KR19990030697A - 제초제 내성을 위한 키메라 유전자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물체들에 3,5-디할로-4-히드록시벤조니트릴 기재의 제초제에 대한 내성을 부여하는 데 쓸 수가 있는, 상기 제초제에 대한 내성의 니트릴라제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자, 외래 프로모터 그리고, 경우에 따라서는, 폴리아데닐화 신호 부위를 함유하는 키메라 유전자에 관한 것이다 (여기서 프로모터는 식물 세포들에서 자연 발현되는 유전자에서 유래한 것이며 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35 S RNA (CaMV 35S)의 프로모터, 해바라기 (Helianthus annuus) 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 (RubisCO)의 작은 아단위(SSU)의 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것임).

Description

제초제 내성을 위한 키메라 유전자
본 발명은 식물체들에 3,5-디할로-4-히드록시벤조니트릴 기재의 제초제에 대한 내성을 부여하는 데 쓸 수가 있는 키메라 유전자, 이 유전자를 이용하는 식물세포들의 형질전환 방법 그리고 이들 세포들에서 재생된 형질전환 식물체들에 관한 것이다.
식물체들의 게놈 내에 상기한 종류의 제초제들의 분해에 특이적인 니트릴라제를 코오딩하는 유전자를 도입하면, 그 식물체들은 상기 제초제들, 특히 3,5-디브로모-4-히드록시벤조니트릴 또는 브로목시닐에 대한 내성을 갖게 된다는 것이, 유럽 출원 제 229.042호로부터, 잘 알여져 있다. 이 기술은 유용한 결과를 가져다 주지만, 특히 식물체들에서의 발현의 수준과, 따라서, 상기 제초제들에 대한 식물체의 내성의 질에 관련하여 성공의 기회를 높이고 그것의 경제적 잠재성을 크게 하기 위하여는 개선이 필요하다.
본 기술에 있어, "식물체"는 광합성을 할 수 있는 분화된 어떠한 다세포 유기체를 의미하는 것으로 이해되고, "식물 세포"는 식물체에서 유래된 그리고 칼루스(callus) 또는 배(embryo) 등의분화하지 않은 조직, 또는 식물체의 부분 또는 식물체 등의 분화한 조직 또는 종자를 형성하는 능력이 있는 어떠한 세포를 의미하는 것으로 이해한다.
본 발명의 목적은 이와 같은 요구를 충족시키기 위한 것이다.
그것은 식물체들에 3, 5-디할로-4-히드록시벤조니트릴 기재의 제초제에 대한 내성을 부여하는 데 쓸 수가 있는, 상기 제초제에 대한 내성의 니트릴라제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자, 외래 프로모터 그리고, 경우에 따라서는, 폴리아데닐화 신호 부위를 함유하는 키메라 유전자에 관한 것이다(여기서 프로모터는 식물세포들에서 자연 발현되는 유전자에서 유래한 것이며 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35 S RNA(CaMV 35S)의 프로모터, 해바라기(Helianthus annuus) 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제(RubisCO)의 작은 아단위 (SSU)의 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것임).
제 1도는 pTiA6의 오른쪽 및 왼쪽 보더를 그들의 본래 방향으로 소유하는 T DNA의 재형성을 나타낸 것이다.
제 2도는 T DNA의 pBR 322속으로의 도입을 나타낸 것이다.
제 3도는 겐타마이신에 대한 내성을 위한 유전자의 클로닝을 나타낸 것이다.
제 4도는 카나마이신에 대한 내성을 위한 유전자의 클로닝을 나타낸 것이다.
본 발명에 따른 키메라 유전자의 프로모터는 식물체에서 자연 발현되는 즉, 비식물형의, 예를 들면 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35 S RNA(CaMV 35S) 등의 바이러스형 등, 또는 바람직하게는 단자엽 또는 쌍자염 식물체들의 식물형, 특히 해바라기(Helianthus annuus) 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제(RubisCO)의 작은 아단위의 유전자에서 유래한 것이다. 이들 프로모터들을 단독으로 또는 조합하여 사용하는 것이 가능하다. 선택대상의 종류는 형질전환시키고자 하는 (단자엽 또는 쌍자엽) 식물체의 성질에 달려있다. 따라서, 쌍자엽 식물체의 형질전환에는 해바라기의 작은 아단위 RubisCO를 사용하는 것이 좋다.
이들 프로모터들의 각각은 다음과 같이 얻어질 수 있다:
1) 콜리플라워 모자이크 바이러스 35 S RNA (CaMV 35S)의 프로모터:
이 프로모터의 분리는 오델(Odell) 등(1985)에 의해 기술된 바 있다.
전사 개시 부위에서 위쪽으로 약 850 bp를 포함하는 클론(pJO5-2)이 구축을 위해 선택된 것으로 기술되었다. EcoRI-HindIII 단편이 분리되었고, 그 말단들을 클레나우 폴리머라제로 블런트(blunt) 상태로 만들어 주었으며 이 단편을 벡터 pUC 19 [얀니쉬-퍼론(Yannish-Perron) 등, 1985년]의 HincII 부위 속으로 클로닝하였다. 이 클론을 XbaI 및 PstI의 작용에 의해 소화시켰고, 얻어진 단편을 파아지 T4 폴리머라제로 처리하여 그 말단들을 블런트 상태로 만들어 주었다. 이 단편을 SmaI 및 XbaI으로 절단시킨 pUC19 Cm [벅클리(Buckley), 1985년] 속으로 클로닝하여, 클레나우 폴리머라제로 처리하였다. 이에 의해 얻어진 클론을 pRPA-BL I45로 표시하였다. 3'말단 AccI 부위를 클레나우나 폴리머라제로써 처리하고 그것을 상기 프로모터로부터 아래쪽에 위치한 단편들의, 클레나우 폴리머라제로 처리해 준, EcoRI 부위와 연결시킴으로서, EcoRI 부위가 재형성되며 이에 의해 얻어진 서열은, 전사 개시 부위에서 시작하면, 다음과 같다:
2) 해바라기(Helianthus annuus) 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제(RubisCO)의 작은 아단위의 프로모터.
이 프로모터가 유래되는 유전자는 왁스만(Wacksman) 등 (1987년)에 의해 분리되었다. 이 유전자의 프로모터를 함유하는 EcoRI 단편은 mp 18, 이 벡터의 폴리링커에서 바로 위쪽의 프로모터의 3' 부분 속으로 클로닝하였다. 이 클론을 그후 BstXI으로 선형화하고 Ba131 엑소누클레아제로 처리하였다. 그에 의해 얻어진 단편들의 혼합물을 SalI으로, 그 다음에는 클레나우 폴리머라제로 처리하였고, 마지막에는 낮은 DNA 농도에서 연결시켰다. 이러한 조작 후의 얻어진 클론들을 서열분석하였고, 추정되는 전사 개시 부위의 아래쪽의 후속 서열을 가지는 그것들의 하나가 선택되었다:
이 클론의 PstI 부위에서 ClaI 링커(A T C G A T)가 도입되었다.
따라서, 이 ClaI 부위를 클레나우 폴리머라제로 처리하고, 이 프로모터의 아래쪽에 위치한 단편들의, 클레나우 폴리머라제로 처리된, EcoRI 부위와 연결함으로써, EcoRI 부위가 재형성되며 이에 의해 얻어지는 서열은, 추정되는 전사 개시 부위에서 시작하면, 다음과 같다:
본 발명의 또 하나의 면에 따르면, 키메라 유전자는 코오딩 유전자와 프로모터 사이에 비(非)번역 중간 부위(링커)를 함유하며, 그것은 다음을 포함하는 군에서 선택될 수가 있다:
-한편은, 클로닝에 의해 부분변형된 그리고 다음의 서열을 갖는 pUC 19의 링커:
-다른 한편은, 옥수수 RubisCO의 작은 아단위의 비번역 부위: 이 부위는 레브런(Lebrun) 등 (1987년)이 기술한 유전자에 해당하는 cDNA에서 나온 것이다. 그것은 다음의 서열을 가지는 EcoRI-NcoI 단편이다:
-또 다른 한편은, 해바라기 RubisCO의 작은 아단위의 비번역 영역: 이 영역은 왁스만과 프레이시네트(Freyssinet) (1987년)가 분리한 cDNA에서 나온 것이다. 그것은 그 자체로서 분리된 적이 없고, 언제나 해바라기 RubisCO의 운송펩티드에 선행하여 발견된다. 그 서열은 다음과 같다:
본 발명에 따른 키메라 유전자는 경우에 따라서는 폴리아데닐화 영역 또는 부위를 함유하며, 그것은, 예를 들어 다음과 같은 것일 수가 있다:
1) pTi 37의 노팔린 신타제 유전자 [베반(Bevan) 등, 1983년]의 폴리아데닐화 부위. 이 부위는 5' 및 3'말단에서, 각각, BamHI 및 EcoRI 부위를 도입하기 위하여 클레나우 폴리머라제로 처리하여 M13mp18의 SmaI 부위 속으로 클로닝한 260-bp MboI 단편 [프랄리(Fraley) 등, 1983년, 특허출원 PCT 제 84/02913호]중에 포함되어 있다. BamHI 부위는 비그나 라디아타(Vigna radiata) 누클레아제로 처리하여 pUC 19의, 클레나우 폴리머라제로 처리된, SalI 부위에서 클로닝하였다. 이 단편은 이제 5' 말단에서 HindIII 부위를 포함하며, 그것은 니트릴라제 유전자의 3' 말단에서 연결될 수가 있다.
2) 옥수수 RubisCO의 작은 아단위의 유전자의 폴리아데닐화 부위: 이 부위는 레브런 등(1987년)이 기술한 유전자의 540-bp SmaI-BalII 단편의 형태로 분리되었다. ClaI 링커(ATCGAT)를 SmaI 부위에서 도입하였다. ClaI으로 절단하고 클레나우 폴리머라제로써 메운 후, 이 단편을 PstI으로 절단한 pUC19속으로 클로닝하였으며 파아지 T4 폴리머라제로써 처리하고 BamHI으로 다시 잘라 주었다. 이 조작으로 HindIII 부위가 폴리아데닐화 부위의 5' 말단에서 도입될 수가 있었다. 얻어진 서열은 다음과 같다:
본 발명의 또 하나의 면에 따르면, 키메라 유전자는 경우에 따라서는, 중간부위와 니트릴라제 유전자 사이에, 옥수수 RubisCO의 작은 아단위의 운송 펩티드를 코오딩하는 부위 및 헤바라기의 작은 아단위의 그것으로 이루어진 군에서 선택된, 그것을 포함하는 것이 좋을 수가 있다. 천연 유전자에서의 운송 펩티드의 기능은 RubisCO의 작은 아단위가 엽록체의 스트로마 속으로 들어가게 하는 것이다.
그것들은 상기한 중간 부위와 니트릴라제의 구조 유전자 사이에 도입된 경우에는 마찬가지로 니트릴라제도 이 구획 속으로 들어가게 하여야 한다:
1) 옥수수 RubisCO의 작은 아단위의 운송 펩티드:
이 단편은 레브런 등(1987년)이 기술한 유전자에 해당하는 cDNA에서 나온 것이다. 그것은 141-bp NcoI-SphI 단편이며, 이 NcoI 부위는 번역 개시 코돈과 운송 펩티드의 절단 부위인, SphI 부위를 걸치고 있다. 이 단편의 SphI 말단을 파아지 T4 폴리머라제로써 처리하고 그것을 니트릴라제 유전자의, 클레나우 폴리머라제로 처리한, NcoI 말단과 연결함으로써, 변형되지 않은 니트릴라제의 엽록체의 스트로마에서의 생성을 가능케 하는 서열이 재형성된다.
2) 해바라기 RubisCO의 작은 아단위의 운송 펩티드:
이 단편은 왁스만과 프레이시네트(1987년)가 분리한 cDNA에서 나온 것이다. 이 서열은 원래 SphI 부위를 운송 펩티드의 절단 부위에서 가진 것은 아니다. 이 영역의 서열은 다음과 같다:
C 하나가 통제 인위돌연변이에 의해 별표로 표시된 A로 치환되어, 이에 의해 SphI 부위가 만들어졌다. 이 조작을 수행하기 위하여, 졸러(Zoller)와 스미스(Smith) (1984년)의 방법이 사용되었다. 270-bp EcoRI-SalI 단편을 M13mp19am4 속으로 클로닝하였다. M13mp19에서 유래된, 상기 벡터는 5327번 염기에서 4번 유전자의 앰버 돌연변이를 가지며, 이 유형의 돌연변이에 대한 억제물질을 갖고 있지 않은 균주에서는 증식할 수가 없다. 이 재조합 파아지의 단일-가닥형의 정제 후, 세 개의 올리고누레오티드들을 한 단계로 혼성체형성(hybridization) 시켰다. 이들 인산화 올리고누레오티드들의 서열은 다음과 같다:
그것들은, 각각 다음을 가능케 한다:
1 : 운송 펩티드의 절단 부위에서의 단편의 돌연변이,
2 : 엠버 돌연변이의 수정,
3 : 인위돌연변이 단편의 위쪽 서열의 프라이밍(priming).
네 종류의 누레오티드 존재하의 클레나우 폴리머라제와 파아지 T4 리가제의 동시 작용 후, 얻어진 혼합물을 HB2154 균주 속으로 형질전환시켰으며 그 다음에는 HB2151의 론(lawn)상에 플레이트하였다 [카터(Carter) 등, 1985년]. 얻어진 클론들 중, SphI 부위를 추가로 가진 것들을 서열분석하여 이 구조를 확인하였고, 그들중 하나를 키메라 유전자의 제조에 사용하였다. 운송 펩티드의 절단 부위의 영역에 있어, 이 서열은 이제 다음과 같다:
5' C A A T G C A T G C
이 단편은 옥수수 RubisCO의 작은 이단위의 운송 펩티드를 코오딩하는 단편에 사용된 것과 똑같은 방식으로 사용된다.
키메라 유전자의 어셈블링은 상기한 요소들로써 제 1도 내지 4도의 도식에 따라 이루어진다. 그리하여 만들어진 각종의 유전자들을 하나 또는 두 종류의 벡터에 위치시켰으며 어셈블리 각각은 참고 번호가 지정되었다. 그리하여 제조된 각종의 벡터들은 아래의 표 1에 기술되어 있다:
[표 1]
사용된 벡터:
제 1 내지 4도에 나타낸 벡트 pRPA-BL-142 및 pRPA-BL-150Aalphal을 가져다. 준, 각종의 카메라 구성들은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 운반 시스템에 의해서 식물체 속으로 도입되었다. 이 목적을 위해 만들어진 운반 벡터들은 다음의 특징을 갖는다:
-pBR 322 유래의 복제 및 운반 원점,
-박테리아 선별을 위한, 예를 들면 겐타마이신에 대한 내성의 유전자,
-파아지 람다 유래의 COS 부위,
-pTiA6 T DNA의 오른쪽 및 왼쪽 보다(border)의 모두,
-경우에 따라서는, 유핵세포의 선별 유전자, 이를 테면 카나마이신에 대한 내성 등,
-경우에 따라서는, pUC18의 lac 알파 보상 유전자를 함유하는 단편.
pRPA-BL-142의 구성(제 1도 내지 제 4도):
pTiA6의 좌측 T DNA의 오른쪽 및 왼쪽 보다(제 1도)를 먼저 서브클로닝 하였다:
-오른쪽 보다:
바커(Barker) 등(1983년)의 번호부여 시스템에서 13774번에서 16202번까지 뻗어있는 BaMHI-EcoRI 단편을 해당 부위들에서 pGEM 1(프로메가 바이오테크사) 속으로 클로닝하여, pBL-17을 얻었다. 이 플라스미드를 NruI (14276번과 14475번) 및 EcoRI(16202번)으로써 소화시키고 클레나우 폴리머라제로 처리해주었다. 이 NruI 부위와 메워준 EcoRI 부위의 연결로써 14276번에서 EcoRI 부위가 재생되며 플라스미드 pBL-19가 얻어진다.
-왼쪽 보더:
바커 등 (1983년)의 시스템에서 602번에서 3390번까지의 뻗어있는 HimdIII 단편을 pGEM 1의 해당 부위 속으로 클로닝하여, pBL-21을 얻었고, 여기서 왼쪽 보더는 폴리링커의 반대 쪽에 있다. 이 플라스미드를 Acc 1(1161번과 2687번)으로 소화시키고 클레나우 폴리머라제로 처리한 후 연결시켰다. 그 결과로서 얻어지는 플라스미드 pBL-26은 HindIII와 XbaI 부위 사이에 삽입된 602번에서 1161번까지 뻗어있는 단편을 함유한다.
T DNA의 제조:
pBL-19의 EcoRI-BaMHI 단편을 PBL-26의 해당 부위 속으로 도입함으로써, PTTA6의 본래 방향의 오른쪽 및 왼쪽보더들을 갖고 있는 T DNA가재형성되었다.
얻어진 플라스미드는 PBL-70으로 표시된다.
T DNA의 PBR 322속으로의 도입(제 2도):
pBL-70을 HindIII로 잘라낸 후, 이 부위를 클레나우 폴리머라제로 처리하였고 이 플라스미드를 EcoRI으로 다시 절단시켰다. 얻어진 단편을 PruII-EcoRI으로 절단한 pBR 322속으로 클로닝하였다. 그 결과로서 얻어지는 클론은 pRPA-BL-112로 표시된다.
겐타마이신에 대한 내성의 유전자의 클로닝(제 3도):
겐타마이신에 대한 내성을 갖는 유전자는 pPH1 JlI [허쉬(Hirsh)와 브링거(Bringer), 1984년]에서 얻어졌다. 이 플라스미드를 BamHI 및 HindIII로 소화시켰고 그 단편들의 모두를 동일한 효소들로써 절단한 pUC 19속으로 클로닝하였다. 암피실린+겐타마이신에 대한 선별 후, 2.45-kbp 단편을 함유하는 클론들이 분리되었다. 이후의 조작을 위해 선택된 클론은 pRPA-BL-133이라 명명되었다.
이 클론의 BamHI 부위에서, pHC 79 [혼(Hohn)과 콜린즈(Collins), 1980년] 에서 분리된 그리고 파아지 람다의 COS 부위를 함유하는 1.6-kb의 BalII 단편을 도입하였다. 양쪽 방향으로 삽입된. 이 단편에 의해서 두 개의 클론들 pRPA-BL-134 및 pRPA-BL-135가 얻어질 수가 있다.
통합 벡터의 제조 (제 3도):
하나의 동일한 벡터에서 상기한 각종의 다른 부분들을 합치기 위하여, 플라스미드 pRPA-BL-134 및 pRPA-BL-135를 SmaI과 HindIII로 소화시키고, 겐타마이신에 대한 내성의 유전자를 함유하는 삽입서열(insert)과 파아지 람다의 COS 부위를 클레나우 폴리머라제로써 처리하였다. 플라스미드 pRPA-BL-112를 PstI 및 EcoRI으로 소화시키고 파아지 T4 폴리머라제로써 처리하였다. 양 단편들을 연결시켰고, 겐타마이신에 대한 내성, COS 부위, T DNA 그리고 pBR 322의 복제 원점을 동시에 함유하는 클론들으 선택하였다.
플라스미드 pRPA-BL-134로부터 pRPA-BL-141과 pRPA-BL-142가 얻어졌고, pRPA-BL-135로부터는 pRPA-BL-143과 pRPA-BL-144가 얻어졌다. 식물체 속으로 운반시키고자 하는 키메라 유전자들의 도입을 위해 pRPB-BL-142가 선택되었다. 이 벡터로부터, 마커 유전자 NOS-NPTII-NOS를 함유하는 구성(제 4도)이 얻어졌다. 플라스미드 pRPA-BL-142를 XbaI으로 소화시켰고, 그 말단들을 비그나 라디아타(Vigna radiata) 누클레아제의 작용에 의해서 환원시켰다. 별도로, pEND4 K [클리(Klee)등, 1985년]를 EcoRI으로 소화시켰으며 클레나우 폴리머라제로써 처리하였다. 가나마이신에 대한 내성의 키메라 유전자를 함유하는 1.6-kbp의 단편을 분리하였고, pRPB-BL-142속으로 도입하였다. 이들 융합들의 산물 하나가 pRPB-BL-150A으로 명명되었고, 이후의 조작을 위해 선택되었다. 이 벡터 속으로의 클로닝을 용이하게 하기 위하여, 파아지 T4 폴리머라제로 처리된, 그리고 pUC 18(얀니쉬-페론 등, 1985년)에서 분리한 lac 알파 보상 유전자를 함유하는 HacII 단편을 비그나 라디아타 누클레아제로 처리해 준 BamHI 부위에서 도입되었다. 얻어진 벡터들은 pRPA-BL-150Aalphal 및 pRPA-BL-150Aalpha2로 명명되었다.
pRPA-BL-150Aalphal은 식물체 속으로의 유전자 도입을 위한 기본으로서 사용된 벡터였다.
pRPA-BL-142 및 pRPA-BL-150Aalphal의 사용
이들 벡터들은 스스로의 힘으로 아그로박테리움에서 유지되지 않는다. 그것들이 유지되기 위하여는, 이 박테리움에 거주하는 플라스미드에서의 단순 재조합에 의해 통합되어야 한다. 이는 pVK 102 등의 코스미드들에 존재하는 부위 등의 단편들의 하나, 또는 상기 서열들을 갖는 플라스미드들을 위한 pBR322의 단편 등을 통하여 일어날 수가 있다. 이는 pRPA-BL-142 및 pRPA-BL-150Aalphal의 호스트이기도 한, GV3850 균주의 Ti 플라스미드 [잠브리스키 (Zambryski) 등, 1983년]에 대해서 사실이다. pBR322의 복제 원점을 사용하여, 이들 플라스미드들을 디테(Ditte) 등 (1980년)이 기술한 세-부분 시스템을 통해서 아그로박테리움 속으로 운반시킨다.
식물체 구성요소의 형질전환
이들 키메라 유전자들의 효능을 시험하기 위하여, 후자를 아래에 기술된 방법에 따라 구성요소 속으로 운반시켰다:
A-형질전환 방법
1. 담배
벡터를 코스미드 pTVK 291 [고마리(Komari) 등, 1986년]을 지니고 있는 비발암성 균주 아그로박테리움 EHA 101[후드 (Hood) 등, 1987년]속으로 도입한다. 형질전환 기술은 호쉬(Horch) 등 (1985년)의 방법에 기초한 것이다. 상업용 담배 PBD6(출처: SEITA, 프랑스)의 재생 방법이 아래에 기술된다.
잎의 체외배양체에서의 담배 PBD6의 재생을 30g/l의 수크로오스를 함유하는 무라시게와 스쿠그(MS) 기초 배지상에서 수행한다. 잎의 체외배양체는 온실 또는 시험관내에서 배양한 식물체로부터 취하고, 3연속 단계의 리프 디스크 기법(leaf disc technique) [사이언스 1985년, 제 227권, 제 1229-1231페이지]에 따라 형질전환시킨다.
제 1단계는 0.05㎎의 NAA 및 2㎎/l의 BAP를 함유하는 MS+30g수크로오스상에서 15일 동안 새싹을 유도하는 것으로 이루어져 있다.
제 2단계는 제 1단계 중에 형성된 새싹을 발육되게 하는 것이다; 그것은 어떠한 호르몬도 함유하지 않은 MS+30g/l 수크로오스상에서 10일 동안 수행한다.
제 3단계는 각기 취한 새싹들을 뿌리가 나게 하는 것이다. 뿌리를 내리게 하는 상기 배지는 염, 비타민 그리고 설탕을 함유하고 있으며, 두-배로 희석한 것이다. 그것은 호르몬을 전혀 함유하고 있지 않다. 10 내지 15일 후, 이삭된 새싹을 땅으로 옮겨준다.
호르몬 밸런스의 결정
최적 재생 반도체 BAP 1.5 및 2㎎/l와 NAA 0.05 및 0.1㎎/l에 대하여 관찰한 25개의 호로는 밸런스 BAP 0.2-0.5-1-1.5-2 및 NAA 0-0.5-0.05를 시험함으로써 얻어졌다. 0.05 NAA와 2㎎/l BAP의 혼합물이 채택된다.
2. 다른 쌍자엽 식물들
표 2에 표시된 바의 식물 구성요소를 사용하여 해당 벡터와 연결된 코스미드 pTVK291을 지니고 있는 발암성 균주의 아그로박테리움 A281을 사용하여 표 2에 나타낸 쌍자엽 식물들을 형질전환시켰다.
B-브로목시닐에 대한 내성의 측정
1. 담배
내성은 시험관 내의 경우 옥타노에이트형의 브로목시닐(20㎎/l)의 존재하의 칼루스들의 성장에 의해서, 그리고 생체 내의 경우 오픈-필드 처리에 추천되는 용량의 10배를 나타내는 용량으로 잎에 브로목시닐 또는 이옥시닐을 살포하는 방법으로 측정하였다. 얻어진 결과는 표 1a에 요약되어 있다.
2. 다른 쌍자엽 식물들
내성은 시험관 내에서 배지 1리터당 10㎎의 (옥타노에이트형의) 브로목시닐의 존재하에 칼루스들의 성장으로 측정하였다. 모든 경우들에 있어, 결과는 양성이다(표 2).
[표 1a]
브로목시닐에 대한 형질전환 담배의 내성
[표 2]
브로목시닐에 대한 각종 쌍자엽 식물들의 내성
본 발명의 키메라 유전자는 식물체들에서의 발현의 수준과 상기 제초제들에 대한 식물체의 내성의 질을 높여주며, 따라서 경제적인 면에서 유리한 것이기도 하다.

Claims (4)

  1. 3,5-디할로-4-히드록시벤조니트릴 기재의 제초제에 대한 내성을 부여하는, 기능상 외래 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 부위와 연결된, 상기 제초제의 분해에 특이적인 니트릴라제를 코오딩하는 유전자를 함유하는, 박테리아 유래의 니트릴라제를 코오딩하는 키메라 유전자(여기서 상기 프로모터는 식물 세포들에서 자연 발현되는 유전자에서 유래한 것이며 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35 S RNA (CaMV 35S)의 상기 유전자와 기능상 연결된 프로모터, 해바라기(Helianthus annuus) 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 (RubisCO)의 작은 아단위(SSU)의 프로모터 및 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35 S RNA (CaMV 35S)의 프로모터와 해바라기(Helianthus annuus) 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 (RubisCO)의 작은 아단위(SSU)의 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것임)를 함유하는, 식물체를 상기 제초제에 내성인 식물체로 형질전환시키는데 유용한 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 플라스미드로 구성된 벡터.
  3. 3,5-디할로-4-히드록시벤조니트릴 기재의 제초제에 대한 내성을 부여하는, 기능상 외래 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 부위와 연결된, 상기 제초제의 분해에 특이적인 니트릴라제를 코오딩하는 유전자를 함유하는, 박테리아 유래의 니트릴라제를 코오딩하는 키메라 유전자(여기서 상기 프로모터는 식물 세포들에서 자연 발현되는 유전자에서 유래한 것이며 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35 S RNA (CaMV 35S)의 상기 유전자와 기능상 연결된 프로모터, 해바라기(Helianthus annuus) 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 (RubisCO)의 작은 아단위(SSU)의 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것임)를 함유하는 미생물.
  4. 3,5-디할로-4-히드록시벤조니트릴 기재의 제초제에 대한 내성을 부여하는, 기능상 외래 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 부위와 연결된, 상기 제초제의 분해에 특이적인 니트릴라제를 코오딩하는 유전자를 함유하는, 박테리아 유래의 니트릴라제를 코오딩하는 키메라 유전자(여기서 상기 프로모터는 식물 세포들에서 자연 발현되는 유전자에서 유래한 것이며 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35 S RNA (CaMV 35S)의 상기 유전자와 기능상 연결된 프로모터, 해바라기(Helianthus annuus) 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 (RubisCO)의 작은 아단위(SSU)의 프로모터 및 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35 S RNA(CaMV 35S)의 프로모터와 해바라기(Helianthus annuus) 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 (RubisCO)의 작은 아단위(SSU)의 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것임)의 통합에 의해서 수득한, 상기 제초제에 대한 내성 유전자를 함유하는 식포.
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