KR100801960B1

KR100801960B1 - ｍＲＮＡ 결합 단백질 ＸａｉＦ, 이를 부착하는 유전자구조물 그리고 이들을 이용한 외래 유전자의 과발현 방법

Info

Publication number: KR100801960B1
Application number: KR1020060111930A
Authority: KR
Inventors: 조쌍구; 최용진; 정미영
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2006-11-14
Filing date: 2006-11-14
Publication date: 2008-02-12

Abstract

본 발명은 새로운 mRNA 결합 단백질, 이와 결합하는 유전자 구조물 및 이들을 이용한 유전자의 과발현 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 mRNA 결합 단백질 XaiF (xylanase activity increasing factor) 및 그의 아미노산 서열; mRNA 결합 단백질 XaiF 유전자, 그의 염기서열, 이를 포함하는 발현 벡터들, 이로 형질전환된 미생물 및 이들을 이용한 mRNA 결합 단백질 XaiF 의 제조방법; 상기 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물 (stem-loop), 그의 염기서열 및 이를 포함하는 클로닝 벡터들; 그리고 mRNA 결합 단백질 XaiF 및 이를 부착하는 유전자 구조물을 이용하여 외래 유전자를 과발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 자일란 분해효소 (xylanase) 유전자 xyn A 와 동시에 발현되어 자일란 분해효소의 활성을 증진시키는 mRNA 결합 단백질 XaiF 는 이를 부착시키는 유전자 구조물 및 다른 강력한 프로모터와 함께 사용하는 경우 외래 유전자의 전사를 증진시키고 그 전사체의 분해를 억제하여 외래 단백질을 대량 생산하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

mRNA 결합 단백질 XaiF, mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물, 외래 유전자의 과발현 방법

Description

ｍＲＮＡ 결합 단백질 ＸａｉＦ, 이를 부착하는 유전자 구조물 그리고 이들을 이용한 외래 유전자의 과발현 방법 {mRNA binding protein XaiF, its cis-acting stem-loop structure and method for producing exogenous genes using the same}

도 1 은 본 발명의 mRNA 결합 단백질 XaiF 을 동시에 발현시키는 경우 자일란 분해효소 xyn A 유전자의 발현이 촉진되는 결과 I을 나타낸 것이다.

도 2 는 본 발명의 mRNA 결합 단백질 XaiF 을 동시에 발현시키는 경우 자일란 분해효소 xyn A 유전자의 전사체의 안정성 증가에 의한 전사체 증가가 촉진되는 결과 Ⅱ를 나타낸 것이다.

도 3 은 본 발명의 mRNA 결합 단백질 XaiF 이 바실러스 EB 프로모터로부터의 자일란 분해효소 xyn A 유전자 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

도 4 는 본 발명의 mRNA 결합 단백질 XaiF 이 자일란 분해효소 xyn A 유전자 전사체의 3'-UTR 부위에 결합하는 양상을 나타낸 것이다.

도 5 는 본 발명의 mRNA 결합 단백질 XaiF 이 융합 유전자 gst-xyn A 3'-UTR 의 이성체 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

도 6 은 본 발명의 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물 (stem-loop)을 나타낸 것이다.

도 7 은 본 발명에 따른 플라스미드 pETXaiF 의 유전자 지도이다.

도 8 은 본 발명에 따른 플라스미드 pT₇200RP 의 유전자 지도이다.

본 발명은 새로운 mRNA 결합 단백질, 이와 결합하는 유전자 구조물 및 이들을 이용한 유전자의 과발현 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 mRNA 결합 단백질 XaiF (xylanase activity increasing factor) 및 그의 아미노산 서열; mRNA 결합 단백질 XaiF 유전자, 그의 염기서열, 이를 포함하는 발현 벡터들, 이로 형질전환된 미생물 및 이들을 이용한 mRNA 결합 단백질 XaiF 의 제조방법; 상기 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물 (stem-loop), 그의 염기서열 및 이를 포함하는 클로닝 벡터들; 그리고 mRNA 결합 단백질 XaiF 및 이를 부착하는 유전자 구조물을 이용한 외래 유전자의 과발현 방법에 관한 것이다.

자일란 (xylan)은 식물의 세포벽을 구성하는 주요 복합 다당체이고, 자일로피라노사이드 (xylopyranoside)가 β-1,4 결합을 이루는 구조를 가진다. 엔도자일라나제 (endo-xylanase)는 자일란을 분해하는 주요 효소로서, 다양한 생물공학적 공정에서 응용되고 있다. 이러한 자일란 분해효소는 세포 내에 포도당과 같이 대사 효율이 높은 당류가 존재하는 경우, 당 대사 억제 (carbon catabolite repression)를 받는 것으로 알려져 있다. 또한, 당 대사 억제 과정에는 트랜스-작동인자 (trans-acting factor)인 대사조절 단백질 CcpA (catabolite control protein A), 시스-작동인자 (cis-acting factor)인 대사 반응요소 cre (catabolite response element) 및 Hpr 단백질 등이 관여하는 것으로 밝혀져 있다. 또한, 그들에 의한 유전자 발현의 억제 조절 기작에 관해서도 잘 규명되어 있다. 그러나, 자일란 분해효소들은 그 발현 억제를 제외하고는 발현 유도 및 활성화 기작 등에 관한 연구가 거의 이루어지지 않았다.

본 발명자들은 자일란 분해효소 xynA 유전자의 발현이 당 대사의 억제 기작에 의해 조절되고, 이 과정이 xynA 유전자의 -137 에서 -124 그리고 +173 에서 +186 에 위치하는 2개의 cre 부위와 이에 부착하는 트랜스-작동 단백질인 CcpA 이 결합하여 이루어지는 것을 밝혀낸 바 있었다. 또한, 상기 xynA 유전자의 아래쪽에 존재하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame; ORF)으로부터 283개의 아미노산으로 이루어진 새로운 단백질이 생산되는 것도 발견하였다. 이 유전자 산물은 상기 xynA 유전자와 함께 발현되는 경우, 자일란 분해효소의 활성을 높이기 때문에, 자일란 분해효소의 활성 증가인자 XaiF (xylanase activity increasing factor)라고 명명하였다.

실제로, 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger)의 경우는 에탄올 조절자 (ethanol regulon)의 트랜스-작동자인 AlcR 결합 부위가 이 조절자의 프로모터 부위에 존재하는 것이 보고되어 있다. 이 결합 부위는 당대사 억제에 관여하는 CreA 단백질의 결합 부위와 인접하거나 겹쳐져서 위치하므로, 두 가지 단백질들 간에 결 합 부위에 대한 경쟁이 일어나는 것으로 알려져 있다.

지금까지 미생물 전사체의 안정성에 영향을 미치는 다양한 요인들이 발견되었고, 이들 중에 5'- 및 3'-말단에 존재하는 헤어핀 구조가 가장 주요한 것이라고 알려져 있다. 이러한 3'-말단 헤어핀 구조는 RNase Ⅱ 및 PNPase 와 같은 염기 분해효소로부터 유전자 전사체를 보호하는 방어 기능을 가지는 데, 더욱 효과적인 방어를 위해서는 이들 구조에 단백질이 결합하는 것이 필요하다고 제시되어 있다. 실제로 대장균 및 바실러스 섭틸리스 균주에 존재하는 아코니타제 (aconitase)는 척추동물의 철분-조절 단백질 (iron-regulatory proteins; IRP1) 및 세포질 아코니타제 (cytoplasmic aconitases)와 동일하게 전사체에 대한 결합능을 가지고, 효소 반응을 촉매하는 등의 기능적인 유사성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 이들 단백질은 그 전사체 자체 또는 척추동물에서 발견되는 아코니타제 단백질들이 결합하는 염기서열에 부착하여 전사체의 안정성을 증대시키는 것으로도 보고되어 있다.

또한, 최근에는 mRNA 분해가 미생물에서 유전자 발현 시 전사후 조절에 관여하는 것으로 알려지고 있다. 특히 미생물에서 전사체의 5'-말단 부위는 mRNA 안정성을 결정하는 주요한 요소가 되고, 이 말단으로부터의 첫 번째 절단이 그 분해 속도를 조절하는 것으로 보고되었다. 반면, mRNA 의 3'-말단 부위에 의한 유전자의 발현 조절은 미생물에서 거의 이루어지지 않았다.

본 발명자들은 미생물에서 자일란과 같은 다당류 분해효소들이 발현 조절되는 과정에서 3'-미번역 부위 (3'-UTR; untranslated region)에 의한 전사후 조절 기작이 작용하는 것을 연구하여 그 가능성을 처음으로 밝혔다. 구체적으로는, mRNA 결합 단백질 XaiF 가 자일란 분해효소의 유전자 xyn A 전사체의 3'- UTR 부분에 위치하는 시스-작동인자에 결합하여 RNA - 단백질의 복합체를 만들고, 이와 같이 형성된 복합체는 RNA 분해효소에 의해 상기 전사체가 분해되는 것을 막아서 유전자 발현 과정에서 보호 작용을 하는 것을 확인하였다.

이에 본 발명자들은 새로운 유전자의 과발현 방법을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 자일란 분해효소의 발현을 조절하는 RNA 결합 단백질 XaiF 를 분리하고 mRNA 결합 단백질 XaiF 유전자를 얻어 그의 염기서열을 결정하고 이를 포함하는 발현 벡터들 및 이로 형질전환 된 미생물을 제작하여 mRNA 결합 단백질 XaiF 을 대량 생산한 다음, 상기 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물을 별도로 분리하여 다양한 강력 프로모터와 이들을 동시에 사용하여 외래 유전자를 과발현 시키는 방법을 제공함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 새로운 mRNA 결합 단백질, 이와 결합하는 유전자 구조물 및 이들을 이용한 유전자의 과발현 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 외래 유전자의 발현 조절에 사용될 수 있는 mRNA 결합 단백질 XaiF 를 제공한다.

또한, 본 발명은 mRNA 결합 단백질 유전자 xaiF, mRNA 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터들 및 이로 형질전환 된 미생물들을 제공한다. 또한, 본 발명은 (1) 형질전환 된 미생물을 배양하고; (2) 단백질의 발현을 유도하고; 및 (3) 재조합 단백질을 정제하는; 과정으로 mRNA 결합 단백질을 얻는 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 외래 유전자의 발현 조절에 사용될 수 있는 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물을 제공한다.

또한, 본 발명은 mRNA 결합 단백질 및 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물을 이용하는 외래 단백질의 과발현 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 외래 유전자의 발현 조절에 사용될 수 있는 mRNA 결합 단백질을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 자일란 분해효소 (xylanase) 유전자의 발현을 증가시키는 mRNA 결합 단백질 XaiF (xylanase activity increasing factor) 및 그의 유전자를 제공한다. 상기 mRNA 결합 단백질 XaiF 는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부 또는 전부를 포함하고, mRNA 결합 단백질 유전자는 서열번호 2의 염기서열 중 일부 또는 전부를 포함한다.

또한, 본 발명은 mRNA 결합 단백질 유전자를 포함하는 재조합 클로닝 또는 발현 벡터들 및 이들로 형질전환 된 미생물들을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 mRNA 결합 단백질 유전자 xaiF 를 포함하는 클로닝 벡터 pW3.1 및 그의 형질전환 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 mRNA 결합 단백질 유전자 xaiF 의 일부 또는 전체를 포함하 는 클로닝 벡터 pEBXA 및 클로닝 벡터 pEBAF 그리고 그들의 형질전환 미생물들을 제공한다.

또한, 본 발명은 자일란 분해효소의 오픈 리딩 프레임 및 자일란 분해효소의 오픈 리딩 프레임과 함께 mmRNA 결합 단백질이 부착하는 3'-미번역 부위를 포함하는 각 클로닝 벡터 pQXA710 및 클로닝 벡터 pQXA785 그리고 그들의 형질전환 미생물들을 제공한다.

또한, 본 발명은 자일란 분해 효소 유전자 xynA 및 mRNA 결합 단백질 유전자 xaiF 를 포함하는 재조합 발현 벡터 pETXynA 및 재조합 발현 벡터 pETXaiF 을 제공한다.

또한, 본 발명은 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 미생물 Escherichia coli BL21(DE3)(pETXynA) 및 Escherichia coli BL21(DE3)(pETXaiF)을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 상기 형질전환 된 미생물을 배양하고; (2) 단백질의 발현을 유도하고; 및 (3) 재조합 단백질을 정제하는; 과정으로 mRNA 결합 단백질을 얻는 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 (1) 상기 형질전환 된 대장균을 배양하고; (2) IPTG 를 첨가하여 mRNA 결합 단백질의 발현을 유도하고; 및 (3) Ni²⁺-NTA 아가로스 컬럼을 사용하여 재조합 단백질을 정제하는; 과정으로 mRNA 결합 단백질 XaiF 을 얻는 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 외래 유전자의 발현 조절에 사용될 수 있는 mRNA 결합 단백 질이 부착하는 유전자 구조물 (stem-loop structure)을 제공한다 (도 6 참조).

본 발명의 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물은 서열번호 3의 염기서열의 일부 또는 전부를 포함한다.

또한, 본 발명은 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물을 포함하는 클로닝 벡터를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물을 포함하는 클로닝 벡터 pT₇200RP 를 제공한다. 또한, 본 발명은 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물을 포함하는 클로닝 벡터 pGST-3U(WT)를 제공한다.

상기 외래 단백질의 과발현 방법에는 상기 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물과 T7 프로모터를 포함하는 강력한 유전자 프로모터를 조합하고 mRNA 결합 단백질을 첨가하거나 발현시키는 과정으로 이루어진다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미생물의 배양

본 발명에서는 대장균 XL1-blue (Stratagene, USA) 및 대장균 BL21(DE3) (Invitrogen, USA) 균주가 플라스미드 및 T7 프로모터를 이용한 단백질 고발현 시스템의 제조 시 숙주 세포로 사용되었다. 또한, 바실러스 섭틸리스 MW15 (Microbiology, 141, 281-290, (1995)) 균주는 알칼라인 프로테아제 (alkaline protease) 및 자일라나제 (xylanase)가 없는 변종으로 그람-양성 미생물의 숙주 세포로 사용되었다. 또한, 플라스미드 벡터 pUC119 및 pET23b 가 각각 유전자의 클로닝 및 단백질의 생산에 사용되었다. 또한, 플라스미드 p15A 로부터 유래하는 복제점 (replication origin)을 가지는 플라스미드 벡터 pACYC184 는 ColE1 복제점을 가지는 플라스미드와 세포 내에서 양립 가능하므로, mRNA 결합 단백질 XaiF 가 트랜스-작동인자로서 자일란 분해효소들의 발현에 미치는 효과를 조사하는 데 사용되었다. 대장균-바실러스 섭틸리스 공통 벡터 (E. coli-B. subtilis shuttle vector) pWPBR 및 바실러스 섭틸리스 균주로부터 유래한 강력한 프로모터인 EB 프로모터를 가지는 플라스미드 벡터 pEBP313 은 그람-양성 숙주 세포에서의 유전자 발현 조절을 조사하는 데 사용되었다.

실시예 2. 플라스미드 벡터의 제작

먼저, 본 발명에서는 Kor. J. Microbiol. Bioeng. 17, 289-294 (1989)의 방법으로 동정한 Bacillus stearothermophilus No. 236의 균주의 유전체로부터 클로닝한 xynA와 xaiF 유전자를 가지는 플라스미드 벡터 pHINC5.5 를 J. Microbiol. Biotechnol. 11, 131-137 (2001)방법으로 제작하고, 이 플라스미드 벡터를 HincII 와 EcoRV 처리하여 얻은 자일란 분해효소 xynA 유전자 (Gene bank accession number: AAB72117; J. Microbiol. Biotechnol. 5, 117-124 (1995)의 방법에 준하여 제작)만을 가지는 1.8 kb DNA 단편과 동일한 플라스미드 벡터 pHINC5.5 를 HincII와 SphI 처리하여 얻은 xynA 및 xaiF (Gene bank accession number: AAB72118; J. Microbiol. Biotechnol. 5, 117-124 (1995)의 방법에 준하여 제작)의 두 유전자를 가지는 3.1 kb DNA 단편을 J. Microbiol. Biotechnol. 8, 378-387 (1998) 의 방법으로 제작한 플라스미드 벡터 pWPBR 에 클로닝하고, 각각을 클로닝 벡터 pW1.8 및 pW3.1로 명명하였다.

그 다음, XynA 단백질의 두 번째 아미노산으로부터 종료 코돈 (stop codon) 아래 70 bp 에 이르는 염기서열을 가지는 700 bp DNA 단편과 이 700 bp 단편과 더불어 그 아래쪽에 위치하는 xaiF 유전자를 포함하는 1670 bp DNA 단편을 다음과 같이 제작하였다. 구체적으로, 상기 클로닝 벡터 pW3.1 을 주형으로 사용하고, 서열번호 4의 프라이머 EBPxA (5'-AGGATCCTAAGTTAAAGAAGA-3') 및 서열번호 5의 프라이머 EBPxAR (5'-CAAGCTTCCTTTGATTGAAGG-3') 그리고 상기 서열번호 4의 프라이머 EBPxA 및 서열번호 6의 프라이머 EBPxFR (5'-CGAAGCTTACCATCCTAACTC-3')를 프라이머로 사용한 중합효소 연쇄반응을 실시하여 상기 700 bp DNA 단편과 상기 1670 bp DNA 단편을 증폭시키고, 제한효소를 처리하여 J. Microbiol. Biotechnol. 1, 37-44 (1991)의 방법에 준하여 제작한 클로닝 벡터 pEBP313 에 서브클로닝 하고 이로부터 얻은 재조합 클로닝 벡터를 각각 pEBXA 및 pEBAF 로 명명하였다.

또한, 상기 xynA 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 해당하는 680 bp DNA 단편과 xynA 유전자의 오픈 리딩 프레임과 종료 코돈 아래의 72개의 염기서열을 포함하는 752 bp DNA 단편을 다음과 같이 제작하였다. 구체적으로, 상기 클로닝 벡터 pW3.1을 주형으로 서열번호 4의 프라이머 EBPxA 및 서열번호 7의 프라이머 XynAR (5'-GCTAAGCTTCCAAACCGTAAC-3') 그리고 상기 서열번호 4의 프라이머 EBPxA 및 상시 서열번호 5의 프라이머 EBPxAR 을 각 단편에 대한 앞 뒤 프라이머로 사용한 PCR 을 실시하여 680 bp DNA 단편 및 752 bp DNA 단편을 증폭시키고 제한효소를 처리하여 클로닝 벡터 pQE30 에 서브클로닝 하고 이로부터 얻은 재조합 클로닝 벡터를 각각 pQXA710 및 pQXA785로 명명하였다.

실시예 3. mRNA 결합 단백질 XaiF 의 자일란 분해효소의 활성에 미치는 효과 조사

본 발명에서는 XaiF 단백질이 가지는 자일라나제 (xylanase)의 활성 증가 효과가 다른 자일란 분해효소에도 동일하게 작용하는 지를 알아보기 위하여, 동종의 균주에서 유래한 두 종의 자일란 분해효소, 즉 β-자일로시다제 및 α-아라비노퓨라노시다제의 생산에 미치는 XaiF 단백질의 효과와 함께 조사하였다.

본 발명에서는 자일란 분해효소 (xylanase), β-자일로시다제 (β-xylosidase) 및 α-아라비노퓨라노시다제 (α-arabinofuranosidase) 등의 효소 활성을 다음과 같이 측정하였다. 구체적으로, 자일란 분해효소 (xylanase)는 DNS 를 이용하여 기질로부터 효소 작용으로 떨어져 나오는 자일로스 (xylose)를 측정하여 활성을 조사하였다. 이 때 분당 1 μmole의 자일로스를 생성하는데 필요한 효소의 양을 효소 1 유닛으로 정의하였다. 또한, β-자일로시다제 및 α-아라비노퓨라노시다제는 효소 반응을 통해 기질로부터 떨어져 나오는 ρ-니트로페놀 (ρ-nitrophenol)의 양을 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 그 활성을 정량하였다. 이 때 분당 1 μmole의 ρ-니트로페놀을 생성하는데 필요한 효소의 양을 효소 1 유닛으로 정의하였다.

그 결과, xynA 유전자의 경우 xaiF 유전자와 동시에 발현되었을 때 그 유전자 산물인 자일라나제 활성이 xaiF 유전자가 발현되지 않은 때와 비교하여 약 2.7 배 정도 증가하는 것으로 나타났고, 다른 두 유전자의 발현에 있어서는 인식할 수 있는 정도의 증가가 나타나지 않았다. 이 결과로부터 XaiF 단백질의 효소 활성의 증대는 자일라나제에 특이적인 효과인 것을 확인할 수 있었다 (표 1 참조).

[표 1]

자일란 분해효소들의 활성에 미치는 XaiF 단백질의 효과 조사

	엔도자일라나제 활성 (U/㎎)	β-자일로시다제 활성 (U/㎎)	α-아라비노퓨라노사다제 활성 (U/㎎)
	pMG12 (xynA)	pMG1 (xylA)	pMG11 (araA)
pACYC184 (대조군)	81±0.15	43.95±2.01	3.357±0.385
pACYC-C17 (xaiF)	21.87±2.54	45.79±3.08	3.655±0.29

실시예 4. mRNA 결합 단백질 XaiF 의 기능에 미치는 탄소원의 효과 조사

본 발명에서는 XaiF 단백질에 의한 xynA 유전자의 트랜스-작동 (trans-activation) 기작이 당 대사 억제에 관여하는 CcpA 와의 상반되게 일어날 것으로 예상하고 이 가정을 확인하기 위하여, 클로닝 벡터 pW1.8 또는 pW3.1 을 가지는 B. subtilis MW15 균주를 서로 다른 당류를 당대사 원료로 가지는 SP I 배지에서 배양한 다음, 자일라나제 활성을 각 시간대별로 조사하였다 (도 1 참조). 그 결과, 자일란이 당 대사 원료로 존재하는 경우 24시간 동안 배양 시 자일라나제 활성은 XaiF 단백질의 발현 여부에 관계없이, 포도당이 당 대사 원료로 사용되는 경우와 비교하여 약 5배 정도 증가하는 것으로 나타났다. 특히, XaiF 단백질에 의한 자일라나제 활성 증가 정도가 배지 내 당의 종류와 관계없이 약 3배 정도로 인 것으로 조사되었다. 이 결과로 인해 xynA 유전자에 대한 XaiF 단백질에 의한 효소 활성 증대 기작과 당 대사 억제 기작이 서로 독립적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 자일란 분해효소 XynA 와 mRNA 결합 단백질 XaiF에 대한 항체제조

본 발명에서는 xynA 유전자와 xaiF 유전자를 각각 서열번호 8의 프라이머 XynAF (5'-CCGCATATGAAGTTAAAGAAG-3') 및 서열번호 7의 프라이머 XynAR 그리고 서열번호 9의 프라이머 XevF (5'-ATCATATGAAGTTAAAGAAGA-3') 및 서열번호 10의 프라이머 XevR (5'-TAAGCTTCCAAACCGTAACGTT-3')을 사용한 PCR 로 증폭시킨 다음, 각각 제한효소 NdeI 과 HindIII를 처리하여 단백질을 높게 발현시키는 발현 벡터 pET23b 에 서브클로닝하고 이들을 각각 재조합 발현 벡터 pETXynA 및 재조합 발현 벡터 pETXaiF 로 명명하였다. 또한, 두 가지 플라스미드를 숙주 세포인 대장균 E. coli BL21(DE3)균주에 형질전환 시키고 이로부터 형질전환 대장균 E. coli BL21(DE3) (pETXynA) 및 E. coli BL21(DE3)(pETXaiF)를 획득하였다.

그 다음, 상기 형질전환 대장균 E. coli BL21(DE3)(pETXynA) 및 E. coli BL21(DE3)(pETXaiF)를 배양하고 다시 배지에 IPTG 를 첨가하여 단백질의 발현을 유도한 후, Ni²⁺-NTA-아가로스 컬럼을 이용하여 제조사의 설명에 따라서 재조합 단백질 XynA-his6 및 XaiF-his6 을 각각 정제하였다.

이로부터 얻은 정제된 단백질은 각각 뉴질랜드 화이트래빗 (New Zealand White rabbits)에 주사하여 면역반응을 유도시킨 다음 혈액을 채취하여 상기에서 발현시킨 재조합 단백질에 대한 항체를 제조하였다. 이와 같은 얻은 항체는 웨스턴 블라팅에 사용되기 위하여 다시 동량의 단백질을 SDS-PAGE 에 걸어 분리시킨 다음 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)에 옮기고 각 항체를 붙여 화학 발광제로 그 양상을 조사하였다.

실시예 6. 생체 외 전사 분석 ( in vitro transcription assay)

본 발명에서는 상기 xynA 유전자의 오픈 리딩 프레임과 위쪽 200 bp 를 포함하는 300 bp DNA 단편을 PCR 로 증폭시키고 PCR 산물을 정제하였다. 이로부터 얻은 DNA 단편을 0.1 ㎍의 XaiF-his6 단백질을 포함하거나 또는 포함하지 않는 최종 부피 50 ㎕의 혼합액 (50 mM 트리스Cl (pH 7.9), 10 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.01% 트리톤 X-100, 10 U 의 RNase 저해제, 2.5 mM ATP, 2.5 mM CTP, 2.5 mM GTP, 0.05 mM UTP, 10 μCi α-³²P-UTP 및 0.2 U 의 대장균 RNA 폴리머라제 전체 (holoenzyme; Epicentre Biotechnologies))에 섞고 37℃에서 20분 동안 반응시켰 다. 표시된 시간에 각 혼합약을 10 ㎕씩을 덜어내고 2.5 mM UTP 및 2.5 ㎍ 헤파린을 섞고 5분 동안 더 반응시킨 다음 5 ㎕의 포름아마이드 완충용액(formamide buffer)을 넣고 반응을 종결시켰다. 각 시료는 5% 폴리아크릴아마이드 / 7 M 우레아 젤에 걸어 분리하고 방사선을 필름에 감광시켜 관찰하였다.

실시예 7. mRNA 분해율 측정

본 발명에서는 상기 클로닝 벡터 pW1.8 또는 pW3.1 을 포함하는 B. subtilis MW15 균주를 LB 배지에서 배수기까지 키우고, 200 ㎍/㎖의 액티노마이신 D (actinomycin D)를 첨가하여 세포 내의 전사를 차단하였다. 표시된 시간에 세포를 채취하고 RNA Zol B 용액을 이용하여 세포내 전체 RNA 를 추출하였다. xynA 전사체의 양은 동위원소로 표지된 DNA 프로브를 사용한 노던 블럿팅을 수행하여 확인하였다. 각 밴드의 강도는 TINA 프로그램 (Fuji Film Co., Ltd., Japan)을 이용하여 측정하였으며, 그 값을 액티노마이신 D 처리 후 0 분을 기준으로 하여 백분율로 전환한 다음 그래프로 나타내었다. 각 그래프의 기울기를 계산하여 처음 xynA 전사체의 양이 반으로 줄어드는 시간을 계산하였다.

실시예 8. mRNA 결합 단백질 XaiF 의 트랜스 작동 기작 조사

본 발명에서는 XaiF 단백질의 분자적 수준에서의 작용 기작을 조사하기 위하여, 유전자 발현의 첫 단계인 전사 단계에 있어서 XaiF 단백질이 존재하거나 또는 존재하지 않은 상태에서 생성되는 xynA 전사체를 측정하였다. 구체적으로, 노던 블럿을 실시한 결과, xynA 유전자가 XaiF 단백질과 함께 발현되는 경우 xynA 전사체가 약 3배 정도 증가된 것으로 조사되었다. 또한, 증가된 전사체가 단백질의 발현과도 직접적으로 연관되는지 여부를 상기에서 제작한 XynA 에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿을 실시하여 xynA 전사체에 해당하는 XynA 단백질의 존재를 확인할 수 있었다 (도 1 참조).

또한, XaiF 단백질의 전사 활성체로서 기능할 가능성은 상기 기술한 생체 외 전사 분석 (in vitro transcription assay)을 실시하여 확인하였다. 그 결과, 생체 외 (in vitro)에서 xynA 유전자의 전사율은 전사 혼합물 내의 XaiF 단백질의 유무와는 상관없는 것으로 조사되었다 (도 2 참조). 따라서, XaiF 단백질은 xynA 전사 단계를 조절하는 것이 아닌 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 결과들을 근거로 하여 XaiF 단백질이 xynA 전사체의 안정성에 미치는 효과를 조사하기 위하여, xynA 전사체의 반감기를 상기 기술한 바와 같이 액티노마이신 D 처리 후에 노던 블럿 방법으로 측정하였다. 흥미롭게도, xynA 유전자는 xaiF 유전자와 동시에 발현되는 경우 xynA 전사체의 반감기가 4분에서 16분으로 약 4배 정도 증가하는 양상을 나타내었다 (도 2 참조). 이러한 결과로 인해 XaiF가 xynA 전사체를 안정시키는 전사 후 조절자로서 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, XaiF 단백질의 기능에 있어서 주요하게 작용하는 xynA 유전자 부위를 예측하기 위하여, xynA 유전자의 프로모터를 B. subtilis의 유전체로부터 유래한 강력한 프로모터인 EB 프로모터로 치환하고 이 새로운 xynA 구성체에 대한 XaiF단 백질의 효과를 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 으로 조사하였다 (도 3 참조). 그 결과, EB 프로모터로부터 생산되는 xynA 전사체도 역시 원래의 프로모터에서 발현되는 양상과 같이 XaiF 단백질이 존재하는 경우에 전사체가 증가되는 것으로 나타났다. 또한 이와 일관되게도, 각 플라스미드를 가지는 B. subtilis MW15 균주를 0.5% 오트 스펠트 자일란 (oat spelt xylan)을 포함하는 LB 배지판에 배양시킨 경우, 전사체의 증가에 상응하는 단백질 발현의 증가와 그에 상응하는 자일라나제 활성의 증가로 인해서 플라스미드 벡터 pEBAF 를 가지는 세포가 플라스미드 벡터 pEBXA 를 가지는 세포에 비해 큰 투명환 (clear zone)을 형성하는 것을 확인하였다. 따라서, XaiF 단백질은 그 기능을 나타내는 데 있어서 xynA 유전자의 5'-부분에 위치하는 프로모터를 필요로 하지 않는 것을 알 수 있었다.

실시예 9. RNA-단백질 결합 형성 분석

본 발명에서는 xynA 유전자의 +492에서 +707 서열에 해당하는 205 bp의 DNA 단편을 포함하는 DNA 단편을 서열번호 11의 프라이머 (5'-CCATCACCTTCAGCAATCACGTGAATGC-3')와 서열번호 5의 프라이머 EBPxAR 을 이용한 PCR 로 증폭시키고 플라스미드 벡터 pGEM-T에 클로닝하였다. 상기 제조된 재조합 플라스미드를 PvuII 와 HindIII 의 제한효소를 처리하여 +492에서 +707 서열에 해당하는 205 bp의 DNA 단편을 얻었으며, 이 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pT7T318 에 서브클로닝하여 XaiF 단백질이 부착하는 유전자 구조물을 포함하는 클로닝 벡터 pT₇200RP 을 제작하였다. 동위원소로 표지된 RNA 프로브는 α-³²P- ATP (NEN)과 제한효소 HindIII 로 절단한 플라스미드를 주형으로 하여 MEGAscript T7 키트 (Ambion)를 사용하여 제작하였다. His6 표지가 부착된 재조합 XaiF 단백질은 Ni²⁺-NTA-아가로스를 이용하여 단백질 구조를 유지한 상태 그대로 제조사의 설명에 따라 정제하였다. 구체적으로는 재조합 단백질 XaiF-his6의 과발현을 위해 pETXaiF를 E. coli BL21 (DE3)에　형질전환하였다． 형질전환된 세포의 성장이 증식기에 이르렀을 때, 0.1 mM IPTG을 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 6시간 동안 20℃에서 배양하였다. 원심분리하여　얻은 세포들을 단백질 분해효소 저해제인 1 mM PMSF을 포함하는 세포용해 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 (imidazole))에 부유시킨 다음, 초음파 파쇄기 (SONOPLUS, BANDELIN, Germany)를 이용하여 세포벽을 파쇄하였다. 원심분리 후 얻어진 상층액을 1 ㎖의 Ni-NTA 현탁액과 섞어 4℃에서 １시간 동안 단백질과 결합하도록 반응시켰다. 결합 반응 후에 Ni-NTA agarose beads를 수세 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 50 mM 이미다졸)으로 ４차례 수세한 후, 용리 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 200 mM 이미다졸)으로 결합되어 있던 단백질을 분리해 내었다. 방사선 동위원소로 표지한 RNA 프로브는 85℃에서 2분 동안 열변성시키고 상온까지 천천히 식혀 이차 구조 형성을 가능하게 하였다. RNA-단백질 결합은 여러 농도의 정제된 XaiF-his6 단백질과 RNA 프로브를10 mM 트리스Cl (pH 7.5), 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 ㎍ 효모 tRNA, 10 U 의 RNase 저해제, 10% 글리세롤 및 20 mM DTT 을 포함하는 최종 부피 20 ㎕ 혼합액에 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 조사하였다. 상기 반응액은 5% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 분리하고 방사선 감광 반응으로 관찰하였다.

실시예 10. 자일란 분해효소 유전자의 3'-미번역 부위 조사

본 발명에서는 야생형 xynA 전사체의 3'-UTR 을 서열번호 8의 프라이머 xynAF 및 서열번호 12의 프라이머 XF-CR3 (5'-AGTGTCGACATAGCTCTGGCT-3')을 이용하여 PCR 로 증폭시키고 이로부터 얻은 산물을 제한효소 PvuII 및 SalI 을 처리하여 최종적으로 0.7 kb의 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pGEX4T1 내의 gst 유전자의 3'-말단과 융합시키는 과정으로 재조합 클로닝 벡터 pGST+3U(WT)를 제작하였다. 또한 xynA 전사체 3'-UTR의 2차 구조는 MFOLD 프로그램을 이용하여 예상하고, 스템-루프 구조를 이룰 것으로 예상된 종료 코돈 아래 쪽 22번째 염기로부터 65번째 염기까지 PCR 반응을 진행하여 이 부분에 존재할 구조물 (stem-loop 부분)에 대한 절단 변종을 제작하였다. 구체적으로 22번째 염기로부터 65번째 염기까지의 절단은 서열번호 13의 프라이머 xynA3UF (5'-TTCAATCAAAGGGGAGCTGAC-3') 및 서열번호 14의 프라이머 xynA3U(Δ22-65)R (5'-AATATTAGCGATGAATTGTTA-3')를 이용하고, 40번째 염기로부터 65번째 염기까지의 절단은 서열번호 13의 프라이머 xynA3UF 및 서열번호 15의 프라이머 xynA3U(Δ40-65)R (5'-CCGAACGGCCCTGGAACCAAT-3')를 이용하고, 이로부터 얻은 재조합 클로닝 벡터는 각각 pGST+3U(Δ22-65) 및 pGST+3U(Δ40-65)로 명명하였다.

그 다음 XaiF의 기능에 있어서 xynA 전사체의 3'-UTR 부분에 존재하는 잠재적인 스템-루프 구조의 중요성을 조사하기 위하여, 웨스턴 블럿팅을 실시하여 xynA 전사체의 3'-UTR 부분을 gst 유전자의 3'-말단에 융합시킨 이성구성체에 대한 XaiF 단백질의 효과를 확인하였다 (도 5 참조). 본래의 xynA 유전자와 마찬가지로, xynA 전사체의 3'-UTR 부분이 융합된 gst 유전자의 경우 XaiF 단백질과의 동시 발현에 의하여 유전자 발현율이 약 3배 정도 증가하는 것으로 나타난 반면, xynA 전사체의 3'-UTR 부분이 없는 원래의 gst 유전자 또는 융합된 xynA 3'-UTR 부분 내에서 루프 구조물을 제거한 경우에는 XaiF 단백질과의 동시 발현에 의하여 발현율이 전혀 증가하지 않았다. 따라서, xynA 전사체의 3'-UTR 부분에 존재하는 구조가 XaiF 단백질에 의한 유전자 발현의 조절에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명에서는 XaiF 단백질이 xynA 유전자의 3'-말단에 대한 요구성을 조사하기 위하여 서로 다른 3'-말단을 가지는 xynA 유전자를 PCR 로 증폭시키고 발현 벡터인 pQE30 에 서브클로닝하여 각각 재조합 발현 벡터 pQXA710 및 재조합 발현 벡터 pQXA785를 제작하였다 (도 4 참조). 이 두 구성체에 대하여 XaiF 단백질의 효과를 배지에 형성된 투명환을 측정하여 조사한 결과, 3'-UTR이 존재하는 xynA 구성체에서만 XaiF 단백질와의 동시 발현에 의해서 투명환이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 따라서, XaiF 단백질에 의한 트랜스-작용 (trans-activation) 효과는 xynA 유전자의 3'-UTR에 존재하는 시스-작동인자와의 결합에 통해서만 나타날 수 있는 것을 알 수 있었다.

또한, 유전자의 5'과 3'-부분에 존재하는 구조물은 RNA 분해효소의 공격에 대한 방어막이 될 뿐 아니라 RNA 결합 단백질들의 결합 부위로도 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 xynA의 3'-UTR 부분에 대한 구조 분석 결과, xynA 유전자의 오픈 리딩 프레임의 종료 코돈으로부터 아래쪽 22번째에서 65번째에 해당하는 염기 서열이 하나의 큰 stem-loop 을 이루고 있는 것을 발견하였다. 따라서, XaiF 단백질이 이 구조에 직접적으로 결합하여 xynA 전사체의 안정성을 높일 것이라고 가정하고, RNA-단백질 결합 형성을 분석하였다. 그 결과 3.75 μM 이상 농도의 XaiF-his6 단백질이 존재하는 경우, RNA와 단백질의 결합으로 인해 위쪽으로 올라간 밴드가 확인되었다 (도 4C 참조). 동위원소로 표지하지 않은 프로브는 과량 혼합액에 넣어주었을 경우, 동위원소 표지된 프로브와 경쟁을 하기 때문에 RNA와 단백질 결합을 방해하므로 위쪽으로 올라간 밴드가 사라지는 결과가 생성된다. 따라서, XaiF 단백질이 xynA 전사체의 3'-UTR 부분에 존재하고 있는 잠재적인 구조에 직접적으로 결합하여 xynA 전사체를 안정화시킬 것이라는 점을 입증할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 새로운 mRNA 결합 단백질 XaiF 및 그의 아미노산 서열; mRNA 결합 단백질 XaiF 유전자, 그의 염기서열, 이를 포함하는 발현 벡터들, 이로 형질전환된 미생물 및 이들을 이용한 mRNA 결합 단백질 XaiF 의 제조방법; 상기 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물 (stem-loop), 그의 염기서열, 이를 포함하는 클로닝 벡터 및 이로 형질전환된 미생물; 그리고 mRNA 결합 단백질 XaiF 및 이를 부착하는 유전자 구조물을 이용하여 외래 유전자를 과발현시키 는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 자일란 분해효소 (xylanase) 유전자 xyn A 와 동시에 발현되어 자일란 분해효소의 활성을 증진시키는 트랜스-작동 단백질 인자인 mRNA 결합 단백질 XaiF 는 이를 부착시키는 시스-작동 유전자 구조물 및 다른 강력한 프로모터와 함께 사용하는 경우 외래 유전자의 전사를 증진시키고 그 전사체의 분해를 억제하여 외래 단백질을 대량 생산하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

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Claims

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서열번호 3의 염기서열로 이루어진, mRNA 결합 단백질 XaiF이 부착하는 유전자 구조물 (stem-loop structure).
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제 9 항에 있어서,

외래 유전자의 발현을 조절하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물.
제 9 항의 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물을 포함하는 클로닝벡터.
mRNA 결합 단백질 XaiF 및 제 9항의 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물을 이용하는 외래 단백질의 과발현 방법.
제 13 항에 있어서,

상기 mRNA 결합 단백질이 부착하는 유전자 구조물과 T7 프로모터를 포함하는 강력한 유전자 프로모터를 조합하는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 과발현 방법.