DD294040A5

DD294040A5 - Chimaeren-gen zur verleihung von herbizidresistenz an pflanzen, verfahren zum transformieren von pflanzenzellen und regenerierte transformierte pflanzen

Info

Publication number: DD294040A5
Application number: DD89326857A
Authority: DD
Inventors: Bernard Leroux; Bernard Pelissier; Michel Lebrun
Original assignee: ��`��@��k��
Priority date: 1988-03-23
Filing date: 1989-03-23
Publication date: 1991-09-19
Also published as: BR8901499A; DE68929125D1; KR0145703B1; NZ228458A; EP0337899A1; PH31569A; FR2629098A1; KR890014742A; US5773698A; AU629539B2; EP0894865A3; HUT52158A; CA1314505C; GR3032288T3; KR100218855B1; RO107001B1; JPH029374A; DE68929125T2; DK144689D0; KR19990030697A

Abstract

Das Chimaeren-Gen, das den Pflanzen Resistenz gegenueber einem Herbizid auf der Basis von 3,5-Dihalogen-4-hydroxybenzonitril verleiht, enthaelt mindestens ein diese Herbizidresistenz codierendes Gen, einen fremden Promoter und ggf. einen Signalbereich fuer die Polyadenylierung. Der Promoter stammt aus einem in Pflanzenzellen natuerlich exprimierenden Gen und ist der Promoter des ARN 35S des Blumenkohlmosaikvirus (CamV 35S) oder der Promotor der kleinen Untereinheit (PSU) der * (RubisCO) der Sonnenblume (Helianthus annuus). Das Chimaeren-Gen kann in eine Pflanze transformiert werden und findet somit in der Landwirtschaft Anwendung. Fig. 4

Description

Im folgenden wird untor „Pflanze" Jod .. .nohrzolligo dlfforonilorto Orga Ismus, dor dor Fotosynthese fähig Ist, und untor

„Pflanzonzollo" jodo aus olnor Pflanze »temmondo ZoIIo vorstandon, dlo undlfforonzlortos Qowobo, wie Kallusso odor

Embryonen, odor difforonzlortos Qowobo, wio Pflanzenteile, Pflanzon odor Samen, bilden kann.

Aufgabe der Erfindung war os, din Bedürfnisse nach Erhöhung dor Erfolgschoncen und Verbesserung dor Wirtschaftlichkeit dos bokannton Verfahrens zu bofrlodlgon.

Die Aufgabo wird gomttß Hauptanspruch gelöst, dio Untoronsprücho botroffon bovorzugto Aueführungsformon.

DIo Erfindung botrifft somit oin Chimflron-Πηη zur Vorloihung von Resistenz gogonübor oinom Horbizld auf dor Basis von

3,6-Dihalogon-4-hydroxybonzonitrll an Pflanzon, das mindostons oin dioso Horblzldrosistonz codiorondos Oon, oinon

Fremdpromotor und ggf. oinon Signalboreich für dio Polyadonyliorung onthAlt und das dadurch gokonnzoichnot ist, daß dor

Promotüf aus einem in Pflenzonzollon natürlich oxprlmlorondon Oon stammt und dor Promotor dos ARN 35S doe

Blumenkohlmosaikvirus (CamV 35S) odor dor Promotor dor kloinon Untoroinhoit (PSU) dor Rlbuloso-1,5-blsphosphot·

Carboxylaso-Oxygonaso (RublsCO) dor Sonnonblumo (Holianthus onnuus) ist.

Der Promotor dos orfindungsgomeßon Chlmäron-Gons stammt aus oinom natürlich in Pflanzonzollon oxprlmlorondon Qon, d. h.

entweder einem nichtpflanzlichon Gon, boispiolswoise oinom viralon Qon, wie ARN 35S dos Blumonkohlmosaikvirus (CamV 35S) oder vorzugsweise aus einkolnv odor zwolkelmblrtttrigon Pflanzon, wio insbesondere dor kloinon Untoroinhoit dor Ribuloso-1,5-blsphosphnt-Carboxylase-Oxygonase (RublsCO) dor Sonnonblumo (Hollanthus annuus). Dioso Promotoren können olloin odor in Kombinotion vorwondot worden. DIo Wahl hingt von dor Art dor zu transformierenden Pflanze (ein- odor zwolkoimblttttrig) ab.

So wird vorzugsweise die kleine Untoroinhoit dor RublsCO dor Sonnonblumo zum Trai.sformioron olnor zwoikoimblättrlgon

Pflanze vorwondot.

Jeder dioser Promotoren kann auf folgondo Welso erholton worden:

1. Promotor des ARN 35S dos Blumonkohlmosaikvirus (CamV 35S):

Die Isolierung dieses Promotors wurdo von Odoll ot al. (1985) beschrieben. Ein Klon (pJ D 6-2), dor ungefähr 850 Bosonpnnro von dor Inltlationsstello der Transkription enthält, wurde für dlo beschriebenen Konstruktionen gowählt. Es wurdo oin EcoRI· Hind Ill-Fragmont Isoliert, dio Endon wurdon mit der KlonowPolymoraso frolgologt und in don Voktor pUC 19 (Yonnlsh-Porron ot al., 1985) an der Hincll-Stollo kloniort. Diosor Klon wurdo mit Xba I und Pstl vordaut, das orhaltono Fragmont wurdo mit Phngen-T4-Polymeraso behandelt, um die Endon frolzulogon. Dioses Fragmon; wurdo in pUC 19Cm (Buckloy, 1985), kloniort, mit Smal und Xba I zorschnitton und mit der Klenow-Polymoraso behandelt. Dor so orhaltono Klon wurdo pRPA-BL 145 genannt. Durch Bindon dor mit Klonow-Polymoreso behandelten 3'-ondständigon Acc I-Stollo mit dor mit Klonow-Polymoraso bohandolton EcoR I-Stollo der untor diosom Promotor liogondon Fragmonto, wird oino EcoRI-Stollo rokonstituiort. Dio so orhaltono Soquonz wolst von dor Initiationsstollo dor Transkription aus folgondo Zusammonsotzung auf:

ACACGCTGACAAGCTGACTCAGCTAQAGTCGAATTC

EcoRI

2. Promotor der kleinen Untoroinhoit dor Ribuloso-i.e-bisphosphat-Cerboxylaso-Oxygonase (RubisCO) der Sonnonblumo (Holianthus annuus);

Das Gen, aus dem dieser Promotor stammt, wurde von Waksman et al. (1987) isoliort. Ein EcoR I-Fragmont, das den Promotor dioses Gens enthält, wurdo in mp 18 kloniort, und zwar der 3'-Borolch des Promotors direkt vor dem Poly linker diesos Voktors. Dor Klon wurde dann mit BstXI linearislert und mit Exonukleaso Bal31 behandelt. Das so orhalteno Fragmontgomisch wurdo mit Sal I, dann mit Klonow-Polymoraso behandelt und schließlich mit einer geringen Konzentration an ADN gebundon. Dio nach dieser Manipulation erhaltenen Klono wurdon sequenziert; der untor ihnon, dor dio folgonde Sequonz untorhalb dor vermeintlichen Initiationsstollo der Transkription aufwies, wurde zurückbehalten:

...5' ATTGGATTCS'...

In dio Pst I-Stollo dioses Klone wurde oin Linker CIa I (A T C G A T) oingeführt. Diese CIa I-Stollo wurde mit Klonow-Polynioraso behandelt und mit dor mit Klenow-Polymerase behandelten EcoRI-Stollo dor nach diesem Promotor Mögenden Fragmente gebunden. Auf diese Waise wird eine EcoRI-Stollo rekonstituiert. Dio so orhaltono Sequenz weist von dor vormointlichen Initiationsstelle dor Transkription aus folgonde Zusammonsotzung auf:

ATTGGATTCTCGACCATCGAATTC

EcoRI

Gemäß einer anderen Ausführungsform weist das erfindungsgemäßo Chimären-Gen einon nicht übersetzten Zwischo'.boroich (Linker) zwischen dem codierenden Gen und dem Promotor auf. Dieser Linker kann aus der folgenden Gruppe gewählt worden:

- Der Linker des durch Klonieren modifizierten pUC 19 mit folgender Soquenz:

GAATTCGAGCTCGGTACCCCATGG EcoRI Ncol

- Der nicht übersetzte Boreich der kloinon Untereinheit dor RubisCO von Mais: Dioser Boroich stammt aus dem ADNc, das dom von Lebrun et al. (1987) beschriebenen Gen entspricht.

Es ist ein EcoRI-Ncol-Fragment mit folgender Soquenz:

GAATTCCCAGCAAGCAAGCAGCGAGTAC EcoRI

ATACATACTAGGCAGCCAGGCAGCCATG

Ncol

- Dor nicht üborsotito Geroich dor klolnon Untereinheit dor RublsCO dor Sonnenblume: Diosor Üoroich stemmt aus dom ADNc, das von Waksmon ot Froyssinot (1987) isoliert wurdo. Als solchor wurdo diosor Boroich nicht !solion, or Mögt Immor vor dom Übergangspoptid der RublsCO dor Sonnonblumo und wolst folgondo Soquonz auf:

OAATTCCGAAAOACAAAOATTATCO EcoRI

TAATG Mot

Das orfindungsgomäßo Chlmäron-Gon enthalt ggf, oinon Polyadonyliorungsborolch odor olno Polyodonyliorungsstollo, wie beispielsweise:

1. Die Polyodonyliorungsstollo dos Gens dor Nopolinsynthaso von pTi 37 (Bovan ot al., 1983). Dioso Slollo ist in oinom Mbol-Fragmont mit 260 ßasonpoaron ontholton (Fraloy ot al., 1983, PCT-A-8<1/02913), das mit Klonow-Polymoraso bohondoli · " ' . dio Srna 1-StOlIe von M 13mp 18 kloniort wurdo, um dio OomHI-und EcoRI-Stollon on don 5'· und 3'-Endon einzuführen, /iü BamH I-Stollo wurdo mit Nuklooso von Vigna radlata bohondoli und in dio mit Klonow-Polymoroso von pUC 19 bohandolto Sall-Stollo kloniort. Diosos Fragment enthält jotzt an soinom B'-Endo oino Hlndlll-Stollo, dio on dio am 3'-Endo dos Nltrlloso-Gens liegonde Stollo gebunden wordon kann.

2. Die Polyadonyliorungsstelle dos Gens der klolnon Untoroinhoit dor RubisCO von Mais: Dioso Stollo wurdo In Form oinos Smal-Bglll-Fragmonts mit 640 Basonpnnron dos von Lobrun ot al, (1987) boscnriobonon Gone isoliert. Ein CIaI-Linker (ATCG AT) wurdo auf der Höho der Smal-Stollo eingeführt. Nach dom Schneiden mit CIaI und Auffüllon mit Klonow-Polymerase wurdo dieses Fragmont in pUC 19 kloniort, mit Pst I goschnitton, mit Phagon-T4-Polymerase bohandolt und mit BamHI wiedor geschnitten. Dioso Manipulation ermöglichte es, olno Hindlll-Stollo am 5'-Endo dor Polyadonyliorungsstollo einzuführen. Die folgende Sequenz wurde erhalten:

5¹ AAGCTTGCATOCCCGATGGG CA G..

Hindlll 1/Smol

Gemäß einor anderen Ausführunqsform dor Erfindung onthfllt das Chlmiiron-Gen vorzugsweise zwischen dom Zwischenboden und dom Nitrilaso-Gen einon oin Übergangspeptid codierenden Boroich, wio don Boroich dor kleinen Untereinheit dor RubisCO von Mais odor don Boroich dor kloinen Untoroinhoit dor Sonnonblumo. Dos Üborgangspoptid dionl im natürlichen Gon dazu, dor kloinen Untereinheit der RublsCO don Eintritt in das Stroma der Chloroploston zu ermöglichen. Ef, muß auch dio Nitrilaso in diesem Raum führen, wenn es zwischen dom oben boschriobonen Zwischonb jroich und dom Struktur-Gon dor Nitrilaso eine .ührtist:

1. ( bergangspoptid dor kleinen Unterolnhoit dor RubisCO von Mais: Diesos Fragmont stammt aus ADNc, das dom von Lobrun et al. (1987) beschriebenen Gen entspricht. Es ist ein Ncol-Sphl-Fragmont mit 141 Basonpaaron, dio Ncol-Stollo bedeckt das Initiatorcodon dor Übersetzung und die Sph I-Stolle dio Schnittstelle dos Üborgangspoptids. Das Sph I-Endo Jiosos Fragments wurde mit Phagon-T4-Polymoraeo behandelt und mit dom mit Klenow-Polymerase behandolton Ncol-Ende dos Nitrilaso· Gens gebunden. Auf diese Weise wird eine Sequenz rekonstituiert, mit der eino nicht modifizierte Nitrilast im Stroma der Chloroploston erhalten werden kann.

2. Üborgangspoptid der kleinen Untereinheit dor RubisCO der Sonnenblume: Dieses Fragment 6tammt aus dem von Waksmon und Freysinnet (1987) isolierten ADNc. Diese Sequenz hat ursprünglich keino Sph I-Stello auf dor Höho dor Schnittstelle des Übergangspeptids. Auf dieser Höhe hat die Sequenz folgendo Zusammensetzung:

5' CAATGCATGA-AG 3'

Durch gezielte Mutagenese wird anstelle dos mit * markierten A ein C gesetzt, wodurch eino Sphl-Stolle entsteht. Zur Durchführung dieser Manipulation wurde das Vorfahren von Zollor und Smith (1984) angewandt. Ein EcoRI-Sall-Fragment mit 270Basenpaaren wurde in MI3mp19am4 geklont. Dieser von M13mp19 abgeleitete Vektor weist eine ambor-Mutation im Gen 4 bei der Base 5327 auf und kann sich In Stämmen, dio einen Mutationsunterdrückor dieser Art nicht haben, nicht vermehren. Nach der Reinigung des Einzelstrangs dieses rekombinanton Phagon wurden drei Oligonukleotido in einor einzigen Stufe hybridisiert. Die Sequenz dieser phosphoryliorton Oligonukleotide ist folgende:

Sph I

1:5' GTTCAATGCATGCAGGTGTGGCCAC 3' 2:5' AAGAGTCTGTCCATCAC 3' 3:5' GTAAAACOACGGCCAGT 3'

Diese Oligonukleotide ermöglichen folgendes:

1. Die Mutation des Fragments auf der Höhe dor Schnittstelle des Übergangspeptids,

2. die Korrektur der amber-Mutation,

3. den Aufbruch dor Sequenz vor dem mutierten Fragment.

Nach der gleichzeitigen Einwirkung von Klonow-Polymoraso in Qogonwart dor vier Nuklootldo und dor Phagon-T4-Llgoso wird das erhaltene Gemisch in don Stamm HB 2154 transformiert und auf einen HB 2161 -Teppich ousgobroltot (Cortor ot öl., 1985). Untor don orhaltonon Klonon wordon dio, dio olno zusätzliche Sph I-Stnllo oufwoison, soquonzlort, um ihre Struktur zu üborprüfon. Einer von Ihnen wurdo für dio Herstellung dor Chlmäron-Gono vorwondot. Auf dor Höho dor Schnittstelle dos Üborgongepoptids hat dio Soquonz folgondo Zusammensetzung:

5' CAATQCATGC

Oiosoe Fragment wird auf glolcho Woise vorwondot wio das das Üborgangspoptid codiorondo Fragmont dor kloinon Unteroinhoit

dor RubisCO von Mais.

Die Zusammensetzung dor Chlmäron-Geno wird gomttß dor Schemata dor Fig. 1 bis 4 mit don obon boschriobonon Elomonton

durchgeführt. Die so hergestellten verschiedenen Gone wurdon in einer oder zwoi Art(on) von Vektoron oingobracht, Jodor

Konstruktion wurdo oino Nummer zugowiosen. Dio so horgostellton vorschledonon Vektoron sind in Tabollo I

zusammengefaßt:

Tabelle I Zusammenbau der vorschiodonon ADN-T, dio dio Chimäron-Gono für dio Bromoxynll-Rosistonz onthalton.

Identi

Vektor

Promotor

PSU dor

Verblndungsboroich

6'

+

Üborgangs

Son-

+

BR-

Nos-

PSU-

fizie

Sonnon-

Son

poptid

non-

XN

poly-

Mais

rung

blumo

s' non-

MpIs blume

+

A

poly-

pRPA-BL

Mais Linkor blumo

+

A

CamV

+

35 S

+

f.

203

150A1

+

204

150A1

+

207

150A1

+

208

150A1

+

217

150A1

+

218

150A1

+

221

150A1

+

222

150A1

+

235

142

+

236

142

+

237

142

+

238

142

+

249

142

+

250

142

+

251

142

+

252

142

447

142

Als Vektoren wurden verwendet:

Die verschiedenen Chimären-Konstruktionen, die zu don in den Fig. 1 bis 4 dargestellten Vektoren pRPA-BL-142 und pRPA-BL-150Aalpha-1 geführt haben, wurdon in die Pflanzen mit dem Übertragungssystem von Agrobacterium tumofacions eingeführt. Die zu diesem Zweck gebildeten Übortragungsvektoren habon folgende Morkmale:

- einen aus pBR 322 stammenden Roplikations- und Übergangsboroich,

- ein bakterielles Selektions-Gen, beispielsweise die Resistenz gegenüber Gentamycin,

- eine aus dom Lambda-Phagen stammende COS-Stelle,

- die boiden rechten und linken Ränder des ADN-T von pTiA6,

- ggf. ein eukaryontisches Solektions-Gen, wie dio Resistenz gegenüber Kanamycin,

- ggf. ein Fragment das des Komplement-Gen Lac-Alpha von pUC 18 enthält.

Aufbau von pRPA-BL-142 (Flg. 1 bis 4): Die rechten und linken Ränder (Fig. 1) dos linken ADN-T von ρΤίΑβ wurdon zuoist unterkloniert. Rechter Rand:

Ein BamHI-EcoRI-Fragment von 13774 bis 16202 gemäß dem Numerierungssystem von Barker et al. (1983) wurde in pGEM 1 (Promega Biotech) an den zu pBL-17 führenden, entsprechenden Stellen geklont. Dieses Plasmid wurde mit Nru I (14276 und 14475) und mit EcoR I (16202) verdaut und mit Klenow-Polymeraso behandelt. Die Bindung der gefüllten Nru I- und EcoR I-Stellen führt zu einer EcoR I-Stelle bei 14276 und zum Plasmid pBL-19.

Linker Rand:

Ein Hindlll-Fragment von 602 bis 3390 gemäß dem System von Barker et al. (1983) wurde In die pGEM 1 entsprechende Stelle, die zu pBL-21 führt, geklont, wobei der linke Rand gegenüber dem Poly linker ist. Dieses Plasmid wurde mit Acc 1(1161 und 2687) verdaut und mit Klenow-Poiymerase behandelt, bevor es gebunden wurde. Das entstandene Plasmid, pBL-26, enthält ein Fragment von 602 bis 1161, das zwischen die Hind III· und Xbal-Stellon eingobaut wurdo.

Herstellung des ADN-T:

Durch Einführen dos EcoR 1-BamH 1-FrBOmOnIe von pDL-10 In dlo entsprechenden Stollon von pDL-26 wurdo oln ADN-T aufgebaut, das dio rochton und linken RÜndor von pTIAG In ihror natürlichen Orlontlorung aufwolet. Das orhaltono Plasmid wurdo mit pBL-70 bezeichnet.

Einführen des ADN-T In pBR 322 (Flg.2):

Nach dom Schnitt des pBL-70 mit Hindill wurdo dioso Stolle mit Klonow-Polymoroso bohandolt und dos Plasmid noch olnmnl mit EcoRI geschnitten. Das erhaltono Fragmont wurdo in mit Prull- EcoRI goschnlttonos pBR 322 goklont. Dor entstandono Klon wurde mit pRPA-BL-112 bezeichnet.

Klonleren einet Gens mit Resistenz gegenüber Qentamycln (FIg,3):

Das Gen mit Resistonz gogünübor Gontomycin wurde von pPH 1J11 (Hirsh und Btingor, 1984) erhalten. Diosos Plasmid wurdo mit DnmHI und Hind III verdaut, dio Gesamtmenge dor Fragmente wurdo mit don gleichen Enzymen geschnitten in pUC 19 kloniort. Nach dor Soloktion auf Ampicillin und Gontamycln wurdon mehrere Klono mit olnom Fragmont mit 24S0 Basonpaaron !solion. Der für die woiteren Manipulationen vorwondote Klon wurde pRPA-BL-133 benannt. An dor BamHI-Stollo diosos Klons wurdo ein Bglll-Fragment mit 1600 Basonpaaren, das aus pHC 70 (Hohn und Collins, 1980) isoliert wurde und die COS-Stelle dos Phagon Lambda enthielt, eingeführt. Diesos Fragment, das in beiden Orientierungen eingeführt wurdo, führte zu don boidon Klonon pRPA-BL-134 und pRPA-BL-135.

Herstellung eines Intogratlonsvoktors (Flg.3):

Um in einem gleichen Voktor dio vorschiodonen, oben boschriobonon Toilo zu vereinen, wurdon dio Plosmide pRPA-BL-134 und pRPA-BL-135 mit Sma I und Hind III verdaut; dor Einschub, der das Rosistonz-Gon für Gentamycin und dio COS-Stello dos Phagon Lambda enthielt, wurde mit Klonow-Polymoraso bohandolt. Das Plasmid pRPA-BL-112 wurdo mit Pst I und EcoR I verdaut und mit Phagon-T4-Polymoraso bohandolt. Dio boidon Frogmonto wurdon vorbundon, es wurdon Klono erhalten, dio zugleich das Resistenz-Gon für Gontamycin, die COS Stolle, ADN-T und don Roplikationsboroich von pBR 322 onthiolton. Das Plasmid pRPA-BL-WiührtezupRPA-BL-MiundpRPA-BL-^.pRPA-BL-ISSführtezupRPA-BL-MSundpRPABL-W.pRPA-BL-^wurdozur Einführung der Chimären-Gene in die zu transformierenden Pflanzen vorwendot. Mit diesem Vektor wurdo oine Konstruktion erhalten, die ein Marker-Gen NOS-NPTII-NOS (Fig.4) enthielt. Das Plasmid pRPA-BL-142 wurdo mit Xba I verdaut, die Endon wurdon durch Einwirkon dor Nukloaso von Vigria radiata verkürzt. Außerdem wurdo pEND4 K (Kloo et al., 1985) mit EcoR I verdaut und mit Klenow-Polymerase bohandolt. Es wurde oin Fragmont mit 1600 Basonpaaron isoliert, das das Chimäron-Gen mit dor Resistonz gegenüber Kanamycin enthielt und das In pRPA-BL-142 eingeführt wurdo. Das Ergebnis einor dieser Fusionon wurdo pRPA-BL-150 A bonannt und für die weitoron Manipulationen verwendet. Um das Klonioron in dioson Vektor zu erleichtern, wurde an dor mit Nukleaso von Vigna radiata behandelten BamHI-Stolle ein mit Phagen-T4-Polymerase behandeltes Hacll-Fragment eingeführt, das das aus pUC 18 isolierte Komplomont-Gon Lac-Alpha enthielt (Yannlsh-Porron et al., 1985). Die boiden erhaltenen Vektoren wurden pRPA-BL-ISOAalpha-1 und pRPA-BL-ISOAalpha-2 bonannt. pRPA-BL-ISOAalpha-1 dionte als Grundlage zur Einführung der Gene in die Pflanzen.

Verwendung von pRPA-BL-142 und pRPA-BL-150Aalpha-1

Diese Vektoren könnon sich nicht allein in Agrobacterium halten. Um sich halten zu können, müssen sie durch einfache Rekombination in ein in diesem Bakterium vorhandenes Plasmid integriert worden. Das kann übor eines der Fragmente erfolgen, wie die Stelle, die sich auf Cosmiden, wie pVK 102, oder anderon befindet, odor das pBR 322-Fragmont für Plasmide, die solche Sequenzen aufweisen. Das ist der Fall beim Plasmid Ti dos Stammes GV3850 (Zambryski et al., 1983), der auch ein Wirt für pRPA-BL-142 und pRPA-BL-150Aalpha-1 ist. Unter Vorwondung des Replikationsberoiches von pBR 322 wurden diese Plasmido in Agrobacterium über das von Ditto et al. (1980) boschriobono dreiteilige System transferiert.

Transformation J<is Pflanzenmaterial»

Die erfindungsgomäßen Chimören-Geno wurdon, um ihre Wirksamkeit zu untersuchen, In Pflanzenmaterial transferiert:

A. Transformationsverfahren

1. Tabak

Der Vektor wurde in den nicht onkogenon Agrobacterium-Stamm EHA101 (Hood et al., 1987), der das Cosmid pTVK 291 (Komari et al., 1986) enthält, eingeführt. Das Transformationsverfahren beruht auf dom Verfahren von Horsh et al. (1985); Industrietabak PBD6 (aus SEITA, Frankreich) wird wie folgt regeneriert: Es worden Blattpflänzlinge auf einem Grundmedium gemäß Murashigo und Skoog (MS) mit 30g/l Saccharose gezogen. Die Blattpflänzlinge werden in Glashäusern oder in vitro kultivierton Pflanzen entnommen und gemäß dem Verfahron dor Blattscheiben (Science 1985, Bd. 227, S. 1229-1231) in drei aufeinanderfolgenden Stufen transformiert.

In dor erston Stufe wird das Wachsen von Trieben auf einem MS-Medium, das 30g Saccharose und 0,05 mg/1 Naphthalinessigsäure (ANA) und 2mg/16-Bonzylaminopurin (BAP) enthält, während 15 Tagon induziert.

In der zweiten Stufe entwickeln sich die im Verlauf der erston Stufe gebildeten Triebe. In dieser Stufe wird während 10 Tagen ein MS-Medium vorwendet, das 30g/l Saccharose aber keine Hormone enthält.

In der dritten Stufe bilden die einzeln entnommenen Triebe Wurzeln. Das Bewurzelungsmediun ι enthält die auf die Hälfte verdünnten Salze, Vitamine und Zucker, jedoch keine Hormone. Nach 10 bis 15 Tagen werdon die Triebe mit Wurzeln in die Erde gesetzt.

Bestimmung des Hormongleichgewichte

Die optimale Regenerierungsfrequenz wurde durch Untersuchen von 25 Hormongleichgewichten bestimmt (BAP: 0,2 - 0,5-1 1,5 - 2 und ANA: 0-0,5 - 0,5). Die Bestimmungen wurden mit 1,5 und 2 mg/l BAP und 0,05 und 0,1 mg/l ANA durchgeführt. Das Gemisch 0,05mg/l ANA und 2mg/l BAP wurde schließlich verwendet.

2. Andere zwelkolmblattrlgo PfUnzon Olo In Tobollo III angogobonon zwoikoimblHttrigon P(Ii nzon wurden untor Vorwondung dos onkugonon Agrobactorium-Stomms A281, der das mit dom ontsprochondon Voktor aesoziiorto Cosrnid pTVK 21 trägt, transformiert, und zwar untor Vorwondung dos in Tabelle III angogobonon Pflanzonmatoriois.

B. Bestimmung der Reilitonz gegenüber Bromoxynil

1. Tabak

Die Resistenz wurde in vitro durch Wochsonlosson von Kallusson in Qogonwart von Dromoxynil (20 mg/l, in Form von Octoat) und in vivo durch Bestäuben von Blättern mit Bromoxynil odor loxynll in Doson, dlo zehnmal größer sind als dio, dio für olno Froihndbehandlung ompfohlon wird, bestimmt. DIo Ergebnisse sind in dor Tobollo Il angogobon.

2. Andere zwelkelmbltttrlge Pflanzen

Die Resistenz wurde in vitro durch Wachsenlaseon von Kallussen In Gogonwort von 10mg Bromoxynil (in Form dos Octoats) jo 1 Modium bestimmt. In ation Fällen sind die Ergebnisse positiv (Ttibollo III).

Tabelle Il

Resistenz des transformierten Tabaks gegonübor Bromoxynil

Identifizierung	Rosistonz dos Tabaks
pRPA-BL	Kallus Pflanzon
203	+ +
204	+ +
207	+ +
208	+ +
217	+ +
218	+ +
221	+ +
222	+ +
235	+ +
236	+ +
237	+ +
238	+ +
249	+ +
250	+ +
251	+ +
252	+ +

Tabelle III

Resistenz gegenüber Bromoxynil verschiedener zwoikeimblättrigor Pflanzon

Pflanzon · Pflanzen- pRPA-BL

material 203 235

Licoporsicom esculentum	Hypokotyl
Solanumtuberosum	Knolle
Glycine max	Hypokotyl
Betavulgaris	Wurzel
Helianthusannuus	Hypokotyl
Pisumsativum	Zwischonknoten
Brassica campestris oleacera	Hypokotyl
Daucuscarota	Wurzel
Phaseolusvulgaris	Hypokotyl

Claims

1. Chimären-Gen zur Verleihung von Roslstonz gogonübor einem Horbizid auf dor Basis von 3,6-Dihnlogon-4-hydroxybonzonitril an Pflanzon mit mindostons oinom dioso Horbizldroslstonz codierondon Gen, oinom Fromdpromotor und ggf. olnom Signalboroich für dio Polyadonyliorung, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor aus oinom in Pflanzonzollon natürlich oxprimiorondon Gen stammt und dor Promotor dos ARN 35S dos Blumonkohlinosalkvlrus (CnmV 35S) odor dor Promotor dor kloinon Untereinheit (PSU) dor Ribuloso-I.B-blsphosphot-Carboxylaso-Oxygonoso (RubisCO) dor Sonnenblume (Holionthus annuus) ist.

2. Chimäron-Gon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß os oinon nicht üborsetzton Zwischenboden (Linker) zwischen dem Promotor und dom die Horbizidreslstenz codiorondon Gen enthält, dor der nicht üborsotzto Borolch dos durch Klonloron modifiziorton pUC 19, dor nicht übersetzte Bereich der kloinon Untoroinhoit dor RubisCO dos Maisos odor der nicht üborsotzto Bereich der kleinen Untereinheit der RubisCO der Sonnenblume ist.

3. Chimären-Gen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß os außordom zwisclion dom Zwischenbereich und dom dio Herbizidresistenz codiorondon Bereich oinon codiorondon Boroich für ein Übergangspoptid enthält, das das Protein in dio Chlcroplaston dor zu transformiorondon Pflanzon einschleusen kann.

4. Chimären-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß dor das Übergangspoptid codierende Boroich dor Boreich dor kloinon Untoroinhoit dor RubisCO des Maisos ist.

5. Chimären-Gen nach einem dor Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß dor das Üborgangspeptidcodiorondo Boroich dor der kloinon Untereinheit dor RubisCO dor Sonnonblumo ist.

6. Chimären-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß dor Polyadenylierungsbereich aus dem Gen dor Nopolin-Synthase stammt.

7. Chimären-Gon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzelchnr t, daß dor Polyadenylierungsbereich aus dem Gen der kleinen Untereinheit der RubisCO des Maisos stammt.

8. Chimären-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen die Resistenz gegenüber Bromoxynil oder loxynil oder eines ihrer Salze oder Ester codiert.

9. Vektor zum Transformieren von Pflanzen in gegenüber einem Herbizid auf der Basis von 3,5-Dihalogen-4-hydroxybenzonitril resistente Pflanzen, gekennzeichnet durch ein Chimären-Gon nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Vektor nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch ein Plasmid.

11. Mikroorganismus, gekennzeichnet durch ein Chimären-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

12. Pflanzenzelle mit einem Resistenzgen gegenüber einem Herbizid auf der Basis von 3,5-Dihalogen-4-hydroxybenzonitril, erhältlich durch Integration des Gons nach oinom der Ansprüche 1 bis 8.

13. Transformierte Pflanze oder transformierter Pflanzenteil, erhältlich durch Regenerierung aus Pflanzenzellen nach Anspruch 12.

14. Samen von transformierten Pflanzen, erhältlich aus Pflanzen nach Anspruch 13.

15. Verfahren zur selektiven Unkrautvernichtung mit einem Herbizid auf der Basis von 3,5-Dihalogen-4-hydroxybenzonitril, dadurch gekennzeichnet, daß das Herbizid auf eine transformierte Pflanze nach einem der Ansprüche 13 oder 14 aufgebracht wird.

16. Verwendung des Chimären-Gens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 als Selektionsmarker von Pflanzenzellen, Kallussen, Pflanzenteilen oder Pflanzen.

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Die Erfindung betrifft ein neues Chimären-Gen, das Pflanzen Roslstenz gegenüber einem Horbizid auf der Basis von 3,5-Dihalogen-4-hydroxybonzonitril verleiht, ein Verfahren zum Transformieren von Pilanzenzollon mit diosom Gen und dio aus diesen Zellen regenerierten transformierton Pflanzen.

Aus der EP-A-229042 ist bekannt, Pflanzen Resistenz gegenüber einem Horbizid dor obon angogobenon Art, insbesondere 3,5-Dibrom-4-hydroxybenzonitril oder Bromoxynil, zu verloihon, und zwar durch Einführen in das Pflanzengenom einos Gens, das eine spezifische Nitrilase zum Abbau dieser Herbizide codiert. Obwohl dieses Verfahren interessante Ergebnisse gibt, muß es noch verbessert werden, um seine Erfolgschancen zu erhöhen und seine Wirtschaftlichkeit zu verbessern, insbesondere was das Expressionsniveau in den Pflanzen und folglich die Qualität der Resistenz dor Pflanzen gegenüber diison Herbiziden betrifft.