BG61275B1 - Production of plants resistant to attacks of sclerotiniasp.by introducing a gene coding for an oxalate oxidase - Google Patents

Production of plants resistant to attacks of sclerotiniasp.by introducing a gene coding for an oxalate oxidase Download PDF

Info

Publication number
BG61275B1
BG61275B1 BG97042A BG9704292A BG61275B1 BG 61275 B1 BG61275 B1 BG 61275B1 BG 97042 A BG97042 A BG 97042A BG 9704292 A BG9704292 A BG 9704292A BG 61275 B1 BG61275 B1 BG 61275B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
gene
rubisco
maize
psu
prpa
Prior art date
Application number
BG97042A
Other languages
English (en)
Other versions
BG97042A (bg
Inventor
Georges Freyssinet
Alain Sailland
Original Assignee
Rhone Poulenc Agrochimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Agrochimie filed Critical Rhone Poulenc Agrochimie
Publication of BG97042A publication Critical patent/BG97042A/bg
Publication of BG61275B1 publication Critical patent/BG61275B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/03—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with oxygen as acceptor (1.2.3)
    • C12Y102/03004—Oxalate oxidase (1.2.3.4)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Networks Using Active Elements (AREA)

Description

Настоящото изобретение се отнася до ген, кодиращ оксалатоксидаза, протеина, кодиран от този ген, химерични гени, включващи този ген и приложението им при трансформация с цел да се предаде на растенията резистентността към болести, причинени от плесени.
Склеротиниоза е най-разпространеното заболяване, причинено от фунги, което засяга голям кръг двусемеделни растения. Агент причинител Sclerotinia Sclerotiorum представлява полифагова плесен, проявяваща слаба специфичност към гостоприемника.
Плесента може да атакува растението както директно, на нивото на стеблото, така и на нивото на листата и после се разпространява до стеблото или на нивото на съцветието. В първите два случая растението увяхва поради прекъсване на снабдяването с хранителни вещества. В последния случай цветовете увяхват, като по този начин се нанася вреда на реколтата.
Плесента продуцира литични ензими, които разграждат клетъчната стена на инфектираните растения, улеснява развитието си в растението. Тези ензими играят важна роля при патогенността, но изглежда не са достатъчни. Тези плесени продуцират също оксалова киселина /Godov et al., 1990/, която причинява спадане на pH-то на инфектираните тъкани, като по този начин подпомага хидролизата на клетъчната стена от литичните ензими. Намаляването на производството на оксалова киселина или разграждането й би позволило едно забавяне или даже инхибиране на развитието на плесента.
С цел да се развитие “nos” резистентно растение, може да се използва стратегията на детоксификация на оксаловата киселина. Разграждането на тази киселина би ограничило спадането на вътреклетъчното pH на атакуваните тъкани на растението, при което литичните ензими трябва да функционират при стойности на pH много отдалечени от рНоптимума, за да могат да бъдат наистина активни и ефикасни. Това би довело до намаля ване на патогенността на плесента.
Оксалатоксидаза, която катализира следната реакция:
о2
С204Н2---------> 2СО2 + Н2О2 оксалатоксидаза може да бъде използвана, за да се постигне целта.
Оксалатоксидаза е изолирана от различни растения, обикновено от едносемеделни / Pieta et al., 1982/: може например да бъде пречистен с протеин от ечемик, като се използват конвенционални хроматографски техники / Superdex G-75 филтрационни гелове и MonoQ йонообменни гелове, Pharmacia/ и се контролира ензиматичната активност съгласно следните колориметрични процедури /Obzansky and Richardson, 1983/:
Оксалова киселина + 02------> 2СО2 + Н202 + оксалатоксидаза
Hj02 + МВТН + DMA-------->индамин + Н20 + пероксидаза
МВТН = З-метил-2-бензотиазолинон хидразон
DMA = Ν,Ν-диметилаланин
Това позволява да се пречисти протеин, който върху акриламиден гел при денатуриращи условия има молекулно тегло 26,000 далтона. Част от пречистената оксалатоксидаза се използва за получаване на заешки антиоксалатоксидаза антитела; остатъкът от протеина се използва за осъществяване на секвенирането на нативния протеин /N-краен/ или след разцепване с цианбромид за секвениране на някои вътрешни пептиди.
Получените резултати са както следват:
N - край: “DPDPLQDF - VADLDG KAVSVNGH вътрешен пептид №2: HFQFNVGKTEAY сДНК
Сравнението на пептидните секвенции, описани по-горе, с данните, съдържащи се в протеинната банка Swiss-Port, дава възможност да се идентифицира житният протеин, наречен Germine и публикуван през 1989 от Dratewka-kos и др. Извършените експерименти позволяват да се определи, че публикуваната от авторите сДНК кодира протеин, състоящ се от 201 аминокиселини и проявяващ оксалатоксидазна активност. В останалата част на описанието на представените експерименти в настоящото изобретение ще бъде използвана нуклеотидната номерация от фиг. 2 на статията на авторите, публикувана в J.Biol.Chem., 264, 4896-4900.
Последователността на тази сДНК се състои от 1075 нуклеотида дължина, с 85 нетранслирани остатъка от 5'края, отворена рамка на разчитане от 672 нуклеотида /от позиция 86 до 757/ и 318 нетранслирани остатъка от 5' края.
Сравнението на пептидната последователност, изведена от сДНК последователността с тази, получена чрез секвениране на нативния протеин, показва, че сДНК кодира не само “зряла” оксалатоксидаза, но също и сигнален пептид от 23 аминокиселини, при N-крайната част. Следователно, оксалатоксидазата се синтезира под формата на препротеин /сигнален пептид и зрял пептид/, който по-нататък претърпява узряване чрез отстраняване на сигналния пептид с цел да се освободи зрелия активен ензим.
По-нататък ще използваме или частта, кодираща препротеина /нуклеотиди от 86 до 757/, или само тази част, кодираща зрелия протеин /от позиция 155 до 757/. В последния случай AUG кодон, кодиращ метионин трябва да бъде поставен пред АСС кодона, кодиращ треонин, първата аминокиселина от зрелия протеин.
Тъй като атакуването на растенията от Sclerotinia Sclerotiorum е предимно през стеблото на растението, препоръчително е да бъде възможно експресирането на оксалатоксидазата, или в хлорофилните тъкани, поради което може да се използва промоторът от малката субединица на рибулозо 1,5-дифосфат карбоксилазата от Helianthus annuus/PSuHa, Waksman et al., 1987/ или в различните тъкани на растението, поради което се използват универсален промотор 35S от РНК на вируса на мозайката по карфиола /CaMV 35S/, част от който е дупликиран и който се нарича “двоен caMV”.
Химеричните гени съгласно изобретението могат да бъдат конструирани например от следните елементи:
А. Двоен CaMV промотор, следван от част от оксалатоксидазната сДНК, кодираща препротеина /сигнален протеин и зрял протеин/ и терминатора “nos”, получен от pTi 37 нопалин синтезен ген /Bevan et al., 1983/.
B. Двоен CaMV промотор, следван от тази част от оксалатоксидазната сДНК, кодираща единствено зрелия протеин, следвана от терминатор “nos”.
C. Ген, идентичен на “А”, но с промотор от малката субединица на рибулозо 1,5дифосфат карбоксилаза /PSuHa/ от слънчоглед, вместо двойния CaMV
D. Ген, идентична “В”, но с промотор от PSuHa вместо двойния CaMV.
Всеки химеричен ген се вкарва в растителната клетка чрез система, използваща Agrobacterium или всяка друга известна система за трансформиране на растителни клетки. Растенията се регенерират от тези трансформирани клетки. Те проявяват засилена толерантност към Sclerotinia sclerotiorum.
КОНКРЕТНИ ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ
Пример 1. Изготвяне на две кодиращи последователности.
Препротеин. Получава се от описаната по-горе с ДНК, смляна с Hindlll /позиция 66/ . Полученият леплив край се затъпява чрез третиране с полимераза на Klenow. Тази ДНК след това се смила с Nhel /в позиция 811/.
Плазмидът PUC 19 /Yanisch-Perron et al., 1985/ паралелно се смила със Sacl.
Полученият леплив край се затъпява чрез третиране с полимераза на Klenow. След това плазмидът се смила с Xbal /съвместим с Nhel/.
сДНК фрагментът и изготвеният по-горе плазмид се свързват /лигират/. Полученият по този начин нов плазмид се нарича pRPAохо-01 и неговата карта се намира на фиг. 1.
В. Зрял протеин. Получава се от описаната по-горе сДНК, след смилане с BstNI /в позиция 173/. Полученият фрагмент и линкерът с последователност:
5' 3'
ATGACCGACCCAGACCCTCTCC TACTGGCTGGGTCTGGGAGAGGT 3' 5' се лигират. Това води до модификация на N-крайната последователност на зрелия протеин, който преминава от TDPDPLQ в MTDPDPLQ.
Този сДНК фрагмент се смила след това с Nhel /в позиция 811/ така, че да може да бъде лигиран с плазмида pUC19, приготвен, както е описано по-горе. Образуваният по този начин нов плазмид се нарича pRPA-oxo-02 и неговата карта се намира на фиг. 1.
Пример 2. Изготвяне на химеричните гени.
а/ Изготвяне на векторите, съдържащи промотора и терминатора “nos”; - пример двоен CaMV: този вектор се получава от плазмид pRPA-BL-410, получен по следния начин:
Сливане (Фузия) на транзитен пептид от PSU от царевица RuBisCO/Aroa ген
Транзитният пептид от PSU от царевица Ru BisCO гена е производен на фрагмента EcoRI-SphI с 192 - Ьр (базови двойки); получава се от сДНК, съответстваща на PSU гена на царевица RuBisCO гена, описан от Lebrun et al /1987/, имащ Ncol сайт, обхващащ иницииращия кодон за транслация и SphI сайт, съответстващ на сайта за разцепване на транзитния пептид.
Транслационната фузия между транзитния пептид от царевица и бактериалния EPSPS ген се получава чрез третиране на SphI края с полимераза на бактериофаг Т4 и чрез лигирането му с Ncol края, третиран с полимераза на Klenow, на АгоА гена на pRPA-BL 104, повторно срязан с EcoRI.
Сливане (Фузия) на транзитен пептид на PSU от царевица RuBisCO /последователност от 22 аминокиселини от зрялата част на PSU от царевица RuBisCO/АгоА гена.
По същия начин един EcoRI-Hindll фрагмент с 228 Ьр от сДНК на PSU на царевица RuBisCO гена се лигира с Ncol края, третиран с полимераза на Klenow, на АгоА гена от pRPABL 104 и повторно срязан с EcoRI. Транслационната фузия се осъществява между транзитния пептид за PSU от царевица RuBisCO, 22-те аминокиселини от зрялата част на PSU от царевица RuBisCO и бактериалния EPSPS ген.
Транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBisCO.
Фрагментът е получен от сДНК, изолирана от Waksman and Freyssinet /1987/. Създава се SphI сайт съгласно метода на Zoller and Smith /1984/ при сайта за разцепване на транзитния пептид. Полученият по този начин транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBisCO представлява EcoRI-SphI фрагмент със 171 Ьр.
Фузия на транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBiSCO последователност от 22 аминокиселини от зрялата част на PSU на царевица RuBiSCO/АгоА гена.
Структурата, съдържаща транзитния пептид от PSU от царевица RuBiSCO, последователност от 22 аминокиселини от PSU от царевица RuBiSCO от зрялата част на слетия ген на царевицата се срязва с EcoRI-SphI от 171 Ьр, съответстващ на транзитния пептид от PSU на споменатия ген от слънчоглед RuBiSCO. Получената структура показва заместване на EcoRI-SphI фрагментите и представлява транслационна фузия, транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBiSCO последователност от 22 аминокиселини от зрялата част на царевица RuBiSCO/АгоА гена.
EcoRI-Sall фрагментът се лигира със Sall-SstI фрагмент, съдържащ 3' “nos” последователността, и правия край на Т-ДНК. Полученият EcoRI-SstI фрагмент, включващ “транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBiSCO /последователност от 22 аминокиселини от зрялата част на PSU на царевица RuBiSCO/AroA гена /3' “nos”/ Т-ДНК правия край” замества EcoRI-SstI фрагмента, съдържащ правия край на Т-ДНК от плазмида 150 А 2, съдържащ двойния CaMV промотор. Транскрипционната фузия “двоен CaMV / транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBiSCO/ последователност от 22 аминокиселини от зрялата част на PSU на царевица RuBiSCO/AroA ген/ 3' “nos” във вектора 150 Аа 2 се нарича pRPA-BL 294.
Фузия на транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBiSCO последователност от 22 аминокиселини от PSU на царевица RuBiSCO транзитен пептид от PSU на царевица RuBiSCO/АгоА ген.
Конструираната структура се изрязва с Ncol-Hindlll, като се освобождава АгоА генът. След това се лигира с 1,5 квр Ncol-Hindlll фрагмент, съдържащ слетия “транзитен пептид от PSU от царевица RuBiSCO/AroA ген”. Получената структура показва заместване на Ncol-Hindlll фрагментите и представлява транслационна фузия “транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBiSCO/последователност от 22 аминокиселини от PSU от RuBiSCO от зрялата част от гена на царевицата/транзитен пептид от PSU от царевица RuBiSCO/AroA ген”.
EcoRI-Sall фрагментът се лигира със
Sall-SstI фрагмента, съдържащ 3’ “nos” последователност и правия край на Т-ДНК. Полученият EcoRI-Sstl фрагмент, съдържащ “транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBiSCO последователност от 22 аминокиселини от PSU от RuBiSCO от зрялата част на гена на царевицата/транзитен пептид от PSU от царевица RuBiSCO/AroA ген /3' “nos”/ ТДНК прав край”, е заместен при EcoRI-SstRI фрагмента, съдържащ правия край на Т-ДНК на плазмида 150 А а 2, съдържащ двойния CaMV промотор. Транскрипционната фузия “двоен CaMV/ транзитен пептид от PSU от слънчоглед RuBiSCO/последователност от 22 аминокиселини от PSU от RuBiSCO от зрялата част на гена на царевицата/транзитен пептид от PSU от царевица RuBiSCO/AroA ген/3' “nos” във вектора 150 А а 2 се нарича pRPABL 410. Този плазмид се смила с EcoRI и Sall, с цел да се отдели структурният ген “оптимизиран транзитен пептид - област кодираща зрял EPSPS, делетиран pRPA-BL-410 /вж.фиг. 1/.
- Пример PSU на: този вектор е получен от плазмид pRPA-BL-207/, описан в заявка за ЕР 0337899, който се смила с EcoRI и Hindlll, с цел да се отдели нитрилазкодиращата област, pRPA-BL-207, делетиран / вж.фиг. 1/.
б. Конструиране на химерични гени.
- pRPA-охо-ОЗ: получава се чрез смилане на pRPA-oxo-01 с EcoRI и Sall. Полученият фрагмент, който кодира протеина, се вмъква между сайтовете за EcoRI и Sall, по-долу от двойния CaMV и по-горе от терминатора “nos”.
- pRPA-oxo-04: получава се чрез смилане на pRPA-oxo-02 с EcoRI и Sall.
Полученият фрагмент, кодиращ зрелия протеин, след това се вмъква между сайтовете за EcoRI и Sall, по-долу от двойния CaMV и по-горе от терминатора “nos”.
- pRPA-oxo-05: получава се чрез сми15 лане на pRPA-oxo-01 с EcoRI и Hindlll.
Полученият фрагмент, кодиращ препротеина, след това се вмъква между сайтовете за EcoRI и Hindlll по-долу от двойния PSU и по-горе от терминатора “nos”.
- pRPA-oxo-06: получава се чрез смилане на pRPA-oxo-02 с EcoRI и Hindlll. Полученият фрагмент, кодиращ зрелия протеин, след това се вмъква между сайтовете за EcoRI и Hindlll по-долу от PSU на промо25 тора и терминатора “nos”.
Таблица 1
Схематично представяне на четирите химерични гена.
Идентификация Промотор Област^ кодираща оксалатоксидаза Терминатор
pRPA-oxo-03 dCaMV препротеин nos
pRPA-oxo-04 dCaMV зрял nos
pRPA-oxo-05 PSUHa препротеин nos
pRPA-oxo-06 PSUHa зрял nos
Пример 3. получаване на трансгенетична рапица
а. Трансформиране
Всеки вектор, както е описано по-горе, се вкарва в неонкогенен Agrobacterium tumefaciens щам ЕНА 101 /Hood et al., 1987/, носещ космидий pTVK /Komari et al., 1986/.
Методът за трансформиране на рапица, сорт Westar, най-вече се базира на описаната трансформация от boulter et al. /1990/ при използване на бактериална концентрация от 2,5x10’ на ml/DO 600 nm 1/.
б. Регенерация.
Методът на регенерация се основава найвече на този, описан от Boulter et al. /1990/. Растенията се засаждат на среда на De Block et al. /1989/. След това се пренасят в парник за етапа на разцъфване.
Пример 4. Измерване на резистентността на рапицата към Sclerotinia Sclerotirum.
In vitro:
- листни петури: резистентността се измерва чрез претегляне на масата на три листни петури след растеж в продължение на 11 дни върху среда на Murashige and SKoog /MS/ c хормони, към която е добавено 1 мМ оксалова киселина.
При тези условия се наблюдава, че при листните петури, получени от рапица, модифицирана с един от химеричните гени, pRPAохо-03, pRPA-oxo-04, pRPA-oxo-05 и pRPAохо-06, масата на листните петури нараства чувствително, докато при листните петури, получени от немодифицирана рапица, масата остава непроменена или даже спада.
Удължаване на корените. Резистентността също се измерва in vitro чрез измерване на удължаването на корените след растеж в продължение на два дни във вода, към която се прибавят 5 мМ оксалова киселина. Наблюдава се в този случай, че корените на рапичните растения, модифицирани в един от химеричните гени, pRPA-oxo-03, pRPA-oxo-04, са способни да растат и да увеличават дължината си, докато корените на немодифицирани рапици не показват растеж при тези условия.
In vivo:
Резистентността in vivo се измерва в оранжерия, след заразяване на растенията от рапица, получени от регенерацията, веднага след появата на първите цветове, било чрез поставяне на спори от S.sclerotiorum върху венчелистчетата, при което инфектирането на листата естествено се появява по време на изпадането на листенцата, или чрез директно поставяне на мицел или на импрегнирани с мицел венчелистчета върху листата. Растенията, модифицирани с един от химеричните гени, pRPAохо-03, pRPA-oxo-04, pRPA-oxo-05 и pRPAохо-06, не позволяват на плесента да се развива, и не проявяват никакви симптоми, характерни за гниене, причинено от склеротиниоза, докато немодифицираните рас5 тения скоро биват завладявани от гниене, характерно за развитието на Sclerotinia sclerotiorum.
ОПИСАНИЕ НА ПРИЛОЖЕНАТА 10 ФИГУРА
Метод за получаване на четирите химерични гена от двата структурни гена, pRPAохо-01, и pRPA-xox-02H, Hindlll; B,BstN; Ν, Nhel; Ε, EcoRI; Sc, SacI; S, Sall и X, Xbal.

Claims (8)

  1. Патентни претенции
    1. ДНК последователност, кодираща оксалатоксидаза, която намира приложение за придаване на резистентност на растения към болести, причинени от Sclerotinia sp.
  2. 2. Протеин, оксалатоксидаза, който се използва за придаване на резистентност на растения към болести, причинени от Sclerotinia sp.
  3. 3. Химеричен ген, който включва кодираща ДНК последователност съгласно претенция 1.
  4. 4. Вектор за трансформиране на растения, който включва химеричен ген съгласно претенция 3.
  5. 5. Трансформирана растителна клетка, която съдържа вектор съгласно претенция 4.
  6. 6. Трансформирано растение, получено от клетка съгласно претенция 5.
  7. 7. Растение съгласно претенция 6, което е двусемеделно.
  8. 8. Растение съгласно претенция 7, което е рапица.
BG97042A 1991-03-05 1992-11-03 Production of plants resistant to attacks of sclerotiniasp.by introducing a gene coding for an oxalate oxidase BG61275B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9102874A FR2673644A1 (fr) 1991-03-05 1991-03-05 Sequence adn codant pour une oxalate oxydase et plantes transformees contenant cette sequence et resistantes au sclerotinia.
PCT/FR1992/000195 WO1992015685A1 (fr) 1991-03-05 1992-03-04 Production de plantes resistantes aux attaques de sclerotinia sclerotiorum par introduction d'un gene codant pour une oxalate oxydase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG97042A BG97042A (bg) 1993-12-24
BG61275B1 true BG61275B1 (en) 1997-04-30

Family

ID=9410559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG97042A BG61275B1 (en) 1991-03-05 1992-11-03 Production of plants resistant to attacks of sclerotiniasp.by introducing a gene coding for an oxalate oxidase

Country Status (24)

Country Link
EP (1) EP0531498B1 (bg)
JP (1) JPH05506582A (bg)
KR (1) KR930700665A (bg)
CN (1) CN1051576C (bg)
AT (1) ATE338129T1 (bg)
AU (1) AU660976B2 (bg)
BG (1) BG61275B1 (bg)
BR (1) BR9204788A (bg)
CA (1) CA2082042C (bg)
CZ (1) CZ289623B6 (bg)
DE (1) DE69233653T2 (bg)
DK (1) DK0531498T3 (bg)
EG (1) EG21465A (bg)
ES (1) ES2273329T3 (bg)
FR (1) FR2673644A1 (bg)
HU (1) HUT65677A (bg)
IE (1) IE920691A1 (bg)
IL (1) IL101117A (bg)
MX (1) MX9200917A (bg)
NZ (1) NZ241829A (bg)
PT (1) PT100203B (bg)
UA (1) UA43308C2 (bg)
WO (1) WO1992015685A1 (bg)
ZA (1) ZA921647B (bg)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RO114979B1 (ro) * 1991-02-25 1999-09-30 Ici Plc Oxalat oxidaza avand capacitatea de a degrada acidul oxalic si procedeu pentru obtinerea oxalat oxidazei in plante
WO1994012622A1 (en) * 1992-11-30 1994-06-09 Zeneca Limited Oxalate decarboxylase
ATE221121T1 (de) * 1992-12-07 2002-08-15 Biogemma Fr Verwendung einer dna sequenz, kodierende für ein protein mit der fäligkeit oxalsäure abzubauen, zur genselektion
AUPM379294A0 (en) * 1994-02-10 1994-03-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
ZA986308B (en) * 1997-07-18 1999-11-24 Pioneer Hi Bred Int The induction of stress-related factors in plants.
US6166291A (en) 1997-07-18 2000-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of pathogen resistant plants
AU8919098A (en) * 1997-08-26 1999-03-16 North Carolina State University Fumonosin resistance
FR2844142B1 (fr) 2002-09-11 2007-08-17 Bayer Cropscience Sa Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree
FR2848570B1 (fr) 2002-12-12 2005-04-01 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant
CN100383239C (zh) * 2004-07-21 2008-04-23 华南农业大学 从小麦麸皮中提取草酸氧化酶的方法
AR074941A1 (es) 2009-01-07 2011-02-23 Bayer Cropscience Sa Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion
CA2786001A1 (en) 2009-12-31 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Engineering plant resistance to diseases caused by pathogens
CN103060350A (zh) * 2011-10-21 2013-04-24 华中农业大学 核盘菌草酸脱羧酶基因SsOXDC2及其在大豆抗病改良中的应用
CN103911384B (zh) * 2014-01-21 2016-05-25 江苏大学 一种控制油菜菌核病的基因及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988008450A1 (en) * 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
RO114979B1 (ro) * 1991-02-25 1999-09-30 Ici Plc Oxalat oxidaza avand capacitatea de a degrada acidul oxalic si procedeu pentru obtinerea oxalat oxidazei in plante

Also Published As

Publication number Publication date
FR2673644B1 (bg) 1994-12-02
AU1682092A (en) 1992-10-06
PT100203A (pt) 1993-07-30
DK0531498T3 (da) 2007-01-02
BG97042A (bg) 1993-12-24
CZ289623B6 (cs) 2002-03-13
CA2082042A1 (en) 1992-09-06
WO1992015685A1 (fr) 1992-09-17
IL101117A (en) 2004-09-27
IL101117A0 (en) 1992-11-15
HUT65677A (en) 1994-07-28
EP0531498B1 (fr) 2006-08-30
JPH05506582A (ja) 1993-09-30
KR930700665A (ko) 1993-03-15
DE69233653D1 (de) 2006-10-12
FR2673644A1 (fr) 1992-09-11
CA2082042C (en) 2007-05-29
UA43308C2 (uk) 2001-12-17
CZ336992A3 (en) 1994-01-19
ATE338129T1 (de) 2006-09-15
ZA921647B (en) 1992-11-25
PT100203B (pt) 1999-06-30
DE69233653T2 (de) 2007-10-04
MX9200917A (es) 1992-11-01
HU9203473D0 (en) 1993-01-28
CN1051576C (zh) 2000-04-19
IE920691A1 (en) 1992-09-09
NZ241829A (en) 1994-04-27
BR9204788A (pt) 1993-07-27
ES2273329T3 (es) 2007-05-01
EG21465A (en) 2001-11-28
CN1065683A (zh) 1992-10-28
AU660976B2 (en) 1995-07-13
EP0531498A1 (fr) 1993-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2279524T3 (es) Promotor de un gen especifico de la corteza radicular.
US5376543A (en) Agrobacterium mediated transformation of germinating plant seeds
US9434955B2 (en) Proteins relating to grain shape and leaf shape of rice, coding genes and uses thereof
BG61275B1 (en) Production of plants resistant to attacks of sclerotiniasp.by introducing a gene coding for an oxalate oxidase
JPH06197651A (ja) 耐病原体性トランスジェニック生物およびその生物を作製するのに用いるｄｎａ−トランスファベクターならびにその生物を作製する方法
CN109111514B (zh) 兼抗纹枯病和根腐病的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料
US5658773A (en) Tomato acid invertase gene
HUT58758A (en) New signalsequencies
AU719467B2 (en) Method for regulating cell death
US6235530B1 (en) Production of plants resistant to attacks by sclerotinia sclerotiorum by the introduction of a gene encoding an oxalate oxidase
JPH06500237A (ja) β―１，３―グルカナーゼ活性を有する新規蛋白質をコードする組換えＤＮＡ、このＤＮＡを含む細菌、形質転換植物細胞および植物
US7557264B2 (en) Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use
EP0494215A1 (en) Light-activatable plant promoter
US6664384B1 (en) Duplicated cassava vein mosaic virus enhancers and uses thereof
CN117430679B (zh) 来源于小麦的广谱抗病相关蛋白及其相关生物材料与应用
JP3551443B2 (ja) ウド及び広葉樹のシンナミルアルコ−ルデヒド ロゲナ−ゼ遺伝子及び該遺伝子を導入した広葉樹
CN118256519B (zh) 抗病相关蛋白TaMYB22在调控植物条锈病抗性中的应用
AU769546B2 (en) Method for obtaining transgenic plants expressing a protein with activity producing hydrogen peroxide by transformation by Agrobacterium rhizogenes
US6791009B1 (en) Transgenic plants with enhanced chlorophyll content and salt tolerance
KR940001266B1 (ko) 내빙 단백질이 발현되는 식물체의 제조방법
KR101546448B1 (ko) 상처에 의해 유도되는 ｇＯｓＬＴＰ－３ 프로모터 및 이의 용도