BG100619A - Метод за контролиране на патогени по растенията - Google Patents

Метод за контролиране на патогени по растенията Download PDF

Info

Publication number
BG100619A
BG100619A BG100619A BG10061996A BG100619A BG 100619 A BG100619 A BG 100619A BG 100619 A BG100619 A BG 100619A BG 10061996 A BG10061996 A BG 10061996A BG 100619 A BG100619 A BG 100619A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
plant
ala
gly
promoter
sequence
Prior art date
Application number
BG100619A
Other languages
English (en)
Other versions
BG61548B1 (en
Inventor
Ellen Lawrence
Elaine Levine
Dilipkumar Shah
Original Assignee
Monsanto Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Company filed Critical Monsanto Company
Publication of BG100619A publication Critical patent/BG100619A/bg
Publication of BG61548B1 publication Critical patent/BG61548B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Abstract

1. Рекомбинантна двойноусукана DNA-молекула, съдържаща в оперативна последователност: а) промотор, предизвикващ получаването на RNA-последователност,в растителните клетки; б) структурно кодирана последователност, чиито кодове произвеждат Aspergillus glucose oxidase; в) 3' нетрансформиран регион, предизвикващ добавянето на полиаденилатни нуклеотиди към 3' края на RNA-последователността в растителните клетки.

Description

(54) МЕТОД ЗА КОНТРОЛИРАНЕ НА ПАТОГЕНИ ПО РАСТЕНИЯТА (57) 1. Рекомбинантна двойноусукана DNA-молекула, съдържаща в оперативна последователност: а) промотор, предизвикващ получаването на RNAпоследователност, в растителните клетки; б) структурно кодирана поел едователност, чиито кодове произвеждат Aspergillus glucose oxidase; в) 3' нетрансформиран регион, предизвикващ добавянето на полиаденилатни нуклеотиди към 3' края на RNA-последователността в растителн ите клетки.
претенции 14 претенции , 0
Метод за контролиране на патогени по растенията
Област на изобретението
Изобретението се отнася до метод за контролиране на патогени по растенията чрез протеин, който се получава чрез генетична модификация на растението за да се получи протеин и до гени и растения, които се използват при този метод.
Предшестващо ниво на изобретението
Добре известно е, че ензимното действие на глюкозната оксидаза е антибактериалйо. В присъствието на кислород, глюкозната оксидаза катализира окислението на глюкоза до — глюконолактон и водороден прекис. Антибактериалният начин на действие се дължи както на окислителния потенциал на водородния прекис, така и на присъствието на — глюконолактон, който е известен гликозитрансферазен
инхибитор.
Антибактериалния ефект на продуктите на този ензим води до неговото широко използване в хранителната промишленост, където се счита за GRAS съединение (общопризнато като безвредно). Също така глюкозната оксидаза се използва за предпазване от бактериално увреждане на приготвени храни. В медицината се използва, като ензимен бактерицид - част от препарат, използван при превързочните материали за рани, при заболявания на зъбите, зъбен кариес, малки четки за зъби. Глюкозната оксидаза също се споменава като метод за контрол на зъбен кариес. Най-новите публикации показват, че глюкозната оксидаза е включена, като част от механизъм за биоконтрол, използван от Penicillium dangearii за контрол на патогенни фунги Verticillium dahliae по растенията [Kim et al., 1988, 1990].
Обаче, използването на глюкозната оксидаза като средство за самозащита на растенията от патогенни организми, се счита, че има малка способност, дължаща се на естеството на ензимното действие. Първо, свободното количество глюкоза в растенията е малко. Изглежда ензимът е в недостатъчно количество, за да произведе достатъчно водороден прекис й/или —глюконолактон за да се преодолее патогенна атака. Второ, присъствието на такъв ензим в растителна клетка, консумираща глюкоза и произвеждаща дори малко количество водороден прекис, би трябвало да се очаква да бъде определящо за оцеляването на клетката. Транегенни растения, експресиращи глюкозна оксидаза, не би трябвало да се очаква да се развиват нормално, също както и регенерирали растения или растения от последователни генерации.
Предметът на настоящето изобретение осигурява глюкозна оксидаза, която може да бъде безопасно експресирана в растителни клетки, осигурявайки устойчивост спрямо заболяване на тези клетки. По-нататъшна цел на настоящето изобретение е да осигури метод за преобразуване на растение, така че то да експресира глюкозна оксидаза, която безопасно да може да бъде експресирана в растения и да осигури устойчивост на тези растения спрямо заболяване.
Същност на изобретението
Изненадващо беше установено, че генът за глюкозна оксидаза от Aspergillus niger може да бъде използван за трансформиране на растения, които са нормални в развитието си и устойчиви на патогенна атака. Следователно, цел на настоящето изобретение е да осигури генетични конструкции, съдържащи ген за Aspergillus glucose oxidise (AGO), използван за включване в растителни клетки. Друга цел на настоящето изобретение е да осигури транформирани, патогеноустойчиви растения, съдържащи такъв генетичен материал.
В допълнение, растенията също могат да бъдат трансформирани, така че да ко-експресират други протеини против фунги или инсектицидни протеини, например като се използват Bacillus thuringiensis (B.t.) гени. Примери на
трансформирани растения за експресиране на B.t. гени са описани в Европейско Патентно Описание N 385962, което отговаря на U.S. Serial Number 07/476,661, заявен на 12.02.1990 г. [Fischhoff et al.], който е вмъкнат тук чрез цитирането му. B.t. ген може да бъде инкорпориран в растение, съгласно настоящето изобретение, чрез едновременно трансформиране, чрез последователно трансформиране или чрез размножаване.
Съгласно аспект на настоящето изобретение, се осигурява рекомбинантна двойно-усукана молекула DNA, съдържаща в оперативна последователност:
а) промотор, чиито функции в растителните клетки са да предизвиква получаването на RNA - последователност; и
б) структурно-кодирана последователност, чиито кодове произвеждат Aspergillus glucose oxidise;
в) 3' нетрансформиран регион, чиито функции в растителните клетки са да предизвика добавянето на полиаденилатни нуклеотиди към 3' края на RNA последователността.
4Съгласно друг аспект на настоящето изобретение, се осигурява метод за получаване на генетично трансформирани растения, които екпресират антипатогенно количество AGO, състоящ се от етапите:
а) вкарване в генома на растителна клетка, рекомбинантна двойно-усукана - DNA молекула, включваща (i) промотор, чиито функции в растителните клетки са да предизвиква получаването на RNA последователност; и
(ii) структурно-кодираща последователност, чиито кодове произвеждат AGO;
(iii) 3' нетрансформиран регион, чиито функции в
растителните клетки са да предизвика добавянето на полиаденилови нуклеотиди към 3' края на RNAпоследователността;
б) получаване на трансформирани растителни клетки;
в) регенериране от трансформираните растителни клетки на генетично трансформирани растения, които експресират инхибиторно количество AGO.
Също се осигуряват, в съответствие с друг аспект на настоящето изобретение, трансформирани растения, които съдържат DNA, включваща гореспоменатите елементи (i), (ii) и (ίϋ)·
Тук, терминът ’'Aspergillus glucose oxidase” или AGO, се използва за да означи естествена глюкозна оксидаза, получена от Aspergillus sp. или имаща хомоложност - 80%, за предпочитане - 90%, спрямо такъв ензим, като например ензима, кодиран чрез SEQ ID N0:1.
Тук, терминът контрол на микробиологичното увреждане или патогенна резистентност е използван за да се отбележи причината за намаляването на увреждането в посева, причинено от бактериална или фунго-патогенна инфекция.
Тук, терминът ’’структурно-кодираща последователност означава - DNA - последователност, която кодира полипептид, който може да бъде направен от клетка, като се следва транскрипцията на DNA към mRNA, последвана от довеждане до желания полипептид.
Тук, терминът място на растението означава областта, непосредствено обграждаща растението и включваща растението и неговата коренова зона.
Подробно описание на изобретението
Един вариант на настоящето изобретение включва изолиране на протеин от Asprgillus niger. Този протеин, обозначен AGO, беше пречистен до хомогенизат. Той подтиска растежа на агрономически важни фунгопотогени, включително Varticillium dahliae, един от най-разпространените и увреждащи растенията патогени, причиняващи заболяване при повечето растения, Phitophthora infestans (Pi), патоген причиняващ късна главня заболяване при картофите и доматите, Botrytis cinerea (Be), източника на сива плесен по различни плодове и зеленчуци, Septoria nodorum (Sn), агент причиняващ петна по покривната люспа на пшеницата, Pseudocercosporella herpotrichoides (Ph), агент причиняващ пигментови петна по пшеницата, Gaeumannomyces graminis var tritici (Ggt), агент причиняващ общо заболяване по житните култури, в толкова малко количество като 50 ng, при експериментални условия. Беше установено също, че той подтиска Erwinia carotovora, агент причиняващ меко гниене по картофите, заболяване след прибиране на реколтата om картофи. Очаква се, че е способен да контролира много други патогенни организми по растенията, въз основа на продуктите на неговата ензимна активност, —глюконолактон и водороден прекис. Всеки от тези вторични продукти е токсичен за такива организми.
Много видове растения могат да бъдат защитени, чрез методите на настоящето изобретение. Например, монго плодове и зеленчуци, такива като ягоди, картофи и домати, могат да бъдат защитени от патогени по растенията
посредством настоящите методи. Различни видове Phitophthora са патогенични за много други растения, като плодни дървета и тревни площи, и така тези растения могат също да бъдат защитени с методите на настоящето изобретение. Още повече пшеница и ечемик могат да бъдат защитени от Ggt, Sn и Ph с настоящия метод.
Както е отбелязано по-горе, антимикробните протеини от настоящето изобретение могат да бъдат използвани в комбинация с други протеини против фунги, така че да се осигури широк спектър на действие, т.е. контрол на допълнителни патогени и/или да осигури много начини на действие за инхибирането на същия фунгопатоген. Източници на други такива протеини, против фунги, могат да бъдат микробни, такива като протеините от настоящето изобретение или могат да бъдат растения. Много такива гени против фунги са описани в литературата.
Въпреки, че AGO ще въздейства за защита на растенията от патогенна атака в присъствие на естествено, срещащи се нива на глюкоза, може да бъде желателно да се осигури инвертаза, която ще причини хидролиза на сукроза, така че да се освободи допълнително глюкоза, върху която да въздейства
AGO. ИнВертазата ще бъде за предпочитане инвертаза на клетъчната стена, такава като от мая (ЕР 0 442 592 Willmitzer et al., 1991, also AU 70898/91) или вакуоларен ензим, такъв като от домати или други растения. В тези два случая могат да бъдат използвани природни сигнални последователности; обаче, може би е за предпочитане инвертазата да бъде отделена докато е необходимо в извънклетъчното пространство, или да не се получава ако е необходимо. Първата алтернатива може да бъде реализирана чрез използването на сигнална последователност, която ще насочва ензима към извънклетъчното пространство. Един такъв сигнал е картофения протеазен инхибиторен сигнал (Keil et al., 1986; Nelson et al., 1980). Промотора, който е единствено активен, като резултат от патогенната инфекция би бил полезен при ограничаване на експресията на инвертазата докато е необходимо за да се получи глюкоза, като субстрат за AGO.
По време на съхранение, когато инфекцията от Erwinia може да причини загуби на целия склад, картофените грудки естествено съдържат глюкоза от разлагането на нишесте. Следователно, включването на ген за инвертаза не е желателно или необходимо за защита от меко гниене.
Биоефективни опити in vitro
Προ ти во гъбни опити
Глюкозна оксидаза от Aspergillus niger може да бъде получена от Sigma Chemical Co. (St.Louis. Cat.# G-7141). Тя беше използана за изследвания in vitro активността срещу няколко организми.
Тестовете срещу Pi u Вс се осъществяват в среда #303, получена както следва: 1 литър съдържа lg MgSO47H2O; 2g КН2РО4; 0.5 g NaCl; lg СаСОз; 1ml ZnSO47H2O наличност lmg/ml; 1ml FeSO47H2O наличност - lmg/ml; 0.5 ml FeEDTA наличност - 100 mM; 20 g Maltrin M - 100; 20 g Casein; 5 g Yeast Extract; 5 g Glucose; 3.02 g Pipes 10 mM; pH се довежда до 6.5 и филтърно се стерилизира. Тестове срещу Ggt се осъществяват в полу-усукана PDA (Difco). Тестове срещу Ph се осъществяват в CDAA. 1% среда се пригатвя както следва: 35 g/1 Difko Czapek Dox Broth, 1 g/1 Proline, 500 mg/1 Asparagine, 500mg/l Cysteineq lg/1 Agar се поставя в автоклав за 23 минути и се добавят филтърно стерилизирани витамини (lppm Tiamine и lppm Biotin).
Be и Pi се тестват в течна среда в плата с 96 легла. Вс се използва при 5х102 спори за легло и се инкубира при 20— С за 24 48 часа. Pi се посява при 5х103 спорангии за легло и се инкубира при 18— С за 24 - 48 часа. Оценката на израстването се извършва посредством измерване на OD при 595 пт. Израстването на Pi е 90% е инхибирано при концентрации ниски като ЗхЮ 5 Ш/~ 1. Израстването на Вс е 95% е инхибирано при 0.001 Ш/- 1.
Активността срещу Gaeumannomyces се оценява върху твърди агарови плата. Приблизително агарова площ от 0.5 cm2 за подпомагане израстването на тежки фунги се поставя в центъра на плата с полу-усукана PDA , които се оставят да израстнат за няколко дни при 22 — С.
* Наличното стерилно AGO се добавя директно към леглата. Във видимата зона на инхибиране се отличава с ниски количества, като 0.02 IU/легло.
Тестове срещу Ph се провеждат в плата с 96 легла. Използва се 14-дневна култура Pseudocercosporella herpotrichoides var. tritici върху воден агар, за да се направи споровата суспензия.
Пластината се залива с 5-10 ml CDAA. 1% среда и спори се смесват В течната среда посредством внимателно разбъркване. Концентрираната спорова суспензия се изтегля с пипета и се добавя към общия обем CDAA, необходим за теста, като концентрацията на спори се довежда до 100 000 cnopu/ml. Експерименталното инкубиране е на тъмно при 24— С.
Споровата концентрация се разпределя по 50 - 1/ легло в микротитърно плато с 96 легла. След това тези плата се поставят в инкубатор (10 часа/ дневна светлина при 12— С) за 24 часа преди приложението на пробата. 50- 1 от пробата се добавят към 50- 1 инокулум (приготвен 24 часа по-рано), като се получава общ обем от 100 - 1/работно легло/повторно третирано. Експерименталните плата се инкубират 48 часа и резултатите се определят чрез отчитане на оптичната гъстота (OD) с Bio Rad микротитърно плато, модел за отчитане 3550, при единична държина на вълната 595 пт. Прави се отчитане на OD в начален момент (to), който се избира непосредствено след употреба на пробата, отчита се и OD 48 часа след употреба на пробата (tie). Оценката на растежа на фунгите се определя чрез разликата на отчетените OD между to и t4s , увеличена с изчислената стойност на биомасата на фунгите. (Изчислената стойност на биомасата на фунгите е съотношението между растежа на фунгите и оптичната гъстота и се определя в отделни експерименти. Съотношението между растежа на фунгите и оптичната гъстота и се определя чрез израстване на фунги в плата с 96 легла, като мицела се събира извънредно, на абсорбционни интервали от приблизително 0.1 OD. Изчислената стойност се получава от линейното съотношение между биомасата на фунгите и OD за специфичните фунги. Това е стойността на наклона, получена от линейното съотношение. Изчислената стойност за Ph е 4.91.) След това се определя процента на инхибиране от разликата между биомасата на третираните и биомасата на контролите. AGO дава 60% инхибиране на Ph при 1.7хЮ-4Ш/- 1.
Тестовете срещу Sn се провеждат в основата си като тези срещу Ph , с изключение приготвянето на споровата суспензия. Използват се 7-дневна спорообразуваща култура Septoria nodorum върху УМА агар, за да се направи споровата суспензия. Малки количества (<1т1) от CDAA среда се капват върху културата с розова спорова маса, от пикнидия Спорите се смесват със CDAA средата чрез последователното им всмукване и изсмукване с пипета. Концентрираната суспензия се добавя към общия обем CDAA, необходим за теста, като концентрацията на спорите се довежда до 50 000 cnopu/ml. Изчислената стойност за Sn е 0.508. AGO дава 60% инхибиране на Sn при 1.7xlO-4IU/-- 1.
Бактериален опит
Култури на бактерията Erwina carotovora се поддържат чрез поставяне в редици върху PDA плата и се инкубират при 24 - С на тъмно. За да се приготви бульон от инокулум, клуп от активно израстваща бактерия (5-9-дневна) се добавя към 50 ml от 1/4 засилен PD бульон в 125т1 колба на Erlenmeyer. Колбата се поставя В разклащащ инкубатор (130 грт) при 24 - С на тъмно. След 24 часа, бактериите се пелетизират, ресуспендират в стерилизирана дейонизирана вода и три или четири алеквотни части от по 100 -- 1 се поставят за отчитане в леглата на плато с 96 легла. Микроплатото за отчитане е установено на 595 пт и е определена средната оптична гъстота на леглата. Това абсорбционно число (ABS = onmu4Ha гъстота) се използва в следната формула за изчисляване на частите на образуваната колония (CFUs), съдържаща се в бульона.
CFU = (ЗхЮ6) + [(3xlO8)xABS] + [(5х108) ABS2]
Бульонът се довежда за използване go 105 CFU.
AGO изцяло контролира израстването на Е. carotovora при ниски концентрации, като 3xlO'5IU/- 1.
Идентифициране на ензима
Могат да бъдат изобретени множество методи за да се установи получаването на протеин в хетерологична система като растителните клетки. Западни методи за откриване на петна могат да бъдат използвани за имунологично откриване на протеин, и ензимни или биологични опити могат да бъдат използвани за да се определи активността на протеина.
Ензимен опит с глюкозна оксидаза
За да се установи активността на GO се използва модифициране на непрекъснатия спектрофотометричен опит (Frederick et al., 1990). За положителен контрол се използва Aspergillus niger GO (Sigma). Реакционната смес се състои от 20 — g/ml хрянова пероксидаза (Sigma), 0.32 тМ Triton Х-100стабилизиран орто-дианисидинов разтвор (Sigma), и 0.1 М глюкоза в 75 тМ натриевофосфатен бувер (pH 5.0). Към него се добавят 100 — 1 от различни концентрации на A. niger GO за контролните реакции или 100 - 1 от пробата, извлечена от хетерологичен източник. Опитът се провежда при стайна температура, като се наблюдава нарастване при абсорбцията при 460 пт.
Алтернативен опит за глюкозна оксидаза, с използване на реагента 4-амино-антипирин (4-ААР) се оптимизира за да се използва за алкилиране no Gallo, 1981. Реагентът 5Х 4-ААР се приготвя при общо обем 10 ml с 0.68g КН2РО4, 8.3mg 4-ААР (0.82 тМ), 25- 1 Triton Х-100, 0.0658g кристален фенол и 1000 U хрянова пероксидаза, с pH доведено до 5.0 с КОН. Опитът се провежда чрез смесване на 200 - 1 от този 4-ААР реагент, 5 — 1 1 тМ FAD, 50 - 1 1М глюкоза; и тестваната проба (до 750 - 1 ).
Резултатът се отчита при OD 508.
Опит за биологичната активност на глюкозна оксидаза
Изолирани 4-6-дневни Ggt фунги се прехвърлят върху агарови (Difko) плата със свежа 1/4 усукана картофена декстроза. Фунгите израстват при 22- С за четири дни или докато кръгът на израстване стане около 2.5 ст. Използвайки стерилен корков свредел, леглата се правят в агар на 1 ст извън кръга на израстване и 100 - 1 буфер или проба, получена от хетероложен източник се поставя в леглата. Фунгите израстват за 24 часа при стайна температура и се изпитват за инхибиране на растеж.
Имунологично откриване на глюкозна оксидаза
Поликлонални антитела за глюкозна оксидаза, получени от Aspergillus niger са търговски достъпни от много източници, например Rockland Inc., Gilbertsville, Pennsylvania.
Генетично трансформиране
Клониране на AGO ген
Общата DNA се изолира от Aspergilus niger (ATCC 9029) и се използва като модел за PCR изолиране на глюкозооксидазен ген. PCR праймерите се основават на вече публикувана последователност на гена (Frederick et al;Kriechbaum et al.) u ca конструирани за да изолират цялата последователност на гена, включваща сигналната последователност. В допълнение, за да се улесни инкорпорирането на този ген във вектори, подходящи за експресия в хетероложни бактерии, пръчковиден вирус или растителни системи, 5’PRC праймер (SEQ ID N0:3) въвежда Xbal и Bglll рестрикционни ендонуклеазни сайтове отгоре в началото ATG на преобразуване на гена. 3'PRC праймер (SEQ ID N0:4) въвежда BamHI Kpnl рестрикционни ендонуклеазни сайтове, непосредствено след ограничителния кодон. Полученият PCR фрагмент се клонира в pUC118 като Xbal/Kpnl фрагмент за да се създаде pMON22514 и последователността се изгражда изцяло. Последователността (SEQ ID N0:1) точно отговаря на публикуваната последователност. SEQ ID N0:2 е съответната аминокиселинна последователност.
Конструкция на растителен ген
Експресията на растителен ген, който съществува в двойно-усукана форма на DNA, включва транскрипция на пратеник RNA (mRNA) от една усукана DNA чрез RNA полимеразен ензим, и последователното обработване на mRNA, предварително транскрибирана вътре в ядрата. Обработването включва 3' непреобразуван регион, който прибавя полиаденелатни нуклеутиди към 3' края на RNA. Транскрибирането на DNA в mRNA се регулира чрез регион на DNA, обикновено отбелязан като промотор. Региона на промотора съдържа последователност от основи, която сигнализира RNA полимераза за присъединяване към DNA и за предизвикване на транскрипцията на mRNA , използвайки едно от усукванията на DNA, като модел за да се направи съответно усукване на RNA.
Множество промотори, които са активни в растителни клетки са описани в литературата. Те включват nopaline synthase (NOS) и octopine synthase (OCS) промотори (които са донесени върху предизвикващи тумор плазмиди на Agrobacterium tumefaciens), мозаечен вирус по карфиола (CaMV)19S и 35S промотори, мозаечен вирус на Figwort (FMV)35S промотор, и леко-индуциращият се промотор от малката нуклонова група в ядрото на рибулоза 1,5-бис-фосфат карбоксилаза (ssRUBISCO, много богат растителен полипептид). Всички тези промотори се използват за създаването на различни типове DNA конструкции, които се експресират в растения. U.S.Patent Number 5,034,322 (Fraley et al.,1991), включен тук чрез цитиране, разкрива подобна употреба. Съществуват известни промотори, които ограничават експресията към някои части на растенията или съответно към частично стимулиране. Например, специфични промотори на картофена грудка, такива като пататинови промотори, или промотори за големи или малки нуклонови групи в ядрата на ADP глюкозо пирофосфорилаза, могат да се използват за да се получи първична експресия в грудката и след това в комбинация с AGO, за да се осигури устойчивост към атаките върху грудката, такава като от Erwinia. Плодово-специфичен промотор е желателен за да предаде устойчивост на ягодите или гроздето спрямо Botrytis. Коренов специфичен промотор е желателен за да се получи експресия на AGO в пшеница или ечемик за да осигури устойтчивост спрямо Ggt. В нивото на техниката са известни много такива специфични промотори за частите на растенията, които биха могли да се използват в настоящето изобретение.
Алтернативно, промотори, използвани в двойно-усукани DNA молекули, могат да бъдат избрани за да предадат специфична експресия на AGO в отговор на инфекция от фунги. Инфекцията на растения от патогени на фунги включва вкарването на широк спетър протеини, наречени защитносвързани или патогенетично - свързани (PR) протеини [Bowles; Bol et al.; Linthorst]. Такива защитно-свързани или PR гени могат да кодират ензими на фенилпропаноиден метаболизъм (такива като фенилаланинова амониева лиаза, шалконова синтаза, 4-комаратова соА лигаза, комариново-кисела 4хидроксилаза), протеини, които модифицират стените на растителната клетка (такива като хидроксипролин-обогатени гликопротеини, протеини обогатени с глицин, пероксидази), ензими ( такива като читинази и глюканази), които разграждат стената на клетката на фунгите, тауматин-подобни протеини, или протеини с вече известна функция. Защитно-свързани или PR гените се изолират и характеризират от множество растителни видове. Промоторите на тези гени могат да бъдат използвани за да се постигне експресията на AGO в трансгенетични растения, когато са предизвикани от патоген, по-специално патоген на фунги, такъв като Pi. Такива промотори могат да бъдат извлечени от защитно-свързани или PR гени, изолирани от самите картофи [Fritzemeier et al.; Cuypers et al.; Logemann et al.; Matton and Brisson; Taylor et al.; Matton et al.; Schroder et al.] За да се постави AGO гена под контрола на промотор, индуциран от инфекция с Р. infestants се предпочита промоторът, описан от Taylor et al., 1990.
Избраният специален промотор трябва да бъде способен да причини достатъчно експресия на ензима, кодиращ последователност за да се достигне до получаването на ефективно количество AGO.
Промоторите, използвани в DNA-конструкциите (т.е. химерични растителни гени) от настоящето изобретение могат да бъдат модифицирани, ако е необходимо, като се въздейства върху техните контролни характеристики. Например, CaMV 35S промоторът може да бъде сВързан с частта на ssRUBISCO гена, така че да подтиска експресията на ssRUBISCO в отсъствието на светлина, за да се създаде промотор, който е активен в дрожди, но не и в корени. Полученият химеричен промотор може да бъде използван както е описано тук. По такъв начин, за целите на това описание, фразата CaMV 35S промотора влючва варианти на CaMV 35S промотора, т.е. промотори, получени посредством свързване с опертивни региони, безпорядъчна или контролирана мутагенеза. По нататък, промоторите могат да бъдат променени за да съдържат многократно увеличени последователности, за да се подпомогне увеличаването на генната експресия. Примери за такива увеличени последователности са описани от Key et al.
Увеличеният CaMV 35S промотор може да бъде конструиран както следва. Частта на CaMV 35S промотора се удължава между позиция -343 и +9, като предварително се конструира в pUC13. [Odell et al.]. Този сегмент съдържа регион, идентифициран като много необходим за максимална експресия на CaMV 35S промотора. Той беше отрязан като Clal-Hinlll част, беше осъществено закръгляване завършващо с DNAполимераза I и уплътняване в HincII сайт на pUC18. Този горен регион на 35S промотора беше отрязан от този плазмит като Hindlll-EcoRV част (удължена от -343 до -90) и уплътнен в същия плазмид между Hindlll и PstI сайтове. Увеличения CaMV
35S промотор (по-нататък CaMV E35S) съдържа удвоени последователности между -343 и -90 [Key et al.].
Получената RNA чрез DNA конструкцията от настоящето изобретение също съдържа 5’ непреобразувана водеща последователност. Тази последователност може да бъде отцепена от промотора, избран да експресира гена, и може да бъде специфично модифицирана така че да усили преобразуването на mRNA. 5' - непреобразуваните региони могат също да бъдат получени от вирусни RNA, от подходящи еукариотски гени, или от синтетична генна последователност. Настоящето изобретение не е ограничено до конструкции в които непреобразувания регион е получен от 5' непреобразувана последователност, която придружава промоторната последователност. Разбира се, непреобразуваната водеща последователност може да бъде получена от несвързан промотор или кодираща последователност. Например, петуниев протеин 70 под въздействието на топлинен шок, съдържа такава водеща последователност. [Winter].
Както е отбелязано по-горе, 3' непреобразувания регион на химерните растителни гени от настоящето изобретение съдържа полиадинилиращ сигнал, чийто функции в растенията, причиняват добавянето на аденилови нуклеотиди към 3' края на RNA. Примери на предпочитани З’региони са (1) 3' транскрибирани непреобразувани региони, съдържащи полиаденилатен сигнал на Agrobacterium индуцираща тумор плазмидни гени (Ti), такива като нопалинов синтазен (NOS) ген и (2) растителни гени като соеви 7s натрупани протеинови гени и граховия ген ssRUBISCO Е9 [Ficshhoff, et al.].
Трансформация и експресия на растение
Химеричен растителен ген, съдъжащ структурна кодираща последователност, съгласно настоящето изобретение, може да бъде уплътнен до геном на растението по всеки подходящ метод. Подходящи вектори за трансформация на растение, включват такива, получени от Ti плазмид на Agrobacterium tumefaciens, както и такива описани например от Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) и ЕРО публикация 0 120 516
(Schilperoort et.al.). В допълнение към векторите за трансформация на растение, получени от Ti или корен индуциращи (Ri) плазмиди на Agrobacterium , могат да бъдат използвани алтернативни методи за уплътняване на DNA конструкциите от това изобретение в растителни клетки.
Такива методи могат да включват например, използването на липозоми, електропорообразуване, химикали, които увеличават свободно увеличаване на DNA нагоре, свободно доставяне на DNA посредством микропрожекторно бомбандиране, и трансформация използваща вируси или тичинков прашец.
Растения, които могат да бъдат защитени чрез настоящето изобретение, включват, но без ограничаване, картофи, домати, пшеница, царевица, ягоди, грозде, както и различни служещи за украса растения. Методи за регенерация на тъканна кулура и растение са известни за всички тези видове растения.
Преходна експресия на глюкозо - оксидаза в тютюневи растения
Особено полезен плазмиден касетъчен вектор за трансформация на двуплодни растения е pMON999. Експресионния касетъчен pMON999 съдържа CaMV E35S промотор и 3'край включващ полиаденилатни сигнали от NOS гена. ρΜΟΝ999 включва Bglll, Kpnl u EcoRI сайтове за уплътняване на кодиращи последователности и Notl-Notl сайтоВе атакуващи експресионната касета на гена на
растението.
Bglll/Kpnl частта на pMON22514, съдържаща AGO кодиращ регион беше уплътнена в pMON999 за да се получи pMON22515. pMON22515 беше елекропорирано в тютюневи протопласти. Експресията на глюкозната оксид аза чрез трансформирани тютюневи клетки беше потвърдена от Western blot анализ както и от ензимни опити.
Устойчива трансформация на двусемеделни
Shuttle вектор за AGO беше създаден чрез ексцизия на AGO кодиращ регион като BamHI/Bglll част от pMON22515. След това той беше поставен в pUC-основен вектор и полученият плазмид pMON22579, съдържа FMV промотор, AGO кодиращ регион и 3' край включващ полиаденилатни сигнали от NOS гена. Частта Notl/Notl от този вектор, съдържаща FMV промотора, AGO кодиращия регион и 3' края на NOS гена, включващ полиаденилатния сигнал се премества В Notl рестрикционен сайт на pMON17227 (WO 92/0449, Barry et al.) за да се получи крайния Ti вектор, pMON22587.
Както е описано по-горе AGO гена може също да бъде експресиран в специфични части на растението, чрез използване на тъканни специфични промотори. Patatin промотора се експресира главно в грудката на кортофите. Частта KpnI/Xbal съдържаща AGO кодиращия регион се отстранява от pMON22514 и се уплътнява в pUC-осноВен вектор съдържащ patatin 1.0 промотор (Bevan et.al. 1986) и 3'края включващ полиаденилатни сигнали от NOS гена за да се получи
pMON22516. Notl частта, на pMON22516 съдържаща patatin промотор, AGO кодиращ регион и 3' края на NOS гена, включващ полиаденилатен сигнал се премества в Notl рестрикционене сайт на pMON17227, което беше описано по-горе, за да се получи Ti плазмидния вектор pMON22517.
Тези вектори могат да бъдат въведени в безопасни Agrobacterium ABI и използвани за да трансформират картофи, домати или други ексрастения в тъканна култура. След подбора за канамицинова или глифосфатна устойчивост и растителна регенерация могат да бъдат възстановени всички растения, съдържащи ген AGO. Експресията на гена на глюкозната оксидаза може да бъде потвърдена чрез Western blot анализ, ензимен опит или биологичен опит.
Експресия на AGO чрез трансформирани картофени растения
Протеинът беше екстрахиран от грудките от картофените растения, които бяха трансформирани с Ti плазмиден вектор pMON22517 и бяха изследвани за присъствие на глюкозна оксидаза чрез Western blot анализ. Високи нива на глюкозно оксидазна експресия ляха открити в някои растения. Тези нива на експресия бяха потвърдени от ензимни опити, с използване на 4-амино-антипиринова система. Общото количество протеин беше екстрахирано от няколко грудки чрез надробяване в 25тМ фосфатен буфер рН7.0+ 5тМ EDTA+100 тМ КС1. Протеинът беше концентриран и промит с 12.5 тМ фосфатен буфер рН7.0.
Протеинът, екстрахиран от грудки експресиращи AGO се изследва срещу P.infestans в плато за анализ с 96 легла в 12.5 тМ фосфатен буфер pH 7.0. Резултатите са показани в табл. 1. При най-високото ниво на изследван протеин, 21.2 — g/— 1 Pi спорите остават увредени или израстват от спорите, на които няколкократно е бил спиран растежа за сревнение с Hollow вектор (pMON17227) или с буферни контролни растителни екстракти.
Табл. 1
Третиране_________________Фунгицидно инхибиране *
Буферен контрол0
Контрол на Hollow вектор2 ρΜΌΝ22517, линия 93 ρΜΟΝ22517, линия 303 * Скала: 0= няма инхибиране, 1=слабо инхибиране, 2 = умерено инхибиране, 3 = силно инхибиране.
Разлистени картофени растения се трансформират с Ti плазмиден вектор pMON22587 и се изследват за наличие на AGO последством ензимен анализ. Резуслатите са показани в табл.2. както по-горе, pMON17227 трансформирани картофени растения се използват като Hollow вектор контролни растения.
Табл.2
Експресия нивоа Глюкозно оксидазна активност8 Еквивалент къмс
Линия # (%) (U/10ngX10-4) (U/gFW)
Rus.Bur. 0 0 0
22587-2 0.075 72.2 7.22
22587-3 0.150 126.4 12.64
22587-4 0.007 6.0 0.6
22587-12 0.125 88.2 8.82
22587-31 0.350 140.4 14.04
22587-32 0.350 121.0 12.10
18.18
0.12
0.450
0.003
22587-33
22587-34
181.8
1.2 a HuBomo на експресия е отбелязано като процент на глюкозна оксидаза в общото количество екстрахиран листен протеин.
в Глюкозно оксидазната активност в листните екстракти се определля чрез анализ на ензимната активност и се изчислява като единици ензимна активност в общия протеин.
с Единицитие активност на глюкозна оксидаза на грам свежа листна тъкан (U/gFW) се изчисляват от активността в общия протеин чрез коефициент на превръщане 10 -- g общ протеин на грам свежа листна тъкан.
Разлистените картофени растения се трансформират е Ti плазмиден вектор pMON22587 и също се изследват за нива на Н2О2 чрез утаяване с титанов хлорид. В две разлистени линии бяха открити нива на Н2О2 два до четири пъти по-високи отколкото нивата на нетрансформираните контролни растения.
Картофи, устойчиви на заболяване
Грудки, експресиращи AGO се изследват срещу Erwinia carotovora чрез опит е парче от грудка. Грудки от 34 се трансформират е ρΜΟΝ22517 и се изследват за устойчивост срещу повреди при меко гниене. Линиите също се изследват за степените на експресия чрез Western blot анализ. Грудките се стерилизират повърхностно в съответствие метода на Yang et al. (1989). две или три грудки от линия се разрязват асептично на парчета е дебелина 7-10 тт, като се получават 6 до 12 парчета на линия. Парчетата се поставят върху овлажнена
стерилна филтърна хартия Whatman #1 в блюда на Петри. Центъра на Всяко парче се инокулира е 50,000 CFU бактерии в 10 — 1. Блюдата се държат при висока влажност на околната среда в продължение на три дни при 23- С. Оценките за заболяването включват измерване на дължината, радиуса и дълбочината на получените увреждания. Разредена мацерирана тъкан от увредените места се използва за да се определи крайния брой бактерии на увреждане. Резултатите от това определение са представени в табл.З. За линиите, които изглеждат най-добре защитени всички измерени параметри са по-добри от тези на Hollow вектора и буферните контролни грудки. Грудки, за които е открито, че експресират AGO при най-високи нива, като цяло имат най-ниско ниво бъктерии в увредените места.
Табл.З
Линия # Експресия8
Нива CFU X 109
Буферен контрол нула 16.76
Hollow Вектор нула 14.32
22517-10 нула 20.7
22517-24 нула 20.09
22517-13 нула 16.3
ф 22517-12 нула 19.26
22517-9 ниска 9.34
22517-28 ниска 13.56
22517-33 ниска 9.57
22517-14 ниска 8.22
22517-17 ниска 8.36
22517-19 ниска 9.37
22517-32 ниска 7.17
22517-20 ниска 7.4
22517-21 ниска 6.25
© 22517-34 ниска 4.44
22517-11 ниска 3.06
22517-8 ниска 1.5
22517-7 средна 12.88
22517-31 средна 12.06
22517-1 средна 7.54
22517-15 средна 6.7
22517-25 средна 12.25
22517-35 средна 6.81
22517-2 средна 3.52
22517-3 средна 1.26
22517-5 средна 1.4
22517-6 висока 15.74
22517-18 висока 2.675
22517-26 висока 4.55
22517-29 висока 4.35
22517-4 висока 4.2
22517-30 висока 3,92
22517-16 висока 1.12
22517-23 висока 2.67
22517-36 висока 0.855
a CFU = единици образуващи колония в Нива на експресия, определени чрез Western blot анализ. Листенца от растения, трансформирани с pMON22587 и експресиращи AGO се изследват за устойчивост спрямо Pi. Напълно експандирани лестенца (—20 cm2) се инокулират чрез добавяне на капчици от 10— 1 спорангиева суспензия Phitophtora infestans в центъра на неаксиалната листна повърхност. Инокулата е с гъстота ΙΟ5 106 спорангии, събрана от 2-3 седмични листа, съдържащи LB-V8 среда. Инокулираните листенца се държат Nunc-Bio опитни блюда (243x243x18 cm) при влага, осигурена от влажна филтърна хартия на дъното, и се инкубират в камера за израстване при около 19- С с 16часов фотопериод. Наблюдава се развитието на симптоми и инфектираните области върху листенцата се измерват чрез покриване на всяко листенце с прозрачна мрежа 5тт х 5тт. За всяка линия листенца се изчислява средната големина на инфектираната повърхност и стандартното отклонение.
Трансгенетичните линии експресиращи AGO показват значителен контрол върху симптомите, причиняващи Phitophtora infestans инфекция на листенцата. Резултатите от две линии са показани в табл.4. Симптомната редукция е 47 и 57% в сравнение с контроли (и нетрансформираните и Hollow вектор трансформанти).
Табл.4
Площ на инфекцияз{ст£)
Аиния N 3 dpib 4dpi 5dpi 6dpi
Russet Burbank 1.2 2.1 4.2 7.1
17227-1с 1.6 2.7 4.7 8.7
22587-3d 0.4 0.8 1.1 3.0
22587-12d 0.5 1.3 2.3 3.7
а Площ на инфекция, отбелязана като средната за 5 листенца.
b Дни след инокулиране.
с Контролна линия, трансформирана с единствен вектор, d Трансгенетични линии, експресиращи глюкозна оксидаза.
Стабилна трансформация на едносемеделни
За трансформиране на едносемеделни се конструира вектор с AGO и intron специално използван за увеличаване на честотата на получаване на трансформирани растения, които експресират желания протеин на високи нива. Използва се hsp 70 intron, описан в ЕР 602 123 (еквивалентен на US 08/181,364, Brown et.al., включен тук чрез цитиране). pMON19477, описан тук, се отрязва и частта 800 bp BgHI-BamHI съдържаща hsp 70 intron след това се клонира в изключителния Bglll сайт в pMON22515, превръщайки се в pMON22623.
pMON22623 се въвежда в пшенични клетки чрез микропрожекторно бомбардиране, като се използват известни методи (Vasil et.al.).
Когато трансформираните растения се възстановят, капацитета на тяхната фунгицидна устойчивост, особено спрямо Ggt, се оценява по известни методи.
Всички публикации и патенти, споменати в това описание, включени тук чрез цитиране, тъй като всяка от изложените индивидуални публикации или патенти е специфична и индивидуална би трябвало да бъде включена чрез цитиране.
От гореизложеното, може да се види, че това изобретение е добре приспособено за постигане на всички цели и предмети, поставени заедно с предимствата, които са очевидни и присъщи на изобретението.
Би трябвало да се разбере, че някои особености и субкомбинации, могат да бъдат използвани без да са свързани с други особености и субкомбинации. Това е очаквано и е в обхвата на претенциите.
Тъй като много възможни варианти могат да бъдат направени от това изобретение, без да се отклоняваме от неговия обхват, би трябвало да се разбира, че цялата материя тук и по-нататък или показана в приложените фигури се интерпретира илюстративно и в неограничен смисъл.
СПОМЕНАВАНИЯ
Barry, G.F., G. Kishore, and S.R. Padgette. Glyphosate Tolerant 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthases. PCT Appl. WO 92/04449, 1991.
Bevan, M. et al. Nature. 304:184, 1983.
Bevan, M. et al. Nucleic Acid Research. 14:4625,1986.
Bol, J. et al. Ann Rev of Phvtopathol.. 28:113-138, 1990.
Bowles, D. Ann Rev of Biochem.. 59:873-907, 1990.
Cuypers, B. et al. Mol Plant-Microbe Interactions. 1:157-160,1988. . Fischhoff, D.A. and Perlak, F.J. Synthetic plant genes and method for preparation. European Patent Application, Pubheation Number 0 385 962, 1990.
Frederick, K. et al. J, Biol. Chem.. 265:3793-3802.
Fritzemeier, K. et al. Plant Physiol. 85:34-41, 1987.
Gallo. Methods in Enzymology. 71:665-668,1981.
Herrera-Estrella, L. et al. Nature. 303:20-9, 1983.
Kay, R. et al., Science. 236:1299-1302, 1987.
Keil, M. et al. Nucleic Acids Res.. 14:5641 - 5650, 1986.
Klee, H. J. et al. Bio/Technology. 3:637-642, 1985.
Kim , K. et al. Phytopathology. 78:488-492, 1988.
Kim, K. et al. Can. J. Microbiol.. 36:199-205,1990.
Kriechbaum M. et al. FEBSLett., 255:63-66,1989.
*© Linthorst, H. J. M. Crit Rev Plant Sci. 10:123-150.
Logemann, J. et al. Plant Cell. 1:151-158,1989.
Matton, D. and Brisson, N. Mol Plant-Microbe Interactions. 2:325-331, 1989.
Matton, D. et al. Plant Mol Biol. 14:863-865, 1990.
Nelson, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:1975 - 1979, 1980.
Odell, J. et al., Nature. 313:810, 1985.
Schroder, M.et al. Plant J. 2:161-172,1992.
Taylor, J., et al. Molecular Plant-Microbe Interactions. 3:72-77,1990.
Vasil et al. Bio/Technology 11: 1153-1158, 1993.
Winter et al. Mol. Gen. Genet.. 221(2):315-19, 1988.
S9
Опис на последователности /1/ Обща информация:
/1 /Заявител:
/А/Иле: Monsanto Company /В/Улица: 800 North. Lindbergh. Boulevard /c/Град: St. Lous /D/Щат: Missouri /Е/Страна: United States of America /F/Пощенски код (ZIP),: 65198 /G/Телефон: /Й4/537-7286 /Η/Телефакс: /314/537-6047 /ii/Заглавие на изобретението: Метод за контролиране на патогени по растенията /iii/Брои на последователностите: 4 /iv /Форма за> компютърно четене:
/A/Тип среда: Дискета /В/Компютър: IBM PC съвместим / С/Операционна система: pc-dos/ms-dos
Ζθ/Програмен продукт: Patentin Release=I.o,Version=i.25/EP0/ / vi/Информация за приоритетна заявка:
/A/Номер на заявката: us 08/161041 /B/Дата на подаван е: 24.11.1993 /2/Информация за seq id N0:1:
/ i /Характеристики на последователността:
/ А/Дължина: 1848 основни двоики /B/Тип: Нуклеинова кис елина /С/Верижност: двойна /О/Топология: линейна / ϋ/Молекулен тип: dna /Геномна/ / ix/Характеристика:
/А/Ше/код: CDS /В/Място: 16. .1833 / xi / Описание на последователност: SEQ id N0:1 :
TCTAGAAGAT СТАТС ATG CAG ACT СТС CTT GTG AGC TCG CTT GTG GTC TCC51
Met Gin Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser 1510
CTC GCT GCG GCC CTG CCA CAC TAC ATC AGG AGC AAT GGC ATT GAA GCC
Leu Ala Ala Ala Leu Pro His Tyr lie Arg Ser Asn Gly lie Glu Ala
2025
AGC CTC CTG Ser Leu Leu 30 ACT GAT CCC AAG GAT GTC TCC GGC CGC ACG GTC GAC TAC 147
Thr Asp Pro Lys Asp 35 Vai Ser Gly Arg 40 Thr Vai Asp Tyr
ATC ATC GCT GGT GGA GGT CTG ACT GGA CTC ACC ACC GCT GCT CGT CTG 195
He lie Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu
45 50 55 60
ACG GAG AAC CCC AAC ATC AGT GTG CTC GTC ATC GAA AGT GGC TCC TAC 243
Thr Glu Asn Pro Asn He Ser Vai Leu Vai He Glu Ser Gly Ser Tyr
65 70 75
GAG TCG GAC AGA GGT CCT ATC ATT GAG GAC CTG AAC GCC TAC GGC GAC 291
Glu Ser Asp Arg Gly Pro lie He Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp
80 85 90
ATC TTT GGC AGC AGT GTA GAC CAC GCC TAC GAG ACC GTG GAG CTC GCT 339
He Phe Gly Ser Ser Vai Asp His Ala Tyr Glu Thr Vai Glu Leu Ala
95 100 105
ACC AAC AAT CAA ACC GCG CTG ATC CGC TCC GGA AAT GGT CTC GGT GGC 387
Thr Asn Asn Gin Thr Ala Leu He Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly
110 115 120
TCT ACT CTA GTG AAT GGT GGC ACC TGG ACT CGC CCC CAC AAG GCA CAG 435
Ser Thr Leu Vai Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gin
125 130 135 140
GTT GAC TCT TGG GAG ACT GTC TTT GGA AAT GAG GGC TGG AAC TGG GAC 483
Vai Asp Ser Trp Glu Thr Vai Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp
145 150 155
AAT GTG GCC GCC TAC TCC CTC CAG GCT GAG CGT GCT CGC GCA CCA AAT 531
Asn Vai Ala Ala Tyr Ser Leu Gin Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn
160 165 170
GCC AAA CAG ATC GCT GCT GGC CAC TAC TTC AAC GCA TCC TGC CAT GGT 579
Ala Lys Gin He Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly
175 180 185
GTT AAT GGT ACT GTC CAT GCC GGA CCC CGC GAC ACC GGC GAT GAC TAT 627
Vai Asn Gly Thr Vai His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr
190 195 200
TCT CCC ATC GTC AAG GCT CTC ATG AGC GCT GTC GAA GAC CGG GGC GTT 675
Ser Pro He Vai Lys Ala Leu Met Ser Ala Vai Glu Asp Arg Gly Vai
205 210 215 220
CCC ACC AAG AAA GAC TTC GGA TGC GGT GAC CCC CAT GGT GTG TCC ATG 723
Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Vai Ser Met
225 230 235
TTC CCC AAC ACC TTG CAC GAA GAC CAA GTG CGC TCC GAT GCC GCT CGC 771
Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gin Vai Arg Ser Asp Ala Ala Arg
240 245 250
GAA TGG CTA CTT CCC AAC TAC CAA CGT CCC Pro
Glu Trp Leu 255 Leu Pro Asn Tyr Gin 260 Arg
GGA CAG TAT GTT GGT AAG GTG CTC CTT AGC
Gly Gin Tyr Vai Gly Lys Vai Leu Leu Ser
270 275
CGT GCC GTT GGC GTG GAA TTC GGC ACC CAC
Arg Ala Vai Gly Vai Glu Phe Gly Thr His
285 290
GTT TAC GCT AAG CAC GAG GTC CTC CTG GCC
Vai Tyr Ala Lys His Glu Vai Leu Leu Ala
305 310
CCC ACA ATC CTC GAA TAT TCC GGT ATC GGA
Pro Thr lie Leu Glu Tyr Ser Gly lie Gly
320 325
CCC CTT GGT ATC GAC ACC GTC GTT GAC CTG
Pro Leu Gly lie Asp Thr Vai Vai Asp Leu
335 340
CAG GAC CAG ACC ACC GCT ACC GTC CGC TCC
Gin Asp Gin Thr Thr Ala Thr Vai Arg Ser
350 355
GCA GGA CAG GGA CAG GCC GCT TGG TTC GCC
Ala Gly Gin Gly Gin Ala Ala Trp Phe Ala
365 370
GGT GAC TAT TCC GAA AAG GCA CAC GAG CTG
Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
385 390
CAG TGG GCC GAA GAG GCC GTC GCC CGT GGC
Gin Trp Ala Glu Glu Ala Vai Ala Arg Gly
400 405
GCC TTG CTC ATC CAG TAC GAG AAC TAC CGC
Ala Leu Leu He Gin Tyr Glu Asn Tyr Arg
415 420
AAC GTC GCG TAC TCG GAA CTC TTC CTC GAC
Asn Vai Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
430 435
TTC GAT GTG TGG GAC CTT CTG CCC TTC ACC
Phe Asp Vai Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
445 450
CTC GAC AAG GAC CCC TAC CTT CAC CAC TTC
Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
465 470
AAC CTG CAA GTC CTG ACC819
Asn Leu Gin Vai Leu Thr
265
CAG AAC GGC ACC ACC CCT867
Gin Asn Gly Thr Thr Pro
280
AAG GGC AAC ACC CAC AAC915
Lys Gly Asn Thr His Asn
295300
GCG GGC TCC GCT GTC TCT963
Ala Gly Ser Ala Vai Ser
315
ATG AAG TCC ATC CTG GAG1011
Met Lys Ser lie Leu Glu
330
CCC GTC GGC TTG AAC CTG1059
Pro Vai Gly Leu Asn Leu
345
CGC ATC ACC TCT GCT GGT1107
Arg lie Thr Ser Ala Gly
360
ACC TTC AAC GAG ACC TTT1155
Thr Phe Asn Glu Thr Phe
375380
CTC AAC ACC AAG CTG GAG1203
Leu Asn Thr Lys Leu Glu
395
GGA TTC CAC AAC ACC ACC1251
Gly Phe His Asn Thr Thr
410
GAC TGG ATT GTC AAC CAC1299
Asp Trp lie Vai Asn His
425
ACT GCC GGA GTA GCC AGC1347
Thr Ala Gly Vai Ala Ser
440
CGA GGA TAC GTT CAC ATC1395
Arg Gly Tyr Vai His lie
455460
GCC TAC GAC CCT CAG TAC1443
Ala Tyr Asp Pro Gin Tyr
475
TTC Phe CTC AAC Leu Asn GAG CTG GAC CTG CTC GGT CAG GCT GCC GCT ACT CAA CTG 1491
Glu Leu 480 Asp Leu Leu Gly 485 Gin Ala Ala Ala Thr 490 Gin Leu
GCC CGC AAC ATC TCC AAC TCC GGT GCC ATG CAG ACC TAC TTC GCT GGG 1539
Ala Arg Asn lie Ser Asn Ser Gly Ala Met Gin Thr Tyr Phe Ala Gly
495 500 505
GAG ACT ATC CCC GGT GAT AAC CTC GCG TAT GAT GCC GAT TTG AGC GCC 1587
Glu Thr He Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala
510 515 520
TGG ACT GAG TAC ATC CCG TAC CAC TTC CGT CCT AAC TAC CAT GGC GTG 1635
Trp Thr Glu Tyr He Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val
525 530 535 540
GGT ACT TGC TCC ATG ATG CCG AAG GAG ATG GGC GGT GTT GTT GAT AAT 1683
Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn
545 550 .*,· 555
GCT GCC CGT GTG TAT GGT GTG CAG GGA CTG CGT GTC ATT GAT GGT TCT 1731
Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gin Gly Leu Arg Val He Asp Gly Ser
560 565 570
ATT CCT CCT ACG CAA ATG TCG TCC CAT GTC ATG ACG GTG TTC TAT GCC 1779
lie Pro Pro Thr Gin Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala
575 580 585
ATG GCG CTA AAA ATT TCG GAT GCT ATC TTG GAA GAT TAT GCT TCC ATG 1827
Met Ala Leu Lys He Ser Asp Ala He Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met
590 595 600
CAG TGATAAGGAT CCGGTACC
1848
Gin
605 /</Информация /за seq id ΝΟι2 :
/I /Характеристики на последователността: /А/Дължина: 605 амино киселини /В/Тип: аминокиселина /D /Топологиа:линеина /11/Молекулен тип: протеин /к1/ Описание на последователност: seq id no:2 :
Met 1 Gin Thr Leu Leu 5 Val Ser Ser Leu Val 10 Val Ser Leu Ala Ala 15 Ala
Leu Pro His Tyr He Arg Ser Asn Gly He Glu Ala Ser Leu Leu Thr
20 25 30
Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr lie lie Ala Gly 35 40 45
Gly Gly 50 Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala 55 Ala Arg Leu Thr 60 Glu Asn Pro
Asn lie Ser Vai Leu Vai He Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg
65 70 75 • 80
Gly Pro lie He Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp lie Phe Gly Ser
85 90 95
Ser Vai Asp His Ala Tyr Glu Thr Vai Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gin
100 105 110
Thr Ala Leu lie Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Vai
115 120 125
Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gin Vai Asp Ser Trp
130 135 140
Glu Thr Vai Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Vai Ala Ala
145 150 155 160
Tyr Ser Leu Gin Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gin He
165 170 175
Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Vai Asn Gly Thr
180 185 190
Vai His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro He Vai
195 200 205
Lys Ala Leu Met Ser Ala Vai Glu Asp Arg Gly Vai Pro Thr Lys Lys
210 215 220
Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Vai Ser Met Phe Pro Asn Thr
225 230 235 240
Leu His Glu Asp Gin Vai Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu
245 250 a 255
Pro Asn Tyr Gin Arg Pro Asn Leu Gin Vai Leu Thr Gly Gin Tyr Vai
260 265 270
Gly Lys Vai Leu Leu Ser Gin Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Vai Gly
275 280 285
Vai Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn Vai Tyr Ala Lys
290 295 300
His Glu Vai Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Vai Ser Pro Thr He Leu
305 310 315 320
Glu Tyr Ser Gly He Gly Met Lys Ser lie Leu Glu Pro Leu Gly He
325 330 335
Asp Thr Vai Vai Asp Leu Pro Vai Gly Leu Asn Leu Gin Asp Gin Thr
340 345 350
54
Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg He Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gin Gly
355 360 365
Gin Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser
370 375 380
Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gin Trp Ala Glu
385 390 395 400
Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu He
405 410 415
Gin Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp He Val Asn His Asn Val Ala Tyr
420 425 430
Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp
435 440 445
Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His lie Leu Asp Lys Asp
450 455 460
Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gin Tyr Phe Leu Asn Glu
465 470 475 480
Leu Asp Leu Leu Gly Gin Ala Ala Ala Thr Gin Leu Ala Arg Asn lie
485 490 495
Ser Asn Ser Gly Ala Met Gin Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr He Pro
500 505 510
Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr
515 520 525
lie Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser
530 535 540
Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val
545 550 555 560
Tyr Gly Val Gin Gly Leu Arg Val He Asp Gly Ser He Pro Pro Thr
565 570 575
Gin Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys
580 585 590
He Ser Asp Ala lie Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gin
595 600 605
/^/Информация за seq id no:5 :
// / Характеристики на последователността: /А/ Дължина: 82 основни двоики /В/ Тип: нуклеинова киселина /С/ Верижност: единшна /D/ Топология: линейна /ii / Молекулен тип: dna /геномна/ /xi / Описание на последователност: SEQ ID N0:3 :
CCATCTAGAA GATCTATCJff ССАСАСГСГС СТТ /Й/ Информация за SEQ ID N0:4 :
/i / Характеристики на последователността:
/А/ Дължина: 35 основни двоики /В/ Тип: нуклеинова киселина /С/ Верижност: единична /о/ Топология: линейна /ii/ Молекулен тип: dna /геномна/ /xi/ Описание на последователност: seq id no:4 :
TGGGCTACCG GATCCITjffC ACTGGATGGA AGCATA 35

Claims (14)

  1. Патентни претенции
    1. Рекомбинантна, двойно-усукана DNA молекула, съдържаща в оперативна последователност:
    а) промотор, чиито функции в растителните клетки са да предизвиква получаването на RNA - последователност; и
    б) структурно-кодирана последователност, чиито кодове произвеждат Aspergillus glucose oxidise;
    в) 3' нетрансформиран регион, чиито функции в растителните клетки са да предизвика добавянето на полиаденилатни нуклеотиди към 3' края на RNAпоследователността.
  2. 2. DNA молекулата, съгласно претенция 1, където споменатата структурна последователност е SEQ ID N0:1.
  3. 3. DNA молекулата, съгласно претенция 1, където споменатият промотор е избран от FMV35S и CaMV 35S промотори.
  4. 4. DNA молекулата, съгласно претенция 1, където споменатият промотор е индуциран чрез патогенна инфекция.
  5. 5. Метод за получаване на генетично трансформирани, болестно-устойчиви растения, характеризиращ се това , че съдържа етапите:
    а) вкарване в генома на растителна клетка, рекомбинантна двойно-усукана - DNA молекула, включваща (i) промотор, чиито функции в растителните клетки са да предизвиква получаването на RNA последователност; и (ii) структурно-кодираща последователност, която предизвиква получаване на Aspergillus glucose oxidise;
    (iii) 3' нетрансформиран регион, чиито функции в растителните клетки са да предизвика добавянето на полиаденилатни нуклеотиди към 3’ края на RNAпоследователността;
    б) получаване на трансформирани растителни клетки;
    в) регенериране от трансформираните растителни клетки на генетично трансформирани растения, които експресират Aspergillus glucose oxidise В количество, за ефективно ограничаване на увреждане, причинено от инфекция на бактерии или фунгицидни патогени.
  6. 6. Метод, съгласно претенция 5, харатеризираящ се с това, че споменатата структрурна кодираща последователност е SEQ ID NO.T.
  7. 7. Метод, съгласно претенция 5, характеризиращ е това, че споменатият промотор е избран от FMV35S и CaMV 35S промотори.
  8. 8. Метод, съгласно претенция 5, характеризиращ се това, че споменатият промотор е индуциран чрез патогенна инфекция.
  9. 9. Метод, съгласно претенция 5, характеризиращ се това, че споменатите растения са картофени или пшенични растения.
  10. 10. Генетично трансформирано, болестно-устойчиво растение, съдържащо рекомбинантна двойно-усукана DNA-молекула, включваща в оперативна последователност:
    а) промотор, чиито функции в растителните клетки са да предизвиква получаването на RNA - последователност; и
    б) структурно-кодирана последователност, чиито кодове произвеждат Aspergillus glucose oxidise;
    в) 3' нетрансформиран регион, чиито функции в растителните клетки са да предизвика добавянето на полиаденилатни нуклеотиди към 3' края на RNA последователността.
  11. 11. Растение, съгласно претенция 10, характеризиращо с това, че споменатият промотор е избран от FMV35S и CaMV 35S промотори.
  12. 12. Растение, съгласно претенция 10, характеризиращо с това, че споменатият промотор е индуциран чрез патогенна инфекция.
  13. 13. Растение, съгласно претенция 10, характеризиращо с това, че споменатата структурна кодираща последователност е SEQ ID N0:1.
  14. 14. Растение, съгласно претенция 10, характеризиращо с това, че е картофено или пшенично растение.
BG100619A 1993-11-24 1996-05-23 Method of controlling plant pathogens BG61548B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16104193A 1993-11-24 1993-11-24
PCT/US1994/011837 WO1995014784A1 (en) 1993-11-24 1994-10-25 Method of controlling plant pathogens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG100619A true BG100619A (bg) 1996-12-31
BG61548B1 BG61548B1 (en) 1997-12-30

Family

ID=22579557

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG100619A BG61548B1 (en) 1993-11-24 1996-05-23 Method of controlling plant pathogens

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5516671A (bg)
EP (1) EP0733116A1 (bg)
JP (1) JPH09506249A (bg)
CN (1) CN1066198C (bg)
AU (1) AU678640B2 (bg)
BG (1) BG61548B1 (bg)
BR (1) BR9408140A (bg)
CA (1) CA2172628A1 (bg)
CZ (1) CZ131796A3 (bg)
HU (1) HUT74393A (bg)
PL (1) PL178652B1 (bg)
SK (1) SK280613B6 (bg)
WO (1) WO1995014784A1 (bg)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPM379294A0 (en) * 1994-02-10 1994-03-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
US5856127A (en) * 1996-07-26 1999-01-05 The Research Foundation Of State University Of New York Antimicrobial peptides
US5850019A (en) * 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
WO1998013478A2 (en) * 1996-09-04 1998-04-02 Mogen International N.V. Antifungal proteins, dna coding therefore, and hosts incorporating same
US5879921A (en) * 1996-11-07 1999-03-09 Novo Nordisk A/S Recombinant expression of a glucose oxidase from a cladosporium strain
US6166291A (en) 1997-07-18 2000-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of pathogen resistant plants
ZA986308B (en) * 1997-07-18 1999-11-24 Pioneer Hi Bred Int The induction of stress-related factors in plants.
AU5851299A (en) * 1998-07-28 2000-02-21 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Methods and means for inducing tolerance to stress
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
CN1098931C (zh) * 1999-01-28 2003-01-15 中国农业科学院生物技术研究所 葡萄糖氧化酶基因在培育抗病转基因植物中的应用
JP2005502358A (ja) * 2001-09-13 2005-01-27 バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト 真菌グリオキサールオキシダーゼ
MXPA05000758A (es) 2002-07-18 2005-04-28 Monsanto Technology Llc Metodos para utilizar polinucleotidos artificiales y composiciones de los mismos para reducir el silenciamiento de los transgenes.
DK1585822T3 (da) * 2002-11-18 2012-05-14 Novozymes Inc Promotorvarianter til ekspression af gener i en fungal celle
BRPI0408896A (pt) 2003-03-28 2006-04-25 Monsanto Technology Llc promotores de planta para uso no desenvolvimento precoce de sementes
ES2638554T3 (es) 2003-08-25 2017-10-23 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de tubulina para su uso en plantas
EP1679367A4 (en) 2003-10-29 2008-08-27 Kureha Corp FOR THE FIGHT AGAINST ILLNESS DAMAGE TO GRASS-TYPED PLANTS AND TO THEIR USE, COMBATIENT, COMBUSTION PROCEDURE AND BIOMATERIAL
EP2333079B1 (en) 2004-01-20 2016-03-30 Monsanto Technology LLC Chimeric promoters for use in plants
WO2006023869A2 (en) 2004-08-24 2006-03-02 Monsanto Technology Llc Adenylate translocator protein gene non-coding regulatory elements for use in plants
EP1789539A2 (en) 2004-09-14 2007-05-30 Monsanto Technology, LLC Promoter molecules for use in plants
US9580695B2 (en) * 2004-12-23 2017-02-28 Philip Morris Usa Inc. Reduction of tobacco-specific nitrosamines using genetic modification to elevate production of native antioxidants in tobacco
US20090031440A1 (en) 2005-02-26 2009-01-29 Basf Plant Science Gmbh Expression Cassettes for Seed-Preferential Expression in Plants
CN101198701B (zh) 2005-04-19 2013-04-24 巴斯福植物科学有限公司 单子叶植物中的淀粉胚乳特异性和/或萌芽胚特异性表达
WO2006120197A2 (en) 2005-05-10 2006-11-16 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
US8993846B2 (en) 2005-09-06 2015-03-31 Monsanto Technology Llc Vectors and methods for improved plant transformation efficiency
US20070204367A1 (en) 2006-02-17 2007-08-30 Stanislaw Flasinski Chimeric regulatory sequences comprising introns for plant gene expression
AU2008214568B2 (en) 2007-02-16 2013-04-18 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
US7838729B2 (en) 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
US8580942B2 (en) 2008-04-07 2013-11-12 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements from a metallothionein-like gene and uses thereof
WO2010099431A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Monsanto Technology Llc Hydroponic apparatus and methods of use
BR112012000448A2 (pt) 2009-07-10 2015-10-06 Basf Plant Science Gmbh cassete de expressão para a regulação da expressão semente-específica de um polinucleotídeo de interesse, vetor, célula hospedeira, tecido de planta, órgão de planta, planta ou semente transgênicos, metodo para expressar um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira, métodos para produzir um tecido vegetal, órgão de planta, planta, ou semente transgênicos e uso do cassete de expressão
US8937214B2 (en) 2009-10-23 2015-01-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for expression of transgenes in plants
EP2507375A4 (en) 2009-12-03 2013-04-24 Basf Plant Science Co Gmbh EXPRESSION CASSETTES FOR EMBRYOSPECIFIC EXPRESSION IN PLANTS
JP5846687B2 (ja) 2009-12-05 2016-01-20 天野エンザイム株式会社 変異酵素及びその用途
ES2736037T3 (es) 2010-01-14 2019-12-23 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de las plantas y usos de los mismos
NZ608144A (en) 2010-08-30 2014-12-24 Dow Agrosciences Llc Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics
CA2831133C (en) 2011-03-25 2019-10-15 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
UY39070A (es) 2011-05-13 2021-03-26 Monsanto Technology Llc Moléculas de adn reguladoras de la expresión génica de plantas; construcciones, plantas y sus partes, y productos que las comprenden
US10077450B2 (en) 2012-02-29 2018-09-18 Dow Agrosciences Llc Sugarcane bacilliform viral (SCBV) enhancer and its use in plant functional genomics
US9663793B2 (en) 2012-04-20 2017-05-30 Monsanto Technology, Llc Plant regulatory elements and uses thereof
CA3062341C (en) 2012-12-19 2022-04-12 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
CA2891285C (en) * 2013-01-28 2021-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel glucose oxidases derived from aspergillus niger
EA029474B1 (ru) 2013-03-14 2018-03-30 Монсанто Текнолоджи Ллс Регуляторные элементы растений и их применение
CN110066796B (zh) 2013-03-14 2023-11-10 孟山都技术有限公司 植物调控元件和其用途
CN104711273B (zh) * 2015-03-17 2018-01-26 中国科学院微生物研究所 一种重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备方法及其应用
EP3274462A4 (en) 2015-03-26 2018-12-26 The Texas A&M University System Conversion of lignin into bioplastics and lipid fuels
JP7123803B2 (ja) 2016-03-11 2022-08-23 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物調節エレメント及びその使用法
PE20190224A1 (es) 2016-05-24 2019-02-13 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de plantas y sus usos
CA3029271A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
CN108251389A (zh) * 2017-08-18 2018-07-06 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体
EP3737747A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 The Texas A&M University System Increasing plant bioproduct yield
EP4314281A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Production of circular polyribonucleotides in a eukaryotic system
WO2022204466A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Production of circular polyribonucleotides in a prokaryotic system
TW202305129A (zh) 2021-03-26 2023-02-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於產生環狀多核糖核苷酸之組成物及方法
WO2023077118A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2023141540A2 (en) 2022-01-20 2023-07-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2023225459A2 (en) * 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
US20240093220A1 (en) 2022-09-09 2024-03-21 Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Plant regulatory elements and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4940840A (en) * 1984-03-26 1990-07-10 Dna Plant Technology Corporation Novel chitinase-producing bacteria and plants
SE8500341L (sv) * 1985-01-24 1986-07-25 Pharmacia Ab Desinfektionssats samt sett for desinfektion
US4696674A (en) * 1986-02-10 1987-09-29 Frito-Lay, Inc Novel potato cultivar
US4723052A (en) * 1986-06-13 1988-02-02 S. Lynn Loosli Potato variety named LC-1
DK501686A (da) * 1986-10-20 1988-04-21 Otto Melchior Poulsen Enzymholdigt, baktericidt middel samt tandplejemidler og saarbehandlingsmidler, som indeholder det
US5094951A (en) * 1988-06-21 1992-03-10 Chiron Corporation Production of glucose oxidase in recombinant systems
US5266688A (en) * 1988-06-21 1993-11-30 Chiron Corporation Polynucleotide sequence for production of glucose oxidase in recombinant systems
US5270194A (en) * 1989-08-31 1993-12-14 Instrumentation Laboratory Spa Stabilized glucose oxidase from Aspergillus Niger
FI88246C (fi) * 1989-10-27 1993-04-26 Genencor Int Europ Foerfarande foer bekaempning av mikroorganismer
EP0618769B1 (en) * 1991-12-10 1997-02-26 Genencor International, Inc. Fungistatic method and composition employing type ii endoglycosidases and peroxidases

Also Published As

Publication number Publication date
WO1995014784A1 (en) 1995-06-01
CZ131796A3 (en) 1996-10-16
BG61548B1 (en) 1997-12-30
PL314590A1 (en) 1996-09-16
PL178652B1 (pl) 2000-05-31
AU678640B2 (en) 1997-06-05
HUT74393A (en) 1996-12-30
CN1066198C (zh) 2001-05-23
SK65596A3 (en) 1996-10-02
SK280613B6 (sk) 2000-05-16
AU8120994A (en) 1995-06-13
JPH09506249A (ja) 1997-06-24
EP0733116A1 (en) 1996-09-25
US5516671A (en) 1996-05-14
CN1136329A (zh) 1996-11-20
BR9408140A (pt) 1997-08-12
CA2172628A1 (en) 1995-06-01
HU9601403D0 (en) 1996-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU678640B2 (en) Method of controlling plant pathogens
Wu et al. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants.
US5597946A (en) Method for introduction of disease and pest resistance into plants and novel genes incorporated into plants which code therefor
JP3310307B2 (ja) ブドウからのスチルベンシンターゼ遺伝子
US7122719B2 (en) Method of imparting disease resistance to plants by reducing polyphenol oxidase activities
US5670706A (en) Fungal resistant plants, process for obtaining fungal resistant plants and recombinant polynucleotides for use therein
AU671669B2 (en) Transgenic pathogen-resistant organism
CA2183067A1 (en) Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
US7888493B2 (en) Bacterial strains, genes and enzymes for control of bacterial diseases by quenching quorum-sensing signals
EP2009093A2 (en) Transgenic strains of trichoderma and their use in biocontrol
CA2067317A1 (en) Caffeoyl-coa 3-o-methyltransferase genes
KR101957550B1 (ko) 항진균성 식물 단백질, 펩티드 및 사용 방법
AU718274B2 (en) Antifungal proteins, DNA coding therefore, and hosts incorporating same
HUT65677A (en) Production of plants resistant to attacks of sclerotinia sclerotiorum
US6087560A (en) Transgenic fungal resistant plants expressing chitinase and glucanase, process for obtaining, and recombinant polynucleotides for uses therein
WO1994008010A1 (en) Method of controlling plant pathogenic fungi
Honée et al. Molecular characerization of the interaction between the fungal pathogen Cladosporium fulvum and tomato
US6066491A (en) Process for obtaining fungal resistant plants with recombinant polynucleotides encoding β-1,3-glucanase modified for apoplast targeting
KR20040003855A (ko) 고추 한별 품종 (Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ.ｃｖ. Ｈａｎｂｙｕｌ)으로부터 유래한리피드트랜스퍼단백질 ＣＡＬＴＰ Ⅰ·ＣＡＬＴＰⅡ·ＣＡＬＴＰⅢ을 코딩하는 유전자 및 마커로서의 활용
AU692228B2 (en) Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
WO1994018335A2 (en) Method of controlling plant pathogenic fungi
MXPA04012451A (es) Cepas mejoradas de trichoderma como agentes de biocontrol, metodos para su obtencion y su uso para el control de enfermedades causadas por hongos fitopatogenos.
EP1930440A1 (en) Bacterial Strains, Genes and Enzymes for Control of Bacterial Diseases by Quenching Quorum-Sensing Signals
MeeDo et al. Expression of peroxidase-like genes, H (2) O (2) production, and peroxidase activity during the hypersensitive response to Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Capsicum annuum