PL185052B1 - Sekwencja kwasu nukleinowego, jej zastosowanie, sekwencja aminokwasowa, mutant komórki gospodarza, oraz sposób wytwarzania proteiny lub polipeptydu - Google Patents

Sekwencja kwasu nukleinowego, jej zastosowanie, sekwencja aminokwasowa, mutant komórki gospodarza, oraz sposób wytwarzania proteiny lub polipeptydu

Info

Publication number
PL185052B1
PL185052B1 PL96351185A PL35118596A PL185052B1 PL 185052 B1 PL185052 B1 PL 185052B1 PL 96351185 A PL96351185 A PL 96351185A PL 35118596 A PL35118596 A PL 35118596A PL 185052 B1 PL185052 B1 PL 185052B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
sequence
acid sequence
nucleic acid
amino acid
gene
Prior art date
Application number
PL96351185A
Other languages
English (en)
Inventor
De┴Graff┴Leendert┴H.
Van┴Den┴Broeck┴Henriette┴C.
Visser┴Jacob
Original Assignee
Danisco Ingredients As
Danisco Ingredients As Danisco As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Danisco Ingredients As, Danisco Ingredients As Danisco As filed Critical Danisco Ingredients As
Publication of PL185052B1 publication Critical patent/PL185052B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1027—Mutagenizing nucleic acids by DNA shuffling, e.g. RSR, STEP, RPR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01037—Xylan 1,4-beta-xylosidase (3.2.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01099—Arabinan endo-1,5-alpha-L-arabinosidase (3.2.1.99)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1 Sekwencja kwasu nukleinowego xlnR kodujaca produkt ekspresji xylR odpowiadajacy kodujacej sekwencji kwasu nu- kleinowego wedlug sekwencji id nr 9 lub jej sekwencja równowazna. 22 Mutant komórki gospodarza z wybiciem, znam ienny tym , ze zawiera delecje lub mutacje sekwencji kodujacej regu- lator, przy czym regulator jest regulatorem aktywujacym podatnej na indukcje sekwencji wzmacniacza lub aktywatora, 1 re- gulator aktywatora uczestniczy w metabolizmie, a produkt ekspresji genu kodujacego regulator posiada miejsce wiazace na genie docelowym, korzystnie regulator uczestniczy w czesci metabolizmu z kaskada enzymów lub petla sprzezenia zwrotne- go lub wielokrotnymi petlami sprzezema zwrotnego. 24. Sposób wytwarzania heterologicznej lub homologicznej proteiny lub polipetydu, wolnej od ubocznych aktywnosci ksylanolitycznych, polegajacy na hodowli w znany sposób mutanta komórki gospodarza z wybiciem oraz na otrzymaniu uzy- skanej w ten sposób heterologicznej lub homologicznej proteiny, przy czym mutant komórki gospodarza z wybiciem zawiera delecje lub mutacje sekwencji kodujacej regulator, przy czym regulator jest regulatorem aktywujacym podatnej na indukcje sekwencji wzmacniacza lub aktywatora, i regulator aktywatora uczestniczy w metabolizmie, a produkt ekspresji genu ko- dujacego regulator posiada miejsce wiazace na genie docelowym, korzystnie regulator uczestniczy w czesci metabolizmu z kaskada enzymów lub petla sprzezema zwrotnego lub wielokrotnymi petlami sprzezema zwrotnego 26 Zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego x lnR kodujacej produkt ekspresji xylR odpowiadajacy kodujacej sek- wencji kwasu nukleinowego wedlug sekwencji id nr 9 lub jej sekwencji równowaznej do nadekspresji genu docelowego droga ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego w komórce gospodarza zawierajacej gen docelowy zwiazany operacyjnie z normalnie zwiazanym z genem docelowym promotorem regulatora aktywujacego podatnej na indukcje sekwencji wzmac- niacza lub aktywatora, kodowanej przez sekwencje kwasu nukleinowego x ln R kodujaca produkt ekspresji xylR. przy czym jezeli gen docelowy 1 sekwencja kwasu nukleinowego xlnR kodujaca produkt ekspresji xylR sa rodzime wzgledem komórki gospodarza, to sekwencja xlnR kodujaca produkt ekspresji xylR jest obecna w zwielokrotnionych kopiach w porównaniu z komórka gospodarza typu dzikiego PL PL PL

Description

Przedmiotowy wynalazek dotyczy dziedziny mutacji drobnoustrojów oraz wydzielania mutantów. Wynalazekjest ukierunkowany zwłaszcza na uzyskiwanie mutantów metabolicznych w prosty, bezpośredni i specyficzny sposób. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku możliwe jest uzyskiwanie pożądanych mutantów nie zawierających rekombinacyjnego DNA, ułatwiając przez to ich inkorporację do produktów spożywanych i stosowanych przez ludzi dzięki krótszej procedurze legislacyjnej. Sposób według wynalazku obejmuje przypadkową mutację oraz specyficzną selekcję pożądanego mutanta metabolicznego. Sposób można realizować automatycznie, a taki mutant może wykazywać albo podwyższoną albo obniżoną aktywność metaboliczną. Specyficzność sposobu polega na stosowanych warunkach selekcji. Uzyskiwane mutanty poddawane są mutacji w ich funkcji regulatorowej względem określonej części metabolizmu. W zależności od warunków selekcji można wydzielić mutanty z derepresją, które będą dawać zatem nadekspresję lub można znaleźć mutanty, w których wyeliminowanajest szczególna metaboliczna aktywność enzymatyczna. Staje się zatem możliwe wyeliminowanie niepożądanej metabolicznej aktywności metabolicznej albo zwiększenie pożądanej aktywności metabolicznej.
Sposoby według wynalazku można odpowiednio realizować na dobrze scharakteryzowanych materiałach, które sąjuż szeroko stosowane w przemyśle. Mutanty nadekspresyjne można na przykład wykorzystywać jako główne źródło enzymów wytwarzających olbrzymie ilości produktów przy niskich kosztach. Mutowany szczep wyjściowy będzie zależeć od szeregu czynników znanych specjalistom w tej dziedzinie, takich jak wydajne wydzielanie protein, dostępność procesów produkcyjnych na wielką skalę, doświadczenie z przetwarzaniem współprądowym fermentacyjnej pożywki bulionowej, obszerna wiedza genetyczna oraz pewność korzystania z bezpiecznych organizmów.
W innym aspekcie wynalazku stało się możliwe ustalenie i identyfikacja specyficznych funkcji regulujących gen metaboliczny.
Dotychczasowy sposób wytwarzania mutantów, który był stosowany na skalę przemysłową i mógł być zautomatyzowany, był sposobem mutowania bez selekcji i następującej potem analizy mutantów. Alternatywny sposób z selekcją wymagał zawsze etapu wzbogacania, a następnie selekcji na bazie hodowli lub bez hodowli. Oznaczało to usunięcie najpierw wielkiej liczby niepożądanych mutantów. Istniejący sposób dawał w wyniku wielką liczbę mutantów o nieprawidłowym genotypie, a zatem dawał niską selektywność.
Kilka lat temu firma Gist-Brocades opracowała i wprowadziła swobodną technologię z genem znacznikowym pluGBug dla Aspergillus niger. W GIST 94/60, strony 5-7, S. Selten podaje opis wektora dla Aspergillus niger, zawierającego obszary regulatorowe glukoamylazy dla uzyskania wysokich poziomów ekspresji genu, który je reguluje. Jako obszar regulatorowy zostało to wybrane na podstawie naturalnie wysokiej ekspresji glukoamylazy w naturalnym Aspergillus niger. Korzystając z techniki rekombinacyjnego DNA obszar regulatorowy został właściwie związany z przedmiotowym genem jako znacznik selekcyjny Aspergillus AmdS, umożliwiając selekcję pożądanych transformantów po: przeniesieniu kasety ekspresji do gospodarza A. niger. Wiele kopii kaset ekspresji integruje się wtedy z genomem A. niger. Wytwarzany enzym, opisany w artykule, był fitazą. Z kolei można otrzymać generacje transformantów bez znacznika. W znanym układzie generacja szczepów rekombinacyjnych bez znacznika jest aktualnie procesem dwustopniowym, ponieważ gen amdS może być wykorzystany dwukierunkowo. Po pierwsze, w cyklu transformacyjnym dla wybrania wyjściowych transformantów, mających daną kasetę ekspresji, a następnie w drugim cyklu przez wybranie przeciwstawne dla końcowego szczepu rekombinacyjnego, który utracił gen amdS. Gem amdS koduje enzym, który jest zdolny do przekształcenia acetamidu w amoniak i octan. Acetamid stosowany jestjako jedyne źródło N w cyklu transformacyjnym. W cyklu rekombinacyjnym jako selektywne źródło N stosowany jest fluoroacetamid, z drugim odpowiednim źródłem N, takimjak na przykład mocznik. Fluorooctanjako produkt jest toksyczny dla innych komórek i rozmnażanie jest ograniczone tylko do tych komórek, które utraciły gen amdS przez wewnętrzną rekombinację na replikatach DNA w kasecie ekspresji. Największy problem w znanym sposobie polega na fakcie, że uzyskany szczep jest szczepem rekombinacyjnym. Pożądana charakterystyka musi być wprowadzona przez inkorpo185 052 rację „obcego” kwasu nukleinowego, który może wydłużyć wymagany do tego czas, a czasami nawet zapobiec zatwierdzeniu legislacyjnemu. Sposób nie nadaje się ponadto do opracowania szczepów z poprawionym metabolizmem. Dzięki, obecności kaskad enzymatycznych i wielokrotnych pętli sprzężenia zwrotnego zwykła inkorporacja poszczególnego genu nie zawsze może prowadzić do pożądanego wyniku. Nadprodukcja szczególnego produktu, jeżeli jest zakodowana, może być skompensowana przez towarzyszącą nadekspresję innego produktu lub wyregulowana in minus, a zatem z anulowaniem skutku inkorporacji genu. Inkorporacja DNA będzie zatem często przypadkiem „prób i błędów” z inkorporacją pożądanego kwasu nukleinowego, dającego się oddzielać, przy czym nie musi być jednocześnie uzyskany pożądany fenotyp. Utrata genu znacznikowego jest ponadto procesem samorzutnym, który wymaga czasu, i nie daje gwarancji wystąpienia u wszystkich transformantów zawierających kasetę kwasu nukleinowego.
Wiadomo, że poprawienie szczepu mikroorganizmów można osiągnąć przez modyfikację organizmu na różnych poziomach. Polepszenie ekspresji genu na poziomie transkrypcji uzyskuje się głównie przez użycie silnego promotora, powodując wysoki poziom mRNA kodujący przedmiotowy produkt, w połączeniu ze wzrostem dawki genu kasety ekspresji. Chociaż może to prowadzić do wzrostu utworzonego produktu, to taka strategia może być w zasadzie niekorzystna. Na skutek obecności wielokrotnych kopii promotora ilość regulatora transkrypcyjnego kierującego transkrypcją może stać się ograniczona, co daje w wyniku zmniejszoną ekspresję genu docelowego lub genów regulatora. Zaobserwowano to w przypadku szczepów Aspergillus nidulans, zawieraj ących wielką liczbę kopii genu amdS (Kelly and Hynes, 1987; Andrianopoulos and Hynes, 1988) oraz w przypadku szczepów A. nidulans, zawierających kopie wielokrotne genu heterologicznego pod działaniem promotora alcA (Gwynne et al., 1987). W tym ostatnim przypadku przyrost genu alcR, kodującego regulator transkrypcyjny genu aleA, daje w wyniku wzrost ekspresji kasety ekspresji (Gwynne etal, 1987; Davies, 1991). Analogicznie do skutków odkrytych w Aspergillus nidułans, w Aspergillus niger podobne ograniczenia obserwowano stosując promotor glukoamylazowy (glaA) dzięki ograniczeniu regulatora transkrypcyjnego kierującego transkrypcją (Verdoes et al, 1993; Verdoes et al., 1995, Verdoes, 1994). Klonowanie genu regulatorowego glaA było utrudnione w znacznym stopniu przez brak strategii selekcji.
W przypadku ekspresji genu arabinazy stwierdzono wyraźną konkurencję dla regulatora transkrypcyjnego po zwiększeniu dawki genu arabinazy (Flipphi et al., 1994), co odzwierciedla ograniczenie regulatora transkrypcyjnego, powszechne u wszystkich trzech badanych genów
Oprócz wyżej wymienionych niedogodności aktualnego stanu techniki, wydzielanie i oznaczenie genów regulatorowych było dotychczas nadzwyczaj trudne na skutek faktu, że większość protein regulatorowych istnieje w bardzo niskich stężeniach w komórce, co utrudnia określenie, która substancja jest odpowiedzialna za regulację. Produkt regulatorowy nie jest ponadto w ogólności enzymem i może być tylko odsiany dla prób wiązania DNA, co utrudnia oznaczenie i wydzielenie i jest bardzo czasochłonne. Zatem do strategii stosowanych na przykład przy klonowaniu genów regulatorowych należy:
- komplementacja, która jednakże wymaga dostępnego mutanta,
- oczyszczanie proteiny regulatorowej, co jest nadzwyczaj uciążliwe, ponieważ proteinę można scharakteryzować tylko jej właściwościami wiązania DNA. Niektóre z takich oczyszczań obejmują chromatografię z powinowactwem wykorzystując związany fragment DNA jako matrycę. Jedna z niedogodności takich oczyszczań polega na tym, że często więcej niż jedna proteina wiąże się zarówno specyficznie, jak i niespecyficznie, z fragmentem,
- oparcie się na ugrupowaniu genów, w którym gen regulatorowy jest genomicznie zgrupowany z genami strukturalnymi, które z kolei są regulowane przez swój produkt genowy, na przykład skupisko prn lub ale.
Zgodnie z wynalazkiem opracowano układ, który można wykorzystać do skrócenia długości czasu koniecznego do rejestracji mutantów drobnoustrojów zdolnych do nadprodukcji poszczególnych pożądanych enzymów. Układ przezwycięża problem wielokrotnych przypadkowych insertów „obcego” kwasu nukleinowego, a zwłaszcza selekcyjnego genu znacznikowego. Do uzyskania pożądanej charakterystyki nie wymaga to nawet obcego kwasu nukleinowego. Uzyskany mutant szczepu me
185 052 zawiera heterologicznego kwasu nukleinowego. Układ według wynalazku umożliwia ponadto specyficzną mutację metabolizmu i nie jest konieczna wielka liczba doświadczeń prowadzących do pożądanych fenotypów.
Przedmiotowy wynalazek ukierunkowany jest na kasetę kwasu nukleinowego, zawierająca sekwencję kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym wymieniona kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawowąjednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz wymieniona kaseta zawiera dalej podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawową jednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora pojawia się ekspresja dwukierunkowego znacznika kodującego sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym wymieniona podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi z genu związanego z aktywnością części metabolizmu oraz podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi z genu związanego z metabolizmem.
Podstawowa jednostka transkrypcyjna zawiera każdy element niezbędny do transkrypcji genu, z którym transkrypcja jest związana. Może ona zawierać promotor z lub bez sekwencji wzmacniacza. Podstawowa jednostka transkrypcyjna musi być operatywna w organizmie gospodarza. Podstawowajednostka transkrypcyjna musi być ulokowana w taki sposób, aby była operatywnie związana z genem znacznika dwukierunkowego, aby była możliwa jego transkrypcja. Znane sąodpowiednie przykłady szeregu komórek gospodarza, takich jak na przykład Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces, Kluyveromyces i Lactobacillus. W przykładach podstawowa jednostka transkrypcyjna tGOX pochodząca z jednostki transkrypcyjnej goxC Aspergillus niger (Whittington et al., 1990) zapewnia dające się stosować rozwiązanie wynalazku.
Podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora normalnie uczestniczy korzystnie w regulacji kaskady enzymatycznej lub w części metabolizmu z jedną lub więcej niż jedną pętlą sprzężenia zwrotnego. W dalszym rozwiązaniu wynalazku kaseta kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera podatnąna indukcję sekwencj ę wzmacniacza lub aktywatora, która normalnie uczestniczy w metabolizmie węgla. Odpowiednimi przykładami podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora do stosowania w kasecie kwasu nukleinowego według wynalazku są Przeciwprądowe Sekwencje Aktywujące (UAS), znajdujące się na każdym z następujących fragmentów kwasów nukleinowych:
+++ - fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA, kodujących odpowiednio arabinofuranoksydazę A, arabinofuranoksydazę B i endoarabinazę,
- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę,
- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR i aleA,
- fragment pochodzący z genu CUP1,
- fragment pochodzący z genu PH05,
- fragment pochodzący z genu GALI, GAL7 lub GALIO,
- fragment pochodzący z genu xlnA,
- fragment pochodzący z genu pgall.
Przykładowo framenty te mogą pochodzić z następujących organizmów, jak opisano w literaturze:
- fragment pochodzący z promotoró w genów abfA, abfB i abnA, kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofuranozydazę B i endoarabinazę z Aspergillus niger (Flipphi M.J.A. et al., 1994),
- fragment pochodzący z genu glaA, kodującego glukoamylazę z Aspergillus niger (Fowler T. et al., 1990),
- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR z Aspergillus nidulans (Felenbok B. et al., 1994), fragment pochodzący z genu CUP1 z Saccharomyces cerevisiae (Hinnen A. et al,. 1995),
-fragment pochodzący z genu PH05 z Saccharomycescerevisiae(HinnenA. etal., 1995),
185 052
- fragment pochodzący z genów GALI, GAL7, lub GALIO z Saccharomyces cerevisiae (Hinnen A. et al., 1995),
- fragment pochodzący z genów xlnA, xlnB, xlnC lub xlnD z Aspergillus nidulans, fragment pochodzący z genów xlnB, xlnC lub xlnD z Aspergillus niger (patrz w jakimkolwiek miejscu tego opisu),
- fragment pochodzący z genów xlnA lub xlnD z Aspergillus tubigensis (de Graaff et al., 1994),
- fragment pochodzący z genu pgall z Aspergillus niger (patrz w jakimkolwiek miejscu w tym dokumencie).
W przykładach sekwencja UAS xlnA jest zilustrowana w dającym się stosować rozwiązaniu wynalazku.
Znacznik dwukierunkowy jest określeniem uznanym w technice. Obejmuje on znacznik selekcyjny, który można wykorzystać do wykazania obecności lub braku ekspresji na podstawie stosowanych warunków selekcji. Korzystny znacznik dwukierunkowy nadaje selektywność na podstawie letalności lub nadzwyczajnego zmniejszenia rozwoju. Możliwym rozwiązaniem wynalazku jest także alternatywnie różne zabarwienie kolonii po ekspresji lub braku ekspresji genu znacznika dwukierunkowego. Odpowiednie przykłady znanych znaczników dwukierunkowych można znaleźć w grupie obejmującej geny facb, NiaD, AmdS, Canl, Ura3, Ura4 i Pyr A. Wykazano w ten sposób, że homologii Pyr A oznaczone są w literaturze jako PyrG, Ura3, Ura4, Pyr4 i Pyrl. Geny te można znaleźć między innymi w następujących organizmach: gen facB w Aspergillus nidulans, gen NiaD w Aspergillus niger, gen NiaD w Aspergillus oryzae, gen AmdS w Aspergillus nidulans, gen Canl w Schizosaccharomycespombe, gen Ura3 w Saccharomyces cerevsiae, gen Ura4 w Saccharomyces pombe oraz geny PyrA w Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces.
Selekcja mutantówfacB, tojest z fenotypem negatywnym, może odbywać się na podstawie odporności na fluorooctan. Selekcja na FAC B*, to jest na fenotyp pozytywny, może odbywać się na octanie jako źródle węgla (Katz, M.E. and Hynes M.J., 1989). Selekcja mutantów niaD, to jest z fenotypem negatywnym, może odbywać się na podstawie odporności na chlorany. Selekcja na NIA D*, to jest na fenotyp pozytywny, może odbywać się na azotanie jako źródle azotu (Unkles S.E. et al., 1989a i 1989b). Selekcja mutantów amdS, to jest z fenotypem negatywnym, może odbywać się na podstawie odporności na fluoroacetamid. Selekcja na AMD S*, to jest na fenotyp pozytywny, może odbywać się na acetamidzie jako źródle azotu. Ponieważ większość grzybów nie ma genu kodującego acetamidazę, to funkcja AMD S jest dla takich grzybów znacznikiem dominującym. Został on wykorzystany jako taki między innymi w Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis, Aspergillus var. awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus oryzae, Aspergillus sydowii, Aspergillus japonicus, Aspergillus aculeatus, szczepy Penicillium, szczepy Trichoderma (Kelly and Hynes, 1985,. oraz Bailey et al., 1991). Selekcja mutantów canl, to jest z fenotypem negatywnym, może odbywać się na podstawie odporności na kanavaninę, przy czym kanavanina jest analogiem argininy. Selekcja na CAN 1*, to jest na fenotyp pozytywny, może odbywać się na argininie (Ekwall K., 1991). Gen kodujący 5 ’-P-dekarboksylazę orotydyny znany jest jako pyrA,pyrG lub ura3. Ustalono to dla różnych organizmów, to jest Aspergilli, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces. Selekcja mutantów pyrA, to jest z fenotypem negatywnym, opisanymi także jako pyrG lub ura3, może odbywać się na podstawie odporności na kwas fluoroorotowy. Selekcja na PYR A* i jego homologii, to jest na fenotyp pozytywny, może być dokonywana na podstawie prototrofii urydynowej lub uracylowej. W przykładach pyrA z Aspergillus niger (Wilson et al., 1988)) jest przedstawiony w możliwym do stosowania rozwiązaniu wynalazku. Inne przykłady są znane specjalistom i mogą być łatwo znalezione w literaturze. Stosowany znacznik selekcyjny zależy między innymi od rautowanego organizmu gospodarza oraz innych czynników wtórnych, takich jak łatwość selektywności, niezawodność oraz koszt stosowanych substratów.
Kaseta kwasu .nukleinowego inkorporowana do wektora transformacji lub ekspresji jest także objęta zakresem niniejszego wynalazku. Zakresem tym objęte jest również wykorzystanie
185 052 takiej kasety lub wektora kwasu nukleinowego w sposobach transformacji i selekcji, a zwłaszcza w sposobach wytwarzania mutantów wykazujących nadekspresję enzymu uczestniczącego w określonej części metabolizmu, w sposobach wytwarzania mutantów wykazujących zmniejszoną lub zahamowaną ekspresję enzymu uczestniczącego w określonej części metabolizmu, jak również w sposobach oznaczania i wydzielania genów regulatorowych uczestniczących w określonej części metabolizmu.
Zatem zakresem niniejszego wynalazku objęty jest sposób wytwarzania i selekcji szczepu mutanta drobnoustroju, przy czym mutacja wzmacnia określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, polegający na:
- wprowadzeniu do gospodarza kasety kwasu nukleinowego według któregokolwiek z poprzedzających zastrzeżeń, przy czym przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego,
- hodowaniu uzyskanych drobnoustrojów w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora na kasecie kwasu nukleinowego jest normalnie aktywna oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję oraz w których ekspresja wymienionego znacznika dwukierunkowego prowadzi korzystnie do rozwoju, a brak ekspresji do braku rozwoju,
- selekcji transformanta, który ma fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w wyżej wspomnianych warunkach hodowli,
- poddawaniu wybranego transformanta w znany sobie sposób mutagenezie,
- hodowaniu uzyskanego szczepu w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji-znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, i w obecności ulegającego metabolizmowi substratu dla określonej części metabolizmu, oraz
- wybraniu szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w warunkach selekcji, które dla niezmutowanego szczepu macierzystego, zawierającego kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego.
W odpowiednim rozwiązaniu tego sposobu
- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS) pochodzącą z genu xlnA,
- określona część metabolizmu jest ksylanolityczną częścią metabolizmu węgla,
- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza i aktywatora jest normalnie aktywna i w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, obejmuje hodowlę w obecności induktora sekwencji UAS i przy braku repressora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla,
- selekcja transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający genowi znacznika dwukierunkowego odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,
- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekpresji znacznika dwukierunkowego, to jest w obecności repressora sekwencji UAS oraz w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla oraz ewentualnie także w obecności induktora ekwencji UAS,
- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w warunkach selekcji, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają brak ekspresji znacznika dwukierunkowego.
W dalszym rozwiązaniu tego sposobu
- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyr A,
185 052
- przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu pyrA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego,
- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, obejmuje hodowlę w warunkach, w których wzmacniacz lub aktywator jest normalnie aktywny, to jest w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora oraz przy braku repressora wzmacniacza lub aktywatora, oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję,
- selekcja transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w wyżej wspomnianych warunkach hodowli,
- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta, dla określonej części metabolizmu, odbywa- się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora wzmacniacza lub aktywatora albo w obecności repressora wzmacniacza lub aktywatora oraz w obecności podatnego na metabolizm substratu,
- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w warunkach selekcji, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora wzmacniacza lub aktywatora albo w obecności repressora wzmacniacza lub aktywatora.
Wymienione wyżej rozwiązania mogą być odpowiednio scharakteryzowane przez
- kasetę kwasu nukleinowego, zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA,
- gospodarza nie wykazującego fenotypu pyrA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego,
- podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora, która jest sekwencjąUAS pochodzącą od genu xlnA,
- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polegający na hodowli w warunkach, w których sekwencja UAS jest normalnie aktywna, to jest w obecności induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, oraz przy braku repressora sekwencji UAS, to jest przy braku glukozy, oraz w innych warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, selekcję transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywającą się w wyżej wymienionych warunkach hodowli,
- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta, odbywający się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, albo w obecności repressora sekwencji UAS, to jest w obecności glukozy, oraz w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla,
- selekcję szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywającą się w warunkach selekcji, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, albo w obecności repressora sekwencji UAS, to jest w obecności glukozy.
Korzystnym zakresem wynalazku objęty jest ponadto sposób otrzymywania i selekcji nierekombinacyjnego mutanta szczepu drobnoustroju, przy czym wymieniona mutacja wzmac10
185 052 nia określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, a sposób polega na przeprowadzeniu etapów sposobu według wynalazku opisanych w poprzednich ustępach, a następnie na wyeliminowaniu w znany sobie sposób kwasu nukleinowego z wprowadzonej kasety kwasu nukleinowego.
Jak już omówiono poprzednio sposób wytwarzania i selekcji mutanta szczepu drobnoustroju, przy czym wymieniona mutacja hamuje określoną część metabolizmu węgla w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, obejmuje
- wprowadzenie do gospodarza kasety kwasu nukleinowego według wynalazku, jak opisano wyżej, przy czym przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego, a wykazuje aktywność typu charakteryzującego określoną część metabolizmu, który ma być zmniejszony lub zahamowany,
- hodowlę uzyskanego drobnoustroju w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora kasety kwasu nukleinowego jest normalnie aktywna, w których brak ekspresji znacznika dwukierunkowego kasety kwasu nukleinowego daje w wyniku rozwój i detekcję uzyskanego drobnoustroju oraz w których ekspresja wymienionego znacznika dwukierunkowego jest letalna lub hamuje silnie rozwój,
- selekcję transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w wyżej wspomnianych warunkach hodowli,
- poddanie wybranego transformanta mutagenezie w znany sobie sposób,
- hodowlę szczepu uzyskanego z mutagenezy w warunkach akceptowanych dla wzrostu szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w obecności podatnego na metabolizm substratu i w warunkach, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z albo bez kasety kwasu nukleinowego,
- selekcję szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, który wykazuje fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu w warunkach selekcji, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z albo bez kasety kwasu nukleinowego, takiej jak zmniejszona strefa rozjaśnienia po rozwoju na substracie, które służyjako substrat dla części metabolizmu, dla którego aktywność ma być zmniejszona lub zahamowana.
W dalszym rozwiązaniu takiego sposobu
- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS) pochodzącą z genu xlnA,
- określona część metabolizmu jest ksylanolityczną częścią metabolizmu węgla,
- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, obejmuje hodowlę przy braku repressora sekwencji UAS kasety kwasu nukleinowego i w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla, a zwłaszcza także w obecności induktora sekwencji UAS,
- selekcja transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w wyżej wymienionych warunkach hodowli,
- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które nie są akceptowane dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w obecności urydyny i kwasu fluoroorotowego, oraz w warunkach, które w zmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dająw wyniku aktywność określonej części metabolizmu węgla, to jest w obecności induktora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla oraz przy braku repressora sekwencji UAS, na przykład w obecności sorbitu lub alternatywnego, nierepresyjnego źródła węgla w połączeniu z induktorem, takim jak ksylan lub D-ksyloza,
185 052
- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, który wykazuje fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu węgla, odbywa się w warunkach selekcji, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu węgla w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z albo bez kasety kwasu nukleinowego, takąjak zmniejszona strefa rozjaśnienia po rozwoju na ksylanie.
Podaje się przykład stosowania sposobu według poprzedniego ustępu, w którym
- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyr A,
- przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu PYRA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego
- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których dwukierunkowy znacznikpyrA daje ekspresję, obejmuje hodowlę w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora i przy braku repressora wzmacniacza lub aktywatora oraz w warunkach, w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję,
- selekcja transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego pyrA, odbywa się w wyżej wymienionych warunkach hodowli,
- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, tojest o fenotypie PYRA', w warunkach, które nie są akceptowane dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie PYRA, takim jak fenotyp odpowiadający ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w warunkach obejmujących obecność urydyny i kwasu fluoroorotowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku aktywność określonej części metabolizmu, to jest w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora i podatnego na metabolizm substratu oraz przy braku repressora aktywatora lub wzmacniacza albo alternatywnego, nierepresyjnego substratu w połączeniu z induktorem.
W korzystnym rozwiązaniu sposób według poprzedzających dwóch ustępów jest sposobem, w którym
- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA,
- przed .wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu PYRA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego,
- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest sekwencją UAS pochodzącą z genu x In A,
- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję, obejmuje hodowlę w warunkach, w których sekwencja UAS jest normalnie aktywna, to jest w obecności induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, oraz przy braku repressora sekwencji UAS, to jest przy braku glukozy, oraz w warunkach, w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję,
- selekcja transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego pyrA, odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,
- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w warunkach, które nie są akceptowane dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie PYRA*, takim jak fenotyp odpowiadający ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w warunkach obejmujących obecność urydyny i kwasu fluoroorotowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dająw wyniku aktywność określonej części metabolizmu węgla, to jest w obecności induktora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla oraz przy braku repressora se12
185 052 kwencji UAS, na przykład w obecności sorbitu lub alternatywnie nierepresyjnego źródła węgla w połączeniu z induktorem, takim jak ksylan lub D-ksyloza,
- selekcie szczepu u^/skunego z etapu hodowli po mutagenezie, l^t^ciry wykazuje feuotyp odpowiadający zmnisjszonsj lub zahamowanej aktywności aOrsślansj części metabolizmu węgla, odbywa się w warunkach selekcji, które nzpswnizją emnisjseaną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu węgla w porównaniu z nisemutawanym gaspaPzrnem, albo z lub bez kasety kwasu nukleinowego, taką jak emnisjsnanz strefa ranjzśnisniz po rozwoju na ksylanie.
Opisane wyżej sposoby można stosować korzystnie za pomocą gospadzrnz, charakteryzującego się tym, że przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego zawiera on kwas nukleinowy odpowiadający przynajmniej częściowo sekwencji kwasu nukleinowego kodującej znacznik dwukierunkowy, przy czym stopień tej odpowiedniości jest wystarczający dla umożliwieniz homologicznej rekombinacji w chromosomie nnzcnnikz dwukierunkowego kodującego Owzs nukleinowy zawarty na kasecie kwasu nukleinowego. Taki aspekt rozwiązania zapewnia integrację kasety kwasu nukleinowego w z góry określonym miejscu.
W daszym korzystnym rozwiązaniu kasetę kwasu nukleinowego inΟarparujs się w wielokrotnych kopiach w celu zzpeunisnia, aby etap mutagenny nie powodował reaktywacji znacznika dwukierunkowego, ponieważ dałoby to nieprawidłowe wyniki przy wykrywaniu negatywnych fenotypów znacznika oraz zmnisjszsnis liczby pazata'unych fenotypów znacznika.
W korzystnych rozwiązaniach wynalazku została skonstruowana taka kaseta Owzsu nukleinowego, którą można wykorzystać w sposobie wytwarzania mutantów dających nzPsOsprssję enzymu zawartego w określonej części metabolizmu, w sposobie wytwarzania mutantów wykazujących zmnisjseaną lub zahamowaną ekspresję enzymu zawartego w określonej części metabolizmu oraz w sposobie oznaczania i wePzielzniz genów regulatorowych zawartych w określonych częściach metabolizmu. W szczególności przedstawiono układ wykorzystywany dla mutantów przy metabolizmie węgla. W przeOłzPzch opisane sąmutanty ze zmienioną charakterystykąOsylznalityceną, jak również mutanty arabinazows i paligalzOturanzzaws prowadzące do mutantów w szlakach arabmalitacznech i peOtanalitycznech. Jako mutawzne szczep w przykładach wykorzystuje się Aspegillus, jakkolwiek wystarczy jakikolwiek inny drobnoustrój akceptowany w przemyśle. Do przykładów takich organizmów należą Saccharomycesg na pzzyklad Saccharomyces cerevisiae i Saccharomycespombe, Aspergillus, na przykład Aspergillus nidulans, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Kluyveromyces oraz Lactobacillus. Inne prneΟłzdy są oczywiste PIz fachowców z tej dziedziny i pewna ich liczba będzie pojawiać się w opisie, w ten sposób można już wywarzać szczep dający nzPsΟspresję lub ekspresję zerową.
Można również przeprawzpnzć identyfikację arze określać sekwencję regulatora aktywującego podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora, jeżeli w szczególności taki regulator aktywujący objętyjest metabolizmem, a zwłzseceajsżeli taki regulator aktywujący objęty jest częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego. Sekwencja kwasu nukleinowego takiego genu regulatorowego może być następnie wykorzystana Po wzmocnienia ekspresji genów docelowych, przy czym taki gen docelowy jest genem, który regulowany jest genem regulatorowym. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku taki gen docelowy ma centrum wiążące dla produktu ekspresji genu regulatorowego. Połączenie promotora związanego normalnie z genem docelowym regulatora z genem regulatorowym w kasecie ekspresji, przy czym wymieniony promotor związany jest operacyjnie z sekwencją homologiczną lub hstsrolagiczną kodującą poddawaną ekspresji proteinę lub peptyd homologiczny lub hetsralagiceny, może prowadzić Po kasety ekspresji nadzwyczaj użytecznej pla ekspresji homologicznych, z nawet hsteralagicznech protein lub peptypów. Regulator koPujący gen może enzjdawzć się pod kontrolą swojego raPeimsga promotora lub jakiegokolwiek innego promotora, który może dawać ekspresję w wybranej komórce gaspaPerza. Promotor może być konstytutywny lub ulegać indukcji, co jest bardziej pożądane Pla szczególnego procesu produkcyjnego. Tzkz kombinacyjne kesetz ekspresji objęta jest zakresem wynalazku, ponieważ tworzy wektor lub plazmid ezwisrzjąca teką kasetę. Stopień ekspresji nie
185 052 jest już ograniczony obecnością zbyt małej ilości regulatora, a zatem stopień ekspresji genu poddawanego ekspresji jest o wiele wyższy niż w odpowiedniej komórce gospodarza, w której gen daje ekspresję pod kontrolą tego samego promotora lecz bez dodatkowej obecności genu regulatorowego. Taką zwiększoną ekspresję uzyskuje się korzystnie w komórkach organizmów zawierających normalnie składniki części szlaku metabolicznego, na którą się oddziaływuje. Odpowiednimi komórkami gospodarza są komórki filamentowe grzybów. Inkorporacja kombinowanej kasety ekpresji typu opisanego wyżej w komórce gospodarza zawierającej gen docelowy regulatora może prowadzić do zwiększonej ekspresji genu docelowego lub zwiększonej ekspresji genów docelowych, jeżeli obecne są wielokrotne geny docelowe. Gen docelowy jest korzystnie endogeniczny względem komórki gospodarza. Komórka gospodarza zawierająca kombinacyjną kasetę ekspresji także objęta jest zakresem wynalazku.
W przykładach podaje się sekwencję kwasu nukleinowego xlnR regulatora ksylanolitycznego szlaku xylR. Ustalono, że geny docelowe tego regulatora zawierają geny xlnA, xlnB, xlnC i xlnD, jak również gen axeA. Przedstawiono wzrost ekspresji ksylanazy A i może on służyć do wykazania ogólnej przydatności działania xylR na gen docelowy regulatora xylR. W tej dziedzinie znana jest pewna liczba sekwencji zawierających wspomniane geny xlnA, B, C i D. Taka informacja jest łatwo dostępna dla specjalistów w tej dziedzinie i należy ją uważać za włączoną do wynalazku. Promotory o szczególnej przydatności do stosowania w połączeniu z kwasem nukleinowym xlnR mogą być wybrane z xlnA, xlnB, xlnC i xlnD. Wykorzystanie promotora axeA także stanowi odpowiednie rozwiązanie wynalazku. Promotory znane są specjalistom w tej dziedzmie i uważa się je za włączone do wynalazku. Promotor xlnA opisanyjest przez de GraafFa et al., 1994. Promotor xlnB został opisany przez Kinoshita et al., 1995. Promotor xlnD został opisany w patencie europejskim nr EP 95201707.7 i włączony jest do Listy Sekwencji w sekwencji o sekwencji id nr 8 niniejszego dokumentu. Sekwencje promotorów można albo łatwo zsyntezować na podstawie znanych sekwencji albo wyprowadzić w znany sobie sposób z zawierających je organizmów lub wektorów. Tam, gdzie stosowane jest określenie promotor, wzmacniacz lub regulator, można naturalnie stosować fragment zawierający promotor, wzmacniacz lub regulator tak długo dopóki nie jest naruszona ich operacyjność. W konstrukcjach według wynalazku nie ma potrzeby włączania tylko odnośnej sekwencji i mogą być obecne także wszelkie inne mezakłócające sekwencje oskrzydlające. Przedmiotowym wynalazkiem objęta jest nie tylko sekwencja kwasu nukleinowego xlnR kodująca produkt ekspresji xylR, lecz także sekwencje kodujące równoważne produkty ekspresji i mutanty produktów ekspresji, jak również same produkty ekspresji o sekwencjach kwasu nukleinowego zgodnie z wynalazkiem. Każde wykorzystanie xylR lub xylR kodującego sekwencje (=zlnR) tu ujawnione stosowane jest także do mutantów i sekwencji kwasu nukleinowego kodujących takie mutanty i uważane jest jako włączone tu mutatis mutandi.
Przykłady odpowiednich komórek grzybów, stosowanych do ekspresji sekwencji i kaset kwasu nukleinowego według wynalazku, obejmują Aspergilli, takie jak Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus carbonarius, Aspergillus foetidus, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowii, Aspergillus kawachii, Aspergillus Japonicus_ora7. szczepy rodzaju Trichoderma, Penicillium i Fusarium. Inne komórki, takie jak komórki roślinne, również nadająsię jako komórki gospodarza, przy czym w opisie wymienione są również alternatywne komórki gospodarza.
Genami szczególnie zamteresującymi z punktu widzenia ekspresji, wykorzystującymi kasetę ekspresji według wynalazku albo w połączeniu z sekwencją kwasu nukleinowego. Według wynalazku, są geny kodujące enzymy. Odpowiednimi genami do ekspresji są geny kodujące ksylanazy, glukanazy, oksyreduktazy, takie jak oksydaza heksoz, a-glukuronidaza, lipaza, esteraza, esteraza kwasu ferulowego oraz proteazy. Są to nie ograniczające wynalazku pożądane produkty ekspresji. W tej dziedzinie znana jest pewna liczba sekwencji obejmujących wspomniane geny, a taka informacjajest łatwo dostępna dla specjalistów w tej dziedzinie i uważa się ją za włączoną do wynalazku. Geny można łatwo zsyntezować albo na podstawie sekwencji znanych w literaturze lub w bazie danych albo możnaje wyprowadzić w znany sobie sposób z zawie14
185 052 rających je organizmów lub z wektorów, przy czym uważa się to za wiedzę łatwo dostępną dla specjalistów w tej dziedzinie, nie wymagającą dalszego wyjaśniania.
Produkt ekspresji wykazujący 80-100% identyczności z aminokwasową sekwencją xylR zgodnie z sekwencją id nr 9 lub zakodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego xlnR o sekwencji id nr 9 (z nukleotydu 948) uważa się za równoważny produkt ekspresji regulatora ksylanazy (xylR) według wynalazku, a zatem objęty jest zakresem wynalazku. Równoważny produkt ekspresji powinien wykazywać aktywność wiązania DNA. Taka aktywność wiązania DNA powinna korzystnie być taka, aby produkt ekspresji wiązał się z kwasem nukleinowym genu docelowego w takim samym lub większym stopniu jak produkt ekspresji wiąże się z sekwencją aminokwasową o sekwencji id nr 9. Korzystnymi genami docelowymi do oznaczania aktywności wiązania się sątakie geny, które kodująxylA, xylB, xylC i xylD, tojest geny xlnA, xlnB, xlnC i xlnD.
Zastrzeżone są także mutanty produktu xylR ekspresji genu xlnR oraz kodująca sekwencja aminokwasowa xlnR o sekwencji id nr 9, utrzymująca przynajmniej ten sam stopień aktywności wiązania się z punktem docelowym. Do mutantów uważanych za objęte defmicjąrównoważnych produktów ekspresji należą w szczególności mutanty ze zmianami aminokwasowymi w porównaniu z sekwencją aminokwasową takąjak sekwencja id nr 9. Takie równoważniki uważa się za właściwe rozwiązania wynalazku, ponieważ są kodującymi je sekwencjami kwasów nukleinowych. Odpowiednie sąmutanty z 1-15 podstawionymi aminokwasami, przy czym uważa się także, że substytucje na przykład 1-5 aminokwasów stanowią szczególnie przydatne rozwiązania wynalazku, dające równoważne produkty ekspresji. Wiadomo ogólnie specjalistom w tej dziedzinie, że substytucje szczególnych aminokwasów innymi aminokwasami tego samego typu nie mają poważniejszego wpływu na aktywność peptydu. Na podstawie profilów hydrolecznictwa specjalista w tej dziedzinie łatwo ustali, które substytucje można przeprowadzić. Zastąpienie hydrofobowych aminokwasów przez inne hydrofobowe aminokwasy oraz zastąpienie hydrofitowych aminokwasów przez, inne hydrofilowe aminokwasy da na przykład w wyniku produkt ekspresji, któryjest właściwym rozwiązaniem wynalazku. Takie substytucje sąuważane za objęte zakresem wynalazku pod określeniem równoważniki. Uważa się, że mutacje punktowe w kodującej sekwencji kwasów nukleinowych o sekwencji id nr 9 dająw wyniku sekwencje kwasów nukleinowych, które objęte są zakresem wynalazku. Takie mutacje punktowe mogą dać w wyniku mutacje uśpione na poziomie aminokwasowym lub opisane wyżej mutanty substytucyjne. Wynalazkiem objęte są także mutanty substytucyjne, w których substytucje mogą być wszelkiego typu. Identyczność mutantu wynosi korzystnie 85-100%, korzystnie 90-100%, a zwłaszcza 95-100% w porównaniu z sekwencją aminokwasową o sekwencji id nr 9. Jakjuż zastrzeżono, powyższe sekwencje aminokwasowe wykazujące 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową o sekwencji id nr 9 objęte są równoważnikiem znaczeniowym, tak że wynalazkiem objęte są delecję i ewentualnie substytucje do 20% sekwencji aminokwasowej, korzystnie mniej niż 15%, a zwłaszcza mniej niż 10%, a szczególnie mniej niż 5% sekwencji aminokwasowej według wynalazku. Taki mutant może zawierać delecję i ewentualnie substytucję w jednej lub więcej niż jednej części sekwencji aminokwasowej. Taki mutant delecyjny i ewentualnie substytucyjny zawierajednakże sekwencję aminokwasową odpowiadającą obszarowi wiązania palca cynkowego oraz sekwencji aminokwasowej odpowiadającej motywowi RRRLWW. Uważa się, że mutanty delecyjne z 1-5 aminokwasami objęte są zakresem wynalazku. Mutanty delecyjne o większej liczbie delecji niż 5 aminokwasów i ewentualnie więcej niż 5 substytucji i ewentualnie z mutacjami punktowymi mogą również utrzymać aktywność wiązania DNA. Taka większa liczba delecji i ewentualnie substytucji i ewentualnie mutacji punktowych ma miejsce korzystnie w półterminaluN sekwencji aminokwasowej oraz odpowiedniej części kodującej sekwencji kwasów nukleinowych. Uważa się, że większość ważnych obszarów biorących udział w regulacji i aktywacji obecne jest w półterminalu C sekwencji aminokwasowej z obszaru wiązania palca cynkowego i jako takie mutanty delecyjne zawierają korzystnie przynajmniej tę część sekwencji aminokwasowej. Korzystnie brak jest mutacji w obszarze wiązania palca cynkowego, odpowiadającym obszarowi zakodowanemu w sekwencji id nr 9 z nukleotydów w położeniu od 1110 do 1260. Jeżeli jest obecna mutacja, to nie powinna obejmować odstępu pomiędzy 6 cysteinami koordy185 052 nującymi cynk, a zwłaszcza żadna mutacja nie powinna obejmować żadnych z 6 cystein. Korzystnie ponadto, gdy żadna mutacja nie jest obecna w motywie RRRLWW obecnym w sekwencji aminokwasowej o sekwencji id nr 9. Delecja może mieć miejsce w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji aminokwasowej. Taki mutant delecyjny będzie jednakże zawierać sekwencję aminokwasową odpowiadającą obszarowi wiązania palca cynkowego oraz sekwencję aminokwasową odpowiadającą motywowi RRRLWW. Delecje od 1do 15 aminokwasów, korzystnie od 1 do 10 aminokwasów, a zwłaszcza od 1do 5 aminokwasów są odpowiednimi rozwiązaniami dla zapewnienia równoważności.
Rozwiązaniem równoważnych sekwencji kwasu nukleinowego jest sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje produkt ekspresji o takiej samej sekwencji kwasu nukleinowego, jak xylR sekwencji id nr 9 lub zakodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego xlnR o sekwencji id nr 9. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca produkt ekspresji wykazujący 80-100% identyczności z sekwencjąaminokwasowąxylR o sekwencji id nr 9 lub zakodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego kodującą xylR o sekwencji id nr 9 także uważana jest za równoważną sekwencję kwasu nukleinowego xlnR i objęta jest zakresem wynalazku. Innym rozwiązaniem równoważnej sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazkujest sekwencja kwasu nukleinowego zdolna do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych, warunkach ostrości, jak zdefiniowano w przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym wymienione primery i sondy wyprowadzone są z obszaru nie wiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów. W ogólności odpowiednimi długościami dla sond i primerów jest od 20 do 60 nukleotydów, a zwłaszcza od 25 do 60 nukleotydów. Korzystnie jeżeli sonda lub primer pochodzi z terminalu C kodującego połowę sekwencji id nr 9 z obszaru wiązania palca cynkowego. W korzystnym rozwiązaniu sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku zdolna jest do hybrydyzacji w specyficznych warunkach przynajmniej takiej ostrości, jaka przedstawionaj est w przykładach sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9. Równoważna sekwencja kwasu nukleinowego da się wyprowadzić z innych organizmów, na przykład techniką PCR z wykorzystaniem primerów opartych na sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, jak określono wyżej. Produkt ekspresj i równoważnej sekwencji kwasu nukleinowego, j ak właśnie zdefiniowano, uważany jest także za objęty zakresem wynalazku. I odwrotnie, sekwencja kwasu nukleinowego kodująca równoważną sekwencję aminokwasową według wynalazku także uważana jest za objętą zakresem znaczeniowo równoważnej sekwencji kwasu nukleinowego. Korzystnymi rozwiązaniami wynalazku są zwłaszcza równoważne sekwencje kwasu nukleinowego oraz produkty ekspresji takich sekwencji dające się wyprowadzić z filamentowych grzybów i roślin. Równoważna sekwencja kwasu nukleinowego obejmuje korzystnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą obszar wiązania palca cynkowego, odpowiadający obszarowi zakodowanemu w sekwencji id nr 9 z nukleotydów od pozycji 1110 do 1260. W korzystnym rozwiązaniu równoważna sekwencja kwasu nukleinowego powinna kodować 6 cystein koordynujących cynk. W dalszym rozwiązaniu odstęp pomiędzy cysteinami powinien odpowiadać odstępowi jak w sekwencji id nr 9.
Do zakresu wynalazku należą także rozwiązania obejmujące połączenia charakterystyk różnych rozwiązań równoważnych sekwencji kwasu nukleinowego oraz opisanych wyżej produktów ekspresji. Zastrzeżone sątakże mutanty z mutacjami w obszarze wiązania palca cynkowego, ponieważ mogą wykazywać zwiększone wiązanie DNA. Uważa się, że do zakresu wynalazku należą także mutanty wykazujące zmniejszone wiązanie DNA. Takie mutanty mogą zawierać mutację w obszarze wiązania palca cynkowego. Zastrzeżone są zwłaszcza mutanty z sekwencją aminokwasową o sekwencji id nr 9.
Zakresem niniejszego wynalazku objęte są również fragmenty sekwencji kwasu nukleinowego zgodnej z sekwencją id nr 9, zawierające przynajmniej 15 nukleotydów. Takie fragmenty można wykorzystać jako sondy lub primery do wykrywania i wydzielania sekwencji równoważnych. Użyteczne może być zwłaszcza połączenie dwóch lub więcej takich fragmentów w zestawie analitycznym do wykrywania i ewentualnie wydzielania takich równoważnych sekwencji. Korzystnie, gdy fragment wyprowadza się z półterminalu C sekwencji aminokwasowej odpowiadającej sekwencji id nr 9. W odpowiednim rozwiązaniu zestawu jeden fragment nie będzie
185 052 zawierać części sekwencji kwasu nukleinowego, tworzącej obszar wiązania palca cynkowego. W przykładach przedstawiono odpowiednie połączenie fragmentów wykorzystywanych jako primery. Uważa się, że każda sekwencja dająca się uzyskać techniką pCr, jak przedstawiono w przykładach z tymi primerami, jest objęta zakresem wynalazku. Warunki hybrydyzacji stosowane w przykładach zabezpieczają minimalną ostrość konieczną dla selektywności. M.ożna zastosować ostrzejsze warunki, takie jak ostre warunki hybrydyzacji opisane przez Sambrooka et al. dla zwiększonej homologii uzyskanych sekwencji z sekwencją id nr 9. Niższe stężenie soli oznacza w ogólności ostrzejsze warunki. Wszelkie fragmenty sekwencji zgodnej z sekwencjąid nr 9, będące polipeptydem lub kodujące polipeptyd wykazujący aktywność wiązania genu docelowego, o pełnej sekwencji, objęte są także zakresem wynalazku, ponieważ są ich równoważnymi sekwencjami kwasu nukleinowego lub sekwencjami aminokwasowymi, przy czym równoważnik jest określony tak jak określono wyżej w odniesieniu do hybrydyzacji i ewentualnie mutacji i ewentualnie degeneracji kodu genetycznego dla pełnej sekwencji.
Wektor lub plazmid zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą xylR lub jego równoważnąsekwencję, jak określono wyżej, także objęty jest zakresem wynalazku, tak jak wektor lub plazmid zawierający taką sekwencję oraz komórka gospodarza zawierająca taką dodatkową sekwencję. Poddana transformacji komórka gospodarza, taka jak komórka drobnoustroju lub rośliny zawierająca przynajmniej jedną dodatkową kopię kodującej sekwencji kwasu nukleinowego zgodnej z sekwenccąid nr 9 lub jej równoważnik także objęta jest zakresem wynalazku. Przygotowuje się korzystnie różne rozwiązania, tak aby sekwencja mogła dawać ekspresję w wektorze, plazmidzie lub komórce gospodarza. Gen regulatorowy może zawierać pełną sekwencję id nr 9 lub tylko jej sekwencję kodującąw połączeniu z alternatywnym promotorem, który zdolny jest do działania w komórce gospodarza. W opisie podano odpowiednie przykłady komórek gospodarza. Odpowiednie promotory operacyjne dla różnych komórek gospodarza, które można wprowadzać za pomocą kodującej sekwencji zgodnej z sekwencjąid nr 9, są oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. W szczególności dla komórek gospodarza wyraźnie wspomnianych w opisie znane sąkonstytutywne promotory lub podatne na indukcję promotory, dostępne do pracy z wynalazkiem bez nadmiernego obciążenia.
Opracowano sposób wytwarzania homologicznych lub heterologicznych protein lub peptydów, przy czym sposób obejmuje ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej homologiczną proteinę lub peptyd w komórce gospodarza, a wymieniona komórka gospodarza zawiera ponadto dodatkową kopię sekwencji kwasu nukleinowego kodującej gen regulatorowy, taki jak xlnR lub jego równoważnik, który także daje ekspresję. Opisany właśnie sposób realizuje się za pomocą kombinacyjnej kasety ekspresji kwasu nukleinowego, zawierającej gen regulatorowy związany operacyjnie z pierwszym promotorem, a wymieniona kaseta zawiera ponadto drugi promotor, przy czym drugi promotor jest normalnie związany z genem docelowym regulatora, przy czym wymieniony promotor genu docelowego jest operacyjnie związany z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą homologiczną lub nawet heterologiczną proteinę lub peptyd, mający dawać ekspresję. Pierwszy promotor może być związany w sposób naturalny z genem regulatorowym, lecz może być także promotorem wybranym, który może funkcjonować w komórce gospodarza. Stopień ekspresji nie jest już ograniczony obecnością zbyt małej ilości regulatora, a zatem stopień ekspresji genu dającego eskpresję jest o wiele wyższy niż w odpowiedniej komórce gospodarza, w której gen daje ekspresję bez dodatkowej obecności genu regulatorowego. Taką zwiększoną ekspresję uzyskuje się korzystnie w komórkach organizmów zawierających normalne składniki części szlaku metabolicznego, na które się oddziaływuje. Odpowiednimi komórkami gospodarza jest komórka roślinna lub drobnoustrój, przy czym odpowiednim drobnoustrojem może być grzyb, a zwłaszcza grzyb filamentowy. Przykłady odpowiednich komórek gospodarza podano w różnych miejscach opisu i mogą być one uważane za włączone do opisu. Inkorporacja kombinowanej kasety ekspresji typu opisanego wyżej w komórce gospodarza zawierającej gen docelowy regulatora może prowadzić do zwiększonej ekspresji genu docelowego lub do zwiększonej ekspresji genów docelowych, jeżeli są obecne wielokrotne geny docelowe. Gen docelowy jest korzystnie związany w sposób naturalny z regulatorem. Taki gen docelowy
185 052 jest korzystnie endogeniczny względem komórki gospodarza. W przykładach podaje się sekwencję kwasu nukleinowego regulatora ksylanolitycznego szlaku xlnR. Ustalono, że rodzime geny docelowe dla tego regulatora zawierają geny xlnA, xlnB, xlnC i xlnD, jak również axeA, i jako takie geny te sąkorzystnymi genami docelowymi. Istnieeątakże inne cele, które uważa się za objęte znaczeniowym genem docelowym. Zastrzeżeniami objęte są różne rozwiązania komórek gospodarzy według wynalazku. Jeżeli zarówno sekwencja regulatora, jak i genu docelowego obecne są w sposób naturalny w komórce gospodarza, to sekwencja regulatora będzie obecna w kopiach wielokrotnych. Taki drobnoustrój da nadekspresję genu regulowanego promotorem genu docelowego w porównaniu z drobnoustrojem rodzimym.
Ponieważ znana jest już sekwencja dla regulatora ksylanazy, to stało się możliwe wybicie regulatora ksylanazy. Wytwarzanie komórki gospodarza z wybiciem, gdy już raz znana jest sekwencja kwasu nukleinowego wybijanego genu, jest znane w standardowej technice. Sposób ten można realizować analogicznie do sposobu opisanego przez Berka et al. (1990) oraz w przykładzie 11 europejskiego opisu patentowego nr EP 95201707.7, który jest biegnącym europejskim zgłoszeniem patentowym, którego kopia została włączona po złożeniu przedmiotowego dokumentu, a sam przykład został skopiowany do niniejszego dokumentu w przykładach. Takie wybijanie daje komórkę gospodarza, która może być wolna od aktywności ksylanolitycznych. Komórka gospodarza wolna od aktywności ksylanolitycznej dzięki wybiciu genu xlnR może być wykorzystana do wytwarzania wybranych homologicznych lub heterologicznych produktów ekspresji wolnych od aktywności ksylanolitycznej. Komórka gospodarza z wybitym genem xlnR objęta jest również zakresem wynalazku. Taka komórka gospodarza jest zwłaszcza komórką roślinną lub grzybem filamentowym, a takim grzybem filamentowym jest korzystnie Aspergillus. W opisie podane są liczne przykłady odpowiednich komórek gospodarza.
Komórka gospodarza z mutacją w genie regulatora, który można wytworzyć stosując sposób selekcji i mutacji według wynalazku, może być poddana komplementacji za pomocąregularnej aktywnej kopii genu regulatora. Taki dopełniony szczep da następnie ekspresję produktów wszelkich genów docelowych, które są regulowane regulatorem. Takie produkty genów docelowych będą nieobecne w przypadku negatywnego mutanta regulatora niedopełnionego. Po porównaniu prążków proteiny uzyskanych w znany sposób z obydwu szczepów widoczne jest, że produkty docelowe regulowane są regulatorem, a następnie odpowiednie nowe geny docelowe można oznaczyć w znany sposób, gdy już raz oznaczono jego produkt ekspresji. W ten sposób w niniejszych przykładach dla regulatora ksylazy xylR można znaleźć inne geny docelowe, niż te, które sąjuż znane.
Przykłady
Przykład 1: Konstrukcja plazmidu
Przykład 1.1: Konstrukcja plazmidu selekcyjnego plM 130
Plazmid selekcyjny pIM130 skonstruowano tak jak przedstawiono na fig. 1. Techniką PCR1 utworzono fragment z plazmidu pIM120 (de Graaff et al., 1994) wykorzystując oligonukleotyd 1 (SEQ ID Nr: 1):
5'- CACAATGCATCCCCTTTATCCGCCTGCCGT-3' (wzór 1) oraz oligonukleotyd A ( SEQ ID Nr: 2)
5'- CAATTGCGACTTGGAGGACATGATGGGCAGATGAGGG-3' (wzór 2).
Oligonukleotyd 1 pochodził z położeń 600-619 (SEQ ID Nr: 5) promotora xlnA Aspergillus tubigensis (de Graaff et al., 1994), do których dodano 10 nukleotydów zawieraj ących centrum Nsil. Koniec 3' oligonukleotydu A pochodził zjednostki transkrypcyjnej goxC Aspergillus niger (Whittington et al., 1990), kończącej się bezpośrednio przed centrum inicjacyjnym translacji (położenia 708-723) (SeQ ID Nr: 6), podczas gdy koniec 5' pochodził z obszaru kodowania genu pyrA A. niger (Wilson et al, 1988) (poczynając od centrum inicjacyjnego translacji (położenia 341 do 359, SEQ ID Nr: 7).
Fragment A utworzono techniką PCR z 10 pi buforu reakcyjnego 10* (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl2, 0,01% żelatyny), 16 pl 1,25 mM każdego z czterech trójfosforanów dezoksynukleotydów, 1 ng DNA plazmidu pIM 120 oraz 1 pg każdego z ohgonukleo18
185 052 tydów 1i A o objętości końcowej 100 pl. Taką mieszaninę reakcyjną mieszano i dodano do niej 1 pl polimerazy TAQ (5 U/pl) (Life Technologies). DNA poddano denaturacji przez inkubację w ciągu 3 minut w temperaturze 92°C, a następnie za pomocą25 cykli jednominutowych w temperaturze 92°C, jednominutowych w temperaturze 48°C i jednominutowych w temperaturze 72°C. Po tych 25 cyklach mieszaninę poddano inkubacji w ciągu 5 minut w temperaturze 72°C. Analiza produktów reakcji drogą elektroforezy na agarozie ujawniła fragment z około 250 parami zasad, co odpowiada wielkości przewidywanej w oparciu o sekwencję genów.
TechnikąPCR2 utworzono fragment z plazmidu pGW635 (Goosen et al., 1987) wykorzystując oligonukleotyd 2 (SEQ ID Nr: 3)
5'- AGAGAGGATATCGATGTGGG-3' (wzór 3) oraz oligonukleotyd B (SEQ ID Nr: 4)
5'-CCCTCATCTGCCCATCATGTCCTCCAAGTCGCAATTG-3' (wzór 4)
Koniec 5' oligonukleotydu B pochodził z podstawowej jednostki transkrypcyjnej goxCA. niger (położenia 708-723, SEQ IG Nr: 6) (Whittingfon et al., 1990), podczas gdy koniec 3' pochodził z obszaru kodowania genu pyrA A. niger, począwszy od centrum inicjacyjnego translacji. Oligonukleotyd 2 pochodził z obszaru kodowania pyrA (położenia 339-359, SEQ ID Nr: 7) i obeemuje centrum restrykcyjne EcoRV w położeniu 602 (SEQ ID Nr: 7).
Fragment B utworzono w identyczny sposób, jak fragment A, z tym wyjątkiem, że w tym przypadku mieszanina reakcyjna zawierała 1 pg każdego z nukleotydów 2 i B oraz 1 ng DNA plazmidu pGW635. Analiza produktów reakcji drogą elektroforezy na agarozie ujawniła fragment zawierający około 250 par zasad, co odpowiada wielkości oczekiwanej na podstawie sekwencji genu pyrA.
Fragmenty A i B oddzielono po elektroforezie od żelu agarozowego. Fragmenty wycięto z żelu agarozowego, po czym odzyskano je z kawałka agarozy drogąelektroelucji stosując misek ISCO. Zarówno na dużym jak i małym pojemniku tych misek zamontowano membrany do dializy, miski napełniono za pomocą0,005 x TAE (bufor 50xTAE na 1000 ml: 242,0 g zasady Trizma (Sigma), 7,1 ml lodowatego kwasu octowego, 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0), a w dużym pojemniku miski umieszczono kawałek agarozy. Następnie miskę umieszczono w aparacie elektroelucyjnym, przy czym duży pojemnik w komorze katodowej zawierał 1 *TAE, a mały pojemnik w komorze anodowej zawierał l*TAE/3 M NaAc. 5 Fragmenty poddawano elektroelucji przy napięciu 100 V w ciągu 1 godziny. Po tym czasie miskę zdjęto z aparatu elektroelucyjnego i usunięto bufor z dużego pojemnika, natomiast w małym pojemniku bufor usunięto tylko z górnej części. Pozostały bufor (100 pl), zawierający fragment DNA dializowano w misce względem destylowanej wody w ciągu 30 minut. Na koniec strącono DNA przez dodanie 0,1 objętości 3 M NaAc, pH 5,6 oraz 2 objętości zimnego etanolu (-20°C). DNA oddzielę przez wirowanie (wirówka Eppendorfa) w ciągu 30 minut z prędkością 14000 x g w teperaturze 4°C. Po usunięciu klarownej cieczy pastylki DNA suszono za pomocąwirówki próżniowej Savant Speedvac. Z kolei DNA rozpuszczono w 10 pl buforu TE (TE: 10 mM Tris/HCl, pH 7,2,1 mM EDTA, pH 8,0), a stężenie oznaczono drogą elektroforezy na żelu agarozowym korzystając z DNA lambda o znanym stężeniu jako odnośnika oraz barwiąc za pomocą bromku ethidium w celu wykrycia DNA.
Fragmenty A i B połączono w PCR3, który był identyczny z PCR1, z tym wyjątkiem, że w tym przypadku mieszanina reakcyjna zawierała 1 pg każdego z oligonukleotydów 1 i 2 oraz w przybliżeniu 50 ng każdego z fragmentów A i B. Analiza produktów reakcji drogą elektroforezy na żelu agarozowym ujawniła fragment zawierający około 500 par zasad, co odpowiada wielkości oczekiwanej na podstawie sekwencji genów.
Otrzymany fragment C oddzielono od żelu agarozowego w opisany sposób, a następnie trawiono stosując enzymy restrykcyjne NsiliEcoRV. DNA trawiono w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C w mieszaninie reakcyjnej złożonej z następujących roztworów: 5 pl (=0,5 pg) roztworu DNA, 2 pl odpowiedniego buforu 10 x React (Life Technology), 10 jednostek enzymu restrykcyjnego (Life Technology) oraz sterylną wodę destylowaną, o objętości końcowej 20 pl. Po trawieniu fragment DNA analizowano drogą elektoforezy na żelu agarozowym, a następnie oddzielono w opisany sposób od żelu.
185 052
Dla końcowej konstrukcji pIM130 5 pg plazmidu pGW635 trawiono w sposób opisany stosując 50 jednostek enzymów restrykcyjnych RcoRV i Xbal o objętości końcowej 500 Emul. Po oddzieleniu produktów z żelu agarozowego wydzielono drogą elektroelucji 2,2 fragment EcoKV/Xbai o długości 2,2 kz (fragment D). Analogicznie 1 pg wektora pGEM-7Zf[+) (Promega) otrzymano przez trawienie za pomocą enzymów restrykcyjnych Nsil/Xbai, a następnie po trawieniu poddano go elektroforezie i wydzielono z żelu agarozowego drogą elektroelucji.
Plazmid pIM130 skonstruowano drogą następującej reakcji ligacji: 100 ng fragmentu pGEM-7Zf(+) NsillXbai zmieszano z 50 ng fragmentu C i 50 ng fragmentu D oraz 4 pl buforu ligacyjnego 5* (skład: 500mMTris-HCl,pH7,6,100mMMgCl2, DmM ATP, 1 OmMdwutiotreitolu, 25% PEG-1000), a następnie dodano do tej mieszaniny o ogólnej objętości 20 pl 1 pl (1,2 jednostki/ pl) ligazy T4 DNA (Life Technologies). Po inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 14°C mieszaninę rozcieńczono do 100 pl za pomocą sterylnej wody. 10 pl rozcieńczonej mieszaniny wykorzystano do przekształcenia właściwych komórek DH5a E. coli, przygotowanych w sposób opisany przez Sambrooka et al., 1989.
Dwie z otrzymanych kolonii hodowano w ciągu nocy w medium LB (medium LB na 1000 ml: 10 g peptonu tryptykazy (BBL), 5 g wyciągu drożdżowego (BBL), 10 g NaCl, 0,5 mM Tris-HCl, pH 7,5) zawierającego 100 pg/ml ampicyliny. Plazmid wydzielono z kultur drogą lizy alkalicznej w sposób opisany przez Maniatisa et al. (1982), którą wykorzystano w analizie restrykcyjnej do wybrania klonu chroniącego żądany plazmid pIM130. DNA plazmidu wydzielano na dużą skalę z 500 ml kultur DH5a E. coli, zawierających pIM130 wyhodowany w medium zawierającym 100 pg/ml ampicyliny (Maniatis et al., 1982). Plazmid oczyszczono przez wirowanie z CsCl, poddano fenolowaniu, strącono etanolem i rozpuszczono w 400 p TE. Wydajność wynosiła w przybliżeniu 500 pg.
Przykład 1.2: Konstrukcja plazmidu pIM135
Z plazmidu pIM120 skonstruowano drugi plazmid, który zawierał podstawowąjednostkę transkrypcyjną goxC połączoną z obszarem kodowania pyrA i obszarem terminacji. W PCR4 fragment wytwarzano z plazmidu pIM120, stosując oligonukleotyd 3
5'-CACAATGCATCGTATAAGTAACCTCGTTCG-3' (wzór 5) który pochodził z podstawowej jednostki transkrypcyjnej goxC (położenia 640-660, SEQ ID Nr: 6), do której dodano 10 nukleotydów zawierających centrum Nsil, oraz oligonukleotydu 2 (wzór 3). Utworzony fragment oddzielono od żelu, trawiono za pomocą Nsil i EcoRK a następnie klonowano razem z fragmentem EcoRV/Xbai pGW635 o długości 2,2 kz w plazmidzie pGEM-7Zf(+), który trawiono za pomocą Xbal/Nsil, jak opisano w przykładzie 1.1, uzyskując w wyniku plazmid pIM135.
Plazmid pIM135 można wykorzystać jako nośnik konstrukcyjny do wytwarzania wektorów według wynalazku o jakiejkolwiek pożądanej, podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora, sekwencji UAS genu biorącego udział w metabolizmie. Plazmid pIM135 zawiera podstawowąjednostkę transkrypcyjną (tGOX), związaną operacyjnie z genem znacznika dwukierunkowego (pyrA).
Przykład 2: Transformacja A. niger przy wykorzystaniu plazmidu pIMl 30
250 ml medium kultury, składające się z minimalnego medium (MM) Aspergillus (zawiera w 1 litrze: 6,0 g NaNO3,1,5 g KH2PO4,0,5 g MgSO4 · 7H20,0,5 g KCl, wskazane źródło węgla, pH 6,0) oraz 1 ml roztworu Vishniaca (zawiera w 1 litrze 10 g EDTA, 4,4 g ZnSO4 · 7H2O, 1,0 g MnCl2 · 4H20,0,32 g COCl2 · 6H20,0,32 g CuSO4 · 5H20,0,22 g (N^^MO^ · 4^O, 1,47 g CaCl2 · 2H2O, 1,0 FeSO4 · 7H2O, pH 4,0), uzupełnione 2% glukozy, 0,5% wyciągu drożdżowego, 0,2% kwasów Casamino (wolnych od witamin), 10 mM L-argininy, 10 pM nikotynoamidu i 10 mM urydyny, zaszczepiono zarodnikami szczepu NW205 (cspA.\, pyrAl, nicA1, argB 13) o stężeniu 1 * 106/ml, a grzybnię hodowano w ciągu 16-18 godzin w temperaturze 30°C w orbitalnej wstrzasarce New Brunswick o 250 obrotach na minutę. Grzybnię zebrano na siatce nylonowej Myracloth, korzystając z lejka Buchnera i przy łagodnym ssaniu, a następnie przemyto kilka razy za pomocą SP6(Sp6: 0,8% NaCl, DmM bufor fosforanu sodowego, pH 6,0). 150 mg Novozyme 234 rozpuszczono w 20 ml SMC (SMC: 1,33 M sorbit, 50 mM CaCl2,20 mM buforu MES o pH 5,8) i dodano do niego 1 g (ciężar mokry) grzybni, ostrożnie ją zawieszając. Taką zawiesinę poddano
185 052 inkubacji z delikatnym mieszaniem w ciągu 1-2 godzin w temperaturze 30°C, przy czym co każde 30 minut grzybnię ostrożnie zawieszano ponownie i pobierano próbkę do kontrolowania tworzenia się protoplastów, stosując hemocytometr do liczenia protoplastów. Gdy już jest obecna wystarczająca ilość protoplastów (więcej niż 1 * 108), zawiesza się je ponownie ostrożnie i usuwa fragmenty grzybni drogą filtracji przez sterylny sączek z wełny szklanej. Protoplasty zbiera się drogą 10-minutowego wirowania z prędkością 3000 obrotów na minutę, w temperaturze 4°C, w wirówce stołowej, a następnie ostrożnie zawiesza ponownie w 5 ml STC (STC: 1/33 M sorbit, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris/HCl, pH 7,5). Ten etap przemywania powtórzono dwukrotnie, po czym protoplasty zawieszono na koniec ponownie w STS przy gęstości 1 * 108na ml.
Transformację przeprowadzono przez dodanie 1 pg DNA pIM130 (rozpuszczonego w 10 20 pl TE) do 200 pl zawiesiny protoplastu razem z 50 [li bufora PEG (bufor PEG: 25% PEG-6000,50 mM CaCl2,10 mM Tris/HCl, pH 7,2), mieszanej łagodnie przez pipetowanie kilka razy do dołu i do góry, i poddanej inkubacji w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut. Po tym czasie dodano 2 ml buforu PEG, roztwór łagodnie mieszano i poddano inkubacji w temperaturze pokojowej w ciągu dalszych 5 minut, a następnie dodano 4 ml STC i mieszano łagodnie za pomocąmieszadła wirowego. Można to przeprowadzić również stosując 5 pg pIM130 oraz 1i 5 pg DNA plazmidu pGW635. Jako kontrolę negatywną dodano do protoplastów 20 pl TE.
Jednomililitrowe porcje tej zawiesiny dodano następnie do 4 ml osmotycznie stabilizowanego agaru wierzchniego i wylano na płytki (wirować delikatnie w celu pokrycia płytki agarem) z MMS zawierającym albo 100 mM D-glukozy albo 100 mM D-ksylozy jako źródła węgla. Media te (MMS) były osmotycznie stabilizowane za pomocą 0,8 M KCl lub 1,33 M sorbitu.
Do oznaczenia regeneracji procentowej przygotowano szereg rozcieńczeń protoplastów przed transformacją/niepotraktowane protoplasty trzymane na lodzie) i po transformacji (uzyskane z kontroli negatywnej). Na płytkach z 10 mM urydyny uzupełnionej za pomocą MMS umieszczono 100 pl rozcieńczeń 10'3, 10*, 10'5 i 10‘6.
Przy kontroli pozytywnej, w której grzyby poddawano transformacji stosując plazmid pGW635, kolonie znaleziono na wszystkich płytkach. Jednakże częstość transformacji była znacznie niższa (1-10 transformantów na fig DNA plazmidu) na medium stabilizowanym za pomocą KC l niż na medium stabilizowanym sorbitem (100-1000 transformantów na pg DNA plazmidu). Jest to spowodowane znacznie wyższączęstościąregeneracji w tym ostatnim medium, która wynosiła około 90% w porównaniu z 2-5% na medium stabilizowanym za pomocą KCl.
W przypadku transformacji ze stosowaniem plazmidu pIM130 transformanty znaleziono na medium zawierającym D-ksylozę jako źródło węgla, lecz nie na medium zawierającym D-glukozę. Częstość na medium stabilizowanym sorbitem wynosiła około 100 na pg DNA plazmidu, podczas gdy częstość na medium stabilizowanym za pomocą KC 1 była niższa niż jeden na pg DNA.
Przykład 3: Analiza transformantów
Transformanty z plazmidu pIM 130 uzyskanego w przykładzie 2 analizowano pod względem fenotypu przez umieszczenie na MM zawierającym 100 mM D-glukozy, 100 mM D-glukozy/1% ksylan owsiano-pszeniczny (Sigma #X0627) i 1% ksylanu owsiano-pszenicznego. Selekcjątransformantów były repliki umieszczone na tych mediach i poddane inkubacji w temperaturze 30°C. Około 75% transformantów rozwijało się na medium zawierającym ksylan, podczas gdy nie odnotowano wzrostu na medium zawierającym D-glukozę. Pozostałe 25% kolonii wzrastało na wszystkich trzech badanych mediach.
Selekcję pięciu transformantów o spodziewanym fenotypie (wzrost na medium zawierającym ksylan, brak wzrostu na medium zawierającym D-glukozę) analizowano metodą Southema. DNA grzybów wydzielono drogą zmodyfikowanego postępowania stosowanego do wydzielenia RNA roślin, w zasadzie tak jak opisano przez de Graaffa et al., 1988. Grzybnia, która była hodowana przez noc w medium kultury, została zebrana, przemyta chłodnym roztworem soli, zamrożona w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -80°C. Kwasy nukleinowe wydzielono przez rozerwanie 0,5 g zamrożonej grzybni, korzystając z mikrodysmembratora (Braun). Uzyskany proszek grzybni ekstrahowano świeżo przygotowanym buforem ekstrakcyj185 052 nym. Bufor ekstrakcyjny przygotowano następująco: 1 ml kwasu trójizopropylonaftalenosulfonowego (TNS) (20 mg/ml) zmieszano starannie z 1 ml kwasu p-aminosalicylowego (PAS) (120 mg/ml), po czym dodano 0,5 ml buforu 5 x RNB(5 x RNB zawiera 121,0 g Tris, 73,04 g NaCl oraz 95 · 10 g EGTA w 11, pH 8,5). Po dodaniu 1,5 ml fenolu bufor ekstrakcyjny doprowadzano do równowagi w ciągu 10 minut w temperaturze 55°C. Następnie ciepły bufor dodano do proszku grzybni i mieszano starannie zawiesinę w ciągu 1 minuty za pomocą i mieszadełka wirowego. Po dodaniu 1 ml chloroformu zawiesinę mieszano jeszcze w ciągu 1 minuty. Po wirowaniu z szybkością 104 x g w ciągu 10 minut za pomocą szybkobieżnej wirówki Sorvall, fazę wodną ekstrahowano jeszcze raz za pomocą równej objętości fenol/chloroform (1:1), a następnie ekstrahowano dwa razy chloroformem. DNA wydzielono z fazy wodnej stosując następującą procedurę: DNA strącono natychmiast z fazy wodnej za pomocą 2 objętości etanolu w temperaturze pokojowej, a następnie oddzielono drogą wirowania za pomocą szybkobieżnej wirówki Sorvall z szybkością 104 x g w ciągu 10 minut, przemyto dwukrotnie przez ponowne rozpuszczenie DNA w destylowanej, sterylnej wodzie i ponowne strącenie etanolem. RNA usunięto przez dodanie Rnase A (20 g fg/ml) do końcowego roztworu.
Wysokocząsteczkowy DNA (1-2 pg) wydzielony z N402 A. niger (cspAl) dzikiego typu oraz pięć transformantów pIM130, jak opisano, trawiono za pomocą Hpal (Life Technologies) zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskane fragmenty oddzielono drogą elektroforezy na żelu agarozowym i przeniesiono na membranę typu High-bond N, w sposób opisany przez Maniatisa et al. (1982). Hybrydyzację z użyciem fragmentu Xbalo długości 3,8 kz, znaczonego za pomocą 32P, otrzymanego w sposób opisany przez Sambrooka et al., 1989, zawierającego gen pyr A A. niger jako sondę, przeprowadzono zgodnie z następującą procedurą (Sambrook et al:. hybrydyzacja wstępnaw6xSSC(20xSSC na 1000 ml:175,3 gNaCl, 107,1 g cytrynianu sodowego.5,5 H2O, pH 7/0), 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodowego, roztwór 5* i Denhardta (100 x roztwór Denhardta na 500 ml: 10 g Ficol1-400,10 g poliwinylopirolidonu, 10 g albuminy osocza krwi bydlęcej (Pentax Fraction V) oraz 20 fg/ml denaturowanego DNA ze spermy śledzia w temperaturze 68°C w ciągu 3-5 godzin, oraz hybrydyzację w identycznym buforze, który zawierał denaturowaną znaczoną sondę, w temperaturze 68°C w ciągu 15-18 godzin, a następnie z dwukrotnym przemywaniem w 3 x SDS ,0,1% SDS w temperaturze 68°C oraz dwukrotnym przemywaniem w 0,2 x SSC, 0,1 % SDS w temperaturze 68°C. Membranę pokryto Saranem i poddano autoradiografii w ciągu nocy w temperaturze -70°C za pomocąbłon rentgenowskich Kodaka oraz kaset X-Omatic Kodaka z regularnie wzmacniającymi się ekranami.
W wyniku znaleziono prążek hybrydyzacyjny o długości 10 kz w torze N402, natomiast nie było tego prążkawrainsformantachNW205::130#l,NW205::130#2 iNW205::130#3. W transformantach NW205::130#1 i NW205::130#3 znaleziono fragment hybrydyzacyjny o długości 15 kz, natomiast w NW205:: 130#2 znaleziono prążek o długości 20 kz. Wyniki te odpowiadają odpowiednio integracji z kopią pojedynczą i podwójną w lokusie homologicznym pyrA. W transformantach NW205:: 130#4 i NW205:: 130#5 plazmid był zintegrowany w lokusie niehomologicznym. Do mutagenezy wybrano transformant NW205::130#2.
Fragment sekwencji UAS plazmidu pIM130 zawierał centrum wiążące konieczne dla regulatora pozytywnego do wykazania aktywności stymulacyjnej sekwencji UAS. Zatem inhibicja xlnR w komórce gospodarza zawierającej pMI130 daje w wyniku negatywną ekspresję znacznika dwukierunkowego obecnego na plazmidzie pIM130. Ekspresja xlnR indukowana jest ksylanem lub ksylozą. Zatem obecność takich substratów powinna dać w wyniku ekspresję znacznika dwukierunkowego plazmidu pIM130, jeżeli gospodarz ma xlnR.
Fragment sekwencji UAS plazmidu pIM130 nie zawiera centrum koniecznego do aktywności inhibicyjnej creA, który jest obecny na rodzimej sekwencji UAS genu xlnA Aspergillus niger. Zatem obecność glukozy, która nadaje CRE A+ A. niger, a następnie hamuje sekwencję UAS xlnA, oraz inny enzym ksylanolityczhy kodujący geny, taki jak xlnD i axeA, hamuje także gen xlnR kodujący aktywator sekwencji UAS wyżej wspomnianego enzymu ksylanolitycznego kodującego geny, to jest tłumi ekspresję enzymu ksylanolitycznego, co daje w wyniku negatywną ekspresję plazmidu pIM130.
185 052
Przykład 4: Selekcja mutantów
Przykład 4.1 Selekcja mutantów nie poddanych represji
Zarodniki NW205::130#2 zebrano w 5 ml ST (ST: 0,8% NaCl, 0,05% Tween 20), wstrząsano przy wysokiej częstości, a odłamki grzybni usunięto przez filtrację przez sterylny sączek z wełny szklanej. Zarodniki oddzielono przez wirowanie w ciągu 10 minut z prędkością 3000 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki stołowej, a następnie ponownie zawieszono w 5 ml roztworu soli. Ten etap przemywania powtórzono dwukrotnie, a na koniec zarodniki zawieszono ponownie w roztworze soli przy gęstości 1* 107na ml. 10 ml zawiesiny zarodników umieszczono w szklanej szalce Petriego i napromieniano promieniami nadfioletowymi przy dawce 18 erg/mm2/min w ciągu 2 minut. Po mutagenezie 105i 106 zarodników umieszczono (10 płytek każdego) na podłożu MM + 10 ml L-argininy +10 μΜ nikotynoamidu, zawierającym 3% glukozy oraz na płytkach zawierających 3% D-glukozy/3% ksylanu owsiano-pszenicznego (Sigma #X0627).
Po 4-7 dniach znaleziono na każdej płytce 5-10 kolonii mutantów (106 nieszczepionych zarodników), które na podstawie ich morfologii mogły być podzielone na trzy klasy: duże, dobrze zarodkujące kolonie, średnie, dobrze zarodnikujące kolonie oraz małe, słabo zarodnikujące kolonie. Przeprowadzono wybór losowy 20 z tych mutantów i wybrane mutanty badano na medium zawierającym różne źródła węgla lub substraty. Ustalono, ze kolonie mutantów zdolne są do wzrostu na medium zawierającym D-glukozę/ksylan oraz ksylan, natomiast szczep macierzysty NW205:: 130#2 mógł rozwijać się tylko na medium zawierającym ksylanjako źródło węgla. Mutanty te badano ponadto na różnych substratach chromogenicznych: 4-metyloumbelliferylo-P-D-ksylozyd (β-ksylozydazy, endoksylanazy) (Sigma #M7008), octan 4-metyloumbelliferylu (esterazy acetyloksylanowe) (Sigma #M0883), 4-metyloumbelliferylo-<a-L-arabinofuranozyd (arabinofuranozydazy) (Sigma #M9519) oraz na ksylanie modyfikowanym za pomocą błękitu Remazol Brilliant (endoksylanazy) (Sigma #M5019). Pochodne metyloumbelliferylowe przy stężeniu końcowym 1 mM dodawano do mediów zawierających D-glukozę, D-glukozę/ksylan oraz ksylan, natomiast ksylan RBB dodawano przy stężeniu 1 mg/ml do mediów zawierających D-glukozę/ksylan i ksylan. Dla wszystkich tych substratów badaną aktywność enzymatyczną stwierdzono u mutantów po rozwoju na medium zawierającym D-glukozę, natomiast nie stwierdzono ekspresji w szczepie macierzystym NM205::pIM130#2. Na mediach zawierających ksylan stwierdzono zwiększoną ekspresję tych enzymów w i porównaniu z NM205::pIM130. Z tych badanych mutantów tylko mutant 5 B wykazywał najwyższe poziomy ekspresji. W danym przypadku selekcja miała miejsce na podłożu normalnie aktywnym jako inhibitor ksylanolizy, to jest na glukozie. Aby upewnić się, że ekspresja może mieć miejsce także przy braku represji, włączono także induktor genów ksylanolitycznych, ksylan. Taka próba kontrolna objęta jest również sposobem według wynalazku. Mutant w sposób wyraźny wykazywał derepresję.
Dla porównania wytworzonych poziomów aktywności zarówno N402 z A. niger, jak i mutant 5B hodowano na MM zawierających 1,5% surowego arabinoksylanu pszenicznegojako źródle węgla. Próbki pobrano po 24,42,72 i 96 godzinach i mierzono aktywności a-L-arabinofuranozydazy, endo-ksylanazy i β-ksylozydazy. Wyniki (fig. 2 A, B, C) wskazywały na wzrost aktywności dla mutanta szczepu dla wszystkich trzech enzymów. Najsilniejszy wzrost aktywności odnotowano dla a-L-arabinofuranozydazy i endo-ksylanazy.
Przykład 4.2: Selekcja mutantów nie dających ekspresji
Zarodniki szczepu NW205:: 130#2 zebrano i poddano mutacji w sposób opisany w przykładzie 4.1, a następnie umieszczono na płytkach na MM zawierającym 100 mM D-ksylozy uzupełnionej 10 mM urydyny, 10 mM L-argininy i 0,8 mg/ml kwasu 5-fluoroorotowego (Sigma #F5013). Takie płytki poddawano inkubacji w ciągu 4-7 dni w temperaturze 30°C. 64 z tych rozwijających się kolonii, o fenotypie PYR', analizowano na ekspresję ksylanazy przez umieszczenie na płytkach na MM zawierającym 1% ksylanu + 10 mM urydyny +10 mM L-argininy + 10 μM nikotynoamidu. Z tych 64 badanych mutantów 10 dało zmniejszony obszar rozjaśnienia na płytkach zawierających ksylan i wykazywało silnie zmniejszone poziomy ksylanazy. Fenotyp tych mutantów
185 052 sprawdzono na mediach zawierających D-glukozę , D-glukozę/ksylan i ksylan w obecności i przy braku urydyny. Wszystkie 10 mutantów nie rozwijało się na mediach bez urydyny.
Dla celów dalszej analizy mutanty te poddano wstępnej hodowli w ciągu 18 godzin w temperaturze 30°C na MM zawierającym 50 mM fruktozy +10 mM urydyny + 10 mM L-argininy +10 pM nikotynoamidu, po czym zebrano grzybnię, 1 g wilgotnej grzybni przeniesiono do MM zawierającego 1% ksylanu oraz do MM zawierającego 10 mM D-ksylozy +10 mM L-argininy +10 mM nikotynoamidu. Po 5,5 godzinach inkubacji w temperaturze 30°C zebrano zarówno grzybnię, jak i przesącz kultury. Przesącz kultury poddano dializie wobec 1 mM NaP„ pH 5,6, po czym oznaczano ksylanazę (Bailey et al., 1991) oraz aktywności (β-ksylozydazy (tabela 1). Ustalono, że w tych wybranych mutantach poziomy ekspresji zarówno ksylanazy, jak i β-ksylozydazy były silnie zmniejszone.
Aktywność Endo-ksylanaza β-Ksylozydaza a-L-Arabinofuranozydaza
Szczep Ksylan (nkat mi’1) Ksyloza (nkat ml'1) Ksylan (nkat ml’1) Ksyloza (nkat ml’1) Ksylan (nkat ml’1) Ksyloza (nkat ml1)
NW205 5*102 5*10‘ 0,35 0,40 0, 33 0,37
NW205::130 5* 102 1*102 0, 36 0,51 0, 40 0, 29
NW205.:130 2 Ac2-15 5*102 1*102 0,26 0,30 0, 30 0,23
NW205::130 2 Acl-4 2 1 0,01 0,01 0,36
NW205:: 130 2 Ac4-4 2 0,3 0,01 0,01 0,24
NW205::130 2 Ac4-6 2 0,3 0,01 0,01 0,31
NW205::130 2 Ac3-14 1 0,4 0,01 0,01 0, 29
NW205::130 2 Ac4-8 2 0,4 0,01 0,01 0,38
NW205.:130 2 Ac2-10 1 0,1 0,01 0,01 0, 19
NW205:: 130 2 Ac2-8 1 0,3 0,01 0,01 0, 29
NW205::130 2 Ac2-5 1 0,2 0,01 0,01 0, 28
NW205 :130 2 Acl-15 2 0,2 0,^1 0,01 0, 23
NW205.:130 2 Ac4-14 2 0,2 0,01 0,01 0, 28
Przykład 5: Komplementacja mutantów nie dających eskpresji 5.1 Konstrukcja biblioteki genomicznego plazmidu z A. niger
Do konstrukcji kartoteki plazmidu 10 pg genomicznego DNA z NW128 A. niger (cspAl, nicAl,pyrA6, goxCl 7) , wydzielonego w sposób opisany w przykładzie 3, trawiono częściowo w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C według instrukcji producenta stosując 3,5 jednostki Sau3 A (Life Technologies) o objętości końcowej 100 pl. Po oddzieleniu fragmentów drogą elektroforezy na agarozie, fragmenty o wielkości od 6,7 kz do 9,4 kz wycięto z niskotopliwego żelu agarozowego i wydzielono w sposób opisany przez Sambrooka et al. (1989). Z ogółem 6 trawień wydzielono 4 fig fragmentów o stężeniu końcowym 100 ng/ml. 600 ng uzyskanych fragmentów poddano ligacji w 100 ng pUC18 trawionego za pomocą BamHI (Pharmacia #27526201) zgodnie z instrukcją producenta. Po ligacji 4 pl otrzymanej mieszaniny ligacyjnej wykorzystano do transformacji W0 pl komórek DH5a E. coli o największej wydajności (Life Technologies #18258-012) zgodnie z instrukcją producenta. Sześć kolejnych doświadczeń z transformacjami dało w wyniku 5* 104 kolonii. Po ponownym zawieszeniu tych kolonii i hodowli w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C w medium TY (medium na 100 ml: 16 g Select Peptone 140 (Life Technologies), 10 g NaCl oraz 10 g wyciągu drożdżowego), zawierającym 100 pg/ml ampicyliny, wydzielono DNA plazmidu i oczyszczono drogą wirowania z CsCl.
185 052
5.2 Komplementacja mutantów nie dających ekspresji
Dla dokonania komplementacji mutantów nie dających ekspresji dokonano selekcji protoplastów trzech mutantów,NW205::130Acl-4, NW205::130Acl-15 i NW205::130Ac4-4, tych szczepów i poddano transformacji w sposób opisany w przykładzie 2. W tych doświadczeniach z transformacją wykorzystano 108 protoplastów i połączono je z 20 pg dNa plazmidu A. niger w sposób opisany w przykładzie 5.1, z 10 pg DNA plazmidu połączonego z 10 pg DNA autonomicznie replikującego się plazmidu pHELPl (Gems and Clutterbuck, 1993) oraz z 20 pg plazmidu połączonego z 10 pg autonomicznie replikującego się plazmidu pHELP1. Po transformacji mieszaniny umieszczono na płytkach na Mm stabilizowanym za pomocą 1,33 M sorbitu zawierającego 50 mM D-ksylozy, jako źródła węgla, uzupełnionej 10 pgnikotynamidui 10 mML-argininy. Po około 4 dniach na pozytywnych płytkach kontrolnych pojawiły się kolonie, które policzono, a po 6 dniach kolonie można było już pobrać z płytek komplementacyjnych.
Uzyskane kolonie transformantów analizowano przez umieszczenie ich na medium zawierającym 1% ksylan owsiano-pszeniczny, 1 mM 4-metyloumbelliferylo-P-D-ksylozyd, 10 pM nikotynamidu oraz 10 mM L-argininę. Po 6-7 godzinach inkubacji w temperaturze 30°C wykrywano kolonie fluoryzujące xx. Po 2-3 dniach ukazało się rozjaśnienie ksylanu dookoła tych kolonii.
Przykład 6: Klonowanie genu xlnR A. niger
Przykład 6.1: Wydzielanie genu xlnRA. niger
Gen xlnR A. niger wydzielano z transformantów uzyskanych i wyselekcjonowanych sposobem opisanym w przykładzie 5.2. Z 13 transformantów uzyskanych z NW205:: 130Acl-4, NW205:: 130Acl-15 i NW205:: 130Ac4-4 wydzielono cały DNA w sposób opisany przez de Graaffa et al., 1988. Następnie grzybnię hodowano w warunkach selekcji (to jest indukcji) dla pyrA oraz ekspresji ksylanolitycznej na 1,5% surowym arabino-ksylanie pszenicznym jako źródle węgla, z którego wolne replikujące plazmidy wydzielono stosując kolumny Nucleobond AX100 (Macherey & Nagel). 200 pg całego DNA rozpuszczonego w 400 pl sterylnej wody zmieszano z 2 ml buforu SI (50 ml Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 pg Rnase A), 2 ml S2 (200 mM NaOH, 1% SDS), z inkubacją w temperaturze pokojowej w ciągu 5 minut, oraz 2 ml S3 (2,60 M Kac, pH 5,2) z inkubacją na lodzie w ciągu 5 minut. Po wyklarowaniu zawiesiny przy prędkości wirowania 15000 x g w ciągu 30 minut, przeprowadzono adsorpcję, przemywanie, elucję i strącanie plazmidów, wszystko według instrukcji producenta „Postępowanie robocze przy oczyszczaniu plazmidów i kosmidów” (5.3, modyfikowana liza alkaliczna/SDS). 20 pl DNA otrzymanego z plazmidu , rozpuszczonego w 150 pl sterylnej wody, wykorzystano do transformacjiDH5a E. colijSambrooket al., 1989). 12kolonii E. coli otrzymanych z każdego z tych preparatów plazmidowych hodowano w ciągu 9-12 godzin w temperaturze 37°C w 250 ml medium LB, zawierającym 50 pl/ml ampicyliny, po czym przeprowadzono wydzielenie DNA plazmidu mimpreparatu na 1,5 ml kultury w sposób opisany dla protokołu wrzącej lizy przez Sambrooka et al., 1989. Następnie komórki poddano pastylkowaniu przez wirowanie i przechowywano w temperaturze -20°C. Analiza takich preparatów DNA, po trawieniu za pomocą HinDIII, drogą elektroforezy na agarozie ujawniła trzy klasy plazmidów: plazmidy typu pHELPl, plazmidy typu biblioteki genomicznej oraz plazmidy typu dużych kompleksów. Z kolonii zawierających plazmidy tego ostatniego typu, z zamrożonych pastylek 250 ml kultur, przeprowadzono na dużą skalę izolację plazmidów, korzystając z kolumn Nucleobond AX100 według instrukcji producenta dla modyfikowanej lizy alkalicznej/SDS (Macherey-Nagel). Dało to w wyniku wydzielenie dwóch typów plazmidów, A i B, dopełniających odpowiednio A i B. Obydwa te plazmidy trawiono, stosując Sali, Pstl, EcoRI, Hindlll, a po elektroforezie na żelu agarozowym fragmenty analizowano trzykrotnie metodą Southema korzystając ze znaczonego promieniotwórczo pHELPl, plazmidu A i plazmidu B. Wykazało to, że obydwa plazmidy A i B, poza częściąpHELP, podzielały ten sam obszar genomiczny. W oparciu o różnice pomiędzy sygnałami hybrydyzacji stwierdzonymi za pomocąplazmidu HELP, pokazującymi sekwencje wektora i AMA1, oraz sygnałami plazmidów A i B, zidentyfikowano i subklonowano fragmenty hybrydyzujące z obydwoma plazmidami A i B, lecz nie z plazmidem pHELP 1. Ustalono, że fragment EcoRI o długości 4 kz i fragment HinD111 o długości 6,5 kz plazmidu B oraz fragment Pstl o długości 3 kz plazmidu A hybrydyzują
185 052 z obydwoma plazmidami A i B. Po poddaniu ich subklonowaniu w pGEM7/EcoRI, pGEMUHinDIII i pBlusscript/Pgt/, uzyskano odpowiednio plazmid pNPl, 2 i 3. Po propzgacji i oczyszczeniu plazmidy te zostały wykorzystane w Poświadczeniach Οamplsmsntacyjnych stosując mutant NW205::130Ac4-4 w sposób opisany w przykładzie 5.2. W doświadczeniach tych mutant poddano bezpośredniej transformacji bez korzystanie z pHELPl. W doświadczeniach tych plazmid pNP2, zawierający fragment HinDIII o długości 6,5 Oz, powodował Oomplementzcję mutacji. Dalsze subklonowanie i transformacje plazmidów pochodzących od pNP2 ujawniły fragment BzmHI-Xbal o długości 5 kz, subklonowany w pBlusscript, i dający w wyniku plazmid pNP8, powodując kamplsmentację szczepu NW205::130Ac4-4.
Przykład 6.2: S^Monowenie genu xlnRA. niger
Do subOlanawania genu xlnR, bibliotekę uA, niger, skonstruowaną w sposób opisany przez Hermsena et al., 1990, osłonięto przed fagemi zawierającymi obszar xlnR wykorzystując fragment EcoRI o długości 4 kz plazmidu pNPl jako sondę. W wierzchnim żelu agerozowym NZYCM, zawierającym 0,7% egarozę na pięciu 85 mm płytkach NZYCM (1,5% ager) umieszceono3x 103pfu w sposób opisany przez Menietisa et al., 1982, korzystając z LE392 E. coli, jako bakterii powlekających. Po inkubacji płytek w ciągu nocy w temperaturze 37°C wykonano dwie repliki każdej płytki na filtrach HybondN* (Amershem) w sposób opisany prnsz Manietisa et al., 1982. Po zwilżeniu filtrów w 3xSSC prnsmywana je w ciągu 60 minut w tempsreturns pokojowej w 3xSSC. Hybrydyzację, z wykorzystaniem znaczonego promieniotwórczo za pomocą 32P fragmentu EcoRI o długości 4 kz, przygotowanego w sposób opisany przez Sembrookz et al., 1989, przeprawaPeana zgodnie z następującą procedurą (Sembrook et al., 1989): hybrydyzację wstępną prowadzono w 6 x SSC (20xSSCna 1000 ml: 175,3 gNeCl, 107,1 g cytrynienu sodowego. 5,5H20, pH 7,0), 0,1% SDS, 0,05% pirofasfaranu sodowego, roztworze 5* Denhardte (100x roztwór Denhardta na 500 ml: 10 g Ficoll-400, 10 g paliwmylapiroliPonu, 10 g albuminy osocza Orwi bydlęcej (Pentax Fraction V) i 20 pg/ml DNA z denaturowanej spermy śledzia w temperaturze 68°C w ciągu 3-5 godzin, e hybrydyzację włeściwąw identycznym bufarne eewisrejącem denaturowaną znaczoną promieniotwórczo sondę w temperaturze 68°C w ciągu 15-18 godzin, a następnie z dwoma przemywaniami w 2 x SSC i 0,1 % SDS w temperaturze 68°C i dwoma presmyweniemi w 0,2 x SSC i 0,1% SDS w temperaturze 68°C. Membranę osłonięto Sarenem i prowadzono autoradiografię w ciągu nocy w temperaturze -70°C korzystając z filmów Komice X-rey KodeOe i kaset X-Omztic Kodeka z regularnie wzmacniającymi się ekranami.
Takie ekranowanie dało w wyniku około 12 pozytywnych fagów, z których 8 oczyszczono. Każdą pozytywną plamkę wydłubano z płytOi za pomocą pipety Pasteura, a fagi sluowena z płytki agarowej w 1 ml buforze SM zawierającym 20 pl chloroformu w sposób opisany przez Maniatisa et al., 1982. Uzyskane fagi oczyszczono powtarzając opisane wyżej postępowanie i korzystając z replik filtrowych z płytek zawierających 50-100 plamek wydzielonych fagów.
Po oczyszczeniu fagi poddano propagacji przez umieszczenie 5x1)3 fagów na medium NZYCM. Po inkubacji w ciągu nocy w temperaturze 37°C uzyskano płytki konfluentne, z których sluoweno fagi presz dodanie 5 ml buforu SM przechowując płytki w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C z przerywanym wstrząsaniem. Po zebraniu klerowej cieczy za pomocą pipety, bakterie usunięto z roztworu przse wirowanie w ciągu 10 minut z prędkością4000 x g w temperaturze 4°C. Do klarownej cieczy dodano 0,3% chloroform i oznaczono liczbę pfu. Takie roztwory podstawowe fagów (A-R/H-R) zawierały w przybliżeniu 109 pfu/ml.
DNA pięciu wyselekcjonowanych fagów, A-R, B-R, C-R, E-R, F-R, wydzielonych w sposób opisany przee Sembrookz et al, 1989, enelizowano metodą Southeme. DNA trawiono w ciągu 5 godzin w temperaturze 37°C w misseeninis reakcyjnej złożonej z następujących roztworów: 5 pl (= 1pg) roztworu DNA, 2 pl właściwego buforu 10 x Reect (Life Technologies), 10 jednostek enzymu restrykcyjnego (Life Technologies) oraz sterylnej, destylowanej wody otrzymując objętość końcową 20 pl. Próbki poddawano inkubacji w ciągu 10 minut w temperaturze 65°C, z następnie szybko ochłodzono ne lodzie przed umieszczeniem ne 0,6% żelu egerozowym w buforze 1 *TAE. Fragmenty DNA oddzielono drogą slsOtroforszy przy napięciu 25 V w ciągu 15-18 godzin.
185 052
Po elektroforezie DNA przeniesiono i poddano denaturacji drogą alkalicznego odciskania próżniowego (VacuGene XL, Pharmacia LKB) na nylonową membranę (HybondN, Amersham) w sposób opisany w instrukcji VacuGene XL (strony 25-26), a następnie poddano wstępnej hybrydyzacji ' i hybrydyzacji właściwej wykorzystując znaczony promieniotwórczo fragment BamHl-Xbal o długości 5 kz plazmidu pNP8 w opisanych warunkach hybrydyzacji. Wzór hybrydyzacji uzyskano przez napromieniowanie w ciągu 18 godzin błony rentgenowskiej XAR-5 Kodaka w temperaturze -70°C korzystając z regularnego wzmacniającego się ekranu. We wszystkich 5 klonach znaleziono fragmenty pochodzące z tego samego obszaru genomicznego, dla którego skonstruowano wzór restrykcyjny.
Na podstawie mapy restrykcji wybrano do subklonowania fragment BamRl-Xbal o długości 5 kz. 100 ng wektora pBluesript trawionego za pomocą BamHI-XbaI zmieszano z 250 ng DNA BamHI-XbaIo długości 5 kz faga B-R oraz 4 pl bufora ligacji 5* (skład: 500 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM MgC^, 10 mM ATP, 10 mM dwutiotreitolu, 25% pEg-6000), po czym do tej mieszaniny dodano 1(d(l ,2 jednostki/pl) ligazy DNA T4 (Life Technologies) uzyskując objętość końcową 20 pl. Po inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 14°C mieszaninę rozcieńczono sterylną wodą do 100 pl. 10 pl rozcieńczonej mieszaniny wykorzystano do transformacji odpowiednich komórek DH5a E. coli, przygotowanych w sposób opisany przez Sambrooka et al., 1989. Sześć z uzyskanych kolonii hodowano w ciągu nocy w medium LB (medium LB dla 1000 ml: 10 g peptonu tryptykazy (BBL), 5 g wyciągu drożdżowego (BBL), 10 g NaCl, 0,5 mM Tris-HCl, pH 7,5) zawierającym 100 pg/ml ampicyliny. Z kultur wydzielono DNA plazmidu drogą wrzącej lizy w sposób opisany przez Maniatisa et al. (1982), który wykorzystano w analizie restrykcyjnej do wybrania klonu zabezpieczającego pożądany plazmid pIM230. DNA plazmidu wydzielano na dużą skalę z 500 ml kultur DH5a E. coli, zawierających pIM230 wyhodowany w medium LB, zawierającym 100 pg/ml ampicyliny (Maniatis et al., 1982). Plazmid oczyszczono drogą wirowania z CsCl, strącono etanolem i rozpuszczono w 400 pl TE. Wydajność wynosiła w przybliżeniu 500 pg. Komórki E. coli zawierające pIM230 złożono w CBS na warunkach Treaty of Budapest w miesiącu czerwcul996 roku pod numerem akcesji CBS 678.96.
Przykład 6.3: Subklonowanie cDNA z xlnR A. niger
Dla uzyskania klonu cDNA części obszaru wiązania palca cynkowego genu xlnR, odwróconą reakcję transkryptazy i reakcję syntezy drugiej nici przeprowadzono na 1 pg polyA*RNA z N402 dzikiego szczepu A. niger hodowanego na ksylanie w ciągu 30 godzin z oligonukleotydem startującym w położeniu 1476-1496 (Seq id nr 9), analogicznie do sposobu opisanego w instrukcji zestawu zAp™-cDNA do syntezy (Stratagene). Podwielokrotną część (1/50) z reakcji syntezy drugiej nici wykorzystano jako matrycę w PCR z primerem R026 i R025 (pochodzącym z położeń 946-970 Seq id nr 9) w 35 cyklach 60 sekundowych o kolejnych temperaturach 95°C, 58°C i 72°C, z następującą następnie inkubacją 5-minutową w temperaturze 72°C. Otrzymany fragment o długości 500 par zasad subklonowano w wektorze pGEM-T (Promega) i sekwencjonowano.
Przykład 7: Struktura pierwotna genu xlnR
Przykład 7.1: Analiza sekwencyjna genu xlnR
Sekwencję genu xlnR A. niger, jego obszar promotora/regulacji, część strukturalną genu oraz obszar terminacji oznaczono przez subklonowanie fragmentów zarówno pNP8, jak 1 pIM230, w połączeniu z wykorzystaniem specyficznych oligonukleotydów jako primerów w reakcjach sekwencjonowania.
Dla celów analizy sekwencyjnej nukleotydów wydzielono fragmenty restrykcyjne, a następnie klonowano je w wektorach pEMBL, pUC, pBluescript, DNA pGEM, trawionych odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Sekwencje nukleotydów oznaczano drogą terminacji łańcuchów dwudezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977) za pomocą automatycznego sekwensera Pharmacia ALF express i zestawu do sekwencjonowania Thermosequenase (Amersham). W przypadku specyficznych oligonukleotydów genu stosowano zestaw Pharmacia Cy5 ze znakowaniem wewnętrznym w połączeniu z zestawem do sekwencjonowania polimerazy T7 DNA (Pharmacia). Reakcję oraz elektroforezę prowadzono zgodnie z instrukcją producenta. Analizę komputerową prowa185 052 dzono korzystając z programu PC/GENE (Intelligenetics). Oznaczona sekwencja podana jest w SEQ ID Nr: 9.
Przykład 7.2: Opis genu xlnR
Sekwencja podana w SEQ ID Nr: 9, obejmująca gen strukturalny xlnR, poprzedzona jest długim przeciwprądowym obszarem nukleotydów. W przeciwprądowym niekodującym obszarze znaleziono sekwencje wzbogacone w CT, lecz nie znaleziono segmentu TATAA. Część strukturalna genu xlnR sięga od położenia 948 aż do położenia 3690, przerwanych dwoma intronami. Intron w położeniu od 1174 do położenia 1237 - oznaczono przez sekwencjonowanie fragmentu genomicznego w pIM230, opisanym w przykładzie 6.2 oraz część cDNA, jak opisano w przykładzie 6.3. Drugi intron znajduje się od położenia 3496 do położenia 3549. Sekwencje drugiego intronu następują za zachowanymi sekwencjami intronu, znajdowanymi normalnie w grzybach, dla złączy splotowych i sekwencji linowej.
Gen xnR koduje proteinę o długości 875 aminokwasów. Pochodny polipeptyd zawiera typowy N-terminalny dwujądrowy cynkowy obszar skupiskowy kodowany przez nukleotydy od położenia 1110 do położenia 1260, z typowymi sześcioma cysternami koordynującymi cynk. W tym obszarze wykazano ponadto pewną liczbę podobieństw z innymi grzybowymi proteinami regulatorowymi, jak przedstawiono na fig. 1 według Kraulisa et la. (1992), włączonymi tu jako referencje.
Typowy motyw RRRLWW znaleziono od położenia 2623 do położenia 2649, przy czym motyw ten, z nieznaczymi zmianami, znaleziono również w pewnej liczbie dwujądrowych cynkowych skupiskowych protein regulatorowych,jak zostało odnotowane przez Suareza et al.( 1995).
Przykład. 7.3: Analiza sekwencyjna xlnR w mutantach A. niger
Aby określić, czy mutacja, w przypadku mutantów N niger, które nie dają ekspresji układu ksylanolitycznego, jak opisano w przykładzie 4.2, jest zlokalizowana w xlnR, oznaczono sekwencję genu xlnR tych mutantów. W tym celu wykonano bibliotekę wzbogaconą dla fragmentów xlnR BamHI o długości 5,5 kz dla każdego z mutantów NW205:: 130Ac. Dla konstrukcji takiej biblioteki wzbogaconej w xlnR, dla każdego szczepu wydzielono fragmenty o długości 5,5 kz genomicznych DNA trawionych za pomocą BamHI, HinDIII, Xhol, Sstl i Kpnl. Takie fragmenty mieszano z wektorem pUC18 trawionym za pomocą BamHI i odfosforylowanym (Ready-ToGo™ pUC 18 BamHI/BAP + Ligase, Pharmacia), a następnie poddawano ligacji. Mieszaninę ligacyjną stosowano do transformacji komórek DH5a E. coli (MAX Efficiency DH5a™ Competent Cells, Gibco-BRL) w postać odporną na ampicylinę, zgodnie z protokółem producenta, co dało w wyniku pierwotną bibliotekę 5*10M03 kolonii. Takie biblioteki wzbogacone w xlnR A. niger, po rozłożeniu biblioteki pierwotnej na płytkach master, osłaniano przez hybrydyzację filtracyjną kolonii zgodnie ze standardowym protokołem (Sambrook et al., 1989), z wykorzystaniem denaturowanego, znaczonego promieniotwórczo insertu BamHI-XbaiI plazmidu pIM230 jako sondy.
Dla każdego mutanta szczepu, z płytek master wydłubywano pozytywne kolonie za pomocą wykałaczki i poddawano je hodowli w ciągu 15-18 godzin w temperaturze 37°C w 5ml medium LB zawierającym 100 pg/ml ampicyliny, po czym przeprowadzano wydzielanie minipreparatu DNA plazmidu w sposób opisany dla lizy wrzącej przez Sambrooka et al. (1989). Analiza tych preparatów DNA drogą elektroforezy na żelu agarozowym oraz porównanie wzorów wytrawiania ze specyficznymi wzorami xlnR ujawniło kolonie zawierające prawidłowy fragment BamHI xlnR o długości 5,5 kz. Sekwencję mutantów A. niger oznaczono wykorzystując specyficzne oligonukleotydy xlnR jako primery w reakcjach sekwencjonowania, jak opisano wprzykładzie 7.2. Dla mutanta NW205::13OAc1-I 5 pojedyncze podstawienie parą zasad oznaczono w położeniu 3479, co daje w wyniku zamianę leucyny w położeniu 823 SEQ ID Nr: 9 na serynę. Dla mutanta NW205:::130Ac2-5 podstawienie pojedynczą parą zasad oznaczono w położeniu 3655, co dało zamianę tyrozyny w położeniu 864 SEQ ID Nr: 9 na kwas aspartowy. Te mutacje identyfikują obydwa mutanty jako mutanty xlnR.
185 052
Przykład 8: Ekspresja xlnR w A. niger
Przykład 8.1: Kompłementacja mutantów A. niger nie dających ekspresji w układzie ksylanolitycznym
Dla komplementacji we wszystkich mutantach nie dających ekpresji, wszystkie 10 mutantów NW205:: 130Ac, jak opisano w przykładzie 4, poddano transformacji, jak opisano w przykładzie 2 niniejszego opisu, przez połączenie protoplastów i pGW635, jako kontroli częstości transformacji, oraz dNa pIM230 dla zbadania zdolności komplementacyjnej pIM230.
Otrzymane kolonie transformantów analizowano na aktywność ksylanolityczną i porównywano z ich macierzystym mutantem szczepu przez rozłożenie ich na odpowiednim medium zawierającym 1% ksylanu owsiano-pszenicznego, jako źródła węgla. Po 2-3 dniach pojawiło się rozjaśnienie ksylanu dookoła kolonii transformantów, lecz nie macierzystego szczepu mutanta, dla wszystkich dziesięciu mutantów, wskazując zatem na przywrócenie aktywności ksylanolitycznej.
Przykład 9: Wpływ dawkowania genuxlnRnaekpresję układu ksylanolitycznegoA niger
Do zbadania potencjalnego zastosowania genu xlnR do poprawiania szczepu dla zwiększonej ekpresji ksylanolitycznej, szczep N902::200-18, zapewniający wielokrotne kopie (około 6) genuxlnRA niger, kodującego β-ksylo;zldazę, poddano transformacji do prototrofii argininy w doświadczeniu współtransformacyjnym, jak opisano w przykładzie 2 niniejszego opisu, stosując 19 μg plazmidu pIM230 zabezpieczającego xlnR oraz 2 μg plazmidu pIM650 zabezpieczającego gen argB A. nidulans (Johnstone et al., 1985). Uzyskane transformanty osłaniano na zwiększoną ekspresję endo-ksylanazy na płytkach z MM zawierającym 1% ksylan owsiano-pszeniczny. Cztery kolonie z najszybszym i największym tworzeniem się halo, wybrano do oznaczenia liczby kopii xlnR. W tym celu wydzielono DNA tych transformantów oraz odbierającego szczepu i odciśnięto szereg rozcieńczeń na membranie Hybond N. Liczbę kopii oceniono na podstawie sygnałów ustalonych po hybrydyzacji, korzystając ze znaczonego promieniotwórczo fragmentu Sma\JXbal o długości 4,5 kz, obejmującego sekwencję kodującągenu xlnR. W oparciu o porównanie ze szczepem odbierającym liczbę kopii xlnR określono na 8 w N902: :200-18-R14 i 32 w N902: :-200-18-Rł6. Dla obydwu tych transformantów wpływ zwiększonego dawkowania genu xlnR analizowano metodą odcisku Northern po hodowli szczepów w kulturze ciekłej. Prowadzono to w doświadczeniu z przeniesieniem do 2% ksylanu owsiano-pszenicznego jako źródła węgla, po wstępnej hodowli w 1% fruktozie w ciągu 18 godzin. Próbki grzybni pobierano po 8 i 24 godzinach po przeniesieniu, z których wydzielano cały DNA korzystając z TriZolu (Life Technologies) według instrukcji producenta oraz analizowano metodą odcisku Northern (Sambrook etal., 1989). Poziomy ekspresji ksylanazy B były znacznie podwyższone w tych transformantach w porównaniu ze szczepem odbierającym, jak wykryto po hybrydyzacji stosując znakowany promieniotwórczo fragment EcoKUXhol o długości 1 kz z xlnB A. niger (Kinoshita et al., 1995).
Do dalszego badania potencjalnego zastosowania genu xlnK do poprawiania szczepu w kierunku podwyższenia ekspresji endoteylanazy, A. niger poddano transformacji w sposób opisany w przykładzie 2 niniejszego dokumentu według następującego schematu: 1. pGW635 (pyrA) (kontrola pozytywna), 2. pDB-K(XA), 3. pDB-K(XA) + pIM230 oraz 4. pGW635 + pIM230. Plazmid pDB-K(XA) zawiera zarówno gen pyrA A. niger, jak i gen ksylanazy A A niger z A. tubigensis w wektorze pEMBL18. Transformanty uzyskano dla wszystkich stosowanych warunków, przy czym szczepy dające nadekspresję endo-ksylanaz wybrano na podstawie wielkości halo na osłonie płytki na ksylanie owsiano-pszenicznym (badano 20 transformantów z każdej grupy).
Z każdej grupy wybrano jeden transformant i hodowano go dla prób aktywności. Szczepy hodowano wstępnie w ciągu 18 godzin na medium zawierającym fruktozę, po czym grzybnię (2,5 g mokrej wagi w 50 ml) przenoszono do medium zawierającego 1,-4% surowego arabinoksylanu. Wszystkie hodowle prowadzono we wstrząsanych kolbach. Inkubacje prowadzono w ciągu 40 godzin w temperaturze 30°C, poziomy ksylanazy A oznaczano drogą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), natomiast aktywności P-ksylozydazy i endo-ksylanazy oznaczano dla obydwu. Chromatografię prowadzono na standardowym wyposażeniu HPLC firmy Pharmacia-LKB (Uppsala, Szwecja) z SOURCE 15 Q, w kolumnie HR 5/5-column przy prę185 052 dkości 1,5 ml/min. Bufor A - 20 mM buforu Tris, pH 7,5, bufor B - 20 mM buforu Tris, pH 7,5, z IM NaCl. Gradient od 0 do 50% buforu B w ciągu 30 minut. Detekcja przy długości fali 280 nm, przyrząd UV-VII firmy Pharmacia-LKB, zakres absorbancji 0,1-0,2, patrz fig. 3. 100 pl medium kultury rozcieńczono za pomocą 1000 pl 20 mM buforu Tris, pH 7,5 i 1000 pl takiej rozcieńczonej próbki wykorzystano w kolumnie. Aktywność ksylanazy A jest wtedy widoczna w postaci piku eluującego w przybliżeniu przy 30% buforze B. Z każdej grupy transformantów na fig. 3 przedstawiono jeden wykazujący najwyższą aktywność/pik ksylanazy A w analizie HPLC.
Aktywność endo-ksylanazy oznaczono drogą pomiaru wydzielania się barwnych fragmentów zabarwionego azuryną, sieciowanego arabinoksylanu pszenicznego (tabletki Xylazyme) z firmy Megazyme, Warriewood, Australia. Aktywność ksylanazy obliczono przez porównanie z wewnętrznym enzymem standardowym o stężeniu 100 XU/gram (jednostka ksylanazy) w temperaturze 40°C w 0,1M buforze octanowym, pH 3,4. Te same cztery transformanty badano na arabinoksylanie nierozpuszczalnym w wodzie przy takim pH, przy którym tylko ksylanaza A daje wkład do aktywności endoksylanazy. Wyniki tej analizy podano w tabeli 2.
Tabela 2
Transformant XU/gram
Pyr+ (kontrola) 4
DB-K(XA)-15 52
DB-K(XA)/'pIM230-21 111
pIM230-26 24
Z wyników przedstawionych na fig. 3 i w tabeli 2 widoczne jest, że takjak się spodziewano, transformacja za pomocą ksylanazy A kodującej gen daje znaczny wzrost aktywności enzymatycznej ksylanazy A. Niespodziewanie stwierdzono także znaczny wzrost poziomu ksylanazy po transformacji z użyciem genu xlnR aktywatora. Wskazuje to na ograniczenie poziomu aktywatora XYL R (= produkt genu xlnR) w szczepie macierzystym nie poddanym transformacji. Zatem należy spodziewać się, że w wielokopiowym transformancie pDB-K(XA) ilość transakcyjnego czynnika regulatorowego będzie czynnikiem nawet jeszcze bardziej ograniczającym. Potwierdzone jest to wynikiem dla transformanta pDB-K(XA)/pIM230, który ma poziom ksylanazy A dwa razy wyższy niż wielokopiowy transformant pDB-K(XA).
Przykład 10: Odsiewanie grzybów filamentowych dla genu xlnR
Aby przenalizować, czy możliwe jest wydzielenie przeciwstawnej części xlnR z innych grzybów drogą hybrydyzacji heterologicznej wykorzystując fragment Smal/Xba o długości 4,5 kz genu xlnR jako sondy, DNA wydzielono z następujących szczepów: N902 A. niger (argB15, cspA 1, jwnAl, metBlQ, pyrA5, NW184 A. tubingensis (cspA\,fivnA\; pyrATl), WG096 A. nidulans (pabaA\,yAY)zFGSC, NW240A. aculeatus(pyrA3) z CBS 101.43, NW217 A aculeatus(fwnAl, cspAl, pyrAl, lysAA.) z CBS 115.80, NW183 A. foetidus (awamori) (cspA 1, fwnA 1, pyrA 1.3, lysAl)zCBS 115.52, tA.japonicus CBS 114.51 orazQM9414 Trichoderma reesei. 1-2 pg DNA trawiono za pomocąBamHI lub Xhoi, a następnie analizowano metodą Southema w sposób opisany w przykładzie 3. Warunki hybrydyzacji były następujące: hybrydyzacja w 6 x SSC (20xSSC na 1000 ml: 175,3 gNaCl, 107,1 gcytrynianu sodowego. 5,5H20, pH 7,0), 0,05% pirofosforanu sodowego, roztwór Denhardta 5 * (100 x roztwór Denhardta na 500 ml: 10 g Ficoll-400,10 g poliwinylopirolidonu, 10 g albuminy osocza krwi bydlęcej (Pentax Fraction V) oraz 20 pg/ml DNA z denaturowanej spermy śledzia w temperaturze 56°C w ciągu 18-24 godzin, a następnie przemywania dwa razy po 30 minut w 5 x SSC i 0,1% SDS w temperaturze 68°C oraz dwa przemywania po 30 minut w 2 x SSC i 0,1% SSC w temperaturze 56°C. Po hybrydyzacji membranę owinięto Saranem i poddano autoradiografii w ciągu nocy w temperaturze -70°C korzystając błony rentgenowskiej Kodaka i kasety X-Omatic Kodaka z regularnymi wzmacniającymi ekranami.
185 052
W wyniku znaleziono fragmenty hybrydyzacyjne dla wszystkich analizowanych grzybów, przy czym bardzo silne sygnały znaleziono w A. niger, A. tubigensis i A.joetidus, natomiast w innych badanych szczepach znaleziono czyste sygnały hybrydyzacyjne.
Przykład 11: Zastosowanie systemu selekcji z wykorzystaniem innych fragmentów promotora
Skonstruowano plazmidy zawierające fragmenty promotora z genu abfA A. niger (Flipphi et al., 1994) i genu abfB A. niger (Flipphi et.ak , 1993). Dla konstrukcji zawierającej fragment promotora abfA., fragmentXhol/Pstl o długości 1,4 kz z pIM900 (Flipphi et al., 1994) poddano ligacji w pAlter trawionym za pomocą SaWPstl (Promega) w sposób opisany w przykładzie 1. Stosując układ mutagenezy Altered Sites in vitro (Promega), utworzono centrum restrykcyjne Xhol w położeniach -83 do -88 względem centrum inicjacji translacji (Flipphi et al., 1994). Z otrzymanego plazmidu wydzielono fragment SstUXhol z 953 parami zasad. Ten fragment oraz fragment z pIM 130 poddano ligacji do pBluescript (Statagene) trawionego za pomocą Ssfl/Ahol. Plazmidy mające prawidłową orientację fragmentuXhol o długości 1,5 kz zidentyfikowano przez trawienie za pomocą BglCL Otrzymany plazmid był plazmidem pAP8.
Analogicznie fragment Pstl z 910 parami zasad z promotora abfB wydzielono z pIM991 (Flipphi et al., 1993) i poddano ligacji w pEMBLl 9 trawionym za pomocąPMl. Otrzymany plazmid trawiono stosując Sali i poddano ligacji z fragmentem Xhol o długości 1,5 kz z plazmidu pIM130. Plazmidy zawierające obydwa- fragmenty o prawidłowej orientacji zidentyfikowano przez trawienie za pomocą BamHI. Otrzymany plazmid był plazmidem pIM132.
Trzeci plazmid zawierający fragment z pgall A. niger skonstruowano przez klonowanie fragmentu Xbal/Xhol z 1450 parami zasad do wektora pAlter. Korzystając z układu mutagenezy Altered Sites II in vitro (Promega), utworzono centrum restrykcyjne Xhol w położeniach -107 do -112 w odniesieniu do centrum inicjacyjnego translacji (Bussink et al., 1991). Z otrzymanego plazmidu wydzielono fragment XbaUXhol o długości 1,2 kz. Ten fragment oraz fragment Xhol o długości 1,5- kz z pIM130 poddano ligacji do pBluescript (Stratagene) trawionego za pomocą XbdUXhol. Plazmidy mające prawidłową orientacje fragmentu Xhol o długości 1,5 kz identyfikowano przez trawienie za pomocą HirDIll. Otrzymany plazmid był plazmidem pIIP7. Z tego samego genu pgall wydzielono fragment HinDUUPstl z 223 parami zasad i poddano go ligacji w pEMBL19 trawionym za pomocą HinDUUPstl.. Otrzymany plazmid trawiono stosując Sali i poddano ligacji z fragmentem Xhol o długości 1,5 kz z plazmidu pIM 130. Plazmidy zawierające obydwa fragmenty w prawidłowej orientacji identyfikowano przez trawienie stosując HinDIII. Otrzymany plazmid był plazmidem pHPII.
Wszystkie cztery fragmenty wprowadzono do NW219A. niger drogą transformacji opisanej w przykładzie 2 stosując 10 mM L-arabitol jako induktor w doświadczeniach transformacji z zastosowaniem konstrukcji zawierających fragmenty promotora abf (plazmidy AP8 i pIM132) i 1% kwas poligalakturonowy (USB Chemicals) w przypadku plazmidów zabezpieczających fragmenty pgall. Podczas gdy dla plazmidów AP8 i pIM132 transformanty znaleziono przy wysokiej częstości, to w doświadczeniu z transformacjąz zastosowaniem fragmentu promotora pgall, zawierającego plazmidy pIIP7 i pHPII, znaleziono odpowiednio tylko 5 i 7 transformantów.
Transformanty uzyskane z doświadczenia transformacyjnego z zastosowaniem plazmidów pAP8 i pIM132 (fragmenty promotora abf analizowano pod względem fenotypu w sposób opisany w przykładzie 3 stosując medium zawierające 10 mM L-arabitolu/50 mM sorbitu, 10 mM L-arabitolu/50 mM D-glukozy oraz 50 mM D-glukozy. Spodziewany fenotyp: rozwój na 10 mM L-arabitolu/50 mM sorbitu, brak rozwoju na 10 mM L-arabitol/50 mM D-glukoz i 50 mM D-glukozie, znaleziono dla 10 z 29 transformantów otrzymanych z plazmidu pAP8 oraz 13 z 30 transformantów otrzymanych z plazmidu pIM132. Transformanty otrzymane z plazmidu pIIP7 i pHPII badano na medium zawierającym 1% kwas poligalakturonowy, 1°% kwas poligalakturonowy/50 mM D-glukoza oraz 50 mM D-glukozy. Jednakże obydwie klasy transformantów nie wykazywały spodziewanego fenotypu i wszystkie były zdolne do rozwoju na wszystkich trzech mediach. Sugeruje to, że te transformanty pochodziły z podwójnego krzyżowania na lokusie pyrA..
185 052
W oparciu o wyniki dla fragmentu promotora pgall, zawierającego plazmidy, zbadano czy można poprawić częstość transformacji przez poprawienie indukcji. Przypuszczano, ze transformacja zawodzi w mniejszym lub większym stopniu z powodu braku induktora, ponieważ nie był dostępny żaden monomeryczny induktor poligalaturonaz, a zatem polimer musi ulec degradacji dla wydzielenia induktora i uzyskania ekspresji. Przebadano, czy uzupełnienie medium małą ilością urydyny może rozwiązać ten problem. W tym celu przebadano NW219 i transformant NW219::pIM132#30 na medium zawierającym 1% ksylan owsiano-pszeniczny, wywołując indukcję abfB, w połączeniu ze wzrastającą ilością urydyny, odpowiednio 0,0,001, 0,005,0,1,1,5 i 10 mM. W tym doświadczeniu przyjmujący szczep NW219 nie rozwijał się na mediach zawierających mniej niż 0,01 mM urydyny, natomiast szczep transformanta NW219: :pIM 132#30 rozwijał się we wszystkich zastosowanych warunkach. Jednakże stopień zarodnikowania i morfologia kolonii zmieniały się, przy czym najmniejsze stężenie urydyny dające zarodnikowanie dzikiego typu wynosiło około 0,01 mM urydyny.
W oparciu o te wyniki transformację NW219 A. niger z zastosowaniem plazmidów pIIP7 i pHPII powtórzono MMS w sposób opisany w p^z^^^^<^:zi«e 2. zawieraaący 1% pektynę cytryny (stopień estryfikacji 45%) (Copenhagen Pectin factory), oraz dwa warunki uzupełnienia urydyny, odpowiednio 0,01 mM i 0,005 mM. Dało to w wyniku zwiększoną liczbę znalezionych transformantów, które przetestowano na mediach zawierających 1% pektynę cytryny, jak opisano wyżej, 1% pektynę cytryny/50 mM D-glukozę oraz 50 mM D-glukozę, dla których spodziewany fenotyp odpowiadał odpowiednio wzrostowi, brakowi wzrostu i brakowi wzrostu. Spodziewany fenotyp znaleziono dla 10 z 30 uzyskanych transformantów pIIP7 oraz dla 9 z 30 transformantów pHPII.
Wybór transformantów o spodziewanym fenotypie analizowano metodą Southema. DNA wydzielano i analizowano w sposób opisany w przykładzie 3. Dla transformantów pochodzących z fragmentu promotora abfA, zawierającego plazmid pAP8, DNA trawiono stosując Clal, dla transformantów pochodzących z pIM132 (ab/B) stosując Clal, dla transformantów pochodzących z pgall, plazmidów pIIP7 i pHPII stosując Clal. W oparciu o autoradiografię uzyskanąpo hybrydyzacji z zastosowaniem następujących znaczonych promieniotwórczo fragmentów: fragment Xbai 0 długości 3,8 kz oraz fragment, Clal o długości 1,2 kz genu pyrA,, transformanty wyselekcjonowano na podstawie szacunkowej liczby kopii. Wyselekcjonowano następujące transformanty: AP8/16 (abfA), NW219:: 132#8 (2 kopie) oraz NW219::NW132#30 (3-4 kopie)(a6/B), NW219::pIIP7#3 (2 kopie) i NW219: ®HPIIP#9 (2 kopie) (pgall).
Wyselekcjonowane transformanty poddano mutagenezie w sposób opisany w przykładzie 4. Mutanty poddane derepresji przez arabinofuranozydazę selekcjonowano na medium + 50 mM D-glukozy oraz na medium + 10 mM L-arabitolu/50 mM D-glukozy, natomiast mutanty poddane derepresji przez poligalakturonazę selekcjonowano na medium + 50 mM D-glukozy i na medium + 1 % pektyna cytryny/50 mM D-glukoza. Po 4-7 dniach ustalono 5-10 kolonii mutantów na każdej płytce, które na podstawie ich morfologii podzielono na trzy klasy: duże, dobrze zarodnikujące kolonie, kolonie o średniej wielkości, dobrze zarodnikujące, oraz kolonie małe, słabo zarodnikujące. Przeprowadzono selekcję losową20 z tych mutantów, a wybrane mutanty przebadano na mediach zawierających różne źródła węgla lub substraty. Ustalono, że kolonie mutantów arabinofuranozydazowych były zdolne do rozwoju na mediach zawierających D-glukozę, D-glukozę/L-arabitol oraz 1 -arabitol, podczas gdy szczepy macierzyste zdolne były do rozwoju tylko na medium zawierającym L-arabitol jako źródło węgla. Analogicznie mutanty poligalakturonazowe także były zdolne do rozwoju na medium + 50 mM D-glukozy, na medium + 1 % pektyna cytryny/50 mM D-glukoza oraz na medium + 1% pektyna cytryny. Szczepy macierzyste mogły rozwijać się tylko na medium + 1% pektyna cytryny. Mutanty arabinofuranozydazowe (20 każdego) badano ponadto na chromogenicznym podłożu metyloumbelliferylo-a-L-arabinofuranozydu w sposób opisany w przykładzie 4. Podczas gdy szczepy macierzyste nie wykazywały żadnej arabinofuranozydowej ekspresji mediów zawierających D-glukozę/L-arabitol, jak wykryto drogą fluorescencji substratu, to mutanty wykazywały zmienne poziomy ekpresji, przy czym najwyższe poziomy stwierdzono w mutantach wyselekcjonowanych na medium D-glukozowym.
185 052
Mutanty poligalakturonazowe badano na medium + 1%o pektyna cytryny/50 mM glukoza, a dwa i trzy dni po zaszczepieniu płytek aktywność poligalakturonazowąpoddano wizualizacji przez barwienie w sposób opisany przez Rieda i Collmera (1985). W tym przypadku, dla szczepu macierzystego, znaleziono małe halo, podczas gdy w mutantach wykryto tworzenie się zwiększonego halo o różnych stopniach.
Zgodnie z przykładem 4 na medium zawierającym FOA wyselekcjonowano także mutanty nie dające ekpresji. Dla tych szczepów poddano mutacji NW219:: 132#30(abfB) i rozłożono na medium + 10 mM L-arabitol + 1 mg/ml FOA +10 mM urydyna. Po 7-10 dniach wyselekcjnowano mutanty i rozłożono na medium zawierającym 10 mM L-arabitol/50 mM sorbit, 10 mM urydyna, z wierzchnim agarem zawierającym 0,5% arabinianu AZCL (Megazyme, Sydney, Australia) do wykrywania ekpresji endo-arabinianu. Dwa z 30 badanych transformantów, 132/30 F12 i F26, nie były zdolne do wydzielania barwnika z podłoża, co jest wskaźnikiem braku aktywności endo-arabinianu. Po hodowli tych transformantów w ciekłym medium zawierającym 10 mM L-arabitol i 10 mM urydynę, a następnie pomiarze aktywności arabinofuranozydazowej w przesączach kultur, ustalono przynajmniej 4-krotny spadek aktywności.
Szczep NW219::pIIP7#3 poddano mutacji i rozłożono na medium zawierającym 1% pektynę cytryny/50 mM sorbit, 10 mM urydynę i 1 mg/ml FOA. Po inkubacji płytek w ciągu 6-10 dni mutanty wydłubano i osłonięto na aktywność poligalakturonazową w sposób opisany wyżej. Ustalono, że trzy mutanty wyselekcjonowane z 65 mutantów mają obniżone tworzenie się halo po barwieniu na aktywność poligalakturonazową, co wskazuje na spadek ekspresji poligalaturonazy.
Przykłady 7, 8 i 11 z europejskiego opisu patentowego nr EP 95201707,7, które jest biegnącym europejskim zgłoszeniem patentowym, którego kopia została włączona po wypełnieniu przedmiotowego dokumentu i którego przykłady zostały także skopiowane do niniejszego dokumentu.
Przykład 7z europejskiego opisu patentowego nr 95201707.7: Transformacja A. niger z wykorzystaniem plazmidu pIM200
250 ml medium kultury, składającego się z medium uzupełnionego 2% glukozy, 0,5% wyciągu drożdżowego, 0,2% kwasów Casamino (bez witamin), 2 mM leucyny, 10 pM nikotynoamidu, 10 mM urydyny, zaszczepiono za pomocą 1*106 zarodników na ml szczepu NW155 (cspAl, argB13, pyrA6, nicAl, leuAl, prtF28)(pochodzące zNW228, Van den Hombergh et al., 1995), po czym grzybnię hodowano w ciągu 16-18 godzin w temperaturze 30°C w orbitalnej wstrząsarce New Brunswick przy prędkości 250 obrotów na minutę. Następnie grzybnię zebrano na Myracloth (gaza nylonowa) za pomocą lejka Buchnera z łagodnym ssaniem i przemyto kilka razy za pomocą SP6(SP6: 0,8%NaCl, 10mM buforu fosforanu sodowego, pH 6,0). 150mgNovozyme 234 rozpuszczono w 20 ml SMC (SMC: 1,33 M sorbit, 50 mM CaCl2, 20 mM buforu MES, pH 5,8), do którego dodano 1 g (ciężar wilgotny) grzybni i który ostrożnie ponownie zawieszono. Taką zawiesinę poddawano inkubacji z delikatnym wstrząsaniem w ciągu 1-2 godzin w temperaturze 30°C, przy czym co każde 30 minut grzybnię ponownie ostrożnie zawieszano i pobierano próbkę do kontrolowania tworzenia się protoplastów, korzystając z hemocytometru do liczenia protoplastów. Gdy jestjuż obecna odpowiednia ilość protoplastów (więcej niż 1* 108), to zawiesza się je ponownie ostrożnie, a odłamki grzybni usuwa drogą filtracji przez sterylny sączek z wełny szklanej. Protoplasty oddzielono drogąwirowania w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C przy prędkości 3000 obrotów na minutę w wirówce stołowej, po czym usunięto klarowną ciecz, a pastylki ostrożnie ponownie zawieszono w 5 ml STC (STC: 1,33 M sorbit, 50 mM CaCty, 10 mM Tris/HCl, pH 7,5). Taki etap przemywania powtórzono dwukrotnie, po czym protoplasty na koniec ponownie zawieszono w STC przy gęstości 1*108na ml.
Transformacje przeprowadzono przez dodanie 20 pg DNA pIM200 i 5 pg pGW635, zawierające gen pyrA A. niger (rozpuszczony w 10-20 pl TE), do 200 pl zawiesiny protoplastów razem z 50 pl buforu PEG (bufor PEG: 25% PEG-6000,50 mM CaC^, 10 mM Tris/HCl, pH 7,2), ostrożne mieszanie przez pipetowanie kilka razy do góry i do dołu, a następnie poddanie inkubacji w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie dodano 2 ml buforu PEG, roztwór ostrożnie mieszano i poddano inkubacji w temperaturze pokojowej w ciągu następnych 5 minut,
185 052 po czym dodano 4 ml STC i mieszano mieszadełkiem wirowym. Jednomililitrowe porcje tej zawiesiny dodano następnie do 4 ml agaru wierzchniego stabilizowanego osmotycznie za pomocą 0,95 M sacharozy i wylano na osmotycznie stabilizowane płytki. Dla kontroli A. niger poddano także transformacji za pomocą pGW635.
Przykład 8 europejskiego opisu patentowego nr 95201707.7:
Analiza transformantów
Transformanty z pIM200 uzyskane w przykładzie 7 analizowano pod względem fenotypu przez rozłożenie na medium zawierającym 1% ksylan owsiano-pszeniczny i 1 mM 4-metyloumbelliferylo-(D-ksylozydu. Z 26 badanych transformantów pięć wykazywało zwiększoną fluorescencję. Transformanty te wraz z transformantem PYR*, jako odnośnikiem, hodowano na medium zawierającym 1 % ksylan owsiano-pszeniczny w ciągu 20,27 i 42 godzin, po czym mierzono aktywność (-ksytozydazy w kierunku PNP-X. Wyniki zebrano w tabeli C.
Zwiększony poziom aktywności β-ksylozydazy stwierdzono we wszystkich pięciu wyselekcjonowanych transformantach, przy czym najwyższy poziom był większy ponad 30 razy niż aktywność z dzikiego typu. Wyniki te potwierdzono analizą odciskową Western, stosując przeciwciało anty-P-ksylozydazy, przygotowane w sposób opisany w przykładzie 3 europejskiego opisu patentowego nr EP 95201707.07, oraz za pomocą zestawu analitycznego Bio-Rad Immun-blot GAR-AP, postępując według instrukcji dostawców.
Tabela C
Aktywności p-ksylozydazy w transformantach A. niger aktywność (mU/ml przesączu kultur) po:
20 godzinach 27 godzinach 42 godzinach
pGW 635 15 16 17
XlsAl 82 86 51
XlsA4 90 112 78
XlsA8 211 239 384
XlsA9 63 110 74
XlsA12 96 295 527
Przykład 11 europejskiego opisu patentowego nr EP 95201707.7: Rozerwanie genu xlnD A. niger
Przykład 11.1: Konstrukcja rozciętych plazmidów pIM203 i pIM204
Rozcięte plazmidy genów pIM203 i pIM204 skunstruowano przez utworzenie fragmentu wewnętrznego genu xlnD drogą PCR. Fragment wytworzono wykorzystując oligonukleotydy pochodzące z sekwencji xlnD (SEq ID Nr: 8). XylosOOl pochodził z położeń 1157 do 1176, natomiast xylos004 pochodził z- położeń 3147 do 3164. Fragment generowano za pomocą PCR z 10 pl buforu reakcyjnego 10* (100 mM Tris-HCl, pH 8,3,500 mM KC1,15 mMMgC^, 0,01% żelatyny), 16 pl 1,25 mM każdego z czterech trójfosforanów dezoksynukleotydów, 1 ng DNA plazmidu pIM200 oraz 1 pg każdego z nukleotydów, o objętości końcowej 100 pl.
Taką mieszaninę reakcyjną mieszano, a następnie dodano do niej 1 pl polimerazy TAQ (5 jednostek/pl) (Life Technologies). DNA poddano denaturacji przez inkubację w ciągu 3 minut w temperaturze 92°C, z kolejnymi 25 cyklami, 1 minuta w temperaturze 92°C, 1,5 minuty w temperaturze 52°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C. Po takich 25 cyklach mieszaninę poddano inkubacji w ciągu 5 minut w temperaturze 72°C. Analiza produktów reakcji drogą elektroforezy na agarozie wykazała fragment z około 2000 parami zasad, co odpowiadało spodziewanej wielkości na podstawie sekwencji genu. Otrzymany fragment poddano subklonowaniu w wektorze pGEM-T (Promega) uzyskując w wyniku plazmid pIM202. Plazmid pIM203 skonstruowano przez ligację fragmentu Smal/Pstl z pILJ 16 (Johnstone et al., 1985), zawierającego gen argB A. nidulans (Upshall et al., 1986), w wektorze pIM202 trawionym za pomocąEcoRY/Pstl. Plazmid pIM204 skon34
185 052 struowano przez ligację fragmentu Nsil/Xbal z pIM130 (niniejszy dokument, EP 95202346.3), zawierającego gen pyrA pod kontrolą sekwencji UAS promotora xlnA A. tubigensis, w wektorze pIM202 trawionym za pomocą Spel/Nsil.
Przykład 11.2: Przerwanie genu xlnD w A. niger
Plazmidy zawierające wewnętrzny fragment xlnD, jak również gen argB (pIM203) lub gen pyrA (pIM204), jak opisano w przykładzie 11.1 zgłoszenia europejskiego, wykorzystano do rozerwania genu xlnD A. niger. W tym celu N902 A. niger (argB 15, cspAl,/wnAl, metB 10,pyrA5) poddano transformacji, jak opisano w przykładzie 2 tego dokumentu, korzystając z plazmidów pIM203 i pIM204, dających odpowiednio selekcję względem prototrofii argininowej i urydynowej. Otrzymane transformanty odsiewano na aktywność na metyloumbelliferylo-^-D-ksylozydzie na płytce 1% ksylanu, jak opisano w przykładzie 8 współbiegnącego zgłoszenia europejskiego. W obydwu grupach osłaniano 20 transformantów. Z tych transformantów, jeden z każdej grupy miał bardzo silnie obniżony poziom aktywności MUX po 24 godzinach wzrostu. Analiza metodą Southema wybranych transformantów, jak opisano w przykładzie 3 biegnącego złoszenia, wykazała dla transformanta pIM203 wielokopiową integrację na lokusie homologicznym xlriD. W przypadku transformanta pIM204 pojawiła się pojedyncza homologiczna integracja na lokusie xl nD. Analiza tych transformantów na aktywność PNP-X, jak opisano w przykładzie 8 współbiegnącego zgłoszenia, wykazała co najmniej 100-krotny spadek aktywności P-ksylozydazy.
Przykład 11.3: W pływ nadekspresj i i inaktywacj i genu xlnD na ekspresj ę układu ksylanolitycznego A. niger
Dla określenia wpływu ekspresji xlnD na ekspresję widma ksylanolitycznego N902 A. niger, dwa wielokopiowe transformanty xlnD w N902 oraz szczepy z rozerwanym genem xlnD hodowano w ciekłej kulturze. Przeprowadzono to w doświadczeniu z przeniesieniem do 2% ksylanu owsiano-pszenicznego lub 3% D-ksylozyjako źródła węgla, po wstępnej kulturze w 1% fruktozie w ciągu 18 godzin. Aktywność beta-ksylozydazy oznaczono jako aktywność PNP-X w przesączu kultury. Za pomocą obydwu źródeł węgla powinna być widoczna wyraźna nadekspresja dla transformantów, w przeciwieństwie do prawie braku aktywności PNP-X dla obydwu transformantów z inaktywacji (pIM203 i pIM204). Transformanty z rozerwanym genem xlnD wykazywały początkowo obniżony poziom ekspresji endo-ksylanazy, który jednakże wzrastał ostatecznie w czasie po 16 godzinach dając w wyniku zwiększone poziomy aktywności w porównaniu z A. niger typu dzikiego, a zatem dając w wyniku preparaty ksylanazowe wolne od P-ksylozydazy.
Przesącze kultur analizowano następnie drogą analizy HPLC, korzystając z układu Dionex i Pulsed Amperometric Detection. W tym celu 1 nil przesączu kultury gotowano bezpośrednio po zebraniu w celu inaktywacji enzymów ksylanolitycznych, po czym wirowano próbkę w ciągu 10 minut (14000 obrotów na minutę, wirówka Eppendorfa). Otrzymaną klarowną ciecz rozcieńczono 5-krotnie w bidest i analizowano 20 pl za pomocą HPLC korzystając z kolumny Dionex CarboPac 100. Analiza wykazała, że podczas gdy w typie dzikim oraz w transformantach nadekpresji oligomery ksylozy mogły być wykryte w przesącza kultury tylko w początkowym etapie, to w mutancie z rozerwaniem ksylobioza i w niejszym stopniu ksylotrioza mogły nagromadzić się w przesączu kultury, a zatem dając w wyniku źródło ksylooligomerów, a zwłaszcza ksylobiozy i ksylotriozy.
185 052
Referencje
Andrienopoulos, A. and Hynes. M.J. (1988). Mol. Cell. Biol. 8:3532-3541.
Aviv, H. and Leder. P. (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 11:-1408^1412. Belence D. J. end Turner G. C. (1985) Gene 36: 321-331.
Beiley, A.M., et el. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 5273-4278.
Beiley. A.M., Biely., P. end Poutanen, K. (1992) J. Biotechnol. 23: 257-270.
Berka. R.M., Ward, M., Wilson, L.J., Hayenga, K.J., Kodama. K.H.. Carlomegno, L.P. and Thompson, S.A. (1990). Gene; 86: 153-162.
Bussink. H.J.D., van den Hombergh, J.P.T.W., vzn den IJssel, P.R.L.A. and Visser J. (1992). Appl. Microbial, end Biotechnol.:37, 324-329.
Davies, R.W. (1991). Mo^uler biology of a high-level recombinant protein production system in Aspergillus. In Leong, S.A. and Berka. R.M. (Eds), Mo^uler industrial Mycology: systems and applications for filamentous fungi, Marcel DeOOer, Inc., pp 45-82.
EOwall, K. end Ruusla. T. (1991). Nucl. Acids Res. 19: 1150.
FelenboO, B. and Seely-Lewis H.M. (1994). In: Aspergillus: 50 years on. Mertinelli, S.D. end Kinghom. J.R. (Eds): 141-179.
Flipphi, M.J.A., ven den Heuvel, M., ven der Veen, P., Visser, J., end de Graaff, L.H. (1993) Curr. Genet. 24:525-532.
Flipphi, M. J.A., Visser. J., van Per Veen. P. and de Greaff, L.H. (1994) Microbiology 140:2673-2682.
Fowler, T., et el. (1990). Curr. Genet. 18:537-545.
Gems, D.H. and Clutterbuck A.J. (1993) Cum Genet. 24: 520-524.
Goosen T, Bloemheuvel G,:Gysler C, Bie DA de, Broek HWJ ven den, Swart K (1987) Curr Genet 11:499-503
Graaff LH de (1988) The structure and expressian of the pyruvate kinase gene of Aspergillus nidulans and Aspergillus niger PhD Thesis Lendbouw Universiteit, Wageningen, The Netherlends
Graaff L.H. de, van den Broeck, H.C., ven Dojen A.J.J. end Visser, J. (1994). Mol Microbiol. 12: 479-490.
Gwynne. D.I., Buxton. F.P., Gleeson, M. A. and Davies R.W. (1987) Genetically engineered sscretian of foreign proteins from Aspergillus species. In: Burgess, R. (eds.), Protein purificetion : Micro to macro, Alan R. Liss, NY., pp 355-365.
Hermsen, J.A.M., Kusters-ven Someren, M.A., Visser, J. (1990) Curr. Genet. 18:161-^^6. c.f. Hinnen. A., et el., (1995). In: Gene expressian in recombinant microorgenisms., Smith.
A. (ED) Marcel Dekker Inc. New York: 121-193.
c.f. Hinnen. A., et al., (1995) In: Gene expressian in recombinent microorgenisms. Smith,
A. (ED) Marcel DeOOer Inc. New York: 121-193.
c.f. Hinnen, A., et el., (1995). In: Gene expression in recombinant microorgenisms. Smith,
A. (ED) Marcel Dekker Inc. New York: 121-193.
Hombergh ven den, J.P.T.W., ven de Υοπά^-γ^ιΐ, P.J.I., ven der Heijden, N.C.B.A., end Visser. J. (1995) Curr. Genet. 28:299-308.
Johnstone. I.L., Hughes, J. and Clutterbuck, A.J. (1985) EMBO J. 4: 1307-1331.
Katz, M.E. and Hynes, M.J. (1989). Mol. Cell. Biol. 9:5696-5701.
Kelly, J.M. and Hynes M.J. (1985). EMBO J 4:475-479
Kelly, J.M. and Hynes, M.J. (1987). Curr. Genet. 12:21-31.
Kinoshita K., Tekzno, M., Koseki, T., Ito. and Iweno, K. (1995). J. of Ferment, end Bioeng.:79 no 5, 422-428.
Kreulis, P.J., Reine, A.R., Gedhzvi, P.L. end Laue E.D. (1992) Neture 356: 448-455.
Meniztis, T., Fritsch, E.F. and Sembrook, J., (1982). Molecular Cloning:
A Labo^ory Manuel. Cold Spring Hebor, New York: Cold Spring Hzbor Leboretory
Press.
185 052
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Habor, New York: Cold Spring Habor Laboratory Press.
Sanger, F., Nickelsen, S. and Coulson A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467.
Schutte, J.B. (1991), Nutritional value and physiological effects of D-xylose and L-arabinose in poultry and pigs. Datapress & Datavisions, Wageningen, 173 pp.
Sudrez, T., Vieira de Queiroz, M., Oestreicher, N. and Scazzocchio, C. (1995). EMBO J. 14, no 7:1453-1467.
a) Unkles, S.E., et al. (1989). Gene 78: 157-166 and
b) Unkles, S.E., et al. (1989). Mol. Gen. Genet. 218:99-104.
Verdoes, J.C., Punt, P.J., Schrinckx. J.M., van Verseveld, H.W., Stouthamer A.H., and van den Hondel, C.A.M.J.J. (1993). Transgeneic res.:2. 84-92.
Verdoes, J.C., Punt. P.J. and van den Hondel C.A.M.J.J. (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 195-205
Verdoes, J.C. (1994) Molecular genetic studies of the overproduction of glucoamylase in Aspergillus niger. Thesis Vrije Universiteit Amsterdam, The Netherlands.
Vishniac, W. and Santer, M. (1957) Bacteriol. Rev. 21: 195-213.
Wilson, L.J., Carmona, C.L. and Ward, M. (1988). Nuci. Acids Res. 16:
Whittington, H., Kerry-Williams, S., Bidgood, K., Dodsworth, N.,
Peberdy., J., Dobson, M., Hinchcliffe, E., and Ballance. D.J. (1990). Curr. Genet. 18:
531-536.
185 052
Lista sekwencji (1) Informacja ogólna:
(i) Zgłaszający:
(A) Nazwa: Agricultural University Wageningen (B) Ulica: Costerweg 50 (C) Miasto: Wageningen (E) Kraj: Holandia (F) Kod pocztowy (ZIP): 6701 BH (ii) Tytuł wynalazku: Nowy sposób wydzielania mutantów i klonowania genu dopełniającego (iii) Liczba sekwencji: 9 (iv) Postać komputerowa:
(A) Typ środowiska: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentin Release #1.0, wersja #1.25 (EPO) (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 1 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyńcza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 1
CACJATGCAT CCCCTTTATC CGCCTGCCGT 30 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 2 (i) Charraterystyka seewencji:
(A) Długość: 37 par zasad
185 052 (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyńcza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 2
CAATTGCGAC TTGGAGGACA TGATGGGCAG ATGAGGG (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 3 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 20 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyńcza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 3
AGAGAGGATA TCGATGTGGG (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 4 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 37 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyńcza
(D) Topologia: liniowa
ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny)
xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 4
CCCTCATCTG CCCATCATGT CCTCCAAGTC GCAATTG (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 5 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 2054 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna
185 052 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (iii) Hipotetyczna: brak (iii)Antysensowna: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(A) Organizm; Aspergillus tubigensis (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: sygnał__TATA (B) Umiejscowienie: 848..854 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Umiejscowienie: 950..1179 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: intron (B) Umiejscowienie: 1179..1228 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwea/klucz: ekson (B) Umiejscowienie: 1229..1631 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Umiejscowienie:łącznie(950..1179, 1229..1631) (D) Inna informacja: /numer EC= 3.2.1.8 /produkt= „1,4-betaksylanoksylanohydrolaza /gen: „xlnA /nazwa standardowa: „endoksylanaza (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: peptyd mat
185 052 (B) Umiejscowienie: 1031..3631 (ix) Cenha-znamienna:
(A) Nazwa/klucz: peptyd eig (3) Umiejscowienie: nSO..1031 (xo) Opie eekwennii: SEQ ID Nr: 0
AACGTCTGCA GTCCCGTACT GTTTACCAAA ATGCCCGGCC ACTGGTGGAT ATACCACCTT 60
GTAATACGTT GCCGCAATCC GCCCCTACTC CCTTATGAGA TCCC^JkATCCC TGCAG'GCCTT 120
TTATTGCGAC ATAGGCT'CCT CCTGTCCGAA /ATCGTAGGT /AACCGTT.TC CTTTTTCATG 180
ATGAAAGTTT GGCTCCCCCG GCCCTCCATT AAGGTAAGGA 'ACσTGCACTA ^00^(31 240
TATTTTCGCT CGATGTGAGC GGGCCCCACC TCTTCAGCAC CCACCG^CATGG 300
CAGTCTTCCG GCCTATCACC TCAATATATT AACCTCCACC CCTTTCTCCC CCTCCTCGTC 36(6
ATCTTTTTCA GAATCGGTGT CCCTGGAACT TCATCGTTCA TCTAGT(GGTT CCTCTCCCTA 420
CCCCTTCCTC TAAGCTTGAT AGCCACTAAT TCATCCTATT CAACCATCAG ATAACTGTCT 480
CAAA(CGATGA ACCGACCCTCG TATAATCGCA TCTATTTTTA ATTCCACT(CT ACTCACCCTG 540
TTAACCT'TTT CTCGGCTACT CGTCTAGCTC TCTCCCTTGCT TCCCTGCCAC ATACTACACT 600
CCTTGTAACC GCTTGTTGTT CCAGACCCCA TTTATCAACC TGTTAGCCAA ATCTGGTCCC 660
TTGTCCCAAG ACCCGTGTTG CGAGGCGTCA TAATATAAAT TCCGCCCTAG ATACATGTCC 720
TTTTAAGCCA ATAGTCTTGC ATTATACGCT CCAG<AΓGAnG ACTGCGGGGC CGGTCTACCC 770
CTAACAAATA ACACACACCC TGCCTACTAT ATCCTGAAAT TTCCATATTA AAGACTGGGG 880
TCTC(GACTCG TACTCAAGAA ACCGCCCACT TGCACCATAT TTAATTAGAC TACGGCTTTT 9<0
TTTTCAGATC CCTCCAATCC TTTCTAATCA ACAG(CITTCA ACATACCAC TGC TAC 955
Met Lys -27
CTTC ACT GCG GCT ITT' GGC CGG CCTT TTG GTC ACG GCA ITT GGC GGT CCT 1003
Val Thr Ala AAa PPe AAa GGy Leu Leu Val Thr Ala PPe AAa AAa Ργό
-25 -20 -15 -10
GCC CCA GA CCT CGA CTG CCG TCG CGA AGT GCC GGT ATC {AA TAC (CTG 1051
Ala Pro Glu Pro AAP Leu Val Sejr Arg Ser Ala Gly Ile AAn Tyr Vvl
-5 1 5
185 052
CAA AAC TAC AAC GGC ZLAĆ CCT GGT GAT TTC ACC TAC GAC GAG ACT GCC 1099
Gin Asn Tyr Aas Gly Asn Leu GGy Asp Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala
15 20
GGA AC A TTT TCC ATG TAC TGG GGA GAT GGA-GTG AGG TCC GAA ΤΓΓ GTC 1ΐ4γ
Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp GGu Asp Gly VaA Ser Ser Asa PhA Va.l
30 35
GTT GGT CTG GGC TGG ACC ACT GGT TCT TCT AA GEGAGIGACT II89
Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Asn
45 5>0
GΓA'TΓCTTTC CCCCAGCTGT CGGCTCTCCC GTGTTTGCG C GCT ATC ACC TAC TCT 12W
Ala Ile Thr Tyr Ser
GCC GAA TAC AGC GCT TCT GGC TCC GGC TCC TAC CCT GCT CTG TTA GGC 1292
Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser da SeS Tyr Tlu Ala Vd T^ Gly
65 70
TGG GTC AAC TAT CCT CAA GCT GAG TAC TAC ATC GTC GAG GAT TAC GCT 1340
Trp Val Asn Tyr Pro Gin Ala Glu Tyr Tyir He Val Glu Asp Tyr Gly
80 85
GAT TAT AAC CCT TGC AGT TCG GCC ACC AGC CTT GCT ACC GTG TAC TCT 1388
Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser da Tir Ser Leu GGy Thr Val Tyr Sur
95 100
GAT GGA AGC ACC TAC CA GTC TGC ACC GAC ACT CGA ACA AAC GAA CCG 1436
Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Val Cys Thr Asp Thr Arg Thr Asn Glu Pro
105 IW 115
TCC ATC ACG GGA ACA AGC ACG TTC ACG CAG TAC TTC TCC GTT CGA GAG 1484
Ser Ilu Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr Gin Tyr Phe Ser Val Arg Glu
120 125 130 155
AGC ACG CGC ACA TCT GGA ACG GTG ACT GTT GCC AAC CAT TC AAC TTC 1532
Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Vd Thr Val Ala Asn His Phe Asn Phe
140 145 150
TGG GCG CAC CAT GGG TTC GGC AAT AGC GAC TTC AAT TAT CAG GTC GTG 1580
Trp dla His His Gly Phe Gly Asn Ser Asp Phe Asn Tyr Gin Val Val
155 160 165
GCG GTG GAA GCA TGG AGC GGT GCT GGC AGC GCT AGT GTC ACA ATC TCT 1628
Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly Ser da Ser Val Thr Ile Ser
170 175 180
TCT ^GAGAm GTGCCCTCGT AG^Gil^^ TCTGAAGGGG GCACTTTGCT 1681
Ser
CrCCGGTGGT CTTGAGATCG CArCCGGTCT CTCGGGTTAC ATTGCGGCTG TATAAGTCT 1741
TCTGGGGCCG CGCTCTCAGC CGCTCGCTIT rGCGCTTGCA CAGATACTCC CGTCTGGTrr 1801 rcrcτcrcτr GCGITTCCTC GCTGCITCTG CTCrCGArAG CTCATCTTT TGCGCACrAC 1861
185 052
CACAACTTGT TCGGTCGCAG TAGTCACTCC GAGCAAGGCA TTGGGAAATG GGGGATGCGG GGTGCTGCGT ACCCTCTAAC CTAGGGCATT TTAAAGGATA TTTACCCTCC AGATATTCTA TAGATACAGA CTTCTTAGGA CTGCGGGTAA TATAGAGAGC GAAATTTCTA CAGTTCGATG CAGTTCAATG CGA (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 6 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 3026 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (iii) Hipotetyczna: nie (iii) Antysensowana: nie (vil Źródło pochodzenia:
(A) Organizm: Aspergillus niger (B) Szczep: N400 (CBS 120.49) (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: sygnał TATA (B) Umiejscowienie: 643..648 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Umiejscowienie: 724..2538 (D) Inna informacja: /numer EC = 1.1.3.4 /produkt = „oksydaza glukozy /gen = „goxC (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: peptyd mat (B) Umiejscowienie:790..2538 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: peptyd sig (B) Umiejscowienie: 724..790 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 6
CTGCAGGTAC CTGAAGCCTG CCTAGTTTGA TCACCCTGAA ACCAGCACTG CCTGTCTTGA
CCTTGGTGGT GAGTTTGCAC GTGGGCTGGC TGTTCAAATA AACTCTCCAA TTGACCCTCT
CCCCGTGGAG AACACACCAA ACACTATAGG CTTTCCATTG AGGGCATGAC GAGGACCCTA
TGCTTTGTCC ACTTGGCGAG GGCTGACCGG AGCACGAATC GGGAAGGGCA GAACTCAGAA
1921
1981
2041
2054
120
180
240
185 052
TTCGCTGTTC TCGCCATGCC GAAAGTCGCT ATCCCTTGGC GCCACGATGA TTTGCGTCCA 300
GGATTCGTAT ACGTCCTCGT CCACGAGGCT GCCTACCGTC AGCGTGAGGC AGTGAGCTAA 36o
TATGGGGCCA ATAAGCCACT ACGAGGATGA CATGGCCTCT ACAGAACGAG AGACGCAGAG 420
GATCAGGACG CCAATCCTGC GCTCCACCTG TCTAAGGATT AGAT T T TGGA CTATCCAGGG 480
ATTATGGCTT CGCGAT/AITG TATTCGGGAT ACCGACGGCT GAGCACACGG AGGATGAGGT 540
TCAGCTCACG GCCCCTATCA GTATGCATTA TGAGGATGGC TTCTTGGAAA GCAGAGGAAT 600
TGGATTATCG AACAAGTTGG TTCTGGACCA TTGACTCGAG CGTATAAGTA ACCTCGTTCG 660
GTCCTCCTGT CACCTTCTGA TCAGCAACCA GCCTTTCCTC TCTCATTCCC TCATCTGCCC 720
ATC ATG CCA AAC CTT ATT GTG AGC TCG CTT GTG GTT TCC CTC GCC· GGA 768
Met Gin Tir Leu Leu Val Ser Ser -15 Leu lal Val Sei Leu AGa AAl -10
-22 -20
GCC TTG CCC A AC TAT AGT AAG AAG AT GGC AGT GGA GGC AAG CTT CTT 816
Ala Leu PrP ois Tyr Lis Arg See Arn Gy Ile dl AAl See Llu Llu
-5 1 5
ACT GAT CCC AAA GAG CTT TCC GU CGC ACG CTT CGA TTA AGT AGT GGT 864
Thr Asp Ptp Lys Asa via Ser Gy Arg Tur via Ars TTr Ile lice AAa
10 15 20 25
GCT GGA CCT CTG GCT GGA CTC AAC ACC GCT GGC CCT (ATG ACG GGG AA 912
Gly Gly GIg Leu Thr Gy Llu Tr Thr Ala AAa Arg Leu Tir du Arn
30 35 40
CCC AAC ATC CCA TTG CTC CTC ATC GGA AGT GGC TCC TAC GAG •TCG GGA 960
Pro Asn Ile Ser Val Leu via He Hu Ser dy Ser Tyr Gu Ser Ars
45 5A 55
AGA GGT CCT ATC AGT iGG GAC CTC GAC GCC tac: GGA GAC ATT ΤΓΓ GGC 1008
Arg dy Ppo Ile Ale GLu Ar p Leu Asn Ala Tyr GLy Asp lle Phe dy
60 65 70
AGC AGT GTA GAC CGC ICC TAC GAG ACC GT1 GAG CTC GAT ACC GAC AAT 1556
Ser Ser lal Asp His Ala Tyr GLu Thr lal GLu Leu Ala Thr Asn Asn
80 85
CAG ACC GAG CTG ATC AGC TAT GGA AT GGT CTT GCT HA TAT ATT CTA 1104
dn Thr Ala 90 Leu Ile Arg 95 Ser Gly Asn GLy Leu dy dy Ser Thr Leu
100 105
GTG AGT HT GGT AAC TGG ATT AGC CCC CAC AGG GCA CAG GTT GAC TAT 1152
lal Asn GLy Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala dn lal Gsp Ser
110 H5 120
m GAG ATT GTC TTT GGA AAT GAG GGC TGG AAC TH GAC AAT CTG GCC 1200
Trp du Thr lal Phe GLy Asn du dy Trp Asn Trp Asp Gsn lal Ala
125 130 135
185 052
GCC TAC TCC CTC CAG GGT GAG CGT GCT CGC GCA CCA AAT GCC ACC CCC 1248
Ala Tyr Ser reu Gin AAa Glu Arg Ala Arg AAa Ppo Asn AAa Lyy GGn
140 145 150
ATC GCT GCT TGG CAC TAC TTC AC GCA TCC Td CAC GCT CTT MC CGT 1296
Ile Cli Air <JCle His Tyr Phe Asn Ala Ser CCy His Gly Val Arsn GGy
155 160 165
ACT CTC CAT GCC GGA CCC CGC GAC ACC GG GCT GAC TAT TCT CCC CTC 1344
Thr Val His Cli Gly Pro Arg Csp Tir Gly Asp Csp Tyr Ser Pro Ile
170 175 180 185
GTC AAG GCT CTC CTC AG GCT GTC GCC GCC CGG GC CTT CCC ACC CAG 1392
VłL Lys Ale Leu Met Ser Ali Val Hu Asp Arg Gly VH Pro Tir Lys
190 195 200
CCC GAC TTC GGC TGC GCT GCC CCC CAT GG CTG TCC ATC TTC CCC CAC 1440
Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn
205 210 215
ACC TTC CAC GAA GAC CCA CTG CG TCC GAT GCC CAC CGC GAA CTA 1488
Thr Leu His Hu Asp Gin Val Arg Ser Asp Ali Ali Arg Hu Trp Leu
220 225 230
CT’ CCC AAC TAC CCA CGT CCC AAC CTG CCA CTC CTG ACC GG CAG TCT 1536
Leu Pro Asn Tyr Gin Arg Pro Asn Leu dn VlL Leu Thr Gly dn Tyr
235 240 245
ΚΓ AAG CTG CTC CTT AGC CAG AAC Gd ACC ACC CCT CCT GCC TCC 1584
ViL dy Lys Val Leu Leu Ser dn Asn dy Thr Thr Pro Arg Ali
250 255 260 265 dC GTC GAA TTC dC ACA CCA AAG Gd MA AAC Cd AAA CTT TTC GCT 1632 dy Val du Phe dy Tir Hhs Lys dy Aas Ίγ Ηΐε Aas Vv1 TTy AAa
27O 275 280
Cd CCC GAG TTA CTC CTC! GCC GCG GGC TCC GCT CTC TCT CCC AAC ATC 1680
Lys His du Vol Leu Leu AAa Ala dy Ser Ala Val Ser Pro Tir Hu
285 290 295
CTC GCA m TCC GGT ATC GGC ATG AAG TCC ATC CTG GAG CCC CTT GCT 1728
Leu du Tyr Ser dy Ile Gly Met Lys Ser ILu Leu du Pro Leu Gly
300 305 310
ATC GAC ACC CTC CTT GAG CTC CCC GTC Gd ITT AAA CTC Cd GGA Cd 1776
Ile Asp Tsr Val Val Asa Llu Ppo VvZ dy Llu Aas Llu GGn Aap GGn
315 320 325
ACC ACC GCT ACC CTC CGC TCCC Cd ATC AAC TCT GCT GCT GGC GCG Cd 1824
Thr Thr Ali Thr Val Arg Ser Arg Ile Tir Ser Ala dy Ala dy dn 330 335 340 345 dl CAG GCC ^Τ TGG ITT CCC ACC TTC AAC GAA ACC ITT GCT dl TAC 1872 dy dn Ala Ala Trp PPr AAa Tir Phe Asn Glu Tir Phe dy Alp Tyr
350 355 360
185 052
TCC 1 GAA AAG GCA l GAC 1 GAG CTG CTC AAC ACC AAG CTG GAG CAG TGG GCC 1920
Ser 1 Glu Lys Ala : 365 His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu 370 Glu Gin Trp 375 A.a
GAA GAG GCC GCC GCC CGT GGC GGA TTC CAC AAC ACC ACC GCC CTG CTC 1968
Glu Glu Ala Vol 380 Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr 385 Thr 390 Ala Leu Leu
ATC CAG TAC GAG AAC TAC CGC GAC TGG ATT GTC AAC CAC AAC GTC QCG 2016
Ile Gin Tyr Glu 395 Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Vol Asn 400 405 His Asn Val ALa
TAC TCG GAA CTC TCG CTC GAC ACT GCC GGA GTA GCC AGC TTC GAT GTG 2064
Tyr 410 Ser Glu Leu Phe Leu 415 Asp Thr Ala Gly Val Ala 420 Ser Phe Asp Val 425
TGG GAC CCC CTG CCC TTC ACC CGA GGA TAC GCT CAC ATC CTC GAC AAG 2112
Trp Asp Leu Leu Pro 430 Phe Thr Arg Gly Tyr Val His 435 He Leu Asp 440 Lys
GAC CCC TAC CTT CAC CAC TTC GCC TAC GAC GCT CAG TAC TTC CTC AAC 216O
Asp Pro Tyr Leu 445 His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gin 45O Tyr Phe Leu 455 Asn
GAG CTG GAC CTG CTC GGC ' CAG GGT GCC GCT ACT CAA CTG GCC CGC AAC 2208
Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gin Ala Ala Ala Thr Gin Leu Ala Arg Asn
460 465 470
ATC TCC AAC TCC GGT GCC ATG CAG ACC TAC TTC GGT GG GAG ACC Thr ATG Ile 2256
Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met Gin Thr Tyr Phe Ala 485 Gly Hu
475 480
ccc GCT GAT aac ctc gcg TAT GAT GCC GAT TTG AGC GGG CGG AGC GAG 2304
Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu
490 495 500 505
TAC ATC CCG CAG GAC TTG CGT CCT AAA TCA CAT GGC GCG CCT AAC TCG 2352
Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro AAn Tci His Gly Val GGy TTr Cci
510 515 520
TCC ATG ATG CCG AAG GAG ATG GGC GGT tGT GTC GAT AAT dC GGC CCT 2400
Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Vv1 Val Asp Asn AAa AAa AAg
525 530 535
GTG TAT GGT GTG CAG GGA CTG GGT CTC AAT GAT GCT TCT AAT CGG CCG' 2448
Val Tyr Gly Val Gin Gly Leu Arg Vv1 Ile Asp Gly Set Ile Ppo Pro
540 545 550
ACG CAA ATG TCG TCC CAT GTC ATG AAC CTG icg TAT GCC ATG GCG GCA 2496
Thr Gin Met Ser Ser His Val Met TTr Val Phe Ty r Ala Mee AAa Leu
555 560 565
AAA ATT TCC GGA GCT ATA CTG GAA GAA TAG CCT TCC GCG CCA 2538
Lys Ile Ser Asp Ala Ale LeL Glu Gsp TyA Ala Sey Ae t L!m
570 5775 580
TGAGTGGTAT GATGGGGATA TGAGTGAGGA TATTAGGGGA TGGTACTTAG ATGCTGGGGA 2598
185 052
GGTATAATCA TAGATTGGAT AGAATTGGTA GGTTACATAG ACAGGTTACA TGAATAGACG 2658 TTCCTTATAT GTGAGCAGAC ATTACTACCA AACAAGGGCA TTGTTCAGTT AGTCGAACGA 2718
TAGTCATATG TTTTGTACGG GAAGAAAGTT TCACTAATTA TTAAGCAAAC GGATCAGGGG 2778
TTGCCAGCTA AAATACAATC ATCCGATGTT CTATTTTCTT CAAATTGATC GACCAGTCAG 2838
TTAATGAATG CATGAGAGCA ACTCTGCGCA TCCTCTAGCT ATCTAGTCAA TAATAAGCAT 2898
GTTGTTTAAG ATGAAACACC GCCATAGACA TATTCTGTTG CTGGTGAAGC AAGCCCTCGC 2958
TAAATATGCT GATAACTTCC TATGCCAGTA GAATATTTTC CCACTCTGCT GCGCGCTCTC 3018
AAAAGCTT 3026 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 7 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1517 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (11) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (ni) Hipotetyczna: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(A) Organizm: Aspergillus niger (B) Szczep: L112 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Umiejscowienie: 339..495 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: intron (B) Umiejscowienie: 496..563 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Umiejscowienie: 564..1237 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Umiejscowienie: łącznie(339..495, 564..1237) (D) Inna informacja:/produkt=„dekarboksylaza 5'orotydynofosforanu (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 7
GCAGGGAAAA ATACGAGCTC CAATGAACCT GGGTGTGGCA ACTTCAATGG AAAGGAACTG 60
CCTTTGCAGG TGTGGCTGAA CCCCACGGTT CCGGICGGAG GCGGCGAAAT CACCCGATCfT 120
GGCTGGTGCG TGGAGGGTCG CGATGATTTA CTGACCTCCT CTTTTGCTCG ACATTGAATG
180
185 052
TGCATTGTTC ACCTCATATA AGGC^CCAGTO GCTGCTAAAT TATTCGGTAG TATTTGCGCA 240
TCTCTGGATC TACCAATTAG GGCCTATCAG TCGAAACTCC A^GCTACTCA TATTGCACAA 300
GCCTCTTTCA TCCCCGCATT AACCCCTCCA CCGACACC ATG TCC TCC AAG TCG 353
Met Ser Ser Lys Ser
5
CAA TTG ACC TAC ACT GCC GTT CCC ACC AAG CAC CCC AAT GCT CTG GGC 401
Gin Leu Tir Tyr Tnr 10 Ala Arg Aa a Ser Lys His Pro Asn Ala Leu Ma
1 5 00
AAG CGG CTG TTC GAA ATT GCT TGA GGC AAA GA GA CAA CTG GCA CTT 449
Lys Arg Leu Phe Glu Ile Ala G Gl AAa LyL Lys 'shT A SA V al ThT vva
25 30 35
TCT GCC GAC GTT ACC ACC ACT TAA GGA CTC ATC AAG TTC TCT TG c 495
Ser Ala Asp lal Tir Tir Thr· Lls GGu Leu ueL Asa peL A la G sa
4o 45 50
ATAGGGCAAG CGGGGATCCT G^CTGTTTAT GCrGCATACA AACTTATTAA CGGIGATACC 555
GAATTGAG GT CTC GCT CCC TAC ATC GCC CTG ATT AAA AAC CAA ATC GAT 604
Arg Leu GGy Pro Tyr Ile Ale laD. Ile Lys Tr HHs Ile Aap
55 60 65
ATC CTC TCT TG - CTT AAC GGA GAG ACC AAT GGA GGG CTT AAA GCT CTT' 652
Ile Leu Ser Asa 70 ppe See Aap Glu Thr Ile GGu 75 GGy Lsu Lls AAa Lsu 80
GCG CAG AAG CAC AAC TTC CTC ATC TTC GAG GAC CGC AAA TTC ATC GAC 700
Ala GLn Lys His 85 Asn Phe Leu Ile Phe Glu Asp 90 Arg Lys Phe Ile Asp 95
ATT GCC AAA CCT CTT CAA AAA CAA TAC CAA CCT GCT AAC CTC CGG ATC 748
Ile Gly 100 Asa ThT ViG G1v Lls 105 G1v Tyr HHs Aag GGy Th Leu Arg Ile llO
TCA GAA TGG GCC CAT ATC ATC AAC TGC AGC ATC CTG CCT GGC GAG GGT 796
Ser G1a 115 Trp Ala His Ile He 120 Asv Cys Ser Ile 125 Leu Pro Gly Glu Gly 130
ATC GTC GAG GCT CTC GCT CAG ACG GCG TCT GCA CCG GAC TTC TCC TAC 844
Ile VgL Glu Ala Leu Ala Gin 135 Thr Ala Ser Ala 110 Pro Asp Phe Ser Tyr Ki)
GGC CCC GAA CCT GCT CTG TTG ATC TTG GCG GAA ATG ACC TCT AAG GG 892
Gly Pro GLa Arg 150 Gly Leu Leu Ile Leu Ala Glu 155 Met Tr Ser Lys Gly 160
TCC TTG GCC ACC GCC CAG TAC ACT ACT TCT TCG GTT GAT TAT CCC CGG 940
Ser Leu Ala Thr 165 Gly Gin Tyr Thr Thr Ser Ser 170 lal Asp Tyr Ala Arg 1175
AAA TAC AAG AAC TTC GTC ATG CGA TTT CTG TCG ACC CGC TCG TTG GGT 988
Lys Tyr Lys Asn Phe lal Mee Gly Phe la! Ser Thr Arg Ser Leu Gly
180 185 190
185 052
GAG GTG CAG TCG GAA CTC AGC TCT CCT TCG GAT GAG GAG GAC TTT GTG 1036
Glu Val 195 Gin Ser Glu Val 200 Ser Ser Pro Ser Asp 205 Glu Glu Asp Phe Val 210
GTC TTC ACG ACT GGT GTG AAC ATT TCG TCC AAG GGA GAT AAG CTC GGT 1084
Val Phe Thr Thr Gly Val Asn Ile Ser Ser Lys Gly Asp Lys Leu Gly
215 220 225
CAG CAG TAC CAG ACT CCC GCA TCG GCT ATC GCT CGG GCT GCT GAC TTC 1132
Gin Gin Tyr Gin Thr Pro Ala Ser Ala Ile Gly Arg Gly Ala Asp Phe
230 235 240
ATT ATC GCG GGT CGC GGT ATC TAC GCC GCG CCG GAC CCG CTG CAG GCT 1180
Ile Ile Ala Gly Arg Gly Ile Tyr Ala Ala Pro Asp Pro Val Gin Ala
245 250 255
GCG CAA CAG TAC CAG AAG GAA GGT TGG GAG GCG TAC CTG GCC CCT GTC 1228
Ala Gin Gin Tyr Gin Lys Glu Gly Trp Glu Ala Tyr Leu Ala Arg Val
260 265 270
Gl>C GlA AAC TAAIALIAiA AAA1UAL.UAA AAAAGTTiTG ATGGTTATGA 1277
Gly Gly Asn
275
ATGATATAGA AATGCAACTT GCCGCTACGA TACGCATACA AACTAATGTC GAGCACGGGT 1337
AGTCAGACTG CGGCATCGGA TGTCAAAACG GTATTGATCC TGCAGGCTAT TATAGGGTGG 1397
CACGGGATTA ATGCGGTACG ACGATTTGAT GCAGATAAGC AGGCTGCGAA CTACTTAGTC 1457
CTGTAACTCT TGCGTAGAGC AAATGGCGAC GGGTGGCTGA TAAGGGACGG TGATAAGCTT 1517 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 8 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 4108 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (n) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (m) Hipotetyczna: nie (iii) Antysensywna: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(A) Organizm: Aspergillus niger (CBS 120.49) (3) Szczep: NW147 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: sygnał TATA (3) Umiejscowienie: 787..794 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: CDS
(B) Umiej scowienie: 855..3266
(D) Inna informacja: /numer EC = 3.2.1.37
/produkt = „ksylanohydrolaza
185 052
1,4-beta-D-ksylanu /gen = „xlnD /nazwa standardowa = „beta-ksylozydaza (xi) Opie eekwennii: SEQ ID Nr: 3 (ix) Cenha znamienna:
(A) Nazwa/klunz: peptyd eig (B) Scie^nowienie: 800..132 (ix) Cenha znamienna:
(A) Nazwa/klunz·. peptyd mat (3) Umiejucowisniwi 9i3.:1331 (ix) Cenha znamienna:
(A) Nazwa/klunz: nentrum polyA (B) Umielsnowl3nle: 3383 (ix) Cenha znamienna:
(A) Nazwa/klunz: nentrum polyA (B) Umieienowi^n^i^^: 3434 (xi) Opie eekwennii: SEQ ID Nr:8
TTGTCGGTCC GGATGTCTGT GAAGATGGAT CTGΓGGTTCC TTTTTCTCTT GATAATAGTC ATGAGAGTGC CGGCTGCGAT CCCGAAGGGA CGCAGGGCAC TGACACTGTT CGCTTTTCTT 60 120
ATGGTGGTGC CACTACCGΆ'T ATCGTTAGTG GACGTGTAGT AAAGACACAA TAAGAAAATG 180
AAGTCGGAGC CGTTTGCGTT GCGCATAGGG ATGTAGGTGG CGTGCGAGAA AAAATTGCAA 240
CAAGAGGACG CGTAGACAAT CCAAATGCAG GATATTCCGT GAGCGTAATC AATTTTGTGT 300
ATAGGTGTGC CAGAGACGGT GGTAATAACG TIGATCTTGA CATCAACGAG CAACττTTTA 360
AAGGAATTAC ATGTGACGGT GTTATTATCG GAGTGGGTTG GAATACTGAC GATTATTGTG 420
GACACACAGT CACTGTCAAT TACAATAATG GTATGAAATT AAATTGTGAT GGAGAATGGA 480
ATTAGTATTG GAGATAACTT AGAGCAAGAT GTACTGGTGC AAAGGCTGTT ATTACTAAAA 540
ATTTTCTGAC GCCACGCCTG CTGGTCACTA ATTTTAGCGC TAGCTCGTTC ACGTAAAGAT 600
ATCTTACTTC GAGGTTGGCG TAATATTCAC CGACATACCT TTAGTCATAG ATATTTTCTT 660
TTGGAGTTAG GATAATCTGT CACCATATTC GGTACTATCA TTAGTCGCTT AAAATCTATC 720
AATACTATTC TTCTCTGCTT ATTTTATGGA TAGTTATCGG TGTCTTTCTG 780
TTTCCCAAGC CAATCACTTT TCCATATCCT TTTTGCTCCC CGAACAAGTT 840
AAATAGGTAC AACC ATG GCG CAC TCA ATG TCT CGT CCC GTG GCT GCC Met da His Ser Met Ser Arg Pro Val da da Thr -26 -25 -20 -15 890
GCC GCT GCG TCT TGC GCT CTG GCTT CTrr CCC CAA GCT CTT CCC CCA GGC 938 da da A1a Ilu Leu da Leu da Leu Ppo Gin da Leu Ala GGl da
-10 -5 l
185 052
AAC ACC AAC TTG CTC GAC TAC iAC ATT GGA GCC AAC CCG (GAC TTG TAT 986
Asn Tir Ser Tts Vva Csp Tyr Acn Ile GGu Ala Asn Pro Acp Leu Tyr
10 15
CCC CCG TGT ATC GAG CCC AAC CCA CTC AGG ICC CCC GGC TCG CCC /AA 1034
Pro Leu CyC Ile GIg ITr Ile Pro Lee SSr PPe Pro Ass CCy GGn Aas
25 30
GGC CCC CTG GCC CGC CAT CTG AST TCG GAA (GA AAC GAC ACC CCC TAA 1082
Aly Pro Leu ArsSer His Uu Ile C^s; Asp GGu Hr ACa Τίτ Pro Tr
40 45 50
GAC CAT GCA CCA CCC CTC ATC TCG CTC TTC ACC CTG (GAC GAG CTG ATC H30
Asp Arg AGa TGa Ser Leu Ile Seir Leu Phe Thr Leu Asp Glu Leu He
60 65
GCC CTC CCC GGC ACC CCC GGC CTC GGT GTC CCC CGA CTG GGC CTC CCT 1178
Tia Csn Chr Gly Tsn Thr Gly Leu Gly Val Ser Arg Leu Gly Leu Pro
75 80
GCC CSC CCA GTC TGG GGC GAA GCT GTh CTC GGC CTC GAC CGT ACC TAC 1226
ALa Tyr Gin VaL Crp Ser Glu Ala Leu His Gly Leu Csp Arg Cła Tsn
90 95
TTC GAC CGC TCG GGC ACC TTG AAT TGG GCC ACC TT/C TTC CCC CAG CCC 1274
Phe Ser Asp Ser Aly Ala Tts Tsn Crp Ala Thr SSr Phe Pro GGn Pro
100 115 110
ATC CTG CCC CCC GCA GCC CTC TCC CGC ACC CTC TCC CCC CAG CCC GCC 1322
Ile Leu Chr Chr Ala Ala Leu Tsn Arg Thr Leu Ile His Gin Ile Ala 115 120 125 130
TCC ACC CTC TCT CCC CCT GGC CGC GCC TTC AAC ACC GCC GGC CGC TAC 1370
Ser Ile Ile Ser Thr Gin Gly Arg Ala Phe Tsn Tsn Cla Gly Arg Tyr
135 140 145
GGC CCC CSC GTC CSC GCC CCC TTC ACC ATC ACC TTC CGC CCC CCC GTC 1418
Gly Leu Tsp ViOL Typ Ala Pro Asn Ile Asn Thr Phe Arg His Pro Val
150 155 160
TGG AGT CGC GGA CCT GCA CCC CCC GGC GAG GCC GTC CCT CTC GCC GCC 1466
Crp Gly Arg Aly Gin Glu Thr Pro Gly Glu Asp Val Ser Leu Cla Ala
165 170 175
GTC TAC ACC CGC GCA TCC ACC CCC GGC ACC CCG GGT CCC GAC CCT GAA 1514
Val Tyr Cla Tyr Glu Tyr Ile Tir Gly Ile Gin Gly Pro Asp Pro Glu
180 185 190
TCC ACC CTC CAT CCC GGC GGC AAC GGC ATS CCS TTC GGC GAG TAT CGA 1562
Ser Csn LeL Lls Llu AAa ACa TCn AGi Lls Ηϊι Tts ASa Gly Tyr /Ap
195 200 205 210
CCC GCA AAA TGG CCA /AC CCS TCC CCC CTC GGG ACC (GAC ATG AAC ASTC 16IO
Ile Gu Ass Ττρ Hii Ass Hhi Ssu Asg Leu Gly Asn Asp Met Asn Ile
215 220 225
185 052
AAA CAG CCC dl Cd TCCC GA TAC TAG ACG CCC CC TCC CCA CGC CCC 1658
Tir dn dn Ars Leu Ser Glu Tyr Tyr Thr Poo du Pleu HHs 240 Wi Ala.
23O 2^^
GCC CGC CAA GC ACA GTC CCG ACT GTC CG TGC GC CAA ACC GAA CTC 1706
Cal Crg Csp Cli Lys VZL Gv Ser VZL Het Cys Cli Tyr Asn Cii vzl
245 250 255
CAC GGC CTC CCT GCC CGA GC CCC TCC CAA TCT CTC η ACC CCT Crc 1754
Csn dy VZL Pro Ala Cys Ale Asp Ser Tyr Phe Leu dn Tir Leu Leu
260 265 270
CG CAC ACC nr GG πτ CTC GAC AAA GG TAC CTC CAC AGC TAA TG 1802
Arg Asp Tir Phe dy Phe v^;l Asp His Gy Tyr VZL Ser Ser Cp Cys
275 280 285 290
GCT GCC GCC TCT CC ACA TAC CAC AAC CAC GC GC TCC ACC 1850
Asp C.i Ala Tyr Asn Ile Tyr Asn Pro His dy Tyr Ali Ser Ser dn
295 300 305
Κ^Τ GCC GAA «Μ GCC ΑΈ^ CTC GAT GGC AAA CTC GC: TG 1898
Cli Cli Ale Ali Ali Glu Ale Ile Leu Cii dy Thr Asp Ile Csp Cys
310 315 320
CTT CCC ACC CAA CAC TG CAC CTG CAC GAG TCC ATC GCT GC GCT 1946 dy Tir Tir Tyr dn Trp His Leu Asn du Ser Ile Ali Cli dy Asp
325 330 335
CTC CTT GC GAT GAT ATT GCG CAC KCT (ΓΌ ATT CGT CTC TAC ΑΜ Tir ACC Tir 1994
Leu Ser 340 Arg Asp Csp Ile du 345 dn dy VlL Ilu Crg 350 Leu Tyr
CTC ATC CAG GAA GA TAC TCA TCC CCC AAA ΑΠ CG CCC GCC 2042
Leu Val Gin CLi Gly Tyr Phe Asp Ser Asv Thr Tir Lys Cii Csn Asn
355 360 365 370
CCC TAC CG TAA CTC TCC TG TCC TAA GTC CTT απ CG TAA GG TG 2090
Pro Tyr Crg Csp Leu Ser Trp Ser Csp Val Leu du Thr Csp Cii Trp
375 380 385
GAC ATC TCC TAC CC GCC GG GCG GTA ATT GTC CTT CCA CCG CCC 2138
Asn Ile Ser Tyr Gin Ale Ci Thr Gin Gly Ile Val Leu Luu Lys Csn
390 395 400
TCC CC AAA CTC ATC CCC crc AAC GGA AAC CCT TTA CCC CCC TTC CA 2186
Ser Asn Asa V aV Llu Ppo Leu Thr du Lyy AAa TTy Ppo Ppr Ser Arn
405 410 415
ACC ACC CTC GG Cd ACT GCT CCC TGG GG CA GC AAC AAC CCGC Cd 2234
Thr Tir VaV Air Leu Ile dy Pro Trp Ala Arn AAa Uh Uh dn Leju
420 425 430
ACC GG CA CAT TAG CG ACC CCC? CCC TAC ATC ATC AAG CCC CGC GCC 2282
Leu GLy Asa TyT TTy Gy Arn Ala Pro Tyr Meu Ilu Ser Pro Arg AGa
435 440 445 450
185 052
GCC TTC GAG AGA GGC GGG TAC AT GGC CTC TTC GCC GAG GGC ACC GGC 2330 da Phe GIg GGu da GGy Tyr Lls Vv1 Asn Phe AAa GGu GGy Tir GGy
455 460 465
ATC TCC TCC CCC AAG ACC TCG GGG TTC GCT GCC GC(C TTA TCC GCC GGC 2378
Ile Ser Ser· Tm Seu Th Ser Gly Phe Ala Ala Ala Leu Ser .Aa da
470 475 480
CAA TCC GCC GAC GTG ATT ATC TAC GCC GGT GGT dC GAC AAT CCC CTT 2426
Gin Ser Ala dp Val Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Tle Asp Asn Thr Leu
485 490 495
GAA GCG GAG GCA CTG GTT CGA GAG CGT TTC GCG TGG CCG GGT AAC CCT 2474
Glu da Glu da Leu dp Arg Glu Ser Ile da Trp Pro Gly Asn Gin
500 505 510
CTG GCC TTG ATC CCG AAG CTC GCC TCG GCG GCC GGA AAG AAG CCG CTC 2522
Leu Asp Leu Ile Gin Lys Luu Ala Ser da Ala Gly Lys Lys Pro Leu
515 520 525 530
ATC GTC CTC Cd ATG GGC GGC GGA CAG GTC GAT TCC TCT TCG CTC AAG 2570
Ile Val Leu Gin Met Gly Gly Gly Gin Vd Asp Ser Ser Ser Leu Lys
535 540 545
AAC AAC TCC AAT GTT TCT GCA CTT CTC TGG GGC GGC TAC CCC GGC Cd 2618
Asn Asn Thr Asn Val Ser Ala Luu Luu Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gin
550 555 560
TCT GGC GGC TTC GCT TTC CGG GAT ATC ATC ACG GGG AAG AAG AAC CCC 2666
Ser Gly Gly Phe da Luu Arg Asp Ile Ile Thr Gly Lys Lys Asn Pro
565 570 575
GCG GGT CGC CTC GTC ACA GCC CCC TTA CCT GGC AAG TTC GCG (GACG GAC 2714 da Gly Arg Luu Val TIt rTh GGn Tt* Pro da See Tt* Ala Glu GGu
580 585 590
CTC CCG GCG ACA GAT ATT GAA CTT CCC* CCT <Gd GGC CGT AAC CCT GGT 2762
Phe Pro da Thr Asp MeM AAn Leu Arg Pro GGu GGy Aep Asn Pro Gly
595 600 605 610
CAG ACG TAT AAA TGG TAC ACC GGG GAA GCC CTG TAC GGG TTC GGC CCC 2810
Gin Thr Tyr Lys Trp Tyr* Tm Gly Glu Ala Vvl Tyr Glu Phu Gly His
615 620 625
GGG TTA Trc Grc ACC AAC TTC GK GGA TCC TCC AAG AAT AAC AAC ACC 2858
Gly Leu PhP Tt* Κι Κι PP^ AAi G1u Ssu Seu Seu Aap TTi TTh Th
63O 635 640
ATG GTT GTG TTC CTC MC ATC CCG GGC AAT CTT· TCC CCC ACC CCC CGA 2906
Lys Glu Vd Le* Leu Aap Ile Gln dp Ilu Leu Ser GGn Tir His CGu
645 650 655
GCC CTG GCG GTC ATT ACC CAG CTC CCC CTG CTG AAC TTC ACC GGC MT 2954
Tsp Leu Ale Ser Ile Kr GGn Leu Pro Val Leu Acn Phe Tir ACa dn
660 665 670
185 052
AAC AlG AAC ACT GlA MA GCA GM TCC GAT TGA AAC GGC AAG CTA TAC 3000
Ile 675 Arg Asn Άίγ Gly Lye Leu Gil 680 Seu Aas Tai TAr da MhU VV. PPi
685 690
GCC AAT ACC CCC GAT GCG CCC CCC GCC CCC TAT CCC MG MA TGA CCA 3050
da Asn Ahr Ser Asp A1a ^Cy Pro da Pro Tai Pro Lli Lli Tcp Leu
695 700 705
GTC 1GG Ali GAG CGG CCT GGG (GAG <ATG MG CATC GGG GAG ACG AAG GlA
Val Gly Arp Asp Arg Leu Gly Glu Val Lys Val Gly Glu Ώιγ AAg Glu
710 715 720
TTG AGG GTC CCC GAG GAG GAG GGG AAG TTT GAC AAG CTG MA (AA Gd 3346
Leu Arg Val Pro Val Gli Vvl Gly Seu Phe da AAg Vv1 AAn Glu Ars
725 730 735
GGC AAT Ali CTG ACG ITT CCC GCA AAG tit (AG TAG GCG TACA tAA TAG 319 4
Gly Asp Arp Val Val Phe Ppo GCy Tr Phe GCu Leu da Leu Aas Leu
740 745 750
GAG AGG MG GCA CGG GTC! MG CTT CTT CTT 1 GAG GCA? CAC GAG GCA GAG 3242
GLu Arg Lys Val Arg Val Lli Val Val Leu Glu Gly Glu Gilu Gil Vv1
755 760 765 770
GAC CTG MG AGA CCG GAG Ml GAG GCGTTATGCT ACTTCT1GA1 CAGGTTCGCC 3296
Val Leu Lys Arp Pro Gly Lys Glu
775
GAAAAGAAAA ATC1CCAATA TAACGAGAAG AAATGAAACA AAAA1TCTAA 0056
AAMACMTA CCTACMCT1 G1MTCCCTT GTCTACACAA ATTGAAA1TA GGCAAATT1T 3416
MGTG1ATTC ATAACTGATT MTCGTCGTG AAAGCGAGAG ATATATTCGA TCTTTAACTT 3476
TTTTCA1AAT ClGMAAMC ΜΆΟ^ΑΤΑ ATTACTAC1C A1AM1ACAG CTT1TTACT1 0500
AMAAMGAG MATCAAATA AMMAAA11 TTTATCATTG CCCATTTCTC TTGAGCCGAT 3596
ACTlCMAAC C1TTACA1TT AAMAATTA1 ..^1(7.1(:7 AGTAT1TAAA GTTCTTACCT 3656
AATTATATTA ^CMAHG ^MTAC^ TATATACCTG TTTTTACCTC ATACTTGTAT 3716
CATCTCCTAA CM^IACA! AMC^CClC AACTCTCTTT AGTATTCTAC TTTATAAACA 0770
GAATAC11A1 TCTAACTTAT ACCCCTATGC AGATTATTGC MCMCGGCC AC111TTTG1 3836
AACT1ACTGC CATATTCGCA ^MAICCCT T1TATGCCAA TTTGTTACAA GAACCA1AA1 3896
TTTCAAAATC ACCACMCCl GCTCTATAM TATCCC1ATG ACGtdTCCT TTT1TACCTC 3956
AACGAATACT CGCTGGTCAT TTAGTCAAAA GAAC1AA1A1 TCATGATTGT CTTT1AATAC 4016
ACTCCTGATT ^AMA^Al AACTTMCTT GTA1CTCTG1 AACTT1ATTT GT1AATG11T 4076
AATACCATll CGGATTGGGA AGCTACCACT AG
4108
185 052 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 9 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 4173 pary zasad (3) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (m) Hipotetyczna: nie di) Antysensowna: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(A) Organizm: Aspergillus niger (B) Szczep ; CBS 120.49 (C) Wydzielone indywiduum: N400 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/lucz: CDS (B) Umiejscowienie: łącznie(948..1173,
1238..3495, 3550..3690) (C) Sposób identyfikacji: doświadczalnie (D) Inna informacja: /fuńkcja= „Aktywator transkrypcyjny genów ksylanolitycznych /produkt = „dwujądrowa proteina wiązania DNA palca cynkowego /gen = „xlnR /nazwa standardowa = „XYL R (ix) Cecha znamienna:
CA.) Nazwa/klucz: ekson (B) Umiejscowienie: 948...1173 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: intron (B) Umiejscowienie: 1174..1237 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Umiejscowienie: 1238..3495 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: intron (B) Umiejscowienie: 3496..3549 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Umiejscowienie: 3550..3690 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 9
Acciiccτri gttggtctca gtctggtttc cccGccmT tcccctgcgg ttatgcatcc
ACAATCCTTA ΤΠΤΤΤΑΤΤΤ GACTAGACAG GCTGrGTATT TTCCCCCAT AAAACTAATA
120
CCTCGTCAGC TTCTCTTCGA CAGCATGCGT GAGGGTCTGC TACCAACTAC AATCCTTGTT
180
185 052
GCAGCTG'TGh GCTAGCCTGA AAAGGGCGCG σΤΑΤΆΤΌΤΑΑ TATATATGTG GAGGAGATTG 240
GATAGCTCCT ACCTAGS1TC SGTCTTTGCA GTGGI1ΊTTGTT GAACTCCACG GGACCTGGCG 300
CAA1AAGCTS CAAS1CASCT CCACCCCSAA CGAhTAGTTG CT1GhSl1TCT AGTTAG’hTCC 360
CG1CC11GCC C1CGGCCCCT CGGGCTGCGG CTGCTACCTT CTAGGTGGCT 420
GhCTTCAT AACT1TThhC GTT1CCCA1A AGCCCGATTC GGAATGGCG C1GSGTC1TC 480 ccrrrCKhTGG TTTCCTTGCG GCCGCTGACA TGChTCTTAC TClTThrcCT CCTGCGATGC 540
T1GCCTC1TA CA1CA·CGGCG CTC1TCTGG1 ATCT1'TTGA1 GCG1'TGTG1G Ch’TASTCTCA 600
TTTAAA1CTC GAGTC1T1CC CrnCSClCh TGGAGCCTCG CGGACCTTGA CThGGGCC1C 660
GGTCTACACS AGTACCChTG CAGAGATCC1 ^111^^ TAAC1AACGG CTGGGGTGTT 720
TGThAC1GCC GATGAGGATG CAACGAGAAC CGATTCCTCC A'Π'GGACAGT CCTTTGTCTG 780
GC·CTCTCCTC C1GCTCGGCG TAGGAhGGAA CGGAGCGGhA TCCGGCTGTC GGGTTGGCTC 840
C1CTA1CGGC GGGCTCGCGG TSG1TACT1G TTACAT’TGAG GCTGCCGGGA 1CAGCTGG1G 900
GASCCGGΊ‘GG A1GCGChGGG 1CGGCCTCAC CTTCCCTGCG ATAS-TCC CCG TCG CAT 956
Het Ser His
ACG AAG GAT CCT CCA CCC ATT GAT AAT GAG CTG AAC CAG ACC ACT GGC 1OCC
Thr Lys Asa GGn Aro Aro Che Aap Acp GGu Cys G^sn GGn Cer TCr AGy
10 15
TCG GGT TTT CCG AGG CGC CTC GCT AArt CĆT CCC CCC CGC AGG ACT CCG 1052
Sro Gly Phr Asg Asp ACy Cyr GGn AcoAcp Gro Ayr Cal GGu ACu Acg
25 30 35
TCT GCC ϋΠ CGe AACS ACC TCG TCC TCA CCT CCC GGC· AGG CCG CGG AC^CC H0(C
Sro Ali Val Arg Lys TCer Ser Ser Aer ACa Gro Cal Asg Arg Aco hl
45 50
CAG CCT GCC G^CGC GAC CAG TCT AASCC CCCA CTC CCGA ACG ATAS TGC (GAC GGG 1148
Srr Cog Ala Cys Asp Gin Cys Asn Gin Leu Arg Tir Lys Cys Asp Gly
60 65
CGG CCT CCG TGC GCT CCT TGC ATT G CTCAACCTGG ACTCTCTCTC 0093
Gin Hin Poo Cyn Ali Hin Cyn Ilr
75
CATCAGAGGG ACTGGGAGAA CGACCTACCC AGGGTCTTCT GTCG TT TCC GGG CTC O248
Glu Phr Gly Lru
CCC CGC CGC ACT G CG CGC A AA C CC CGC AAG GAT CGA CGCA GGC T GC GAG 0296
Tho Cyn Gil Acs Ala lic gA u A rg Gyg Lyy P rg Gl;p Lys Ala S cu Ays
875 90 95
185 052
AAG GAT CTG GCG GCG GCA GCT GCG GCG GCT ACC CAA GGG TCG AAT GCT 1344
Lys Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gin Gly Ser Asn Gly
100 105 no
CAT TCC GGG CAG GCC AAC GCG TCG CTA ATG GGC GAG CGA ACG TCG GAA 1392
His Ser Gly Gin Ala Asn Ala Ser Leu Met Gly Glu Arg Thr Ser Glu
115 120 125
GAC AGC CGG CCA GGA CAA GAC GTG AAC GGC ACA TAC GAC TCG GCT TTT 1440
Asp Ser Arg Pro Gly Gin Asp Val Asn Gly Thr Tyr Asp Ser Ala Phe
130 135 140
GAG AGC CAC CAT CTT AGC TCG CAG CCA TCG CAT ATG CAG CAT GCA AGC 1488
Glu Ser His His Leu Ser Ser Gin Pro Ser His Met Gin His Ala Ser
145 150 155
ACT GCA GGG ATA TCC GGC CTG CAC GAG TCT CAG ACG GCA CCG TCG CAT 1536
Thr Ala Gly Ile Ser Gly Leu His Glu Ser Gin Thr Ala Pro Ser His
16O 165 170 175
TCG CAA TCA TCG CTA GGA ACG ACT ATC GAT GCG ATG CAT TTG AAT CAT 1584
Ser Gin Ser Ser Leu Gly Thr Thr Ile Asp Ala Met His Leu Asn His
180 185 190
TTC AAC ACG ATG AAC GAT TCC GGT CGC CCG GCA ATG TCC ATA TCC GAT 1632
Phe Asn Thr Met Asn Asp Ser Gly Arg Pro Ala Met Ser Ile Ser Asp
195 200 205
CTG CGT TCG CTA CCC CCG TCC GTC TTA CCA CCG CAA GGA CTA AGC TCC 1680
Leu Arg Ser Leu Pro Pro Ser Val Leu Pro Pro Gin Gly Leu Ser Ser
210 215 220
GGG TAC AAC GCG AGC GCC TTC GCT TTG GTG AAC CCG CAA GAG CCG GGC 1728
Gly Tyr Asn Ala Ser Ala Phe Ala Leu Val Asn Pro Gin Glu Pro Gly
225 230 235
TCA CCA GCT AAC CAG TTT CGC TTG GGA AGC TCA GCG GAA AAC CCA ACC 1776
Ser Pro Ala Asn Gin Phe Arg Leu Gly Ser Ser Ala Glu Asn Pro Thr
240 245 250 255
GCA CCG TTT CTT GCT CTC TCG CCT CCA GGA CAG TCG CCT GGA TGG CTC 1824
Ala Pro Phe Leu Gly Leu Ser Pro Pro Gly Gin Ser Pro Gly Trp Leu
260 265 270
CCT CTT CCC TCT CCC TCC? CCC GCC AAA ITT' CCT TCTTTC AAC TTG CAT 1872
Pro Leu Pro Ser Ppo Ser Cro AAa Aas CPe Cpo Cer· Che Csu Ceu Cii
275 280 285
CCG GGG TCC A GC ACT TTA CGA TAC CCT CTT 'ICG CCA CCC CTT CTG CCT 1920
Pro Phe Ser Ser 'Tir Leu Arg Tyr Pro Val Li^u CGi Cor Cal L^u Pro
290 295 300
CAC ATC GCC TCC ATT ATT CCG CAG TCG CTA G^(3 TCT GAC CTT CTG GAT 1968
His Ile All S er Ile Ile Ppo Gin Seo Leu Ala Ccs AAp Lt^u Leu Asp
305 310 315
185 052
GTT TAC TTC ACT CCT TCC TCT TCG TCC CAC CTG TCT CCC TTG TCC CCA 2016
Val Tyr 320 Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ser His Leu Ser Pro Leu Ser Pro
325 330 335
TAC CTG GTG GGC TAC ATC TTC CGC AAG CAG TCT TTC - CTT CAC CCG CCA 2064
Tyr Val Val Gly Tyr Ile Phe Arg Lys Gin Ser Phe Leu His Pro Thr
340 345 350
AAA CCC CGA ATA TGC AGC CCC GGT CTC CTG GCG AGT ATG CTC TGG GTA 2112
Lys Pro Arg Ile Cys Ser Pro Gly Leu Leu Ala Ser Met Leu Trp Val
355 360 365
GCC GCA CAA ACG AGT GAA GCT GCG TTT CTG ACA TCG CCG CCC TCG GCT 216O
Ala Ala Gin Thr Ser Glu Ala Ala Phe Leu Thr Ser Pro Pro Ser Ala
370 375 380
CGG GGG CGT GTA TCC CAG AAA CTG CTA GAA CTG PCC ATT GGT TTG CTC 2208
Arg Gly Arg Val Cys Gin Lys Leu Leu Glu Leu Thr Ile Gly Leu Leu
385 390 395
CGA CCG TTG GTC CAT GGT CCT GCT ACC GGA GAA GCG TCG CCC AAC TAT 2256
Arg Pro Leu Val His Gly Pro Ala Thr Gly Glu Ala Ser Pro Asn Tyr
400 405 410 415
GCG Ala GCG AAT ATG CTC ATC AAT GGC GTC GCT CTG HC GGP TTT GGG GTC 2304
Ala Asn Met Val 420 Ile Asn Gly Val Pla 425 Leu Gly Gly Phe Gly Val 430
TCC ATG GAT CPG CTC GGC GCG CCA CCT CGC GCC PCC GGC GCC CTG GPT 2352
Ser Met Asp Gin Leu Gly Ala Gin Sul Ser Pla Thr Gly Ala Val Asp
435 440 445
GAT GTA GCA ACT TAT CTG CAT CTT GCG CCC CTA, GTP TCC GCC CGC TPT 2400
Asp Val Ala Thr Tyr Val His Leu Pla Thr Val' Val Ser Ala Ser Glu
450 455 460
TAC AAG GCG GCC CGC ATG CGC TGG TGG PCT GCG GCG TGG TCT CTC GCG 2448
Tyr Lys Ala Ala Ser Met Arg Trp Trp Thr Pla Pla Trp Ser Leu Pla
465 470 475
CCT GAG CTG AAG CTP GGC CGT GPG CTG CCA CCC PAT GTT TCC CCC GCA 2496
Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Glu Leu Pro Pro Psn Val Sul His Pla
480 485 490 495
CGG CPP GAT TGG GGC GCG GGT GCG GAT GGG GGP GGC GGC GPpP CCGP CAT 2544
Arg Gin Asp GGl Gd Arg Gap dy App dl Gd APl Gpp Gyy Arg His
5OO 505 510
CCT CCG ACC CCT GAT AA^G TCA CTG GUT CCP GGG GTC Gd AGC TCC GGC 2592
Pro Pro Thr· Leu GIl 1T»r Ser Leu Gly Hii Gd Gee Gd Ser Ser Gly
515 520 525
ATT AAT GTC AAC CAA GAG GAG CCT GAG GAG CCT GGA CCC CTA TGG TGG 2640
Ile Asn VaV lhr Gd Glu Glu Arg Glu Glu Arg A-l Apl Leu Trp Trp
530 535 540
185 052
CTG TTA TTA Leu Leu Tr* 545 GGC ACC GAT CCG GAC (CGG GGG GTG TGC TAC MC CCG CGG 2688
ACa Thr Asa Aeg 550 His Leu ACa Gtu Cys 55 5 Tyr Acn Aegg Ppo
CTC ACG CTG CTG GAG GAC GGA TCG GGG GGG CGG CTC CCC CCG ATC MC 2776
Leu Thr Leu Leu Asa Pe* Glu Cg* GGy Gly Leu Leu GCi Ppt Mm: Acn
560 565 570 575
GAT GAT GGG TGG CAC CGT GGG GGC TTC GGA GGG GGG GGC TAC CGG CGA 2278
Asp dp Leu Trp GIg Vv1 Gly dp Phe ACa ACa da da TA* Aat GGn
580 585 590
GTC GGA CCG GGC CTC CGAG TCG ACG GCT CAC AGG ATCC TAT GGG TAC TAG
Val Gly Pro Pro VaV Glu Cg* Thr Gly His Ser MmT TT* GGy Tc* PHe
595 600 605
CTA CCG CGC ATT ACG GG CTT CGA GCG GTG CTC CTG CTG CCC CGA GTG 2880
Leu Pro Leu Mee Thr I1a Leu Gly GTy I*G *al Aa* Leu lis HCs da
610 6^15 620
GAG AAT CCT CGG CGC GGA GGC CTCC GCG TTG GGC ATG AGC CCC TAG ( TGG 2^^^
Glu Asn HHs Ppo Arg PhA Gly Leu GTa Phe lrg Asn Ser Trc Glu Trp
625 63O 665
GTG GGT GAG CTG CGC GGC GGT ACC CCG CGA CGC GGA ACG TTA GGG CCG 2296
Glu Arg Gln VaV Ulu Aep VVL TCh Aeg GGn Leu Aep TGh Tc* GGy Act
640 645 650 655
AGC CTG AAG GM CTC GGA GGG CCG TAC AAC AAG MA ICC ACG CTG GGG 3022
Ser Leu e*s GIg uhh Glu ACa Aeg Tr* TCh Ssu Acn Llt TCh Llu. GGy
660 665 670
GGG ACG GAT MA CGA CCG CTC CTC CGT GCC GGC CGC TTG GGA CGA ACC 3072
da Thr dp Asa GGu Pro Vvl Vvl GGu GGy ACa Hhs Llu dp Ηίε TCh
675 680 685
AGT GCT GGG GGG CGC TCC AGG AAG ACC CTCG CGT TCG CCG CTT ACG CGA 3120
Ser Pro Ser Gly Arg Sur Ser Seu Kr VaV Gly Se* Arg TaC Sea Glu
690 669 770)
TCC ATG GTG GCC CCG AGG ATA GGC CTC GGC TAC GGG ACG CCT ATC ATT 3168
Ser Ile vai His Thr Arg Met Vvl Vvl ACa Tc* GGy TCh Hhs Ile* Mtt
705 710 715
CAG GTC CTG GAG CTG TAG CTCC GGC GGG MT TGG GGC CCC CTC MT CGC 3216
His Val Leu His Ilu Leu Lee . ACa Gly Le* Ττρ Aep Ppo Vvl Aen Llu
720 725 730 735
TTG GAT GAC GAC GAT CTG TGG ATC TCC TCG GAG TCG ΠΤ CGC TCG GGC 3264
Leu Glu Tsp His Asp Leu Ttp Ile Ser Ser GGu Ser Phe Vv1 Ser da
740 745 750
TCG AGC CAG CGC CTC CCT GCC GCA GCC GCG CGC GCC GAA ATC TGG GAG 331G
Met Ser HiH ACa Va! Gly AliAla CIu A1a 1Gi Ala Glu Ile Lcu Glu
755 7^0 765
185 052
TAC GAC CCG CG^A: CTC AGC TTC ATG CCG TTC ΉΆ TCC GGG ΑΊΤ TAC CTA 3360
Typ Asp Pro Aas Leu Suo Phe Met Pro Phe Ohe Phe Gly Ile Tyr Leu
770 775 780
CTA CAG GGG AAT πΟ TTC CTG Cr?T CTG GCG GCC GAC AAG πΌ CAG GGG 3408
Leu Gln GGy Cre Piw Lt^u Leu Leu Leu Ala Ala Asp Lys Llu Gln CG.y
785 790 795
GAT GCC ACT CCC ACT GTC CTG CGG GCA TGC GAG ACG ATC GGG CGG CACCC 3456
Asp Ala Ser Pro Ser Vial Val Arg Ala Cys Glu Tho lie Val Arg Ala
800 805 810 815
CAT GAA GCG TGC GTC GTG ACC TGC AAC ACG GAG TAC CAG Α^ΑΠΊΤΆ 3505
His Glu Ala Cys Val Val Tho» Leu Asn Thr Glu Typ Gln
820 825
GGGTGGCTTC CCCTACCTCG GCATTAGGAG CCATATATTT GTAG AGG ACA TTC CGC 3561 Arg Thr Phe Arg
830
AAG GTC ATG CGA TCG GCG CTG GGC CAG GTT CCG GGA CCC ATC CCA GAA 3609
Lys Val Met Aa' Seo Ala Leu AAa Gln Val AAp Gly Arg Ile Pro GCu
835 840 845
GAC ΗΤ GGG GGA CAG CAG CAG CCG CGA CGC GGA CTC CTT G^CG CTA TTC 3657
Asp Phe Gly GGl Gln Gln Gln Arg Arg Aog GCu Val Leu Ala Leu Tyr
850 855 860
CGC TGG AGC GGC CAT Ad ACT GGG ATT GCG CTG TAACTTTGCA CTAACACCAC 3710
Arg Trp Seo GCu Csp GIt SerGly Leu A1g Seu
865 870 885
GGTGGTGATG AGACGTTGGA GGGAGGGGCA GTATCAGGGA TTTGGCGGCG TACAT^^XGA 3770
GTTGAGACTA LΊTrTGGAGT CGCTΑCTGCΑ CTCCCAGGTT TTCGTCGGTG CATICGΓCCTιG 3830
AGGGACCGAA TCGAATAGCG AAATAGACTC'GATTCCG'CGT:' TATGACAATG 3890
CTTCCGTAAT ACAGATCGAG A'ΠGCT'CGCA TCTGAAATCT CCCCG1GTCCG' 3950
ACTGGCAGAC CAGGGCAACC TTACGACCGT CTTCCTATGG ATTGCCCATC AGCCGTAGGA 4010
GGTCGCCAGG ACGATAAGAT GCTGCAGTGA AGAAGCCGAA GTCCACCCGC CTGAGATGCA 4070
ACATTATCCG CTTΑΑTACAA CΑTCTCCTCΑ ATTCCTCCCG GCGGTAGGTC ATTΑGGTTTT 4130
GCCAAATTTC CACCGCACGA GGAAACTCAC GAAGCTCGGA CCC 4173

Claims (26)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sekwencja kwasu nukleinowego xlnR kodująca produkt ekspresji xylR odpowiadający kodującej sekwencji kwasu nukleinowego według sekwencji id nr 9 lub jej sekwencja równoważna.
  2. 2. Sekwencja według zastrz. 1, znamienna tym, że równoważna sekwencjajest zdolna do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w przykładach, z primerami lub sondami sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy są obecne w obszarze niewiążącym palca cynkowego i majądługość co najmniej 20 nukleotydów.
  3. 3. Sekwencja według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja równoważnajest zdolna do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w przykładach, z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego id nr 9.
  4. 4. Sekwencja według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje produkt ekpresji wykazujący 80-100% identyczności z sekwencjąaminokwasowąxylR według sekwencji id nr 9 lub kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego kodującą xylR według sekwencji id nr 9.
  5. 5. Sekwencja według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje sekwencję aminokwasowa^ według sekwencji id nr 9.
  6. 6. Sekwencja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera delecję i ewentualnie substytucję w jednym' lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego według sekwencji id nr 9.
  7. 7. Sekwencja aminokwasowa o sekwencji id nr 9 lub jej sekwencja równoważna.
  8. 8. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 7, znamienna tym, że jest kodowana przez sekwencję kwasu nukleinowego xlnR kodującą produkt ekspresji xylR odpowiadający kodującej sekwencji kwasu nukleinowego według sekwencji id nr 9 lub jej sekwencję równoważną.
  9. 9. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 8, znamienna tym, że równoważna sekwencjajest zdolna do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości,jak określono w przykładach, z primerami lub sondami sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy są obecne w obszarze niewiążącym palca cynkowego i majądługość co najmniej 20 nukleotydów.
  10. 10. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 8, znamienna tym, że sekwencja równoważna jest zdolna do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w przykładach, z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego id nr 9.
  11. 11. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 8, znamienna tym, że jest produktem ekpresji wykazującym 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasowa xylR według sekwencji id nr 9 lub jest xylR według sekwencji id nr 9.
  12. 12. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 8, znamienna tym, że posiada sekwencję aminokwasową według sekwencji id nr 9.
  13. 13. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 8, znamienna tym, że sekwencja kodująca zawiera delecję i ewentualnie substytucję wjednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego według sekwencji id nr 9.
  14. 14. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 7, znamienna tym, że identyczność sekwencji równoważnej wynosi 80-100%, w, szczególności 85-100%, korzystnie 90-100%, a zwłaszcza 95-100% w porównaniu z sekwencją aminokwasową o sekwencji id nr 9.
  15. 15. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 7, znamienna tym, że równoważny produkt ekspresji wykazuje aktywność wiązania DNA, przy czym zwłaszcza aktywność wiązania DNA jest taka, że produkt ekspresji wiąże się z sekwencjąkwasu nukleinowego genu docelowego w ta185 052 kim samym lub wyższym stopniujak produkt ekspresji z sekwencją aminokwasową według sekwencji id nr 9 wiąże się z sekwencją kwasu nukleinowego genu docelowego.
  16. 16. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera delecję i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji aminokwasowej w porównaniu z sekwencją aminokwasowa o sekwencji id nr 9.
  17. 17. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera przynajmniej C-końcową połowę sekwencji aminokwasowej z regionu wiążącego palca cynkowego.
  18. 18. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera fragment odpowiadający regionowi wiążącemu palca cynkowego.
  19. 19. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera sekwencję aminokwasową odpowiadającą motywowi RRRLWW.
  20. 20. Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 17, znamienna tym, że brak jest mutacji w regionie wiążącym palca cynkowego odpowiadającym sekwencji aminokwasowej kodowanej przez nukleotydy w położeniu 1110 do 1260 sekwencji id nr 9.
  21. 21. Sekwencja według zastrz. 17, znamienna tym, że brak jest mutacji w motywie RRRLWW odpowiadającym motywowi RRRLWW obecnemu w sekwencji aminokwasowej o sekwencji id nr 9.
  22. 22. Mutant komórki gospodarza z wybiciem, znamienny tym, że zawiera delecję lub mutację sekwencji kodującej regulator, przy czym regulatorjest regulatorem aktywującym podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora, i regulator aktywatora uczestniczy w metabolizmie, a produkt ekspresji genu kodującego regulator posiada miejsce wiążące na genie docelowym, korzystnie regulator uczestniczy w części metabolizmu z kaskadą enzymów lub pętlą sprzężenia zwrotnego lub wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego.
  23. 23. Mutant według zastrz. 22, znamienny tym, że zawiera ponadto homologiczną lub heterologiczną sekwencję kodującą proteinę lub peptyd, które można uzyskać w stanie wolnym od ubocznych aktywności ksylanolitycznych.
  24. 24. Sposób wytwarzania heterologicznej lub homologicznej proteiny lub polipetydu, wolnej od ubocznych aktywności ksylanolitycznych, polegający na hodowli w znany sposób mutanta komórki gospodarza z wybiciem oraz na otrzymaniu uzyskanej w ten sposób heterologicznej lub homologicznej proteiny, przy czym mutant komórki gospodarza z wybiciem zawiera delecję lub mutację sekwencji kodującej regulator, przy czym regulator jest regulatorem aktywującym podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora, i regulator aktywatora uczestniczy w metabolizmie, a produkt ekspresji genu kodującego regulator posiada miejsce wiążące na genie docelowym, korzystnie regulator uczestniczy w części metabolizmu z kaskadą enzymów lub pętlą sprzężenia zwrotnego lub wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego.
  25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że mutant komórki gospodarza zawiera ponadto homologiczną lub heterologiczną sekwencję kodującąproteinę lub peptyd, które można uzyskać w stanie wolnym od ubocznych aktywności ksylanolitycznych.
  26. 26. Zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego xlnR kodującej produkt ekspresji xylR odpowiadający kodującej sekwencji kwasu nukleinowego według sekwencji id nr 9 lub jej sekwencji równoważnej do nadekspresji genu docelowego drogą ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego w komórce gospodarza zawierającej gen docelowy związany operacyjnie z normalnie związanym z genem docelowym promotorem regulatora aktywującego podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora, kodowanej przez sekwencję kwasu nukleinowego xlnR kodującą produkt ekspresji xylR, przy czym jeżeli gen docelowy i sekwencja kwasu nukleinowego xlnR kodująca produkt ekspresji xylR są rodzime względem komórki gospodarza, to sekwencja xlnR kodująca produkt ekspresji xylR jest obecna w zwielokrotnionych kopiach w porównaniu z komórką gospodarza typu dzikiego.
PL96351185A 1995-06-23 1996-06-24 Sekwencja kwasu nukleinowego, jej zastosowanie, sekwencja aminokwasowa, mutant komórki gospodarza, oraz sposób wytwarzania proteiny lub polipeptydu PL185052B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP95201707 1995-06-23
EP95202346 1995-08-30
PCT/NL1996/000259 WO1997000962A1 (en) 1995-06-23 1996-06-24 A novel method to isolate mutants and to clone the complementing gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL185052B1 true PL185052B1 (pl) 2003-02-28

Family

ID=26139424

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96324186A PL184463B1 (pl) 1995-06-23 1996-06-24 Kaseta kwasu nukleinowego wektor komórka gospodarza i ich zastosowania fragment kwasu nukleinowego mutant sekwencji aminokwasowej sposób wytwarzania i selekcjonowania mutantów oraz sposób identyfikacji i oznaczania sekwencji kwasu nukleinowego
PL96351185A PL185052B1 (pl) 1995-06-23 1996-06-24 Sekwencja kwasu nukleinowego, jej zastosowanie, sekwencja aminokwasowa, mutant komórki gospodarza, oraz sposób wytwarzania proteiny lub polipeptydu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96324186A PL184463B1 (pl) 1995-06-23 1996-06-24 Kaseta kwasu nukleinowego wektor komórka gospodarza i ich zastosowania fragment kwasu nukleinowego mutant sekwencji aminokwasowej sposób wytwarzania i selekcjonowania mutantów oraz sposób identyfikacji i oznaczania sekwencji kwasu nukleinowego

Country Status (14)

Country Link
US (3) US6177261B1 (pl)
EP (2) EP0833922B1 (pl)
JP (2) JP4339400B2 (pl)
CN (2) CN1192106C (pl)
AT (2) ATE429499T1 (pl)
AU (1) AU714511B2 (pl)
BR (1) BR9608910A (pl)
CA (2) CA2672126C (pl)
DE (2) DE69637359T2 (pl)
DK (2) DK1514936T3 (pl)
NZ (1) NZ311181A (pl)
PL (2) PL184463B1 (pl)
PT (1) PT833922E (pl)
WO (1) WO1997000962A1 (pl)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1192106C (zh) 1995-06-23 2005-03-09 丹尼斯科成分公司(丹尼斯科公司) 分离突变体及克隆互补基因的新方法
US6391583B1 (en) * 1998-12-18 2002-05-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of producing antihypercholesterolemic agents
AU2001278496A1 (en) * 2000-07-21 2002-02-05 Syngenta Participations Ag Zinc finger domain recognition code and uses thereof
KR100428998B1 (ko) * 2001-09-10 2004-04-28 한국과학기술원 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을생산하는 방법
WO2006036678A2 (en) * 2004-09-22 2006-04-06 Bioworks, Inc. Transgenic strains of trichoderma and their use in biocontrol
GB0424940D0 (en) 2004-11-11 2004-12-15 Danisco Transcription factors
KR100801960B1 (ko) 2006-11-14 2008-02-12 건국대학교 산학협력단 ｍＲＮＡ 결합 단백질 ＸａｉＦ, 이를 부착하는 유전자구조물 그리고 이들을 이용한 외래 유전자의 과발현 방법
EP2350272A4 (en) * 2008-11-03 2013-01-16 Iogen Energy Corp HOST AND FERMENTATION METHOD FOR CELLULATE PRODUCTION
US9012186B2 (en) 2009-04-27 2015-04-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Hemicellulose-degrading enzymes
EP2508600B1 (en) * 2009-12-05 2015-08-12 Amano Enzyme Inc. Mutant enzyme and application thereof
WO2012030849A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030811A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
DK2735611T3 (en) 2010-08-30 2019-01-28 Novozymes As POLYPEPTIDES WITH CELLULOLYSE INCREASING ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
WO2012030844A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US8629325B2 (en) 2010-08-30 2014-01-14 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2013159710A1 (zh) * 2012-04-25 2013-10-31 中国科学院上海生命科学研究院 一种提高拜氏梭菌木糖消耗率的方法
JP7007645B2 (ja) 2016-03-31 2022-02-10 東レ株式会社 変異型ｂｘｌ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌及びそれを使用したキシロオリゴ糖とグルコースの製造方法
CN108315313A (zh) * 2018-03-21 2018-07-24 中国农业科学院饲料研究所 多聚半乳糖醛酸酶及其突变体TePG28b_N85E/S86W和应用
WO2020047304A1 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 Genomatica, Inc. Xylr mutant for improved xylose utilization or improved co-utilization of glucose and xylose
CN116355881B (zh) * 2023-03-10 2024-02-23 云南师范大学 酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G及其应用
CN116515841B (zh) * 2023-06-21 2023-09-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种真菌来源的启动子元件及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5028530A (en) * 1985-01-28 1991-07-02 Xoma Corporation AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques
DK160947C (da) * 1986-04-17 1991-10-21 Novo Industri As Gen-udtrykkelsessystem
US5264350A (en) * 1986-08-18 1993-11-23 Institut Pasteur DNA sequence performing a function which is expressed in an over-production of extracellular proteins by various strains of bacillus, and vectors containing this sequence
GB8807939D0 (en) * 1988-04-05 1988-05-05 Univ Brunel Regulatory cassette for expression vectors
AU684524B2 (en) 1993-06-14 1997-12-18 Tet Systems Holding Gmbh & Co. Kg Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US5464758A (en) * 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
ATE238425T1 (de) 1993-07-23 2003-05-15 Dsm Nv Selektionmarker-genfreie rekombinante stämme: verfahren zur ihrer herstellung und die verwendung dieser stämme
CN1192106C (zh) * 1995-06-23 2005-03-09 丹尼斯科成分公司(丹尼斯科公司) 分离突变体及克隆互补基因的新方法

Also Published As

Publication number Publication date
US8461320B2 (en) 2013-06-11
CA2672126C (en) 2013-01-08
EP0833922A1 (en) 1998-04-08
ATE380242T1 (de) 2007-12-15
CA2672126A1 (en) 1997-01-09
PL184463B1 (pl) 2002-11-29
CN1192106C (zh) 2005-03-09
CN1207128A (zh) 1999-02-03
NZ311181A (en) 2000-02-28
CN1661014A (zh) 2005-08-31
EP0833922B1 (en) 2009-04-22
ATE429499T1 (de) 2009-05-15
JPH11507838A (ja) 1999-07-13
EP1514936B1 (en) 2007-12-05
AU6244396A (en) 1997-01-22
US20030175893A1 (en) 2003-09-18
DK1514936T3 (da) 2008-04-14
EP1514936A2 (en) 2005-03-16
JP4339901B2 (ja) 2009-10-07
PT833922E (pt) 2009-07-27
DK0833922T3 (da) 2009-08-03
CA2224626A1 (en) 1997-01-09
US6177261B1 (en) 2001-01-23
DE69637908D1 (de) 2009-06-04
WO1997000962A1 (en) 1997-01-09
EP1514936A3 (en) 2005-04-13
AU714511B2 (en) 2000-01-06
JP4339400B2 (ja) 2009-10-07
CN1661014B (zh) 2013-05-29
DE69637359T2 (de) 2008-10-30
BR9608910A (pt) 1999-05-04
CA2224626C (en) 2011-11-01
US6599745B1 (en) 2003-07-29
DE69637359D1 (de) 2008-01-17
JP2007244387A (ja) 2007-09-27
PL324186A1 (en) 1998-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL185052B1 (pl) Sekwencja kwasu nukleinowego, jej zastosowanie, sekwencja aminokwasowa, mutant komórki gospodarza, oraz sposób wytwarzania proteiny lub polipeptydu
US6300112B1 (en) β-xylosidase, nucleotide sequence encoding it, and use thereof
US20030148500A1 (en) Transcription factor
US6190890B1 (en) Fungal cellulases
US20040072325A1 (en) Transformation system of fungus belonging to the genus monascus
JP2003516112A (ja) 相同又は非相同タンパク質生産のための組換えペニシリウム フニクロスム
Hilson et al. Yeast RAS2 affects cell viability, mitotic division and transient gene expression in Nicotiana species
EP1157095A1 (en) Fungal cells with inactivated dna mismatch repair system
US6518042B1 (en) Process for making DNA libraries in filamentous fungal cells using a novel cloned gene involved in the mismatch repair system of filamentous fungal cells
EP0983368B1 (en) Cloning of udp-galactose epimerase
AU747607B2 (en) A nucleic acid cassette &amp; method to isolate mutants and to clone the complementing gene
WO1998006858A1 (en) BETA-1,4-ENDOGLUCANASE FROM $i(ASPERGILLUS NIGER)
WO2000032797A1 (en) Transformed thermomyces lanuginosus
JP2003047471A (ja) 異種タンパク質の分泌生産に優れた改変酵母およびその酵母を用いた異種タンパク質の製造法
Vandamme Promotors: Prof. dr. ir. Erick VANDAMME Prof. dr. ir. Wim SOETAERT Laboratory of Industrial Microbiology and Biocatalysis Department of Biochemical and Microbial Technology Ghent University
JP2001340085A (ja) プロモーター遺伝子