JP4339901B2 - 突然変異体を単離する方法、およびその相補的遺伝子をクローン化する新しい方法 - Google Patents
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Description
−相補性によるもの。しかしながら、これは利用可能な突然変異体を要する;
−調節蛋白質の精製によるもの。該蛋白質はDNA結合特性によって特徴付けするしかないので、これは非常に面倒である。これらの精製のいくつかはマトリックスとして結合DNA断片を用いるアフィニティークロマトグラフィーを含む。このタイプの精製における欠点の一つは、しばしば断片に対して1を越えるタンパク質が特異的ならびに非特異的に結合するということである。
+++−各々アラビノフラノシダーゼA、アラビノフラノシダーゼBおよびエンドアラビナーゼをコードするabfA、abfBおよびabnA遺伝子のプロモーターに由来する断片、
−グルコアミラーゼをコードするglaA遺伝子に由来する断片、
−alcRおよびalcAプロモーター上のごときalcR結合部位を有する断片、
−CUPI遺伝子に由来する断片、
−PHO5遺伝子に由来する断片、
−GAL1、GAL7またはGAL10遺伝子に由来する断片、
−xlnA遺伝子に由来する断片、
−pgaII遺伝子に由来する断片。
−各々アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のアラビノフラノシダーゼA、アラビノフラノシダーゼBおよびエンドアラビナーゼをコードするabfA、abfBおよびabnA遺伝子のプロモーターに由来する断片(Flipphi M.J.A.ら1994)、
−アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のグルコアミラーゼをコードするglaA遺伝子に由来する断片(Fowler T.ら1990)、
−アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)のalcRプロモーター上のalcR結合部位を含有する断片(Felenbok B.ら1994),
−サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のCUP1遺伝子に由来する断片(Hinnen A.ら1995)、
−サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のPHO5遺伝子に由来する断片(Hinnen A.ら1995)、
−サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のGAL1、GAL7またはGAL10遺伝子に由来する断片(Hinnen A.ら1995)、
−アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)のxlnA、xlnB、xlnCまたはxlnD遺伝子に由来する断片、
−アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のxlnB、xlnCまたはxlnD遺伝子に由来する断片(本明細書の他所参照)、
−アスペルギルス・トゥービゲンシス(Aspergillus tubigensis)のxlnAまたはxlnD遺伝子に由来する断片(de Graaffら1994)、
−アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のpgaII遺伝子に由来する断片(本明細書の他所参照)。
アスパルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ペニシリウム属(Penicillum)、フサリウム属(Fusarium)、サッカロミセス属(Saccharomyces)およびクリベロシセス属(Kluyveromyces)の種々の生物について見出されてきた。pyrA突然変異体、すなわち、陰性表現型を用いる選択はまた、pyrGまたはura3としても記載され、フルオロオロチニ酸耐性に基いて起こり得る。PYR A+およびその相同体、すなわち、陽性表現型についての選択は、ウリジンまたはウラシルの原栄養性に基いて成し得る。実施例において、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)からのpryA(Wilsonら1988)が本発明の実施可能な態様で示されている。他の例も当業者に知られ、容易に文献中で見い出すことができる。用いられる選択マーカーは、突然変異させるホスト生物、および選択性、信頼性ならびになかでも使用される基質のコストのごとき他の二次的な考慮に依存する。
−前記請求項のいずれか1項による核酸カセットをホストに導入し、
該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連する表現型を呈さず、
−得られた微生物を、該核酸カセットに含まれたエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動する条件下であって、二方向性マーカーが発現され、好ましくは該二方向マーカーの発現が増殖に連結された、および非発現が非増殖に連結された条件下で培養し、
−前記培養条件下で二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体を選択し、
−選択された形質転換体に自体公知の方法で突然変異に付しし、
−得られた株を二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーの非発現の結果となる、該核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、および代謝の所定の部分についての代謝可能な基質の存在下で培養し、
−突然変異誘発に続く培養工程から得られた、二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株を、本発明の範囲内にある二方向性マーカーの非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親のための選択条件下で選択する
ことを含む。
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は、遺伝子xlnAに由来する上流活性化配列(UAS)であり、
−代謝の所定の部分が、炭素代謝のキシラン分解部分であり、
−得られた微生物をエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現する条件下で培養する培養工程が、UASのインデューサーの存在下であってUASのリプレッサーおよび代謝可能な炭素源の不在下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が前記した培養条件下で生じる
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、すなわち、UASのリプレッサーの存在下であって代謝可能な炭素源の存在下かつ所望によりUASのインデューサーの存在下でも起こり、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株の突然変異誘発に続く培養工程かリプレッサーから得られた株の選択が、二方向性マーカーの非発現の結果を導く核酸カセットを含む非突然変異親のための選択条件下で起こる。
−該核酸カセットは、二方向マーカーpyrAをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは、該核酸カセットの導入に先立って、二方向性マーカーの発現に関連するpyrA+表現型を呈さず、
−得られた微生物をエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現される条件下で培養する培養工程が、エンハンサーまたはアクチベーターが正常に作動する条件下、すなわち、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの存在下であってエンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの不存在下、かつ二方向性マーカーが発現される条件下で培養することを含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、すなわち、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの不在下、またはエンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの存在下、かつ代謝の所定の部分についての代謝可能な基質の存在下で起こり、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株の突然変異誘発に続く培養工程から得られた株の選択が、二方向性マーカーの非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親につての選択条件下、すなわち、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの不在下、またはエンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの存在下で起こる。
−核酸カセットが二方向性マーカーpyrAをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連するpyrA+表現型を呈さず、
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列が遺伝子xlnAに由来するUASであり、
−得られた微生物がエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現される条件下で培養される培養工程が、UASが正常に作動する条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときUASのインデューサーの存在下であって、UASのリプレッサーの不存在下、すなわち、グルコースの不在下、および二方向性マーカーが発現される条件下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときUASのインデューサーの不在下、またはUASのリプレッサーの存在下、すなわち、グルコースの存在下、および代謝可能な炭素源の存在下で起こり、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株の突然変異誘発に続く培養工程から得られた株の選択が、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親についての選択条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときUASのインデューサーの不存在下、またはUASのリプレッサーの存在下、すなわち、グルコースの存在下で起こる
によって特徴付けられる。
−前記したごとく本発明の核酸カセットをホストに導入し、
該ホストは、核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連する表現型を呈さず、該ホストは代謝の所定の部分を特徴付けるタイプの低下したまたは阻害された活性を呈し、
−得られた微生物を、核酸カセットのエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、核酸カセットの二方向性マーカーの非発現が、得られた微生物の増殖および検出の結果となり、該二方向性マーカーの発現が好ましくは致死的であるかるいは強力に増殖を阻害する条件下で培養し、
−前記培養条件の下で、二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体を選択し、
−選択された形質転換体に自体公知の方法で突然変異誘発に付し、
−突然変異誘発から得られた株を二方向性マーカーの非発現に対応する表現型を持つ株の増殖に許容される条件下であって、代謝可能な基質の存在下、かつ核酸カセットを含むまたは含まないいずれかの非突然変異ホストと比較して、代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す条件下で培養し、
−代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性に対応する表現型を示す、突然変異誘発に続く培養工程から得られた株を、それに対する活性が低下または阻害されるべき、代謝の部分についての基質として働く基質上での増殖に基づく清澄ゾーンの減少のごとき、核酸カセットを含むまたは含まない非突然変異ホストと比較して、代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す選択条件下で選択すること
からなる。
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は、遺伝子xlnAに由来する上流活性化配列(UAS)であり、
−代謝の所定の部分は、炭素代謝のキシラン分解部分であり、
−得られた微生物が、エンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現される条件下で培養される培養工程が、核酸カセットのUASのリプレッサーの不在下、代謝可能な炭素源の存在下、およびまた好ましくはUASのインデューサーの存在下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの非発現に対応する表現型を持つ株の増殖および検出に許容される条件下、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株の増殖および検出に許容されない条件下、すなわち、ウリジンおよびフルオロオロチン酸の存在下であって、炭素代謝の所定の部分の活性の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親についての条件下、すなわち、UASのインデューサーおよび代謝可能な炭素源の存在下、およびUASのリプレッサーの不在下、例えばソルビトール、またはインデューサー様キシランもしくはD−キシロースと組み合わせた別の非抑制炭素源の存在下で起こり、
−突然変異誘発に続く培養から得られた、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性に対応する表現型を呈する株の選択が、キシラン上での増殖に際しての清澄ゾーンの減少のごとき、核酸カセットを含むまたは含まないいずれかの非突然変異体ホストに比較して、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す選択条件下で起こる。
−該核酸カセットは二方向性マーカーpyrAをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現と関連するPYRA+を表現型を呈さず、
−得られた微生物が、エンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーpyrAが発現される条件下で、培養される培養工程は、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの存在下であって、エンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの不在下、および二方向性マーカーpyrAが発現される条件下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子pyrAの発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択は、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程は、二方向性マーカーの非発現に対応する表現型、すなわちPYRA−表現型を持つ株の増殖および検出に許容される条件下、PYRA+表現型を持つ株の増殖および検出に許容されない条件下、かかる表現型は、二方向性マーカーの発現、すなわちウリジンおよびフルオロオロチン酸の存在を含むかかる条件に対応し、および代謝の所定の部分の活性結果となる核酸カセットを含む非突然変異親についての条件下、すなわちエンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーおよび代謝可能な基質の存在下であって、アクチベーターまたはエンハンサーのリプレッサー、またはインデューサーと組み合わせた別の非抑制基質の不在下で起こる。
−該核酸カセットが二方向性マーカーpyrAをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連したPYRA+表現型を呈さず、
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は遺伝子xlnAに由来するUASであり、
−得られた微生物が−エンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーpyrAが発現される条件下で培養される培養工程が、UASが正常に作動する条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときUASのインデューサーの存在下であって、UASのリプレッサーの不在下、すなわち、グルコースの不在下および二方向性マーカーpyrAが発現する条件下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子pyrAの発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの非発現に対応する表現型、すなわちpyrA−表現型を持つ株の増殖および検出に許容される条件下、PYRA+表現型を持つ株の増殖および検出に許容されない条件下で、かかる表現型は、二方向性マーカーの発現型、すなわちウリジンおよびフルオロオロチン酸の存在を含むかかる条件に対応し、および炭素代謝の所定の部分の活性となる該核酸カセットを含む非突然変異親についての条件下、すなわち、UASのインデューサーおよび代謝可能な炭素源の存在下、およびUASのリプレッサーの不存在下、例えばソルビトールまたは、インデューサー様キシランもしくはD−キシロースと組み合わせた別の非抑制炭素源の存在下で起こり、
−突然変異誘発に続く培養工程から得られた、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性に対応する表現型を呈する株の選択は、キシラン上での増殖に際しての清澄ゾーン減少のごとき、核酸カセットを含むまたは含まないいずれかの非突然変異誘発ホストと比較して、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す選択条件下で起こる
方法である。
実施例1.1:選択プラスミドpIM130の構築
選択プラスミドpIMI30は図1に示したごとくに構築した。PCR1にて、オリゴヌクレオチド1(配列番号:1)
5’CACAATGCATCCCCTTTATCCGCCTGCCGT−3’(式1)
およびオリゴヌクレオチドA(配列番号:2)
5’−CAATTGCGACTTGGAGGACATGATGGGCAGATGAGGG−3’(式2)
を用いて、プラスミドpIM120(de Graaffら、1994)から断片を生じさせた。オリゴヌクレオチド1はAspergillus tubigensis xlnAプロモーター(de Graaffら、1994)から誘導し、600−619位(配列番号:5)にNsiI部位を含む10個のヌクレオチドを付加した。オリゴヌクレオチドAの3’末端は、転写開始部位(708−723位)(配列番号:6)の直前で終わる、Aspergillus niger goxC転写ユニット(Whittingtonら、1990)から誘導し、一方5’末端は、転写開始部位で始まる(341ないし359、配列番号:7)A.niger pyrA遺伝子の暗号領域から誘導した(Wilsonら、1988)。
5’−AGAGAGGATATCGATGTGGG−3’(式3)
およびオリゴヌクレオチドB(配列番号:4)
5’−CCCTCATCTGCCCATCATGTCCTCCAAGTCGCAATTG−3’(式4)
を用いて、プラスミドpGW635(Goosenら、1987)から断片を生じさせた。オリゴヌクレオチドBの5’末端は、A.niger goxC基本転写ユニット(708−723位、配列番号:6)(Whittingtonら、1990)から誘導し、一方、3’末端は転写開始部位で始まるA.niger pyrA遺伝子の暗号領域から誘導した。オリゴヌクレオチド2はpyrA暗号領域(339−359位、配列番号:7)から誘導し、602位(配列番号:7)にてEcoRV制限部位をつないだ。
プラスミドpIM120から、pyrA暗号領域および末端領域に融合させたgoxC基本転写ユニットを含む二次プラスミドを構築した。PCR4にて、NsiI部位を含む10個のヌクレオチドを付加したgoxC基本転写ユニット(640−660位、配列番号:6)から誘導したオリゴヌクレオチド3、
5’−CACAATGCATCGTATAAGTAACCTCGTTCG−3’(式5)
およびオリゴヌクレオチド2(式3)を用いて、プラスミドpIM120から断片を生じさせた。生じた断片をゲルから単離し、NsiIおよびEcoRVで消化し、プラスミドpGEM−7Zf(+)にてpGW635の2.2kb EcoRV/XbaI断片とともにクローン化し、これを実施例1.1に記載したごときにXbaI/NsiIで消化して、結果としてプラスミドpIM135を得た。
Aspergillus最小培地(MM)(1リットル当たり含量:6.0g NaNO3、1.5g KH2PO4、0.5g MgSO4・7H2O、0.5g KCl、示されたごとき炭素源、pH6.0および1mlのVishniac溶液(1リットル当たり含量10g EDTA、4.4g ZnSO4・7H2O、1.0g MnCl2・4H2O、0.32gCoCl2・6H2O、0.32g CuSO4・5H2O、0.22g(NH4)6Mo7O24・4H2O、1.47g CaCl2・2H2O、1.0g FeSO4・7H2O、pH4.0)からなる培地250mlに2%グルコース、0.5%酵母抽出物、0.2%カザミノ酸(ビタミンフリー)、10mM L−アルギニン、10μMニコチンアミド、10mMウリジンを添加し、株NW205(cspA1、pyrA6、nicA1、argB13)1×106胞子/mlとともにインキュベートし、オービタルNew Brunswickシェーカーにて250rpm、30℃で16−18時間菌糸体を増殖させた。該菌糸体をブフナー漏斗および穏やかな吸引を用いてミラクロス(ナイロンガーゼ)上で収穫し、SP6(SP6:0.8%NaCl、10mM Na−リン酸緩衝液pH6.0)で数回洗浄した。150mgのノボザイム234を20ml SMC(SMC:1.33Mソルビトール、50mM CaCl2、20mM MES緩衝液、pH5.8)に溶解し、そこへ1g(湿潤重量)の菌糸体を加え注意深く懸濁させた。この懸濁液を30℃で1−2時間緩やかに振とうしながらインキュベートし、30分毎に菌糸を注意深く再懸濁させ、プロトプラストを計数するためのヘマチトメーターを用いてプロトプラスト形成をモニターするため試料を採取した。十分なプロトプラストが存在した時(1×108以上)、これらを注意深く再懸濁させ滅菌ガラスウールプラグ上での濾過により菌糸残渣を除去した。該プロトプラストをベンチ遠心機で4℃3000rpmにて10分間の遠心分離によって集め、5mlのSTC(STC:1.33Mソルビトール、50mM CaCl2、10mMトリス/HCl、pH7.5)中に注意深く再懸濁した。この洗浄工程を2回繰り返し、該プロトプラストを最終的にSTCに1×108/mlの密度で再懸濁させた。
100mM D−グルコース、100mM D−グルコース/1%オートスペルト・キシラン(Sigma #X0627)および1%オートスペルト・キシランを含有するMM上で平板培養することによって、 実施例2で得られたpIM130からの形質転換体を分析した。選択した形質転換体をこれらの培地にレプリカ平板培養し、30℃でインキュベートした。形質転換体の約75%はキシラン含有培地上で増殖しており、他方、D−グルコースを含有する培地上では増殖は見出されなかった。コロニーの残りの25%は全ての3つのテストした培地上で増殖した。
実施例4.1:抑制された突然変異体の選択
NW205::130#2の胞子を5ml ST(ST:0.8% NaCl、0.05%Tween20)中で収穫し、高周波数で振盪し、菌糸体デブリスを滅菌ガラスウールプラグ上の濾過によって除去した。ベンチ遠心機にての室温における3000rpmでの10分間の遠心によって胞子を収集し、5ml生理食塩水に再懸濁させた。この洗浄工程を2回反復し、胞子を最終的に1ml当たり1*107の密度にて生理食塩水に再懸濁させた。10mlの胞子懸濁液をガラスペトリ皿に分散させ、UVを用いて18エルグ/mm2/分の線量で2分間照射した。突然変異誘発の後、105および106胞子を、3%D−グルコースを含有するMM+10mM L−アルギニン+10μMニコチンアミド上、および3%D−グルコース/3%オートスペント・キシラン(Sigma #X0627)を含有するプレートで平板培養した(各10プレート)。
株NW205::130#2の胞子を収穫し、実施例4.1に記載したごとくに突然変異させ、引き続いて、10mMウリジン、10mML−アルギニンおよび0.8mg/mlの5−フルオロオロチン酸(Sigma #F5013)を含有するMM上で平板培養した。これらのプレートを30℃で4−7日間インキュベートした。PYR−表現型を有する64の増殖コロニーを、1%キシラン+10mMウリジン+10mML−アルギニン+10μMニコチンアミドを含有するMM上で平板培養することによってキシリナーゼ発現につき分析した。テストしたこれらの64の突然変異体のうち、10はキシラン含有プレート上で清澄ゾーンの減少を与え、潜在的キシラナーゼレベルの低下を有した。これらの突然変異体の表現型を、ウリジンの存在および不在下で、D−グルコース、D−グルコース/キシランおよびキシランを含有する培地上で確認した。全ての10の突然変異体はウリジンを含まない培地では増殖しなかった。
5.1 A.ニゲール・ゲノミックプラスミドライブラリーの構築
プラスミドライブラリーの構築のために、最終容量100μl中の3.5U Sau3A(Life-Technologies)を用い、製造業者の指示に従って、実施例3に記載したごとくに単離した、A.ニゲールNM128(cspA1、nicA1、pyrA6、goxC17)のゲノムDNA10μgを37℃で30分間部分的に消化した。アガロースゲル電気泳動による断片の分離の後、6.7kbないし9.4kbのサイズ範囲の断片を、低融点アガロースゲルから切断し、Sambrookら (1989)が記載したごとくに単離した。合計6つの消化物から4μgの断片を最終濃度100ng/μlにて単離した。得られた断片600ngを製造業者の指示に従って100ngのBamHI消化のpUC18(Pharmacia #27526201)中で連結した。連結後、4μgの得られた連結混合物を用いて、製造業者の指示に従って、100μlの大腸菌(E.Coli)DH5α混在能力の充分な(Max Efficiency)細胞(Life Technologies)を形質転換させた。6つの引き続いての形質転換実験の結果、約5*104コロニーが得られた。これらのコロニーの再懸濁および100μg/mlアンピシリンを含有するTY培地(100ml当たりの培地:16g上級ペプトン(select peptone)140(Life Technologies)、10gのNaClおよび10gの酵母エキス)中での37℃での3時間の培養の後、プラスミドDNAを単離し、CsCl遠心によって精製した。
非発現突然変異体の相補性のため、選択した3種の突然変異体、NW205::130Ac1−4、NW205::130 Ac1−15およびNW205::130Ac4−4につきこれらの株のプロトプラストを調製し、実施例2に記載したごとくに形質転換させた。これらの形質転換実験においては、108プロトプラストを用い、これを実施例5.1に記載したA.ニゲールプラスミドライブラリーの20μg DNAと組み合わせ、また自律複製プラスミドpHELP1(GemsおよびClutterbuck, 1993)の10μgDNAと合わせたプラスミドライブラリーの10μgと組み合わせ、また自律複製プラスミドpHELP1の10μgDNAと合わせたプラスミドライブラリーの20μgDNAとを組み合わせた。陽性対照として、2μgのpGW635を用いた。形質転換手法の後、10μMニコチンアミドおよび10mM L−アルギニンを補足した炭素源としての50mM D−キシロースを含有する1.33Mソルビトールで安定化させたMM上で混合物を平板培養した。約4日後、コロニーが陽性対照プレートに出現し、これを計数し、他方、6日後に相補性プレートからコロニーを拾うことができた。
実施例6.1: A.ニゲールxlnR遺伝子の単離
A.ニゲールxlnR遺伝子を得られた形質転換体から単離し、実施例5.2に記載したごとくに選択した。NW205::130 Ac1−4、NW205::130 Ac1−15およびNW205::130 Ac4−4から得られた13の形質転換体から、全DNAを、Graffら, 1988によって記載されているごとくに単離した。C源としての1.5%粗製小麦アラビノ−キシラン上でのpyrAおよびキシラン分解発現のための選択(すなわち、誘導)条件下で菌糸体を培養した後、遊離複製プラスミドをNucleobond AX100カラム(Machery & Nagel)を用いて単離した。400μlの滅菌水中に溶解させた200μgの全DNAを2mlのS1緩衝液(50μMトリス−HCl pH8.0、10mM EDTA、100μg RNaseA)、2mlのS2(200mM NaOH、1%SDS)と混合し、続いて、室温でインキュベートし、2mlのS3(2.60M KAc、pH5.2)と混合し、続いて氷上で5分間インキュベートした。15,000gにおける30分間の懸濁液の清澄化の後、全て「プラスミドおよびコスミドの精製のための実験手法」(5.3修飾アルカリ性/SDS溶解)についての製造業者の指示に従って、プラスミドの吸着、洗浄、溶出および沈殿を行った。150μlの滅菌水に溶解させた20μlの得られたプラスミドDNAを大腸菌(E.Coli)DH5α形質転換で用いた。(Sambrookら, 1989)。各プラスミド調製物から得られた12の大腸菌(E.Coli)のコロニーを、50μg/mlアンピシリンを含有する250ml LB培地中、37℃で9−12時間培養し、しかる後、Sambrooko, 1989によって沸騰溶解プロトコルにつき記載されている1.5ml培養で、ミニプレププラスミドDNA単離を行い、遠心によって細胞をペレット化し、−20℃で貯蔵した。アガロース電気泳動によるHindIII消化後におけるこれらのDNA調製物の分析により、3つのクラスのプラスミド:pHELPタイプのプラスミド、ゲノミックライブラリータイプのプラスミドおよび大きい複合体タイプのプラスミドが明らかとされた。後者のタイプのプラスミドを含有するコロニーから、修飾されたアルカリ性/SDS溶解(Macherey-Nagel)についての製造業者の指示に従ってヌクレオボンド(Nucleobond)AX100カラムを用いる大規模プラスミド単離を、250mlの培養の凍結ペレットで行った。この結果、各々、2つのプラスミドタイプAおよびB、相補体AおよびBが単離された。これらの両プラスミドをSalI、PstI、EcoRI、HindIIIを用いて消化し、アガロース電気泳動の後、変性放射性標識pHELP1、プラスミドAおよびプラスミドBを用いるサザン分析によって、断片を三連で分析した。これは、両プラスミドAおよびBは、pHELP部分以外に、同一のゲノム領域を有することを示した。ベクターおよびAMA1配列を示す、pHELPプラスミドを用いて見出されたハイダリダイゼーションシグナルおよびプラスミドAおよびBシグナルの間の差異に基づき、プラスミドAおよびB双方とハイブリダイズするが、pHELP1とハイブリダイズしない断片を同定し、サブクローンした。プラスミドBの4kb EcoRI断片および6.5kb HindIII断片、およびプラスミドAの3kb PstI断片はプラスミドAおよびB双方とハイブリダイズすることが判明し、pGEM7/EcoRI、pGEM7/HindIIIおよびpBluescript/PstIにサブクローニングし、その結果、各々、プラスミドpNP1、2および3が得られた。増殖および精製の後、これらのプラスミドを、実施例5.2に記載した突然変異体NW205::130 Ac4−4を用いる相補性実験で使用した。これらの実験において、pHELP1を用いることなく突然変異体を直接形質転換した。これらの実験において、6.5kb HindIII断片を含有するプラスミドpNP2は、突然変異の相補性を生起した。pNP2−由来のプラスミドのさらなるサブクローニングおよび形質転換により、pBluescriptにサブクローンされた5kb BamHI−XbaI断片が明らかとなり、プラスミドpNP8が得られ、株NW205::130 Ac4−4相補鎖が生起した。
A.ニゲールxlnR遺伝子のサブクローニング
xlnR遺伝子のサブクローニングのために、Harmsenら, 1990によって記載されているごとくに構築したA.ニゲールのゲノミックライブラリーを、プローブとしてpNP1の4kb EcoRI断片を用いることによって、xlnR領域を含有するファージにつきスクリーニングした。平板培養細菌として大腸菌(E.Coli)LE392を用い、記載されているごとく(Maniatisら, 1982)5つの85−mm直径NZYCM(1.5%寒天)プレート上、0.7%アガロースを含有するNZYCM頂部−アガロース中で、プレート当たり3×103pfuを平板培養した。37℃におけるプレートの一晩のインキュベーションの後、二連の各プレートをManiatisら(1982)に記載されているようにHybondN+フィルター(Amersham)上で作成した。3×SSC中でフィルターを湿らせた後、該フィルターを3×SSC中、室温にて60分間洗浄した。Sambrookら, 1989によって記載されているごとくに調製した32P-標識4kb EcoRI断片を用いるハイブリダイゼーションを以下の手法(Sambrookら,1989)に従って行った:68℃における3−5時間の6×SSC(1000ml当たり20×SSC:175.3g NaCl、107.1gクエン酸ナトリウム・5.5H2O、pH7.0)、0.1%SDS、0.05%ピロリン酸ナトリウム、5*デンハートの溶液(500ml当たり100×デンハート溶液:10gのFicoll−400、10gのポリビニルピロリドン、10g胎児ウシ血清アルブミン(ペンタックスフラクションV)および20μg/ml変性ニシン精子DNA中でのプレハイブリダイゼーションおよび68℃における15−18時間の変性放射性標識プローブを含有する同一緩衝液中でのハイブリダイゼーション、続いての68℃における2×SSC、0.1%SDS中での2回の洗浄、および68℃における0.2×SSC、0.1%SDS中での2回の洗浄。膜をサランラップで被覆し、コニカX−線フィルムおよび正規増感スクリーンを備えたコダックX−Omaticカセットを用い、−70℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
A.ニーガーxlnR cDNAのサブクローニング
xlnR遺伝子の亜鉛フィンガー領域の一部のcDNAクローンを得るために、ZAPTM−cDNA合成キット(Stratagene)に記載された方法と同様に、1476−1496位で開始するオリゴヌクレオチド(配列番号9)にて、30時間キシラン上で培養したA.ニーガーN402野生型株からの1μgのポリA*+RNAで逆転写酵素および第2ストランド合成反応を行った。第2ストランド反応のアリコット(1/50)を、順次95℃、58℃および72℃の60分、続いて72℃の5分のインキュベーションの35サイクルにてのプライマーRO26およびRO25(配列番号9の946−970位な由来する)を用いるPCRで鋳型として使用した。500bpの得られた断片をpGEN−Tベクター(Promega)にサブクローンし、配列決定した。
xlnR遺伝子の一次構造
実施例7.1
xlnR遺伝子の配列分析
配列決定反応において特異的オリゴヌクレオチドのプライマーとしての使用と組み合わせ、pNP8およびpIM230双方からの断片をサブクローニングすることによって、A.ニゲールxlnR遺伝子、そのプロモーター/調節領域、該遺伝子の構造部分および終止領域の配列を決定した。
xlnR遺伝子の記載
xlnR構造遺伝子を含む配列番号9で与えられる配列には、947ヌクレオチド長の上流領域が先行する。上流非コード領域においては、CT−リッチ配列が見出されるが、TATAAボックスは見いだされない。xlnR遺伝子の構造部分は948位から3690位までの範囲であり、2つのイントロンによって中断される。1174位から1237位のイントロンは、実施例6.2に記載されたpIM230中のゲノム断片および実施例6.3に記載されたcDNAの一部を配列決定することによって確認した。第2のイントロンは3496位から3549位までに示される。第2イントロン配列は、スプライス連結および投げ縄(lariat)配列のための、通常は菌類に見出される、保存されたイントロン配列に続く。
A.ニゲール突然変異体におけるxlnRの配列分析
実施例4.2に記載されたキシラン分解システムを発現しないA.ニゲール突然変異体の場合において、突然変異がxlnRに位置するか否かを判断するために、これらの突然変異体のxlnR遺伝子の配列を決定した。このため、5.5kb BamHI xlnRを含有する断片に富んだライブラリーを、NW205::130Ac突然変異体の各々を作成した。このxlnRに富んだライブラリーの構築のため、BamHI、HinDIII、XhoI、SstIおよびKpnI消化のゲノムDNAの5.5kb断片を各株から単離した。これらの断片をBamHI消化した脱リン酸化pUC18ベクター(Ready-To-GOTM pUC18 BamHI/BAP+リガーゼ、Pharmacia)と混合し、連結した。連結混合物を用いて、大腸菌(E.Coli)DH5α(MAX Efficiency DH5αTM能力細胞、Gibco-BRL)を、Amp耐性につき、製造業者のプロトコルに従って形質転換し、その結果、5*102−103コロニーの一次ライブラリーを得た。マスタープレート上で一次ライブラリーを再平板培養した後、これらのA.ニゲールxlnR富化ライブラリーを、プローブとしてのpIM230の変性放射性標識BamHI−XbaIインサートを使用して、標準的なプロトコル(Sambrookら, 1989)に従って、コロニーフィルターハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。
A.ニゲールにおけるxlnRの発現
キシラン分解系を発現しないA.ニゲールの相補性
全ての非発現突然変異体における相補性において、形質転換頻度についての対照としてのプロトプラストおよびpGW635とpIM230の相補性をテストするためのpIM230とを組み合わせることによって、実施例4に記載した全ての10のNW205::130 Ac突然変異体を、本明細書の実施例2に記載したごとくに形質転換した。
A.ニゲールキシラン系の発現に対するxlnR遺伝子用量の効果
増大したキシラン分解発現についての株改良に対するxlnR遺伝子の潜在的使用を実験するために、プラスミドpIM230を保有する19μgのxlnRおよびエイ・ニドゥランス(A. nidulans) argB遺伝子(Johnstoneら, 1985)を有するプラスミドpIM650の2μgを用いて、本明細書の実施例2に記載したごとくに、β−キシシダーゼをコードするエイ・ニゲールxlnD遺伝子の複数コピー(約6)を保有する株N902::200−18を共トランスフェクション実験においてアルギニン原栄養可体に形質転換した。得られた形質転換体を、1%オートスペルトキシランを含有するMMプレート上にて、増大したエンド−キシリナーゼ発現につきスクリーニングした。最速かつ最大ハロー形成を有する4つのコロニーを選択して、xlnRコピー数を決定した。このために、これらの形質転換体および受容体株のDNAを単離し、系列希釈をハイボンド(Hybond)N膜にスポットした。xlnR遺伝子の暗号配列にわたる放射性標識4.5kb SmaI/XbaI断片を用い、ハイブリダイゼーション後に見出されたシグナルからコピー数を見積もった。受容体株に対する比較に基づいて、xlnRコピー数はN902::200−18−R14では8と、N902::200−18−R16では32と判断された。両方のこれらの形質転換体につき、株を液状培養にて培養した後に、xlnRの増大した遺伝子投与量の効果をノーザン分析によって分析した。これは、1%フラクトース中での18時間のプレ培養の後に、炭素源としての2%オートスペルトキシランへの導入実験で行った。菌糸体試料を導入より8および24時間後に採取し、それから、製造業者の指示に従い、TriZol(Life technologies)を用いて全RNAを単離し、ノーザンブロット分析(Sambrookら, 1989)によって分析した。キシラナーゼB発現レベルは、A.ニゲールxlnB(Kinoshitaら, 1995)の放射性標識1kb EcoRI/XhoI断片を用いるハイブリダイゼーション後に検出して、受容体株と比較して、これらの形質転換体において強く増加した。
xlnR遺伝子の4.5kb SmaI/XbaI断片をプローブとして用いる、異種ハイブリダイゼーションによってxlnRカウンターパートを他の菌類を単離することが可能か否かを分析するために、DNAを以下の株から単離した:A.ニゲールN902(argB15、cspA1、fwnA1、metB10、pyrA5)、A.ドゥービゲンシスNW184(cspA1、fwnA1、pyrA22)、FGSC187からのA.ニデュランス(A. nidulans)WG096(pabaA1、yA2)、CBS101.43のA.アクレアトゥス(A. aculeatus)NW240(pyrA3)、CBS115.80からのA.アクレアトゥスNW217(fwnA1、cspA1、pyrA4、lysA1)、CBS115.52からのA.フェティダス(A. foetidus)(awamori)NW183(cspA1、fwnA1、pyrA13、lysA1)、A.ジャポニカス(A. japonicus)CBS114.51およびトリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)QM9414。1−2μgのDNAをBamHIまたはXhoIで消化し、引き続いて、実施例3に記載したごとくにサザン分析によって分析した。使用したハイブリダイゼーション条件は:56℃における18−24時間の6×SSC(1000ml当たりの20×SSC:175.3g NaCl、107.1gクエン酸ナトリウム・5.5H2O、pH7.0)、0.1%SDS、0.05%ピロリン酸ナトリウム、5*デンハート溶液(500ml当たり100×デンハート溶液:10gFicoll−400、10gのポリビニルピロリドン、10gウシ血清アルブミン(PentaxフラクションV)および20μg/ml変性ニシン精子DNA中でのハイブリダイゼーション、続いての68℃における5×SSC、0.1%SDSにおける2回の30分間の洗浄および56℃における2×SSC、0.1%SSCにおける2回の30分間の洗浄であった。ハイブリダイゼーションの後、膜をサランラップで被覆し、コニカX−線フィルムおよび正規増感スクリーンを備えたコダックX−Omaticカセットを用い、−70℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
A.ニゲールabfA遺伝子(Flipphiら, 1994)およびA.ニゲールabfB遺伝子(Flipphiら,1993)からのプロモーター断片を含有するプラスミドを構築した。abfAプロモーター断片を含有する構築体については、pIM900(Flipphiら, 1994)からの1.4kb XhoI/PstI断片を、実施例1に記載したごとくにSalI/PstI消化pAlter(Promega)に連結した。Altered SitesIIイン・ビトロ突然変異誘発系(Promega)を用い、XhoI制限部位を翻訳開始部位に対して−83位から−88位に創製した(Flipphiら, 1994)。得られたプラスミドから、953bp SstI/XhoI断片を単離した。この断片およびpIM130からの1.5kb XhoI断片を、SstI/XhoIで消化したpBluescript(Stratagene)に連結した。1.5XhoI断片の正しい向きを含有するプラスミドを、BglIIを用いる消化によって同定した。得られたプラスミドはpAP8である。
EP 95201707.7の実施例7
プラスミドpIM200を用いるA.ニゲールの形質転換
2%グルコース、0.5%酵母エキス、0.2%カザミノ酸(無ビタミン)、2mMロイシン、10μMニコチンアミド、10mMウリジンを補足したMMよりなる250mlの培養基に、株NW155(cspA1、argB13、pyrA6、nicA1、leuA1、prtF28)(NE228由来、Van den Homberghら, 1995)1ml当たり1*106胞子を接種し、オービタルNew Brunswick振盪機中、30℃および250rpmにて16−18時間増殖させた。Buchner漏斗および温和な吸引を用い、菌糸体をMyracloth (ナイロンゲージ)上に収穫し、SP6(SP6:0.8% NaCl、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0)で数回洗浄した。150mgのNovozyme234を、1g(湿潤重量)の菌糸体を添加し、注意深く再懸濁した20mlのSMC(SMC:1.33Mソルビトール、50mMCaCl2、20mM MES緩衝液、pH5.8)に溶解させた。この懸濁液を30℃にて1−2時間温和に振盪しつつインキュベートし、各30分毎に菌糸体を注意深く再懸濁し、試料を採取して、血球計を用いてプロトプラスト形成をモニターし、プロトプラストを計数した。十分なプロトプラストが存在すれば(1*108を超える)、これらを注意深く再懸濁し、菌糸体デブリスを滅菌ガラスウール栓での濾過によって除去した。ベンチ遠心機にて、3000rpmおよび4℃における10分間の遠心によってプロトプラストを収集し、上清を除去し、ペレットを注意深く5mlのSTC(STC:1.33Mソルビトール、50mM CaCl・、10mMトリス/HCl、pH7.5)に再懸濁させた。この洗浄工程を2回反復し、プロトプラストを最終的に1ml当たり1*108の密度にてSTCに再懸濁させた。
1%オートスペルトキシランおよび1mM 4−メトルウンベリフェリル−β−D−キシロシドを含有するMM上で平板培養することによって、実施例7で得られたpIM200からの形質転換体を表現型により分析した。テストした26の形質転換体のうち、5つは増大した蛍光を有した。参照としてのPYR+と共にこれらの形質転換体を、1%オートスペルトキシランを含有するMM上で20、27および42時間増殖させ、しかる後、PNP−Xに向かうβ−キシロシダーゼ活性を測定した。結果を表Cにまとめる。
実施例11.1:破壊プラスミドpIM203およびpIM204の構築
PCRによりxlnD遺伝子の内部断片を生じさせることによって、遺伝子破壊プラスミドpIM203およびpIM204を構築した。xlnR配列(配列番号8)に由来するオリゴヌクレオチドを用い、断片を生じさせた。キシロース001は、1157位ないし1176位に由来し、キシロース004は3147位ないし3164位に由来した。最終容量100μl中の10μlの10*反応緩衝液(100mM トリス−HCl、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01%ゼラチン)、16μlの1.25mMの各4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、1ngのプラスミドpIM200 DNAおよび1μgの各オリゴヌクレオチドを含有するPCRによって断片を生じさせた。この反応混合物を混合し、1μlのTAQポリメラーゼ(5U/μl)(Life Technologies)を添加した。92℃における3分間のインキュベーションによってDNAを変性させ、続いて1分間の92℃、1.5分間の52℃および1.5分間の72℃の25サイクルを行った。これらの25サイクルの後、混合物を72℃で5分間インキュベートした。アガロース電気泳動による反応生成物の分析により、約2000bpの断片が明らかとなり、これは遺伝子の配列に基づくと、予測されるサイズに対応する。得られた断片をベクターpGEM−T(Promega)にサブクローニングし、プラスミドpIM202が得られた。プラスミドpIM203は、A.ニジュランスargB遺伝子(Upshallら,1986)を含有するpILJ16のSmaI/PstI断片(Johnstoneら, 1985)を、EcoRI/PstI消化のpIM202ベクターに連結することによって構築した。プラスミドpIM204は、A.トゥービゲネシスのxlnAプロモーターのUASの制御下にあるpyrA遺伝子を含有するpIM130のNsi1/Xba1断片(本明細書、Ep 95202346.3)を、SpeI/Nsi1消化のpIM202ベクターに連結することによって構築した。
形質転換における選択マーカーとして、同時係属EP出願の実施例11.1に記載されたごとき、xlnD内部断片ならびにargB遺伝子(pIM203)またはpyrA遺伝子(pIM204)を含有するプラスミドを用いて、A.ニゲールxlnD遺伝子を破壊した。このために、各々、アルギニンまたはウリジン原栄養体につき選択するプラスミドpIM203およびpIM204を用い、A.ニゲールN902(argB15、cspA1、fwnA1、metB10、pyrA5)を、本明細書の実施例2に記載したごとくに形質転換した。得られた形質転換体を、同時係属EP出願の実施例8に記載したごとくに、1%キシランプレート上のメチルウンベリフェリル−β−D−キシロシドに対する活性につきスクリーニングした。形質転換体の両群について、20をスクリーニングした。これらの形質転換体のうち、各群の1つは24時間の増殖の後にMUX活性のひどく低下したレベルを有した。同時係属出願の実施例3に記載したごとき、選択した形質転換体のサザン分析は、pIM203形質転換体につき、同種xlnD遺伝子座における複数のコピー取込みを示した。pIM204形質転換体の場合において、xlnD遺伝子座における単一の同種取込みが起こった。これらの形質転換体の、同時係属EP出願の実施例8に記載したごとき、PNP−X活性についての分析は、β−キシロシダーゼ活性における少なくとも100倍の減少であることを明らかとした。
キシラン分解スペクトルの発現におけるxlnD発現の効果を測定するために、A.ニゲールN902、N902における2つのxlnD複数のコピー−形質転換体ならびにxlnD遺伝子破壊株を液体培地中で培養した。これは、18時間の1%フルクトース中の予備培養の後に、炭素源としての2%オートスペルトキシランまたは3%D−キシロースへの導入実験で行った。ベータ−キシロシダーゼ活性は、培養濾液におけるPNP−X活性として決定した。両C源に関し、両(pIM203およびpIN204)不活化形質転換体に対するPNP−X活性のほとんどの不存在に対するpIM200形質転換体につきはっきりした過剰発現がスクリーニングできた。xlnD遺伝子破壊形質転換体はエンド−キシラナーゼ発現の最初の低下したレベルを示し、しかしながら、これは最終的に16時間後には時間内に増大し、A.ニゲール野生型と比較して増大した活性レベルとなった。かくして、β−キシロシダーゼの無いキシラナーゼ調製が得られた。
Claims (20)
- 配列番号9のxylRのアミノ酸配列から成るポリペプチドと、あるいは配列番号9のxylRをコードする核酸配列から成る核酸によってコードされるポリペプチドと、少なくとも90%の同一性を示す発現生成物をコードする核酸配列から成る核酸xylRであって、ここにおいて、該配列から成る核酸は、その発現生成物がxylRポリペプチドの標的遺伝子に結合できるようなDNA結合活性を有する発現生成物をコードし、ここにおいて前記標的遺伝子はxlnAである、核酸xylR。
- 請求項1に記載の核酸であって、前記核酸が、配列番号9のxylRのアミノ酸配列から成るポリペプチドと少なくとも95%の同一性を示す発現生成物をコードする核酸。
- 前記核酸が配列番号9の核酸配列から成る核酸である、請求項1に記載の核酸。
- 請求項1又は2に記載の核酸であって、該核酸の配列が、配列番号9のコード化核酸配列と比較して、該配列の一以上の部分における欠失および/または置換を含み;配列番号9と比較したとき、1〜15のアミノ酸が欠失及び/又は置換され;前記配列が亜鉛フィンガー結合領域をコードする配列及びRRRLWWをコードする配列を含み;及び、該配列から成る核酸は、その発現生成物がxylRポリペプチドの標的遺伝子に結合できるようなDNA結合活性を有する発現生成物をコードし、ここにおいて前記標的遺伝子はxlnAであることを特徴とする核酸。
- 請求項1〜4の何れか一項に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列から成るポリペプチド。
- 前記アミノ酸が、配列番号9によってコードされるアミノ酸である、請求項5に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチド。
- 請求項5に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、前記DNA結合活性が、配列番号9によってコードされるアミノ酸による発現生成物が、前記標的遺伝子の核酸配列から成る核酸に結合するのと同程度又はそれ以上に、前記発現生成物が標的遺伝子の核酸配列から成る核酸に結合する程度であり、ここにおいて、前記標的遺伝子が、標的遺伝子xlnAである、アミノ酸配列から成るポリペプチド。
- 請求項5〜7の何れか一項に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、前記アミノ酸の配列が、配列番号9によってコードされるアミノ酸配列と比較して、該配列の一以上の部分において、欠失及び/又は置換を含み、配列番号9と比較したとき、1〜15のアミノ酸が欠失及び/又は置換され;及び、前記配列から成るアミノ酸が亜鉛フィンガー結合ドメイン及びRRRLWWモチーフを含む、アミノ酸配列から成るポリペプチド。
- 請求項5〜8の何れか一項に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、前記アミノ酸が亜鉛フィンガー結合領域に対応する断片を含む、アミノ酸配列から成るポリペプチド。
- 請求項5〜9の何れか一項に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、該アミノ酸が、RRRLWWモチーフに対応するアミノ酸を含むアミノ酸配列から成るポリペプチド。
- 請求項5〜10のいずれか一項に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、配列番号9における1110ないし1260位におけるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸に対応する亜鉛フィンガー結合領域に突然変異が存在しない、アミノ酸配列から成るポリペプチド。
- 請求項5〜11のいずれか一項に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、配列番号9によってコードされるアミノ酸に存在するモチーフRRRLWWに対応するRRRLWWモチーフに突然変異が存在しない、アミノ酸配列から成るポリペプチド。
- レギュレーターをコードする配列の欠如、又は、該レギュレーターが発現されないか又はレギュレーターとして不活性であるような突然変異−いわゆるノックアウト突然変異ホスト細胞−を含む突然変異ホスト細胞であって、前記レギュレーターをコードする配列がxylRをコードし、及び、該レギュレーターが請求項1〜4の何れか一項に記載の核酸の配列によってコードされ、又は、該レギュレーターが請求項5〜12の何れか一項に記載のアミノ酸の配列を有し;及び、前記ホスト細胞が糸状菌細胞である、突然変異ホスト細胞。
- キシラン分解副活性を含まずに得ることができる、蛋白質またはペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項13に記載の突然変異ホスト細胞。
- 請求項13または14に記載のノックアウト突然変異体を培養し、その結果として蛋白質を得ることを特徴とする、キシラン分解副活性の無い蛋白質またはポリペプチドを生産する方法。
- 蛋白質またはペプチドを生産するための、組合せ核酸カセットの使用であって、前記組合せ核酸カセットが、
1)標的遺伝子プロモーター、ここにおいて該標的遺伝子はキシラン分解レギュレーターxylRの標的遺伝子であり、及びここにおいて、前記標的遺伝子はxlnAである、
2)さらなるプロモーターに作動可能に連結されたレギュレーターをコードする核酸配列から成る核酸、
3)蛋白質又はペプチドをコードする配列から成る核酸、
を含み、
前記標的遺伝子プロモーターは、(3)のコード配列に作動可能に連結され、ここにおいて、該レギュレーターをコードする核酸配列は、キシランレギュレーターをコードし、ここにおいて、該レギュレーターをコードする核酸配列は、xylRをコードし、ここにおいて、該レギュレーターをコードする核酸配列は、請求項1〜4の何れかに記載の核酸の配列であり、或いは、該レギュレーターは請求項5〜12の何れかに記載のアミノ酸の配列を有することを特徴とする使用。 - 前記レギュレーターをコードする核酸配列から成る核酸に作動可能に連結されたさらなるプロモーターが、前記核酸配列から成る核酸に天然に付随するプロモーターである、請求項16に記載の使用。
- 前記配列から成る核酸が、キシラン分解酵素、グルカナーゼ、α-グルクロニダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、プロテアーゼ又はヘキソース酸化酵素のような酸化還元酵素をコードする、請求項16又は17に記載の使用。
- 請求項1〜4の何れか一項に記載の核酸の使用であって、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸によってコードされる誘導性エンハンサーまたはアクチベーターの活性化レギュレーターの標的遺伝子と正常に関連するプロモーターに作動可能に連結された標的遺伝子を含むホスト細胞において、該核酸配列から成る核酸を発現させることによって、標的遺伝子を過剰生産させるための使用であり、但し、該標的遺伝子および請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸が、該ホスト細胞に天然のものである場合、請求項1〜4のいずれか1項に記載の配列から成る核酸は野生型ホスト細胞と比較して複数コピーが存在し、ここにおいて前記標的遺伝子はxlnAであることを特徴とする使用。
- 請求項1〜4の何れか一項に記載の核酸の少なくとも一つのさらなるコピーを含むホスト細胞であって、該ホスト細胞が糸状菌細胞である、形質転換されたホスト細胞。
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