HUT65677A - Production of plants resistant to attacks of sclerotinia sclerotiorum - Google Patents

Production of plants resistant to attacks of sclerotinia sclerotiorum Download PDF

Info

Publication number
HUT65677A
HUT65677A HU9203473A HU9203473A HUT65677A HU T65677 A HUT65677 A HU T65677A HU 9203473 A HU9203473 A HU 9203473A HU 9203473 A HU9203473 A HU 9203473A HU T65677 A HUT65677 A HU T65677A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
prpa
oxo
plant
protein
ecori
Prior art date
Application number
HU9203473A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9203473D0 (en
Inventor
Alain Sailland
Georges Freyssinet
Original Assignee
Rhone Poulenc Agrochimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Agrochimie filed Critical Rhone Poulenc Agrochimie
Publication of HU9203473D0 publication Critical patent/HU9203473D0/hu
Publication of HUT65677A publication Critical patent/HUT65677A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/03—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with oxygen as acceptor (1.2.3)
    • C12Y102/03004—Oxalate oxidase (1.2.3.4)

Description

A találmány tárgya egy oxalát-oxidázt kódoló gén, az ez által a gén által kódolt protein, ezt a gént magukban foglaló kiméra gének, és ezek alkalmazása transzformációra annak érdekében, hogy gombamegbetegedések iránti rezisztenciát átvigyünk.
A sclerotiniózis egy jelentős gombabetegség, amely nagyszámú kétszikűt érint. A kórokzó a Sclerotinia sclerotiorum egy polifágos gomba, amely kevés gazda-fajlagossággal bír.
A gomba a növényeket közvetlenül megtámadhatja a szár szintjén vagy a levelek szintjén, és aztán terjed rá a szárra, vagy megtámadhatja a virágzó fészekvirágzatot. Az első két esetben a növény a táplálékellátás megszakadása folytán elsorvad. Az utolsó esetben a virágzat elsorvad, veszélyeztetve a betakarítást.
A gomba litikus enzimeket termel, amelyek a fertőzött növény sejtfalát lebontják, és segítik a gomba elterjedését a növényben. Ezek az enzimek a patogenitásban fontos szerepet játszanak, de hatásuk önmagukban nem teljes. A gomba oxálsavat is termel (Godov és munkatársai, 1990), ez az oxálsav a fertőzött szövetek pH-jának csökkenését okozza, elősegítve ezzel a sejtfal litikus enzimek által történő hidrolízisét. Az oxálsav termelés csökkentése, vagy a képződött oxálsav elbontása a gomba fejlődésének lassulásához, vagy éppen gátlásához vezethetne.
Egy nos rezisztens növény kifejlesztése érdekében az oxálsavtól történő detoxifikálás stratégiája használható. Ennek a savnak a lebontása korlátozza a megtámadott növényi szövet intracelluláris pH-jának csökkenését, ennek folytán a litikus enzimek pH optimumuktól igen távoli pH értéken fognak működni, miáltal nem lesznek igazán aktívak és hatékonyak. Ez a gomba patogenitásának csökkenéséhez vezet. Ennek a célnak az elérésére az oxalát-oxidáz használható, ami a következő reakciót katalizálja:
θ2 C2°4H2 ------------------> 2CO2 + H2°2 oxalát-oxidáz
Az oxalát-oxidázt különböző növényekből izolálják, általában egyszikűekből (Piéta és munkatársai, 1982) , a fehérje tisztítható például árpából szokásos kromatográfiás eljárások alkalmazásával (például Sephadex G-75 gélszűréssel és MonoQ ioncserélő gélen, Pharmacia), az enzim aktivitásnak az alábbi kolorimetriás eljárással való nyomonkövetésével (Obzansky és Richardson, 1983):
Oxálsav + 02----------------> 2CO2 + H2O2 oxalát oxidáz
H2O2 + MBTH + DMA--------------> indamin + H20 peroxidáz
MBTH = 3-metil-2-benzotiazolon-hidrazon
DMA = N,N-dimetil-alinin.
Ez lehetővé tette egy olyan protein tisztítását, amely akrilamid gélen, denaturáló körülmények mellett 26 000 daltonos molekulatömeget mutat. A tisztított oxalát-oxidáz egy részét arra használjuk, hogy nyúl anti oxalát-oxidáz antitesteket nyerjünk; a megmaradt fehérjét a natív fehérje (N-terminális) szekvenálásának elvégzésére használjuk vagy, cianogén-bromidos hasítás után, bizonyos belső peptidek szekvenálására. A kapott eredmények a következők:
N-terminális: IDPDPLQDF-VADLDGKAVSVNGH
S
2. számú belső peptid: HFQFNVGKTEAY
CDNS
A fent leírt peptid szekvenciáknak a Swiss-Prot fehérjekönyvtárban található adatokkal való összehasonlítása lehetővé tette számunkra egy Germine elnevezésű búzafehérje azonosítását, amelyet 1989-ben Dratewka-kos és munkatársai írtak le. Vizsgálatokat végeztünk, amelyek alapján megállapítottuk, hogy a szerzők által leírt cDNS egy 201 aminosavból álló fehérjét kódol, amely oxalát-oxidáz aktivitással bír. A vizsgálatok további leírásánál a szerzők által közölt cikk [J. Bioi. Chem., 264. 4896-4900] 2. ábráján szereplő nukleotid-számozást alkalmazzuk.
A fenti cDNS szekvenciája 1075 nukleotid hosszúságú egy 85 egységből álló nem leolvasott 5' véggel, egy 672 nukleotidos nyílt leolvasási kerettel (a 86 - 757 helyzet között), és egy 318 egységből álló nem leolvasott 3' véggel.
A cDNS szekvenciából kikövetkeztetett protein szekvenciának a natív protein szekvenálásával kapott szekvenciával történő összehasonlítása azt mutatja, hogy a cDNS nem csak az érett oxalát-oxidázt kódolja, hanem egy az N-terminális végen lévő, 23 aminosavból álló szignál peptidet is. Ezért az oxalát-oxidáz egy előprotein (preprotein) formájában szintetizálódik (szignál peptid + érett peptid), amely a szignál peptid eltávolításával érésen megy át, így szabadul fel az érett, aktív enzim.
A következőkben vagy azt a részt fogjuk használni, amely az előproteint kódolja (86 - 757 helyzetű nukleotidok), vagy csak azt a részt, amely az érett proteint kódolja (155 - 757 helyzetű nukleotidok) . Az utóbbi esetben az ACC kodon elé (amely az érett fehérje első aminosavját, a treonint kódolja) egy AUG kodont helyezünk (amely metionint kódol).
A Sclerotinia sclerotiorum főként a növény szárán támad, ezért előnyös, ha az oxalát-oxidázt vagy a klorofilos szövetben tudjuk kifejezni, erre a Helionthus annuus ribulóz 1,5-difoszfát-karboxiláz kis alegységének promoterjét (SSUHa, Waksman és munkatársai, 1987) használhatjuk; vagy a növény különböző szöveteiben fejezzük ki, erre a karfiol mozaikvírus 35S RNS mindenütt jelenlévő promoterjét (CaMV 35S) használjuk, amelynek egy része duplikált, és amelyet kettős CaMV néven neveznek.
A találmány szerinti kiméra gének például a következő elemekből konstruálhatok:
A. Kettős CaMV promoter, amelyet az oxalát-oxidáz cDNS-nek az előproteint (szignál peptid + érett peptid) kódoló része követ, és a pTi 37 nopalin szintetáz génből (Bevan és munkatársai, 1983) nyert nos terminátor.
B. Kettős CaMV promoter, amelyet az oxalát-oxidáz cDNS-nek csak az érett proteint kódoló része követ, majd ezt a nos terminátor követi.
C. A gén azonos az A pontban leírttal, de a kettős CaMV helyén napraforgó ribulóz 1,5-difoszfát-karboxiláz kis alegységének (SSUHa) promoterét tartalmazza.
D. A gén azonos a B pontban leírttal, de a kettős CaMV helyén az SSUHa promoterét tartalmazza.
• * · · ·« · • · · ·
Minden kiméra gént beviszünk a növényi sejtbe egy Agrobacterium-ot alkalmazó rendszer segítségével, vagy bármely más olyan rendszerrel, amely egyébként növényi sejtek transzformálására ismert. Ezekből a transzformált sejtekből regeneráljuk a növényeket. A növények megnövekedett tűrést mutatnak Sclerotinia sclerotiorum iránt.
1. Példa
Két kódoló szekvencia készítése:
Előprotein: ezt a fenti cDNS-ből nyerjük HindlII-mal végzett emésztéssel (a 66. helyzetben). A kapott tapadós véget Klenow polimerázzal végzett kezeléssel tompává tesszük. Ezt a DNS-t azután Nhel-vel emésztjük (a 811. helyzetben).
A pUC 19 plazmidot (Yanisch-Perron és munkatársai, 1985) párhuzamosan emésztjük SacI alkalmazásával.
A kapott tapadós véget Klenow polimeráz alkalmazásával tompává tesszük. A plazmidot ezután Xbal-vel emésztjük (kompatibilis Nhel-vel).
Az előző módon készített cDNS fragmentumot és plazmidot ligáljuk. Az így kapott új plazmid elnevezése pRPA-oxo-01, térképét az 1. ábrán mutatjuk be.
B. Érett protein: ezt a fenti cDNS-ből nyerjük BstNI-vel végzett emésztés után (a 173. helyzetben). A kapott fragmentumot és a
5' 3'
ATGACCGACCCAGACCCTCTCC TACTGGCTGGGTCTGGGAGAGGT
3' 5' szekvenciájú linkért ligáljuk. Ez az érett protein N-terminális szekvenciájának módosításához vezet, amely TDPDPLQ-ról MTDPDPLQra változik.
Ezt a cDNS fragmentumot azután Nhel-vel emésztjük (a 811. helyzetben), hogy azután az előzőekben leírt módon elkészített pUC19 plazmiddal ligálhassuk. Az új, így kapott plazmid elnevezése pRPA-oxo-02, térképe az 1. ábrán látható.
2. Példa
A kiméra gének készítése
a. A promotert és a nos terminátort tartalmazó vektorok készítése;
- példa a kettős CaMV: ezt a vektort az alábbi módon előállított pRPA-BL-410 plazmidból nyerjük:
Kukorica RuBisCO SSU tranzit peptid/AroA gén fúzió:
A kukorica RuBisCO SSU gén tranzit peptidje egy 192 bázispár hosszúságú EcoRI-Sphl fragmentumból származik, amelyet a Lebrun és munkatársai (1987) által leírt kukorica RuBisCO SSU génnek megfelelő olyan cDNS-ből nyertünk, amely egy olyan Ncol hellyel bír, amely a transzláció iniciátor kodonjától a tranzit peptid hasítási helyének megfelelő Sphl helyig terjed.
A kukorica tranzit peptid és a bakteriális EPSPS gén közötti transzlációs fúziót az Sphl végnek bakteriofág T4 polimerázzal való kezelésével, és ennek pRPA-BL 104 AroA gén Klenow polimerázzal kezelt, EcoRI-vel vágott Ncol végével való ligálásával érjük el.
Kukorica RuBisCO SSU tranzit peptidje/kukorica RuBisCO ssu érett részének 22 aminosavból álló szekvenciája/AroA gén fúzió
Hasonló módon ligáljuk kukorica RuBisCO gén SSU cDNS-ének
228 bázispárból álló EcoRI-HindlI fragmentumát pRPA-BL 104 AroA génjének Klenow polimerázzal kezelt és EcoRI-vel vágott Ncol végével. Transzlációs fúziót nyerünk a kukorica RuBisCO SSU tranzit peptidje, a kukorica RuBisCO SSU érett részének 22 aminosavja és a bakteriális EPSPS gén között.
Napraforgó RuBisCO SSU tranzit peptid
A fragmentumot a Waksman és Freyssinet (1987) által izolált cDNS-ből nyerjük. Egy Sphl helyet hozunk létre Zoller és Smith (1984) eljárása szerint a tranzit peptid hasítási helyén. Az így nyert napraforgó RuBisCO SSU tranzit peptidje egy 171 bázispárból álló EcoRI-Sphl fragmentum.
Napraforgó RuBisCO SSU tranzit peptidje/kukorica RuBisCO SSU érett részének 22 aminosavból álló szekvenciája/AroA gén fúzió
A kukorica RuBisCO SSU tranzit peptidje/kukorica RuBisCO SSU érett részének 22 aminosavból álló szekvenciája gén-fúziót tartalmazó konstrukciót a 171 bázispárból álló EcoRI-Sphl fragmenttel hasítjuk, amely megfelel a fenti napraforgó RuBisCO gén kis alegysége (SSU) tranzit peptidjének. A kapott konstrukció az EcoRI-Sphl fragmentum egy szubsztitúcióját képezi, és ez egy transzlációs fúzió, a napraforgó RuBisCO SSU tranzit-peptidje/kukorica RuBisCO SSU érett részének 22 aminosavból álló szekvenciája/AroA gén fúzió.
Az EcoRI-Sall fragmentumot a 31 nos szekvenciát és a T-DNS jobboldali végét tartalmazó Sall-SstI fragmentummal ligáijuk. A kapott EcoRI-SstI fragmentumot, amely a napraforgó RuBisCO SSu tranzit peptidje/a kukorica SSU érett részének 22 aminosavból álló szekvenciája/AroA gén/3' nos/T-DNS jobboldali vége
- 9 egységet tartalmazza, behelyettesítjük az olyan EcoRI-SstI fragmentum helyére, amely a kettős CaMV promotert tartalmazó 150 A alfa 2 plazmid T-DNS-ének jobboldali végét tartalmazza. Azt a transzkripciós fúziót, amely a 150 A alfa 2 vektorban tartalmazza a kettős CaMV/napraforgó RuBisCO SSU tranzit peptidje/kukorica RuBisCO SSU érett részének 22 aminosavból álló szekvenciája/AroA gén/3’ nos egységet, pRPA-BL 294-nak nevezzük.
Napraforgó RuBisCO SSU tranzit peptidje/kukorica RuBisCO SSU 22 aminosavból álló szekvenciája/kukorica RuBisCO tranzit peptidje/AroA gén fúzió:
A fenti konstrukciót NcoI-HindlII-mal hasítva szabaddá tesszük az AroA gént. Ezt azután egy olyan 1,5 kbp méretű NcolHindlII fragmentummal ligáljuk, amely a kukorica RuBisCO SSU tranzit peptid/AroA gén fúziót tartalmazza. A kapott konstrukció az Ncol-Hindlll fragmentum egy szubsztitúciója, és a napraforgó RuBisCO SSU tranzit peptidje/kukorica RuBisCO SSU érett részének 22 aminosavból álló szekvenciája/kukorica RuBisCO SSU tranzit peptidje/AroA gén egy transzlációs fúziója.
Az EcoRI-Sall fragmentumot a 3' nos szekvenciát és a T-DNS jobboldali végét tartalmazó Sall-SstI fragmentummal ligáljuk. A kapott EcoRI-SstI fragmentumot, amely tartalmazza a napraforgó RuBisCO SSU tranzit peptidje/kukorica RuBisCO gén SSU érett részének 22 aminosavból álló szekvenciája/AroA gén/3’nos/T-DNS jobboldali vége fúziót, behelyettesítjük az olyan EcoRI-SstI fragmentum helyére, amely a kettős CaMV promotert tartalmazó 150 A alfa 2 plazmid T-DNS-ének jobboldali végét tartalmazza. A kettős CaMV/napraforgó RuBisCO SSU tranzit peptidje/kukorica • 4« »· ·« · • · · * · · · « · · ··· · • · « · • ·· ·· · · ·
RuBisCO gén SSU érett részének 22 aminosavból álló szekvenciája/kukorica RuBisCO SSU tranzit peptidje/AroA gén/3'nos 150 A alfa 2 vektorban lévő transzkripciós fúziójának elnevezése pRPA-BL 410. Ezt a plazmidot EcoRI és Sall-vel emésztjük, hogy eltávolítsuk az optimalizált tranzit peptid - érett EPSPS-t kódoló régió struktúrgént, a pRPABL-410 deléció után elnevezésű plazmidot nyerjük (lásd az
1. ábrán).
- SSUHa példa: Ezt a vektort a 0 337 899 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett pRPA-BL-207 plazmidból nyerjük, amelyet EcoRI-vel és HindlII-mal emésztünk a nitrilázt kódoló régió eltávolítására, így a pRPA-BL-207 deléció után elnevezésű plazmidot nyerjük (lásd az 1. ábrán).
b. Kiméra gének konstruálása pRPA-oxo-03: ezt pRPA-oxo-01 EcoRI-vei és Sall-vel történő emésztésével nyerjük. A kapott fragmentumot, amely az előproteint kódolja, ezután beépítjük az EcoRI és Sáli helyek közé, a kettős CaMV-tól a 3' vég irányába, és a nos terminátortól az 5' vég irányába.
pRPA-oxo-04: a pRPA-oxo-02 EcoRI-vel és Sall-val végzett emésztésével nyerjük. A kapott fragmentumot, amely az érett proteint kódolja, ezután beépítjük az EcoRI és Sáli helyek közé a kettős CamV-tól a 3' vég irányába, és a nos terminátortól az 5’ vég irányába.
pRPA-oxo-05: a pRPA-oxo-01 EcoRI-vel és HindlII-val történő emésztésével nyerjük. A kapott fragmentumot, amely az előproteint kódolja, ezután beépítjük az EcoRI és Hindin helyek közé, a kettős SSUHa-tól a 3' vég irányába, és a nos
V · • · · · · « ♦· ·· ·»·
- 11 terminátortól az 5' vég irányába.
pRPA-oxo-06: ezt pRPA-oxo-02-nek EcoRI-vel és HindlII-val történő emésztésével nyerjük. A kapott fragmentumot, amely az érett proteint kódolja, ezután beültetjük az EcoRI és Hindin helyek közé, az SSUHa promotertől és a nos terminátortól a 3' vég irányába.
1. Táblázat: A négy kiméra gén vázlatos bemutatása:
Azonosítás Promoter Oxalát-oxidázt kódoló réaió Terminátor
pRPA-OXO-03 dCaMV előprotein nos
pRPA-oxo-04 dCaMV érett nos
pRPA-oxo-05 SSUHa előprotein nos
pRPA-oxo-06 SSUHa érett nos
3. Példa
Transzgénes repce előállítása
a. Transzformálás
Minden vektort, az előzőekben leirt módon, beviszünk a pTVK 291 kozmidot (Komari és munkatársai, 1986) hordozó nem-onkogén Agrobacterium tumefaciens EHA 101 törzsbe (Hood és munkatársai, 1987).
A Westar változatú repce transzformálására szolgáló módszer lényegében a Boulter és munkatársai (1990) által leírtakon alapszik, 2,5 x 109/ml (OD 600 nm = 1) baktériumkoncentráció alkalmazásával.
- 12 b. Regenerá1 á s
A regenerálási eljárás lényegében a Boulter és munkatársai (1990) által leírtakon alapszik. A növényeket De Block és munkatársai (1989) szerinti közegben gyökereztetjük, majd melegházban virágzó állapotig neveljük.
4. Példa
Repce Sclerotinia sclerotiorum iránti rezisztenciájának mérése
In vitro:
- Levél-lemezeken: a rezisztencia mérésére három levéllemez tömegének azt követő mérése szolgál, hogy ezeket 11 napon át hormonokat tartalmazó, 1 mmól/1 oxálsawal kiegészített Murashige és Skoog (MS) tápközegen tenyésztjük.
Ilyen körülmények mellett azt figyeltük meg, hogy a pRPAoxo-03, pRPA-oxo-04, pRPA-oxo-05 és pRPA-oxo-06 kiméra gének valamelyikével módosított repce alkalmazásakor a levél-lemez tömege lényegesen növekszik, míg módosítatlan repcéből származó levél-lemezek tömege stagnál vagy éppen csökken.
- Gyökér megnyúlás: a rezisztenciát a gyökér megnyúlásával in vitro is mérjük 2 napon át 5 mmól/1 oxálsawal kiegészített vízben való tenyésztést követően. Megfigyelésünk szerint ebben az esetben a pRPA-oxo-03 és pRPA-oxo-04 kiméra gének valamelyikével módosított repce növény gyökerei növekedésre képesek, hosszúságuk nő, míg a módosítatlan repce gyökerei ilyen körülmények mellett nem növekednek.
In vivő:
Az in vivő rezisztenciát melegházban vizsgáljuk a regene·· »
- 13 rálódás után, az első virágok megjelenése állapotában lévő repce növények befertőzésével, amelyet úgy végzünk, hogy vagy S. sclerotiorum spórákat viszünk a szirmokra, a levelek fertőződése ezáltal természetes módon, a virágok elhullásával következik be, vagy micéliumot vagy micéliummal átitatott virágszirmokat közvetlenül ráhelyezünk a levelekre. A pRPA-oxo-03, pRPA-oxo-04, pRPA-oxo-05 és pRPA-oxo-06 kiméra gének valamelyikével módosított növények ellenállnak a gomba kifejlődésének, nem mutatnak semmiféle rothadási tünetet, amely a sclerotiniózisra jellemző, míg a módosítatlan növények a Sclerotinia sclerotiorum kifejlődésére jellemző gyors rothadást mutatnak.
A mellékelt ábrán a négy kiméra gén előállítási eljárását mutatjuk be a két kódoló génből, pRPA-oxo-01 és pRPA-oxo-02H, Hind III; B, BstN; N, Nhe I; E, Eco Rí; Se, Sac I; S, Sál I és X, Xba I.

Claims (8)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Oxalát-oxidázt kódoló DNS szekvencia, amely alkalmas növények Sclerotinia sp. által okozott megbetegedései elleni rezisztencia létrehozására.
  2. 2. Egy oxalát-oxidáz fehérje, amely növények Sclerotinia sp. okozta betegségei elleni rezisztencia létrehozására használható.
  3. 3. Kiméra gén, amely kódoló szekvenciaként egy az 1. igénypont szerinti DNS szekvenciát tartalmaz.
  4. 4. Vektor növények transzformálására, amely a 3. igénypont szerinti kiméra gént tartalmazza.
  5. 5. Transzformált növényi sejt, amely a 4. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
  6. 6. Transzformált növény, amelyet az 5. igénypont szerinti sejtből nyerünk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a növény kétszikű.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a növény repce.
HU9203473A 1991-03-05 1992-03-04 Production of plants resistant to attacks of sclerotinia sclerotiorum HUT65677A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9102874A FR2673644A1 (fr) 1991-03-05 1991-03-05 Sequence adn codant pour une oxalate oxydase et plantes transformees contenant cette sequence et resistantes au sclerotinia.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9203473D0 HU9203473D0 (en) 1993-01-28
HUT65677A true HUT65677A (en) 1994-07-28

Family

ID=9410559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9203473A HUT65677A (en) 1991-03-05 1992-03-04 Production of plants resistant to attacks of sclerotinia sclerotiorum

Country Status (24)

Country Link
EP (1) EP0531498B1 (hu)
JP (1) JPH05506582A (hu)
KR (1) KR930700665A (hu)
CN (1) CN1051576C (hu)
AT (1) ATE338129T1 (hu)
AU (1) AU660976B2 (hu)
BG (1) BG61275B1 (hu)
BR (1) BR9204788A (hu)
CA (1) CA2082042C (hu)
CZ (1) CZ289623B6 (hu)
DE (1) DE69233653T2 (hu)
DK (1) DK0531498T3 (hu)
EG (1) EG21465A (hu)
ES (1) ES2273329T3 (hu)
FR (1) FR2673644A1 (hu)
HU (1) HUT65677A (hu)
IE (1) IE920691A1 (hu)
IL (1) IL101117A (hu)
MX (1) MX9200917A (hu)
NZ (1) NZ241829A (hu)
PT (1) PT100203B (hu)
UA (1) UA43308C2 (hu)
WO (1) WO1992015685A1 (hu)
ZA (1) ZA921647B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2152225T3 (es) * 1991-02-25 2001-02-01 Zeneca Ltd Uso de un gen que codifica oxalato-oxidasa para la transformacion de plantas.
RO112764B1 (ro) * 1992-11-30 1997-12-30 Zeneca Ltd Secventa adn ce codifica oxalat decarboxilaza
ES2180567T3 (es) * 1992-12-07 2003-02-16 Biogemma Fr Utilizacion de una secuencia de adn codante para una proteina susceptible de degradar el acido oxalico a titulo de gen de seleccion.
AUPM379294A0 (en) * 1994-02-10 1994-03-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
ZA986308B (en) * 1997-07-18 1999-11-24 Pioneer Hi Bred Int The induction of stress-related factors in plants.
US6166291A (en) 1997-07-18 2000-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of pathogen resistant plants
WO1999010514A1 (en) * 1997-08-26 1999-03-04 North Carolina State University Fumonosin resistance
FR2844142B1 (fr) 2002-09-11 2007-08-17 Bayer Cropscience Sa Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree
FR2848570B1 (fr) 2002-12-12 2005-04-01 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant
CN100383239C (zh) * 2004-07-21 2008-04-23 华南农业大学 从小麦麸皮中提取草酸氧化酶的方法
AR074941A1 (es) 2009-01-07 2011-02-23 Bayer Cropscience Sa Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion
MX2012007681A (es) 2009-12-31 2013-01-29 Pioneer Hi Bred Int Ingenieria de resistencia de plantas a enfermedades causadas por patogenos.
CN103060350A (zh) * 2011-10-21 2013-04-24 华中农业大学 核盘菌草酸脱羧酶基因SsOXDC2及其在大豆抗病改良中的应用
CN103911384B (zh) * 2014-01-21 2016-05-25 江苏大学 一种控制油菜菌核病的基因及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988008450A1 (en) * 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
ES2152225T3 (es) * 1991-02-25 2001-02-01 Zeneca Ltd Uso de un gen que codifica oxalato-oxidasa para la transformacion de plantas.

Also Published As

Publication number Publication date
FR2673644B1 (hu) 1994-12-02
ATE338129T1 (de) 2006-09-15
JPH05506582A (ja) 1993-09-30
CA2082042C (en) 2007-05-29
PT100203B (pt) 1999-06-30
KR930700665A (ko) 1993-03-15
CZ336992A3 (en) 1994-01-19
EG21465A (en) 2001-11-28
NZ241829A (en) 1994-04-27
ES2273329T3 (es) 2007-05-01
HU9203473D0 (en) 1993-01-28
IL101117A0 (en) 1992-11-15
EP0531498B1 (fr) 2006-08-30
CZ289623B6 (cs) 2002-03-13
FR2673644A1 (fr) 1992-09-11
AU660976B2 (en) 1995-07-13
BR9204788A (pt) 1993-07-27
IE920691A1 (en) 1992-09-09
DE69233653T2 (de) 2007-10-04
ZA921647B (en) 1992-11-25
CN1051576C (zh) 2000-04-19
WO1992015685A1 (fr) 1992-09-17
PT100203A (pt) 1993-07-30
DK0531498T3 (da) 2007-01-02
DE69233653D1 (de) 2006-10-12
UA43308C2 (uk) 2001-12-17
CA2082042A1 (en) 1992-09-06
MX9200917A (es) 1992-11-01
AU1682092A (en) 1992-10-06
CN1065683A (zh) 1992-10-28
EP0531498A1 (fr) 1993-03-17
BG61275B1 (en) 1997-04-30
IL101117A (en) 2004-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Comai et al. Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate
BG100619A (bg) Метод за контролиране на патогени по растенията
US5866778A (en) Newly characterized oxalate and uses therefor
HUT65677A (en) Production of plants resistant to attacks of sclerotinia sclerotiorum
US20100269225A1 (en) Tissue specific promoters
HU219268B (en) Transgenic organism resistante to fungi
EP0270248B1 (en) DNA useful for the transport of foreign proteins to the plant cell wall
CN102884195B (zh) 调节植物中ω酰胺酶表达以增加植物生长
AU677976B2 (en) Oxalate decarboxylase
WO1993006711A1 (en) Tomato acid invertase gene
HUT58758A (en) New signalsequencies
US6229065B1 (en) Production of plants resistant to attacks by Sclerotinia sclerotiorum by the introduction of a gene encoding an oxalate oxidase
CA2051240A1 (en) Histidinol dehydrogenase protein, dna and muteins and transgenic plants thereof
US7557264B2 (en) Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use
Araki et al. Ethylene formation and phenotypic analysis of transgenic tobacco plants expressing a bacterial ethylene-forming enzyme
KR20040003855A (ko) 고추 한별 품종 (Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ.ｃｖ. Ｈａｎｂｙｕｌ)으로부터 유래한리피드트랜스퍼단백질 ＣＡＬＴＰ Ⅰ·ＣＡＬＴＰⅡ·ＣＡＬＴＰⅢ을 코딩하는 유전자 및 마커로서의 활용
AU769546B2 (en) Method for obtaining transgenic plants expressing a protein with activity producing hydrogen peroxide by transformation by Agrobacterium rhizogenes
KR940001266B1 (ko) 내빙 단백질이 발현되는 식물체의 제조방법
Cescon Identification and Initial Characterization of Carbonic Anhydrase Deletion Mutants of Arabidopsis

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal