 μM de TMAO, enquanto na linha 2 é mostrado que 7 dias de tratamento seca aumenta os níveis de TMAO na pimenta 2,74 vezes a 1224,23 μM. Analogamente na linha 3 da cevada de controle mostra 422,10 μM de TMAO enquanto na linha 4 mostra que 7 dias de tratamento a seca aumenta os níveis de TMAO na cevada 2,97 vezes, para 1.252,73 μM.
[0337] Exemplo 2: TMAO acumula na pimenta e cevada quando aplicado exogenamente. 'Murano' sementes de pimenta e sementes de cevada 'Bomi' foram semeadas e cultivadas como descrito acima. As plantas de controle (seis semanas de idade) foram pulverizadas com água e pimenta tratada plantas foram pulverizadas com 1g/l de TMAO enquanto plantas de cevada foram pulverizadas com 1g/l de TMAO formulado com 0,1% de C8-C10 Alquilpolissacarídeo. As folhas foram colhidas e TMAO foi determinado por NMR. A percentagem de aumento TMAO comparação com controles não tratados foi determinada para cada ponto de tempo. Níveis de TMAO aumentam na pimenta e cevada com o tratamento exógeno de TMAO em 1g/l para níveis mais elevados do que o tratamento da seca e, além disso, os níveis TMAO são elevados até 40 dias após a pulverização na pimenta.
[0338] Tabela 2. Acumulação de TMAO após TMAO tratamentos com pulverização de TMAO di-hidratado
Figure img0002
[0339] Como mostrado na Tabela 2, na linha 1, pimenta pulverizada com TMAO aumenta o seu nível de TMAO 5,29 vezes um dia de pós de pulverização, quando comparado com o controle pulverizado com água. O nível diminui após 10 dias para 3,73 vezes maior de controle (linha 2), após 20 dias a 2,86 vezes de controle (linha 3), após 30 dias a 1,35 vezes do controle não pulverizada (linha 4), mantendo-se acima da água pulverizada controle mesmo 40 dias após a pulverização (linha 5). Analogamente na linha 6, cevada pulverizada com TMAO e um alquilpolissacarídeo, aumenta o seu nível TMAO 8,22 vezes 1 dia após pulverização, quando comparado com o controle pulverizado com apenas o alquilpolissacarídeo devido a uma melhor penetração do TMAO formulado com o alquilpolissacarídeo.
[0340] Exemplo 3: aplicação exógena de TMAO di- hidratado não tem compensações em morango. A produção de frutos foi determinada em plantas de morango 'Sabrina', 'Candonga' e 'Fortuna' tratados com 1 g/l de TMAO di- hidratado ou água, como descrito acima, a fim de avaliar os custos de troca do tratamento sem estresse hídrico. No entanto, não foi observada nenhuma diferença significativa na produção de frutas que foi sempre ligeiramente maior nas plantas tratadas com TMAO di-hidratado.
[0341] Tabela 3. Produção de frutos Morango após os tratamentos de pulverização com TMAO di-hidratado a cada 4 semanas por 3 meses
Figure img0003
[0342] A Tabela 3 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente para três meses, sem um custo de fitness. Na linha 1, o peso total de produção de plantas de variedades Sabrina tratados com TMAO di-hidratado produzido 106% quando comparado com os controles de água tratada, na linha 2 o peso total de produção de plantas de variedades Candonga tratados com TMAO di-hidratado de produzir 102%, quando comparado com controles, na linha 3 o peso total de produção de plantas de variedades Fortuna tratados com TMAO di-hidratado de produzir 101% quando comparado com os controles, enquanto na linha 4 o peso da produção total das três plantas de variedades tratadas com TMAO di-hidratado de produzir 105% quando comparados com os controles de água tratada das três variedades.
[0343] Exemplo 4: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a germinação, tanto em pré-tratamento das sementes e como um aditivo para o meio. Sementes de tomate 'Moneymaker' foram semeadas e plantadas e tratadas como acima descrito.
[0344] Tabela 4. Taxas de germinação de sementes de tomate ± S.E. e Valores ANOVA por duas experiências independentes, onde o efeito de TMAO di- hidratado foi avaliado sobre a germinação das sementes, sob condições de seca geradas pela adição de polietileno glycol (PEG-6000) para o meio de germinação.
Figure img0004
[0345] Asteriscos (*) indicam diferenças estatísticas significativas entre o controle e sementes tratadas (α = 0,05)
[0346] Este exemplo mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente em tratamentos de sementes para melhorar a germinação sob condições de seca antes de ocorrer o estresse hídrico. As sementes são germinadas na presença de PEG a induzir o estresse hídrico. Duas concentrações são usadas nas primeiras 3 linhas 152 g/L (o que corresponde a um valor ^ de -0,2564) e uma dose mais elevada 182 g/L (o que corresponde a um valor de ^ -0,3676) para mostrar que a valores crescentes de estresse hídrico germinação diminui. Na primeira e na quarta linhas nenhum tratamento é aplicado às sementes que estão diretamente germinadas na presença de PEG. Mostra-se que, de facto afeta a germinação de estresse de água que é apenas de 25,80% para 152 g/L de PEG (linha 1) e 15,37% para 182 g/L de PEG (linha 4). Pré-tratamento das sementes durante 3 horas com solução a 0,1 g/L TMAO di- hidratado aumenta significativamente as taxas de germinação de 70,62% para 152 g/L de PEG (linha 2), e 18,53% para 182 g/L de PEG (linha 5) quando em comparação com controles não tratados. Além disso, se TMAO di-hidratado 0,1 g/L é adicionado ao meio de semeadura, a taxas de germinação aumentam significativamente, mesmo superior a 71,09%, para 152 g/L de PEG (linha 3), e especialmente a 45.00%) para a condição de estresse de água mais elevado de 182g/L PEG (linha 6), quando comparados com os controles não tratados.
[0347] Exemplo 5: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta sobrevivência das plantas na pimenta em condições de seca extrema. Sementes de pimenta 'Murano' foram semeadas, cultivadas e tratadas tal como descrito acima. 10 g/L e 1g/L TMAO di-hidratado pulverizado foi o melhor tratamento quando a irrigação foi feita com água, com 83,3% de sobrevivência das plantas, enquanto foi observado 100%) taxa de sobrevivência das plantas quando as plantas foram pulverizadas com 0,1 g/L ou 1g/L e regados com 5 g/L.
[0348] Tabela 5. A taxa média de sobrevivência e análise ANOVA para TMAO di-hidratado de plantas de pimenta tratadas em condições de crescimento de seca.
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Figure img0006
[0349] Tabela 5 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização e/ou irrigação antes de estresse hídrico ocorrendo aumento da taxa de sobrevivência das plantas sob condições de estresse hídrico extremas em uma espécie de cultura vegetal. Em linhas 1-4 os tratamentos de pulverização são comparados combinados de forma independente a partir dos tratamentos de irrigação. A taxa de sobrevivência após a seca aumenta significativamente com a concentração da pulverização com TMAO sendo o mais baixo na linha 1 sem TMAO (42,7%) e a maior na linha 4 com o 10 g/L de TMAO (71,8%). Em linhas 5-8 tratamentos de pulverização são comparados quando as plantas são irrigadas apenas com água. Analogamente taxa de sobrevivência após a seca aumenta significativamente com a concentração de pulverização com TMAO sendo o mais baixo na linha 5 sem TMAO (45,8%) e o mais alto na linha 8 com log/L de TMAO (79,1%). Em linhas 9-12 os tratamentos de pulverização são comparados quando as plantas são irrigadas com 0,1 g/L de TMAO. A taxa de sobrevivência após a seca aumenta significativamente com a concentração da pulverização com TMAO sendo o mais baixo na linha 9 sem TMAO (29,1%) e a maior na linha 12 com 10 g/L de TMAO (83,3%). Em linhas 13-16 os tratamentos de pulverização são comparados quando as plantas são irrigadas com 1 g/L de TMAO. A taxa de sobrevivência após a seca também aumenta significativamente com a concentração de pulverização com TMAO sendo o mais baixo na linha 13, sem TMAO (0%) e o mais alto na linha 16 com 10 g/L de TMAO (37,5%). Os melhores resultados são obtidos quando as plantas são irrigadas com TMAO a 5g/L (linhas 17-20). Mesmo sem tratamento de pulverização a taxa de sobrevivência é de 95,8% (linha 17), que aumenta em até 100% de sobrevivência com 0,1 g/L e tratamentos 1 g/L de pulverização (linhas 18-19). Combinando as maiores doses de pulverização de 10 g/L e 5g /L de irrigação reduz a taxa de sobrevivência de 87,5% (linha 20) devido a uma overdose TMAO.
[0350] Exemplo 6: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a sobrevivência de plantas de tomateiro sob condições de seca extrema. Sementes de tomate Moneymaker foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os modos de aplicação (pulverizado ou TMAO di-hidratado regada) sobre esta experiência. 5g/L de TMAO di-hidratado pulverizado foi o melhor tratamento quando a irrigação foi feita com água, com 74,2% de sobrevivência das plantas. A taxas mais elevadas de teste, ambos os tratamentos mostraram um claro aumento da massa seca da parte aérea, quando comparado com plantas não tratadas. Além disso, as plantas tratadas TMAO comportou-se extremamente saudável comparado com o controle não tratado, apesar de suportar as plantas à seca muito melhor depois de tratamento seca (Figura 1). Além disso, como mostrado na Figura 1, as plantas tratadas TMAO comportou-se extremamente saudável comparado com o controle não tratado, apesar de suportar as plantas à seca muito melhor depois de tratamento seca. Na Figura 1, nas plantas de controle do lado esquerdo irrigadas com água e em plantas tratadas o lado direito irrigadas com 5,5g/L de TMAO di-hidratado após a recuperação seca.
[0351] Tabela 6. A taxa média de sobrevivência e análise de variância para TMAO di-hidratado de plantas de tomate tratadas em condições de seca.
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[0352] Tabela 6 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização e/ou regar antes do estresse hídrico ocorre aumento da taxa de sobrevivência das plantas na família Solanaceae, sob condições de estresse hídrico extremas. Em linhas 1-4 os tratamentos de pulverização são comparados combinados de forma independente a partir dos tratamentos de irrigação. A taxa de sobrevivência após a seca aumenta significativamente com a concentração de pulverização com TMAO sendo o mais baixo na linha 1 sem TMAO (12,5%) e a maior na linha 4 com 5 g/L de TMAO (56,6%). Em linhas 5-8 tratamentos de pulverização são comparados quando as plantas são irrigadas apenas com água. Analogamente taxa de sobrevivência após a seca aumenta significativamente com a concentração de pulverização com TMAO sendo a mais baixa na linha 5 sem TMAO 16,6%) e a maior na linha 8, com 5 g/L de TMAO (74,2%). Em linhas 9-12 os tratamentos de pulverização são comparados quando as plantas são irrigadas com 0,1 g/L de TMAO. A taxa de sobrevivência após a seca aumenta significativamente com as maiores concentrações de pulverização com TMAO sendo o mais baixo em linhas 9 e 10, sem TMAO (16,6%) e com pulverização de 0,1 g/L TMAO (12,5%), respectivamente, e o mais alto na linha 12 com 5 g/L de TMAO (68,9%). Em linhas 13-16 os tratamentos de pulverização são comparados quando as plantas são irrigadas com 1 g/L de TMAO. A taxa de sobrevivência após a seca também aumenta significativamente com as maiores concentrações de pulverização com TMAO sendo o mais baixo em linhas 13 e 14, sem TMAO (4,1%)) e pulverização de 0,1 g/L TMAO (0%) respectivamente, e o mais alto na linha 16 com 5 g/L de TMAO (33,3%). Aumentando o tratamento de irrigação TMAO a 5 g/L (linhas 17-20) melhora as taxas de sobrevivência quando comparado com tratamentos de irrigação de dose baixa combinada com os tratamentos de pulverização, mas em tomate não é tão boa quanto os tratamentos de pulverização por si só, provavelmente devido a uma sobredosagem TMAO, embora concentrações crescentes de TMAO pulverizar ainda aumentar a taxa de sobrevida global. Combinando as doses mais elevadas de pulverização de 5 g/L e de irrigação 5 g/L torna uma taxa de sobrevivência de 50% (linha 20).
[0353] Exemplo 7: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a sobrevivência da planta em pepino em condições de seca extrema. Sementes de pepino 'Comerciante' foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. Aplicações regadas parecem produzir melhor desempenho na taxa de sobrevivência (valor de P 0,05). 5g/L TMAO pulverizado foi o melhor tratamento quando a irrigação foi feita com 5 g/L TMAO, com 95,8% de sobrevivência das plantas.
[0354] Tabela 7. Taxa de sobrevivência média e análise ANOVA para TMAO tratadas plantas de pepino em condições de crescimento de seca.
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[0355] Tabela 7 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização e/ou rega antes do estresse hídrico ocorre aumento da taxa de sobrevivência das plantas na família das cucurbitáceas, sob condições de estresse hídrico extremas. Em linhas 1-4 os tratamentos de pulverização são comparados combinados de forma independente a partir dos tratamentos de irrigação. A taxa de sobrevivência após a seca aumenta significativamente com a concentração de pulverização com TMAO sendo o mais baixo na linha 1 sem TMAO (66,6%) e a maior na linha 4 com 5 g/L de TMAO (94,7%). Em linhas 5-8 tratamentos de pulverização são comparados quando as plantas são irrigadas apenas com água. Analogamente taxa de sobrevivência após a seca aumenta significativamente com a concentração da pulverização de TMAO sendo a mais baixa na linha 5 sem TMAO (54,1%) e a mais alta na linha 8, com 5 g/L de TMAO (95,8%). Em linhas 9-12 os tratamentos de pulverização são comparados quando as plantas são irrigadas com 0,1 g/L de TMAO. A taxa de sobrevivência após a seca aumenta significativamente com a concentração de pulverização com TMAO sendo a mais baixa na linha 9 sem TMAO (45,8%) e a mais alta na linha 12 com 5 g/L de TMAO (95,8%). Em linhas 13-16 os tratamentos de pulverização são comparados quando as plantas são irrigadas com 1 g/L de TMAO. A taxa de sobrevivência após a seca também aumenta significativamente com a qualquer uma das TMAO tratamentos por pulverização, sendo a mais baixa na linha 13 sem TMAO (87,5%) e mais elevados em linhas 14-16 com 0,1, 1 ou 5 g/L de TMAO dando a mesma taxa de sobrevivência de 91,6%. Os melhores resultados são obtidos quando as plantas são irrigadas com TMAO a 5g/l (linhas 17-20). Mesmo sem tratamento de pulverização a taxa de sobrevivência é de 66,6% (linha 17), que aumenta em até 95,8% sobrevida com o tratamento 5g/L de pulverização (linhas 20).
[0356] Exemplo 8: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a sobrevivência de plantas de tomateiro sob irrigação de água limitado. Sementes de tomate 'Moneymaker' foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. Ambos pulverização e tratamentos de irrigação com TMAO aumentaram significativamente o tamanho da planta.
[0357] Tabela 8. O tamanho médio do caule e análise de variância para TMAO e plantas de tomate água irrigado nas condições de água que crescem limitadas.
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[0358] Tabela 8 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização e molhando antes do estresse hídrico ocorre o aumento da biomassa da parte aérea na família Solanaceae, sob condições de estresse hídrico limitados. Em linhas 1-2 os tratamentos de irrigação são comparados combinadas independentemente de entre os tratamentos de pulverização. O comprimento da parte aérea aumenta significativamente após a irrigação limitada com pulverização de 1 g/L de TMAO sendo o mais baixo na linha 1 sem TMAO (10,57 cm) e os maiores na linha 2 com 1 g/L de TMAO pulverização (12,97 centímetros). Em linhas 1, 3, 5 e 7, o pulverizador tratamentos são comparados quando as plantas são irrigadas com água apenas. Comprimento da parte aérea após a irrigação de água limitada aumenta significativamente com a concentração de pulverização com TMAO sendo a mais baixa na linha 1 sem TMAO (10,57 centímetros) e a maior na linha 7 com 5 g/L de TMAO (14,2 cm). Nas linhas 2, 4, 6 e 8 a pulverização tratamentos são comparados quando as plantas são irrigadas com 1 g/L de TMAO. Mais uma vez atirar comprimento aumenta significativamente após a irrigação de água limitada com as concentrações crescentes de pulverização com TMAO sendo o mais baixo na linha 2, sem TMAO pulverização (12,97 centímetros) e a maior na linha 8, quando ambos os tratamentos são combinados com 5 g/L de TMAO tratamento pulverizar e tratamento 1 g/L de irrigação (14,6 cm).
[0359] Exemplo 9: TMAO di-hidratado aplicado exogeneamente aumenta a produção de plantas de tomateiro sob irrigação de água limitada. Sementes de tomate 'Rio Grande' foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. Pulverização de tratamentos com 1 g/L TMAO produção aumentou planta.
[0360] Tabela 9. A produção média de frutos e análise ANOVA para plantas de tomate tratadas com pulverização de TMAO em condições de crescimento água limitada.
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[0361] Tabela 9 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização antes do estresse hídrico ocorre aumento da produção na família Solanaceae, sob condições de estresse hídrico limitados. Na linha 2, é mostrado que 30% da água de irrigação reduz significativamente a produção vegetal (52,9 g/fruto), quando comparado com as plantas na linha 1 sob irrigação de água normal (73,85 g/fruto). No entanto, como mostrado na linha 3, pulverização tratamento com 1 g/L de TMAO di-hidratado aplicado exogenamente a cada 4 semanas restaura a produção de plantas com um aumento da produção de frutos de 45%, mesmo sob irrigação de água limitada (76,73 g/fruto) sobre plantas não tratadas com irrigação por 30%.
[0362] Exemplo 10: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a sobrevivência de plantas e biomassa na cevada sob irrigação de água limitado. Sementes de cevada 'Bomi' foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito.
[0363] Tabela 10. O peso médio seco ± S.E. e análise de variância para TMAO di-hidratado e plantas de cevada irrigadas com água em condições de crescimento de seca.
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[0364] Tabela 10 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização e rega antes do estresse hídrico ocorre aumento da taxa de sobrevivência das plantas e atirar de biomassa em plantas monocotiledôneas, sob condições de estresse hídrico extremas. Nas três primeiras fileiras os tratamentos iniciais são comparados, ambos pulverização de 1 g/L TMAO di-hidratado (linha 2) e tratamentos de irrigação com 1 g/L TMAO di-hidratado (linha 3) aumentam significativamente a biomassa seca média por planta, sob seca extrema condições, para 1205.4 mg e 1371,4, respectivamente, quando comparado com as plantas de controle de água tratada na linha 1 (1017,7 mg). Além disso, resultados análogos podem ser obtidos quando as plantas só são irrigadas com 1 g/L TMAO di-hidratado (linha 5: 1216,1 mg por planta), quando comparado com a mesma quantidade de irrigação limitada com água sem TMAO na linha 4 (1.109,3 mg).
[0365] Exemplo 11: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a produção de plantas em milho sob irrigação de água limitado. Sementes de milho 'FAO700 "foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. Pulverização de tratamentos com 1 g/L TMAO aumentou o número de plantas de folhas verdes, teor de clorofila total e produção de grãos.
[0366] Tabela 11. Número médio de folhas verdes e análise de variância para pulverização TMAO ou plantas de milho sementes tratadas em condições de crescimento água limitada.
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[0367] Tabela 11 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização antes de ocorrer o estresse hídrico, ou através da incubação de sementes, aumentando a produção de biomassa nas plantas monocotiledôneas, sob condições de estresse hídrico limitados. Na linha 2, é mostrado que 30% da água de irrigação reduz significativamente o número de folhas verdes, quando comparado com as plantas na linha 1 sob irrigação de água normal. No entanto, como mostrado nas linhas 3 e 4, o tratamento de pulverização com 1 g/L de TMAO di-hidratado quando aplicado exogenamente a cada 4 semanas significativamente restaura o número de folhas verdes sob irrigação de água limitada, com um aumento de 47% na produção de biomassa, mostrada em produção de folhas verdes sobre as plantas não tratadas com irrigação por 30%.
[0368] Exemplo 12: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a produção de plantas em milho sob irrigação de água limitado. Sementes de milho 'FAO700" foram semeadas e plantadas e tratadas como acima descrito. Como mostrado na Tabela 12, os tratamentos de pulverização com 1 g/L TMAO aumentaram o conteúdo de clorofila da planta.
[0369] Tabela 12. Teor de clorofila Médio e análise ANOVA para TMAO pulverização ou semear plantas de milho tratadas em condições de água de crescimento limitadas.
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[0370] Tabela 12 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização antes de ocorrer o estresse hídrico, ou através da incubação de sementes, aumentando a produção de biomassa nas plantas monocotiledôneas, sob condições de estresse hídrico limitados. Na linha 2, é mostrado que 30% da água de irrigação reduz significativamente o conteúdo de clorofila total quando comparado com plantas na linha 1 sob irrigação de água normal. No entanto, como mostrado nas linhas 3 e 4, o tratamento de pulverização com 1 g/L de TMAO di-hidratado quando aplicado exogenamente a cada 4 semanas significativamente restaura o conteúdo de clorofila sob irrigação de água limitada com um aumento na produção de biomassa entre 40% e 72%, mostrado no teor de clorofila nas plantas não tratadas com irrigação por 30%.
[0371] Exemplo 13: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a produção de plantas em milho sob irrigação de água limitado. Sementes de milho ‘FAO700” foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. Pulverização de tratamentos com 1 g/L TMAO aumentado da produção de grãos de plantas.
[0372] Tabela 13. Número médio de grãos por espiga e análise ANOVA para pulverização por TMAO ou plantas de milho tratadas de semente em condições de água de crescimento limitadas.
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[0373] Tabela 13 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização antes de ocorrer o estresse hídrico, ou através da incubação de sementes, aumentando a produção de biomassa nas plantas monocotiledôneas, sob condições de estresse hídrico limitados. Na linha 2, é mostrado que 30% da água de irrigação reduz significativamente o número total de grãos por espiga de milho quando comparado com plantas na linha 1 sob irrigação de água normal. No entanto, como mostrado nas linhas 3 e 4, o tratamento de pulverização com 1 g/L de TMAO di-hidratado quando aplicado exogenamente a cada 4 semanas restaura significativamente o número total de grãos por espiga de milho sob irrigação de água limitada com um aumento na produção de biomassa entre 19% e 27%, mostrado no teor de clorofila nas plantas não tratadas com irrigação por 30%. De nota, linha 4 mostra realmente um aumento de 2% no número total de grãos por espiga de milho para plantas de milho sob irrigação de água de 30% com um tratamento de pulverização de 1 g/L de TMAO di-hidratado quando comparado com plantas de milho sem estresse hídrico ou 100% de irrigação.
[0374] Exemplo 14: aplicação exógena de TMAO di-hidratado não tem compensações em alho-poró, alface, brócolis, aipo ou couve-rábano. Raiz ou deixa de rendimento foi determinado nas plantas tratadas com 1g/L de TMAO di- hidratado ou água, como descrito acima, a fim de avaliar os custos de troca do tratamento sem estresse hídrico. No entanto, não foi observada nenhuma diferença significativa na produção de rendimento, o qual na maioria dos casos era ligeiramente mais elevado nas plantas tratadas com TMAO di- hidratado.
[0375] Tabela de produção 14. Rendimento após os tratamentos de pulverização TMAO di-hidratado a cada 4 semanas para 3 meses
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[0376] A Tabela 14 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente para três meses, sem um custo de fitness. Na linha 1, o peso total de produção de plantas de alho-poró tratados com TMAO di-hidratado produzido 102% quando comparado com os controles de água tratada, na linha 2 o peso total de produção de plantas de alface tratadas com TMAO di-hidratado produzido 112% quando comparado com os controles, na linha 3 o peso total de produção de plantas de brócolis tratados com TMAO di-hidratado de produzir 120% quando comparado com os controles, enquanto na linha 4 o peso da produção total das plantas de aipo tratados com TMAO di-hidratado de produzir o mesmo que controles de água tratada, e, finalmente, na linha 5 plantas couve-rábano produzido 103% quando comparado com os controles de água tratada.
[0377] Exemplo 15: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a produção de plantas no brócolis sob irrigação de água limitado. Sementes de brócolos 'Parthenon' foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. Pulverização e irrigação tratamentos com 1 g/L TMAO aumentou produção de planta.
[0378] Tabela 15. A produção média da inflorescência e análise ANOVA para plantas de brócolis tratadas com pulverização de TMAO em condições de crescimento água limitada.
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[0379] Tabela 15 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização antes do estresse hídrico ocorrer aumento da produção na família Brassicaceae, sob condições de estresse hídrico limitados. Na linha 2, é mostrado que 30% da água de irrigação reduz significativamente a produção vegetal (80,5 g/planta) quando comparado com plantas na linha 1 sob irrigação de água normal (202,8 g/planta). No entanto, como mostrado nas linhas 3 e 4, pulverização ou tratamento de irrigação com 1 g/L de TMAO di-hidratado aplicado exogenamente a cada 4 semanas restaura parcialmente a produção de planta com um aumento de produção de inflorescências de 8% ou 6%), respectivamente, mesmo debaixo de água limitada irrigação (87,3 g/planta e 85,2 g/planta) sobre as plantas não tratadas com irrigação de 30%.
[0380] Exemplo 16: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a produção de plantas na cevada cultivada no campo, sem irrigação. "Hispânicos" sementes de cevada foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. Ambos, semente (1 g/L/Kg TMAO) e uma combinação de tratamentos de sementes e pulverização com 1 g/L TMAO aumento da produção de grãos da planta.
[0381] Tabela 16. A produção média de sementes em gramas por metro quadrado e análise de variância para as sementes de TMAO ou sementes e plantas de cevada pulverização tratada cultivadas no campo, sem irrigação externa e com 200 1/m2 de água da chuva no total ao longo da temporada.
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[0382] Tabel a 16 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente por pulverização antes de ocorrer o estresse hídrico, ou através da incubação de sementes, aumentando a produção de sementes em plantas de cereais cultivados em campo aberto sem irrigação adicional. Na linha 2, é mostrado que o tratamento de sementes com 1g TMAO por 1 kg de sementes aumenta significativamente até 18% o rendimento quando comparado com plantas na linha 1 sem tratamento. Além disso, como mostrado na linha 4, um tratamento de pulverização adicional com 1 g/L de TMAO di- hidratado aplicado exogenamente a cada 4 semanas aumenta significativamente o rendimento total por metro quadrado até 35% quando comparado com o controle não tratado.
[0383] Exemplo 17: TMAO di-hidratado aplicado exogenamente aumenta a produção de plantas em girassol no campo, sem irrigação externa. Sementes de girassol 'SAMBRA" foram plantadas, cultivadas e tratadas como descrito. O tratamento de sementes (1 g/L/Kg TMAO) aumentou teor de clorofila de plantas e produção de sementes.
[0384] Tabela 16. Efeitos do tratamento de sementes com TMAO sobre a aptidão da planta em girassol sob condições de estresse naturais. A tabela mostra o teor de clorofila, o peso das sementes e valores P para o teste ANOVA. Ambas as diferenças de clorofila e de peso entre os grupos TMAO controle e são estatisticamente significativos. Valores de teor relativo de clorofila são obtidos por absorção óptica em duas faixas de ondas diferentes: 653nm (clorofila) e 931nm (Próximo do Infra-vermelho)
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[0385] Tabela 17 mostra que TMAO pode ser aplicado exogenamente pelo tratamento de sementes antes de ocorrer o estresse hídrico, aumentando a produção de sementes e petrolífera plantas de culturas como girassol cultivadas em campo aberto sem irrigação adicional. Na coluna 5, é mostrado que o tratamento de sementes com 1g TMAO por 1 kg de sementes aumenta significativamente até 30% o teor de clorofila e o rendimento até 77% quando comparado com plantas de controle sem tratamento.
[0386] Exemplo 18: DDAO aplicado exogenamente aumenta sobrevivência das plantas na pimenta em condições de seca extrema. Sementes de pimenta 'Murano' foram semeadas, cultivadas e tratadas tal como descrito acima. 0,5 g/L DDAO aplicado como sementes, irrigação ou pulverização tratamento melhorou a taxa de sobrevivência quando comparado com controles não tratados. 0,5 g/L DDAO pulverizado foi o melhor tratamento, com 83,3% de sobrevivência das plantas.
[0387] Tabela 18. Taxa de sobrevivência média e análise ANOVA para plantas de pimenta tratadas com DDAO em condições de crescimento de seca.
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[0388] Tabela 18 mostra que DDAO pode ser aplicado exogenamente por sementes e/ou pulverização e/ou irrigação antes de estresse hídrico ocorre aumento da taxa de sobrevivência das plantas sob condições de estresse hídrico extremas em uma espécie de cultura vegetal. Em linhas 1-2 do tratamento de sementes são comparados e tratamento DDAO aumenta a sobrevida de 22,9% para 76,1%. A taxa de sobrevivência após a seca também aumenta significativamente a 35,4% quando a DDAO é aplicada na irrigação, como mostrado na row6, enquanto que a menor sobrevivência foi na linha 5, o controle de irrigação sem DDAO (8,3%). Os melhores resultados são obtidos quando as plantas são irrigadas com DDAO a 0,5 g/L (linha 4).
[0389] Exemplo 19:
[0390] Como mostrado na Tabela 19 e na Tabela 20 abaixo, a sobre-expressão de GS-FMO OX5 aumentar a produção endógena de TMAO di-hidratado não tem vantagens e desvantagens em Arabidopsis. Biomassa de plantas e produção de sementes foi determinada em sementes transgênicas (genótipos X3 e X8) e de tipo selvagem (Col-0) de Arabidopsis thaliana foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito acima, a fim de avaliar os custos de trade-off do aumento da TMAO produção endógena sem estresse hídrico. No entanto, como mostrado nas Tabelas 19 e 20, não foi observada nenhuma diferença significativa na biomassa da planta ou semente ou peso rendimento. O peso médio vegetativo aumentou com o número de cópias do FMO GS-OX5, sendo significativamente maior quando 8 cópias do gene estando presentes em comparação com o genótipo de 3 cópias. A semente peso médio aumentou com o número de cópias do FMO GS-OX5, sendo maior quando 8 cópias do gene estão presentes em comparação com o genótipo 3 cópias.
[0391] Tabela 19. Planta A biomassa foi avaliada como valor médio em peso (em gramas) ± S.E. por três diferentes grupos de plantas cultivadas sob nenhuma condição de estresse: plantas tipo selvagem (Col-0) e transgênicas (X3 e X8) de Arabidopsis thaliana.
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[0392] Tabela 20. Peso das sementes Planta ou o rendimento foi avaliado como valor do peso médio (em mg) ± S.E. para três grupos diferentes de sementes e siliques de plantas de Arabidopsis cultivadas sob nenhuma condição de estresse: tipo selvagem (Col-0) e transgênicos (38,3 e 38,8) plantas de Arabidopsis thaliana.
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[0393] Exemplo 20:
[0394] Como mostrado na Tabela 21 abaixo, a sobre-expressão de FMO GS-OX5 aumenta sobrevivência planta em Arabidopsis sob irrigação de água limitada: As plantas de controle (seis semanas de idade) foram irrigadas com 40 ml de água duas vezes na semana, enquanto plantas tratadas com "água de irrigação limitada" foram irrigadas com 30 ml de água uma vez por semana. Sementes Transgênicas (genótipos X3 e X8) e de tipo selvagem (Col-0) de Arabidopsis thaliana foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. O valor de fitness aumentou com o número de cópias do FMO GS-OX5, sendo maior quando 8 cópias do gene estão presentes em comparação com o genótipo de 3 cópias. Valores de aptidão foram designados utilizando os seguintes critérios: 0: Planta inoperante; 1: sintomas de plantas criticamente danificadas; 2: sintomas de plantas danificadas moderada; 3: sintomas de plantas ligeiramente danificado; 4: planta saudável. Como mostrado na Tabela 20, as plantas transgênicas tinham um valor de fitness significativamente maior do que as plantas não transgênicas.
[0395] Tabela 21. O valor médio de fitness ± S.E. por três genótipos diferentes cultivadas sob irrigação de água limitada: plantas tipo selvagem (Col-0) e transgênicas (X3 e X8) de Arabidopsis thaliana.
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[0396] Exemplo 21
[0397] Sobre-expressão de FMO GS-OX5 aumentou sobrevivência de planta em Arabidopsis sob condições de seca: As plantas de controle (seis semanas de idade) foram irrigadas com 40 ml de água duas vezes na semana; enquanto plantas "secas" tratadas não foram irrigadas até que todas as plantas foram murchas. (TMAO hidratado aplicado exogenamente é capaz de recuperar a sobrevivência da planta no tipo selvagem seca plantas estressadas. Sementes Transgênicas (genótipos FMOX3 e FMOX8) e de tipo selvagem (Col-0) de Arabidopsis thaliana foram semeadas, cultivadas e tratadas como descrito. Após o primeiro ciclo de plantas de tipo selvagem murchas foram pulverizadas com 1 g/L TMAO di-hidratado para determinar se as plantas de tipo selvagem murchas conseguiram recuperar e executar, bem como as plantas transgênicas nos seguintes ciclos de murchidão com a aplicação exógena. Valores de aptidão foram atribuídos utilizando os seguintes critérios: 0: morte da planta; 1: sintomas de plantas criticamente danificada; 2: sintomas de plantas danificadas moderada; 3: sintomas de plantas ligeiramente danificada; 4: planta saudável. Como mostrado na Tabela 21, as plantas transgênicas tratadas com TMAO tinham um valor de fitness significativamente maior do que as plantas não transgênicas tratadas com TMAO.
[0398] Tabela 22. O valor médio de capacidade ± S.E. por três genótipos diferentes cultivados sob condições de seca: plantas de tipo selvagem (Col-0) e transgênica (X3 e X8) de Arabidopsis thaliana.
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[0399] Embora um certo número de aspectos e modalidades exemplares tenham sido discutidas acima, aqueles especialistas na técnica irão reconhecer certas modificações, adições, permutações e sub-combinações. Consequentemente, pretende-se que as seguintes reivindicações em anexo e as reivindicações a seguir introduzidas são interpretados para incluir todas essas modificações, adições, trocas, e sub-combinações são como no seu verdadeiro espírito e escopo.
[0400] A discussão antecedente da divulgação foi apresentada para fins de ilustração e descrição. O precedente não se destina a limitar a revelação para a forma ou formas aqui divulgadas. Na descrição pormenorizada precedente, por exemplo, várias características da invenção são agrupadas em uma ou mais modalidades para fins de simplificação da descrição. Este método de divulgação não deve ser interpretado como o reflexo de uma intenção que a divulgação reivindicada requer mais recursos do que expressamente recitado em cada reivindicação. Em vez disso, dado que as seguintes reivindicações refletir, aspectos da invenção encontram-se em menos do que todas as características de uma modalidade anterior divulgado único. Assim, as seguintes reivindicações são incorporadas neste detalhada
[0401] Descrição, com cada uma das reivindicações de pé por si próprio como uma modalidade preferida separada da divulgação.
[0402] Tal como aqui utilizado "expressão do gene" e "expressão", devem ser entendidos como sendo sinônimos e significa a realização da informação que é armazenada em uma molécula de ácido nucleico. Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são aqui utilizados indiferentemente.
[0403] Vários componentes são aqui ditos como "operativamente ligada", "ligada" ou "operativamente associada". Tal como aqui utilizado, "operativamente ligado", "ligação operativa", "ligada" ou "operativamente associada" refere-se a sequências de ácidos nucleicos de um único fragmento de ácido nucleico de modo a que a função de uma é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência de codificação quando é capaz de afetar a expressão dessa sequência de codificação.
[0404] Tal como aqui utilizado, "pelo menos um", "uma ou mais" e "e/ou" são expressões abertas que são ambos conjuntivo e disjuntivo em operação. Por exemplo, cada uma das expressões "pelo menos um de A, B e C", "pelo menos um de A, B, ou C," "um ou mais de A, B, e C", "uma ou mais de A, B, ou C "e" A, B e/ou C "significa A isoladamente, B sozinho, C sozinha, A e B, em conjunto, A e C em conjunto, B e C em conjunto, ou A, B e C em conjunto.
[0405] Tal como aqui utilizado, "algures" significa, em algum ponto do tempo indefinido ou indeterminado. Assim, por exemplo, como aqui utilizado, "algum tempo depois" significa seguinte, imediatamente a seguir ou em algum ponto do tempo indefinido ou indeterminado após o ato anterior
[0406] O uso dos termos "um", "uma," e "o", e referentes semelhantes no contexto de descrever a divulgação (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) devem ser entendidos para cobrir ambos o singular e o plural, a menos que aqui indicado de outra forma ou contradito pelo contexto claramente. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" são para ser interpretados como termos abertos (isto é, que significam "incluindo, mas não limitado a,"), a menos que indicado de outra maneira. Recitação de faixas de valores aqui destinam-se meramente a servir como um método abreviado de referir individualmente cada valor separado que cai dentro do intervalo, a menos que aqui indicado de outra forma, e cada valor separado incorporado na especificação como se fosse aqui individualmente recitados. Por exemplo, se o intervalo de 10-15 é descrito, em seguida, 11, 12, 13, e 14 são também divulgados. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que aqui indicado de outro modo ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") aqui proporcionados, pretende apenas iluminar melhor a divulgação e não representa uma limitação ao escopo da revelação, a menos que de outro modo reivindicado. Nenhuma linguagem na especificação deve ser entendida como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da divulgação.

Claims (5)

1. Método para produzir uma planta tolerante à seca caracterizado por compreender: aplicar pelo menos um tratamento de uma quantidade eficaz de N-óxido de trimetilamina (TMAO) di- hidratado ou N-óxido de N,N-dimetildecilamina (DDAO), a uma planta, parte de planta, ou semente; em que o pelo menos um tratamento é um tratamento de irrigação e/ou pulverização à planta e a quantidade eficaz de TMAO di-hidratado ou DDAO é de 0,1 a 10 g por litro; ou o pelo menos um tratamento é um tratamento de semente e a quantidade eficaz de TMAO di-hidratado ou DDAO é entre 0,5 g a 1g por kg de semente ou 1 g por litro por kg de semente; e cultivar de dita planta, parte de planta, ou semente, em que uma planta tolerante à seca é produzida.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ainda compreender: aplicar pelo menos um segundo tratamento de uma quantidade eficaz de TMAO di-hidratado ou DDAO a dita planta tolerante à seca.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um tratamento com a dita quantidade eficaz de TMAO di-hidratado ou DDAO é um tratamento de irrigação e/ou tratamento de pulverização.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um tratamento com a dita quantidade eficaz de TMAO compreende os dois compostos diferentes do grupo consistindo em TMAO di-hidratado e DDAO.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ainda compreender aplicar sais ou qualquer outro aditivo a dita planta e cultivar a dita planta, em que uma planta tolerante à seca é produzida.
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