CN101061225A - 浓缩分泌的重组蛋白的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

描述了涉及获得分泌的重组蛋白的浓缩制备物的方法和组合物。这些蛋白质以带有壳多糖结合结构域(chitin－binding domain(CBD))的融合蛋白的形式表达。所述融合蛋白能够在壳多糖存在的情况下被浓缩。也描述了：含有修饰的LAC4启动子的穿梭载体；壳多糖酶－阴性宿主细胞；能够在非变性条件下从壳多糖洗脱的CBD；和灭菌的壳多糖，其可以被任选地磁化以促进重组蛋白质的回收。

Description

浓缩分泌的重组蛋白的方法和组合物
背景技术
[0001]壳多糖(几丁质，chitin)，一种N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的β-1，4-连接的无支链共聚物，构成了地球上继纤维素之后第二大最丰富的聚合物。它是昆虫外骨骼(Merzendorfer，H.，et al.，J.Exptl.Biol.206：4393-4412(2003)，无脊椎动物甲壳类的外壳和真菌细胞壁(Riccardo，A.，et al.″Native，industrial and fossil chitins，″inChitin and Chitinases，ed.P.Jolles and R.A.A.Muzzarelli，pub.Birkhauser Verlag：Basel，Switzerland(1999))的主要成分。壳多糖酶水解壳多糖的β-1，4-糖苷键，并且已经在原核生物、真核生物和病毒生物体中发现。在酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，壳多糖酶在有效的细胞分离方面具有形态学作用(Kuranda，M.，et al.J.Biol.Chem.266：19758-19767(1991))。此外，植物表达壳多糖酶以抵抗含壳多糖的病原体。实际上，壳多糖基因在转基因植物中的异源表达已显示出增加对某些植物病原体的抗性(Carstens，M.，et al.Trans.Res.12：497-508(2003)；Itoh，Y.，et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.67：847-855(2003)；Kim，J.et al.Trans.Res.12：475-484(2003))。根据氨基酸序列相似性，壳多糖酶属于糖基水解酶家族18或家族19(Henrissat，B.，et al.Biochem.J.293：781-788(1993))。壳多糖酶催化结构域序列的家族性差异反映了它们不同的壳多糖水解机制，所述水解引起产物的端基构型或是保持(家族18)或是翻转(家族19)(Robertus，J.D.，et al.″The structure and action ofchitinases，″in  Chitin and Chitinases，ed.P.Jolles and R.A.A.Muzzarelli，pub.Birkhauser Verlag：Basel，Switzerland(1999))。
[0002]大多数壳多糖酶具有带有各自独立起作用的催化结构域和非催化结构域的模块结构域组织。O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸区域常常将这两个结构域分开，并且起到防止壳多糖酶的蛋白水解作用或帮助壳多糖酶分泌的作用(Arakane，Y.，Q.et al.Insect Biochem.Mol.Biol.33：631-48(2003))。根据蛋白质序列相似性，非催化性壳多糖结合结构域(CBD，也称作ChBDs)属于三个结构类型中的一种(1型、2型或3型)(Henrissat，B.″Classification of chitinases modules，″，Chitin andChitinases，ed.P.Jolles and R.A.A.Muzzarelli，pub.Birkhauser Verlag：Basel，Switzerland(1999))。取决于不同的壳多糖酶，CBD的存在可以增强(Kuranda，M.，etal.J.Biol.Chem.266：19758-19767(1991))或抑制(Hashimoto，M.，et al.J.Bacteriol.182：3045-3054(2000))催化结构域引起的壳多糖水解。
[0003]CBD的体积小(～5-7kDa)、其对壳多糖的底物亲和特异性和高亲和力使得它们被用作将蛋白质固定于壳多糖表面的亲和标签(Bernard，M.P.，et al.Anal.Biochem.327：278-283(2004)；Ferrandon，S.，et al.Biochim.Biophys.Acta.1621：31-40(2003))。例如，环状芽胞杆菌(B.circulans)壳多糖酶A13型CBD已被用于将细菌中表达的融合蛋白固定在壳多糖珠子上，以便为内含肽-介导的蛋白质剪接提供平台(Ferrandon，S.，et al.Biochim.Biophys.Acta.1621：31-40(2003))和固定于壳多糖包被的微量滴定皿(Bernard，M.P.，et al.Anal.Biochem.327：278-283(2004))。由于真核生物蛋白表达系统能够进行用细菌系统不可能进行的生物学过程(例如，蛋白质糖基化，分子伴侣介导的蛋白质折叠等)，从真核细胞分泌CBD-标记的蛋白质也是被期待的。然而，许多真核细胞，特别是真菌，分泌内源性壳多糖酶，由于其与CBD标记蛋白质竞争壳多糖结合位点，在壳多糖固定化应用期间与CBD标记蛋白质共同纯化，和降解目标壳多糖包被表面，使得CBD标记蛋白质与壳多糖的固定化变得复杂。
[0004]从宿主细胞分泌到周围培养基的蛋白质被大大稀释，使得从大体积中纯化的成本大并且麻烦。需要降低从蛋白质在其中分泌的培养基中分离蛋白质的成本和增加其简便性。
[0005]存在许多方法从大体积培养基中纯化蛋白质。这些方法的不同之处在于成本、效率和实现纯化所需的时间长度。例如，分泌培养基中的蛋白质可以通过沉淀来收集。此方法需要加入大量沉淀剂如硫酸铵、丙酮或三氯乙酸，随后进行离心或者过滤。这些制剂中的许多制剂是有毒的或是挥发性的，它们都显著增加了蛋白质收集的花费。此外，沉淀可以引起蛋白质功能的明显丢失。
[0006]另一方法是应用各种树脂进行层析，如阴离子/阳离子交换树脂、疏水相互作用树脂或尺寸排阻凝胶。通过层析收获蛋白质需要所有的耗尽培养基(spentculture medium)以缓慢的流速(一般为1-10ml/min)通过树脂。在需要处理大量培养基的情况下，这是非常费时的。例如，以5ml/min速率通过树脂的100升耗尽培养基会花费333小时来处理。此外，这些类型的层析树脂不能选择性地仅纯化目标蛋白质，必须与其它方法在多步骤纯化方法中共同应用。
[0007]特异结合掺入蛋白质结构的肽序列的亲和层析树脂常常被应用，这是因为它们能够选择性纯化目标蛋白质。在一个典型的策略中，肽序列(例如，肽抗体表位或六组氨酸序列)被工程化改造进入所需蛋白质的序列中。带有这些标记的、表达的蛋白质会特异地与相应的树脂(例如，具有固定化抗体的树脂或用于六组氨酸结合的镍树脂)相互作用。虽然这些方法常常从小体积中产生高度纯化蛋白质，但由于其成本和性能，它们在处理大体积时受到实用性的限制。例如，抗体亲和树脂非常昂贵，镍树脂可以使得恰巧含有组氨酸残基链的不需要的蛋白质被共同纯化。
[0008]应用包括珠子在内的磁载体的磁技术已经被用于从培养基纯化蛋白质(Safarik et al.Biomagnetic Research and Technology 2：7(2004))。此方法的问题是需要定制每一磁珠试剂，以结合各个分泌蛋白质。这涉及将亲和配体连接到珠子的复杂的化学过程。这在效率和成本上也有障碍。
[0009]在一些情况下，已经利用了分泌蛋白质和底物之间的天然亲和性。例如，溶菌酶对壳多糖有结合亲和性，因而在鸡卵清酶暴露于壳多糖时，它可以被纯化(Safarik et al.Journal of Biochemical and Biophysical Methods 27：327-330(1993))。
概述
[0010]在本发明的一个实施方式中，提供了得到分泌的重组蛋白的浓缩制备物的方法，包括步骤：(a)用含有DNA的载体转化宿主表达细胞，所述DNA编码含有CBD和目标蛋白的融合蛋白；(b)在所述宿主表达细胞中表达所述融合蛋白，并从其分泌所述融合蛋白；和(c)通过CBD将所述分泌的融合蛋白结合到壳多糖制备物，在非变性条件下，所述融合蛋白能够被洗脱进所需的缓冲体积，以获得分泌的重组蛋白的浓缩制备物。
[0011]在本发明的另一个实施方式中，提供了得到分泌的重组蛋白的浓缩制备物的方法，包括步骤：(a)提供穿梭载体，其中所述穿梭载体(i)大肠杆菌中的质粒并且整合到酵母表达细胞的基因组中，和(ii)含有DNA，所述DNA编码含有CBD和目标蛋白的融合蛋白；(b)用所述穿梭载体转化壳多糖酶缺陷型宿主表达细胞，用于在所述酵母表达细胞中表达所述融合蛋白，并从其分泌所述融合蛋白；和(c)通过CBD将所述分泌的融合蛋白结合到壳多糖制备物，以获得分泌的重组蛋白的浓缩制备物。
[0012]两个实施方式均应用穿梭载体进行示范，在一些实施方式中，所述载体在大肠杆菌中能够被克隆但是不表达，以及能够在宿主表达细胞中表达。这种类型的穿梭载体的一个例子是含有修饰LAC4启动子的穿梭载体，进一步通过pKLAC1来示范。
[0013]两个实施方案也均应用壳多糖酶缺陷型的宿主表达细胞来示范。宿主表达系统可以是酵母细胞，例如，选白克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)和酵母(Saccharomyces)种的单个酵母种。当酵母细胞是克鲁维酵母各个种时，它们可以选自马克斯克鲁维酵母变种脆壁克鲁维酵母(fragilis)或乳酸克鲁维酵母(lactis)。
[0014]在上述实施方式的例子中，可以在培养期间或培养末期将壳多糖加入培养基中的酵母细胞。当进一步培养时，壳多糖应该是无菌的。壳多糖可以是涂层、胶体、珠、柱、基质、片层或膜。当壳多糖是珠时，所述珠可以是有孔的或无孔的。任选地，壳多糖珠可以被磁化。
[0015]当通过施加磁力将融合蛋白结合于磁化壳多糖时，融合蛋白可以被回收。融合蛋白与壳多糖的结合任选地是可逆的，使得融合蛋白可以在不同于结合条件的非变性条件下从壳多糖释放。
[0016]在本发明的一个实施方式中，克鲁维酵母细胞制备物的特征在于壳多糖酶阴性表型，其中所述表型是表达分泌的壳多糖酶的壳多糖酶基因中的突变的结果，所述制备物可以生长至与野生型克鲁维酵母细胞相似的细胞密度。细胞密度是指培养48小时时的细胞干重(Colussi et al.Applied and EnvironmentalMicrobiology 71：2862-2869(2005))。
[0017]优选地，克鲁维酵母细胞的制备物能够表达和分泌重组的融合蛋白。表达可以由LAC4启动子或其修饰物来调节，例如，应用具有修饰的LAC4启动子的穿梭载体，用于在克鲁维酵母中表达蛋白质，而在大肠杆菌中基本上不表达蛋白质。穿梭载体的一个例子是pKLAC1。
[0018]上述克鲁维酵母细胞的制备物可以包括培养基，在其中，克鲁维酵母至少能够生长或维持。培养基也可以含有无菌壳多糖。无菌壳多糖可以是能够与放置在培养基或与含有培养基的容器接触的磁体结合的磁珠形式。
附图说明
[0019]图1示出了蛋白质印迹，其中乳酸克鲁维酵母(K.lactis)分泌入耗尽培养基的三种蛋白质与针对环状芽孢杆菌(B.circulans)ChilA壳多糖结合结构域(α-CBD)产生的多克隆抗体交叉反应(泳道1)，所述三种蛋白质的大致质量是＞200、85和50kDa。85kDa蛋白质与壳多糖珠结合，并相应于乳酸克鲁维酵母壳多糖酶(泳道2)。
[0020]图2(A)示出了多结构域KlCts1p壳多糖酶，其带有一个信号肽(条纹)、一个催化结构域(灰色)、一个富含丝氨酸/苏氨酸的结构域(白色)和一个壳多糖结合结构域(黑色)。信号肽切割发生在A19之后。
[0021]图2(B)示出了KlCts1p属于糖基水解酶家族18。预定的KlCts1p催化位点位于氨基酸150-158。这9个位点中的每一位点的可选氨基酸在括号中提供。(“X”代表任何氨基酸)。
[0022]图2(C)示出了，KlCts1p含有2类壳多糖结合结构域。KlCts1p CBD与用SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)软件预测的2类CBD共有序列(SEQ ID NO：14)比对(Letunic，L，et al.Nucl.Acids Res.30：242-244(2002)；Schultz，J.，et al.PNAS 95：5857-5864(1998))。所显示的是KlCts1p CBD(SEQ ID NO：15)与含有预测的2类CBD的示范性蛋白的比对，所述蛋白来自真菌(番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)(SEQ ID NO：16)；品种特异性激发子(Race-specificelicitor)A4前体)，细菌(Ralsonia solanacearum(SEQ ID NO：17)；Q8XZL0)，线虫(秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(SEQ ID NO：18)；可能的内切壳多糖酶)，哺乳动物(Homo sapiens(SEQ ID NO：19)；壳多糖酶)和昆虫(黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(SEQ ID NO：20)；可能的壳多糖酶3)。保守的半胱氨酸残基以粗体印刷给出。
[0023]图3示出了，乳酸克鲁维酵母的缺失突变体不分泌KlCts1p，如壳多糖酶活性所确定。
[0024]图3(A)示出了细胞在YPD培养基中30℃生长22、44和68小时后测定的壳多糖酶活性。活性测定为在pH 4.5和37℃下每分钟从50mM 4MU-GlcNAc3释放4-MU的速率(相对荧光单位，RFU/min)。
[0025]图3(B)示出了，在相应于缺失突变体的样品的蛋白质印迹中没有检测到分泌的壳多糖酶(泳道1)，而对于野生型，则容易地检测到壳多糖酶(泳道2)。
[0026]图4(A)示出了，在应用α-CBD抗体的蛋白质印迹上，存在来自乳酸克鲁维酵母(KLCts1p)的分泌的壳多糖酶。此试验需要分泌的壳多糖酶结合到壳多糖柱并且随后在变化pH的缓冲液中洗脱或煮沸2分钟而洗脱。
[0027]图4(B)示出了，应用20mM NaOH，壳多糖酶(KLCts1p)从壳多糖的洗脱几乎立即发生。壳多糖结合的KlCts1p在五个连续1ml级分的20mM NaOH(E0-E4，其中E0表示柱空体积)中洗脱，经SDS-PAGE分离并经α-CBD蛋白质印迹检测。
[0028]图4(C)示出了，在20mM NaOH中洗脱的KlCts1p保持壳多糖分解活性。应用多种浓度的NaOH从壳多糖微型柱洗脱壳多糖结合KlCts1p，通过测定在pH 4.5和37℃下每分钟从50mM 4MU-GlcNAc3释放4-MU/min的速率，分析洗出液的壳多糖酶活性。
[0029]图4(D)示出了，天然KlCBD可以单独起作用地或作为融合蛋白的一部分起可洗脱亲和标签的作用，其中CBD得自乳酸克鲁维酵母，融合蛋白(人血清白蛋白(HSA)-KICBD)在壳多糖酶缺陷型突变体(K.lactis Δcts1细胞)中表达，从壳多糖珠子洗脱的条件是20mM NaOH。相比而言，来自环形芽孢杆菌的CBD的融合蛋白(HSA-BcCBD)在20mM NaOH中不能类似地从壳多糖珠子洗脱。对照(B-PB)是通过煮沸壳多糖珠子洗脱的融合蛋白质。
[0030]图5示出了pGBN1(pKLAC1)表达载体。所需基因被克隆到与驻留在载体中的交配因子α前原分泌前导序列相同的翻译阅读框中。存在含有独特限制性位点的多接头，以允许克隆所需基因。
[0031]图6示出了重组蛋白从乳酸克鲁维酵母Δcts1细胞的分泌。
[0032]图6(A)示出了，麦芽糖结合蛋白(MBP)从Δcts1乳酸克鲁维酵母细胞的分泌，表明了产量与野生型细胞一样好或者优于野生型细胞。
[0033]图6(B)示出了，HSA-KlCBD融合蛋白从Δcts1乳酸克鲁维酵母细胞的分泌，和在20mM NaOH中所述融合蛋白从壳多糖的洗脱。
[0034]图7是概括了CBD-标记蛋白质从乳酸克鲁维酵母细胞分泌的流程图。
[0035]图8示出了，CBD-标记人血清白蛋白(HSA-CBD)的SDS-PAGE分离，所述蛋白应用在培养生长的各个点加入到生长培养基的磁性壳多糖珠子分离自培养基。
[0036]泳道1示出了分子量标记。
[0037]泳道2示出了HSA-KlCBD，得自作为培养基成分被加入乳酸克鲁维酵母培养物72小时的高压灭菌壳多糖磁珠。
[0038]泳道3示出了HSA-KlCBD，得自被加入乳酸克鲁维酵母培养物48小时的高压灭菌壳多糖磁珠。
[0039]泳道4示出了HSA-KlCBD，得自在收获前1小时被加入乳酸克鲁维酵母培养物的壳多糖磁珠。
[0040]泳道5示出了HSA-KlCBD，得自被加入细胞培养物的上清液的磁性壳多糖珠子。
[0041]图9A和9B示出了如何用壳多糖磁珠从稀释液纯化蛋白质的示意图。
图9A
[0042]步骤1：对磁性壳多糖珠子灭菌(例如，高压、紫外线、辐射、化学处理等)。
[0043]步骤2：在用细胞接种之前，将灭菌后的壳多糖珠子加入生长培养基。在细胞培养物生长期间，细胞分泌标记有壳多糖结合结构域(黑色圆圈)的蛋白质(空心圆)。
[0044]步骤3：分泌的CBD标记蛋白质固定于生长培养基中的磁性壳多糖珠子。
[0045]步骤4：在培养物生长期间的一些时间点，通过暴露于固定珠子的磁场，将含有结合的CBD标记蛋白质的磁性壳多糖珠子从细胞和生长培养基中分离。
[0046]步骤5：用所需缓冲液或介质洗涤珠子。
[0047]步骤6：从磁场释放壳多糖珠子-蛋白质复合物。
[0048]步骤7a：如果可以从壳多糖解离的CBD被用于构建融合蛋白，则纯化的CBD融合蛋白从磁性壳多糖珠子洗脱。
[0049]步骤7b：取决于所需用途，不确定地使收获的蛋白质保持固定在壳多糖磁珠上。
图9B
[0050]步骤1：用细胞接种缺乏磁性壳多糖珠子的培养基。
[0051]步骤2：生长细胞分泌标记有壳多糖结合结构域(黑色圆圈)的蛋白质(空心圆)。
[0052]步骤3：可以除去培养物中的细胞(例如，离心、过滤、凝絮、使细胞通过重力沉降，等)和
[0053]步骤4a：在培养物生长期间的任何点，将无菌磁性壳多糖珠子直接加入培养物。
[0054]步骤4b：将磁性壳多糖珠子加入澄清的耗尽培养基。
[0055]步骤5a和5b：通过暴露于固定珠子的磁场，从细胞和/或生长培养基分离CBD-标记蛋白质。
[0056]步骤6：用所需缓冲液或介质洗涤珠子。
[0057]步骤7：从磁场释放壳多糖珠子-蛋白质复合物。
[0058]步骤8a：如果可以从壳多糖解离的CBD被用于构建融合蛋白，则纯化的蛋白从磁性壳多糖珠子洗脱。
[0059]步骤8b：取决于所需用途，不确定地使收获的蛋白质保持固定在壳多糖磁珠上。
[0060]图10(a)示出了适于从微量滴定皿中的制备物分离磁珠的磁架。
[0061]图10(b)示出了适于从微量离心管中的制备物分离磁珠的磁架。
[0062]图10(c)示出了适于从标准的50ml实验室试管中的制备物分离磁珠的磁架。
[0063]图10(d)示出了适于从标准的250ml离心瓶中的制备物分离磁珠的磁架。
[0064]图11(a)示出了适于从培养容器或发酵罐中的制备物分离磁珠的可浸入电磁体探针的图。
[0065]步骤1和2：将电磁体探针(深灰色)浸入含有固定于磁珠(灰色)的蛋白质的培养容器或发酵罐。
[0066]步骤3：打开电磁体，磁珠被固定在其表面。
[0067]步骤4：将电磁体(打开的)从培养容器或发酵罐移除，从而分离磁珠。
[0068]图11(b)示出了适于从发酵罐或培养容器的流出物分离磁珠的磁力设备的图示。
[0069]步骤1：来自含有培养基、细胞和与磁珠(灰色)结合的蛋白质的发酵罐或容器的流出物从发酵罐流入或通过磁分离设备。
[0070]步骤2：由电磁体或可移动永久磁体组成的磁分离设备从剩余流出物中分离磁珠。
[0071]步骤3：澄清的流出物流过磁分离设备。
[0072]图12示出了，来自环形芽孢杆菌的分泌的GluC-CBD融合蛋白可以被获得，不论磁化壳多糖珠子是在细胞培养起始或期间或培养物上清液被收获之后被加入。凝胶示出了通过在SDS样品缓冲液中煮沸从磁化壳多糖珠子洗脱后得到的GluC-CBD的量。
泳道1：对照-未染色标准品(Mark 12-Invitrogen，Carlsbad，CA)；
泳道2：对照-GluC蛋白；
泳道3：过夜温育GluC-CBD转化的环状芽孢杆菌细胞。温育开始时将磁化壳多糖珠子加入培养基。
泳道4：过夜温育GluC-CBD转化环状芽孢杆菌细胞。收集培养基1小时前将磁化壳多糖珠子加入培养基。
泳道5：过夜温育GluC-CBD转化环状芽孢杆菌细胞。在收获并离心培养基之后，将磁化壳多糖珠子加入上清液。
[0073]图13示出了柱状图，其中得自壳多糖柱的连续级分的荧光素酶的量表明，在非变性条件下，荧光素酶-CBD在级分2至10中洗脱出来，在级分3、4和5中可见最高活性。
发明详述
[0074]本文描述了在蛋白质从形成所述蛋白质的宿主细胞分泌入培养基之后浓缩所述蛋白质的方法。所述方法应用CBD对壳多糖的亲和力，并且可以通过应用不分泌壳多糖酶的细胞增强。壳多糖酶阴性细胞可以作为遗传修饰的结果而形成或者可以天然发生。可以期望的是，这些壳多糖酶缺陷型修饰细胞可以生长至与野生型细胞相似的密度和相似的产量。宿主细胞可以用编码与在合适的启动子下表达CBD的DNA融合的目标基因的载体转化，因而相对大量的目标蛋白通过宿主细胞分泌入生产培养基中。壳多糖底物可以存在于生产培养基中，或者在单独的反应容器中，用于将目标蛋白从混合物中拉出。CBD融合蛋白的结合将分泌的重组蛋白浓缩在壳多糖表面。应用许多方法中的任一方法，可以进一步浓缩蛋白质。例如，在一个实施方式中，磁化壳多糖，将磁场施加于生产培养基，将壳多糖珠子浓缩至磁性表面附近。其它实施方式包括离心沉淀壳多糖珠。随后目标蛋白可以从浓缩的壳多糖底物被回收。
[0075]术语“浓缩的(concentrated)”是指完成一个程序后的重量与体积的比值大于所述程序之前的该比值。
修饰宿主细胞，以敲除壳多糖酶表达
[0076]用于分泌重组CBD标记蛋白质的优选宿主细胞背景是这样的宿主细胞，其：(i)不产生会污染含有CBD的分泌融合蛋白制备物的壳多糖结合蛋白或壳多糖分解活性；(ii)能够在培养物中实现高细胞密度；和(iii)能够有效分泌重组蛋白。不分泌壳多糖酶的宿主细胞的优势包括：(i)消除了CBD标记蛋白和内源性壳多糖酶之间对壳多糖结合位点的竞争；(ii)消除了壳多糖固定的融合蛋白受到内源性壳多糖酶污染的风险；和(iii)消除了内源性壳多糖酶对目标壳多糖底物的降解。
[0077]合适的宿主细胞包括多种昆虫细胞培养物产生系和哺乳动物细胞系以及酵母生产株和细菌细胞。
[0078]分泌蛋白质用于制备目的的细胞的例子包括大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)各种、芽孢杆菌属(Bacillus)各种、链霉菌属(Streptomyces)各种等，植物细胞(例如，拟南芥属(Arabidopsis)各种、红豆杉属(Taxus)各种、长春花属(Catharanthus)各种、烟草属(Nicotiana)各种、稻属(Oryza)各种、大豆、紫花苜蓿、番茄等)，真菌细胞(例如，克鲁维酵母属各种、酵母属各种、毕赤酵母属各种、汉逊酵母属各种、耶氏酵母属各种、脉孢菌属(Neurospora)各种、曲霉菌属(Aspergillus)各种、青霉菌属(Penicillium)各种、假丝酵母属(Candida)各种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)各种、隐球菌属(Cryptococcus)各种、鬼伞菌属(Coprinus)各种、菰黒粉菌属(Ustilago)各种、Magnaporth各种、木霉菌属(Trichoderma)各种等等)，昆虫细胞(例如，Sf9细胞，Sf12细胞，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞、果蝇属(Drosophila)各种等)，或哺乳动物细胞(例如，原代细胞系，HeLa细胞，NSO细胞，BHK细胞，HEK-293细胞，PER-C6细胞等)。这些细胞可以在微升体积到多升体积的培养物中生长。
[0079]克鲁维酵母各种用于本文中以说明与CBD融合的分泌蛋白如何快速和容易地从混合物被分离。根据本发明实施方式的克鲁维酵母属的酵母包括vander Walt在The Yeasts，ed.N.J.W.Kregervan Rij：Elsevier，New York，NY，p.224(1987)中定义的酵母，并且包括马克斯克鲁维酵母乳酸变种(K.marxiamus var.lactis(K.lactis))、马克斯克鲁维酵母马克斯变种(K.marxianus var.marxianus(K.fragilis))、马克斯克鲁维酵母drosophilarum变种(K.marxianus var.drosophilarum(K.drosophilarum)和K.waltii和本领域中归类为克鲁维酵母的其它菌株。
[0080]在那些天然分泌一种或多种壳多糖酶的宿主细胞中，可以通过遗传修饰产生壳多糖酶缺失突变体。遗传修饰是指在目标基因中抑制、取代、缺失或添加一个或多个碱基中的任何一种修饰。这种修饰可以在体外实现(对分离的DNA)或者在原位实现，例如，通过遗传工程技术，或者可选地通过将宿主细胞暴露于诱变剂如辐射(X线、γ射线、紫外线和类似物)或能够与DNA的碱基的多种官能团反应的化学剂，例如烷化剂：甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate(EMS))、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、N-硝基喹啉1-氧化物(N-nitroquinoline 1-oxide(NQO))、双烷化剂、嵌入剂和类似物。而且，通过修饰一部分编码壳多糖酶的区域和/或所有或部分的转录启动子区域，目标基因的表达可以被抑制。
[0081]遗传修饰也可以通过基因断裂得到。壳多糖酶基因断裂的一个例子提供在有关乳酸克鲁维酵母的实施例1中。本实施例中描述的方法可以广泛应用于任何克鲁维酵母种。
[0082]在实施例1中，编码KlCts1p的壳多糖酶基因在工业乳酸克鲁维酵母株(GG799)中被断裂，该菌株优选地缺乏乳酸克鲁维酵母放毒者质粒。断裂通过替换一部分壳多糖酶基因发生，例如，将天然发生的乳酸克鲁维酵母壳多糖酶基因的起始168个氨基酸替换为选择性标记基因如G418抗性序列盒。
[0083]乳酸克鲁维酵母GG799Δcts1细胞能够在培养中取得与野生型细胞相同的高细胞密度(实施例2)，不产生具有可检测的壳多糖结合或壳多糖分解活性的蛋白质(图3A)，并且能够大量分泌重组蛋白(图6)。这一菌株被证实很适于用作产生重组CBD标记蛋白质的宿主。
[0084]对于生产目的，需要壳多糖酶阴性突变宿主细胞在培养中获得与野生型细胞相似的高细胞密度，虽然缺乏具有可检测的壳多糖结合或壳多糖分解活性的分泌蛋白质，以及这些细胞可以大量分泌重组蛋白质。因而，壳多糖酶阴性宿主细胞可以用在发酵中，以便有效地制备具有工业用途的与CBD直接连接或通过接头肽或连接化学基团与CBD连接的纯化重组蛋白质。
设计和应用载体，用于在酵母中表达和分泌高水平的蛋白质
[0085]针对多种酵母的表达载体的例子描述在Muller et al.Yeast 14：1267-1283(1998)中，针对克鲁维酵母的表达载体也描述在US 4,859,596、US5,217,891、US 5,876,988、US 6,051,431、US 6,265,186、US 6,548,285、US 5,679,544和美国申请序列号11/102,475中。
[0086]表达载体可以是外源性的。例如，YEp24是用于在酿酒酵母中进行基因过表达的附加型穿梭载体(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。用于此生物体的附加型穿梭载体的其它例子是pRS413、pRS414、pRS415和pRS416。克鲁维酵母中的自主复制载体包括pKD1(Falcone et al.，Plasmids 15：248(1986)；Chen et al.，Nucl.Acids Res.14：4471(1986))，pEW1(Chen et al.，J.General Microbiol.138：337(1992))。除了完整的pKD1载体之外，含有pKD1起点和顺式作用稳定性基因座(cis-acting stability locus(CSL))的更小的载体已经被构建，并且用于在乳酸克鲁维酵母中异源蛋白表达(Hsieh，et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.4：411-416(1998))。其它附加型载体也在乳酸克鲁维酵母中复制。带有着丝点(cen)和自主复制序列(ars)的质粒已被用于在乳酸克鲁维酵母中表达克隆真菌cDNA(van der Vlug-Bergmans，et al.Biotechnology Techniques 13：87-92(1999))。此外，含有乳酸克鲁维酵母ARS序列(KARS)的载体已被用于表达真菌α-半乳糖苷酶(Bergkamp，et al.Curr Genet.21：365-70(1992))和植物α-淀粉酶(Strasser et al.Eur.J.Biochem.184：699-706(1989))。
[0087]其它载体可以被整合入宿主基因组。例如，美国6,602,682、美国6,265,186和美国申请序列号11/102,475，描述了整合入克鲁维酵母基因组的质粒。
[0088]载体应该含有下列至少一种或多种：(i)强酵母启动子；(ii)编码分泌前导序列的DNA(如果需要蛋白质分泌到培养基中)；(iii)编码待表达蛋白质的基因；(iv)转录终止序列；和(v)酵母选择性标记基因。这些序列组分典型地在大肠杆菌中在质粒载体中装配，随后所述载体被转移到酵母细胞中实现蛋白质生产。这种类型的载体被称作穿梭载体。
[0089]虽然穿梭载体由于能够在转化宿主细胞之前在大肠杆菌中制备而被优选，但是本发明实施方式不限于穿梭载体。
[0090]例如，能够整合入酵母基因组的DNA片段可以通过PCR或解旋酶依赖性扩增(Helicase-Dependent Amplication(HDA))构建和直接导入酵母细胞。可选地，表达载体能够在不同于大肠杆菌的细菌中通过克隆步骤被装配或者直接在酵母细胞中装配。
[0091]蛋白质在克鲁维酵母中，更通常地在酵母中的过表达，涉及穿梭载体的构建，所述穿梭载体含有带有适于指导感兴趣基因在导入酵母宿主后高水平转录的序列的DNA片段。例如，当PLAC4存在于整合型质粒或附加型质粒中时，其可以起到在酵母中表达蛋白质的强启动子的作用，所述质粒如基于pKD1的载体、含2μ质粒的载体(2micron-containing vector)和着丝粒载体。分泌前导序列(如果需要蛋白质分泌到培养基中)可以含有酿酒酵母(S.cerevisiae)α-MF前原分泌前导肽。也可以应用其它原核或真核分泌信号肽(例如，克鲁维酵母α-交配因子前原分泌信号肽，克鲁维酵母杀伤毒素信号肽)或合成的分泌信号肽。可选地，分泌前导序列可以从载体中完全省去，以获得所需蛋白质的细胞表达。
[0092]穿梭载体允许克隆基因在被引入酵母细胞进行表达之前在细菌中繁殖。然而，利用野生型PLAC4的酵母表达系统可以受到来自细菌宿主细胞如大肠杆菌的PLAC4控制下的基因的偶然蛋白质表达的不利影响。此启动子活性可以干扰其翻译产物对细菌有害的基因的克隆效率。
[0093]带有突变的Pribnow盒类似序列的PLAC4变体可以通过定点诱变产生，所述诱变基本上保持它们在克鲁维酵母各种中作为强启动子的功能，所述克鲁维酵母示范为但不限于乳酸克鲁维酵母。这些突变启动子与野生型PLAC4中的非突变Pribnow盒类似序列的作用基本上一样好，或者优于该序列。
[0094]术语“突变(mutation)”在本文中意图于包括下列中的任何：在野生型DNA序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。
[0095]在本发明的一个实施方式中，真菌表达宿主是酵母克鲁维酵母属的各个种，细菌宿主是大肠杆菌和特征如下的一系列PLAC4变体：(a)启动子的-198至-212区域，例如在位点-201、-203、-204、-207、-209和-210基本上不干扰该启动子作为乳酸克鲁维酵母中的强启动子的能力；(b)启动子的-133至-146区域，例如在位点-139、-140、-141、-142和-144基本上不干扰强启动子活性；或(c)-198至-212和-133至-146区域可以被并入；(d)产生杂合启动子，其由酿酒酵母(Sc)PGK启动子的283bp(-1至-283)组成，替换乳酸克鲁维酵母PLAC4的-1至-283区域。这些取代在美国申请序列号11/102,475中详述。
[0096]转录终止序列的一个例子是TTLAC4。
[0097]酵母选择性标记基因可以是，例如，赋予对抗生素(例如G418、潮霉素B和类似物)的抗性的基因，补充菌株的营养缺陷型的基因(例如，ura3、trp1、his3、lys2和类似物)或乙酰胺酶(amdS)基因。在转化的酵母细胞中表达乙酰胺酶，使得它们在缺乏简单氮源但含有乙酰胺的培养基中生长。乙酰胺酶将乙酰胺分解为氨，其可以被细胞用作氮源。这种选择方法的益处是富集了已并入基于pKLAC1的表达载体的多串连整合的细胞的转化子群体，和产生比单个整合更多的重组蛋白质(图5)。
[0098]含有PLAC4突变体的上述载体已被插入大肠杆菌/克鲁维酵母整合型穿梭载体，例如，pGBN1和pKLAC1(美国申请序列号11/102,475)，其在转化感受态宿主细胞后整合入克鲁维酵母基因组，随后指导蛋白质表达。
[0099]美国申请序列号11/102,475描述了含有突变PLAC4的穿梭载体用于酵母中，特别是克鲁维酵母，例子为乳酸克鲁维酵母，其较专利US 4,859,596、US5,217,891、US 5,876,988、US 6,051,431、US 6,265,186、US 6,548,285、US 5,679,544中描述的载体提供了改进。这种改进是由于，修饰的LAC4在酵母中用于表达和不能够在大肠杆菌中表达蛋白质，从而避免了在细菌克隆宿主细胞中的毒性所引起的问题。
DNA载体向宿主细胞的导入
[0100]对于真核细胞和原核细胞，DNA向宿主细胞的导入方法是已经确立的(Miller，J.F.Methods Enzymol.235：375-385(1994)；Hanahan，D.et al.，MethodsEnzymol.204：63-113(1991))。在酵母中，将DNA导入细胞的标准方法包含遗传杂交、原生质体融合、基于锂的转化、电穿孔、接合或文献中描述的任何其它技术，所述文献例如，Wang et al.Crit Rev Biotechnol.21(3)：177-218(2001)；Schenborn et al.Methods MoI Biol.130：155-164(2000)；Schenborn et al.Methods MoI Biol.130：147-153(2000)。关于克鲁维酵母的转化，在Ito et al.(J.Bacteriol.153：163(1983))；Durrens et al.(Curr.Genet 18：7(1990))；Karube et al.(FEBS Letters 182：90(1985))和欧洲专利申请361 991中描述了已确立的技术。
CBD的性质，包含洗脱性质
[0101]CBD作为壳多糖酶的组分，可以得自许多不同来源，例如，真菌、细菌、植物和昆虫。来自壳多糖酶的任何CBD都可以在本文中应用，虽然优选分离自壳多糖酶催化结构域的CBD。也优选能够在不同于结合条件的非变性条件下从壳多糖分离的CBD。不是所有CBD都能够在非交性条件下从壳多糖分离。例如，环状芽孢杆菌CBD与壳多糖紧密结合，所述结合是不可逆的，除非将突变引入蛋白质，如美国6,897,285、美国公开2005-0196804和2005-0196841中所述。相比而言，克鲁维酵母各种产生与壳多糖紧密结合、但可以在改变的条件如NaOH下可逆分离的CBD(参见例如实施例5和6)。
[0102]克鲁维酵母大量产生表达的分泌的内切壳多糖酶(KCBD)，在本文中通过示例的方式显示出，它是有效的亲和标签，允许可逆地固定或纯化嗜碱性蛋白质或耐碱性蛋白质。KCBD能够在不存在催化性结构域时结合壳多糖(参见例如图4D)，充当克鲁维酵母中异源表达蛋白上的亲和标签，如图4D和6B所示，和在约5mM至500mM范围的NaOH中从壳多糖解离，而来自环状芽孢杆菌的CBD(BcCBD)不能如此。
壳多糖结合CBD的特性
[0103]合成的壳多糖或天然发生的壳多糖可以用于结合CBD融合蛋白。合成的壳多糖的例子是乙酰化壳聚糖，聚合的N-乙酰基葡萄糖胺单糖、多糖或寡糖，或聚合的葡萄糖胺单糖、寡糖或多糖，其中葡萄糖胺随后被化学乙酰化。
[0104]天然发生的壳多糖的例子是来自蟹类、昆虫外骨骼或真菌细胞壁或本领域已知的任何来源的壳多糖。
[0105]壳多糖可以被任选地固定在图7所述的基质上。基质的一个例子是聚合物如塑料。可选地，壳多糖可以被聚集形成例如：悬浮液、胶体、珠、柱、基质、片层或膜。在发酵期间，壳多糖可以被灭菌以加入发酵培养基，或者在发酵末期，可以以无菌形式用于结合融合蛋白。
利用壳多糖涂覆磁珠浓缩与CBD融合的任何分泌蛋白质的一般可应用方法
[0106]用于结合分泌的CBD融合蛋白的壳多糖基质可以任选地被磁化，以便容易从培养基中移去目标蛋白。磁化的壳多糖通过使壳多糖和磁性材料结合而制备。磁性材料可以是分散的部分如铁屑。在一个优选实施方式中，磁化壳多糖是珠的形式，虽然磁化壳多糖可以用作任选为惰性的其它材料的涂层。而在一个优选实施方式中，磁性材料是磁性壳多糖，具有下列性质的其它磁性材料可以应用：(a)能够结合目标蛋白或与目标蛋白融合而表达；和(b)能够结合于可以被磁化的材料。
[0107]在一个实施方式中，应用磁化壳多糖珠子(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)结合分泌的CBD融合蛋白。珠子的大小不是至关重要的，虽然直径为200nm以下的大小形成的珠子具有这样的优势，即在施加磁力之前能够通过无菌过滤器和在培养基中形成胶体(参见，例如5,160,726)。也可以应用更大的珠子。壳多糖珠子可以是固体(例如，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)或有孔的(例如，JP 62151430)。而且，珠子可以通过多种方式被磁化，例如，通过使铁屑分散遍布珠子或者形成带有铁芯的珠子(通过用壳多糖涂覆铁)(参见，例如，5,262,176)。虽然在一个优选实施方式中，本文应用的磁化壳多糖是珠子的形式，不用途排除其它形状和大小的壳多糖表面。
[0108]磁性壳多糖珠子也可以在细胞培养物生长期间或之后、或从培养物清除生长细胞之后加入生长培养基(图9B)。因此，已经显示，磁化壳多糖珠子可以被灭菌而不明显改变它们的结合性质。当壳多糖珠在生长期间被加入培养基时，优选对珠进行灭菌。
[0109]典型地，CBD标记蛋白与壳多糖珠的最大结合(图9B，步骤4a和4b)会在4℃、在1小时内发生，然而，其它温度和时间段也是可能的。固定于磁性壳多糖珠子的蛋白质在磁场中被收获(图9B，步骤5a和5b)，细胞、污染蛋白质和生长培养基从珠子洗去(图9B，步骤6)。如果可洗脱CBD被用作亲和标签，壳多糖珠-蛋白质复合物随后从磁场释放(图1B，步骤7)，收获的蛋白质可以不确定地保持固定于壳多糖珠子上(图9B，步骤8b)或可以从壳多糖解离(图9B，步骤8a)。
[0110]通过向发酵容器中的培养基加入磁化壳多糖珠子，可以从而实现回收目标蛋白的有效的一步法。细胞在含有磁化壳多糖珠子的培养基中生长，因而在培养期间，分泌的CBD-标记蛋白与珠子结合，并且可以通过施加来自发酵容器外部的磁体、或者按需要来自发酵容器内部的磁体的磁力的简单步骤从培养基直接收获(参见图9-11)。此方法需要磁化壳多糖珠被灭菌。本文示出，来自发酵起始或发酵期间加入的50-70μm大小的灭菌壳多糖珠的产量与珠子在发酵完成时加入所得到的蛋白质产量相似(图8)。
[0111]从大体积浓缩分泌蛋白质的本方法的一个引人注目的特征是其普遍性。本方法采用壳多糖结合结构域在与其它蛋白质融合时结合壳多糖的能力，其中所述其它蛋白质不受CBD存在的损害。
[0112]通过确认分泌融合蛋白的细胞不天然产生结合壳多糖的蛋白质，竞争性结合和污染被避免。CBD以显著的亲和力结合壳多糖。使得所需的蛋白质CBD融合蛋白从壳多糖珠回收可以这样实现：突变CBD，因而结合可以在被控制条件下逆转，以便释放融合蛋白(美国6,897,286)；或者可选地应用内含肽切割系统或蛋白酶切割，以便从CBD壳多糖复合物释放蛋白质(WO 2004/053460，美国5,643,758)。另外，如果在CBD和所需蛋白质之间存在蛋白水解切割位点，通过应用蛋白酶消化(例如，肠激酶、genenase、弗林蛋白酶(furin)、因子X等)，CBD标记可以从所需蛋白质释放。
[0113]CBD-壳多糖相互作用的强力性质使得CBD-标记蛋白质迅速地固定于任何形式的磁化壳多糖，例如珠子。
[0114]当磁化壳多糖是珠子形式时，含有结合的CBD标记蛋白的壳多糖珠子可以在磁场中在数秒内收获。如果需要，通过在洗脱缓冲液中温育，CBD-标记蛋白可以从磁化基质解离(如果应用可洗脱CBD)。本方法的优势包括改进的速度、成本效应和简便性。
[0115]应用适于普通实验室管(例如，96孔微量滴定皿、微量离心管、15mlFalcon管、50ml Falcon管、250ml Nalgene瓶等)的磁分离设备从数微升至数升培养基中收获CBD-标记蛋白质(图3-6)。本方法容易升级为允许从更大体积的培养基中收获CBD-标记蛋白质。在优选实施方式中，磁体由稀土金属构建(例如，钕、钐、钴等)，但是也可以应用其它类型的磁体(例如，铁氧体、陶瓷、电磁体等)。
表达系统的应用
[0116]对于用作药物、用于食品或工业的蛋白质，需要从混合物中生产和分离目标蛋白。现存的或需要的基于发酵生产的蛋白质列表非常巨大。几个例子包括超氧化物歧化酶、过氧化物酶、淀粉酶、脂酶、酰胺酶、糖苷酶、木聚糖酶、虫漆酶、木质素酶、凝乳酶和类似物，或者其任何片段或衍生物，血液衍生物(如血清白蛋白，α球蛋白或β球蛋白，凝血因子例如因子VIII、因子IX、冯维勒布兰德因子，纤连蛋白，α-1抗胰蛋白酶，和类似物，或者其任何片段或衍生物)，胰岛素及其变体，淋巴因子如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF、M-CSF和类似物)，TNF和类似物，或者其任何片段或衍生物，生长因子(如生长激素、促红细胞生成素、FGF、EGF、PDGF、TGF和类似物，或其任何片段或衍生物)，载脂蛋白及其分子变体，用于产生疫苗的抗原多肽(肝炎、巨细胞病毒、EB病毒、疱疹病毒和类似物)，单链抗体(ScFv)或可选的多肽融合物，如，特别是含有融合于稳定部分的生物活性部分的融合物。
[0117]上下文引用的所有参考文献，以及美国临时申请序列号60/616,420和60/690,470，并入本文作为参考。
实施例
实施例1：用于下述实施例的材料和方法
酵母株，培养条件和转化条件
[0118]乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母菌株(表1)在YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、和2％葡萄糖)或YPGal培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％半乳糖)中30℃常规培养。
表1：用于本研究的酵母菌株
  生物体  菌株   基因型   来源
  乳酸克鲁维酵母  GG799   MATα[pGKl1O pGKl2O]   本研究
 PCKl1   MATα cst1∷KanR[pGKl1OpGKl2O]   本研究
 PCKl2   MATαLAC4∷BcCBD-HSA[pGKl1OpGKl2O]   本研究
  PCKl3   MATαLAC4∷KlCBD-HSA[pGKl1OpGKl2O]   本研究
  CBS 2359   MAFTα[pGKl1+pGKl2+]   ACTT 8565
  CBS 683   MATα[pGKl1+pGKl2+]   ACTT 56498
  PRY297   MATαade1 ade2[pGKl1+pGKl2+]   ACTT 56794
  PRY298   MATαade1 ade2，[pGKl1+pGKl2+]   ACTT 52735
  PRY299   MATα uraA[pGKl1+pGKl2+]
  酿酒酵母   BY4741   MATα his3Δ1 leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0   ResearchGenetics*
  6947   MATα his3Δ1 leu2Δ0met15Δ0 ura3Δ0cts1∷kanMX4   ResearchGenetics*
  PCSc1   MATα his3Δ1 leu2Δ0met15Δ0 ura3Δ0cts1∷kanMX4[pKlCTS1]   本研究
*Research Genetics，Invitrogen，Carlsbad，CA
[0119]乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母的转化应用电穿孔实现。乳酸克鲁维酵母的转化子通过在含有200mg G418/ml的YPD琼脂中生长而选择，而酿酒酵母转化子通过在含有补充菌株营养缺陷型所需的合适补充物的SD培养基(0.67％酵母氮基，2％葡萄糖)或SGal培养基(0.67％酵母氮基，2％半乳糖)中生长而获得。
分泌的乳酸克鲁维酵母壳多糖结合蛋白的检测和分离
[0120]应用蛋白质印迹检测与多克隆抗壳多糖结合结构域抗体(α-CBD)交叉反应的分泌的乳酸克鲁维酵母蛋白质，所述抗体针对来自环状芽孢杆菌壳多糖酶A1的壳多糖结合结构域(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
[0121](a)在生长48-96小时后，通过以4000×g离心10分钟，从乳酸克鲁维酵母GG799中分离耗尽培养基。
[0122]离心之后，在4-20％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上(DaiichiPharmaceutical Corp.，Montvale，NJ)，通过SDS-PAGE分离耗尽培养基中的蛋白质，并将其转移到Protran硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell Bioscience，Keene，NH)。使膜在含有0.05％Tween 20(PBS-T)和5％脱脂奶粉(w/v)的磷酸盐缓冲液中4℃封闭过夜，并用α-CBD多克隆抗体(1∶2000，在含有5％脱脂奶粉的PBS-T中)探测，随后用辣根过氧化物酶偶联的抗-兔二抗(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)；1∶2000，在含有5％脱脂奶粉的PBS-T中)探测。蛋白质-抗体复合物应用LumiGloTM检测试剂(Cell Signaling Technologies，Beverly，MA)可视化。
[0123](b)为了分离结合壳多糖的分泌蛋白质，使乳酸克鲁维酵母GG799细胞在20ml YPD培养基中生长96小时。通过离心从培养物中去除细胞，将耗尽培养基转移到含有1ml水洗壳多糖珠子的新鲜试管中(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)并于室温下温育，同时轻轻旋转1小时。通过离心收获壳多糖珠，用10ml水洗涤。移去大约50μl体积的蛋白质结合壳多糖珠，并在蛋白质加样缓冲液中煮沸2分钟以洗脱结合蛋白质，随后洗脱的蛋白质用SDS-PAGE分离，并接受应用α-CBD多克隆抗体的蛋白质印迹分析或是接受氨基末端蛋白质测序。
乳酸克鲁维酵母壳多糖酶衍生壳多糖结合结构域(KlCts1p CBD)的壳多糖结合性质的分析
[0124]使来自20ml乳酸克鲁维酵母GG799耗尽培养基的KlCts1p结合于1ml体积的壳多糖珠，如上述。用10ml水洗涤KlCts1p结合珠并重悬浮于1.5ml水中。通过将KlCts1p结合珠的100μl等分试样分散到各个一次性柱(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)，制备微型柱。使1ml体积(～10个床体积)的下列缓冲液通过各个微型柱：50mM醋酸钠，pH 3.0；50mM醋酸钠，pH 5.0；100mM甘氨酸-NaOH，pH 10.0；未缓冲的20mMNaOH，pH 12.3；5MNaCl和8M尿素。然后应用2ml水洗涤每一柱，随后将珠子重悬浮于200μl水中，转移到微量离心管并通过短暂离心收集。通过在50ml的3×SDS-PAGE加样缓冲液(New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)中煮沸5分钟，洗脱保持结合于壳多糖的蛋白质。通过SDS-PAGE分离洗脱蛋白质并通过蛋白质印迹分析检测，如上述。
[0125]以相同的方式应用不同浓度的NaOH(0-40mM)进行KlCts1p洗脱。如上述制备壳多糖结合KlCts1p的等分试样(100μl)，并将其分配到微量过滤杯(Millipore，Billerica，MA)，所述杯已插入1.5ml微量离心管中，从而形成旋转柱。以15,800×g微量离心1分钟，收集流过物(flow-through)并弃去。随后将珠子重悬浮于每一所需浓度(0-40mM)的100μl NaOH中，以15,800×g离心1分钟，收集洗出液。如下测定每一洗出液中的壳多糖酶活性。
乳酸克鲁维酵母壳多糖酶基因(KlCTS1)的断裂
[0126]应用基于PCR的方法构建由ADH2启动子-G418抗性基因序列盒组成的线性DNA断裂片段，其每一端具有80-82bp的KlCTS1 DNA。当在KlCTS1基因座进行整合时，此片段使编码KlCts1p的起始168个氨基酸的DNA替换为G418抗性序列盒。应用含有与ADH-G418序列(无下划线)杂交的DNA并且具有由KlCTS1 DNA序列(下划线)构成的尾部的引物，
5′- CCAGTAATGCAACTATCAATCATTGTGTTAAACTGGTCACCAGAAATACAA GATATCAAAAATTACTAATACTACCATAAGCCATCATCATATCGAAG-3′(SEQ IDNO：1)和
5′- CCAAACTAGCGTATCCGGTTGGATTATTGTTTTCGATATCGAAATCGAAACC ATCGACGACAGCAGTGTCGAATGGTCTTTCCCCGGGGTGGGCGAAGAACTCC-3′(SEQ ID NO：2)，应用Taq DNA聚合酶，从含ADH2-G418的载体pGBN2扩增断裂DNA片段。用扩增产物转化乳酸克鲁维酵母GG799细胞，在含有200mgG418/ml的YPD琼脂上选择菌落。使用KlCTS1特异性正向引物5′-GGGCACAACAATGGCAGG-3′(SEQ ID NO：3)(设计在整合位点上游)和G418特异性反向引物5′-GCCTCTCCACCCAAGCGGC-3′(SEQ ID NO：4)，应用全细胞PCR，从已在KlCTS1基因座正确整合该断裂DNA片段的细胞扩增～600bp的诊断性DNA片段。在以此方式测定的20个转化子中，2个Dcts1乳酸克鲁维酵母菌株被鉴定和进一步表征。
KlCTS1在酿酒酵母中的异源表达
[0127]为了在酿酒酵母中表达KlCTS1，用下列引物PCR扩增该基因：5′-GGC GGATCCGCCACCATGTTTCACCCTCGTTTACTT-3′(BamH I位点用下划线示出)(SEQ ID NO：5)和5′-ACAT GCATGCCTAGAAGACGACGTCGGGTTTCAA-3′(Sph I位点用下划线示出)(SEQ ID NO：6)，并克隆入pMW20(31)的BamH I-Sph I位点，使KlCTS1的表达位于半乳糖可诱导/葡萄糖可阻遏的酿酒酵母GAL10启动子的控制下。通过转化将此表达构建体导入酿酒酵母Δcts1菌株RG6947。为了诱导KlCtsp1产生，在30℃中使2ml起始培养物在含有20mg尿嘧啶/ml的SD培养基中生长过夜，随后用每一培养物1ml接种20ml YPD和20ml YPGal培养物。使每一培养物在30℃振荡下生长过夜，随后分析耗尽培养基的壳多糖酶产生和通过显微镜分析细胞形态学。
壳多糖酶活性测定
[0128]应用1-4GlcNAc残基的壳多糖寡糖作为底物，每一寡糖与4-甲基伞形酮(4-methyl umbelliferone(4-MU))衍生化作为底物：4-甲基伞形基-N-乙酰-β-D-壳三糖苷(4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-chitotrioside(4MU-GlcNAc))、4-甲基伞形基N，N′-二乙酰-β-D-壳四糖苷(4-methylumbelliferylN，N′-diacetyl-β-D-chitotetraoside(4MU-GlcNAc2))、4-甲基伞形基N，N’，N”-三乙酰-β-D-壳三糖苷(4-methylumbelliferyl N，N’，N”-triacetyl-β-D-chitotrioside(4MU-GlcNAC3))或者与4-甲基伞形基-N，N’，N”，N-四乙酰-β-D-壳四糖苷衍生化(4-methylumbelliferyl N，N’，N”，N-tetraacetyl-β-D-chitotetraoside(4MU-GlcNAc4))(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO and EMD Biosciences，San Diego，CA)。通过应用Genios荧光微量滴定板读数器(Tecan，San Jose，CA)和340nm/465nm激发/发射滤波器于37℃测定4-MU的释放，测定壳多糖酶活性。96孔黑色微量滴定板的每孔中的反应混合物是100ml并且含有50mM底物、1×McIlvaine′s缓冲液(在不同试验中的pH范围是4-7)和5-10ml样品。记录起始释放速率，酶单位计算为每分钟释放4-MU的皮摩尔数(pmol)。在用于反应的条件下，制备4-MU(Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)的标准曲线，用于从荧光单位进行转变。
显微镜方法
[0129]收获约1-2OD600单位的细胞并于冰上将其固定在1ml的2.5％(v/v)戊二醛中1小时。细胞用水洗涤两次，并重悬浮于约100ml封固剂(mounting medium)(20mM Tris-HCl pH 8.0，0.5％N-丙基没食子酸，80％甘油)中。在膜染色试验中，将荧光增白剂(Calcofluor white)(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)加入到封固剂，至终浓度100mg/ml。应用光相位Normaski成像或荧光DAPI滤波器装置，用ZeissAxiovert 200M显微镜观察细胞。
细胞壳多糖测定
[0130]用KOH提取细胞，通过壳多糖酶将碱性不溶性物质中的壳多糖水解为GlcNAc，用于通过前述Morgan-Elson试验进行定量(Bulik，D.A.，et al.EukaryotCell 2：886-900(2003))。
实施例2：乳酸克鲁维酵母壳多糖酶(KlCts1p)的鉴定和生物化学特征
[0131]在对乳酸克鲁维酵母GG799耗尽培养基的蛋白质印迹分析中，应用针对环状芽孢杆菌ChilA壳多糖酶结合结构域(α-CBD)产生的多克隆抗体，以便鉴定含有交叉反应的壳多糖结合结构域的天然分泌的乳酸克鲁维酵母蛋白(图1)。
[0132]在4-20％聚丙烯酰胺Tris-甘氨酸SDS凝胶上分离10ml未浓缩的乳酸克鲁维酵母GG799耗尽培养基(生长96小时)中的分泌蛋白质，并应用针对环状芽孢杆菌壳多糖酶A1壳多糖结合结构域产生的多克隆抗体，通过蛋白质印迹筛选壳多糖结构域的存在情况(泳道1)。在SDS-PAGE分离之前，将分泌蛋白质结合于壳多糖珠并通过煮沸2分钟而直接洗脱到SDS-PAGE加样缓冲液(泳道2)。
[0133]为了检测这些蛋白质中的任何蛋白质是否能够结合壳多糖，将耗尽培养基与壳多糖珠子混合并在室温下旋转1小时。壳多糖珠子用水洗涤，通过煮沸将结合蛋白质直洗脱到SDS-PAGE加样缓冲液中。蛋白质印迹表明，仅85kDa的a-CBD交叉反应蛋白质能够结合壳多糖(图1，泳道2)。对以此方式从壳多糖珠子直接纯化的蛋白质进行N-端蛋白质测序，鉴定出天然蛋白质的起始20个氨基酸(FDINAKDNVAVYWGQASAAT)(SEQ ID NO：7)。利用此氨基酸序列作为针对探针序列数据库的待询序列进行tBLASTn搜索，鉴定出部分测序的乳酸克鲁维酵母基因，所述基因的翻译精确匹配于待询序列并且与酿酒酵母细胞外壳多糖酶Cst1p(ScCts1p)具有明显的同源性。
克降KlCTS1和序列分析
[0134]在本工作开始时，乳酸克鲁维酵母基因组的序列还未被报道。因此，应用DNA印迹杂交和锚定PCR的结合来克隆通过应用tBLASTn算法的数据库搜索被初始鉴定的部分KlCTS1序列(见上文)的其余部分。KlCts1p序列与近来报道的乳酸克鲁维酵母基因组序列中的乳酸克鲁维酵母ORF KLLA0C04730g的翻译产物一致(Dujon B.，et a1.Nature 430：35-44(2004))。
[0135]KlCTS1编码分子量是85kDa的、具有551个氨基酸的蛋白质，如SDS-PAGE所确定。KlCTS1p与酿酒酵母Cts1p壳多糖酶有53％的同一性和82％的相似性，并且具有由信号肽、催化结构域、富含丝氨酸/苏氨酸的结构域和壳多糖结合结构域构成的相似的模块型结构域结构(图2A)。Signal P软件(Nielson et al.Protein Eng.10：1-6(1997))预测出存在在A19后切割的信号肽(图2A)。这与从纯化的分泌KlCts1p测定的、起始于F20的氨基端蛋白质序列一致。预测的KlCts1p催化结构域和其它壳多糖酶的催化结构域之间的氨基酸同源性表明，KlCts1p属于壳多糖酶家族18(图2B)。此外，SMART结构域预测软件(Letunic，I.，et al.Nucl.AcidsRes.30：242-244(2002)和Schultz，J.，et al.PNAS 95：5857-5864(1998))表明存在含有6个保守半胱氨酸残基的C端2型壳多糖结合结构域(图2C)。
[0136]比较KlCts1p和酿酒酵母壳多糖酶(ScCts1p)的催化性质。因为酿酒酵母Cts1p的最适pH为酸性(Kuranda，M.，et al.J.Biol.Chem.266：19758-19767(1991))，首先选择pH 4.5来定义KlCts1p的底物偏好。如图3B所示，来自两种酵母的壳多糖酶既水解4MU-GlcNAc3又水解4MU-GlcNAc4底物。然而，乳酸克鲁维酵母壳多糖酶不同于ScCts1p，不同之处在于其相对于4MU-GlcNAc3优选4MU-GlcNAc4的程度。对于从菌株CBS2359和CBS683分泌的壳多糖酶，观察到与乳酸克鲁维酵母菌株GG799所示相似的结果。此外，KCts1p在pH 4.5时显示出最大活性，这比ScCts1p显示最大活性的pH值的碱性高约0.5pH单位(图3C)。
KlCts1p CBD-壳多糖亲和试验
[0137]在一系列条件下检测KlCts1p和壳多糖珠的缔合。图4A示出了KlCts1p与壳多糖的缔合在5M NaCl和pH 3、pH 5以及pH 10的缓冲液中是稳定的。在8M尿素中——该条件通常使蛋白质变性，仅仅约60％的壳多糖结合KlCts1p从壳多糖珠解离。然而，在20mM NaOH中，pH 12.3时，观察到完全解离。壳多糖结合KlCts1p的洗脱曲线显示，在起初两个级分(包含空体积)中洗脱出等量蛋白质，这表明KlCts1p-壳多糖缔合的去稳定在20mM NaOH中立即发生(图4B)。令人惊讶地，以此方式洗脱的KlCts1p保持壳多糖分解活性(图4C)。事实上，壳多糖结合前和用20mM NaOH洗脱后对壳多糖酶活性的测定表明，接近100％的壳多糖酶活性被恢复。
[0138]为了测定KlCts1p CBD是否可以起如下作用：i)独立于KlCts1p催化结构域；和ii)作为异源表达蛋白质上的亲和标签，含有与来自KlCts1p(KlCBD)的氨基酸470-551的CBD融合的C端的人血清白蛋白(HSA)从乳酸克鲁维酵母分泌。为了对照，HAS也被融合到环状芽孢杆菌壳多糖酶A1 3型CBD(BcCBD)并以相同方式从乳酸克鲁维酵母分泌。如实施例1所述将CBD融合蛋白结合到壳多糖珠子，测定在20mM NaOH存在时它们的壳多糖亲和力。图4D显示，在20mM NaOH中，HSA-KlCBD融合蛋白从壳多糖珠子完全解离，而甚至在用20mM NaOH大量洗涤之后，HSA-BcCBD融合蛋白仍与壳多糖结合。这些结果表明，KlCBD独立于KlCts1p催化结构域起作用，其在20mM NaOH中从壳多糖解离是固有的性质。而且，这些数据表明了这样的可能性，即KlCBD能够被用作可洗脱亲和标签，以便纯化或可逆性地壳多糖固定嗜碱性或耐碱性蛋白质。
KlCTS1的断裂
[0139]为了测定乳酸克鲁维酵母中的KlCts1p的体内功能，在单倍体细胞中断裂KlCTS1等位基因。应用基于PCR的方法装配含有卡那霉素选择性标记序列盒的DNA断裂片段，如材料和方法和所述。应用此片段将乳酸克鲁维酵母细胞转化为G418抗性。通过全细胞PCR筛选已在KlCts1基因座处整合了断裂DNA片段的转化子。在所测定的20个菌落中，2个菌落正确地整合了断裂DNA片段(数据未显示)，表明KlCTS1对于乳酸克鲁维酵母的生存不是必需的。此外，乳酸克鲁维酵母Dcts1不能分泌壳多糖酶，如由耗尽培养基中缺乏KlCts1p(图5A)和壳多糖分解活性(图3A)所证明。
[0140]测定乳酸克鲁维酵母野生型(GG799)和Δcts1细胞的生长和细胞形态学。在YPD培养基中，Δcts1菌株生长为小簇的松散块状细胞，其在短暂超声波处理后容易地分散成单个细胞。对用壳多糖结合染料荧光增白剂(Calcofluor white)染色的细胞的荧光显微镜分析表明，Δcts1细胞通过膜连接(图5B，右图)，表明这些细胞在胞质分裂期间不能降解膜壳多糖。对酿酒酵母Δcts1细胞观察到相似的表型(Kuranda，M.，et al.J.Biol.Chem.266：19758-19767(1991))。因此，KlCTS1恢复酿酒酵母Δcts1细胞正常细胞分离的能力被检测。将KlCTS1置于酿酒酵母表达载体中GAL10半乳糖诱导型启动子的控制下。表达KlCTS1的酿酒酵母Δcts1细胞在含半乳糖培养基中分泌KlCTS1(图6A)，并且不形成细胞聚集物(图6B)。总体考虑，这些数据表明，KlCTS1和ScCTS1编码参与细胞分离的功能上等价的蛋白质，推测细胞分离是通过促进膜壳多糖降解实现。
乳酸克鲁维酵母壳多糖酶缺失突变体的特性
[0141]测定Δcts1细胞生长至高培养密度的能力。有关乳酸克鲁维酵母Δcts1细胞的聚集表型使通过600nm处吸光度(OD600)测定的细胞密度偏差至野生型细胞的65％以下。然而，生长48小时的野生型和Acts1细胞的培养物产生几乎相同的细胞干重。此外，两个菌株间的细胞总壳多糖没有显著差异。在KOH提取细胞壳多糖和壳多糖酶水解后，菌株GG799产生每毫克干细胞21.8±1.9纳摩尔(nmoles)GlcNAc，Δcts1菌株产生每毫克干细胞20.8±1.0纳摩尔(nmoles)GlcNAc。因此，虽然它们具有温和的生长表型，但Δcts1细胞保持能够在培养中获得与野生型细胞相同的细胞密度，这表明此菌株背景将适于商业生产CBD-标记蛋白质。
实施例3：pGBN2-HSA-KlCBD的制备
[0142]为了产生KlCts1p的CBD和人血清白蛋白(HSA)的融合，应用DeepVentTM DNA聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)，用引物5′-GGA AGATCTGACTCCTGGGCTGTTACAAGA-3′(Bgl II位点以下划线示出)(SEQID NO：8)和5′-ATAAGAAT GCGGCCGCbCTAGAAGACGACGTCGGGTTTCAAATA-3’(Not I位点以下划线示出)(SEQ ID NO：9)，扩增编码KlCts1p的C端81个氨基酸的DNA片段。将KlCts1p-CBD片段克隆入乳酸克鲁维酵母整合型表达质粒pGBN2(NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的Bgl II-Not I位点，产生pGBN2-KlCBD。用引物5′-CCG CTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3′(Xho I位点以下划线示出)(SEQ ID NO：10)和5′-CGC GGAICCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3′(BamH I位点以下划线示出)(SEQ ID NO：11)扩增HAS，并克隆入pGBN2-KlCBD的Xho I-Bgl II位点。当整合到乳酸克鲁维酵母基因组中时，得到的表达构建体产生由酿酒酵母a-交配因子前原分泌前导序列(存在于pGBN2中)、HAS、和KlCBD组成的单个多肽。
[0143]以相似方式装配产生HAS的对照构建体，所述HAS含有来自环状芽孢杆菌壳多糖酶A1的羧基端3型CBD(BcCBD)。应用引物5′-GGA AGATCTACGACAAATCCTGGTGTATCCGCT-3′(Bgl II位点以下划线示出)(SEQ ID NO：12)和5′ATAAGAAT GCGGCCGCTTATTGAAGCTGCCACAAGGCAGGAAC-S′(Not I位点以下划线示出)(SEQ ID NO：13)PCR扩增来自pTYB1(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的BcCBD。将扩增产物克隆入pGBN2的Bgl II-Not I位点，产生pGBN2-BcCBD。扩增HAS并克隆入pGBN2-BcCBD的Xho I-Bgl II位点，如上述。
实施例4：在乳酸克鲁维酵母Δcts1细胞中产生和分泌HSA-CBD
[0144]载体pGBN2-HSA-KlCBD(5μg)应用SacII线性化并通过电穿孔转化乳酸克鲁维酵母Δcts1细胞。在含有5mM乙酰胺的酵母碳基琼脂培养基(DifcoTM，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上，于30℃生长4天，选择转化子。应用单独的转化子起始2ml YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)培养，于30℃生长过夜。应用过夜培养物的1∶100稀释液接种2ml YPGal(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％半乳糖)培养物。振荡下于30℃接种培养物48小时。以15,800×g离心1ml培养物2分钟以去除细胞，制备耗尽培养基。将20ml澄清的耗尽培养基的等分试样转移到新试管中，混合以10ml的3×蛋白质加样缓冲液并于95℃加热10分钟。在10-20％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上分辨20ml等分试样，通过考马斯染色检测分泌的HSA-KlCBD融合蛋白。
实施例5：用壳多糖珠纯化HSA-KlCBD
[0145]为了通过将融合蛋白固定于壳多糖而分离分泌的HSA-KlCBD，使含有整合HSA-KlCBD表达片段的乳酸克鲁维酵母Dcts1细胞(见上文)在20ml YPD培养基中生长96小时。通过离心将细胞从培养基中去除，耗尽培养基转移到含有1ml水洗壳多糖珠(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的新鲜试管中并在室温下温育1小时，同时轻轻旋转。离心收获壳多糖珠，用10ml水洗涤并重悬浮于1ml水中。通过在SDS加样缓冲液中煮沸约50ml体积的蛋白质结合壳多糖珠2分钟，随后微量离心2分钟以去除壳多糖珠，洗脱固定的HSA-KlCBD。上清液中洗脱的HSA-KlCBD通过SDS-PAGE和考马斯染色或应用a-CBD或a-HAS抗体的蛋白质印迹进行观察。此外，通过使5ml的20mM NaOH穿过柱子，HSA-KlCBD可以从壳多糖珠洗脱。以此方式产生的HAS不含有偶然结合于壳多糖或降解壳多糖的内源性乳酸克鲁维酵母蛋白质。
实施例6：应用磁化壳多糖珠浓缩HSA-KlCBD
[0146]在培养物生长各个阶段，应用CBD-标记人血清白蛋白(CBD-taggedhuman serum albumin(HSA-CBD))证明CBD-标记蛋白与磁性壳多糖珠的缔合情况(参见图8)。用已在30℃生长24小时的2ml起始培养物的100ml接种乳酸克鲁维酵母菌株GG799Δcts1 PCKl3的4个25ml YPGal(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％半乳糖)培养物。
[0147]培养物1：在接种之前，将已经通过高压灭菌灭菌20分钟的1ml沉淀的壳多糖磁珠加入培养基中。于30℃温育培养物72小时，同时以～300r.p.m.振荡。
[0148]培养物2：在生长24小时时，将1ml无菌磁性壳多糖珠子加入培养基。使培养基于30℃温育另外48小时(总共72小时)，同时以～300r.p.m.振荡。
[0149]培养物3：75小时后，将1ml壳多糖磁珠加入第三培养物，随后室温下轻轻振荡1小时。
[0150]培养物4：通过以5000r.p.m.离心5分钟使第四培养物清除细胞，随后将1ml磁性壳多糖珠子加入澄清的耗尽培养基，随后室温下轻轻振荡1小时。
[0151]将每一培养物倒入标准的50ml加盖实验室试管中。通过将试管插入50ml的磁力设备30秒(图9)随后倒出上清液而收获磁珠。随后从磁场移去试管，磁性壳多糖颗粒沉淀应用40ml水洗涤并在磁场中重新分离。此洗涤步骤总共重复3次，随后将珠子转移到四个加螺帽的微量离心管中。为了洗脱结合的HSA-CBD，将每一试管中的珠子重悬浮于含有二硫苏糖醇的250ml的3×蛋白质加样缓冲液中(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)，并于98℃加热5分钟。5ml每一样品中的洗脱蛋白质在10-20％SDS-PAGE凝胶中分离，通过考马斯染色观察(图8)。观察每一样品中的洗脱HSA-CBD，表明磁性壳多糖珠子在培养物生长期间或之后成功地捕获CBD-标记蛋白质。在每一培养物中的捕获HSA-CBD的产量估计为4mg/L。
实施例7：应用磁化壳多糖珠子浓缩分泌的GluC-CBD蛋白
[0152]为了检测磁珠浓缩培养基中CBD融合蛋白的能力，使用编码融合蛋白(GluC-CBD，其中GluC是来自金黄色葡萄球菌的内源性蛋白)的DNA转化的环状芽孢杆菌的20ml过夜培养物，在125ml瓶中生长。将编码GluC的DNA插入含有环状芽孢杆菌CBD的质粒pGNB5。应用标准技术实现感受态细胞的转化(Harwood and Cutting， Molecular Biological Methods，ed.John Wiley & Sons Ltd.，New York，NY，pp.33-35，67，1990)。为了比较目的，培养4个培养物：一个含有表达GluC内切蛋白酶的质粒，三个含有针对融合蛋白(GluC-CBD)的质粒。对于所有试验，向培养物中加入5％珠体积。作为对照，使含有GluC构建体的培养物在磁珠存在的情况下生长过夜，以检测非特异性结合(图12，泳道2)。在不同时间将磁珠加入三个GluC-CBD培养物，观察温育时间是否影响结合能力。培养物1于整个生长周期存在珠子的情况下37℃振荡下培养过夜(图12，泳道3)。对于培养物2，磁珠在37℃生长16小时后加入并37℃振荡下温育1小时(图12，泳道4)。培养物3于37℃振荡下培养过夜，通过离心去除细胞(10,000rpm，10分钟)。将磁珠加入上清液并于振荡下室温温育1小时(图12，泳道5)。在所有情况下，应用磁分离架(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)收获珠子，用10ml LB肉汤洗涤三次，随后用10ml的1MNaCl洗涤两次。将珠子悬浮于1mI的1MNaCl中，转移到1.5ml eppendorf管，并以10,000rpm离心1分钟以便去除液体。将珠子悬浮于带有DTT的100ml 3×SDS样品缓冲液中，煮沸5分钟去除蛋白质。通过在10,000rpm离心2分钟，从缓冲液中分离珠子。在10-20％Tricine凝胶上分析样品，通过蛋白质印迹转移到PVDF膜上，并用考马斯兰染色。洗脱蛋白质的鉴定通过N端测序证实。结果表明，分泌的GluC-CBD融合蛋白是磁性壳多糖珠子结合的主要蛋白，并且可以通过在SDS加样缓冲液中煮沸被有效地洗脱。结果也显示，珠子可以在试验期间的任何时间点加入而不改变它们的效力。
实施例8：荧光素酶的生产和从壳多糖珠的洗脱
[0153]将编码野生型乳酸克鲁维酵母CBD的基因克隆入载体pKLAC1的NotI/StuI限制性位点，产生载体pKLAC1-KlCBD。随后将编码Gaussia荧光素酶(GLuc)的基因克隆入载体pKLAC1-KlCBD的XhoI/NotI限制性位点，产生与载体来源的分泌信号的N端融合和与KlCBD基因的C端融合。将此构建体线性化并转化入乳酸克鲁维酵母感受态细胞。得自分泌GLuc-KlCDB的乳酸克鲁维酵母细胞的1升耗尽培养基与20ml床体积的壳多糖室温下混合1小时。将壳多糖珠倒入柱子，随后用10柱体积(200ml)的水洗涤。用20mM NaOH洗脱结合的蛋白质。在含有1ml 1M Tris-Cl pH 7.5的试管中收集4ml洗脱级分，以便在洗出液从柱子中出来时中和该洗出液。分析25微升每一洗脱级分的1∶40稀释液中的荧光素酶活性，表示为RLU(相对光单位)。图13示出，活性GLuc在级分2至10中被洗脱，最高活性可见于级分3、4和5中。
                               序列表
<110>新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Inc.)
     C.H.塔龙
     P.A.科卢西
<120>浓缩分泌的重组蛋白的方法和组合物
<130>NEB-247-PCN
<150>+60/690,470
<151>2005-06-14
<150>60/690,470
<151>2005-06-14
<150>PCT/US2005/035697
<151>2005-10-03
<150>60/616,420
<151>2004-10-06
<160>20
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>98
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>1
ccagtaatgc aactatcaat cattgtgtta aactggtcac cagaaataca agatatcaaa    60
aattactaat actaccataa gccatcatca tatcgaag                            98
<210>2
<211>104
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>2
ccaaactagc gtatccggtt ggattattgt tttcgatatc gaaatcgaaa ccatcgacga    60
cagcagtgtc gaatggtctt tccccggggt gggcgaagaa ctcc                     104
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>3
gggcacaaca atggcagg                                                  18
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>4
gcctctccac ccaagcggc                                                 19
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>5
ggcggatccg ccaccatgtt tcaccctcgt ttactt                              36
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>6
acatgcatgc ctagaagacg acgtcgggtt tcaa                                34
<210>7
<211>20
<212>PRT
<213>乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)
<400>7
Phe Asp Ile Asn Ala Lys Asp Asn Val Ala Val Tyr Trp Gly Gln Ala
1               5                   10                  15
Ser Ala Ala Thr
            20
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>8
ggaagatctg actcctgggc tgttacaaga                                     30
<210>9
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>9
ataagaatgc ggccgcctag aagacgacgt cgggtttcaa ata                      43
<210>10
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>10
ccgctcgaga aaagagatgc acacaagagt gaggttgct                           39
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>11
cgcggatcct aagcctaagg cagcttgact tgc                                 33
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>12
ggaagatcta cgacaaatcc tggtgtatcc gct                                  33
<210>13
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>13
ataagaatgc ggccgcttat tgaagctgcc acaaggcagg aac                      43
<210>14
<211>57
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>2类壳多糖结合结构域共有序列
<400>14
Gln Asp Cys Thr Asn Ala Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Gly Glu Cys
1               5                   10                  15
Glu Pro Gln Phe Leu Thr Cys Ser Gly Gly Ile Ala Arg Ile Met Asp
            20                  25                  30
Cys Pro Ala Asp Leu Ile Tyr Asn Glu Pro Leu Leu Ile Cys Asp Trp
        35                  40                  45
Arg His Asn Val Ile Gly Cys Glu Gly
    50                  55
<210>15
<211>48
<212>PRT
<213>乳酸克鲁维酵母
<400>15
Cys Ser Asp Gly Glu Ile Ser Cys Thr Ala Asp Gly Lys Ile Ala Ile
1               5                   10                  15
Cys Asn Tyr Gly Ala Trp Val Tyr Thr Glu Cys Ala Ala Gly Thr Thr
            20                  25                  30
Cys Phe Ala Tyr Asp Ser Gly Asp Ser Val Tyr Thr Ser Cys Asn Phe
        35                  40                  45
<210>16
<211>64
<212>PRT
<213>番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)
<400>16
Thr Lys Cys Met Gly Pro Lys Asp Cys Leu Tyr Pro Asn Pro Asp Ser
1               5                   10                  15
Cys Thr Thr Tyr Ile Gln Cys Val Pro Leu Asp Glu Val Gly Asn Ala
            20                  25                  30
Lys Pro Val Val Lys Pro Cys Pro Lys Gly Leu Gln Trp Asn Asp Asn
        35                  40                  45
Val Gly Lys Lys Trp Cys Asp Tyr Pro Asn Leu Ser Thr Cys Pro Val
    50                  55                  60
<210>17
<211>68
<212>PRT
<213>Ralstonia solanacearum
<400>17
Phe Lys Cys Pro Ala Pro Ser Gly Arg Tyr Leu Val Asp Asp Gly Thr
1               5                   10                  15
Asn Asn Arg Gly Pro Asn Gln Val Pro Arg Thr Asn Cys Thr Arg Ala
            20                  25                  30
Tyr Ala Val Cys Asp Ala Gln Ser His Ala Thr Leu Asp His Cys Pro
        35                  40                  45
Ser Gly Gln Val Phe Asp Lys Arg Phe Ser Thr Cys Val Val Lys Asp
    50                  55                  60
Ala Cys Asp Glu
65
<210>18
<211>54
<212>PRT
<213>秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)
<400>18
Phe Lys Cys Thr Lys Asp Gly Phe Phe Gly Val Pro Ser Asp Cys Leu
1               5                   10                  15
Lys Phe Ile Arg Cys Val Asn Gly Ile Ser Tyr Asn Phe Glu Cys Pro
            20                  25                  30
Asn Gly Leu Ser Phe His Ala Asp Thr Met Met Cys Asp Arg Pro Asp
        35                  40                  45
Pro Ser Lys Cys Ala Lys
    50
<210>19
<211>48
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>19
Cys Ala Gly Arg Ala Asn Gly Leu Tyr Pro Val Ala Asn Asn Arg Asn
1               5                   10                  15
Ala Phe Trp His His Cys Val Asn Gly Val Thr Tyr Gln Gln Ash Cys
            20                  25                  30
Gln Ala Gly Leu Val Phe Asp Thr Ser Cys Asp Cys Cys Asn Trp Ala
        35                  40                  45
<210>20
<211>52
<212>PRT
<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
<400>20
Leu Glu Cys Thr Glu Gly Asp Tyr Tyr Pro His Arg Asn Cys Arg Lys
1               5                   10                  15
Tyr Tyr Ile Cys Asn Lys Ala Leu Val Pro Ser Glu Cys Gly Gly Asp
            20                  25                  30
Leu His Trp Asp Gly Ile Lys Lys Leu Cys Asp Trp Pro Glu Asn Val
        35                  40                  45
Gln Cys Val Thr
    50

Claims (28)

1.得到分泌的重组蛋白质的浓缩制备物的方法，包括：
(a)用含有DNA的载体转化宿主表达细胞，所述DNA编码包括壳多糖结合结构域(CBD)和目标蛋白的融合蛋白；
(b)在所述宿主表达细胞中表达所述融合蛋白，并从所述宿主表达细胞分泌所述融合蛋白；和
(c)通过CBD将所述的分泌的融合蛋白结合到壳多糖制备物，所述融合蛋白能够在非变性条件下洗脱入所需的缓冲液体积，以便得到所述分泌的重组蛋白的浓缩制备物。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中的所述载体是穿梭载体。
3.根据权利要求2的方法，其中在所述载体中编码所述目标蛋白的所述DNA在大肠杆菌(E.coli)中转录是沉默的，在所述宿主表达细胞中转录是活化的。
4.根据权利要求2的方法，其中所述穿梭载体具有修饰的LAC4启动子。
5.根据权利要求4的方法，其中所述穿梭载体是PKIAC1。
6.根据权利要求1的方法，其中所述宿主表达细胞是壳多糖酶-缺陷型细胞。
7.根据权利要求3的方法，其中所述宿主表达细胞是酵母细胞。
8.根据权利要求5的方法，其中所述酵母细胞是选自克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)和酵母(Saccharomyces)的单个种。
9.根据权利要求7的方法，其中所述酵母细胞是克鲁维酵母。
10.根据权利要求9的方法，其中所述克鲁维酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)变种脆壁克鲁维酵母(fragilis)或乳酸克鲁维酵母(lactis)。
11.根据权利要求1的方法，其中所述宿主表达细胞处于培养中，因而所述融合蛋白被分泌到所述培养基中。
12.根据权利要求11的方法，还包括：在培养期间将壳多糖加入所述培养基。
13.根据权利要求12的方法，其中所述壳多糖是无菌的。
14.根据权利要求1或11的方法，其中，在培养之后，所述壳多糖被加入所述混合物。
15.根据权利要求1或13的方法，其中所述壳多糖是选自涂层、胶体、珠、柱、基质、片层或膜的形式。
16.根据权利要求1或13的方法，其中所述壳多糖是壳多糖珠，所述珠或是有孔的或是无孔的。
17.根据权利要求16的方法，其中所述壳多糖珠被磁化。
18.根据权利要求17的方法，其中在步骤(d)中，回收与所述壳多糖结合的结合的融合蛋白还包括施加磁力。
19.根据权利要求1的方法，其中所述融合蛋白和壳多糖的所述结合是可逆的，因而在不同于结合条件的非变性条件下，所述融合蛋白可以从所述壳多糖释放。
20.得到分泌的重组蛋白质的浓缩制备物的方法，包括：
(a)提供穿梭载体，其中所述穿梭载体(i)能够整合到酵母宿主细胞的基因组中，和(ii)含有DNA，所述DNA编码含有壳多糖结合结构域和目标蛋白的融合蛋白；
(b)用所述穿梭载体转化壳多糖酶缺陷型宿主表达细胞，用于在所述酵母宿主表达细胞中表达所述融合蛋白，并从所述酵母宿主表达细胞分泌所述融合蛋白；和
(c)通过CBD将所述分泌的融合蛋白结合到壳多糖制备物，以获得所述分泌的重组蛋白的浓缩制备物。
21.克鲁维酵母细胞制备物，特征在于壳多糖酶阴性表型，其中所述表型是编码分泌的壳多糖酶的壳多糖酶基因中的突变的结果，所述制备物能够生长至与野生型克鲁维酵母细胞相似的细胞密度。
22.根据权利要求21的克鲁维酵母细胞制备物，还能够表达和分泌重组蛋白。
23.根据权利要求22的克鲁维酵母细胞制备物，其中所述表达由LAC4启动子或其修饰物调节。
24.根据权利要求21的克鲁维酵母细胞制备物，包括穿梭载体，所述穿梭载体具有修饰的Lac4启动子，用于在克鲁维酵母中表达蛋白质而在大肠杆菌中基本上不表达蛋白质。
25.根据权利要求22的克鲁维酵母细胞制备物，其中所述穿梭载体是pKLACI。
26.根据权利要求21的克鲁维酵母细胞制备物，还包括培养基，在所述培养基中，所述克鲁维酵母至少能够生长或维持，所述培养基还包括无菌壳多糖。
27.根据权利要求26的克鲁维酵母细胞制备物，其中所述无菌壳多糖是磁珠形式。
28.根据权利要求21的克鲁维酵母细胞制备物，其中所述制备物包含在容器中，所述容器任选地含有磁体或与磁体接触，用于可逆地结合所述壳多糖珠。
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