CN1195064C - 标记基因可从其上选择性地去除的用于将基因导入植物的载体 - Google Patents

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Abstract

一个用于将基因转入到植物中的载体，该载体在必要时可使在表达后从标记基因存在和发挥功能的染色体的DNA上切除与目的基因一起转入到植物中的标记基因，因而也消除了其功能，以及在其中导入了基因的植物细胞所衍生的组织的形态变化的基础上来检测该标记基因的表达和消除。该载体的构建利用了一个作为标记基因的能诱导形态学异常及控制一个能与调控器一块消失的DNA因子的基因。由于其所处位置，该形态学异常诱导基因能与该DNA因子一起起作用，而该目的基因并不处于这样一个位置上故其不与该DNA因子一起作用。

Description

标记基因可从其上选择性地去除的 用于将基因导入植物的载体
技术领域
本发明涉及利用遗传工程方法将所需基因导入植物得到转基因植物的新载体。
背景技术
利用遗传工程对微生物和培养细胞的转化目前已被应用于生产用作药品和诸如此类的生理活性物质，因此对工业有巨大的贡献。在植物育种领域，工业化应用遗传工程落后的原因是植物的生命周期比微生物等的生命周期长得多。但是，由于这一技术能使所需基因直接导入用于育种的植物，它比需要重复杂交的经典育种方法具有下面的优点：(a)能够只导入一个需要改进的特征；(b)能够导入除了植物以外的其它物种的特征(如微生物等)；和(c)能够大大缩短育种周期。所以，人们已经广泛深入地研究了植物育种的遗传工程方法。
具体地说，转基因植物的生产需要下面三个步骤：(1)将所需基因导入植物细胞(包括将它导入染色体、核酸等)；(2)选择只由其中已经导入所需基因的细胞组成的植物组织；和(3)从选择的植物组织再生植株。另外，其中在选择已经导入所需基因的组织时，通常使用可选择的标记基因。也就是说，通常把可选择标记基因与所需基因一起导入植物细胞，通过在导入细胞以及起源于这些细胞的组织中表达可选择标记基因显示的可鉴定的特征作为所需基因导入的指标。结果是，在至今通过遗传工程方法转化的植物的所有情况中，除了所需因外，也导入和表达了可选择标记基因。
但是，对于用作可选择标记的产物，只有几个基因对人体的安全性已经证实。因此，甚至是利用可选择标记基因导入了有用的特性生产的西红柿或土豆，只要表达了可选择标记基因，当将它们作为可食产品提供时将要承担许多障碍，包括顾客中莫名其妙的不安。
另外，在选择导入基因的组织后，甚至对研究植物育种的研究人员来说，可选择标记基因的表达将引起相当大的障碍，那是因为已经通过可选择标记基因产生的转基因植物再次导入另一个基因时，该基因的导入就不能利用同一可选择标记基因来进行了。换句话说，因为可选择标记基因已经存在于植物中，则它总会在植物中表达，而不管新的所需基因是否与可选择标记基因一起导入植物中。所以，这样的可选择标记基因不能再用作新的所需基因导入的指标。结果是，在某些植物中重复基因转移的次数自然地受到用于植物中的不同可选择标记基因的数目的限制。但是，至今可得的可选择标记基因的种类不是很多。另外，并不是所有可选择标记基因在目标植物中都可使用。
为了解决上述问题从而有效地生产完全不受可选择标记基因影响的导入了基因的组织或植物，本发明人已经开发了新的载体以用于将所需基因导入植物细胞(日本专利申请号H07-313432)。这一载体含有所需基因、作为可选择标记基因的形态学异常诱导基因和可去除的DNA元件。由于所处位置，其中形态学异常诱导基因能完整地与可去除的DNA元件一起起作用，而所需基因则不与可去除的DNA元件一起完整地起作用。当利用这一载体将所需基因导入植物中时，可选择标记基因是可以从它存在和发挥功能的DNA中去除的。在可选择标记基因通过培养转基因细胞表达后，以一定比例失去功能，由导入了该基因的植物细胞衍生的组织的形态学变化可以检测可选择标记基因的表达和其功能的丢失。也就是说，由这一可选择标记基因在其中表达的细胞所衍生的组织显示了某种不正常的形态，而且，当通过去除可选择标记基因而失去其功能的细胞(即只导入了所需基因的细胞)从其后的组织产生时，从得到的细胞再生了具有正常形态的组织。因此，利用这一载体，通过简单地重复培养导入基因的细胞和通过肉眼选择培养得到的组织就可以生产含有只导入有所需基因的细胞的植物组织以及随后的植物个体。
但是，甚至在本发明人开发的这一载体中可选择标记基因的去除也是不能自由控制的。因此，如果可去除的DNA元件的能力较强的话，可选择标记基因将可被非常快地去除。例如，在与所需基因一起导入植物细胞后，可选择标记基因在它表达之前可被立即去除。在这种情况下，可以得到只导入有所需基因的细胞构成的组织；但是，未发生有基因导入的组织的导入了可选择标记基因的形态学变化，结果是未筛选到这样的组织。
另外，如果可选择标记基因的去除是可以自由控制的，只导入了所需基因的细胞的产生和起源于这样的细胞的植物组织的产生是可同时发生或适当控制的，所以，利用这一载体在实践中生产转基因植物是非常方便的。
因此，本发明的一个目的是提供用于在植物中导入基因的载体，它含有可选择标记基因，其中在它表达后，通过从DNA如染色体等中去除可选择标记基因就可以选择性地去除与所需基因一起导入植物细胞的可选择标记基因的功能，可选择标记基因存在于该DNA中并在其中起作用，通过由导入基因的植物细胞衍生的组织的形态学变化可以检测可选择标记基因的功能的表达和丢失。
本发明的公开
通过利用形态学异常诱导基因作为可选择标记基因，同时将可去除DNA元件置于可诱导启动子的控制下构建载体可以完成本发明的目的，其中对形态学异常诱导基因的定位使它不与可去除DNA元件完整地起作用，其中所需基因的定位使它不与可去除DNA元件一起完整地起作用。
下面将详细地讨论本发明。
如本文所用，形态学异常诱导基因是诱导组织的形态学异常分化如矮小、顶端优势的破坏、色素的变化、冠状虫瘿的形成、有绒毛的根、波纹状叶子等的形成。据报道，各种形态学异常诱导基因如细胞分裂素合成基因(如ipt(异戊烯基转移酶)基因(A.C.Smigocki，L.D.Owens，Proc，Natl.Acad.Sc.USA，85：5131，1988))，iaaM(色氨酸单加氧酶)基因(H.J.Klee等人，Genes &Development，1：86，1987)，基因5(H.Koerber等人，EMBO杂志，10：3983，1991)，基因6b(P.J.J.Hooyaas等人，Plant Mol.Biol.，11：791，1988)，rol基因如rolA到D(F.F.White等人，细菌学杂志(J.Bacteriol)，164：33，1985)等等，存在于在各种植物中诱导肿瘤或畸胎瘤(即形成不定枝或不定根)的土壤杆菌属等的细菌中。另外，据报道还有萨氏假单胞菌中的iaaL(吲哚乙酸赖氨酸合成酶)基因和各种植物中的同源盒基因，光敏色素基因等等。
任何这些基因可以用于本发明。其中，在本发明中诱导顶端优势的破坏的ipt基因和诱导从绒毛根再生的植物的绒毛根、矮小、波纹状叶子等的rol基因是优选的可选择标记基因，因为在各种形态学异常诱导基因中它们诱导可鉴定的形态学异常。
另外，可以设计这些可选择标记基因的组合，以使得在特定的其中导入了可选择标记基因的植物中再分化出特异结构如不定茎和不定根等等。在本发明中，根据生产转基因植物的条件，例如待导入基因的植物的种类，可以使用形态学异常诱导基因的组合。
本文所用的可去除DNA元件是指可以从该DNA元件在其中存在和起作用的DNA中去除的DNA序列元件。在植物中，已知存在于染色体中的转座子就是这种元件。转座子的结构、活性和行为已经差不多完全被鉴定了。转座子要起作用，基本上需要两个成分，从转座子中存在的基因表达的酶，它催化转座子本身的切除和转座(转座酶)，以及存在于转座子终端区的DNA结合序列，转座酶在此基础上起作用。通过这些元件，转座子从它存在的染色体中被切除，然后通常转座到该DNA的新位置。但是，该转座子同时以一定的比例丢失而不转座。本发明就利用了转座子的这种转座错误。
转座子可以是两种类型中的一种，自发转座子或非自发转座子。自发转座子保留了两个元件，转座酶和DNA结合序列。在自发转座子中，转座酶表达并结合到DNA结合序列上起作用，从而从染色体中自发切除转座子。非自发转座子保留了终端DNA结合序列，转座酶与该序列结合起作用。在非自发转座子中，转座酶基因突变以致转座酶不表达，所以转座子不能从染色体中自发切除。但是，当将转座酶用于来自自发转座子或来自独立的转座酶基因的非自发转座子时，非自发转座子与自发转座子的行为相似。
因此，在本发明中可以使用自发和非自发的转座子。例如，通过在其中插入形态学异常诱导基因和从自发转座子得到或合成的转座酶基因后就可以使用非自发转座子。
自发转座子的例子包括从玉米中分离的Ac和Spm(A.Gierl和H.Saedler，植物分子生物学(Plant Mol.Biol)，19：39，1992)。通过用限制性内切酶Sau3A消化玉米染色体wx-m7座位可以得到Ac(U.Behrens等人，Mol.Gen.Genet.，194：346，1984)。在植物转座子中这一转座子是分析得最多的。事实上，已经确定了该DNA序列(M.Mueller-Neumann等人，Mol.Gen.Genet.198：19，1984)。同时，非自发转座子的例子包括通过分别删除Ac和Spm的内部区得到的Ds和dSpm(H.-P.Doring和P.Starlinger，Ann.Rev.Genet.，20：175，1986)和那些从玉米以外的许多植物中分离的那些，这些植物例如金鱼草和空心菜等等(例如，Y.Inagaki等人，植物细胞(Plant Cell)，6：375，1994)。当将这些转座子导入外源植物的染色体中时，同时从染色体中切除了这些转座子并转座(例如，B.Baker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：4844，1986)。
另一个不存在于植物中的可去除的DNA元件，是起源于位点特异重组系统的元件。位点特异重组系统包括两个元件，具有特异性DNA序列的重组位点(相应于本发明的可去除DNA元件)和与DNA序列特异结合并且如果存在两个或更多序列时催化这些DNA序列之间的重组的酶(重组酶)。当两个DNA序列以同一方向位于同一DNA分子的给定间隔中时，可从DNA分子如质粒和染色体等中切除这些DNA序列支持的区域。当两个DNA序列以相反的方向定位于同一DNA分子上时，将这些DNA序列支持的区域进行颠倒。本发明利用了前面的切除过程。通过位点特异的重组系统，同源重组的结果是重组位点内发生切除和倒位，这与利用转座子的机制不同。已知重组基因不一定与重组位点存在于同一DNA分子上。重组酶基因只需要存在于同一细胞中并表达以便去除或颠倒两个DNA序列支持的区域(N.L.Craig，Annu.Rev.Genet.，22：77，1988)。
目前，在例如噬菌体、细菌(例如大肠杆菌)和酵母等的微生物中已经鉴定了位点特异的重组系统。其例子包括Cre/lox系统、pSR1系统、FLP系统、cer系统和fim系统(例如，N.L.Craig，Annu.Rev.Genet.，22：77，1988)。当从利用衍生于P1噬菌体的Cre/lox系统的微生物中分离的位点特异的重组系统(国际公开号WO93/01283)被导入与衍生这一系统的有机体不同的有机体(包括植物)中时，其行为与原始有机体中一样。同时根据本发明可以使用酵母(zygosaccharomyces rouxii)的位点特异重组系统(pSR1系统(H.Matsuzaki等人，细菌学杂志，172：610，1990))。这一pSR1系统也可以在更高等的植物中保持其固有功能(H.Onouchi等人，Nucleic Acid Res.，19：6373，1991)。
根据本发明，将这一可去除的DNA元件置于可诱导启动子的控制下。
亦即，可诱导启动子存在于范围从原核生物有机体(例如细菌等)到真核生物有机体(例如酵母、真菌、高等植物和哺乳动物等)之间的所有有机体中的结构基因的上游，这些元件可单独地或相互协调来控制某一基因或基因组的表达。例如，有时它们对应于各个个体的分化和生长时期或偶尔依赖于热、光、金属和诸如此类的环境因子来进行基因表达的开和关。根据本发明，利用具有如此功能的可诱导启动子，在其下游的可去除的DNA元件控制表达或可移动性。
目前已知的这种可诱导启动子的例子包括那些化学物质应答的启动子，如谷胱苷肽-S-转移酶I系统基因启动子(未审公开日本专利申请号H05-268965)、谷胱苷肽-S-转移酶II系统(GST-II)基因启动子(国际公开号WO93/01294)、Tet阻遏物融合类型花椰菜花叶病毒35S启动子(C.Gatz等人，Mol.Gen.Genet.，227：229，1991)、Lac操纵子/阻遏物系统启动子(R.J.Wilde等人，EMBO杂志，11：1251，1992)、alcR/alcA系统启动子(国际公开号WO94/03619)、糖皮质激素系统启动子(Takushi Aoyama，蛋白质、核酸和酶(Protein，Nucleic acid and Enzyme)，41：2559，1996)等，那些热应答启动子，如hsp80启动子(未审公开日本专利申请号H05-276951)等和那些光应答启动子，如核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因(rbcS)启动子(R.Fluhr等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2358，1986)、果糖-1，6-二磷酸酶基因启动子(PCT国际公开的日本再公开专利申请号H07-501921)、捕光叶绿素a/b结合蛋白基因启动子(未审公开日本专利申请号H05-89)等。
在这些启动子中，在高等植物中的rbcS启动子作为可诱导启动子已经得到最深入的研究并且Chua等人对其有更详细的分析(例如，参见Matsuoka，Plant Cell Technology Supplement，3：552，1991)。由于这一原因，在本发明的实施例1中利用这一启动子，但是这一因子的调节对应于光的基因表达的机制还没有确立。另一方面那些应答化学物质的启动子，通常包括GST-II基因启动子，其通过化学物质的量可以相对自由地控制基因表达的诱导，因此在实际使用中，与不得不通过控制热或光的来控制基因表达的热-或光应答启动子相比，他们是具有优势的。
在本发明中，可以将形态学异常诱导基因插入到某一个位置上，在这一位置上该基因与可去除的DNA元件一起切除。例如，当将转座子用作可去除DNA元件时，形态学异常诱导基因可以插入到不影响转座子的切除的位置上，该位置在转座子基因启动子区的上游但在转座酶结合的终端区的下游。当使用pSR1系统时，可以将形态学异常诱导基因插入到不抑制重组酶表达的重组位置支持的区域中的任何位置上。
可以将本发明的载体用于任何通过遗传工程方法能将基因导入其中的植物。根据本发明，所需基因可以是赋予农业上优良特征的任何基因和允许进行基因表达机制等的研究的任何基因，虽然农业上优良的特征并非必需。
关于所需基因的启动子和终止子，只要他们在植物中有功能，对其使用没有任何限制。启动子的例子包括花椰菜花叶病毒的35S启动子(J.T.Odell等人，自然(伦敦)，313：810，1985)、胭脂碱合成酶的启动子(W.H.R.Langridge等人，Plant Cell Rep.4：355，1985)等。终止子的例子包括胭脂碱合成酶的多聚腺苷酸化信号(A.Depicker等人，J.Mol.Appl.Gen.，1：561，1982)、章鱼碱合成酶的多聚腺苷酸化信号(J.Gielen等人，EMBO J.，3：835，1984)等等。
另外，如果序列已知，通过克隆cDNA或基因组DNA，或通过化学合成可以得到本发明的基因，即DNA。
通过感染植物的病毒或细菌可以间接在植物细胞中导入本发明的载体(I.Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42：205，1991)。病毒的例子包括花椰菜花叶病毒、双粒病毒组、烟草花叶病毒、菠萝花叶病毒(bromomosaic virus)等。细菌的例子包括根癌土壤杆菌(下文中称为根癌土壤杆菌)和发根土壤杆菌等。已知通常用土壤杆菌属的细菌感染双子叶植物。最近，也已经有通过用他们感染单子叶植物，在这些植物中导入基因的报道(例如，国际公开号WO94/00977)。
通过物理和化学方法如微注射、电穿孔、聚乙二醇方法、融合方法和高速弹道渗透等可以在植物细胞中直接导入本发明的载体(I.Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42：205，1991)。由于它们对土壤杆菌的感染有抗性，通常利用土壤杆菌属的间接导入方法不能用于许多单子叶植物和双子叶植物，而上面提到的直接导入方法对这些植物是有效的。
[效果]
在本发明中，表达形态学异常诱导基因使细胞生理异常。生理异常包括在植物细胞中植物生长激素的生产，结果是使含有形态学异常诱导基因的细胞的增殖和分化混乱后诱导出各种形态学异常。例如，顶端优势破坏形成的紊乱的茎的聚集(极端多茎的表现型)和绒毛根等性状可以起源于导入了形态学异常诱导基因的细胞。这一表现型是通过上面提到的细胞的不正常增殖和分化形成的。所以，这一形态学异常组织只由含有这一基因的细胞组成。因此，如果利用这一基因作为可选择标记基因与所需基因一起构建载体导入植物细胞中，培养该细胞，然后只通过肉眼筛选起源于植物细胞的形态学异常组织就可以选择只由导入了可选择标记基因和所需基因的细胞组成的组织。
另外，根据本发明可将形态学异常诱导基因掺入到一个特定位置上，在该位置上它与可诱导启动子控制下的可去除DNA元件完整地起作用。当利用具有这种构建的载体把基因导入植物中时，根据所用的可诱导启动子的情况对转基因后的植物细胞可人工施加适当的刺激，例如热、光和化学物质等可表达可去除的DNA元件，随着可去除DNA元件以一定的比例从其导入和发生作用的DNA分子上的除去，作为可选择标记基因的形态学异常诱导基因也失去了其功能，同时不与该(形态学诱导)基因完整起作用的所需基因仍然保留于同一DNA分子上并保持了其功能。因此，也就是说，保留了那些其中仅导入了所需基因的细胞。
而且，由于该可选择标记基因的功能的丢失，即形异学异常诱导基因的功能的丢失是可以与导入该基因时所用的同样的方式通过肉眼检测到其形态学变化的，仅由其中可选择标记基因的功能已丢失的细胞组成的组织，即仅由其中所需基因已导入的细胞组成的组织可以被明确而容易地选择出来。也就是说，为了获得只由这种细胞组成的组织，先培养导入了基因的细胞，并通过肉眼选择表现出形态学异常的组织，然后分离选择出的组织，这种形态学异常例如由形态学异常诱导基因的表达引起的多茎表现型和绒毛根等。接着，如果根据分离组织培养过程中使用的可诱导启动子选择性地给予适当的刺激，这时可从表现出形态学异常的组织中获得的表现出形态学正常的组织，同样也可以用肉眼选择。
附图的简要说明
图1显示在pNPI206构建方案中直到制备pNPI201的步骤。
图2显示在pNPI206构建方案中制备pNPI201到pNPI203的步骤。
图3显示在pNPI206构建方案中制备pNPI203到pNPI204的步骤。
图4显示在pNPI206构建方案中制备pNPI204到pNPI206的步骤。
图5是pNPI206结构中T-DNA区的限制酶图谱。
图6显示了pNPI125构建方案。
图7显示了pNPI128的构建方案。
图8显示了在pNPI123构建方案中直到制备pIPT2的步骤。
图9显示了在pNPI123构建方案中制备pIPT2到pIPT3的步骤。
图10显示了在pNPI123构建方案中制备pIPT3到pNPI4的步骤。
图11显示了在pNPI123构建方案中制备pIPT4到pNPI123的步骤。
图12显示了在pNPI303构建方案中制备pNPI200和pG1E7到pNPI301的步骤。
图13显示在pNPI303构建方案中制备pNPI123和pNPI128到pIPT8的步骤。
图14显示了在pNPI303构建方案中制备pNPI301和pIPT8到pNPI302的步骤。
图15显示了在pNPI303构建方案中制备pNPI302到pNPI303的步骤。
实施本发明的最佳方式
[实施例]
在下面的实施例中，根据分子克隆，第二版(Sambrook等人，冷泉港实验室出版社，纽约，1989)的指导，或通过制造商的另外说明进行实验。
实施例1
1.构建载体
从日本专利申请号H07-313432叙述的质粒pNPI125中利用限制性内切酶XbaI和EcoRI切下酵母位点特异性重组系统(pSR1系统)的重组酶基因(下文中称为“R基因”)和与其连接的胭脂碱合成酶多聚腺苷酸化信号，并将它们插入到pHSG398(从Takara Shuzo有限公司购买)的XbaI-EcoRI限制性内切酶位点之间得到质粒pNPI200。
另一方面，利用限制性内切酶KpnI消化含有核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因启动子(rbcS-3B)的质粒(从名古屋大学的Mamoru Sugita博士处得到)，利用T4聚合酶I(大亚基)消化，以将所得的粘性末端形成平末端。然后，在得到的平末端之间插入5’-磷酸SalI接头得到质粒pRBCS，利用限制性内切酶SalI从pRBCS切下rbcS-3B，并将它插入pNPI200的SalI限制性内切酶位点间得到质粒pNPI201。
同时，rbcS-3B是来源于西红柿(蕃茄VFNTLA 1221)的光应答的启动子。除了这一启动子，西红柿有五个其它类似于rbcS的可诱导启动子启动子(rbcS-1、-2、-3、-3A和-3C)，Sugita等人已经分析了它们的表达方式(M.Sugita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7104，1987)。
然后，利用限制性内切酶PstI和BamHI消化质粒pNPI201，利用T4聚合酶I(大亚基)，通过消化将所得的粘性末端变成平末端，然后连接，得到质粒pNPI202。利用限制性内切酶EcoRI和HindIII，从质粒pNPI202中切下含有rbcS-3B、R基因和胭脂碱合成酶多聚腺苷酸化信号的片段并将它们插入到pUC119(从Takara Shuzo有限公司购买)的EcoRI-HindIII限制性内切酶位点之间以得到质粒pNPI203，再次利用限制性内切酶EcoRI和HindIII从质粒pNPI203中切出含rbcS-3B、R基因和胭脂碱合成酶多聚腺苷酸化信号的片段并将它们插入日本专利申请号H07-313432所述的质粒pNPI128的EcoRI-HindIII限制性内切酶位点之间，得到质粒pNPI204。
然后，在所得的质粒pNPI204的HindIII限制性内切酶位点中插入含有花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)和与其连接的ipt基因的片段，它们是利用限制性内切酶HindIII从也是日本专利申请号H07-313432中叙述的质粒pNPI123中切下的，如此得到了质粒pNPI205。
利用限制性内切酶PstI从质粒pNPI205切下含有与CaMV35S启动子连接的ipt基因、R基因和与rbcS-3B连接的胭脂碱合成酶多聚腺苷酸化信号和位于其两末端的酵母位点特异性重组系统的重组序列Rs的片段，将它插入用于把基因转入到植物中(购自TOYOBO有限公司)的载体质粒pBI121(从TOYOBO有限公司购买)上的SseI限制性内切酶位点。这样就得到了所需的称为质粒pNPI206的载体。当利用含有这一质粒的根癌土壤杆菌感染植物时，在这种情况下，植物染色体中整合了存在于质粒RB位点和LB位点之间的T-DNA区及从nptII基因(新霉素磷酸化酶基因)到GUS基因(β-葡糖醛酸酶基因)的约12.5kb的区域。
同时，在大肠杆菌JM109菌株中导入质粒pNPI206，得到的菌株以大肠杆菌JM109(pNPI206)用于国际保藏[国际贸易和工业部，工业科学和技局，国家生物科学和人技术研究所(Higashi 1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，305)国际登记号FERM BP-5518，根据布达佩斯条约原始保藏于1996年4月24日)。
图1到4显示了pNPI206的构建方案，图5显示了它的T-DNA区域的限制性酶切图谱。同时，图6显示了pNPI125的构建方案，图7显示了pNPI128的构建方案，图8到11显示了pNPI123的构建方案。在这些附图中，“35S-P”代表花椰菜花叶病毒35S启动子，“NOS-P”代表了胭脂碱合成酶启动子，“T”代表了胭脂碱合成酶多聚腺苷酸化信号，“圆圈T”代表了ipt基因本身的多聚腺苷酸化信号，“半着色点网三角”代表重组序列Rs与其序列方向。如图5所示，这一质粒在其T-DNA区域含有作为可选择标记基因的lpt基因和作为所需基因的模型的nptII基因和GUS基因，T-DNA区域也就是整合进植物染色体中的区域。这一ipt基因是致病原根癌土壤杆菌具有的肿瘤诱导基因中的一个，将它导入植物细胞后可诱导植物激素即细胞分裂素的过度生产，并导致细胞朝着形成极端多茎的方向分化。同时，赋予卡那霉素抗性的nptII基因和通过代谢特异底物在含有该基因的细胞中生产蓝色色素的GUS基因是通常用于分析植物中基因表达的基因。
另外，由于在酵母位点特异重组系统(pSR1系统)中的一对重组序列Rs之间的区域在质粒中以可去除的DNA元件起作用插入ipt基因的形式是夹在方向相同的Rs重组序列之间。但同时，R基因作为催化去除Rs之间的区域的酶的基因被连接到可诱导启动子，也就是光应答启动子rbcS-3B的下游，因此除非将它置于适当的光条件下通过调节启动子可使该基因发生表达，或发生Rs之间的去除，否则将不会发生这些事件。
II.在土壤杆菌中导入pNPI206
在10毫升YEB液体培养基(含有5克/升牛肉提取物，1克/升酵母提取物，1克/升蛋白胨，5克/升蔗糖，和2毫摩尔/升MgSO4，pH7.2，22℃(下面使用22℃的pH，除非另外说明))中接种根癌土壤杆菌菌株LBA4404(购自CLONTECH CO.LTD)，在28℃培养直到OD630在0.4到0.6范围内。然后，在4℃，6900×g离心培养物10分钟，收集细胞。将细胞悬浮于20毫升10毫摩尔/升Tris-HCl(pH8.0)中，在4℃，6900×g再离心悬浮液10分钟。随后，将收集的细胞再悬浮于200微升的YEB液体培养基中，并将这一悬浮液用作导入质粒的细胞悬浮液。
将用于质粒导入的200微升细胞悬浮液与6微克上述步骤I中得到的pNPI206在15毫升容量试管(Falcon制造)中混合，将试管浸入已在液氮中预冷30到40分钟的乙醇中5分钟冷却混合物，将试管在29℃的水浴中放置25分钟，在试管中加入750微升YEB液体培养基，然后于29℃在摇床上把细胞在试管中培养1小时从而将PNPI206导入土壤杆菌中。
III.来自土壤杆菌的pNPI206在烟草中的导入、导入pNPI206的烟草细胞的培养和所得组织的形态学
将在温室中生长的烟草(烟草栽培种SR1)的成熟叶子在1v/v％的氯化钠水溶液中浸泡灭菌，用无菌水洗涤三次。然后，去除叶子的中肋，以便形成约8平方毫米的叶盘。然后将所得叶盘在上述步骤II中导入了pNPI206的根癌土壤杆菌菌株LBA4404的细胞悬浮液中浸泡约1分钟，由此被感染(在YEB液体培养基中过夜培养后用OD630＝0.25的无菌水稀释悬浮液)。将感染叶盘置于无菌滤纸上以便去除任何额外的细胞悬浮液。然后将它置于无激素的MS琼脂培养基上(T.Murashige和F.Skoog，Physiol Plant.，15：473，1962(假如在其中加入了0.8w/v％的琼脂))，该培养基含有50毫克/升的乙酰丁香酮，叶子的背面朝上，在暗处25℃，培养3天(下文中，植物组织的培养温度是25℃，除非另外说明)。其次，当将这一叶子移植到只含有500毫克/升的羧苄青霉素的无激素MS琼脂培养基中，在约7到10微摩尔/秒/米2量的光下培养，同时用含有同样成分的培养基继代培养，在感染后三个月得到了225个极端多茎表现型系，其中的126个系分成两组，将各组在约7到10微摩尔/秒/米2或约70微摩尔/秒/米2量的光下，利用含有同样成分的培养基继续培养。
结果是，在约70微摩尔/秒/米2量的光下培养的系中，在感染约6个月后，从43个极端多茎表现型系中产生具有肉眼可见的正常表现型(下文中称为“正常个体”)，而在约7到10微摩尔/秒/米2量的光下培养的这些系中，在同样的时期后，只有12个极端多茎表现型系产生正常个体。
结果如表1所示。
表1：在用pNPI206转化的培养烟草组织中的正常个体的光条件和产生的比例
光条件*1 用于检测光条件的极端多茎表现型系的数目 产生正常个体的系的数目 正常个体的产生比例(％)*2
 L2→L1     126     43     34.1
 L2→L2     126     12     9.5
在L2条件下培养三个月，然后在L1或L2条件下培养三个月。
*1：光条件L2；约7到10微摩尔/秒/米2量的光
          L1；约70微摩尔/秒/米2量的光
*2：(产生正常个体的系的数目/用于检测光条件的极端多茎表现型系的数目)×100
正如从上面的表中显示的结果可以看出，当用本发明的载体pNPI206转移的培养烟草组织在低光条件下培养，然后在高光条件下培养时，正常个体产生的比例差不多是低光条件下连续培养(所产生正常个体)的4倍。因此，这表明在利用pNPI206导入基因的组织中，用于调节可去除DNA元件的光应答启动子rbcS-3B控制了用作可选择标记基因的形态学异常诱导基因的行为，并且通过将导入基因组织的光条件从低光量转换到高光量可以加速它的去除。
实施例2
1.构建载体
用PstI消化实施例1中得到的质粒pNPI200，利用T4聚合酶I(大亚基)把所得的粘性末端消化变成平末端。利用限制性内切酶NdeI从质粒pG1E7(购自Zeneca有限公司)中切下GST-II 27 RD亚基基因(GST-II-27)启动子(PCT国际公开日本国内再公开的专利申请号H06-511385，第7页右下栏15到17行)，同时利用T4聚合酶I(大亚基)将得到的粘性末端进行平齐化，随后插入pNPI200的平末端之间以得到质粒pNPI300。其次，利用限制性内切酶EcoRI从所得的pNPI300中切下含有GST-II-27启动子-R基因和胭脂碱合成酶多聚腺苷酸化信号的片段，并插入到pUC18(购自TakaraShuzo有限公司)的EcoRI限制性内切酶位点内以得到质粒pNPI301。
GST-II是存在于玉米等中的酶，是有关除草剂解毒的GST的同工酶之一。同时，GST-II-27启动子控制了作为GST-II亚基之一的27kD的亚基的基因表达，已知通过存在除草剂解毒剂如2，2，5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1，3-噁唑烷或其类似物(PCT国际公开日本再公开的专利申请号H06-511385)时诱导GST-II-27的表达，这一启动子可显著增加GST-II的活性从而提高玉米等对除草剂的抗性。
另一方面，利用限制性内切酶HindIII从质粒pNPI123中切下CaMV35S启动子和与其连接的ipt基因，并插入到pNPI128的HindIII限制性内切酶位点中，得到质粒pIPT8。随后，利用限制性内切酶EcoRI从pNPI301中切下含有GST-II-27启动子、R基因和胭脂碱合成酶多聚腺苷酸化信号的片段并插入到所得的pIPT8的EcoRI限制性内切酶位点中以获得质粒pNPI302。
利用限制性内切酶SseI从质粒pNPI302切下含有与CaMV35S启动子连接的ipt基因、R基因和与GST-II-27启动子和定位于两端的酵母位点特异重组系统的重组序列Rs连接的胭脂碱合成酶多聚腺苷酸化信号的片段，并将它插入到用于在植物中导入基因的载体质粒pBI121的SseI限制性内切酶位点中，就可以得到所需载体，将所得的所需载体命名为质粒pNPI303。即在这一质粒pNPI303中，用GST-II-27启动子而不是用pNPI206的rbcS-3B用于控制R基因。图12到15显示了pNPI303的构建方案。用于这些附图中的符号与用于图1到11的那些相同。
而且，同时在大肠杆菌JM109菌株中导入质粒pNPI303。并且将得到的大肠杆菌作为大肠杆菌JM109(pNPI303)用于国际保藏[国际贸易和工业部，工业科学和技术局，国家生物科学和人类技术研究所(Higashi 1-1-1，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，305)，国际登记号FERM BP-5927，于1997年4月23日根据布达佩斯条约原始保藏]。
II.在烟草中导入pNPI303和导入有pNPI303的烟草的分析
以与实施例1的步骤II和III所述相同的方式，将质粒pNPI303导入根癌土壤杆菌菌株LBA4404，用得到的根癌土壤杆菌菌株LBA4404感染烟草的叶盘，然后将这一感染的叶盘平放在含有50毫克/升的乙酰丁香酮的无激素MS琼脂培养基上，在光下培养3天。其次，当将得到的被感染的叶子移植到只含有500毫克/升羧苄青霉素的无激素MS琼脂培养基上，继续培养，继代培养同样的时期时，得到了极端多茎的表现型，在培养2个月后得到30个极端茎表现型系，将它们分成4组，将每组放在含有500毫克/升羧苄青霉素的无激素MS琼脂培养基上，在培养基中另外加入0、10、20或30毫克/升的2，2，5-三甲基-(二氯乙酰)-1，3-噁唑烷，以便检测正常个体的产生比例。
表2显示了在存在2，2，5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1，3-噁唑烷时培养1个月后的结果。在这种情况下，为了证实用作实施例中所需基因的模型的GUS基因的表达，肉眼进行正常个体的检测，并根据Jefferson等人的方法，进行GUS活性试验。
表2：用pNPI303转化的培养烟草组织中正常个体的产生比例和2，2，5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1，3-噁唑烷的浓度
产生的正常个体的数目   浓度0(毫克/升)   浓度10(毫克/升)   浓度20(毫克/升)   浓度30(毫克/升)
    系的数目*1   0   5   7   6
    茎的数目*2   0(0*3)   5(2*3)   9(4*3)   9(5*3)
存在2，2，5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1，3-噁唑烷时培养后1个月
*1：产生正常个体的系的数目
*2：产生正常个体的茎的数目
*3：在作为正常个体产生的茎中显示GUS活性的个体数目
如表2显示的结果可以看出，当没有加入2，2，5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1，3-噁唑烷时没有产生正常个体。另一方面，当它以10毫克/升的量加入时产生正常个体，当它以20毫克/升的量加入时产生比例进一步增加。结果是，同时发现在这种情况下，作为用于调节可去除DNA元件的化学物质应答启动子的GST-II-27启动子可以正常地起作用，于是当通过pNPI303在植物组织中导入基因并将所得组织在存在适当化学物质进行培养时，它诱导可去除DNA元件的表达和加速它的去除，并且进一步将作为可选择标记基因的形态学异常诱导基因去除。
另一方面，在约一半作为正常个体产生的茎中证实了GUS活性的表达，也就是所需基因的存在和表达，在其余一半中检测不到GUS活性。虽然其中的原因仍未清楚，但是，例如，如果通过相互连接，优选在烟草染色体中导入多个pNPI303的T-DNA区，在T-DNA区内的重组序列Rs之间不发生同源重组，而在互不相同的T-DNA区的重组序列之间发生，从而导致去除的区域夹在这样的序列中间。结果是，不仅ipt基因而且GUS基因也可以包括在与可去除DNA元件一起去除的区域中，在这种情况下，与这一实施例的情况相同，从极端多茎表现型中将产生正常但没有GUS活性的个体。
同时，将显示GUS活性的正常个体之一以PCR进行DNA分析，在DNA水平证实了GUS基因的存在和作为可选择标记基因的ipt基因与可去除DNA元件一起去除了。
工业应用性
当利用本发明的载体把基因导入植物细胞中时，通过在基因导入后对细胞施加特定刺激，如热、光和化学物质等可使得与所需基因一起导入的可选择标记基因的功能在其存在和起功能的DNA上以一定的比率去除后被消除。因此，仅仅通过改变用于导入的所需基因的部分而不改变可选择标记基和其它的结构就可以使该载体在特定植物中实现该基因的重复导入。于是，重复导入的进行就可以不受次数限制了。
另外，因为将形态学异常诱导基因用作可选择标记基因，利用组织的形态学变化作为指标可以进行只由导入可选择标记基因的细胞形成的组织(也就是只由导入所需基因的细胞形成的组织)的筛选，以及以在可选择标记基因的功能消失后还能够表达的方式单独导入的所需基因的细胞形成的组织的筛选。结果是，可以确定地和容易地选择只起源于在染色体等中仅导入了所需基因的细胞的组织，并且不存在选择过程中减弱植物细胞的活性的问题，因为在培养基中不必要加入用于筛选的抗生素。因此，可以有效地进行基因的重复导入，不经过杂交步骤也可以得到由只这些细胞组成的转基因个体，也就是消除了可选择标记基因的影响及完全清除有关基因产物的忧虑的个体。
另外，根据本发明的载体，去除可选择标记基因是可以人工控制的。结果，即使在可去除DNA元件具有非常优良的去除能力因而该可选择的标记基因可快速被去除，同时当不能进行如此调控而要获得仅由其中导入了所需基因的细胞组成的组织变得相当困难的情况下，其能力在本发明中仍然可被用作可去除的DNA元件。另一方面，由于利用本发明的载体可以有选择地进行同步化地或有控制地产生这种细胞以及这些细胞组成的植物组织，可以非常方便地在实践中来产生转基因植株。例如，当ipt基因被用作形态学异常诱导基因即可选择的标记基因时，在无植物激素条件下，它可诱导在其中导入了该基因的细胞的相当活跃的生长，并且引起不定牙等的分化。因此，在维持可选择的标记基因的前期条件下通过持续培养可大量生产能产生当有必要时在任何时候都可在其中导入所需基团的细胞的组织。

Claims (7)

1.一种用于在植物中导入基因的载体，它包括所需基因、作为可选择标记基因的形态学异常诱导基因以及置于可诱导启动子控制下的可去除DNA元件，其中形态学异常诱导基因存在于可去除DNA元件内，形态学异常诱导基因所处的位置使它与可去除DNA元件完整地起作用，而所需基因所处的位置使它不与可去除DNA元件一起完整地作用。
2.根据权利要求1所述的载体，其中控制可去除DNA元件的可诱导启动子是核酮糖二磷酸羧化酶小亚基rbcS的启动子。
3.根据权利要求1所述的载体，其中控制可去除DNA元件的可诱导启动子是谷胱苷肽-S-转移酶II系统基因的启动子。
4.根据权利要求1所述的载体，其中可去除DNA元件来自于位点特异重组系统。
5.根据权利要求1所述的载体，其中形态学异常诱导基因从属于土壤杆菌属的细菌中得到。
6.根据权利要求1所述的载体，其中形态学异常诱导基因是细胞分裂素合成基因。
7.根据权利要求6所述的载体，其中细胞分裂素合成基因是存在于根癌土壤杆菌的T-DNA中的ipt基因，即异戊烯基转移酶基因。
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