CN1141062A

CN1141062A - 来自被真菌感染的藻类的α-1，4-葡聚糖裂解酶，其纯化，基因克隆和在微生物中的表达

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Publication number: CN1141062A
Application number: CN94193792A
Authority: CN
Inventors: 于书; K·波森; K·M·克拉; M·波科; J·尼尔森; J·马库森
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-15
Publication date: 1997-01-22
Anticipated expiration: 2014-10-15
Also published as: JP3553948B2; CN1215172C; CA2174115A1; US6013504A; AU7856394A; CN1117865C; AU696700B2; CA2174115C; GB2297090B; NZ274509A; WO1995010618A3; GB9321301D0; EP0723592A1; EP0723592B1; DK0723592T3; BR9407836A; DE69431960T2; WO1995010618A2; DE69431960D1; GB9605385D0

Abstract

本发明描述了一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，该方法包含从被真菌感染的藻类中分离该酶。测定了该酶的氨基酸序列。还测定了编码该酶的核酸序列。

Description

来自被真菌感染的藻类的α-1，4-葡聚糖裂解酶，其纯化，基因克隆和在微生物中的表达

本发明涉及一种酶，特别是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)。本发明还涉及提取该酶的方法。本发明还涉及编码该酶的核苷酸序列。

FR-A-2617502和Baute等在Phytochemistry[1988]Vol.27No.11 pp3401-3403中报道了以明显的酶促反应在普通羊肚菌(Morchella vulgaris)中生产1，5-D-脱水果糖(“AF”)。AF的产量相当低。尽管提及了可能的酶促反应，但这两份文献都没有提供任何酶的任何氨基酸序列资料，更不用说任何核苷酸序列资料。这些文献说到AF可作为制备抗生素羟基羟甲基吡喃酮的前体。

Yu等在Biochimica et Biophysica Acta[1993]Vol.1156 pp313-320中报道了从红海藻中制备GL和其降解α-1，4-葡聚糖以生产AF的用途。AF的产量相当低。尽管该文献提及了GL酶，但未提供该酶的任何氨基酸序列，更不用说编码该酶的任何核苷酸序列资料。该文献还建议GL的来源就是藻类。

根据本发明，提供了一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，它包含从被真菌感染的藻类分离该酶。

优选使用不含被该酶降解的凝胶分离和/或进一步纯化该酶。

优选凝胶以糊精为基础，优选β-环糊精或其衍生物，优选环糊精，更优选β-环糊精。

根据本发明，还提供了一种以本发明的方法制备的GL酶。

优选该酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2，或其任意变异体。

术语“其任意变异体”指在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对该序列的至少一个氨基酸的任意取代，改变，修饰，置换，缺失或增加。

根据本发明，还提供了编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，优选其中的序列不存在于其天然环境中(即不构成表达该酶的细胞生物体天然基因组的一部分)。

优选的核苷酸序列是DNA序列。

优选的DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源或含任意合适的密码子取代的序列。

“基本上同源”的表达包含有关结构和/或核苷酸成份和/或生物活性的同源性。

“含任意合适的密码子取代”的表达包含用另一编码相同氨基酸的密码子进行的任何密码子置换或取代或在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对其进行的任何增加或删除。

换句话来说，本发明也包含修饰的DNA序列，其中至少一个核苷酸已缺失，取代或修饰，或者其中至少插入了一个额外的核苷酸以编码具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，优选酶具有增强的裂解酶活性的酶。

根据本发明，还提供了制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含表达本发明的核苷酸序列。

根据本发明，还提供了使用β-环糊精来纯化酶，优选GL。

根据本发明还提供了一种核苷酸序列，其中的DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源，或含任意合适的密码子取代的序列，优选其中的序列是一种分离的形式。

本发明的一个关键的方面在于认识到了GL来自被真菌感染的藻类。这是首次测定了GL的氨基酸序列并确定了编码GL的核酸序列。因此，本发明的一个关键的优势是现在可用诸如重组DNA技术大量制备GL，从而使诸如抗生素羟基羟甲基吡喃酮的化合物能较容易地大量制备。

优选分泌该酶以简便其纯化。为做到这一点，将编码成熟酶的DNA与选定宿主的信号序列，启动子和终止子融合。

为了在黑色曲霉(Aspergillus niger)中表达，将gpdA(来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)启动子和信号序列与编码成熟裂解酶的DNA(例如SEQ.I.D.No.3或SEQ.ID.No.4)的5′端融合。将黑色曲霉trpC基因的终止子序列置于该基因的3′端(Punt.P.J.et al(1991)：J.Biotech.17，19-34)。将该构建体插入含E.coli复制起点和选择起点及黑曲霉(A.niger)选择标记的载体中。黑曲霉选择标记的例子是用于选择转化子的amdS基因，argB基因，pyrG基因，hygB基因，BmlR基因。可将该质粒转化黑色曲霉并可从转化子培养基中回收成熟的裂解酶。

可将构建体转化进蛋白酶缺陷型菌株中以减少培养基中对裂解酶的蛋白裂解性降解(Archer D.B.et al(1992)：Biotechnol.Lett.14，357-362)。

根据下面的描述，其它优势将会变得更明显。

因此，本发明涉及从被真菌感染的藻类(优选被真菌感染的红藻，如可在中国收集到的类型：例如Gracilariopsis lemaneiformis)分离α-1，4-葡聚糖裂解酶。被真菌感染的藻类的一个例子已根据布达佩斯条约进行了保藏(见下文)。

经过使用原位杂交技术建立了在被真菌感染的红藻Gracilariopsis lemaneiformis中检测酶GL。支持这种观察的进一步证据由Southern杂交实验的结果提供。因此，GL的酶活性可从被真菌感染的藻类中获得，而不是象以前认为的就从藻类获得。

令人特别感兴趣的是，发现有两种天然的DNA序列，每种编码一种具有GL特征的酶。已测序了这些DNA的核酸序列，它们以SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4(在下文讨论和提供)被提供。

可用Yu等(出处同上)所述的方法进行起始酶纯化。然而，优选的起始酶纯化包括使用在纯化步骤中不会分解的固态支持物。这种凝胶支持物具有与标准实验室蛋白质纯化装置相配伍的优势。优选的纯化方法的详情在下文给出。使用已知的用于蛋白质纯化的标准技术终止纯化。使用互补电泳技术确定酶的纯度。

根据pI、最适温度和最适pH鉴定纯化的裂解酶。在这一方面，发现酶具有下列特征：当使用支链淀粉时具有最适底物特异性和3.5-7.5的最适pH，最适温度为50℃，pI为3.9。

如上所述，测定了根据本发明的酶(以氨基酸测序技术部分测定)，其氨基酸序列在下文提供。同样测定了编码根据本发明的酶(即GL)的核苷酸序列并在下文提供该DNA序列。

根据布达佩斯条约下列样品于1994年6月20日保藏在认可的保藏单位(The National Collections of Industrial and MarineBacteria Limited(NCIMB)at 23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB2 1RY)：

含质粒pGL1的E.coli(NCIMB 40652)-(参考DH5α-pGL1)；和含质粒pGL2的E.coli(NCIMB 40653)-(参考DH5α-pGL2)。

根据布达佩斯条约下列样品作为保藏品于1994年10月11日被认可的保藏单位(藻类和原生动物培养物保藏中心(CCAP)，Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3，Oban，Argyll，Scotland，United Kingdom，PA34 4AD)接受：

被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis(CCAP 1373/1)-[参考GLQ-(青岛)]。

因此本发明最优选的实施方案包括由作为保藏品NCIMB 40652或保藏品NCIMB 40653的主体的质粒中提供的GL编码序列表达获得的GL酶和从作为保藏品CCAP 1373/1的主体的被真菌感染的藻类中获得的GL酶。

现在本发明将仅以实施例的方式进行描述。

下面提供了实施例的参考附图，其中：

图1显示染色的被真菌感染的藻类；

图2显示染色的被真菌感染的藻类；

图3显示真菌菌丝切片；

图4显示被真菌感染的藻类切片；

图5显示被真菌感染的藻类切片；

图6显示pGL1的质粒图谱；

图7显示pGL2的质粒图谱；

图8显示了以SEQ.ID.No.3所给出的氨基酸序列，显示了测序的肽片段的位置；

图9显示了SEQ.ID.No.1与SEQ.ID.No.2的序列对比；

图10是显微照片；

更详细地说，图1显示了钙粉白(Calcoflour White)染色揭示的在Gracilariopsis lemaneiformis上部分和下部分中的真菌(108x和294x)。

图2显示了含真菌的Gracilariopsis lemaneiformis的PAS/苯胺蓝黑染色。真菌具有明显较高的碳水化合物含量。

图3的显微照片显示了生长于藻类细胞厚壁(w)之间的具2层薄壁的真菌菌丝(f)的纵剖面和擦伤切片。注意藻类叶绿体中的类囊体膜(箭头)。

图4显示用克隆2探针进行的反义检测(上排)似乎局限于通过钙粉白染色连续切片(下排)所示的真菌(46x和108x)。

图5显示在Gracilariopsis lemaneiformis的真菌上发现以克隆2探针获得的高强度反义检测(294x)。

图6显示了质粒pGL1的图谱，它是一种pBluescript IISK，含有从被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis所构建的基因组文库中分离的3.8kb的片段。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。

图7显示了质粒pGL2的图谱，它是一种pBluescript IISK，含有从被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis所构建的基因组文库中分离的3.6kb的片段，该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。

图9显示了SEQ.ID.No.1(GL1)与SEQ.ID.No.2(GL2)的序列对比。GL1的残基总数是1088个，GL2的残基总数是1091。在进行比较进，使用了结构-遗传模型(打开缺口花费：10；连接缺口花费：2)。在图9中，显示两个对比的残基相同的符号是“∶”；显示两个对比的残基相似的符号是“.”。说成是“相似”的氨基酸有：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。总共有845个氨基酸(即77.67％)相同；60个氨基酸(5.51％)相似。在GL1中插入的缺口数为3，在GL2中插入的缺口数为2。

图10是生长于藻类细胞壁(w)之间的真菌菌丝(f)的显微照片。注意藻类细胞中的红藻淀粉颗粒(s)和类囊体(箭头)。

下面序列资料用于制备下述PCR反应的引物和用于检测由各自的核苷酸序列产生的氨基酸序列。

从被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中的肽类装配的氨基酸序列：

Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala

Ala Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn

Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly

Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu

Asn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp

Tyr Lys Phe Gly Pro Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala

用于制备引物A和B的氨基酸序列(27-34)(Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val)引物A：ATG TA(TC)AA(CT)AA(CT)GA(CT)TC(GATC)AA(CT)GT 128mix引物B：ATG TA(TC)AA(CT)AA(CT)GA(CT)AG(CT)AA(CT)GT 64mix

用于生产引物C的氨基酸序列(45-50)(Gly Gly His Asp Gly Tyr)引物C：TA(GATC)CC(GA)TC(GA)TG(GATC)CC(GATC)CC 256mix

[与互补链相对应的序列]

用于生产引物E的氨基酸序列(74-79)(Gln Trp Tyr Lys Phe Gly)：引物E：GG(GATC)CC(GA)AA(CT)TT(GA)TAC CA(CT)TG 64mix

[与互补链相对应的序列]

用于生产引物F1和F2的氨基酸序列(1-6)(Tyr Arg Trp Gln Glu Val)：引物F1：TA(TC)CG(GATC)TGG CA(GA)GA(GA)GT 32mix引物F2：TA(TC)AG(GA)TGG CA(GA)GA(GA)GT 16mix

从第一PCR扩增获得的序列(克隆1)ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCTTCTTGGCGGC CACGACGGTT AMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly

从第二PCR扩增获得的序列(克隆1)ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCTTCTTGGTGGA CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGGAGAATTCGAC CGAACGNGAA TTGTACTTGC CCGTGCTGAC CCAATGGTACAAATTCGGCC CMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr GluArg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro

从第三PCR扩增获得的序列(克隆2)TACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGAATGCGGCTTT CGGGAAACCG ATTATCAAGG CAGCTTCCATGTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGACCACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGTGTGCACCTGT TGTGTGGGAG AATACAACCA GTCGCGATCTGTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCCTyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Gly LysPro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln AspAsp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val ValTrp Glu Asn Thr Thr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr LysPhe Gly1. Gracilariopsis lemaneiformis的细胞学研究1.1.1 Gracilariopsis lemaneiformis中真菌感染的检测：

从中国收集到的Gracilariopsis lemaneiformis的切片可徒手切成或从石蜡包埋的材料切成。用光学显微镜仔细检查切片的材料。在Gracilariopsis lemaneiformis中清楚地观测真菌菌丝。

组成Gracilariopsis lemaneiformis叶状体的细胞以高度有序且几乎是对称的方式存在。G.lemaneiformis的管状叶状体由大型、无色的中央细胞组成，此中央细胞被伸长的、纤细的椭圆细胞和小而圆的含红色色素的外周细胞包围。所有藻类的细胞类型以具有厚的细胞壁为特征。发现大多数真菌菌丝在大细胞的中间层和外周层之间的界面上。这些细胞可清楚地与藻类细胞区分开来，因为它们是长的圆柱状的。观察到菌丝在高度有序的藻类细胞间的不规则生长。菌丝最常见的方向是沿藻类叶状体的主轴。在有些情况下观测到指向中央和外周的侧枝。菌丝不会与藻类内部/附生的第二世代混淆。

已知钙粉白可以染含几丁质和纤维素的组织。与几丁质的反应需要四个共价连接的末端N-乙酰氨基葡糖残基。普遍认为纤维素几乎局限于高等植物，尽管在一些藻类中可能出现微量的纤维素。还已知在Gracilaria(江蓠属)中不含几丁质。

在切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料中发现钙粉白的染色与真菌菌丝细胞壁相对应的区域。

当在紫外灯下观察时在江蓠属组织的浅兰色的背景中，菌丝显示出亮白色(见图1)。几丁质是大多数真菌的主要细胞壁成份，但在江蓠属中缺乏几丁质。根据这些观察我们得出结论：所研究的藻类被真菌感染。在研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中，发现40％的下部材料被真菌菌丝感染。在藻类顶部材料中，发现25％的所研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片被感染。

用希夫过碘酸(PAS)和苯胺蓝黑染色切片的Gracilariopsislemaneiformis显示：与藻类细胞相比真菌细胞内的碳水化合物含量明显要高(见图2)。番红O和孔雀绿显示出与在被真菌感染的高等植物中所发现的真菌细胞相同的颜色反应。

吖啶橙与切片的Gracilariopsis lemaneiformis之间的反应清楚地显示出真菌的无规则生长。1.1.2电子显微镜检术

2％ OsO₄固定的、用钙粉白检测到真菌的15μm厚切片，用水洗涤并在二甲氧丙烷和无水乙醇中脱水。往载玻片上的每个切片滴一滴丙酮与spurr树脂1∶1的混合物，1小时后换作一滴纯树脂。将充满树脂的明胶包埋的胶囊面朝下放在切片上并在4℃过夜。在55℃聚合8小时后，浸入液氮，可以从载玻片上分离出附着在树脂块上的厚切片。

修块并在切片机上用钻石刀切成100nm厚的切片。切片在含水乙酸双氧铀和柠檬酸铅中染色。在电子显微镜下以80KV检查切片。

检查证实了光学显微镜的观察结果。并为产生裂解酶的G。lamneiformis的中国品种被真菌寄生物或共生物感染提供了进一步的证据。

真菌菌丝由50至100μm长且直径仅几微米的管状细胞构成。细胞顺序排列且相邻细胞间有隔壁。偶尔也可看见分枝。菌丝在藻类叶状体厚细胞壁之间生长而不会穿透细胞壁或损伤细胞。已知这种称为真菌植物共生物的共生关系也出现在一些丝状海洋真菌和大型海洋藻类之间(Donk and Bruning，1992-Ecology of aquatic fungi inand on algae.In Reisser.W.(ed.)：Algae and Symbioses：Plants，Animals.Fungi，Viruses，Interactions Explored.Biopress Ltd.，Bristol.)。

检查图10的显微照片，可注意到藻类和真菌细胞之间的一些区别。与藻类几μm厚的细胞壁相反，真菌细胞壁仅100-200nm厚。在藻类细胞中可见典型的植物细胞器，如具有类囊体膜的叶绿体及红藻淀粉粒，但真菌没有。

红藻细胞间连接的特征是称为纹孔栓或纹孔连结的特殊结构。该结构是凸出的电子密集核心，它们是藻类分类学中的重要特征(Pueschet，C.M.：An expanded survey of the ultrastructureof Red algal pit plugs.J.Phycol.25，625，(1989))。在我们的材料中，在藻类叶状体中常观察到这种连结，但在真菌细胞间观察不到。1.2原位杂交实验

原位杂交技术根据的原理是与mRNA的反义核糖核酸序列杂交。该技术用于观察显微切片中所说mRNA存在的区域。在该特定情况下，该技术用于定位Gracilariopsis lemaneiformis切片中的α-1，4-葡聚糖裂解酶。1.2.1制备用于原位杂交的³⁵S标记的探针

将来自称为克隆2(见上文)的第三PCR扩增的238bp PCR片段克隆进pGEM-3Zf(+)载体(Promega)。反义RNA的转录由SP6启动子驱动，正义RNA由T7启动子驱动。使用具有下述修改的核糖核酸酶保护试验试剂盒(Ambion)。在6％测序凝胶上电泳转录子以去掉未掺入的核苷酸并用由T7 RNA聚合酶体外转录试剂盒(Ambion)提供的洗脱缓冲液洗脱。反义转录子含23个非编码核苷酸，而正义转录子含39个。如进行杂交，使用10⁷cpm/ml ³⁵S标记的探针。

基本上按Langedale等(1988)的描述进行原位杂交。发现杂交温度在45℃最佳。在45℃洗涤后，用Kodak K-5照相乳胶覆盖切片并在5℃黑暗中放置3天(参考：Langedale，J.A.，Rothermel，B.A.and Nelson，T.(1888)，Genes and development 2：106-115，Cold Spring Harbour Laboratory)。

用针对α-1，4-葡聚糖裂解酶的核糖探针进行的原位杂交实验显示在检测的Gracilariopsis lemaneiformis中真菌菌丝上和周围有强烈的杂交信号(见图4和5)。这被当作是α-1，4-葡聚糖裂解酶产生的明显证据。在两种Gracilariopsis lemaneiformis藻类组织中检测到微弱的随机背景反应。应在用正义和反义探针时都观察到该反应。仅在用反义探针时获得了真菌菌丝的强烈染色。

在45℃的标准杂交条件下的杂交和洗涤步骤中获得了这些结果。在50℃下观察不到对真菌的染色，而背景染色仍相同。将温度升高到55℃，明显地且同等地降低了正义和反义探针的背景染色。

根据使用互补染色方法的细胞学检查得出结论：Gracilariopsislemaneiformis被真菌感染。在藻类组织的下部感染最显著。

在切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料中，原位杂交结果清楚地表明杂交局限于发现真菌感染的区域(见图4)。结果表明：α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA似乎局限于Gracilariopsislemaneiformis中被真菌感染的区域。

根据这些观察我们推断在被真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis中检测到α-1，4-葡聚糖裂解酶活性。2. 酶的纯化和鉴定

从被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis材料中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶可按下述进行：2.1材料和方法

经过滤收获藻类并用0.9％ NaCl洗涤。经匀浆接着在50mM柠檬酸盐-NaOH pH6.2(缓冲液A)中，冰浴，超声处理6×3分钟来破碎细胞。在25,000×g下离心40分钟去掉细胞碎片。该步骤中获得的上清认为是无细胞提取物并在8-25％梯度凝胶上分离后用于活性染色和Western印迹。2.2用β-环糊精Sepharose凝胶分离

将无细胞提取物直接上样到用缓冲液A预先平衡的β-环糊精Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上。用3体积缓冲液A与2体积的含1M NaCl的缓冲液A洗柱。用加入2％糊精的缓冲液A洗脱α-1，4-葡聚糖裂解酶。集中活性组分并将缓冲液变为20mM Bis-tris丙烷-HCl(pH7.0，缓冲液B)。

将活性组分上样到用缓冲液B预先平衡的Mono Q HR5/5柱上。用含0.3M NaCl的缓冲液B线性梯度洗脱真菌裂解酶。

另外可将经过β-环糊精Sepharose层析后获得的裂解酶制品浓缩到150μl并上样到在EPLC条件下操作的Superose 12柱上。2.3α-1，4-葡聚糖裂解酶活性分析和测定底物特异性、最适pH和温度的条件

用于分析α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mgml-1支链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH6.0)。反应在30℃下进行30分钟并经加入3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应。在室温静置10分钟后，在550nm下测量光密度。3. 来自被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的α-1，4

-葡聚糖裂解酶的氨基酸测序3.1该裂解酶的氨基酸测序：

使用来自溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)的内蛋白酶Arg-C或来自Lysobacter enzymogenes的内蛋白酶Lys-C消化裂解酶，两者都是测序级，购自德国Boehringer Mannheim。为了用内蛋白酶Arg-C进行消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl10M尿素，50mM甲胺，0.1M Tris-HCl，pH7.6的溶液中，充入N₂并加入10μl 50mM DTT和5mW EDTA后使蛋白质变性并在N₂中下50℃还原10分钟。接着，加入1μg溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0的内蛋白酶Arg-C，充入N₂并在37℃下消化6小时。为了随后衍生半胱氨酸，可加入12.5μl 100mM碘乙酰胺，将溶液在N₂中避光室温保温15分钟。

为了用内蛋白酶Lys-C消化，可将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH₄ HCO₃，pH8.4中。充入N₂并加入5μl 45mM DTT后，蛋白质在50℃变性和还原15分钟。冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺N₂中避光室温处理15分钟以衍生半胱氨酸。

随后，加入90μl水和溶于50μl 50mM麦黄酮和10mM EDTA pH8.0中的5μg内蛋白酶Lys-C并在37℃ N₂中消化24小时。

使用溶剂A：0.1％ TFA水溶液和溶剂B：0.1％TFA乙腈溶液经在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separations Groap：Califormia)上经反向HPLC分离所得的多肽。在使用脉冲液体快速循环在Applied Biosystems 476A测序仪上测序前，使用相同的溶剂系统将所选的肽类在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μm；Dr.Ole Schon，Novo Nordisk，Denmark)上再层析。

来自被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的酶的氨基酸序列信息如下所示，具体地为SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2。SEQ.ID.No.1具有：残基数：1088.氨基酸组成(包括信号序列)：＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

61 Ala 15 Cys 19 His 34 Met 78 Thr

51 Arg 42 Gln 43 Ile 53 Phe 24 Trp

88 Asn 53 Glu 63 Leu 51 Pro 58 Tyr

79 Asp 100 Gly 37 Lys 62 Ser 77 ValSEQ.ID.No.2具有：残基数：1091.氨基酸组成(包括信号序列)：＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

58 Ala 16 Cys 14 His 34 Met 68 Thr

57 Arg 40 Gln 44 Ile 56 Phe 23 Trp

84 Asn 47 Glu 69 Leu 51 Pro 61 Tyr

81 Asp 102 Gly 50 Lys 60 Ser 76 Val3.2N-末端分析

研究表明：天然葡聚糖裂解酶1 N-末端序列被封闭。基本上按照LeGendre等(1993)[Purification of proteins and peptidesby SDS-PAGE；In：Matsudaira，P.(ed.)A practical guide toprotein and peptide purification for microsequencing，2ndedition；Academic Press Inc.，San Diego；pp.74-101]的描述用无水TFA在40℃处理印迹到PVDF膜上的葡聚糖裂解酶1 30分钟来去封闭。所得的序列是TALSDKQTA，它与来自葡聚糖裂解酶1的克隆之序列(SEQ.I.D.No.1从位置51至59的序列)相匹配，表明葡聚糖裂解酶1的N末端残基是N-乙酰苏氨酸。SEQ.I.D.No.1位置1至50的序列表述信号序列。4. 编码来自被直菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的α- 1，4-葡聚糖裂解酶的基因的DNA测序4.1分子生物学方法：

按Saunders(1993)所述，经下述修改来分离DNA：以ELUTIP-d(Schleicher & Schuell)纯化代替凝胶纯化从DNA中去掉多糖。(参见：Saunders，G.W.(1993).Gel Purification of redalgal genomic DNA：An inexpensive and rapid method for theisolation of PCR-friendly DNA.Journal of phycology 29(2)：251-254 and Schleicher & Schuell：ELUTIP-d.Rapid Methodfor Purification and Concentration of DNA。)4.2PCR

使用Gene Amp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus，美国)并按照厂商说明书制备有关DNA分子，不同的是Taq聚合酶较晚加入(见PCR循环)并将温度循环变成如下方式：PCR循环：循环次数 C 时间(分)

1 98 5

60 5加入Taq聚合酶和油：

35 94 1

47 2

72 3

1 72 204.3PCR片段的克隆：

按照提供者的说明将PCR片段克隆进pT7Blue(来自Novagen)。4.4DNA测序：

基本上按照Sanger等(1979)的双脱氧法使用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA序列仪测序双链DNA.(参见：Sanger，F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinatinginhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467.)。

序列如SEQ.I.D.No.3和4所示，其中：SEQ.I.D.No.3具有：总碱基数为：3267DNA序列组成：850A；761C；871G；785TSEQ.I.D.No.4具有：总碱基数：3276DNA序列组成：889A；702C；856G；829T4.5文库的筛选：

除了预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml变性鲑精DNA中进行外，按照厂商说明书对来自Stratagene的λZap文库进行筛选。向杂交溶液中加入32P标记的变性探针。在55℃进行杂交过夜。滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗两次在1×SSC，0.1％SDS中洗两次。4.6探针

经过用合适的限制性酶消化从pT7 blue载体中分离已克隆的PCR片段。经琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段并用Agarase(BoehringerMannheim)从琼脂糖中纯化片段。由于片段仅为90-240bp长，因此在使用Prime-It随机引物试剂盒(Stratagene)或Ready to GoDNA标记试剂盒(Pharmacia)以32P-dCTP标记前要对分离的片段进行连接反应。4.7结果：4.7.1编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的PGR DNA片段的产生：

来自α-1，4-葡聚糖裂解酶的三个重叠的胰酶消化肽的氨基酸序列可用于产生混合的寡核苷酸，该寡核苷酸可用作PCR引物(见上面给出的序列)。

在第一次PCR扩增中，引物A/B(见上面)用作上游引物，引物C(见上面)用作下游引物。预期PCR产物的大小为71碱基对。

在第二次PCR扩增中，引物A/B用作上游引物，引物E用作下游引物。预期PCR产物的大小为161个碱基对。

在第三次PGR扩增中，引物F1(见上面)和F2(见上面)用作上游引物，引物E用作下游引物。预期PCR产物的大小为238个碱基对。在2％ LMT琼脂糖凝胶上分析PCR产物，从凝胶上切下预期大小的片段并用Agarase(Boehringer Manheim)处理，克隆进pT7blue载体(Novagen)并测序。

来自第一次和第二次PCR扩增的克隆片段编码相应于测序肽的氨基酸(见上面)。来自第三次扩增的克隆(见上面)与测序肽仅有大约87％的同源性。4.7.2用克隆的PCR片段筛选基因组文库

用上述克隆筛选文库得到了两个克隆。一个克隆含核苷酸序列SEQ.I.D.No.4(基因2)。另一克隆含SEQ.I.D.No.3的一些序列(从碱基对1065往下)(基因1)。

使用Gibco BRL的5′race系统以RACE(cDNA末端的快速扩增)方法(Michael A.F.，Michael，K.D.& Martin，G.R.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8998-99002.)获得SEQ.I.D.No.3的5′末端(即：从碱基对1064往上)。根据Collinge等的方法(Collinge，D.B.，Milligan D.E：，Dow，J.M.，Scofield，G.& Daniels，M.J.(1987)，Plant Mol Biol 8：405-414)分离总RNA。根据厂商的方案，使用1μg总RNA进行5′race。根据厂商的方案将第二次扩增的PCR产物克隆进Novagen的pT 7blue载体。测序三种独立的PCR克隆以补正PCR错误。

进行另一次PCR以给刚描述的克隆在紧接ATG起始密码子前面增补XbaI和NdeI限制性位点，该PCR使用下述寡核苷酸作为上游引物：GCTCTAGAGC ATGTTTTCAACCCTTGCG，使用含序列GL1(即：SEQ.I.D.No.3)中bp 1573-1593的互补序列的引物作为下游引物。

基因1(即SEQ.I.D.No.3)的完整序列的产生是经过将基因组克隆中作为BamHI-HindIII片段的基因3′端克隆进Stratagene的pBluescriptII KS+载体中并再将PCR产生的作为XbaI-BamHI片段的该基因的5′端克隆到3′端前面。

以HindIII平整末端片段的形式将基因2克隆进StratagenepBluescriptII SK+载体的EcoRV位点。经SacI消化去掉部分3′非翻译序列，接着重新连接。经过用HindIII和NarI消化并在下述退火寡核苷酸存在的条件下重新连接将HindIII和HpaI限制性位点导入紧靠起始ATG之前处。

AGCTTGTTAAC ATGTATCCAACCCTCACCTTCGTGG

ACAATTGTACATAGGTTGGGAGTGGAAGCACCGC

在测序的克隆中未发现内含子。

克隆1类型(SEQ.ID.No.3)与所有10个肽序列(见图8)的序列对比表现出100％相同性。由从被真菌感染的藻类Gracilariopsis lemaneiformis中分离的基因编码的两种蛋白质序列对比表现出约78％的相同性，表明两种基因都编码α-1，4-葡聚糖裂解酶。5.GL基因在微生物中的表达

(例如：毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属裂解酶转化子的分析)

将编码GL的DNA序列导入微生物中以生产高比活性和高产量的酶。

在这点上，将基因1(即SEQ.I.D.No.3)以NotI-HindIII平整末端(使用Amersham International的DNA平整末端形成试剂盒)片段的形式克隆进用EcoRI消化且平整末端化(使用AmershamInternational的DNA平整末端形成试剂盒)的毕赤氏酵母属表达载体pHIL-D2(含AOX1启动子)中以便在Pichia pastoris中表达(根据Invitrogen提供的毕赤氏酵母属表达试剂盒中描述的方案进行)。

在另一实施方案中，将基因1(即SEQ.I.D.No.3)以NotI-HindIII钝端化片段的形式(使用Amersham International DNA钝端形成试剂盒)克隆进用SmaI消化的曲霉属表达载体pBARMTE1(含有来自Neuropera crassa的甲基色氨酸抗性启动子)中以便在黑色曲霉中表达(Pall et al(1993)Fungal Genet Newslett.Vol 40Page 59-62)。根据Daboussi等(Curr Genet(1989)vol.15pp453-456)的方法使用溶胞酶Sigma L-2773和溶胞酶Sigma L-8012制备原生质体。随后根据Buxton等(Gene(1985)Vol.37pp207-214)所述的方案进行原生质体的转化，除了使用了Punt等(Methods in Enzymology(1992)Vol 216 pp447-457)描述的方案进行涂布转化了的原生质体并使用0.6％渗透稳定的上层琼脂糖。

结果表明在转化的Pichia pastoris和黑色曲霉中观测到裂解酶活性。5.1一般方法：

无细胞提取物的制备。

以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％ NaCl洗涤并重悬于破碎缓冲液(50mM磷酸钾盐，pH7.5，含1mM EDTA和5％甘油)中。使用玻璃珠和涡旋处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白酶抑制剂)。以9000rpm离心5分钟后接着以20,000×g离心5分钟获得裂解酶提取物(上清)。

以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)测试裂解酶的活性。

将1体积的裂解酶提取物与等体积4％的支链淀粉溶液混合。然后在控制的温度下保温反应混合物，以特定的间隔取样并分析AF。

也使用放射活性方法分析了裂解酶活性。

反应混合物含10μl ¹⁴C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反应混合物在25℃放置过夜，然后在常规TLC系统中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc.，Meriden，CT)检测产生的放射活性AF。

电泳和Western印迹。

使用8-25％梯度凝胶和Phast System(Pharmacia)进行SDS-PAGE。也在PhastSystem的Semidry转移单位上进行Western印迹。

1∶100稀释第一抗体，此抗体是抗纯化的从青岛(中国)收集的红海藻中分离的裂解酶的。与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(DakoA/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗体并以1∶1000的稀释度被使用。I部分，含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析结果：1.诱导5天后测定裂解酶活性(根据手册)并证实B系列的所有样品活性都是细胞内的。B系列样品：11 12 13 15 26 27 28 29 30比活： 139 81 122 192 151 253 199 198 150^*比活定义为在含2％(w/v)糖原，1％(w/v)甘油，10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)的反应混合物中每mg蛋白质每分钟释放的AFnmol数。反应温度为45℃，反应时间为60分钟。

样品B27时间进程如下。该资料也在图1中提供。时间(分)： 0 10 20 30 40 50 60比活： 0 18 54 90 147 179 253

除时间改变外，试验条件如上。2.Western-印迹分析。

所有样品的CFE显示出具有与天然裂解酶相应分子量的带。在Pichia pastoris中细胞内表达的MC-裂解酶培养物名称比活^*A18 10A20 32A21 8A22 8A24 6II部分.曲霉属转化子结果：I.培养(含0.2％酪蛋白的酶水解产物的基础培养基)5天后测定裂解酶活性，以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂分析。1).培养基裂解酶活性的分析：

在生长于含0.2％支链淀粉的培养基中的35个培养物中，仅在两个培养物中可检测到AF。5.4+和5.9+培养基分别含0.13g AF/升和0.44g AF/升。结果表明细胞分泌了有活性的裂解酶。在无细胞提取物中也可测出裂解酶活性。2).在无细胞提取物中分析裂解酶活性：培养物名称比活^*5.4+ 515.9+ 1485.13 995.15 255.19 37

^*比活定义为在25℃每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol数。+表示加入0.2％支链淀粉。

结果表明：GL的基因1在黑色曲霉细胞内表达。

转化的E.coli实验(使用Qiagen的Qia表达载体试剂盒的克隆载体pQE30)表明，表达出了能被抗从真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis中纯化的酶的抗体识别的酶。

除了黑色曲霉作为宿主外，也可使用已知具有良好表达系统的其它重要的工业微生物，如：米曲霉，曲霉属种类，木霉属种类，啤酒糖酵母，克鲁维氏酵母属种类，汉逊氏酵母属种类，毕赤氏酵母属种类，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，芽孢杆菌属种类，链霉属种类或大肠杆菌。

本发明其它优选的实施方案包括下列之任一个：一种由于导入本文所述的DNA序列而具有产生AF能力的转化的宿主生物体；这种转化的宿主生物体是一种微生物，其中优选宿主生物体选自由细菌，霉菌，真菌和酵母组成的类群中；优选宿主生物体选自由糖酵母属，克鲁维氏酵母属，曲霉属，汉逊氏酵母属，毕赤氏酵母属，芽孢杆菌属，链霉菌属，大肠杆菌属组成的类群中，如米曲霉，啤酒糖酵母，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，大肠杆菌；一种制备1，5-D-脱水果糖的方法，包含将α-1，4-葡聚糖(例如淀粉)与转化宿主生物体表达的α-1，4-葡聚糖裂解酶接触。该生物体含有编码该酶的核苷酸序列，其中优选核苷酸序列是DNA序列，优选其中的DNA序列是上文所述的序列之一；一种插入了上文所述核苷酸序列的载体，优选其中载体是一种复制载体，优选其中的载体是含有在启动子序列下游的核苷酸序列的表达载体，该载体优选含有一个标记(如抗性标记)；用该载体转化的细胞生物体，或细胞系；一种产生α-1，4-葡聚糖裂解酶或编码该酶的任意核苷酸序列或其部分之产物的方法，包含培养用该载体转染的该生物体(或来自细胞系的细胞)并回收该产物。

不偏离本发明的范围对本发明进行的其它修改对本领域的技术人员而言将是显而易见的。

序列描述(1)一般资料：(i)申请人：

(A)名称：DANISCO A/S

(B)街道：Langebrogade 1

(C)城市：Copenhagen

(D)州：Copenhagen K

(E)国家：丹麦

(F)邮编(编码)：DK-1001(ii)发明题目：酶(iii)序列号：20(iv)计算机可读形式：

(A)媒体类型：Floppy盘

(B)计算机：IBM PC兼容性

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version#1.25(EPO)(v)本申请资料：

申请号：WO PCT/EP94/03399(2)SEQ ID NO：1资料：(i)序列特征：

(A)长度：1088氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Phe Ser Thr Leu Ala Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Ser1 5 10 15Thr Phe Val Gly Ala Glu Val Arg Ser Asn Val Arg Ile His Ser Ala

20 25 30Phe Pro Ala Val His Thr Ala Thr Arg Lys Thr Asn Arg Leu Asn Val

35 40 45Ser Met Thr Ala Leu Ser Asp Lys Gln Thr Ala Thr Ala Gly Ser Thr

50 55 60Asp Asn Pro Asp Gly Ile Asp Tyr Lys Thr Tyr Asp Tyr Val Gly Val65 70 75 80Trp Gly Phe Ser Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly Ser

85 90 95Ser Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val Asn

100 105 110Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Ile Thr Val Gln His Pro Val Gln

115 120 125Val Gln Val Thr Ser Tyr Asn Asn Asn Ser Tyr Arg Val Arg Phe Asn

130 135 140Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Thr Arg Gly Pro Ile Leu Lys Gln145 150 155 160Gln Leu Asp Trp Ile Arg Thr Gln Glu Leu Ser Glu Gly Cys Asp Pro

165 170 175Gly Met Thr Phe Thr Ser Glu Gly Phe Leu Thr Phe Glu Thr Lys Asp

180 185 190Leu Ser Val Ile Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg Lys

195 200 205Ser Asp Gly Lys Val Ile Met Glu Asn Asp Glu Val Gly Thr Ala Ser

210 215 220Ser Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr Gly225 230 235 240Asn Ala Ile Ala Ser Val Asn Lys Asn Phe Arg Asn Asp Ala Val Lys

245 250 255Gln Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Lys Tyr Gln Asp

260 265 270Thr Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile Ala Met Thr Asn Tyr Asn Tyr

275 280 285Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Trp Asp Leu Arg Pro Pro His His Asp

290 295 300Gly Ala Leu Asn Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr Tyr Ala Ala Pro305 310 315 320Trp Leu Ile Val Asn Gly Cys Ala Gly Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Tyr

325 330 335Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met Asn Thr Gly Asp

340 345 350Thr Thr Trp Asn Ser Gly Gln Glu Asp Leu Ala Tyr Met Gly Ala Gln

355 360 365Tyr Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly Ala Gly Gly Gly Met

370 375 380Glu Cys Val Val Thr Ala Phe Ser Leu Leu Gln Gly Lys Glu Phe Glu385 390 395 400Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ser Val Met Pro Pro Lys Tyr Val Phe

405 410 415Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Thr Ser Ser Leu Leu Arg Ala His

420 425 430Met Pro Ala Gly Glu Asn Asn Ile Ser Val Glu Glu Ile Val Glu Gly

435 440 445Tyr Gln Asn Asn Asn Phe Pro Phe Glu Gly Leu Ala Val Asp Val Asp

450 455 460Met Gln Asp Asn Leu Arg Val Phe Thr Thr Lys Gly Glu Phe Trp Thr465 470 475 480Ala Asn Arg Val Gly Thr Gly Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ser Val Phe

485 490 495Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys Gln Thr Asn Ile Thr Cys

500 505 510Phe Leu Arg Asn Asp Asn Glu Gly Gln Asp Tyr Glu Val Asn Gln Thr

515 520 525Leu Arg Glu Arg Gln Leu Tyr Thr Lys Asn Asp Ser Leu Thr Gly Thr

530 535 540Asp Phe Gly Met Thr Asp Asp Gly Pro Ser Asp Ala Tyr Ile Gly His545 550 555 560Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Val Glu Cys Asp Ala Leu Phe Pro Asp Trp

565 570 575Gly Arg Pro Asp Val Ala Glu Trp Trp Gly Asn Asn Tyr Lys Lys Leu

580 585 590Phe Ser Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln Asp Met Thr Val Pro Ala

595 600 605Met Met Pro His Lys Ile Gly Asp Asp Ile Asn Val Lys Pro Asp Gly

610 615 620Asn Trp Pro Asn Ala Asp Asp Pro Ser Asn Gly Gln Tyr Asn Trp Lys625 630 635 640Thr Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp Met Arg Tyr Glu Asn His

645 650 655Gly Arg Glu Pro Met Val Thr Gln Arg Asn Ile His Ala Tyr Thr Leu

660 665 670Cys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val Glu Asn Ala Asp Thr Leu

675 680 685Thr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser Arg Gly Gly Tyr Ile Gly

690 695 700Asn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly Asp Asn Ser Thr Thr Ser705 710 715 720Asn Tyr Ile Gln Met Met Ile Ala Asn Asn Ile Asn Met Asn Met Ser

725 730 735Cys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Asp

740 745 750Asn Glu Asn Gln Arg Thr Pro Cys Thr Gly Asp Leu Met Val Arg Tyr

755 760 765Val Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His Tyr Asp Arg

770 775 780Trp Ile Glu Ser Lys Asp His Gly Lys Asp Tyr Gln Glu Leu Tyr Met785 790 795 800Tyr Pro Asn Glu Met Asp Thr Leu Arg Lys Phe Val Glu Phe Arg Tyr

805 810 815Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe

820 825 830Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn

835 840 845Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly

850 855 860Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg865 870 875 880Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro Asp

885 890 895Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala Met Asn Gly Gly Asp Arg Ile

900 905 910Tyr Asn Tyr Pro Val Pro Gln Ser Glu Ser Pro Ile Phe Val Arg Glu

915 920 925Gly Ala Ile Leu Pro Thr Arg Tyr Thr Leu Asn Gly Glu Asn Lys Ser

930 935 940Leu Asn Thr Tyr Thr Asp Glu Asp Pro Leu Val Phe Glu Val Phe Pro945 950 955 960Leu Gly Asn Asn Arg Ala Asp Gly Met Cys Tyr Leu Asp Asp Gly Gly

965 970 975Val Thr Thr Asn Ala Glu Asp Asn Gly Lys Phe Ser Val Val Lys Val

980 985 990Ala Ala Glu Gln Asp Gly Gly Thr Glu Thr Ile Thr Phe Thr Asn Asp

995 1000 1005Cys Tyr Glu Tyr Val Phe Gly Gly Pro Phe Tyr Val Arg Val Arg Gly

1010 1015 1020Ala Gln Ser Pro Ser Asn Ile His Val Ser Ser Gly Ala Gly Ser Gln1025 1030 1035 1040Asp Met Lys Val Ser Ser Ala Thr Ser Arg Ala Ala Leu Phe Asn Asp

1045 1050 1055Gly Glu Asn Gly Asp Phe Trp Val Asp Gln Glu Thr Asp Ser Leu Trp

1060 1065 1070Leu Lys Leu Pro Asn Val Val Leu Pro Asp Ala Val Ile Thr Ile Thr

1075 1080 1085(2)SEQ ID NO：2资料：(i)序列特征：

(A)长度：1091氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Tyr Pro Thr Leu Thr Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Arg1 5 10 15Thr Phe Thr Cys Val Gly Ile Phe Arg Ser His Ile Leu Ile His Ser

20 25 30Val Val Pro Ala Val Arg Leu Ala Val Arg Lys Ser Asn Arg Leu Asn

35 40 45Val Ser Met Ser Ala Leu Phe Asp Lys Pro Thr Ala Val Thr Gly Gly

50 55 60Lys Asp Asn Pro Asp Asn Ile Asn Tyr Thr Thr Tyr Asp Tyr Val Pro65 70 75 80Val Trp Arg Phe Asp Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly

85 90 95Ser Ser Thr Pro Gly Asp Ile Asp Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val

100 105 110Asn Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Phe Thr Leu Glu Lys Pro Val

115 120 125Gln Val Gln Val Thr Ser Tyr Lys Asn Asn Cys Phe Arg Val Arg Phe

130 135 140Asn Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Asp Arg Gly Pro Ile Leu Gln145 150 155 160Gln Gln Leu Asn Trp Ile Arg Lys Gln Glu Gln Ser Lys Gly Phe Asp

165 170 175Pro Lys Met Gly Phe Thr Lys Glu Gly Phe Leu Lys Phe Glu Thr Lys

180 185 190 Asp Leu Asn Val Ile Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg

195 200 205Lys Arg Asp Gly Lys Gly Ile Met Glu Asn Asn Glu Val Pro Ala Gly

210 215 220Ser Leu Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr225 230 235 240Gly Thr Ala Ile Ala Ser Val Asn Glu Asn Tyr Arg Asn Asp Pro Asp

245 250 255Arg Lys Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Glu Phe Trp

260 265 270Asp Ser Glu Gln Asn Arg Asn Lys Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile

275 280 285Ala Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Tyr Asn Tyr Asn Gln Ser Asp

290 295 300Leu Ile Ala Pro Gly Tyr Pro Ser Asp Pro A5n Phe Tyr Ile Pro Met305 310 315 320Tyr Phe Ala Ala Pro Trp Val Val Val Lys Gly Cys Ser Gly Asn Ser

325 330 335Asp Glu Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Thr

340 345 350Tyr Met Asn Thr Gly Gly Thr Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Asn Leu

355 360 365Ala Tyr Met Gly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr

370 375 380Gly Asp Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Gln Ala Phe Ser Leu Leu385 390 395 400Gln Gly Lys Glu Phe Glu Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ala Val Met

405 410 415Pro Pro Lys Tyr Val Phe Gly Tyr Phe Gln Gly Val Phe Gly Ile Ala

420 425 430Ser Leu Leu Arg Glu Gln Arg Pro Glu Gly Gly Asn Asn Ile Ser Val

435 440 445Gln Glu Ile Val Glu Gly Tyr Gln Ser Asn Asn Phe Pro Leu Glu Gly

450 455 460 Leu Ala Val Asp Val Asp Met Gln Gln Asp Leu Arg Val Phe Thr Thr465 470 475 480Lys Ile Glu Phe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Thr Gly Gly Asp Ser

485 490 495Asn Asn Lys Ser Val Phe Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys

500 505 510Gln Thr Asn Val Thr Cys Phe Leu Arg Asn Asp Asn Gly Gly Ala Asp

515 520 525Tyr Glu Val Asn Gln Thr Leu Arg Glu Lys Gly Leu Tyr Thr Lys Asn

530 535 540Asp Ser Leu Thr Asn Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Asp Gly Pro Ser545 550 555 560Asp Ala Tyr Ile Gly His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Gly Asn Cys Asp

565 570 575Ala Leu Phe Pro Asp Trp Gly Arg Pro Gly Val Ala Glu Trp Trp Gly

580 585 590Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Phe Lys Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln

595 600 605Asp Met Thr Val Pro Ala Met Met Pro His Lys Val Gly Asp Ala Val

610 615 620Asp Thr Arg Ser Pro Tyr Gly Trp Pro Asn Glu Asn Asp Pro Ser Asn625 630 635 640Gly Arg Tyr Asn Trp Lys Ser Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp

645 650 655Met Arg Tyr Glu Asn His Gly Arg Glu Pro Met Phe Thr Gln Arg Asn

660 665 670Met His Ala Tyr Thr Leu Cys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val

675 680 685Ala Asn Ala Asp Thr Leu Thr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser

690 695 700Arg Gly Gly Tyr Ile Gly Asn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly705 710 715 720Asp Asn Ser Ser Ser Gln Arg Tyr Leu Gln Met Met Ile Ala Asn Ile

725 730 735Val Asn Met Asn Met Ser Cys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly

740 745 750 Gly Phe Thr Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Val Cys Pro Gly Asp Leu Met

755 760 765Val Arg Phe Val Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His

770 775 780Tyr Gly Arg Leu Val Glu Gly Lys Gln Glu Gly Lys Tyr Tyr Gln Glu785 790 795 800Leu Tyr Met Tyr Lys Asp Glu Met Ala Thr Leu Arg Lys Phe Ile Glu

805 810 815Phe Arg Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn

820 825 830Ala Ala Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn

835 840 845Asp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly

850 855 860His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr865 870 875 880Thr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe

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(A)长度：3267碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

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(A)长度：3276碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：ATGTATCCAA CCCTCACCTT CGTGGCGCCT AGTGCGCTAG GGGCCAGAAC TTTCACGTGT 60GTGGGCATTT TTAGGTCACA CATTCTTATT CATTCGGTTG TTCCAGCGGT GCGTCTAGCT 120GTGCGCAAAA GCAACCGCCT CAATGTATCC ATGTCCGCTT TGTTCGACAA ACCGACTGCT 180GTTACTGGAG GGAAGGACAA CCCGGACAAT ATCAATTACA CCACTTATGA CTACGTCCCT 240GTGTGGCGCT TCGACCCCCT CAGCAATACG AACTGGTTTG CTGCCGGATC TTCCACTCCC 300GGCGATATTG ACGACTGGAC GGCGACAATG AATGTGAACT TCGACCGTAT CGACAATCCA 360TCCTTCACTC TCGAGAAACC GGTTCAGGTT CAGGTCACGT CATACAAGAA CAATTGTTTC 420AGGGTTCGCT TCAACCCTGA TGGTCCTATT CGCGATGTGG ATCGTGGGCC TATCCTCCAG 480CAGCAACTAA ATTGGATCCG GAAGCAGGAG CAGTCGAAGG GGTTTGATCC TAAGATGGGC 540TTCACAAAAG AAGGTTTCTT GAAATTTGAG ACCAAGGATC TGAACGTTAT CATATATGGC 600AATTTTAAGA CTAGAGTTAC GAGGAAGAGG GATGGAAAAG GGATCATGGA GAATAATGAA 660GTGCCGGCAG GATCGTTAGG GAACAAGTGC CGGGGATTGA TGTTTGTCGA CAGGTTGTAC 720GGCACTGCCA TCGCTTCCGT TAATGAAAAT TACCGCAACG ATCCCGACAG GAAAGAGGGG 780TTCTATGGTG CAGGAGAAGT AAACTGCGAG TTTTGGGACT CCGAACAAAA CAGGAACAAG 840TACATCTTAG AACGAACTGG AATCGCCATG ACAAATTACA ATTATGACAA CTATAACTAC 900AACCAGTCAG ATCTTATTGC TCCAGGATAT CCTTCCGACC CGAACTTCTA CATTCCCATG 960TATTTTGCAG CACCTTGGGT AGTTGTTAAG GGATGCAGTG GCAACAGCGA TGAACAGTAC 1020TCGTACGGAT GGTTTATGGA TAATGTCTCC CAAACTTACA TGAATACTGG TGGTACTTCC 1080TGGAACTGTG GAGAGGAGAA CTTGGCATAC ATGGGAGCAC AGTGCGGTCC ATTTGACCAA 1140CATTTTGTGT ATGGTGATGG AGATGGTCTT GAGGATGTTG TCCAAGCGTT CTCTCTTCTG 1200CAAGGCAAAG AGTTTGAGAA CCAAGTTCTG AACAAACGTG CCGTAATGCC TCCGAAATAT 1260GTGTTTGGTT ACTTTCAGGG AGTCTTTGGG ATTGCTTCCT TGTTGAGAGA GCAAAGACCA 1320GAGGGTGGTA ATAACATCTC TGTTCAAGAG ATTGTCGAAG GTTACCAAAG CAATAACTTC 1380CCTTTAGAGG GGTTAGCCGT AGATGTGGAT ATGCAACAAG ATTTGCGCGT GTTCACCACG 1440AAGATTGAAT TTTGGACGGC AAATAAGGTA GGCACCGGGG GAGACTCGAA TAACAAGTCG 1500GTGTTTGAAT GGGCACATGA CAAAGGCCTT GTATGTCAGA CGAATGTTAC TTGCTTCTTG 1560AGAAACGACA ACGGCGGGGC AGATTACGAA GTCAATCAGA CATTGAGGGA GAAGGGTTTG 1620TACACGAAGA ATGACTCACT GACGAACACT AACTTCGGAA CTACCAACGA CGGGCCGAGC 1680GATGCGTACA TTGGACATCT GGACTATGGT GGCGGAGGGA ATTGTGATGC ACTTTTCCCA 1740GACTGGGGTC GACCGGGTGT GGCTGAATGG TGGGGTGATA ACTACAGCAA GCTCTTCAAA 1800ATTGGTCTGG ATTTCGTCTG GCAAGACATG ACAGTTCCAG CTATGATGCC ACACAAAGTT 1860GGCGACGCAG TCGATACGAG ATCACCTTAC GGCTGGCCGA ATGAGAATGA TCCTTCGAAC 1920GGACGATACA ATTGGAAATC TTACCATCCA CAAGTTCTCG TAACTGATAT GCGATATGAG 1980AATCATGGAA GGGAACCGAT GTTCACTCAA CGCAATATGC ATGCGTACAC ACTCTGTGAA 2040TCTACGAGGA AGGAAGGGAT TGTTGCAAAT GCAGACACTC TAACGAAGTT CCGCCGCAGT 2100TATATTATCA GTCGTGGAGG TTACATTGGC AACCAGCATT TTGGAGGAAT GTGGGTTGGA 2160GACAACTCTT CCTCCCAAAG ATACCTCCAA ATGATGATCG CGAACATCGT CAACATGAAC 2220ATGTCTTGCC TTCCACTAGT TGGGTCCGAC ATTGGAGGTT TTACTTCGTA TGATGGACGA 2280AACGTGTGTC CCGGGGATCT AATGGTAAGA TTCGTGCAGG CGGGTTGCTT ACTACCGTGG 2340TTCAGAAACC ACTATGGTAG GTTGGTCGAG GGCAAGCAAG AGGGAAAATA CTATCAAGAA 2400CTGTACATGT ACAAGGACGA GATGGCTACA TTGAGAAAAT TCATTGAATT CCGTTACCGC 2460TGGCAGGAGG TGTTGTACAC TGCTATGTAC CAGAATGCGG CTTTCGGGAA ACCGATTATC 2520AAGGCAGCTT CCATGTACGA CAACGACAGA AACGTTCGCG GCGCACAGGA TGACCACTTC 2580CTTCTCGGCG GACACGATGG ATATCGTATT TTGTGTGCAC CTGTTGTGTG GGAGAATACA 2640ACCAGTCGCG ATCTGTACTT GCCTGTGCTG ACCAAATGGT ACAAATTCGG CCCTGACTAT 2700GACACCAAGC GCCTGGATTC TGCGTTGGAT GGAGGGCAGA TGATTAAGAA CTATTCTGTG 2760CCACAAAGCG ACTCTCCGAT ATTTGTGAGG GAAGGAGCTA TTCTCCCTAC CCGCTACACG 2820TTGGACGGTT CGAACAAGTC AATGAACACG TACACAGACA AAGACCCGTT GGTGTTTGAG 2880GTATTCCCTC TTGGAAACAA CCGTGCCGAC GGTATGTGTT ATCTTGATGA TGGCGGTATT 2940ACTACAGATG CTGAGGACCA TGGCAAATTC TCTGTTATCA ATGTCGAAGC CTTACGGAAA 3000GGTGTTACGA CGACGATCAA GTTTGCGTAT GACACTTATC AATACGTATT TGATGGTCCA 3060TTCTACGTTC GAATCCGTAA TCTTACGACT GCATCAAAAA TTAACGTGTC TTCTGGAGCG 3120GGTGAAGAGG ACATGACACC GACCTCTGCG AACTCGAGGG CAGCTTTGTT CAGTGATGGA 3180GGTGTTGGAG AATACTGGGC TGACAATGAT ACGTCTTCTC TGTGGATGAA GTTGCCAAAC 3240CTGGTTCTGC AAGACGCTGT GATTACCATT ACGTAG 3276(2)SEQ ID NO：5资料：(i)序列特征：

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20 25 30Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp

35 40 45Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu

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85 90(2)SEQ ID NO：6资料：(i)序列特征：

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(A)长度：23个碱基对

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(B)位置：取代(9，″″)

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TANCGNTGGC ANGANGT 17(2)SEQ ID NO：11：资料：(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

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(B)位置：取代(3，″″)

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(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(6，″″)

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(D)其它资料：/注意＝“N是G或A”(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(15，″″)

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TANAGNTGGC ANGANGT 17(2)SEQ ID NO：12：资料：(i)序列特征：

(A)长度：71个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(A)长度：23个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe1 5 10 15Leu Leu Gly Gly His Asp Gly

20(2)SEQ ID NO：14：资料：(i)序列特征：

(A)长度：160个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGTGGA 60CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGG AGAATTCGAC CGAACGGAAT 120TGTACTTGCC CGTGCTGACC CAATGGTACA AATTCGGCCC 160(2)SEQ ID NO：15：资料：(i)序列特征：

(A)长度：54个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe1 5 10 15Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val

20 25 30Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln

35 40 45Trp Tyr Lys Phe Gly Pro

50(2)SEQ ID NO：16：资料：(i)序列特征：

(A)长度：238个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(A)长度：79个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala1 5 10 15Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg

20 25 30Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp

35 40 43Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr Thr Ser

50 55 60Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe Gly65 70 75(2)SEQ ID NO：18：资料：(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GCTCTAGAGC ATGTTTTCAA CCCTTGCG 28(2)SEQ ID NO：19：资料：(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：AGCTTGTTAA CATGTATCCA ACCCTCACCT TCGTGG 36(2)SEQ ID NO；20：资料：(i)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：ACAATTGTAC ATAGGTTGGG AGTGGAAGCA CCGC 34

Claims

1.一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶(GL)的方法，包含从被真菌感染的藻类中分离该酶。

2.根据权利要求1的方法，其中的酶是使用不会被该酶降解的凝胶来分离和/或进一步纯化的。

3.根据权利要求2的方法，其中的凝胶是以糊精或其衍生物为基础的，优选环糊精，更优选β-环糊精。

4.一种根据权利要求1至3中任意一项的方法制备的GL酶。

5.一种包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2或其任一变异体的酶。

6.一种编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列。

7.根据权利要求6的核苷酸序列，其中的序列是DNA序列。

8.根据权利要求7的核苷酸序列，其中的DNA序列包含与SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.4中任一个相同，或互补，或基本同源，或含任意合适的密码子取代的序列。

9.一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含表达根据权利要求6至8任意一项的核苷酸序列。

10.根据前面权利要求中任意一项的方法，其中的藻类是Gracilariopsis lemaneiformis。

11.β-环糊精在纯化一种酶，优选GL中的应用。

12.一种核苷酸序列，其中的DNA序列包含与SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.4中任一个相同，或互补，或基本同源，或含任意合适的密码子取代的序列。