DE3810286C2

DE3810286C2 -

Info

Publication number: DE3810286C2
Application number: DE3810286A
Authority: DE
Inventors: Angelo Dr. Spena; Thomas Dipl.-Biol. Schmuelling; Francesco Prof. Dr. Salamini; Joseph St. Prof. Dr. 5000 Koeln De Schell
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1988-03-25
Filing date: 1988-03-25
Publication date: 1990-07-05
Also published as: EP0362349A1; DE68925258D1; ES2083391T3; EP0334383A2; WO1989009262A3; EP0334383A3; DE3810286A1; BR8906478A; HU892098D0; AU633484B2; FI895626A0; ZA892206B; ATE132188T1; WO1989009262A2; EP0362349B1; HUT52159A; GR3019435T3; IL89725A0; DE68925258T2; AU3358989A

Description

Die Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit gegenüber der entsprechenden natürlichen Pflanze modifizierter Physiologie, Morphologie und modifiziertem Hormonmetabolismus, Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen und Gewebekulturen, enthaltend Zellen oder Organe dieser Pflanzen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der transgenen Pflanze zur Züch tung von Pflanzen mit veränderten biochemischen physiologi schen, entwicklungsphysiologischen und morphologischen Merkma len sowie die Verwendung der transgenen Pflanze oder Gewebekul turen davon zur Herstellung von sekundären Pflanzenprodukten.

In vielen Fällen der Bakterien-induzierten Phytopathogenese spielt die Hormonbiosynthese bei der Wechselwirkung zwischen Pflanze und Bakterien eine wichtige Rolle. Ein Beispiel dafür ist Agrobakterium tumefaciens, das äthiologische Agens von Wurzelhalsgallen. Diese Pflanzenerkrankung wird durch eine veränderte Hormonbiosynthese in den infizierten Pflanzenzellen hervorgerufen. Bei der Infektion werden die Pflanzenzellen transformiert. Dies geschieht durch Insertion eines DNA- Fragments, der "T-DNA", in das Genom der Pflanzenzelle und anschließende Expression. Dadurch wird der Hormonmetabolismus der Pflanzenzelle verändert und das unkontrollierte Tumor wachstum induziert.

Auch bei der Pathogenese der hr("hairy-root")-Krankheit ist eine Transformation einzelner Zellen der Pflanze das erste Er eignis. Die hr-Krankheit wird durch Integration von DNA-Frag menten des R _i-Plasmids von Agrobakterium rhizogenes in das Genom der betroffenen Pflanzenzelle hervorgerufen. Die von Agrobakterium tumefaciens verursachten Wurzelhalsgallen sind chimere Gewebe, da die durch die T-DNA induzierte Biosynthese von Auxinen (IAA) und Cytokininen (IPT) sowohl das Wachstum transformierter als auch das Wachstum nicht-transformierter Zellen fördert. Dagegen bestehen die durch Agrobakterium rhi zogenes am Infektionsort induzierten Wurzeln nur aus transfor mierten Zellen. Dementsprechend wurde die Auffassung vertre ten, daß die Produkte der auf der in das Pflanzengenom integrierten DNA des R _i-Plasmids enthaltenen rol-Gene haupt sächlich, wenn nicht sogar ausschließlich, in transformierten Zellen wirken und somit diese Gene nicht direkt an der Synthese von transportablen Wachstumsfaktoren beteiligt sind.

Bekannt sind vier rol-Gene, nämlich das rolA-, rolB-, rolC- und rolD-Gen. Die rolA-, rolB- und rolC-Loci bzw. -Gene ent sprechen den offenen Leserastern 10, 11 und 12 der T _L-DNA des R _i-Plasmids. Eine genauere Beschreibung der Loci findet sich in Spena et al., EMBO J. 6 (1987), Seite 3891. Die Sequenz der T _L-DNA von Agrobakterium rhizogenes wurde veröffentlicht von Slightom et al., J. Biol. Chem., 261 (1986), S. 108. Der binäre Vektor pPCV002 wurde von Koncz und Schell in Mol. Gen. Genet. 204 (1986), S. 383, beschrieben.

Das hr-Syndrom tritt bei Pflanzen auf, die aus Ri-transfor mierten Wurzeln regeneriert worden sind. Die charakterisieren den Merkmale dieses Syndroms sind zusätzliches Wurzelwachstum, hohe Wachstumsgeschwindigkeit von Wurzeln in hormonfreien Kulturmedien, verminderte Apikaldominanz sowohl in Stengeln als auch in Wurzeln, veränderte Blatt- und Blütenmorphologie, plagiotropes Wurzelwachstum (d.h. veränderter Geotropismus) und reduzierte Fertilität. Das Entstehen des voll ausgebilde ten hr-Syndroms ist korreliert mit der Expression der rolA-, rolB- und rolC-Loci bzw. Gene, deren Genprodukte eine synergistische Aktivität bei der Verursachung der Wurzelbil dung haben; Spena et al., a.a.O.

Spena et al. beschreiben jedoch lediglich die Wirkung von allen drei Loci, von einzelnen oder von Unterkombinationen der Loci auf die Induktion der Wurzelbildung am Infektionsort in fizierter Kalanchoe- oder Tabak-Pflanzen. Spena et al. be schrieben dagegen keine besonderen biologischen Wirkungen des rolA-, rolB- oder rolC-Locus oder bestimmter Kombinationen dieser Loci auf vollständige transgene Pflanzen, in denen jede Zelle und nicht nur die am Infektionsort vorliegende Zelle diese Loci oder Kombinationen davon enthält. Auch die Auswir kungen der Veränderung von Promotoren bei Verwendung einzelner rol-Gene oder einer Kombination von mehr als einem rol-Gen wurden nicht an vollständig transgenen Pflanzen untersucht.

Aus Oono et al., Jpn. J. Genet, 62 (1987), 501 sind transgene Tabakpflanzen bekannt, die ein rolC-Gen unter der Kontrolle seines natürlichen Promotors enthalten und dadurch zwergwüchsiger sind als die Wildtyp-Pflanzen.

Im Bereich der Zierpflanzenzüchtung besteht ein großes Bedürf nis für ausgeprägt zwergwüchsige Pflanzen, für Pflanzen, deren Blütezeit regulierbar ist, und für Pflanzen, die auch bei Haltung in Blumenvasen eine lange Lebenszeit aufweisen, also eine verzö gerte Seneszenz haben. Ferner besteht ein Bedürfnis nach Pflanzen mit einem verbesserten Wurzelsystem, die auch unter schwierigen Standortbedingungen gut wachsen. Derartige physio logische und morphologische Eigenschaften konnten bisher lediglich durch chemische Behandlung von Pflanzen erzielt werden.

Für den Anbau im Gewächshaus sind ausgeprägt zwergwüchsige Pflanzen von besonderem Interesse. Solche Pflanzenmorphologien wurden seit her neben der Verwendung von chemischen Wirkstoffen im wesent lichen durch eine physikalische Beeinträchtigung des Pflanzen wachstums erzielt.

Pflanzen, die zur Züchtung von Pflanzen mit den genannten gewünschten Eigenschaften geeignet sind, standen bisher nur in beschränktem Umfang zur Verfügung.

Ein besonderes Problem kann bei der Selektion von neu gezüchteten Pflanzen aufgrund der Fertilität beider Kreuzungs partner auftreten.

Daneben werden pflanzliche Gewebekulturen zur Herstellung von sekundären Pflanzenprodukten verwendet. Die dabei erzielten Ausbeuten sind jedoch noch nicht zufriedenstellend.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Pflanzen bereitzustellen, die modifizierte physiologische und morpholo gische Eigenschaften haben, und die zur Züchtung neuartiger Pflanzen mit veränderten phaenotypischen Merkmalen und zur Herstellung davon abgeleiteten Gewebekulturen geeignet sind. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zu grunde, Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen bereitzu stellen.

Die Lösung der vorstehenden Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Somit betrifft die Erfindung transgene Pflanzen mit modifi zierter Physiologie, Morphologie und modifiziertem Hormonmeta bolismus, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolA- Gens, des rolB-Gens, des rolC-Gens, des rolA- und rolC-Gens, des rolB- und rolC-Gens oder des rolA- und rolB-Gens der T _L- DNA des R _i-Plasmids aus Agrobakterium rhizogenes und/oder des codierenden Bereichs des IPT (Isopentenyladenosin)-Gens der T- DNA des T _i-Plasmids aus Agrobakterium tumefaciens enthält, wobei die codierenden Bereiche unter der Kontrolle ihres natürlichen oder eines heterologen Promotors stehen, mit Ausnahme des codierenden Bereichs des rolC-Gens, der, sofern er nicht in Kombination mit einem anderen codierenden Bereich im Genom vorliegt, unter der Kontrolle eines heterologen Promotors steht, und die gegebenenfalls zusätzlich ein selektierbares Markergen enthält, wobei die codierenden Bereiche und das Markergen exprimiert werden.

Im wesentlichen beruht die Erfindung auf der Erkennung neuer Wirkungen der rolA-, rolB-, und rolC-Loci bzw. -Gene in trans genen Pflanzen. Dazu gehören die folgenden Wirkungen:

a) bei der getrennten Expression der rol-Gene in transgenen Pflanzen entstehen spezifische und unterscheidbare morphologische Veränderungen, die darauf hinweisen, daß diese Gene unterschiedliche biologische Ziele haben;
b) bei der Expression von chimeren Genen, in denen der codierende Bereich der rolB- oder rolC-Gene durch den CaMV ("Cauliflower Mosaic Virus) 35S-Promotor gesteuert wird, werden in den transgenen Pflanzen neuartige morphologische Veränderungen hervorgerufen;
c) durch die rol-Gene induzierte Wurzeln sind immer transformiert; und
d) durch Kombination des rolC-Gens mit dem rolB-Gen oder dem rolA-Gen oder durch erhöhte Expression des rolC-Gens wird das beste Wurzelwachstum erzielt.

Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zeigen, daß die rol- Genprodukte entweder unterschiedliche Ziele haben oder in un terschiedlicher Weise dasselbe Ziel beeinflussen, das eine Rolle bei der Steuerung der Pflanzenentwicklung spielt. Ferner zeigen die Ergebnisse, daß die Regulation der Expression die ser Gene wesentlich für die Entstehung der morphologischen Veränderungen der transgenen Pflanzen ist. Jedes dieser drei rol-Gene ist bereits allein in der Lage die Wurzelbildung z. B. in Tabak hervorzurufen. Eine höhere Wurzelhäufigkeit und ein stärkeres Wurzelwachstum wird jedoch durch die Aktivität mehr als eines einzelnen rol-Gens erzielt.

Die erfindungsgemäßen Pflanzen haben gegenüber der Ausbildung des vollen hr-Syndroms durch die kombinierte Expression der codierenden Bereiche der rolA-, rolB- und rolC-Gene nur ein zelne, jeweils erwünschte Merkmale bzw. durch die Änderung der Genregulation neue und/oder verstärkte phänotypische Merkmale.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen sind ausgeprägt zwergwüchsig, haben eine veränderte Blütenperiode, eine verzögerte Seneszenz, ein verändertes Wurzelsystem, z.B. können sie ein plagiotropes Wurzelwachstum (dicht unter der Oberfläche) auf weisen, sie haben eine veränderte Fertilität, eine veränderte Anzahl von Blüten und/oder eine veränderte Blütengröße. Zur Erzielung dieser Eigenschaften der transgenen Pflanzen werden erfindungsgemäß die obengenannten besonderen Kombinationen der codierenden Bereiche der rolA-, rolB- oder rolC-Gene eingesetzt. Ferner lassen sich die erfindungsgemäßen transge nen Pflanzen durch Verwendung des codierenden Bereichs des IPT-Gens allein oder in Kombination mit einem der rol-Gene herstellen.

Erfindungsgemäße Pflanzen mit erhöhtem und/oder verändertem Wurzelwachstum haben unter schwierigen in der Natur vorkommen den Wachstumsbedingungen einen Selektionsvorteil gegenüber vielen natürlichen Pflanzen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der heterologe Promotor der HSP ("Heat Shock Promotor")-70-Promotor von Drosophila melanogaster.

Der HSP-70-Promotor von Drosophila melanogaster ist beschrie ben in Spena et al., EMBO J. 4 (1985), S. 2739.

In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform ist der heterologe Promotor ein starker konstitutiver Promotor.

In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform ist der starke konstitutive Promotor der CaMV35S-Promotor.

In einer weiteren erfindungsgemäß besonders bevorzugten Aus führungsform enthält die transgene Pflanze in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens der T _L-DNA des R _i-Plasmids aus Agrobakterium rhizogenes, der unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors steht, vorzugsweise unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors. Sofern der CaMV35S-Promotor zur Steuerung des rolC-Gens verwendet wird, sind die entspre chenden transgenen Pflanzen dominant männlich-steril, weiblich-fertil und weisen einen verlängerten Lebenszyklus bzw. eine verzögerte Seneszenz auf.

Mit Hilfe dominant männlich-steriler Pflanzen läßt sich eine wirtschaftlichere Herstellung von Hybridsaatgut erzielen. Selbst, wenn dabei die weibliche Fertilität leicht reduziert sein kannt, wird es dem Pflanzenzüchter ermöglicht, eine aus reichende Menge von Hybridsaatgut herzustellen, so daß sich damit die Eigenschaften der Hybridpopulation bestimmen lassen. Der wesentliche Vorteil dominant männlich-steriler Pflanzen ist, daß bei Kreuzungen zwischen verschiedenen Sorten keine Emaskulation mehr erforderlich ist. Falls die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung ferner ein Herbizid- Resistenzgen enthalten, läßt sich eine reine Population männlich-steriler Elterpflanzen züchten, denn aufgrund der kombinierten Vererbung der männlichen Sterilität und der Herbizidresistenz kann in der Nachkommenschaft einer Kreuzung zwischen männlich-sterilen und männlich-fertilen Pflanzen durch Herbizidbehandlung die männlich-fertile Nachkommenschaft eliminiert werden.

Ein Beispiel einer erfindungsgemäßen dominant männlich-steri len transgenen Pflanze ist eine Tabakpflanze, die das chimere CaMV35S-rolC-Gen enthält.

Diese erfindungsgemäße Pflanze ist ausgeprägt zwergwüchsig und hat eine reduzierte Apikaldominanz. Sie hat auch einen verlängerten Lebenszyklus und eine verlängerte Blüh- und Knospungsperiode bzw. eine verzögerte Seneszenz. Ihre Blüten sind kleiner als die der Wildtyp-Pflanze. Vorteilhafterweise werden diese Merk male an die nächste Pflanzengeneration weitergegeben. Bei der Bestäubung der erfindungsgemäßen transgenen Tabakpflanze CaMVCl-I mit den vorstehend genannten Eigenschaften mit einer Wildtyp-Pflanze (SR1) wurden 23 Pflanzen mit dem transgenen Phänotyp und 62 Pflanzen mit dem Wildtyp-Phänotyp erhalten. In einem weiteren Experiment wurden sogar 50% Pflanzen mit transgenem Phänotyp erhalten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die transgene Pflanze den codierenden Bereich des IPT-Gens unter der Kontrollle des HSP-70-Promotors von Drosophila melanogaster.

Die Expression von codierenden Bereichen unter der Kontrolle eines 457 bp langen DNA-Fragments des hsp70-Gens von Drosophila melanogaster, das den Promotor und 199 bp der nicht translatierten Sequenz enthält, läßt sich in Tabakpflanzen durch Wärmebeeinflussung regulieren; vgl. Spena et al., EMBO J. 4 (1985), S. 2739 und Spena und Schell, Mol. Gen. Genet. 206 (1987), S. 436. Dieser Promotor weist einen sehr niedrigen Grundpegel der Transkription bei normaler Wachstumstemperatur auf, der sich allerdings über eine Aktivierung durch einen Hitzeschock dramatisch steigern läßt.

Cytokinine sind Pflanzenhormone, die verschiedene biologische Phänomene, wie Seneszenz, Blütenmorphologie, Apikaldominanz und die Bildung zusätzlicher Wurzeln beeinflussen. Das IPT-Gen der T-DNA des T _i-Plasmids von Agrobakterium tumefaciens codiert die Isopentenyltransferase. Diese katalysiert den ge schwindigkeitsregulierenden Schritt bei der Synthese von Isopentenyladenosin, einem Cytokinin, im Gewebe transgener Pflanzen. Transgene Pflanzen, die in ihrem Genom das IPT-Gen unter der Kontrolle des eigenen Promotors oder von anderen Promotoren enthalten, bilden aufgrund der inhibitorischen Wir kung des erhöhten Cytokinin-Spiegels keine Wurzeln aus.

Um dieses Problem zu umgehen, wurde der codierende Bereich des IPT-Gens der T-DNA des Octopin-T _i-Plasmids pTi15955 unter die Kontrolle des HSP-70-Promotors von Drosophila melanogaster ge stellt. Das Octopin-T _i-Plasmid pTi15955 ist beschrieben in Barker et al., Plant Mol. Biol. 2 (1983), S. 325. Das verwen dete chimere HSIPT-Gen besteht (1) aus dem Promotor-Bereich des HSP-70-Gens von Drosophila (Spena et al., EMBO J. 4 (1985), S. 2739), (2) einem nicht translatierten Signalbe reich, der gebildet wird durch die Verbindung von 199 bp aus dem nicht translatierten Signalbereich des HSP-70-Gens von Drosophila mit 16 bp, die sich unmittelbar stromaufwärts vom ATG-Startcodon des codierenden Bereichs des IPT-Gens befinden, (3) aus 702 bp des codierenden Bereichs des IPT-Gens, und (4) aus 373 Basenpaaren der 3′-Flanke des IPT-Gens, die sich bis zu einer RsaI-Restriktionsspaltstelle erstrecken.

Transgene Tabakpflanzen, die dieses chimere Gen enthalten, bilden Wurzeln und haben eine veränderte Blütenmorphologie. Die Blüten sind größer und haben größere Narben als Wildtyp- Pflanzen (SR1). Das chimere HSIPT-Gen ist bei diesen trans genen Pflanzen wärmeinduzierbar.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die transgenen Pflanzen in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolB-Gens und des rolC-Gens unter der Kontrolle eines wurzel spezifischen Promotors und weisen dadurch eine veränderte bzw. vorteilhalfe Wurzelbildung und ein verändertes bzw. vorteil haftes Wurzelwachstum in Abwesenheit der anderen für transgene rolBC-Pflanzen typischen Merkmale auf.

Erfindungsgemäß werden auch transgene Pflanzen mit modifizier ter Physiologie, Morphologie und modifiziertem Hor monmetabolismus bevorzugt, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolA-, rolB- und rolC-Gens enthalten, wobei jedoch mindestens einer der codierenden Bereiche unter der Kontrolle eines heterologen Promotors steht und die anderen codierenden Bereiche gegebenenfalls unter der Kontrolle ihres natürlichen Promotors stehen. Vorzugsweise ist der heterologe Promotor ein starker konstitutiver Promotor. Besonders bevorzugt wird der CaMV35S-Promotor.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen abgeleitet von Solanaceae, Apocynaceae, Chenopodiaceae, Poly gonaceae, Boraginaceae, Compositae, Rubiaceae, Scrophularia ceae, Caprifoliaceae, Leguminosae, Araceae, Moraceae, Asple nium, Euphorbiaceae, Kohl-Arten, Sonnenblumen, Karotten, Pap rika, Porree, Raphanus-Arten, Salat-Arten, Sellerie-Arten, Zwiebeln, Fenchel, Weizen, Roggen, Gerste, Mais, Zuckerrübe, Sojabohne, Hafer, Reis-Arten, Dahlien, Ziertabak, Pelargonien, Petunien, Primeln, Veilchen, Astern, Amaranthus-Arten, Anemo nen, Löwenmäulchen, Akelei, Zierspargel, Begonien, Pantoffel blume, Blumennessel, Chrysanthemen, Cyclamen, Delphinium, Nel ken, Gerbera, Impatiens, Lupine, Levkoje, Portulaceae, Hahnen fuß, Salbei, Gloxinie, Tagetes, Königskerze, Zinnie, Rosaceae, Saponaria oder Panax ginseng. Besonders bevorzugt sind von Kartoffel oder Tabak abgeleitete Pflanzen.

Wesentlich ist hierbei, das sowohl dikotyle als auch monoko tyle Pflanzen als Ausgangsmaterial zur Herstellung der erfin dungsgemäßen Pflanzen geeignet sind.

Ferner werden erfindungsgemäß Gewebekulturen bereitgestellt, die Zellen oder Organe der vorstehend beschriebenen transgenen Pflanzen enthalten.

In vitro-Wurzelkulturen von transgenen Pflanzen, die den co dierenden Bereich des rolC-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors tragen, wachsen mindestens 10mal so schnell, wie in vitro-Wurzelkulturen von Wildtyp-Pflanzen. Eine weitere Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit läßt sich durch die Kombination des rolC-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors mit einem der rolB- oder rolA-Gene, gegebe nenfalls unter der Kontrolle eines heterologen Promotors, erzielen.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen lassen sich zur Züchtung von Pflanzen mit veränderten biochemischen, physiolo gischen, entwicklungsphysiologischen und/oder morphologischen Merkmalen verwenden.

Ferner lassen sich die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen oder von diesen Pflanzen abgeleitete Gewebekulturen zur Herstellung von sekundären Pflanzenprodukten verwenden, vorzugsweise von Alkaloiden, Monoterpenen, Sesquiterpenen, Diterpenen, Triterpensteroiden, Tetraterpenen, Polyketiden, Polyacrylenen, Flavonoiden, Phenylpropanoiden, Aminen, Alka loiden, Nichtprotein-Aminosäuren, Cyanglycosiden oder Glucosi nolaten.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen lassen sich nach dem folgenden Verfahren herstellen.

Zunächst werden Protoplasten oder Gewebe einer Pflanze zusammen mit Agrobakterium tumefaciens- oder Agrobakterium rhizogenes-Bakterien gezüchtet, die ein vom T _i- oder R _i-Plas mid abgeleitetes rekombinantes Plasmid enthalten, in das der oder die codierenden Bereiche der T _L-DNA des R _i-Plasmids aus Agrobakterium rhizogenes und/oder der codierende Bereich des IPT-Gens der T-DNA des T _i-Plasmids aus Agrobakterium tumefaciens und gegebenenfalls ein selektierbares Markergen inseriert ist. Entscheidend für die Herstellung der transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung ist lediglich die Verwen dung bestimmter rekombinanter Plasmide.

Sodann werden transgene Zellen selektiert und aus den transgenen Zellen transgene Pflanzen gezüchtet.

In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfah rens werden die rekombinanten Plasmide so ausgewählt, daß die vorstehend erläuterten Kombinationen der codierenden Bereiche in das Genom der transgenen Pflanze eingeführt werden können.

Erfindungsgemäß werden Ausführungsformen des Verfahrens zur Herstellung der oben genannten erfindungsgemäßen Pflanzen bevorzugt, bei denen das rekombinante Plasmid codierende Bereiche und Promotoren mit der biologischen Aktivität enthält, wie sie in den beispielhaften Plasmiden pPCV002-ABC, pPCV002-AB, pPCV002-B1100, pPCV002-B300, pPCV002-CaMVBT, pPCV002-C, pPCV002-CaMVBT+C, pPCV002-CaMVC, pPCV002-A oder pPCV002-AC enthalten sind. Besonders bevorzugt werden Ausführungsformen, in denen das rekombinante Plasmid codierende Bereiche und Promotoren mit der biologischen Aktivität enthält, wie wie sie im Plasmid pPCV002-BC oder pPCV002-HSIPT enthalten sind.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen sind nämlich nicht nur die individuell aufgeführten Plasmide geeignet, sondern auch alle biologisch-funktionellen Aquiva lente dieser Plasmide. Der Fachmann auf diesem Gebiet ist bei spielsweise in Kenntnis der Erfindung dazu in der Lage, codierende Bereich von rol-Genen aus verschiedenen in Agrobakterium rhizogenes vorkommenden R _i-Plasmiden zu isolie ren und diese zur Konstruktion von rekombinanten Plasmiden zu verwenden, mit deren Hilfe die codierenden Bereiche in das Genom gewünschter Pflanzen zur Herstellung transgener Pflanzen integriert werden können. Für diese Zwecke geeignete Plasmid systeme werden beispielsweise in der EP-A1 1 16 718 beschrie ben. In ähnlicher Weise können erfindungsgemäß nicht nur in ihrer DNA-Sequenz identische Promotoren, beispielsweise nur ein bestimmter CaMV35S-Promotor, verwendet werden, sondern auch in ihrer biologischen Funktion äquivalente Promotoren, beispielsweise 35S-Promotoren, die aus unterschiedlichen CaMV- Viren isolierbar sind.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 Schematische Darstellung der verwendeten rekombinanten Plasmide.

Fig. 2 Dargestellt ist der Vergleich einer Wildtyp-(SR1)- Tabakpflanze, rechts, mit einer transgenen rolABC- Pflanze, links, und einer transgenen rolAB-Pflanze, Mitte. Die transgene rolABC-Pflanze weist alle phänotypischen Merkmale des hr-Syndroms auf, während sich die transgene rolAB-Pflanze sowohl von der Wildtyp(SR1)-Pflanze als auch von der rolABC-Pflanze unterscheidet.

Fig. 3 Vergleich einer Wildtyp-Tabakpflanze (SR1), links, mit einer transgenen CaMV-C-Pflanze. Die CaMV-C-Pflanze hat eine verminderte Apikaldominanz durch die eine zwergwüchsige Morphologie entsteht. Sie weist eine er höhte Anzahl von Seitenschößlingen auf und hellgrüne, lanzettliche Blätter. Die Blütenstände haben kleinere Blüten, die männlich-steril sind.

Fig. 4 Transgene CaMV-C-Pflanze.

Fig. 5 In vitro Wurzelkulturen.

Gezeigt wird ein Vergleich des Wurzelwachstums einer Wildtyp-(SR1)-Tabakpflanze, rechts, mit Wurzeln einer transgenen CaMV-C-Pflanze, die im dunkeln in hormonfreiem, flüssigem Medium (MS) drei Wochen gezüchtet wurden.

Fig. 6 Transgene rolA-Pflanze.

Die abgebildete transgene rolA-Pflanze wurde mit dem rekombinanten Plasmid pPCV002-A hergestellt. Sie weist runzelige Blätter und einen komprimierten Blütenstand auf. Diese Morphologie wird durch die Expression des codierenden Bereichs des rolA-Gens hervorgerufen.

Fig. 7 Vergleich einer transgenen rolC-Pflanze, Mitte, mit einer Wildtyp (SR1)-Pflanze, links, und einer CaMV-C- Pflanze, rechts.

Die transgene rolC-Pflanze wurde mit dem rekombinanten Plasmid pPCV002-C konstruiert. Die transgene rolC- Pflanze weist eine leicht reduzierte Apikaldominanz und kleinere Blüten mit verminderter Pollenbildung auf. Dieser Phänotyp beruht auf der Expression des codierenden Bereichs des rolC-Gens unter der Kontrolle des eigenen Promotors.

Fig. 8 Transgene rolAC-Pflanze.

Die abgebildete transgene rolAC-Pflanze wurde mit dem rekombinanten Plasmid pPCV002-AC hergestellt. Sie weist runzelige Blätter, eine leicht reduzierte Apikaldominanz und kleinere Blüten auf. Diese Morphologie beruht auf der kombinierten Expression des codierenden Bereichs des rolA-Gens und des rolC-Gens.

Fig. 9 Blütenmorphologie I.

Dargestellt ist ein Vergleich der Blüten vom Wildtyp (SR1)-Pflanzen und von transgenen Pflanzen. Transgene rolA und rolB-Pflanzen weisen eine größere Blüte auf, während transgene rolC-Pflanzen kleinere Blüten haben,

Fig. 10 Blütenmorphologie II.

Dargestellt ist ein Vergleich der Blüten von Wildtyp (SR1)-Pflanzen und von transgenen Pflanzen. Die Blüten von transgenen CaMVC-Pflanzen sind sehr klein und männlich-steril. Die Blüten transgener CaMVBT-Pflan zen, in denen derselbe Promotor die Expression des codierenden Bereiches des rolB-Gens steuert, haben überstehende Narben und kürzere Staubblätter.

Fig. 11 Größe der Samenkapseln.

Dargestellt sind die Samenkapseln von Wildty (SR1)- Pflanzen im Vergleich mit Samenkapseln von transgenen Pflanzen. Bei transgenen rolA- und rolB-Pflanzen ist die Größe der Samenkapsel unverändert. Dagegen ist die Samenkapsel von transgenen rolC-Pflanzen deutlich kleiner. Die Samenkapseln transgener CaMV-C-Pflanzen sind noch kleiner. Alle dargestellten Samenkapseln wurden durch Kreuzbestäubung weiblicher Rezipienten mit SR1-Pollen erhalten.

Fig. 12 Transgene rolBC-Pflanze.

Die abgebildete transgene rolBC-Pflanze wurde mit dem rekombinanten Plasmid pPCV002-BC erhalten. Sie weist eine verminderte Apikaldominanz und kleinere Blüten auf. Diese Morphologie beruht auf der Expression des rolC-Gens. Aufgrund der kombinierten Expression des codierenden Bereichs des rolB- und rolC-Gens hat diese transgene Pflanze ein verstärktes Wurzelsystem.

Fig. 13 Northern-Blot-Analyse von polyA-RNA aus transgenen rolABC-Pflanzen und polyA-RNA aus transgenen CaMV-C- Pflanzen.

In transgenen rolABC-Pflanzen wird der codierende Bereich des rolC-Gens organspezifisch exprimiert. Dagegen wird der codierende Bereich des rolC-Gens in transgenen CaMV-C-Pflanzen konstitutiv exprimiert.

Spur 1-4: polyA-RNA von Wurzeln (r), Stengel (s) und Blättern (1) einer transgenen rolABC-Pflanze.

Spur 5-7: polyA-RNA von Wurzeln (r), Stengeln (s) und Blättern (s) einer transgenen CaMV-C-Pflanze.

Der Northern-Blot wurde mit den radioaktiv markierten EcoRI-Fragment 15 der T _L-DNA von Agrobakterium rhizogenes, das die rolA-, B- und C-Gene enthält, hybridisiert.

Fig. 14 Northern-Blot-Analyse von polyA-RNA aus verschiedenen transgenen Pflanzengeweben. Der abgebildete Northern- Blot zeigt die Expression der verschiedenen rol-Gene. Es wurde polyA-RNA der nachfolgend genannten transgenen Pflanzengewebe aufgetragen:

Spur 1: Clon rolABC 1-27
Spur 2: Clon rolA-2
Spur 3: Clon rolA-4
Spur 4: Clon rolB1100-1
Spur 5: Clon rolB1100-2
Spur 6: Clon rolCaMVBT-5
Spur 7: Clon rolCaMVBT-6
Spur 8: Clon rolCaMVC-2
Spur 9: Clon rolCaMV-4
Spur 10: Clon rolAB-1
Spur 11: Clon rolAB-5
Spur 12: Clon rolAC-1,5
Spur 13: Clon rolAC-2,4
Spur 14: Clon rolBC-10
Spur 15: Clon rolBC-14
Spur 16: Clon rolCaMVBT+C1
Spur 17: Clon rolCaMVBT+C3

Fig. 15 Dargestellt sind Blattnekrosen einer transgenen CaMVBT-Pflanze, die aufgrund der höheren Expression des rolB-Gens in Blättern durch die spezifische Expression unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors hervorgerufen werden.

Das voll ausgeprägte hr-Syndrom tritt bei transgenen Pflanzen auf, die das rolA-, rolB- und rolC-Gen exprimieren; vgl. Spena et al., a.a.O. Die erfindungsgemäße Untersuchung von transgenen Pflanzen, die in ihrem Genom unterschiedliche Kombinationen der codierenden Bereiche dieser drei rol-Gene enthalten, hat ergeben, daß sie unterscheidbare und spezifi sche Wachstumsabnormalitäten aufweisen, die mit der Expression der genannten codierenden Bereiche korreliert sind; vgl. Fig. 2, 6 bis 9, 11, 12. Transgene Pflanzen, die jeweils nur den codierenden Bereich eines einzigen der rol-Gene in ihrem Genom enthalten, weisen nicht alle phänotypischen Merkmale des hr- Syndroms auf. Daraus folgt, daß das hr-Syndrom durch eine kombinierte Wirkung von Genen hervorgerufen wird, die jeweils eine unterscheidbare biologische Wirkung in der transgenen Pflanze haben.

Es war bereits bekannt, daß das rolB- und rolC-Gen in R _i- transgenen R _i-Tabakpflanzen und in R _i-transgenen Kartoffel pflanzen, die jedoch alle mindestens drei Gene, nämlich das rolA-, rolB- und rolC-Gen in ihrem Genom enthalten, Organ-spe zifisch exprimiert werden. Außerdem ist eine organ-spezifische Expression aus transgenen Tabakpflanzen bekannt, die alle drei Gene enthalten; vgl. Spena et al., a.a.O. In diesen Experimenten wurde durch Northern-Blot-Analyse gezeigt, daß die Expressionsrate des rolB- und rolC-Gens in Stengeln hoch, in Wurzeln etwas niedriger und in Blättern sehr viel niedriger ist. Diese Ergebnisse wurden durch die Analyse der Expressionsrate eines Indikatorgens unter der Kontrolle des rolB- und rolC-Promotors bestätigt. Dabei konnte die Organ- und Zell-Spezifität der Expression näher bestimmt werden. Durch Veränderung der Expressionsrate der Gene entstehen auch entwicklungsphysiologische Veränderungen. Beispielsweise ist eine erhöhte Anzahl von Seitensprossen korreliert mit einer höheren Expressionsrate des rolC-Gens (Fig. 13). Die Spezifität der Expressionsrate spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung morphologischer Veränderungen in transgenen hr- Pflanzen. Transgene Pflanzen, die chimere Gene enthalten, in denen der codierende Bereich des rolB- oder rolC-Gens unter der Kontrolle eines CaMV35S-Promotors steht, weisen neue morphologische Wachstumsabnormalitäten auf. Durch Northern- Blot-Analyse und histochemische Färbungen wurde gezeigt, daß die Blattnekrose mit einer erhöhten Expressionsrate des rolB- Gens in den Blättern korreliert ist (Fig. 15). Die erhöhte Expressionsrate dieses Gens kann durch Expression unter der Kontrolle eines CaMV35S-Promotors erzielt werden.

Die unterscheidbaren Wachstumsmuster von transgenen Tabak pflanzen, die in ihrem Genom chimere CaMVBT- und CaMVC-Gene enthalten, in denen die beiden codierenden Bereiche durch den selben Promotor gesteuert werden, weisen darauf hin, daß die biologische Wirkung der Produkte dieser Gene auf die gesamte Pflanze unterschiedlich ist. Daraus folgt, daß die Produkte der rolB- und rolC-Gene entweder unterschiedliche biologische Ziele haben oder auf dasselbe Ziel unterschiedlich wirken. Die durch die Expression der rol-Gene verursachten Änderungen sind ein Anzeichen für Veränderungen von hormongesteuerten Vorgängen. Daher wurden Modelle vorgeschlagen, bei denen das hr-Syndrom durch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Auxin erklärt wird, die durch eine rol-verursachte Modifikation des Rezeptions-Transduktions-Systems verursacht wird. Andererseits wurde vermutet, daß eine Funktion der rol-Gene zu Veränderun gen der Cytokinin-Biosynthese führt oder eine Cytokinin- ähnliche Wirkung hat. Bei den entsprechenden Experimenten wurde die Virulenz von im Bereich des IPT-Gens mutierten T _i- Plasmiden durch Einbau eines Bereichs der T _L-DNA des R _i-Plas mids wieder hergestellt. Die biologische Wirkung der Produkte der rolA- und rolB-Gene erinnert in der Tat an durch Auxin verursachte Wirkungen und die durch das rolC-Gen ausgelöste biologische Wirkung weist auf eine Cytokinin-Aktivität hin. Jedoch lassen sich die Wirkungen der rol-Gene nicht leicht durch Modelle erklären, bei denen die Synthese von transportierten Phytohormonen, wie Indolessigsäure (IAA) und Isopentenyladenosin (IPT) erforderlich ist. Die Wirkung dieser Gene ist zumindest bei der Wurzelbildung auf die transformierten Zellen beschränkt. rolB- und/oder rolA-be dingte Auxin-ähnliche Wirkungen könnten nicht nur durch Her beiführen einer Änderung des Rezeptions-Transduktions-Systems für das Auxin-Signal erhalten werden, sondern auch durch Inhi bition der Wirkung von Auxin-Antagonisten, wie Cytokininen, oder durch Synthese einer Substanz mit einer Auxin-ähnlichen Wirkung, die nicht in Pflanzengeweben transportiert wird, wie Phenylessigsäure. Das Ergebnis wäre in beiden Fällen eine er höhte biologische Auxin-Wirkung ohne eine Änderung der IAA- Konzentration. Andererseits sind die bei transgenen CaMV-C-Pflanzen auftretenden Merkmale und die bei hr-Pflanzen und bei transgenen CaMV-BT-Pflanzen durch eine erhöhte Expressionsrate des rolC-Gens auftretenden Wirkungen typisch für eine erhöhte Cytokinin-Aktivität. Entsprechend könnte die erhöhte Cytokinin-Aktivität auch auf eine Hemmung oder partielle Inaktivierung von Indolessigsäure oder auf die Synthese einer zellautonomen Substanz mit Cytokinin-Wirkung zurückzuführen sein.

Die Untersuchung des Wachstumsverhaltens von transgenen Tabak- Wurzelkulturen hat ergeben, daß insbesondere durch die Kombination des rolB- und rolC-Gens oder, mit etwas weniger starker Wirkung, des rolA- und des rolC-Gens, eine wesentliche Verbesserung des Wurzelwachstums in den in vitro-Wurzelkul turen erzielbar ist. Dabei ist das rolB-Gen bei der Induktion der Wurzelbildung das effizienteste der rolA-, rolB- und rolC- Gene. Für ein schnelles Wachstum verzweigter Wurzeln ist jedoch auch das rolC-Gen erforderlich. Das Produkt des rolC- Gens hat eine eher niedrige Fähigkeit, die Wurzelbildung zu induzieren. Transgene rolC- und insbesondere CaMVC-Wurzeln sind stark verzweigt und haben ein schnelles und plagiotropes Wachstum, vgl. Fig. 5.

Es ist bekannt, daß Auxine die Bildung zusätzlicher Wurzeln (Rhizogenese) induzieren. Aber auch andere Phytohormone, z.B. Cytokinine, beeinflussen die Rhizogenese. Darüber hinaus gibt es Hinweise, daß zur Induktion der Wurzelbildung ein hohes Auxin/Cytokinin-Verhältnis optimal ist, während für das weitere Wurzelwachstum ein niedriges Auxin/Cytokinin-Verhält nis erforderlich ist. Somit ist für die wirksame Wurzelbildung und das wirksame Wurzelwachstum die gemeinsame Wirkung der rolB- und rolC-Genprodukte vorteilhaft, wobei das rolB-Gen- Produkt (Auxin-ähnliche Wirkung) wirksam die Wurzelbildung induziert und das rolC-Genprodukt (Cytokinin-ähnliche Wirkung) durch Gegenwirkung zur biologischen Aktivität des rolB-Genpro dukts ein schnelles und verzweigtes Wurzelwachstum gestattet.

Die in den nachstehenden Beispielen verwendeten rekombinanten Plasmide sind bis auf das Plasmid pPCV002-BC in Spena et al., a.a.O., beschrieben.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen lassen sich beispielsweise durch Transformation von Protoplasten mit den rekombinanten Plasmiden, anschließende Selektion von transge nen Zellen und durch Züchtung adulter Pflanzen aus den selektierten transgenen Zellen herstellen.

Material und Methoden Bakterien-Stämme und -Kulturen

Die verwendeten Bakterien-Stämme und -Kulturen sind in Spena et al., a.a.O., beschrieben. Alle rekombinanten Plasmide wurden zunächst in E. coli, Stamm SM10, überführt und sodann in Agrobakterium tumefaciens, Stamm GV3101, mobilisiert; Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), S. 383.

Konstruktion der verwendeten rekombinanten Plasmide.

Die verwendeten rekombinanten Plasmide wurden in üblicher Weise konstruiert; Maniatis et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Could Spring Harbour Laboratory, 1982. Die in Fig. 1 abgebildeten rekombinanten Plasmide wurden bis auf das rekombinante Plasmid pPCV002-BC bereits in Spena et al., a.a.O., beschrieben.

Pflanzliche Gewebekulturen und Transformation

Die Wurzelinduktion auf Blättern von Kalanchoe diagremontiana und auf Blattscheibchen steriler Schößling-Kulturen von Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 (Nagy und Maliga, Z. Pflanzenphys. 78 (1976) S. 453) wurde durchgeführt wie von Spena et al., a.a.O., beschrieben.

Um zu prüfen, ob die rol-Gen-induzierten Wurzeln immer trans formiert waren, wurden Blattscheibchen mit verschiedenen Konstrukten inkubiert und auf MS-Medium ohne Kanamycin gezüch tet; Murashige und Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), S. 473. Nach 4 Wochen wurden die Wurzeln abgeschnitten und in zwei Hälften zerlegt. Eine Hälfte wurde einer Kanamycin-Selektion (50 mg/Liter) während der Kallus-Bildung auf MS-Medium unterworfen. Dabei war das MS-Medium mit 0,6 mg/Liter Naphthylessigsäure (NAA) und 0,2 mg/Liter Kinetin angerei chert. Transgene Pflanzen wurden üblicherweise aus transgenen Calli auf mit 0,5 mg/Liter Benzylaminopurin (BAP) und 0,1 mg/Liter NAA angereichertem MS-Medium gezüchtert. Schwierig ist jedoch die Regeneration transgener Pflanzen aus Calli, wenn in das zelluläre Genom die aus den rekombinanten Plasmiden pPCV002-CaMVBT oder pPCV002-CaMVBT+C abgeleiteten codierenden Bereiche integriert sind. Daher wurden die Schößlinge 10 bis 12 Wochen auf MS-Medium gezüchtet, das mit 7,5 mg/Liter Isopentenyladenosin und 0,1 mg/Liter Chlor phenoxyessigsäure angereichert war; Firoozabady, Plant Science 46 (1986), S. 127. Die Schößlinge wurden auf hormonfreiem MS- Medium bei Selektion auf Kanamycinresistenz bewurzelt. Die Wurzelkulturen wurden entweder auf festem oder auf flüssigem MS-Medium etabliert.

DNA- und RNA-Analyse

DNA und RNA wurden auf aus den Geweben der transgenen Pflanze nach Taylor und Powell erhalten; BRL-Focus 4 (1983), S. 4. Die polyA-RNA wurde durch Chromatographie an oligo-dT-Cellulose nach den Angaben des Herstellers (Boehringer Mannheim) gesammelt und sodann auf einem 1,5prozentigem Agarose- Formaldehydgel aufgetrennt. Sodann wurden sie auf Nylonmembra nen überführt und mit radioaktiven Sondenmolekülen hybridi siert. Als Sondenmoleküle wurden gereinigte DNA-Fragmente ver wendet, die durch Nick-Translation mit einem Nick- Translations-Kit von BRL nach den Angaben des Herstellers markiert wurden. Die Hybridisierung der Northern-Blot wurde in 10% Dextransulfat, 1M Natriumchlorid, 1% Natriumlaurylsul fat, 100 µg/ml heterologer DNA bei 65°C durchgeführt. Es wurde zunächst bei Raumtemperatur mit 2×SSPE, 1% SDS gewaschen und anschließend bei 65°C mit 0,2×SSPE und 1% SDS. Die DNA-Blots wurden sodann in üblicher Weise weiter behandelt; Maniatis et al., a.a.O.

Nachweis der Aktivität der Neomycinphosphotransferase II

Der Nachweis der Aktivität der Neomycinphosphotransferase II wurde in in situ-Tests, wie von Spena et al., EMBO J. 4 (1985), S. 2739 beschrieben durchgeführt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Konstruktion des Plasmids pPCV002-BC

Das rekombinante Plasmid pPCV002-BC wurde durch Subclonierung des 3581bp-SmaI/EcoRI-DNA-Fragments im binären Vektor pPCV002 erhalten. Eine genauere Beschreibung des Fragments findet sich in Spena et al. a.a.O. Aus dem Plasmid pPCV002-ABC wurde ein SmaI/EcoRI-Fragment, das die codierenden Bereiche der rolB- und rolC-Gene enthält, in die SmaI/EcoRI-Restriktionsspalt stellen des Plasmids pUC19 subcloniert. Dieses Fragment ent spricht den Basenpaaren 9863 bis 13 445 nach der Numerierung der T _L-DNA-Sequenz gemäß Slightom et al. (1986), a.a.O. Aus dem so entstandenen Plasmid pUC19-BC wurde ein EcoRI/XbaI-DNA- Fragment herausgeschnitten und in die EcoRI/XbaI-Restriktions spaltstellen des Vektors pPCV002 subcloniert. Somit wurde das Plasmid pPCV002-BC erhalten.

Beispiel 2 Konstruktion des Plasmids pPCV002-HSIPT

Die Konstruktion des Plasmids pPCV002-HSIPT wurde in an sich bekannter Weise durchgeführt; vgl. Maniatis et al. (1982), a.a.O. Aus der T-DNA des Octopin T _i-Plasmids pT _i 15955 wurde ein RsaI/RsaI-DNA-Fragment, in die SmaI-Restriktionsspalt stelle des Plasmids pUC9 subcloniert. Dieses DNA-Fragment entspricht den Basenpaaren 8488 bis 9836 gemäß Numerierung von Barker et al., Plant Mol. Biol. 2 (1983), S. 335 bis 350. Das erhaltene Plasmid pUC9-IPT wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI an einer Restriktionsspaltstelle stromaufwärts vom codierenden Bereich des IPT-Gens geöffnet und der Promotor in an sich bekannter Weise durch Verdauung mit der Exonuklease Ba131 entfernt. Die Anzahl der vor dem Translations-Startpunkt verbleibenden Basenpaare wurde durch DNA-Sequenzierung nach der Kettenabbruchmethode überprüft. Sodann wurde der codierende Bereich des IPT-Gens durch eine Restriktionsspal tung mit den Enzymen EcoRI und HindIII aus dem Plasmid pUC9- IPT entfernt und in die BamHI/HindIII-Restriktionsspaltstellen des Plasmids pUC8-HSP-70 subcloniert, wobei die EcoRI- und die BamHI-Restriktionsspaltstellen vor der Ligierung durch Behandlung mit Klenow-Polymerase in stumpfe Enden überführt wurden. Das resultierende Plasmid pUC8-HSIPT enthält somit den codierenden Bereich des IPT-Gens stromabwärts des hitzeindu zierbaren HSP-70-Promotors von Drosophila melanogaster. Dieses chimere Gen wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII ausgeschnitten und in die EcoRI- und HindIII- Restriktionsspaltstellen des binären Pflanzenvektors pPCV002 subcloniert. Somit weist das erhaltene Plasmid pPCV002-HSIPT die folgenden Strukturmerkmale auf:

- 258bp des HSP-70-Promotors von Drosophila melanogaster;
- 199bp nicht-translatierte Sequenz von Drosophila melano gaster;
- 16bp nicht-translatierte Sequenz des IPT-Gens mit der Nukleotidsequenz "GGATCTAATTC" an der Fusionsstelle;
- 712bp codierender Bereich des IPT-Gens; und
- 373bp 3′-stromabwärts nicht-translatierte Sequenz mit dem Terminationsbereich des IPT-Gens.

Beispiel 3 Die biologische Wirkung der rolA-, rolB- und rolC-Gene in transgenen Tabakpflanzen

Transgene Tabakpflanzen, in denen das rolA-, rolB- und das rolC-Gen exprimiert wird, weisen alle für das hr-Syndrom charakteristischen phänotypischen Veränderungen auf. Dagegen weisen transgene Tabakpflanzen, in denen ein einzelnes der rol-Gene oder Kombinationen von zwei dieser Gene exprimiert werden, andere, für diese einzelnen Gene oder Kombinationen charakteristische phänotypische Veränderungen auf. Fig. 2 zeigt eine transgene Tabakpflanze, die die codierenden Bereiche des rolA- und des rolB-Gens in ihrem Genom enthält und exprimiert im Vergleich mit einer normalen Tabakpflanze Wildtyp (SR1) oder mit einer transgenen Tabakpflanze, die die codierenden Bereiche des rolA-, rolB- und rolC-Gens in ihrem Genom enthält und exprimiert. Es ist leicht erkennbar, daß die erfindungsgemäße Pflanze, die den codierenden Bereich des rolA- und des rolB-Gens in ihrem Genom enthält und exprimiert, sich sowohl von der Wildtyp-Pflanze (SR1) als auch von der hr- Syndrom-Pflanze unterscheidet, die alle drei codierenden Bereiche exprimiert.

Transgene Pflanzen, die Kombinationen der codierenden Bereiche des rolB- und des rolC-Gens oder des rolA- und des rolC-Gens in ihrem Genom enthalten, zeigen nicht alle charakteristischen Merkmale des hr-Syndroms, unterscheiden sich aber auch von Wildtyp-Pflanzen; vgl. Fig. 12 bzw. Fig. 8.

Zur selben Schlußfolgerung gelangt man auch bei der Untersuchung der Nachkommen bei Kreuzungsexperimenten zwischen transgenen rolAB- und transgenen rolC-Pflanzen. Bei diesen in an sich bekannter Weise durchgeführten Kreuzungsexperimenten wurde eine transgene Tabakpflanze, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolA- und des rolB-Gens enthält (z.B. AB3-5) mit einer transgenen Tabakpflanze gekreuzt, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens enthält (z.B. C9a). 29 von 100 Pflanzen der Nachkommengeneration zeigten das vollständige hr-Syndrom.

Transgene Tabakpflanzen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens enthalten und diesen exprimieren, haben eine veränderte Blattmorphologie, verminderte Blütengröße und Pollenbildung (Fig. 9), die Samenkapseln sind kleiner (Fig. 11) und die Pflanze ist stärker verzweigt (Fig. 7).

Transgene Tabakpflanzen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolB-Gens enthalten und expremieren, weisen andere Wachstumsveränderungen auf. Dies sind im wesentlichen andere Änderungen der Blattmorphologie und vergrößerte Narben und Blüten (Fig. 9). Die Pollenbildung ist nur geringfügig vermindert und die Samenkapseln sind nicht beeinträchtigt (Fig. 11). Die Blüten von transgenen Tabakpflanzen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolA-, rolB- und rolC-Gens enthalten, sind kleiner als die von Wildtyppflanzen (SR1), während die Blüten von transgenen Pflanzen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolB-Gens enthalten größer sind und veränderte Merkmale aufweisen (Fig. 9).

Transgene Pflanzen, die in ihrem Genom eine Kombination des codierenden Bereiches des rolC-Gens mit dem codierenden Bereich des rolA-Gens oder des rolB-Gens enthalten, weisen ebenfalls kleine Blüten auf. Gegebenenfalls steht in diesen Pflanzen einer der codierenden Bereiche unter der Kontrolle eines star ken heterologen Promotors. Solche Pflanzen sind beispielsweise mit Hilfe der Plasmide pPCV002-AC, pPCV002-BC oder pPCV002- CaMVBT+C erhältlich.

Transgene Tabakpflanzen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolA-Gens enthalten, unterscheiden sich in ihren veranderten Wachstumseigenschaften sowohl von transgenen Pflanzen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolB- Gens enthalten, als auch von denen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens enthalten. Ein besonders typisches Merkmal solcher Pflanzen sind die runzeligen Blät ter, ein komprimierter Blütenstand (Fig. 6) und größere Blüten mit veränderter Morphologie (Fig. 9).

Die Nachkommen der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen zeigen ähnliche morphologische Veränderungen wie die Eltern pflanzen. Die Vererbung der veränderten Merkmale erfolgte bei den durchgeführten Experimenten zusammen mit einer Resistenz gegenüber Kanamycinsulfat. In einem weiteren Experiment wurden verschiedene erfindungsgemäße Tabakpflanzen untersucht, um zu überprüfen, ob die phänotypischen Veränderungen mit der Expression von rol-Genen korreliert sind.

Fig. 13 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von polyA-RNA, die aus dem Gewebe unterschiedlicher erfindungsgemäßer transgener Pflanzen extrahiert wurde. In allen untersuchten Fällen ist das veränderte Wachstum mit der Expression von rol-Genen korreliert.

Beispiel 4 Veränderung der rol-typischen Merkmale durch Veränderung der Expressionsrate

Transgene Pflanzen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens enthalten, der unter der Kontrolle des CaMV35S- Promotors steht, weisen einen anderen Phänotyp auf als solche, bei denen der im Genom enthaltene codierende Bereich des rolC- Gens unter der Kontrolle des natürlichen Promotors steht; vgl. Fig. 3, 4 und 7. Die Verwendung des CaMV35S-Promotors führt zu einem buschigen Phänotyp mit einer erhöhten Anzahl von Schößlingen. Die Blüten sind winzig (Fig. 10) und die Blätter sind schmal und lanzettlich (Fig. 4). Die transgenen CaMV-C-Pflanzen sind dominant männlich-steril.

Versuche in einem System mit vorübergehender Expression, bei dem Tabakblatt-Protoplasten verwendet werden, haben ergeben, daß die Expressionsrate des codierenden Bereichs des rolC-Gens bei Verwendung des CaMV35S-Promotors 15-fach erhöht ist. Dies stimmt mit Ergebnissen von Northern-Blot-Analysen überein, die mit polyA-RNA aus transgenen Pflanzen durchgeführt wurden. Ferner wird dies bestätigt durch die Untersuchung der Expression in transgenen Pflanzen, die ein chimeres Gen ent halten, das aus dem codierenden Bereich der β-Glucuronidase und dem rolC-Promotor besteht. Somit ist die Änderung der Expressionsrate des codierenden Bereichs des rolC-Gens verantwortlich für die Reduktion der Apikaldominanz.

Ferner wurden transgene Pflanzen hergestellt, in denen der codierende Bereich des rolB-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors steht. Zur Herstellung dieser Pflanzen wurde das rekombinante Plasmid pPCV002-CaMVBT verwendet. Eines der Merkmale dieser transgenen Pflanzen ist eine frühere Blattseneszenz (Nekrose); vgl. Fig. 15. Durch Northern-Blot- Analyse der polyA-RNA aus diesen transgenen Pflanzen wurde festgestellt, daß das chimere Gen in Blättern stärker exprimiert wird, als in transgenen Pflanzen, in denen der codierende Bereich des rolB-Gens unter der Kontrolle des natürlichen Promotors steht. Somit beruht der neue Phänotyp auf der erhöhten Expressionsrate des codierenden Bereichs des rolB-Gens.

Ferner wurden erfindungsgemäß transgene Pflanzen hergestellt, die eine Kombination des codierenden Bereichs des rolB-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors und des codierenden Bereichs des rolC-Gens enthalten. Zur Herstellung dieser Pflanzen wurde das rekombinante Plasmid pPCV002-CaMVBT+C ver wendet. Diese Pflanzen weisen eine Blattnekrose auf, wie sie typisch für transgene CaMVBT-Pflanzen ist; vgl. Fig. 15.

Dagegen ist die Blütenmorphologie vergleichbar mit transgenen Pflanzen, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC- Gens enthalten. Die nekrotischen Vorgänge beginnen am Blattgewebe zwischen den Adern und breiten sich dann über das gesamte Blatt aus; vgl. Fig. 15. Dies wird üblicherweise bei Pflanzen beobachtet, die das Reifestadium vor der Blütenbil dung erreicht haben. Die zuerst betroffenen Blätter sind weder die ältesten noch die jüngsten, sondern befinden sich etwa in der Mitte der Pflanze. Allerdings weisen einige transgene CaMVBT+C-Pflanzen eine erhöhte Anzahl von Schößlingen und Blättern auf, wobei der nekrotische Prozeß bei diesen Pflanzen weniger ausgeprägt und auf den Zeitraum nach der Blüte verschoben ist. Die Northern-Blot-Analyse verschiedener transgener CaMVBT+C-Pflanzen weist darauf hin, daß die Pflanzen mit einer erhöhten Anzahl von Schößlingen und verspäteter Blattnekrose das CaMVBT-Gen weniger stark exprimieren als das rolC-Gen. Somit haben diese Pflanzen ein erhöhtes Verhältnis von rolC-Transkripten zu rolB- Transkripten.

Beispiel 5 Transgene, rol-Gen-induzierte Tabakwurzeln

Zunächst wurde untersucht, ob rol-Gen-induzierte Tabakwurzeln auf mit Kanamycin versetztem MS-Medium wachsen können, da sie infolge ihrer Konstruktion mit Hilfe der Plasmide pPCV002-ABC, pPCV002-B1100, pPCV002-AC neben den codierenden Bereichen der rol-Gene auch das Neomycinphosphotransferase II-Gen enthalten. Es wurden 166 rol-Gen-induzierte Tabakwurzeln untersucht. Davon vermochten 153 deutlich auf dem mit Kanamycinsulfat versetzten MS-Medium zu wachsen. 12 weitere waren nicht eindeutig positiv, so daß sie noch zusätzlich in in situ-Tests auf die Aktivität des Neomycinphosphotransferase II-Gens un tersucht wurden. Ferner wurden Southern-Blots des Pflanzenge noms angefertigt. Die Ergebnisse zeigen, daß diese Wurzeln tatsächlich transformiert sind.

Die unterschiedlichen codierenden Bereiche der rol-Gene oder deren Kombinationen haben unterschiedliche Wirkungen auf das Wurzelwachstum. Transgene Tabakwurzeln, die einzelne rol-Gene enthalten, wuchsen besser als nicht transformierte Wurzeln. Transgene Wurzeln, die das rolC-Gen enthalten, verzweigten sich häufiger als solche, die das rolA-Gen oder das rolB-Gen enthalten. Dagegen war das Wachstum transgener Wurzeln kräftiger, wenn sie Kombinationen des rolC-Gens mit dem rolA- Gen und/oder dem rolB-Gen enthalten. Das rolB-Gen hat bei Kombination mit dem rolC-Gen eine stärkere Wirkung als die Kombination des rolA-Gens mit dem rolC-Gen. Kombinationen der Gene rolA und rolB ergaben kein wesentlich besseres Wurzelwachstum als die einzeln verwendeten Gene. Wenn der codierende Bereich des rolC-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors steht, führt dies zu einem erhöhten Wurzel wachstum (Fig. 5). Dagegen wachsen die Wurzeln weniger stark, wenn der codierende Bereich des rolB-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors exprimiert wird. Jedoch wachsen sie schneller, wenn der codierende Bereich des rolB-Gens unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotor steht und mit dem codierenden Bereich des rolC-Gens kombiniert ist. Dabei sind die Wurzeln stark verzweigt und wachsen plagiotrop. Zur Herstellung dieser von transgenen Pflanzen ableitbaren Wurzeln wurden die in Spena et al., a.a.O. und in Beispiel 1 beschriebenen rekombinanten Plasmide verwendet.

Gewebekulturen dieser Wurzeln sind insbesondere zur vorteil haften Herstellung von sekundären Pflanzenprodukten geeignet.

Claims

1. Transgene Pflanze mit gegenüber der entsprechenden natürlichen Pflanze modifizierter Physiologie, Morpholo gie und modifiziertem Hormonmetabolismus, die in ihrem Genom den codierenden Bereich entweder des rolA-Gens, oder des rolB- Gens, oder des rolC-Gens, oder des rolA- und rolC-Gens, oder des rolB- und rolC-Gens oder des rolA- und rolB-Gens der T _L-DNA des R _i-Plasmids aus Agrobakterium rhizogenes und/oder des codierenden Bereichs des IPT (Isopentenyladenosin)-Gens der T-DNA des T _i-Plasmids aus Agrobakterium tumefaciens enthält, wobei die codierenden Bereiche entweder unter der Kontrolle ihres natürlichen oder eines heterologen Promotors stehen, mit Ausnahme des codierenden Bereiches des rolC-Gens, der, sofern er nicht in Kombination mit einem der anderen codierenden Bereiche im Genom vorliegt, unter der Kontrolle eines heterologen Promotors steht, wobei die codierenden Bereiche exprimiert werden.

2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, die in ihrem Genom zustäzlich ein selektierbares Markergen enthält, das exprimiert wird.

3. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 oder 2, bei der der heterologe Promotor der HSP ("Heat Shock Promoter")-70-Promotor von Drosophila melanogaster ist.

4. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der der heterologe Promotor ein starker konstitutiver Promotor ist.

5. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, bei der der starke konstitutive Promotor der CaMV ("Cauliflower Mosaic Virus") 35S-Promotor ist.

6. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 5, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolC-Gens der T _L-DNA des R _i-Plasmids aus Agrobakterium rhizogenes enthält, der unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors, vorzugsweise des CaMV35S-Promotors steht.

7. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 bis 6, bei der der co dierende Bereich des IPT-Gens unter der Kontrolle des HSP-70-Promotors von Drosophila melanogaster steht.

8. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 bis 7, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolB-Gens und des rolC- Gens unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promo tors enthält und dadurch eine veränderte Wurzelbildung und ein verändertes Wurzelwachstum in Abwesenheit der anderen für transgene rolBC-Pflanzen typischen Merkmale aufweist.

9. Transgene Pflanze mit modifizierter Physiologie, Morpholo gie und modifiziertem Hormonmetabolismus, die in ihrem Genom den codierenden Bereich des rolA-, rolB- und rolC- Gens enthält, wobei mindestens einer der codierenden Be reiche unter der Kontrolle eines heterologen Promotors steht, vorzugsweise des CaMV35S-Promotors, und die ande ren codierenden Bereiche unter der Kontrolle ihres natür lichen Promotors stehen.

10. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 9, die von Solanaceae, Apocynaceae, Chenopodiaceae, Polygonaceae, Boraginaceae, Compositae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caprifoliaceae, Leguminosae, Araceae, Moraceae, Asplenium, Euphorbiaceae, Kohl-Arten, Sonnenblumen, Karotten, Paprika, Porree, Raphanus-Arten, Salat-Arten, Sellerie-Arten, Zwiebel, Fenchel, Weizen, Roggen, Gerste, Mais, Zuckerrübe, Sojabohne, Hafer, Reis-Arten, Dahlien, Ziertabak, Pelargonien, Petunien, Primeln, Veilchen, Astern, Amaranthus-Arten, Anemonen, Löwenmäulchen, Akelei, Zierspargel, Begonien, Pantoffelblume, Blumennessel, Chrysanthemen, Cyclamen, Delphinium, Nelken, Gerbera, Impatiens, Lupine, Levkoje, Portulaceae, Hahnenfuß, Salbei, Gloxinie, Tagetes, Königskerze, Zinnie, Rosaceae, Saponaria oder Panax ginseng, vorzugsweise aber von Kartoffel oder Tabak abgeleitet ist.

11. Gewebekultur, enthaltend Zellen oder Organe einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

12. Verwendung einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprü che 1 bis 10 zur Züchtung von Pflanzen mit veränderten biochemischen, physiologischen, entwicklungsphysiologischen und/oder morphologischen Merkmalen.

13. Verwendung einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einer Gewebekultur nach Anspruch 11 zur Herstellung von sekundären Pflanzenprodukten, vor zugsweise von Alkaloiden, Monoterpenen, Sesquiterpenen, Diterpenen, Triterpensteroiden, Tetraterpenen, Polyketiden, Polyacetylenen, Flavonoiden, Phenylpropanoiden, Aminen, Nichtprotein-Aminosäuren, Cyanglycosiden, oder Glucosinolaten.

14. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem man

a) Protoplasten oder Gewebe einer Pflanze zusammen mit Agrobakterium tumefaciens- oder Agrobakterium rhizogenes-Bakterien züchtet, die ein von T _i- oder R _i-Plasmiden abgeleitetes, rekombinantes Plasmid enthalten, in das der oder die codierenden Bereiche der T _L-DNA des Ri-Plasmids aus Agrobakterium rhizogenes und/oder der codierende Bereich des IPT-Gens der T-DNA des T _i-Plasmids aus Agrobakterium tumefaciens inseriert ist (sind);
b) transgene Zellen selektiert; und
c) aus den transgenen Zellen eine transgene Pflanze züchtet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem in das rekombinante Plasmid zusätzlich ein selektierbares Markergen inseriert ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, bei dem das rekombinante Plasmid codierende Bereiche und Promotoren mit der biologischen Aktivität der in den rekombinanten Plasmiden pPCV002-ABC, pPCV002-AB, pPCV002-B1100, pPCV002-B300, pPCV002-CaMVBT, pPCV002-C, pPCV002-CaMVBT+C, pPCV002- CaMVC, pPCV002-A, pPCV002-AC, pPCV002-BC oder pPCV002- HSIPT enthaltenen codierenden Bereiche und Promotoren enthält.

17. Rekombinantes Plasmid, das codierende Bereiche und Promo toren mit der biologischen Aktivität der im rekombinanten Plasmid pPCV002-BC enthaltenen codierenden Bereiche und Promotoren enthält.

18. Rekombinantes Plasmid, das codierende Bereiche und Promotoren mit der biologischen Aktivität der im rekombinanten Plasmid pPCV002-HSIPT enthaltenen codierenden Bereiche und Promotoren enthält.