ES2273329T3 - Produccion de plantas resistentes a los ataques de sclerotinia sclerotiorum por introduccion de un gen que codifica una oxalato oxidasa. - Google Patents
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Abstract
SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA UNA OXIDASA OXALATO. LA PROTEINA SE PUEDE UTILIZAR PARA LA RESISTENCIA DE LAS PLANTAS A LAS ENFERMEDADES PROVOCADAS POR SCLEROTINIA SP. PUEDE SER PROPORCIONADA POR UN GEN QUIMERICO Y UN VECTOR QUE CONTIENE UNA SECUENCIA CODIFICANTE. SE PUEDE UTILIZAR PARA PROPORCIONAR A LAS PLANTAR UNA RESISTENCIA AUMENTADA CONTRA LAS ENFERMEDADES DEBIDAS A SCLEROTINIA SP.
Description
Producción de plantas resistentes a los ataques
de Sclerotinia sclerotiorum por introducción de un gen que
codifica una oxalato oxidasa.
La presente invención tiene por objeto la
utilización de un gen que codifica una oxalato oxidasa, de la
proteína codificada por ese gen y de los genes quimera que
comprenden ese gen para la transformación de plantas con miras a
conferirles resistencia a enfermedades fúngicas.
La esclerotiniosis es una enfermedad fúngica
importante que afecta a un gran número de dicotiledóneas. El
responsable, Sclerotinia sclerotiorum es un hongo polífago
que presenta poca especificidad de huésped.
El hongo puede atacar a la planta o bien
directamente al nivel del tallo, o bien a nivel de las hojas y
después ganar el tallo, o bien a nivel del capítulo floral. En los
dos primeros casos, la planta se marchita por agotamiento de la
alimentación. En el último caso, la flor se marchita comprometiendo
la cosecha.
El hongo produce enzimas líticas que degradan la
pared celular del vegetal infectado facilitando su desarrollo en la
planta. Esas enzimas juegan un rol importante en la patogenicidad,
pero no parecen suficientes. Ese hongo produce también ácido
oxálico (Godov et al., 1990). Ese ácido oxálico provoca un
descenso del pH en los tejidos infectados que facilita la
hidrólisis de la pared celular por parte de las enzimas líticas. Una
reducción de la producción de ácido oxálico o una degradación de
ese ácido oxálico debe permitir un enlentecimiento o incluso una
inhibición del desarrollo del hongo.
Para desarrollar una planta resistente a
"nos", se puede utilizar la estrategia de desintoxicación del
ácido oxálico. La degradación de ese ácido limitará las
disminuciones del pH intracelular del tejido vegetal atacado, las
enzimas líticas funcionarán por lo tanto demasiado lejos de su pH
óptimo para ser realmente activas y eficaces. Como resultado habrá
una disminución de la patogenicidad del hongo.
Para lograr ese objetivo, se puede utilizar la
oxalato oxidasa que cataliza la reacción siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
C_{2}O_{4}H_{2}\xrightarrow[\textstyle{oxalato
\ oxidasa}]{\textstyle{O_{2}}} 2CO_{2} +
H_{2}O_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
La oxalato oxidasa se aísla de plantas
diferentes, en general de las monocotiledóneas (Pieta et al.,
1982); se puede, por ejemplo purificar la proteína de cebada
utilizando técnicas de cromatografía clásica (geles de filtración
Superdex G75 y de intercambio de iones MonoQ, Pharmacia), siguiendo
la actividad enzimática según el protocolo colorimétrico siguiente
(Obzansky y Richardson, 1983).
\vskip1.000000\baselineskip
Ácido \
oxálico + O_{2} \xrightarrow[\textstyle{oxalato \ oxidasa}] 2CO_{2}
+ H_{2}O_{2}
+
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,4cmH_{2}O_{2} + MBTH + DMA \xrightarrow[\textstyle{peroxidasa}]
indamina + H_{2}O \
+
\vskip1.000000\baselineskip
MBTH =
3-metil-2-benzotiazolinona
hidrazona
DMA = N,N-dimetilalinina.
Esto permitió purificar una proteína que, en gel
de acrilamida en condiciones desnaturalizantes, tiene una masa
molecular de 26 000 Dalton. Una parte de la oxalato oxidasa
purificada se utilizó para obtener anticuerpos antioxalato oxidasa
de conejo; el resto de la proteína se utilizó para hacer la
secuenciación de la proteína nativa (N-terminal) o,
después del corte con bromuro de cianógeno, la secuenciación de
ciertos péptidos internos. Los resultados obtenidos son los
siguientes:
N-terminal:
TDPDPLQDF-VADLDGKAVSVNGH
- S
Péptido interno nº 2: HFQFNVGKTEAY
El ADNc
\newpage
La comparación de las secuencias peptídicas
descritas antes con los datos contenidos en el banco proteico
Swiss-Prot nos permitió identificar una proteína de
trigo llamada Germine y publicada en 1989 por
Dratewka-kos et al. Se realizaron
experiencias y nos permitieron determinar que el ADNc publicado por
los autores codifica una proteína de 201 aminoácidos y que presenta
una actividad de oxalato oxidasa. Para el desarrollo de la
descripción de las experiencias presentadas en esa patente
retomaremos la numeración de los nucleótidos de la figura 2 del
artículo de los autores publicados en J. Biol. Chem., 264, 4 896 - 4
900.
La secuencia de ese ADNc tiene una longitud de 1
075 nucleótidos con un 5' sin traducir de 85 residuos, una fase de
lectura abierta de 672 nucleótidos (de la posición 86 a la 757)
después un 3' sin traducir de 318 residuos.
La comparación de la secuencia proteica deducida
de la secuencia del ADNc con la obtenida por secuenciación de la
proteína nativa muestra que el ADNc codifica no solamente la oxalato
oxidasa madura sino también un péptido señal de 23 aminoácidos en
la parte N-terminal. La oxalato oxidasa se sintetiza
por lo tanto en forma de una preproteína (péptido señal más péptido
maduro) que es madurada por eliminación del péptido señal para
liberar la enzima activa madura.
Para el desarrollo utilizaremos o bien la parte
que codifica la preproteína (nucleótidos 86 a 757) o bien solamente
la parte que codifica la proteína madura (de la posición 155 a la
757). En ese último caso, deberemos colocar un codón AUG (que
codifica una metionina) delante del codón ACC (que codifica la
treonina, primer aminoácido de la proteína madura).
Como los ataques de plantas por el
Sclerotinia sclerotiorum se hacen principalmente por el tallo
o por la planta, es interesante poder expresar la oxalato oxidasa o
bien en los tejidos clorofílicos y para eso se puede utilizar el
promotor de la subunidad pequeña de la
ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa
de Helianthus annuus (PSUHa, Waksman et al., 1987) o
bien en diferentes tejidos del vegetal y para eso utilizaremos el
promotor ubicuo del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV 35S) del cual se duplicó una parte que se denominó "doble
CaMV".
El documento WO 88/08450 menciona un gen quimera
que contiene una oxalato oxidasa, pero no menciona ni sugiere
expresarlo en los tejidos vegetales para conferir resistencia a
Sclerotinia.
Los genes quimera utilizables de acuerdo con la
invención pueden ser construidos por ejemplo a partir de los
elementos siguientes:
- A.
- Promotor doble CaMV seguido de la parte del ADNc de la oxalato oxidasa que codifica la preproteína (péptido señal más péptido maduro) y del terminador "nos" obtenido a partir del gen de la nopalina sintasa de pTi 37 (Bevan et al., 1983).
- B.
- Promotor doble CaMV seguido de la parte del ADNc de la oxalato oxidasa que codifica solamente la proteína madura seguido del terminador "nos".
- C.
- Gen idéntico a "A" pero con el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa del girasol (PSUHa) en el lugar del doble CaMV.
- D.
- Gen idéntico a "B" pero con el promotor de la PSUHa en el lugar del doble CaMV.
Cada gen quimera se introduce en la célula
vegetal por un sistema que utiliza Agrobacterium o por cualquier
otro sistema conocido por otra parte por transformar las células
vegetales. Se regeneran plantas a partir de las células
transformadas. Éstas presentan una mayor tolerancia al
Sclerotinia sclerotiorum.
\vskip1.000000\baselineskip
Preproteína: se la obtiene a partir del ADNc
descrito precedentemente digerido por Hind III (en posición 66). El
extremo cohesivo obtenido se vuelve romo por tratamiento con
polimerasa de Klenow. Ese ADN se digiere a continuación con Nhe I
(en posición 811).
Paralelamente el plásmido pUC 19
(Yanisch-Perron et al., 1985) se digiere con
Sac I.
El extremo cohesivo obtenido se vuelve romo por
tratamiento con polimerasa de Klenow. A continuación el plásmido se
digiere con Xba I (compatible con Nhe I).
El fragmento de ADNc y el plásmido preparados
antes se ligan. El nuevo plásmido obtenido de ese modo se denomina
pRPA-oxo-01 y su mapa se presenta en
la figura 1.
\newpage
B. Proteína madura: se la obtiene a partir del
ADNc descrito antes después de la digestión con BstN I (en posición
173). El fragmento obtenido y el ligador que tiene por
secuencia:
5'
\hskip4,5cm3'
ATGACCGACCCAGACCCTCTCC
TACTGGCTGGGTCTGGGAGAGGT
3'
\hskip4,8cm5'
se ligan. Esto da lugar a una
modificación de la secuencia N-terminal de la
proteína madura que pasa de TDPDPLQ a
MTDPDPLQ.
Ese fragmento de ADNc s digiere a continuación
con Nhe I (en posición 811) para después ligarlo con el plásmido
pUC19 preparado como se describe en el párrafo antes mencionado. El
nuevo plásmido constituido de esa manera se denomina
pRPA-oxo-02 y su mapa se presenta en
la figura 1.
- ejemplo doble CaMV: ese vector se obtiene a
partir del plásmido pRPA-BL-410
obtenido de la manera siguiente:
El péptido de tránsito de la PSU del gen de la
RuBisCO de maíz proviene de un fragmento EcoRI-SphI
de 192 pb; que procede del ADNc correspondiente al gen de la PSU
del gen de la RuBisCO de maíz, descrito por Lebrun et al
(1987), que posee un sitio NcoI que recubre el codón iniciador de la
traducción y un sitio SphI correspondiente al sitio de corte del
péptido de tránsito.
Por tratamiento del extremo SphI con la
polimerasa del bacteriófago T4 y ligándolo con el extremo NcoI,
tratado con la polimerasa de Klenow, del gen AroA de
pRPA-BL 104 vuelto a cortar con EcoRI, se obtiene la
fusión traduccional entre el péptido de tránsito de maíz y el gen
de la EPSPS bacteriana.
De manera similar se liga un fragmento
EcoRI-HindII de 228 bp del ADNc de la PSU del gen de
la RuBisCO de maíz con el extremo NcoI tratado con la polimerasa de
Klenow del gen AroA de pRPA-BL 104 y vuelto a cortar
con EcoRI. Se obtiene una fusión traduccional entre el péptido de
tránsito de la PSU de la RuBisCO de maíz, los 22 aminoácidos de la
parte madura de la PSU de la RuBisCO de maíz y el gen de la EPSPS
bacteriana.
El fragmento procede del ADNc aislado por
Waksman y Freyssinet (1987). Se creó un sitio SphI según el método
de Zoller y Smith (1984) en el sitio de corte del péptido de
tránsito. El péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO de girasol
obtenido de esa manera es un fragmento EcoRI-SphI de
171 pb.
La construcción que contiene la fusión péptido
de tránsito de la PSU de la RuBisCO de maíz/secuencia de 22
aminoácidos de la PSU de la RuBisCO de maíz de la parte madura del
gen de maíz se cortó con EcoRI-SphI de 171 pb
correspondiente al péptido de tránsito de la PSU del gen de la
RuBisCO de girasol. Una construcción resultante presenta una
sustitución de los fragmentos EcoRI-SphI y es una
fusión traduccional "péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO
de girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la parte madura de la PSU
de la RuBisCO de maíz/gen AroA".
El fragmento EcoRI-SalI se ligó
con el fragmento SalI-SstI que contiene la secuencia
nos 3' y el borde derecho del ADN-T. El fragmento
EcoRI-SstI resultante que comprende "péptido de
tránsito de la PSU de la RuBisCO de girasol/secuencia de 22
aminoácidos de la parte madura de la PSU de la RuBisCO de maíz/gen
AroA/nos 3'/borde derecho del ADN-T" es
sustituido en el fragmento EcoRI-SstI que contiene
el borde derecho del ADN-T del plásmido 150 A alfa
2 que contiene el promotor doble CaMV. La fusión transcripcional
``doble CaMV/péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO de
girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la parte madura de la PSU de
la RuBisCO de maíz/gen AroA/nos 3' en el vector 150 A alfa 2 se
denominó pRPA-BL 294.
La construcción antes mencionada se corta con
NcoI-HindIII liberando el gen AroA. Después se pone
a ligar con un fragmento NcoI-Hind III de 1,5 kpb
que contiene la fusión "péptido de tránsito de la PSU de la
RuBisCO de maíz/gen AroA". Una construcción resultante presenta
una sustitución de los fragmentos NcoI-HindIII y es
una fusión traduccional "péptido de tránsito de la PSU de la
RuBisCO de girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la PSU de la
RuBisCO de la parte madura del gen de maíz/péptido de tránsito de la
PSU de la RuBisCO de maíz/gen AroA".
El fragmento EcoRI-SalI se ligó
con el fragmento SalI-SstI que contiene la secuencia
nos 3' y el borde derecho del ADN-T. El fragmento
EcoRI-SstI resultante que comprende "péptido de
tránsito de la PSU de la RuBisCO de girasol/secuencia de 22
aminoácidos de la PSU de la RuBisCO de la parte madura del gen de
maíz/péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO de maíz/gen
AroA/nos 3'/borde derecho del ADN-T" es
sustituido en el fragmento EcoRI-SstI que contiene
el borde derecho del ADN-T del plásmido 150 A alfa 2
que contiene el promotor doble CaMV. La fusión transcripcional
``doble CaMV/péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO de
girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la PSU de la RuBisCO de la
parte madura del gen de maíz/péptido de tránsito de la PSU de la
RuBisCO de maíz/gen AroA/nos 3' en el vector 150 A alfa 2 se
denominó pRPA-BL 410. Ese plásmido se digiere con
EcoRI y SalI para quitar el gen estructural "péptido de tránsito
optimizado-zona que codifica la EPSPS madura",
pRPA-BL-410 suprimido (ver figura
1).
- ejemplo PSUHa: se obtiene ese vector a partir
del plásmido pRPA-BL-207 (descrito
en la solicitud de patente europea 0 337 899) que se digiere con
Eco RI y Hind III para quitar la zona que codifica la nitrilasa,
pRPA-BL-207 suprimido (ver figura
1).
pRPA-oxo-03: se
obtiene digiriendo pRPA-oxo-01 con
Eco RI y Sal I. El fragmento obtenido que codifica la preproteína
se inserta a continuación entre los sitios Eco RI y Sal I
respectivamente secuencia abajo del doble CaMV y secuencia arriba
del terminador nos.
pRPA-oxo-04: se
obtiene digiriendo pRPA-oxo-02 con
Eco RI y Sal I. El fragmento obtenido que codifica la proteína
madura se inserta a continuación entre los sitios Eco RI y Sal I
respectivamente secuencia abajo del doble CaMV y secuencia arriba
del terminador nos.
pRPA-oxo-05: se
obtiene digiriendo pRPA-oxo-01 con
Eco RI y Hind III. El fragmento obtenido que codifica la
preproteína se inserta a continuación entre los sitios Eco RI y Hind
III respectivamente secuencia abajo del PSUHa y secuencia arriba
del terminador nos.
pRPA-oxo-06: se
obtiene digiriendo pRPA-oxo-02 con
Eco RI y Hind III. El fragmento obtenido que codifica la proteína
madura se inserta a continuación entre los sitios Eco RI y Hind III
respectivamente secuencia abajo del PSUHa y secuencia arriba del
terminador nos.
| Identificación | Promotor | Zona codificante | Terminador |
| oxalato oxidasa | |||
| pRPA-oxo-03 | dCaMV | preproteína | nos |
| pRPA-oxo-04 | dCaMV | madura | nos |
| pRPA-oxo-05 | PSUHa | preproteína | nos |
| pRPA-oxo-06 | PSUHa | madura | nos |
Cada vector como el descrito antes se introduce
en la cepa no oncogénica de Agrobacterium tumefaciens EHA 101 (Hood
et al., 1987) portadora del cósmido pTVK 291 (Komari et
al., 1986).
La técnica de transformación de la colza
variedad Westar sigue esencialmente la descrita por Boulter et
al. (1990), utilizando una concentración de bacterias de 2,5 x
10^{9} por ml (DO 600 nm = l).
La técnica de regeneración sigue esencialmente
la descrita por Boulter et al. (1990). Las plantas son
enraizadas en el medio de De Block et al. (1989). A
continuación se llevan a floración en invernadero.
- Discos foliares: la resistencia se mide por
pesada de la masa de tres discos foliares al cabo de 11 días de
crecimiento en un medio de Murashige y Skoog (MS) con hormonas al
que se agregó ácido oxálico 1 mM.
En esas condiciones, se observa que para los
discos foliares procedentes de colzas modificadas con uno de los
genes quimera pRPA-oxo-03,
pRPA-oxo-04,
pRPA-oxo-05 y
pRPA-oxo-06, la masa de los discos
foliares aumenta netamente, en tanto que, para los discos foliares
procedentes de colzas sin modificar, la masa se estanca o incluso
disminuye.
- Elongación de las raíces: la resistencia
también se mide in vitro por medición de la elongación de las
raíces al cabo de dos días de crecimiento en agua a la que se
agregó ácido oxálico 5 mM. Se observa entonces que las raíces de
plantas de colza modificadas, con uno de los genes quimera
pRPA-oxo-03,
pRPA-oxo-04, son capaces de
extenderse y alargarse, en tanto que las raíces de colzas sin
modificar no presentan, en esas condiciones, ningún crecimiento.
La resistencia in vivo se mide en
invernadero después de la contaminación de las plantas de colza
procedentes de la regeneración, desde la aparición de las primeras
flores, sea por depósito de esporas de S. sclerotiorum sobre
los pétalos, teniendo entonces lugar la infección de las hojas
naturalmente en el momento de la desfloración, sea por depósito
directamente sobre las hojas de micelio o de un pétalo impregnado de
micelio. Las plantas modificadas por uno de los genes quimera
pRPA-oxo-03,
pRPA-oxo-04,
pRPA-oxo-05, y
pRPA-oxo-06 no dejan que se
desarrolle el hongo y no presentan ningún síntoma de la podredumbre
característica de la esclerotiniosis, en tanto que plantas sin
modificar son rápidamente invadidas por la podredumbre
característica del desarrollo de Sclerotinia
sclerotiorum.
Procedimiento de obtención de los cuatro genes
quimera a partir de los dos genes estructurales,
pRPA-oxo-0l y
pRPA-oxo-02 H, Hind III; B, BstN; N,
Nhe I; E, Eco RI; Sc, Sac I; S, Sal I y X, Xba I.
Claims (15)
1. Procedimiento para mejorar la resistencia
de las plantas a las enfermedades fúngicas, en particular a las
provocadas por Sclerotinia sp., que se caracteriza por
expresar en dichas plantas una proteína que posee una actividad de
oxalato oxidasa, dicha expresión se realiza por transformación
genética de dichas plantas con un gen quimera que comprende una
secuencia que codifica una proteína que posee una actividad de
oxalato oxidasa.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que se caracteriza porque dicha proteína se
encuentra bajo la forma de una preproteína que comprende un péptido
señal y un péptido maduro, dicho péptido maduro que posee una
actividad de oxalato oxidasa, proviene del mismo gen de oxalato
oxidasa.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, que se caracteriza porque la preproteína es
una germina.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, que se caracteriza porque la germina es una
germina de trigo.
5. Célula vegetal genéticamente modificada,
que se caracteriza por contener un vector que comprende un
gen quimera que comprende una secuencia que codifica una proteína
que posee una actividad de oxalato oxidasa.
6. Célula de acuerdo con la reivindicación 5,
que se caracteriza porque dicha proteína se encuentra bajo
la forma de una preproteína que comprende un péptido señal y un
péptido maduro, dicho péptido maduro que posee una actividad de
oxalato oxidasa, proviene del mismo gen de oxalato oxidasa.
7. Célula de acuerdo con la reivindicación 6,
que se caracteriza porque la preproteína es una germina.
8. Célula de acuerdo con la reivindicación 7,
que se caracteriza porque la germina es una germina de
trigo.
9. Célula de acuerdo con una de las
reivindicaciones 5 a 8, que se caracteriza porque la
secuencia que codifica la proteína que posee una actividad de
oxalato oxidasa se asocia a un promotor y un elemento
terminador.
10. Célula de acuerdo con la reivindicación 9,
que se caracteriza porque el promotor se elige entre el
promotor de la subunidad pequeña de la
ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa
de Helianthus anuus (PSUHa), y el promotor duplicado del ARN
35S del virus del mosaico de la coliflor (doble CaMV).
11. Célula de acuerdo con la reivindicación 9,
que se caracteriza porque el elemento terminador es la
secuencia nos.
12. Célula de acuerdo con una de las
reivindicaciones 5 a 11, que se caracteriza porque dicho gen
quimera se elige entre los genes quimera siguientes:
- a.
- gen quimera que comprende el promotor doble CaMV, la secuencia que codifica la germina bajo la forma de preproteína, y el terminador nos.
- b.
- gen quimera que comprende el promotor doble CaMV, la secuencia que codifica únicamente la germina bajo la forma de péptido maduro, y el terminador nos.
- c.
- gen quimera que comprende el promotor PSUHa, la secuencia que codifica la germina bajo la forma de preproteína, y el terminador nos.
- d.
- gen quimera que comprende el promotor PSUHa, la secuencia que codifica únicamente la germina bajo la forma de péptido maduro, y el terminador nos.
13. Planta transformada procedente de una
célula de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 12.
14. Planta de acuerdo con la reivindicación 13,
que se caracteriza por ser una dicotiledónea.
15. Planta de acuerdo con la reivindicación 14,
que se caracteriza por ser una colza.
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