PL184463B1

PL184463B1 - Kaseta kwasu nukleinowego wektor komórka gospodarza i ich zastosowania fragment kwasu nukleinowego mutant sekwencji aminokwasowej sposób wytwarzania i selekcjonowania mutantów oraz sposób identyfikacji i oznaczania sekwencji kwasu nukleinowego

Info

Publication number: PL184463B1
Application number: PL96324186A
Authority: PL
Inventors: De@Graaff@Leendert@H; Van@Den@Broeck@Henriëtte@C; Visser@Jacob
Original assignee: Danisco Ingredients As
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1996-06-24
Publication date: 2002-11-29
Also published as: NZ311181A; US6177261B1; CA2672126A1; EP1514936A2; ATE380242T1; CN1661014B; US8461320B2; AU6244396A; DE69637359T2; US6599745B1; DK1514936T3; CN1661014A; PL324186A1; DK0833922T3; CN1192106C; DE69637359D1; DE69637908D1; CA2224626A1; EP0833922B1; JPH11507838A

Abstract

kierunkowy oraz p odatna na indukcje sekw encje w zm acniacza lub aktyw atora z w ia z a n a z podstaw ow a je d n o stk a tran sk ry p cy jn a w tak i spo- sób, ze po indukcji sekw encji w zm acniacza lub aktyw atora znacznik d w ukierunkow y kodujacy daje ekspresje, przy c zy m p o d a tn a n a in d u - kcje sek w en cja w z m ac n ia c za lub a k ty w ato ra p ochodzi od genu zw iazan eg o z ak ty w n o sc ia czesci m e ta b o liz m u , a z w la s z c z a od genu zw iazanego z c ze scia m e ta b o liz m u z k a sk ad a enzym ów lu b z p e tla sp rz e z e n ia zw ro tn e g o lub z w ie lo k ro tn y m i p e tla m i sp rz e z e n ia z w ro - tnego 8 Sposób w ytw arzania i selekcjonow ania m utanta szczepu drobnoustroju posiadajacego m utacje w zm acn iaja ca o k re slo n a c z e s c m eta- bolizm u w porów naniu ze szczepem niezm utow anym , z n a m ien n y ty m , ze polega na - w prow adzeniu do g ospodarza kasety kw asu nukleinow ego zaw ierajacej sekw encje k odujaca znacznik dw u k ieru n k o w y , przy czym kaseta kw asu nukleinow ego zaw iera ponadto podstaw ow a jed n o stk e tran sk ry p cy jn a z w iazan a operacyjnie z sek w en cja k w asu 13 Sposób w ytw arzania i selekcjonow ania m utanta szczepu d robnoustroju posiadajacego m utacje h am ujaca o k reslo n a czesc m etabo- lizmu w porów naniu ze szczepem niezm utow anym , z n am ien n y ty m , ze polega n a - w prow adzeniu do g ospodarza kasety kw asu nukleinow ego zaw ierajacej sekw encje k odujaca znacznik d w ukierunkow y, przy czym kaseta kw asu nukleinow ego zaw iera ponadto p odstaw ow a jednostke transkrypcyjna zw iazana operacyjnie z sek w en cja k w asu 24 Sposób identyfikacji i o znaczania sekw encji kw asu nukleinow ego aktyw ujacego regulatora podatnej na indukcje sek w en c ji w zm a- cniacza lub aktyw atora, z n a m ie n n y ty m , ze polega na - przeprow adzeniu próby kom plem entacji, w której z a pom oca czesci genom u niezm utow anego szczepu m ac ierzy ste g o n ie z aw ie- rajacego sekw encji kasety k w asu n ukleinow ego p ro w a d zi sie tra n sfo rm a c je g o sp o d arz a , p rzy c zy m 27 K om binacyjna kaseta kw asu nukleinow ego, zaw ierajaca 1) prom otor norm alnie zw iazany z genem docelow ym aktyw ujacego regulatora podatnej na indukcje sekw encji w z m acn ia cza lub akty- watora, 2) sekw encje kw asu nukleinow ego kodujaca regulator zw iazany operacyjnie z innym prom otorem , 3) h o m o lo g iczn a lub h e te ro lo g ic z n a sek w en cje k o d u ja c a h o m o lo g iczn a lub h e te ro lo g ic zn a proteine lub peptyd, przy c zy m p rom o- tor (1) je s t zw iazany o peracyjnie z hom ologiczna lub h eterologiczna sekw encja kodujaca, przy czym taki aktyw ujacy re g u la to r uczestniczy w szczególnosci w m etabolizm ie, a zw laszcza taki aktyw ujacy regulator uczestniczy specyficznie w czesci m etabolizm u z k a sk a d a enzy- m ów lub petla sprzezenia zw rotnego lub w ielokrotnym i petlam i sprzezenia zw rotnego, a taki gen docelow y zaw iera cen tru m w iazace dla produktu ekspresji genu regulatora PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kaseta kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawową jednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawową jednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora znacznik dwukierunkowy kodujący daje ekspresję, przy czym podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi od genu związanego z aktywnością części metabolizmu, a zwłaszcza od genu związanego z częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego.

Korzystnie kaseta według wynalazku charakteryzuje się tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej geny facB, NiaD, AmdS, Canł, Ura3, Ura4 oraz PyrA oraz ich homologi.

Korzystnie znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej gen facB Aspergillus nidulans, gen NiaD Aspergillus niger, gen NiaD Aspergillus oryzae, gen AmdS Aspergillus nidulans, gen Can1 Schizosaceharomyces pombe, gen Ura3 Saccharomyces cerevisiae,

184 463 gen Ura4 Saccharomyces pombe oraz geny PyrA Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces.

Korzystnie kaseta jest podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora normalnie uczestniczy w regulacji kaskady enzymów, równie korzystnie jest ona podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na każdym z następujących fragmentów kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofuranozydazę B oraz endoarabinazę,

- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę,

- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR i alcA,

- fragment pochodzący z genu CUPl,

- fragment pochodzący z genu PHO5,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10,

- fragment pochodzący z genu xlnA,

- fragment pochodzący z genu pgaTT.

Równie korzystnie kaseta jest podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na następujących fragmentach kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofuranozydazę B oraz endoarabinazę Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę Aspergillus niger,

- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR i alcA Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu CUPl Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu PHO5 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu xlnA, xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu xlnA lub xlnD Aspergillus tubigensis,

- fragment pochodzący z genu pgaTT Aspergillus niger.

Korzystnie jest ona podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora uczestniczy normalnie w metabolizmie węgla.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania i selekcjonowania mutanta szczepu drobnoustroju posiadającego mutację wzma(^:ni^j^cą określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym charakteryzujący się tym, że polega na

- wprowadzeniu do gospodarza kasety kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawowajednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawową jednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora znacznik dwukierunkowy kodujący daje ekspresję, przy czym podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi od genu związanego z aktywnością części metabolizmu, a zwłaszcza od genu związanego z częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, przy czym przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu związanego ze znacznikiem dwukierunkowym,

- hodowaniu uzyskanego drobnoustroju w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora znajdująca się na kasecie kwasu nukleinowego jest normalnie aktywna oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję,

184 463

- wyselekcjonowaniu transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w wyżej podanych warunkach hodowli,

- poddawaniu wyselekcjonowanego transformanta mutagenezie,

- hodowaniu uzyskanego szczepu w warunkach akceptowanych dla szczepu z fenotypem odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w takich warunkach, że w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, oraz w obecności podatnego na metabolizm substratu dla określonej części metabolizmu,

- wybieraniu takiego szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w takich warunkach selekcji, że dla niezmutowanego szczepu macierzystego zawierającego kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS) pochodzącą z genu xlnA,

- określona część metabolizmu jest częścią ksylanolityczną metabolizmu węgla,

- etap hodowli, w którym hoduje się uzyskane drobnoustroje w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polega na hodowli w obecności induktora sekwencji UAS oraz przy braku represora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla,

- wybieranie transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w obecności represora sekwencji UAS i w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla oraz ewentualnie także w obecności induktora sekwencji UAS,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie tego szczepu wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w warunkach selekcji, w których dla niezmutowanego szczepu macierzystego zawierającego kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA,

- przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu pyrA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego,

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polega na hodowli w warunkach, w których wzmacniacz lub aktywator jest normalnie aktywny, to jest w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora oraz przy braku represora wzmacniacza lub aktywatora oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekpresję,

- wybieranie transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora wzmacniacza lub aktywatora albo w obecności represora wzmacniacza lub aktywatora i w obecności podatnego na metabolizm substratu dla określonej części metabolizmu,

184 463

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w warunkach selekcji, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora wzmacniacza lub aktywatora albo w obecności represora wzmacniacza lub aktywatora.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest sekwencją UAS pochodząca z genu xlnA,

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polega na hodowli w warunkach, w których sekwencja UAS jest normalnie aktywna, to jest w obecności induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, oraz przy braku represora sekwencji UAS, to jest przy braku glukozy, oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, albo w obecności represora sekwencji UAS, to jest w obecności glukozy, i w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w warunkach selekcji, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, lub w obecności represora sekwencji UAS, to jest w obecności glukozy.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że selekcjonując nierekombinacyjnego mutanta szczepu drobnoustroju, dodatkowo po ostatnim etapie eliminuje się kwas nukleinowy z wprowadzonej kasety kwasu nukleinowego.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania i selekcjonowania mutanta szczepu drobnoustroju posiadającego mutację hamującą określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym charakteryzujący się tym, że polega na:

-wprowadzeniu do gospodarza kasety kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawową jednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawową, jednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora znacznik dwukierunkowy kodujący daje ekspresję, przy czym podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi od genu związanego z aktywnością części metabolizmu, a zwłaszcza od genu związanego z częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, przy czym przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego oraz wykazuje aktywność typu charakteryzującego określoną zmniejszaną lub hamowaną część metabolizmu, '

184 463

- hodowaniu uzyskanego drobnoustroju w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna, w których brak ekspresji znacznika dwukierunkowego daje w wyniku rozwój i detekcję uzyskanego drobnoustroju i w których ekspresja znacznika dwukierunkowego jest korzystnie letalna lub silnie hamuje rozwój,

- selekcjonowaniu transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w wyżej podanych warunkach hodowli,

- poddaniu wybranego transformanta mutagenezie w znany sobie sposób,

- hodowaniu szczepu uzyskanego z mutagenezy w warunkach akceptowanych dla rozwoju szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego i w obecności podatnego na metabolizm substratu oraz w warunkach, w których następuje zmniejszenie lub inhibicja aktywności określonej części metabolizmu w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem albo z albo bez kasety kwasu nukleinowego,

- selekcjonowaniu szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, wykazującego fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu w warunkach selekcji, w których następuje zmniejszenie lub inhibicja aktywności określonej części metabolizmu w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem z lub bez kasety kwasu nukleinowego, takiej jak zmniejszona strefa rozjaśnienia po rozwoju na podłożu, które służy jako podłoże dla części metabolizmu, dla której aktywność ma być zmniejszona lub zahamowana.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej geny facB, NiaD, AmdS, Can1, Ura3, Ura4 oraz PyrA oraz ich homologi.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej gen facB Aspergillus nidulans, gen NiaD Aspergillus niger, gen NiaD Aspergillus oryzae, gen AmdS Aspergillus nidulans, gen Can1 Schizosaccharomyces pombe, gen Ura3 Saccharomyces cerevisiae, gen Ura4 Saccharomyces pombe oraz geny PyrA Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora normalnie uczestniczy w regulacji kaskady enzymów.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na każdym z następujących fragmentów kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę,

- fragment pochodzący z genu CUP1,

- fragment pochodzący z genu PHO5,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10,

- fragment pochodzący z genu xlnA,

- fragment pochodzący z genu pgall.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na następujących fragmentach kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę Aspergillus niger,

- fragment zawierający centrum wiążące α/cR, 'takie jak na promotorze alcR i alcA Aspergillus nidulans,

184 463

- fragment pochodzący z genu CUP1 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu PHO5 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu xlnA, xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu xlnA lub xlnD Aspergillus tubigensis,

- fragment pochodzący z genu pgaH. Aspergillus niger.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora uczestniczy normalnie w metabolizmie węgla.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że

- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą. (UAS), pochodzącą z genu clnA,

- etap hodowania, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polega na hodowaniu przy braku represora sekwencji UAS, w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla, a zwłaszcza także w obecności induktora sekwencji UAS,

- selekcjonowanie transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w wyżej podanych warunkach,

- etap hodowania wybranego transformanta po mutagenezie odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, w warunkach, które nie są akceptowane do rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w obecności urydyny i kwasu fluoroorotowego, oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego dają w wyniku aktywność określonej części metabolizmu węgla, to jest w obecności induktora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla oraz przy braku represora sekwencji UAS, na przykład obecności D-ksylozy albo alternatywnego nierepresyjnego źródła węgla w połączeniu z induktorem, takim jak ksylan lub D-ksyloza,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowania po mutagenezie, wykazującego fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu węgla, odbywa się w warunkach selekcji, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu węgla w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z albo bez kasety kwasu nukleinowego, takiej jak zmniejszona strefa rozjaśnienia po rozwoju na ksylanie.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA,

- etap hodowania, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję, polega na hodowli w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora i przy braku represora wzmacniacza lub aktywatora w warunkach, w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję,

- selekcjonowanie transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego pyrA odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

- etap hodowania wybranego transformanta po mutagenezie odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest o fenotypie pyrA', w warunkach nieakceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie pyrA+, takim jak fenotyp odpowiadający ekspresji

184 463 znacznika dwukierunkowego, to jest warunkach polegających na obecności urydyny i kwasu fluowo-zrotzwcgz i w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego zapewniają aktywność określonej części metabolizmu, to jest w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora i podatnego na metabolizm substratu oraz przy braku represora aktywatora lub wzmacniacza albo alternatywnego nierepresyjnego substratu w połączeniu z induktorem.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA, gospodarz nie wykazuje fenotypu pyrA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego,

- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest sekwencją UAS, pochodzącą z genu xlnA,

- etap hodowania, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję, polega na hodowli w warunkach, w których sekwencja UAS jest normalnie aktywna, to jest w obecności induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, i przy braku represora sekwencji UAS, to jest przy braku glukozy, oraz w warunkach, w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję,

- etap hodowania wybranego transformanta po mutagenezie odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest o fenotypie pyrA- w warunkach nieakceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie pyrA+, przy czym taki fenotyp odpowiada ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w warunkach polegających na obecności urydyny i kwasu f^uzrzorztowego i w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego zapewniają aktywność określonej części metabolizmu węgla, to jest w obecności induktora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla oraz przy braku represora sekwencji UAS, na przykład obecności D-ksylozy lub alternatywnego nicrcpresyjocgz źródła węgla w połączeniu z induktorem, takim jak ksylan,

- selekcja szczepu uzyskanego w etapie hodowania po mutagenezie, wykazującego fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu węgla, odbywa się w warunkach selekcji, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu węgla w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z lub bez kasety kwasu nukleinowego, takiej jak zmniejszony obszar rozjaśnienia po rozwoju na ksylanie.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że selekcjonując nicrckzmbioacyjncgo mutanta szczepu drobnoustroju, dodatkowo po ostatnim etapie eliminuje się kwas nukleinowy z wprowadzonej kasety kwasu nukleinowego.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób identyfikacji i oznaczania sekwencji kwasu nukleinowego aktywującego regulatora podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora charakteryzujący się tym, że polega na

- przeprowadzeniu próby komplementacji, w której za pomocą części genomu oiezmutzwanego szczepu macierzystego nie zawierającego sekwencji kasety kwasu nukleinowego prowadzi się traosformacju gospodarza, przy czym gospodarz jest mutantem szczepu drobnoustroju, posiadającym mutację hamującą określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, a następnie

- selekcjonuje się pozytywnego transformanta aktywatora na podstawie ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz

- porównuje się kwas nukleinowy z pozytywnego transformanta aktywatora z kwasem nukleinowym mutanta szczepu drobnoustroju, który posiada mutację hamującą określoną

184 463 część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, oraz identyfikuje się i wydziela kwas nukleinowy zawierający fragment obecny w pozytywnym transformancie aktywatora i zmutowany w negatywnym mutancie aktywatora.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz zawiera kwas nukleinowy odpowiadający przynajmniej częściowo sekwencji kwasu nukleinowego kodującej znacznik dwukierunkowy, przy czym ta homologia jest zasadniczo wystarczająca dla umożliwienia rekombinacji homologicznej w chromosomie znacznika dwukierunkowego kodującego kwas nukleinowy na kasecie kwasu nukleinowego.

Przedmiotem wynalazku jest także kombinacyjna kaseta kwasu nukleinowego, zawierająca

1) promotor normalnie związany z genem docelowym aktywującego regulatora podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora,

2) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą regulator związany operacyjnie z innym promotorem,

3) homologiczną lub heterologiczną sekwencję kodującą homologiczną lub heterologiczną proteinę lub peptyd, przy czym promotor (1) jest związany operacyjnie z homologiczną lub heterologiczną sekwencją kodującą przy czym taki aktywujący regulator uczestniczy w szczególności w metabolizmie, a zwłaszcza taki aktywujący regulator uczestniczy specyficznie w części metabolizmu z kaskadą enzymów lub pętlą sprzężenia zwrotnego lub wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, a taki gen docelowy zawiera centrum wiążące dla produktu ekspresji genu regulatora.

Korzystnie, dalszy promotor związany operacyjnie z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego jest promotorem związanym w sposób naturalny z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego.

Korzystnie, sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator koduje regulator ksylanolityczny, a zwłaszcza sekwencja kwasu nukleinowego koduje xylR.

Korzystnie, sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator jest sekwencją kwasu nukleinowego xlnR, kodującą produkt ekspresji xylR, odpowiadającą sekwencji id nr 9 albo sekwencjami kwasu nukleinowego jej równoważnymi, albo sekwencją zdolną do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy pochodzą z obszaru niewiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów, albo sekwencją która wykazuje 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową xylR przedstawioną na sekwencji id nr 9 lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą xylR odpowiadający sekwencji id nr 9, przy czym korzystnie zawiera ona delecję i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego o sekwencji id nr 9.

Korzystnie, promotor (1) jest promotorem należącym do grupy promotorów związanych z genami docelowymi xlnA, xlnB, xlnC, xlnD i axeA.

Korzystnie, promotor (1) jest promotorem związanym z genem docelowym xlnD.

Korzystnie, sekwencja homologiczna lub heterologiczną koduje enzym.

Korzystnie, sekwencja homologiczna lub heterologiczną koduje ksylanazę, glukanazę, α-glukuronidazę, lipazę, esterazę, esterazę kwasu ferulowego, proteazę lub oksyreduktazę, takąjak oksydaza heksozy.

184 463

Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający kombinacyjną kasetę kwasu nukleinowego według wynalazku zdefiniowaną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza zawierająca kombinacyjną kasetę kwasu nukleinowego oraz ewentualnie wektor zawierający taką kasetę kwasu nukleinowego, przy czym kombinacyjna kaseta kwasu nukleinowego, zawiera:

3) homologiczną lub heterologiczną sekwencję kodującą homologiczną lub heterologiczną proteinę lub peptyd, przy czym promotor (1) jest związany operacyjnie z homologiczną lub heterologiczną sekwencją kodującą, przy czym taki aktywujący regulator uczestniczy w szczególności w metabolizmie, a zwłaszcza taki aktywujący regulator uczestniczy specyficznie w części metabolizmu z kaskadą enzymów lub pętlą sprzężenia zwrotnego lub wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, a taki gen docelowy zawiera centrum wiążące dla produktu ekspresji genu regulatora.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że dalszy promotor związany operacyjnie z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego jest promotorem związanym w sposób naturalny z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator koduje regulator ksylanolityczny, korzystnie xylR.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator jest sekwencją kwasu nukleinowego xlnR, kodującą produkt ekspresji xylR, odpowiadającą sekwencji id nr 9 albo sekwencjami kwasu nukleinowego jej równoważnymi, albo sekwencją zdolną do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy pochodzą z obszaru niewiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów, albo sekwencją która wykazuje 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową xylR przedstawioną na sekwencji id nr 9 lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą xylR odpowiadający sekwencji id nr.9, przy czym korzystnie zawiera ona delecję i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego o sekwencji id nr 9.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że promotor (1) jest promotorem należącym do grupy promotorów związanych z genami docelowymi xlnA, xlnB, xlnC, xlnD i axeA.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że promotor (1) jest promotorem związanym z genem docelowym xlnD.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczną koduje enzym.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczną koduje ksylanazę, glukanazę, α-glukuronidazę, lipazę, esterazę, esterazę kwasu ferulowego, proteazę lub oksyreduktazę, takąjak oksydaza heksozy.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka gospodarza zawiera gen docelowy regulatora albo w sposób naturalny albo wprowadzony techniką rekombinacyjnego DNA pod warunkiem, że gdy gen docelowy i regulator są rodzime dla komórki gospodarza, to regulator jest obecny w kopiach wielokrotnych.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera wielokrotne kopie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej wspomniany regulator lub sekwencji kwasu nukleinowego zawierającej kasetę kwasu nukleinowego obejmuj ącą sekwencję

184 463 kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawową jednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawową jednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora znacznik dwukierunkowy kodujący daje ekspresję, przy czym podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi od genu związanego z aktywnością części metabolizmu, a zwłaszcza od genu związanego z częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej geny facB, NiaD, AmdS, Can1, Ura3, Ura4 oraz PyrA oraz ich homologi.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej gen facB Aspergillus nidulans, gen NiaD Aspergillus niger·, gen NiaD Aspergillus oryzae, gen AmdS Aspergillus nidulans, gen Can1 Schizosaccharomyces pombe, gen Ura3 Saccharomyces cerevisiae, gen Ura4 Saccharomyces pombe oraz geny PyrA Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora normalnie uczestniczy w regulacji kaskady enzymów.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na każdym z następujących fragmentów kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę,

- fragment pochodzący z genu CCJUl,

- fragment pochoddący z geeni PH05,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10,

- fragment pochodzący z genu xlnA,

- fragment pochodzący z genu pgaII.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), takąjaka znajduje się na następujących fragmentach kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA abfB i abnA kodujących odpowiednio arabinofurauozydazę A, arabiuofUrauczydazę B oraz endoarabinazę Aspergillus niger,

- fragment pochodząąy z geeni gZaA kodująącno glukoamylazę Aspergillus niger,

- fragment :zawieraający centnun wirąż^c^^ a IcR, takie jak na promotorze alcRś i alc A Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu CUP1 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu PHO5 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu xlnA, xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu xlnA lub xlnD Aspergillus tubigensis,

- fragment pochodzący z genu pgaII Aspergillus niger.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wspomniany regulator lub sekwencję kwasu nukleinowego będącą sekwencją kodującą produkt ekspresji xylR, odpowiadającą sekwencji id nr 9 albo sekwencjami kwasu nukleinowego jej równoważnymi, albo sekwencją zdolną do

184 463 hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy pochodzą z obszaru niewiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów, albo sekwencją która wykazuje 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową xylR przedstawioną na sekwencji id nr 9 lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą xylR odpowiadający sekwencji id nr 9, przy czym korzystnie zawiera ona delecję i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego o sekwencji id nr 9 oraz wspomniany promotor, przy czym promotor jest promotorem związanym z genem docelowym xlnD.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że należy do grupy obejmującej drobnoustroje i komórki roślinne.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że należy do grupy obejmującej komórki grzybów, a zwłaszcza komórki filamentowe grzybów.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że należy do grupy obejmującej rodzaj Aspergillus, Trichoderma, Penicillium i Fusarium.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że należy do szczepu obejmującego Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus foetidus, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowii, Aspergillus kawachii, Aspergillus carbonarius oraz Aspergillus japonicus.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest szczepem należącym do rodzaju obejmującego Saccharomyces, Kluyveromyces i Lactobacillus.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest szczepem należącym do Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces pombe.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen docelowy jest endogeniczny względem komórki gospodarza.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen docelowy jest obecny w kopiach wielokrotnych.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kombinacyjnej kasety kwasu nukleinowego do wytwarzania homologicznej lub heterologicznej proteiny lub peptydu do wytwarzania proteiny lub peptydu z sekwencji kwasu nukleinowego kodujących proteinę lub peptyd, przy czym kombinacyjna kaseta kwasu nukleinowego, zawiera

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że dalszy promotor związany operacyjnie z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego jest promotorem związanym w sposób naturalny z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator koduje regulator ksylanolityczny, a zwłaszcza sekwencja kwasu nukleinowego koduje xylR.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator jest sekwencją kwasu nukleinowego xlnR, kodującą

184 463 produkt ekspresji xylR, odpowiadającą sekwencji id nr 9 albo sekwencjami kwasu nukleinowego jej równoważnymi, albo sekwencją zdolną do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy pochodzą z obszaru niewiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów, albo sekwencją która wykazuje 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową xylR przedstawioną na sekwencji id nr 9 lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą xylR odpowiadający sekwencji id nr 9, przy czym korzystnie zawiera ona delecję i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego o sekwencji id nr 9.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że promotor (1) jest promotorem należącym do grupy promotorów związanych z genami docelowymi xlnA, xlnB, xlnC, xlnD i axeA.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że promotor (1) jest promotorem związanym z genem docelowym xlnD.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczną koduje enzym.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczna koduje ksylanazę, glukanazę, α-glukuronidazę, lipazę, esterazę, esterazę kwasu ferulowego, proteazę lub oksyreduktazę, takąjak oksydaza heksozy.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie komórki gospodarza zawierającej kombinacyjną kasetę kwasu nukleinowego oraz ewentualnie wektor zawierający taką kasetę kwasu nukleinowego do wytwarzania homologicznej lub heterologicznej proteiny lub peptydu do wytwarzania proteiny lub peptydu z sekwencji kwasu nukleinowego kodującej proteinę lub peptyd, przy czym kombinacyjna kaseta kwasu nukleinowego, zawiera

Przedmiotem wynalazku jest także fragment kwasu nukleinowego, wykorzystywany jako primer lub sonda charakteryzujący się tym, że posiada sekwencję kwasu nukleinowego taką, jaka jest obecna w sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, lecz nie taką, jaka jest obecna w obszarze wiązania palca cynkowego sekwencji id nr 9, przy czym fragment ma długość co najmniej 20 nukleotydów'.

Korzystnie fragment zawiera ponadto sekwencję kwasu nukleinowego taką jaka jest obecna w terminalu C kodującym połowę sekwencji id nr 9 z obszaru wiązania palca cynkowego.

Przedmiotem wynalazku jest także połączenie dwóch lub więcej fragmentów kwasu nukleinowego w zestawie analitycznym charakteryzujące się tym, że służy do wykrywania i ewentualnie wydzielania sekwencji równoważnych sekwencji id nr 9, przy czym fragment jest wykorzystywany jako primer lub sonda i posiada sekwencję kwasu nukleinowego taką, jaką jest obecna w sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, lecz nie taką, jaka jest obecna w obszarze wiązania palca cynkowego sekwencji id nr 9, przy czym fragment ma długość co najmniej 20 nukleotydów.

184 463

Korrystynie fragment zawiera ponadto sekwencję kwasu nukleinowego taką jaka jest obecna w terminalu C kodującym połowę sekwencji id nr 9 z obszaru wiązania palca cynkowego.

Korzystnie jeden fragment zawiera część sekwencji kwasu nukleinowego nie kodującą obszaru palca cynkowego.

Przedmiotem wynalazku jest także mutant sekwencji aminokwasowej o sekwencji id nr 9 z mutacją w obszarze wiązania palca cynkowego, wykazującą zwiększone wiązanie DNA.

Przedmiotem wynalazku jest także mutant sekwencji aminokwasowej o sekwencji id nr 9 z mutacją wykazującą obniżone wiązanie DNA.

Przedmiotem wynalazku jest także mutant sekwencji aminokwasowej o sekwencji id nr 9 z mutacją w obszarze wiązania palca cynkowego, przy czym mutacja wykazuje obniżone wiązanie DNA.

Przedmiotowy wynalazek ukierunkowany jest na kasetę kwasu nukleinowego, zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym wymieniona kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawową jednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz wymieniona kaseta zawiera dalej podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawową jednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora pojawia się ekspresja dwukierunkowego znacznika kodującego sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym wymieniona podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi z genu związanego z aktywnością części metabolizmu oraz podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi z genu związanego z metabolizmem.

Podstawowa jednostka transkrypcyjną zawiera każdy element niezbędny do transkrypcji genu, z którym transkrypcja jest związana. Może ona zawierać promotor z lub bez sekwencji wzmacniacza. Podstawowa jednostka transkrypcyjną musi być operatywna w organizmie gospodarza. Podstawowa jednostka transkrypcyjną musi być ulokowana w taki sposób, aby była operatywnie związana z genem znacznika dwukierunkowego, aby była możliwa jego transkrypcja. Znane są odpowiednie przykłady szeregu komórek gospodarza, takich jak na przykład Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces, Kluyveromyces i Lactobacillus. W Przykładach podstawowa jednostka transkrypcyjną tGOX pochodząca z jednostki transkrypcyjnej goxC Aspergillus niger (Whittington et al., 1990) zapewnia dające się stosować rozwiązanie wynalazku.

Podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora normalnie uczestniczy korzystnie w regulacji kaskady enzymatycznej lub w części metabolizmu z jedną lub więcej niż jedną pętlą sprzężenia zwrotnego. W dalszym rozwiązaniu wynalazku kaseta kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora, która normalnie uczestniczy w metabolizmie węgla. Odpowiednimi przykładami podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora do stosowania w kasecie kwasu nukleinowego według wynalazku są Przeciwprądowe Sekwencje Aktywujące (UAS), znajdujące się na każdym z następujących fragmentów kwasów nukleinowych:

+++ - fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA, kodujących odpowiednio arabinofuranoksydazę A, arabinofuranoksydazę B i endoarabinazę,

- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę,

- fragment pochodzący z genu CUP1,

- fragment pochodzący z genu PHO5,

- fragment pochodzący z genu GAL1, GAL7 lub GAL10,

- fragment pochodzący z genu xlnA,

- fragment pochodzący z genu pgall.

Przykładowo framenty te mogą pochodzić z następujących organizmów, jak opisano w literaturze:

184 463

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA, kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofuranozydazę B i endoarabinazę z Aspergillus niger (Flipphi M.J.A. et al., 1994),

- fragment pochodzący z genu glaA, kodującego glukoamylazę z Aspergillus niger (Fowler T. et al., 1990),

- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR z Aspergillus nidulans (Feleobok B. et al., 1994),

- fragment pochodzący z genu CUP1 z Saccharomyces cerevisiae (Hinoen A. et al, 1995),

- fragment pochodzący z genu PHO5 z Saccharomyces cerevisiae (Hinnen A. et al., 1995),

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7, lub GAL10 z Saccharomyces cerevisiae (Hinnen A. et al., 1995),

- fragment pochodzący z genów xlnA, xlnB, xlnC lub xlnD z Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genów xlnB, xlnC lub xlnD z Aspergillus niger (patrz w jakimkolwiek miejscu tego opisu),

- fragment pochodzący z genów x7nA lub xlnD z Aspergillus tubigensis (de Graaff et al, 1994),

- fragment pochodzący z genu pgall z Aspergillus niger (patrz w jakimkolwiek miejscu w tym dokumencie).

W przykładach sekwencja UAS xlnA jest zilustrowana w dającym się stosować rozwiązaniu wynalazku.

Znacznik dwukierunkowy jest określeniem uznanym w technice. Obejmuje on znacznik selekcyjny, który można wykorzystać do wykazania obecności lub braku ekspresji na podstawie stosowanych warunków selekcji. Korzystny znacznik dwukierunkowy nadaje selektywność na podstawie letalności lub nadzwyczajnego zmniejszenia rozwoju. Możliwym rozwiązaniem wynalazku jest także alternatywnie różne zabarwienie kolonii po ekspresji lub braku ekspresji genu znacznika dwukierunkowego. Odpowiednie przykłady znanych znaczników dwukierunkowych można znaleźć w grupie obejmującej geny facb, NiaD, AmdS, Can1, Ura3, Ura4 i PyrA. Wykazano w ten sposób, że homo^i PyrA oznaczone są w literaturze jako PyrG, Ura3, Ura4, Pyr4 i Pyr1. Geny te można znaleźć między innymi w następujących organizmach: gen facB w Aspergillus nidulans, gen NiaD w Aspergillus niger, gen NiaD w Aspergillus oryzae, gen AmdS w Aspergillus nidulans, gen Can1 w Schizosaccharomyces pombe, gen Ura3 w Saccharomyces cerevisiae, gen Ura4 w Saccharomyces pombe oraz geny PyrA w Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces.

Selekcja mutantów facB, to jest z fenotypem negatywnym, może odbywać się na podstawie odporności na fluzrozctan. Selekcja na FAC B*, to jest na fenotyp pozytywny, może odbywać się na octanie jako źródle węgla (Katz, M.E. and Hynes M.J., 1989). Selekcja mutantów niaD, to jest z fenotypem negatywnym, może odbywać się na podstawie odporności na chlorany. Selekcja na NIA D*, to jest na fenotyp pozytywny, może odbywać się na azotanie jako źródle azotu (Unkles S.E. et al., 1989a i 1989tb . Selekcja mutantów amdS, to jest z fenotypem negatywnym, może odbywać się na podstawie odporności na fluoroacetamid. Selekcja na AMD S*, to jest na fenotyp pozytywny, może odbywać się na acetamidzie jako źródle azotu. Ponieważ większość grzybów nie ma genu kodującego acetamidazę, to funkcja AMD S jest dla takich grzybów znacznikiem dominującym. Został on wykorzystany jako taki między innymi w Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis, Aspergillus var. awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus oryzae, Aspergillus sydowii, Aspergillus japonicus, Aspergillus aculeatus, szczepy Penicillium, szczepy Trichoderma (Kelly and Hynes, 1985, oraz Bailey et al., 1991). Selekcja mutantów Can1, to jest z fenotypem negatywnym, może odbywać się na podstawie odporności na kanavaoioę, przy czym kaoavanina jest analogiem argininy. Selekcja na CAN 1*, to jest na fenotyp pozytywny, może odbywać się na argininie (Ekwall K., 1991). Gen kodujący 5'-P-dekarboksylazę orotydyny znany jest jako pyrA, pyrG

184 463 lub ura3. Ustalono to dla różnych organizmów, to jest Aspergilli, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces. Selekcja mutantów pyrA, to jest z fenotypem negatywnym, opisanymi także jako pyrG lub ura3, może odbywać się na podstawie odporności na kwas fluoroorotowy. Selekcja na PYR A* i jego homologi, to jest na fenotyp pozytywny, może być dokonywana na podstawie prototrofii urydynowej lub uracylowej. W Przykładach pyrA z Aspergillus niger (Wilson et al., 1988)) jest przedstawiony w możliwym do stosowania rozwiązaniu wynalazku. Inne przykłady są znane specjalistom i mogą być łatwo znalezione w literaturze. Stosowany znacznik selekcyjny zależy między innymi od imitowanego organizmu gospodarza oraz innych czynników wtórnych, takich jak łatwość selektywności, niezawodność oraz koszt stosowanych substratów.

Kaseta kwasu nukleinowego inkorporowana do wektora transformacji lub ekspresji jest także objęta zakresem niniejszego wynalazku. Zakresem tym objęte jest również wykorzystanie takiej kasety lub wektora kwasu nukleinowego w sposobach transformacji i selekcji, a zwłaszcza w sposobach wytwarzania mutantów wykazujących nadekspresję enzymu uczestniczącego w określonej części metabolizmu, w sposobach wytwarzania mutantów wykazujących zmniejszoną lub zahamowaną ekspresję enzymu uczestniczącego w określonej części metabolizmu, jak również w sposobach oznaczania i wydzielania genów regulatorowych uczestniczących w określonej części metabolizmu.

Zatem zakresem niniejszego wynalazku objęty jest sposób wytwarzania i selekcji szczepu mutanta drobnoustroju, przy czym mutacja wzmacnia określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, polegający na:

- wprowadzeniu do gospodarza kasety kwasu nukleinowego według któregokolwiek z poprzedzających zastrzeżeń, przy czym przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego,

- hodowaniu uzyskanych drobnoustrojów w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora na kasecie kwasu nukleinowego jest normalnie aktywna oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, oraz w których ekspresja wymienionego znacznika dwukierunkowego prowadzi korzystnie do rozwoju, a brak ekspresji do braku rozwoju,

- selekcji transformanta, który ma fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w wyżej wspomnianych warunkach hodowli,

- poddawaniu wybranego transformanta w znany sobie sposób mutagenezie,

- hodowaniu uzyskanego szczepu w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, i w obecności ulegającego metabolizmowi substratu dla określonej części metabolizmu, oraz

- wybraniu szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w warunkach selekcji, które dla niezmutowanego szczepu macierzystego, zawierającego kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego.

W odpowiednim rozwiązaniu tego sposobu

- określona część metabolizmu jest ksylanolityczną częścią metabolizmu węgla,

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza i aktywatora jest normalnie aktywna i w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, obejmuje hodowlę w obecności induktora sekwencji UAS i przy braku repressora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla,

- selekcja transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający genowi znacznika dwukierunkowego odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

184 463

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekpresji znacznika dwukierunkowego, to jest w obecności repressora sekwencji UAS oraz w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla oraz ewentualnie także w obecności induktora sekwencji UAS,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w warunkach selekcji, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają brak ekspresji znacznika dwukierunkowego.

W dalszym rozwiązaniu tego sposobu

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, obejmuje hodowlę w warunkach, w których wzmacniacz lub aktywator jest normalnie aktywny, to jest w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora oraz przy braku repressora wzmacniacza lub aktywatora, oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję,

- selekcja transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w wyżej wspomnianych warunkach hodowli,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta, dla określonej części metabolizmu, odbywa się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora wzmacniacza lub aktywatora albo w obecności repressora wzmacniacza lub aktywatora oraz w obecności podatnego na metabolizm substratu,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w warunkach selekcji, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora wzmacniacza lub aktywatora albo w obecności repressora wzmacniacza lub aktywatora.

Wymienione wyżej rozwiązania mogą być odpowiednio scharakteryzowane przez

- kasetę kwasu nukleinowego, zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA,

- gospodarza nie wykazującego fenotypu pyrA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego, podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora, która jest sekwencją UAS pochodzącą od genu xlnA,

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polegający na hodowli w warunkach, w których sekwencja UAS jest normalnie aktywna, to jest w obecności induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, oraz przy braku repressora sekwencji UAS, to jest przy braku glukozy, oraz w innych warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję,

- selekcję transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywającą się w wyżej wymienionych warunkach hodowli,

184 463

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta, odbywający się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, albo w obecności repressora sekwencji UAS, to jest w obecności glukozy, oraz w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla,

- selekcję szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywającą się w warunkach selekcji, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają brak ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, albo w obecności repressora sekwencji UAS, to jest w obecności glukozy.

Korzystnym zakresem wynalazku objęty jest ponadto sposób otrzymywania i selekcji nierekombinacyjnego mutanta szczepu drobnoustroju, przy czym wymieniona mutacja wzmacnia określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, a sposób polega na przeprowadzeniu etapów sposobu według wynalazku opisanych w poprzednich ustępach, a następnie na wyeliminowaniu w znany sobie sposób kwasu nukleinowego z wprowadzonej kasety kwasu nukleinowego.

Jak już omówiono poprzednio sposób wytwarzania i selekcji mutanta szczepu drobnoustroju, przy czym wymieniona mutacja hamuje określoną część metabolizmu węgla w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, obejmuje

- wprowadzenie do gospodarza kasety kwasu nukleinowego według wynalazku, jak opisano wyżej, przy czym przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego, a wykazuje aktywność typu charakteryzującego określoną część metabolizmu, który ma być zmniejszony lub zahamowany,

- hodowlę uzyskanego drobnoustroju w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora kasety kwasu nukleinowego jest normalnie aktywna, w których brak ekspresji znacznika dwukierunkowego kasety kwasu nukleinowego daje w wyniku rozwój i detekcję uzyskanego drobnoustroju oraz w których ekspresja wymienionego znacznika dwukierunkowego jest letalna lub hamuje silnie rozwój,

- selekcję transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w wyżej wspomnianych warunkach hodowli,

- poddanie wybranego transformanta mutagenezie w znany sobie sposób,

- hodowlę szczepu uzyskanego z mutagenezy w warunkach akceptowanych dla wzrostu szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w obecności podatnego na metabolizm substratu i w warunkach, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z albo bez kasety kwasu nukleinowego,

- selekcję szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, który wykazuje fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu w warunkach selekcji, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z albo bez kasety kwasu nukleinowego, takiej jak zmniejszona strefa rozjaśnienia po rozwoju na substracie, które służy jako substrat dla części metabolizmu, dla którego aktywność ma być zmniejszona lub zahamowana.

W dalszym rozwiązaniu takiego sposobu:

- ' określona część metabolizmu jest ksylanolityczną częścią metabolizmu węgla,

184 463

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, obejmuje hodowlę przy braku repressora sekwencji UAS kasety kwasu nukleinowego i w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla, a zwłaszcza także w obecności induktora sekwencji UAS,

- selekcja transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w wyżej wymienionych warunkach hodowli,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, które nie są akceptowane dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w obecności urydyny i kwasu fluoroorotowego, oraz w warunkach, które w zmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku aktywność określonej części metabolizmu węgla, to jest w obecności induktora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla oraz przy braku repressora sekwencji UAS, na przykład w obecności sorbitu lub alternatywnego, nierepresyjnego źródła węgla w połączeniu z induktorem, takim jak ksylan lub D-ksyloza,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, który wykazuje fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu węgla, odbywa się w warunkach selekcji, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu węgla w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z albo bez kasety kwasu nukleinowego, takąjak zmniejszona strefa rozjaśnienia po rozwoju na ksylanie.

Podaje się przykład stosowania sposobu według poprzedniego ustępu, w którym:

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję, obejmuje hodowlę w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora i przy braku repressora wzmacniacza lub aktywatora oraz w warunkach, w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję,

- selekcja transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego pyrA, odbywa się w wyżej wymienionych warunkach hodowli,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest o fenotypie PYRA, w warunkach, które nie są akceptowane dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie PYRA’, takim jak fenotyp odpowiadający ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w warunkach obejmujących obecność urydyny i kwasu fluoroorotowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku aktywność określonej części metabolizmu, to jest w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora i podatnego na metabolizm substratu oraz przy braku repressora aktywatora lub wzmacniacza albo alternatywnego, nierepresyjnego substratu w połączeniu z induktorem.

W korzystnym rozwiązaniu sposób według poprzedzających dwóch ustępów jest sposobem, w którym:

- kaseta kwaa u nukleinowego zewiera sekweneję kwas u nukleinowego kogującą dwukierunkowy znacznik pyrA,

184 463

- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest sekwencją UAS pochodzącą z genu xlnA,

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję, obejmuje hodowlę w warunkach, w których sekwencja UAS jest normalnie aktywna, to jest w obecności induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, oraz przy braku repressora sekwencji UAS, to jest przy braku glukozy, oraz w warunkach, w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję,

- selekcja transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego pyrA, odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w warunkach, które nie są akceptowane dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie PYRA+, takim jak fenotyp odpowiadający ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w warunkach obejmujących obecność urydyny i kwasu fluoroorotowego oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym, zawierającym kasetę kwasu nukleinowego, dają w wyniku aktywność określonej części metabolizmu węgla, to jest w obecności induktora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla oraz przy braku repressora sekwencji UAS, na przykład w obecności sorbitu lub alternatywnie nierepresyjnego źródła węgla w połączeniu z induktorem, takim jak ksylan lub D-ksyloza,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, który wykazuje fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu węgla, odbywa się w warunkach selekcji, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu węgla w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z lub bez kasety kwasu nukleinowego, taką jak zmniejszona strefa rozjaśnienia po rozwoju na ksylanie.

Opisane wyżej sposoby można stosować korzystnie za pomocą gospodarza, charakteryzującego się tym, że przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego zawiera on kwas nukleinowy odpowiadający przynajmniej częściowo sekwencji kwasu nukleinowego kodującej znacznik dwukierunkowy, przy czym stopień tej odpowiedniości jest wystarczający dla umożliwienia homologicznej rekombinacji w chromosomie znacznika dwukierunkowego kodującego kwas nukleinowy zawarty na kasecie kwasu nukleinowego. Taki aspekt rozwiązania zapewnia integrację kasety kwasu nukleinowego w z góry określonym miejscu.

W dalszym korzystnym rozwiązaniu kasetę kwasu nukleinowego inkorporuje się w wielokrotnych kopiach w celu zapewnienia, aby etap mutagenezy nie powodował inaktywacji znacznika dwukierunkowego, ponieważ dałoby to nieprawidłowe wyniki przy wykrywaniu negatywnych fenotypów znacznika oraz zmniejszenie liczby pozytywnych fenotypów znacznika.

W korzystnych rozwiązaniach wynalazku została skonstruowana taka kaseta kwasu nukleinowego, którą można wykorzystać w sposobie wytwarzania mutantów dających nadekspresję enzymu zawartego w określonej części metabolizmu, w sposobie wytwarzania mutantów wykazujących zmniejszoną lub zahamowaną ekspresję enzymu zawartego w określonej części metabolizmu oraz w sposobie oznaczania i wydzielania genów regulatorowych zawartych w określonych częściach metabolizmu. W szczególności przedstawiono układ wykorzystywany dla mutantów przy metabolizmie węgla. W przykładach opisane są mutanty ze zmienioną charakterystyką ksylanolityczną, jak również mutanty arabinazowe i poligalakturonazowe prowadzące do mutantów w szlakach arabinolitycznych i pektynolitycznych.

Jako mutowany szczep w przykładach wykorzystuje się Aspegillus, jakkolwiek wystarczy jakikolwiek inny drobnoustrój akceptowany w przemyśle. Do przykładów takich organizmów należą Saccharomyces, na przykład Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces pombe, Aspergillus, na przykład Aspergillus nidulans, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Kluyve184 463 romyces oraz Lactobacillus. Inne przykłady są oczywiste dla fachowców z tej dziedziny i pewna ich liczba będzie pojawiać się w opisie. W ten sposób można już wywarzać szczep dający nadekspresję lub ekspresję zerową. Można również przeprowadzać identyfikację oraz określać sekwencję regulatora aktywującego podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora, jeżeli w szczególności taki regulator aktywujący objęty jest metabolizmem, a zwłaszcza jeżeli taki regulator aktywujący objęty jest częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego. Sekwencja kwasu nukleinowego takiego genu regulatorowego może być następnie wykorzystana do wzmocnienia ekspresji genów docelowych, przy czym taki gen docelowy jest genem, który regulowany jest genem regulatorowym. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku taki gen docelowy ma centrum wiążące dla produktu ekspresji genu regulatorowego. Połączenie promotora związanego normalnie z genem docelowym regulatora z genem regulatorowym w kasecie ekspresji, przy czym wymieniony promotor związany jest operacyjnie z sekwencją homologiczną lub heterologiczną kodującą poddawaną ekspresji proteinę lub peptyd homologiczny lub heterdldgiczny, może prowadzić do kasety ekspresji nadzwyczaj użytecznej dla ekspresji homologicznych, a nawet Oeterolcgicznych protein lub peptydów. Regulator kodujący gen może znajdować się pod kontrolą swojego rodzimego promotora lub jakiegokolwiek innego promotora, który może dawać ekspresję w wybranej komórce gospodarza. Promotor może być konstytutywny lub ulegać indukcji, co jest bardziej pożądane dla szczególnego procesu produkcyjnego. Taka kombinacyjna kaseta ekspresji objęta jest zakresem wynalazku, ponieważ tworzy wektor lub plazmid zawierający taką kasetę. Stopień ekspresji nie jest już ograniczony obecnością zbyt małej ilości regulatora, a zatem stopień ekspresji genu poddawanego ekspresji jest o wiele wyższy niż w odpowiedniej komórce gospodarza, w której gen daje ekspresję pod kontrolą tego samego promotora lecz bez dodatkowej obecności genu regulatorowego. Taką zwiększoną ekspresję uzyskuje się korzystnie w komórkach organizmów zawierających normalnie składniki części szlaku metabolicznego, na którą się oddziaływuje. Odpowiednimi komórkami gospodarza są komórki filamentowe grzybów. Inkorporacja kombinowanej kasety ekpresji typu opisanego wyżej w komórce gospodarza zawierającej gen docelowy regulatora może prowadzić do zwiększonej ekspresji genu docelowego lub zwiększonej ekspresji genów docelowych, jeżeli obecne są wielokrotne geny docelowe. Gen docelowy jest korzystnie endogen^/ny względem komórki gospodarza. Komórka gospodarza zawierająca kombinacyjną kasetę ekspresji także objęta jest zakresem wynalazku.

W przykładach podaje się sekwencję kwasu nukleinowego xlnR regulatora ksylandlitycznego szlaku xylR. Ustalono, że geny docelowe tego regulatora zawierają geny xlnA, xlnB, xlnC i xlnD, jak również gen axeA. Przedstawiono wzrost ekspresji ksylanazy A i może on służyć do wykazania ogólnej przydatności działania xylR na gen docelowy regulatora xylR. W tej dziedzinie znana jest pewna liczba sekwencji zawierających wspomniane geny xlnA, B, C i D. Taka informacja jest łatwo dostępna dla specjalistów w tej dziedzinie i należy ją uważać za włączoną do wynalazku. Promotory o szczególnej przydatności do stosowania w odłączeniu z kwasem nukleinowym xlnR mogą być wybrane z xlnA, xlnB, xlnC i xlnD. Wykorzystanie promotora axeA także stanowi odpowiednie rozwiązanie wynalazku. Promotory znane są specjalistom w tej dziedzinie i uważa się je za włączone do wynalazku. Promotor xlnA opisany jest przez de Graaffa et al., 1994. Promotor xlnB został opisany przez Kinoshita et al., 1995. Promotor xlnD został opisany w patencie europejskim nr EP 95201707.7 i włączony jest do Listy Sekwencji w sekwencji o sekwencji id nr 8 niniejszego dokumentu. Sekwencje promotorów można albo łatwo zsyntezować na podstawie znanych sekwencji albo wyprowadzić w znany sobie sposób z zawierających je organizmów lub wektorów. Tam, gdzie stosowane jest określenie promotor, wzmacniacz lub regulator, można naturalnie stosować fragment zawierający promotor, wzmacniacz lub regulator tak długo dopóki nie jest naruszona ich operacyjucść. W konstrukcjach według wynalazku nie ma potrzeby włączania tylko odnośnej sekwencji i mogą być obecne także wszelkie inne mezakłócające sekwencje oskrzydlające.

184 463

Przedmiotowym wynalazkiem objęta jest nie tylko sekwencja kwasu nukleinowego xlnR kodująca produkt ekspresji xylR, lecz także sekwencje kodujące równoważne produkty ekspresji i mutanty produktów ekspresji, jak również same produkty ekspresji o sekwencjach kwasu nukleinowego zgodnie z wynalazkiem. Każde wykorzystanie xylR lub xylR kodującego sekwencje (= zlnR) tu ujawnione stosowane jest także do mutantów i sekwencji kwasu nukleinowego kodujących takie mutanty i uważane jest jako włączone tu mutatis mutandi.

Przykłady odpowiednich komórek grzybów, stosowanych do ekspresji sekwencji i kaset kwasu nukleinowego według wynalazku, obejmują Aspergilli, takie jak Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus carbonarius, Aspergillus foetidus, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowii, Aspergillus kawachii, Aspergillus japonicus oraz szczepy rodzaju Trichoderma, Penicillium i Fusarium. Inne komórki, takie jak komórki roślinne, również nadają się jako komórki gospodarza, przy czym w opisie wymienione są również alternatywne komórki gospodarza.

Genami szczególnie zainteresującymi z punktu widzenia ekspresji, wykorzystującymi kasetę ekspresji według wynalazku albo w połączeniu z sekwencją kwasu nukleinowego według wynalazku, są geny kodujące enzymy. Odpowiednimi genami do ekspresji są geny kodujące ksylanazy, glukanazy, oksyreduktazy, takie jak oksydaza heksoz, α-glukuronidaza, lipaza, esteraza, esteraza kwasu ferulowego oraz proteazy. Są to nie ograniczające wynalazku pożądane produkty ekspresji, w tej dziedzinie znana jest pewna liczba sekwencji obejmujących wspomniane geny, a taka informacja jest łatwo dostępna dla specjalistów w tej dziedzinie i uważa się ją za włączoną do wynalazku. Geny można łatwo zsyntezować albo na podstawie sekwencji znanych w literaturze lub w bazie danych albo można je wyprowadzić w znany sobie sposób z zawierających je organizmów lub z wektorów, przy czym uważa się to za wiedzę łatwo dostępną dla specjalistów w tej dziedzinie, nie wymagającą dalszego wyjaśniania.

Produkt ekspresji wykazujący 80-100% identyczności z aminokwasową sekwencją xylR zgodnie z sekwencją id nr 9 lub zakodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego xlnR o sekwencji id nr 9 (z nukleotydu 948) uważa się za równoważny produkt ekspresji regulatora ksylanazy (xylR) według wynalazku, a zatem objęty jest zakresem wynalazku. Równoważny produkt ekspresji powinien wykazywać aktywność wiązania DNA. Taka aktywność wiązania DNA powinna korzystnie być taka, aby produkt ekspresji wiązał się z kwasem nukleinowym genu docelowego w takim samym lub większym stopniu jak produkt ekspresji wiąże się z sekwencją aminokwasową o sekwencji id nr 9. Korzystnymi genami docelowymi do oznaczania aktywności wiązania się są takie geny, które kodują xylA, xylB, xylC i xylD, to jest geny xlnA, xlnB, xlnC i xlnD.

Zastrzeżone są także mutanty produktu xylR ekspresji genu xlnR oraz kodująca sekwencja aminokwasową xlnR o sekwencji id nr 9, utrzymująca przynajmniej ten sam stopień aktywności wiązania się z punktem docelowym. Do mutantów uważanych za objęte definicją równoważnych produktów ekspresji należą w szczególności mutanty ze zmianami aminokwasowymi w porównaniu z sekwencją aminokwasową taką jak sekwencja id nr 9. Takie równoważniki uważa się za właściwe rozwiązania wynalazku, ponieważ są kodującymi je sekwencjami kwasów nukleinowych. Odpowiednie są mutanty z 1-15 podstawionymi aminokwasami, przy czym uważa się także, że substytucje na przykład 1-5 aminokwasów stanowią szczególnie przydatne rozwiązania wynalazku, dające równoważne produkty ekspresji. Wiadomo ogólnie specjalistom w tej dziedzinie, że substytucje szczególnych aminokwasów innymi aminokwasami tego samego typu nie mają poważniejszego wpływu na aktywność peptydu. Na podstawie profilów hydrolecznictwa specjalista w tej dziedzinie łatwo ustali, które substytucje można przeprowadzić. Zastąpienie hydrofobowych aminokwasów przez inne hydrofobowe aminokwasy oraz zastąpienie hydrofitowych aminokwasów przez inne hydrofilowe aminokwasy da na przykład w wyniku produkt ekspresji, który jest właściwym rozwiązaniem wynalazku. Takie substytucje są uważane za objęte zakresem wynalazku pod określeniem

184 463 równoważniki. Uważa się, że mutacje punktowe w kodującej sekwencji kwasów nukleinowych o sekwencji id nr 9 dają w wyniku sekwencje kwasów nukleinowych, które objęte są zakresem wynalazku. Takie mutacje punktowe mogą dać w wyniku mutacje uśpione na poziomie aminokwasowym lub opisane wyżej mutanty substytucyjne. Wynalazkiem objęte są także mutanty substytucyjne, w których substytucje mogą być wszelkiego typu. Identyczność mutantu wynosi korzystnie 85-100%, korzystnie 90-100%, a zwłaszcza 95-100% w porównaniu z sekwencją aminokwasową o sekwencji id nr 9. Jak już zastrzeżono, powyższe sekwencje amiookwasowe wykazujące 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową o sekwencji id nr 9 objęte są równoważnikiem znaczeniowym, tak że wynalazkiem objęte są delecje i ewentualnie substytucje do 20% sekwencji ammokwasowej, korzystnie mniej niż 15%, a zwłaszcza mniej niż 10%, a szczególnie mniej niż 5% sekwencji aminokwasowej według wynalazku. Taki mutant może zawierać dclccju i ewentualnie substytucję w jednej lub więcej niż jednej części sekwencji aminokwasową. Taki mutant delecyjny i ewentualnie substytucyjny zawiera jednakże sekwencję aminokwasową odpowiadającą obszarowi wiązania palca cynkowego oraz sekwencji aminokwasowej odpowiadającej motywowi RRRLWW. Uważa się, że mutanty delecyjne z 1-5 aminokwasami objęte są zakresem wynalazku. Mutanty delecyjoc o większej liczbie delecji niż 5 aminokwasów i ewentualnie więcej niż 5 substytucji i z mutacjiam mogą rt^-wi^ii^^ utrzymać akkywność wiązania DNA.

Taka większa liczba delecji i ewentualnie substytucji i ewentualnie mutacji punktowych ma miejsce korzystnie w półterminalu N sekwencji aminokwasowej oraz odpowiedniej części kodującej sekwencji kwasów nukleinowych. Uważa się, że większość ważnych obszarów biorących udział w regulacji i aktywacji obecne jest w półterminalu C sekwencji aminokwasowej z obszaru wiązania palca cynkowego i jako takie mutanty delecyjne zawierają korzystnie przynajmniej tę część sekwencji aminokwasowej. Korzystnie brak jest mutacji w obszarze wiązania palca cynkowego, odpowiadającym obszarowi zakodowanemu w sekwencji id or 9 z nukleotydów w położeniu od 1110 do 1260. Jeżeli jest obecna mutacja, to nie powinna obejmować odstępu pomiędzy 6 cysteinami koordynującymi cynk, a zwłaszcza żadna mutacja nie powinna obejmować żadnych z 6 cystein. Korzystnie ponadto, gdy żadna mutacja nie jest obecna w motywie RRRLWW obecnym w sekwencji aminokwasowej o sekwencji id nr 9. Delecja może mieć miejsce w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji aminokwasowej. Taki mutant delecyjny będzie jednakże zawierać sekwencję aminokwasową odpowiadającą obszarowi wiązania palca cynkowego oraz sekwencję aminokwasową odpowiadającą motywowi RRRLWW. Delecje od 1 do 15 aminokwasów, korzystnie od 1 do 10 aminokwasów, a zwłaszcza od 1 do 5 aminokwasów są odpowiednimi rozwiązaniami dla zapewnienia równoważności.

Rozwiązaniem równoważnych sekwencji kwasu nukleinowego jest sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje produkt ekspresji o takiej samej sekwencji kwasu nukleinowego, jak xylR sekwencji id or 9 lub zakodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego xlnR o sekwencji id nr 9. Sekwencja kwasu nukleinowego kodującą produkt ekspresji wykazujący 80-100% identyczności z sekwencją aminokwaso^ją xylR o sekwencji id or 9 lub zakodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego kodującą xylR o sekwencji id or 9 także uważana jest za równoważną sekwencję kwasu nukleinowego xlnR i objęta jest zakresem wynalazku. Innym rozwiązaniem równoważnej sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego zdolna do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak zdefiniowano w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id or 9, przy czym wymienione primery i sondy wyprowadzone są z obszaru nie wiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów. W ogólności odpowiednimi długościami dla sond i primerów jest od 20 do 60 nukleztydów, a zwłaszcza od 25 do 60 nukleotydów. Korzystnie jeżeli sonda lub primer pochodzi z terminalu C kodującego połowę sekwencji id nr 9 z obszaru wiązania palca cynkowego. W korzystnym rozwiązaniu sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku zdolna jest do hybrydyzacji w specyficznych warunkach przynajmniej takiej ostrości, jaka przedstawiona

184 463 jest w Przykładach sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9. Równoważna sekwencja kwasu nukleinowego da się wyprowadzić z innych organizmów, na przykład techniką PCR z wykorzystaniem primerów opartych na sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, jak określono wyżej. Produkt ekspresji równoważnej sekwencji kwasu nukleinowego, jak właśnie zdefiniowano, uważany jest także za objęty zakresem wynalazku. I odwrotnie, sekwencja kwasu nukleinowego kodująca równoważną sekwencję aminokwasową według wynalazku także uważana jest za objętą zakresem znaczeniowo równoważnej sekwencji kwasu nukleinowego. Korzystnymi rozwiązaniami wynalazku są zwłaszcza równoważne sekwencje kwasu nukleinowego oraz produkty ekspresji takich sekwencji dające się wyprowadzić z filamentowych grzybów i roślin. Równoważna sekwencja kwasu nukleinowego obejmuje korzystnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą obszar wiązania palca cynkowego, odpowiadający obszarowi zakodowanemu w sekwencji id nr 9 z nukleotydów od pozycji 1110 do 1260. W korzystnym rozwiązaniu równoważna sekwencja kwasu nukleinowego powinna kodować 6 cystein koordynujących cynk. W dalszym rozwiązaniu odstęp pomiędzy cysternami powinien odpowiadać odstępowi jak w sekwencji id nr 9.

Do zakresu wynalazku należą także rozwiązania obejmujące połączenia charakterystyk różnych rozwiązań równoważnych sekwencji kwasu nukleinowego oraz opisanych wyżej produktów ekspresji. Zastrzeżone są także mutanty z mutacjami w obszarze wiązania palca cynkowego, ponieważ mogą wykazywać zwiększone wiązanie DNA. Uważa się, że do zakresu wynalazku należą także mutanty wykazujące zmniejszone wiązanie DNA. Takie mutanty mogą zawierać mutację w obszarze wiązania palca cynkowego. Zastrzeżone są zwłaszcza mutanty z sekwencją aminokwasową o sekwencji id nr 9.

Zakresem niniejszego wynalazku objęte są również fragmenty sekwencji kwasu nukleinowego zgodnej z sekwencją id nr 9, zawierające przynajmniej 15 nukleotydów. Takie fragmenty można wykorzystać jako sondy lub primery do wykrywania i wydzielania sekwencji równoważnych. Użyteczne może być zwłaszcza połączenie dwóch lub więcej takich fragmentów w zestawie, analitycznym do wykrywania i ewentualnie wydzielania takich równoważnych sekwencji. Korzystnie, gdy fragment wyprowadza się z półterminalu C sekwencji aminokwasowej odpowiadającej sekwencji id nr 9. W odpowiednim rozwiązaniu zestawu jeden fragment nie będzie zawierać części sekwencji kwasu nukleinowego, tworzącej obszar wiązania palca cynkowego. W przykładach przedstawiono odpowiednie połączenie fragmentów wykorzystywanych jako primery. Uważa się, że każda sekwencja dająca się uzyskać techniką PCR, jak przedstawiono w przykładach z tymi primerami, jest objęta zakresem wynalazku. Warunki hybrydyzacji stosowane w przykładach zabezpieczają minimalną ostrość konieczną dla selektywności. Można zastosować ostrzejsze warunki, takie jak ostre warunki hybrydyzacji opisane przez Sambrooka et al. dla zwiększonej homologii uzyskanych sekwencji z sekwencją id nr 9. Niższe stężenie soli oznacza w ogólności ostrzejsze warunki. Wszelkie fragmenty sekwencji zgodnej z sekwencją id nr 9, będące polipeptydem lub kodujące polipeptyd wykazujący aktywność wiązania genu docelowego, o pełnej sekwencji, objęte są także zakresem wynalazku, ponieważ są ich równoważnymi sekwencjami kwasu nukleinowego lub sekwencjami aminokwasowymi, przy czym równoważnik jest określony tak jak określono wyżej w odniesieniu do hybrydyzacji i ewentualnie mutacji i ewentualnie degeneracji kodu genetycznego dla pełnej sekwencji.

Wektor lub plazmid zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą xylR lub jego równoważną sekwencję, jak określono wyżej, także objęty jest zakresem wynalazku, tak jak wektor lub plazmid zawierający taką sekwencję oraz komórka gospodarza zawierająca taką dodatkową sekwencję. Poddana transformacji komórka gospodarza, taka jak komórka drobnoustroju lub rośliny zawierająca przynajmniej jedną dodatkową kopię kodującej sekwencji kwasu nukleinowego zgodnej z sekwencją id nr 9 lub jej równoważnik także objęta jest zakresem wynalazku. Przygotowuje się korzystnie różne rozwiązania, tak aby sekwencja mogła dawać ekspresję w wektorze, plazmidzie lub komórce gospodarza. Gen regulatorowy może zawierać pełną sekwencję id nr 9 lub tylko jej sekwencję kodującą w połączeniu

184 463 z alternatywnym promotorem, który zdolny jest do działania w komórce gospodarza. W opisie podano odpowiednie przykłady komórek gospodarza. Odpowiednie promotory operacyjne dla różnych komórek gospodarza, które można wprowadzać za pomocą kodującej sekwencji zgodnej z sekwencją id nr 9, są oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. W szczególności dla komórek gospodarza wyraźnie wspomnianych w opisie znane są konstytutywne promotory lub podatne na indukcję promotory, dostępne do pracy z wynalazkiem bez nadmiernego obciążenia.

Opracowano sposób wytwarzania homologicznych lub heterologicznych protein lub peptydów, przy czym sposób obejmuje ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej homologiczną proteinę lub peptyd w komórce gospodarza, a wymieniona komórka gospodarza zawiera ponadto dodatkową kopię sekwencji kwasu nukleinowego kodującej gen regulatorowy, taki jak xlnR lub jego równoważnik, który także daje ekspresję. Opisany właśnie sposób realizuje się za pomocą kombinacyjnej kasety ekspresji kwasu nukleinowego, zawierającej gen regulatorowy związany operacyjnie z pierwszym promotorem, a wymieniona kaseta zawiera ponadto drugi promotor, przy czym drugi promotor jest normalnie związany z genem docelowym regulatora, przy czym wymieniony promotor genu docelowego jest operacyjnie związany z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą homologiczną lub nawet hetnrdlogicznc proteinę lub peptyd, mający dawać ekspresję. Pierwszy promotor może być związany w sposób naturalny z genem regulatorowym, lecz może być także promotorem wybranym, który może funkcjonować w komórce gospodarza. Stopień ekspresji nie jest już ograniczony obecnością zbyt małej ilości regulatora, a zatem stopień ekspresji genu dającego eskpresję jest o wiele wyższy niż w odpowiedniej komórce gospodarza, w której gen daje ekspresję bez dodatkowej obecności genu regulatorowego. Takią zwiększoną ekspresję uzyskuje się korzystnie w komórkach organizmów zawierających normalne składniki części szlaku metabolicznego, na które się oddziaływuje. Odpowiednimi komórkami gospodarza jest komórka roślinna lub drobnoustrój, przy czym odpowiednim drobnoustrojem może być grzyb, a zwłaszcza grzyb filameutowy. Przykłady odpowiednich komórek gospodarza podano w różnych miejscach opisu i mogą być one uważane za włączone do opisu. Inkorporacja kombinowanej kasety ekspresji typu opisanego wyżej w komórce gospodarza zawierającej gen docelowy regulatora może prowadzić do zwiększonej ekspresji genu docelowego lub do zwiększonej ekspresji genów docelowych, jeżeli są obecne wielokrotne geny docelowe. Gen docelowy jest korzystnie związany w sposób naturalny z regulatorem. Taki gen docelowy jest korzystnie endogen^z^ względem komórki gospodarza. W przykładach podaje się sekwencję kwasu nukleinowego regulatora ksylanclityyznegd szlaku xlnR. Ustalono, że rodzime geny docelowe dla tego regulatora zawierają geny xlnA, xlnB, xlnC i xlnD, jak również axeA, i jako takie geny te są korzystnymi genami docelowymi. Istnieją także inne cele, które uważa się za objęte znaczeniowym genem docelowym. Zastrzeżeniami objęte są różne rozwiązania komórek gospodarzy według wynalazku. Jeżeli zarówno sekwencja regulatora, jak i genu docelowego obecne są w sposób naturalny w komórce gospodarza, to sekwencja regulatora będzie obecna w kopiach wielokrotnych. Taki drobnoustrój da nadekspresję genu regulowanego promotorem genu docelowego w porównaniu z drobnoustrojem rodzimym.

Ponieważ znana jest już sekwencja dla regulatora ksylanazy, to stało się możliwe wybicie regulatora ksylanazy. Wytwarzanie komórki gospodarza z wybiciem, gdy już raz znana jest sekwencja kwasu nukleinowego wybijanego genu, jest znane w standardowej technice. Sposób ten można realizować analogicznie do sposobu opisanego przez Berka et al. (1990) oraz w przykładzie 11 europejskiego opisu patentowego nr EP 95201707.7, który jest biegnącym europejskim zgłoszeniem patentowym, którego kopia została włączona po złożeniu przedmiotowego dokumentu, a sam przykład został skopiowany do niniejszego dokumentu w przykładach. Takie wybijanie daje komórkę gospodarza, która może być wolna od aktywności ksylauclityczuych. Komórka gospodarza wolna od aktywności ksylanolitycznej dzięki wybiciu genu xlnR może być wykorzystana do wytwarzania wybranych homologicznych lub heterologicznych produktów ekspresji wolnych od aktywności Ssylanolitycznej.

184 463

Komórka gospodarza z wybitym genem xłnR objęta jest również zakresem wynalazku. Taka komórka gospodarza jest zwłaszcza komórką roślinną lub grzybem filamentowym, a takim grzybem filamentowym jest korzystnie Aspergillus. W opisie podane są liczne przykłady odpowiednich komórek gospodarza.

Komórka gospodarza z mutacją w genie regulatora, który można, wytworzyć stosując sposób selekcji i mutacji według wynalazku, może być poddana komplementacji za pomocą regularnej aktywnej kopii genu regulatora. Taki dopełniony szczep da następnie ekspresję produktów wszelkich genów docelowych, które są regulowane regulatorem. Takie produkty genów docelowych będą nieobecne w przypadku negatywnego mutanta regulatora niedopełnionego. Po porównaniu prążków proteiny uzyskanych w znany sposób z obydwu szczepów widoczne jest, że produkty docelowe regulowane są regulatorem, a następnie odpowiednie nowe geny docelowe można oznaczyć w znany sposób, gdy już raz oznaczono jego produkt ekspresji. W ten sposób w niniejszych przykładach dla regulatora ksylazy xylR można znaleźć inne geny docelowe, niż te, które są już znane.

P rzy kłady

Przykład 1: Konstrukcja plazmidu

Przykład 1.1: Konstrukcja plazmidu selekcyjnego plM130

Plazmid selekcyjny plM130 skonstruowano tak jak przedstawiono na fig. 1. Techniką PCR1 utworzono fragment z plazmidu plM120 (de Graaff et al, 1994) wykorzystując oligonukleotyd 1 (SEQ ID Nr: 1):

5' - CACAATGCATCCCCTTTATCCGCCTGCCGT-3' (wzór 1) oraz oligonukleotyd A (SEQ ID Nr: 2)

5' - CAATTGCGACTTGGAGGACATGATGGGCAGATGAGGG-3' (wzór 2).

Oligonukleotyd 1 pochodził z położeń 600-619 (SEQ ID Nr: 5) promotora xlnA Aspergillus tubigensis (de Graaff et al., 1994), do których dodano 10 nukleotydów zawierających centrum Nsil. Koniec 3' oligonukleotydu A pochodził z jednostki transkrypcyjnej goxC Aspergillus niger (Whittington et al., 1990), kończącej się bezpośrednio przed centrum inicjacyjnym translacji (położenia 708-723) (SEQ iD Nr: 6), podczas gdy koniec 5' pochodził z obszaru kodowania genu pyrA A. niger (Wilson et al., 1988) (poczynając od centrum inicjacyjnego translacji (położenia 341 do 359, SEQ ID Nr: 7).

Fragment A utworzono techniką PCR z 10 pl buforu reakcyjnego 10* (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 0,01% żelatyny), 16 pl 1,25 mM każdego z czterech trój fosforanów dezoksynukleotydów, 1 ng DNA plazmidu plM120 oraz 1 pg każdego z oligonukleotydów 1 i A o objętości końcowej 100 pl. Taką mieszaninę reakcyjną mieszano i dodano do niej 1 pl polimerazy TAQ (5 U/pl) (Life Technologies). DNA poddano denaturacji przez inkubację w ciągu 3 minut w temperaturze 92°C, a następnie za pomocą 25 cykli jednominutowych w temperaturze 92°C, jednominutowych w temperaturze 48°C i jednominutowych w temperaturze 72°C. Po tych 25 cyklach mieszaninę poddano inkubacji w ciągu 5 minut w temperaturze 72°C. Analiza produktów reakcji drogą elektroforezy na agarozie ujawniła fragment z około 250 parami zasad, co odpowiada wielkości przewidywanej w oparciu o sekwencję genów

Techniką PCR2 utworzono fragment z plazmidu pGW635 (Goosen et al., 1987) wykorzystując oligonukleotyd 2 (SEQ ID Nr: 3)

5' - AGAGAGGATATCGATGTGGG-3' (wzór3) oraz oligonukleotyd B (SEQ lD Nr: 4)

5' -CCCTCATCTGCCCATCATGTCCTCCAAGTCGCAATTG-3' (wzór 4).

Koniec 5' oligonukleotydu B pochodził z podstawowej jednostki transkrypcyjnej goxC A. niger (położenia 708-723, SEQ ID Nr: 6) (Whittington et al., 1990), podczas gdy koniec 3' pochodził z obszaru kodowania genu pyrA A. niger, począwszy od centrum inicjacyjnego translacji. Oligonukleotyd 2 pochodził z obszaru kodowania pyrA (położenia 339-359, SEQ ID Nr: 7) i obejmuje centrum restrykcyjne EcoRV w położeniu 602 (SEQ ID Nr: 7).

184 463

Fragment B utworzono w identyczny sposób, jak fragment A, z tym wyjątkiem, że w tym przypadku mieszanina reakcyjna zawierała 1 μ każdego z nukleotydów 2 i B oraz 1 ng DNA plazmidu pGW635. Analiza produktów reakcji drogą elektroforezy na agarozie ujawniła fragment zawierający około 250 par zasad, co odpowiada wielkości oczekiwanej na podstawie sekwencji genu pyrA.

Fragmenty A i B oddzielono po elektroforezie od żelu agarozowego. Fragmenty wycięto z żelu agarozowego, po czym odzyskano je z kawałka agarozy drogą elektroelucji stosując misek ISCO. Zarówno na dużym jak i małym pojemniku tych misek zamontowano membrany do dializy, miski napełniono za pomocą 0,005 x TAE (bufor 50xTAE na 1000 ml: 242,0 g zasady Trizma (Sigma), 7,1 ml lodowatego kwasu octowego, 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0), a w dużym pojemniku miski umieszczono kawałek agarozy. Następnie miskę umieszczono w aparacie elektroelucyjnym, przy czym duży pojemnik w komorze katodowej zawierał 1*TAE, a mały pojemnik w komorze anodowej zawierał 1*TAE/3 M NaAc. Fragmenty poddawano elektroelucji przy napięciu 100 V w ciągu 1 godziny. Po tym czasie miskę zdjęto z aparatu elektroelucyjnego i usunięto bufor z dużego pojemnika, natomiast w małym pojemniku bufor usunięto tylko z górnej części. Pozostały bufor (100 (l), zawierający fragment DNA dializowano w misce względem destylowanej wody w ciągu 30 minut. Na koniec strącono DNA przez dodanie 0,1 objętości 3M NaAc, pH 5,6 oraz 2 objętości zimnego etanolu (-20°C). dNa oddzielo przez wirowanie (wirówka Eppendorfa) w ciągu 30 minut z prędkością 14000 x g w temperaturze 4°C. Po usunięciu klarownej cieczy pastylki DNA suszono za pomocą wirówki próżniowej Savant Speedvac. Z kolei DNA rozpuszczono w 10 μΐ buforu TE (TE: 10 mM Tris/Hd, pH 7,2, 1 mM EDTA, pH 8,0), a stężenie oznaczono drogą elektroforezy na żelu agarozowym korzystając z DNA lambda o znanym stężeniu jako odnośnika oraz barwiąc za pomocą bromku ethidium w celu wykrycia DNA.

Fragmenty A i B połączono w PCR3, który był identyczny z PCR1, z tym wyjątkiem, ze w tym przypadku mieszanina reakcyjna zawierała 1 μg każdego z oligonukleotydów 1 i 2 oraz w przybliżeniu 50 ng każdego z fragmentów A i B. Analiza produktów reakcji drogą elektroforezy na żelu agarozowym ujawniła fragment zawierający około 500 par zasad, co odpowiada wielkości oczekiwanej na podstawie sekwencji genów.

Otrzymany fragment C oddzielono od żelu agarozowego w opisany sposób, a następnie trawiono stosując enzymy restrykcyjne Nsili EcoRV. DNA trawiono w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C w mieszaninie reakcyjnej złożonej z następujących roztworów: 5 μl (=0,5 μg) roztworu DNA, 2 μΐ odpowiedniego buforu 10 x React (Life Technology), 10 jednostek enzymu restrykcyjnego (Life Technology) oraz sterylną wodę destylowaną, o objętości końcowej 20 μΐ. Po trawieniu fragment DNA analizowano drogą elektoforezy na żelu agarozowym, a następnie oddzielono w opisany sposób od żelu.

Dla końcowej konstrukcji plM130 5 μg plazmidu pGW635 trawiono w sposób opisany stosując 50 jednostek enzymów restrykcyjnych RcoRViXbalo objętości końcowej 500 μΐ. Po oddzieleniu produktów z żelu agarozowego wydzielono drogą elektroelucji 2,2 fragment EcoRV/Xbai o długości 2,2 kz (fragment D). Analogicznie 1 μg wektora pGEM-7Zf(+) (Promega) otrzymano przez trawienie za pomocą enzymów restrykcyjnych NsiI/Xbai, a następnie po trawieniu poddanego elektroforezie i wydzielono z żelu agarozowego drogą elektroelucji.

Plazmid pIM130 skonstruowano drogą następującej reakcji ligacji: 100 ng fragmentu pGEM-7Zf(+) Nsil/Xbai zmieszano z 50 ng fragmentu C i 50 ng fragmentu D oraz 4 pl buforu ligacyjnego 5* (skład: 500 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM MgC^, 10 mM ATP, 10 mM dwutiotreitolu, 25% PEG-1000), a następnie dodano do tej mieszaniny o ogólnej objętości 20 μί (1,2 jednostki/μl) ligazy T4 DNA (Life Technologies). Po inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 14°C mieszaninę rozcieńczono do 100 μΙ za pomocą sterylnej wody. 10 μΐ rozcieńczonej mieszaniny wykorzystano do przekształcenia właściwych komórek DH5a E. coli, przygotowanych w sposób opisany przez Sambrooka et al., 1989.

Dwie z otrzymanych kolonii hodowano w ciągu nocy w medium LB (medium LB na 1000 ml: 10 g peptonu tryptykazy (BBL), 5 g wyciągu drożdżowego (BBL), 10 g NaCl,

184 463

0,5 mM Tris-HCl, pH 7,5) zawierającego 100 pg/ml ampicyliny. Plazmid wydzielono z kultur drogą lizy alkalicznej w sposób opisany przez Mknlatisa et al. (1982), którą wykorzystano w analizie restrykcyjnej do wybrania klonu chroniącego żądany plazmid pIM130. DNA plazmidu wydzielano na dużą skalę z 500 ml kultur DH5a E. coli, zawierających pIM130 wyhodowany w medium zawierającym 100 pg/ml ampicyliny (Mkniatis et al., 1982). Plazmid oczyszczono przez wirowanie z CsCl, poddano fenoluwanlo, strącono etanolem i rozpuszczono w 400 μΐ TE. Wydajność wynosiła w przybliżeniu 500 pg.

Przykład 1.2: Konstrukcja plazmidu pIM135

Z plazmidu pIM120 skonstruowano drugi plazmid, który zawierał podstawową jednostkę transkrypcyjną goxC połączoną z obszarem kodowania pyrA i obszarem terminacji.

W PCR4 fragment wytwarzano z plazmidu pIM120, stosując oligonokleotyd 3

5' -CACAATGCATCGTATAAGTAACCTCGTTCG-3' (wzór 5), który pochodził z podstawowej jednostki transkrypcyjnej goxC (położenia 640-660, SEQ ID Nr: 6), do której dodano 10 nokleutydów zawierających centrum Nsil, oraz ollgonokleotydu 2 (wzór 3). Utworzony fragment oddzielono od żelu, trawiono za pomocą Nsil i EcoRV, u następnie klonowano razem z fragmentem EcoRV/Xbal pGW635 o długości 2,2 kz w plazmidzie pGEM-7Zf(+), który trawiono za pomocą XbaI/NsiI, jak opisano w Przykładzie 1.1, uzyskując w wyniku plazmid pIM135.

Plazmid pIM135 można wykorzystać jako nośnik konstrukcyjny do wytwarzania wektorów według wynalazku o jakiejkolwiek pożądanej, podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora, sekwencji UAS genu biorącego udział w metabolizmie. Plazmid pIM135 zawiera podstawowąjednostkę transkrypcyjną (tGOX), związaną operacyjnie z genem znacznika dwukierunkowego (pyrA).

P rz y ła d 2: Transformacja A. niger przy wykorzystaniu plazmidu pIM130

250 ml medium kultury, składające się z minimalnego medium (MM) Aspergillus (zawiera w 1 litrze: 6,0 g NaNO₂, 1,5 g KH₂pO4, 0,5 g MgSO4 · 7H₂O, 0,5 g KCl, wskazane źródło węgla, pH 6,0) oraz 1 ml roztworu Vishniaca (zawiera w 1 litrze 10 g EDTA, 4,4 g ZnSO4 · 7H2O, 1,0 g MnC^ · 4^O, 0,32 g CoC^ · 6H2O, 0,32 g CuSO4 · 5H2O, 0,22 g (NH4)₆Mo₇O24 · 4H2O, 1,47 g CaCL, · 2H2O, 1,0 FeSO4 · 7H2O, pH 4,0), uzupełnione 2% glukozy, 0,5% wyciągu drożdżowego, 0,2% kwasów Casamino (wolnych od witamin), 10 mM L-argininy, 10 pM nikutynoumidu i 10 mM urydyny, zaszczepiono zarodnikami szczepu NW205 (cspA1, pyrA6, nicA1, argB13) o stężeniu 1*106/ml, u grzybnię hodowano w ciągu 16-18 godzin w temperaturze 30°C w orbitalnej wstrząsarce New Brunswick o 250 obrotach na minutę. Grzybnię zebrano na siatce nylonowej Myracloth, korzystając z lejka Buchnera i przy łagodnym ssaniu, u następnie przemyto kilka razy za pomocą SP6 (SP6: 0,8% NaCl, 10 mM bufor fosforanu sodowego, pH 6,0). 150 mg ^yozyme 234 rozpuszczono w 20 ml SMC (SMC: 1,33 M sorbit, 50 mM CaC^, 20 mM buforu MES o pH 5,8) i dodano do niego 1 g (ciężar mokry) grzybni, ostrożnie ją zawieszając. Taką zawiesinę poddano inkubacji z delikatnym mieszaniem w ciągu 1-2 godzin w temperaturze 30°C, przy czym co każde 30 minut grzybnię ostrożnie zawieszano ponownie i pobierano próbkę do kontrolowania tworzenia się protoplastów, stosując hemocytometr do liczenia protoplastów. Gdy już jest obecna wystarczająca ilość protoplastów (więcej niż 1*10⁸), zawiesza się je ponownie ostrożnie i usuwa fragmenty grzybni drogą filtracji przez sterylny sączek z wełny szklanej. Protoplasty zbiera się drogą 10-minutowego wirowania z prędkością 3000 obrotów na minutę, w temperaturze 4°C, w wirówce stołowej, u następnie ostrożnie zawiesza ponownie w 5 ml STC (STC: 1,33 M sorbit, 50 mM CaC^, 10 mM Tris/HCl, pH 7,5).

Ten etap przemywania powtórzono dwukrotnie, po czym protoplasty zawieszono na koniec ponownie w STS przy gęstości 1*1(8 ria ml.

Transformację przeprowadzono przez dodanie 1 pg DNA pIM130 (rozpuszczonegow 10-20 pl TE) do 200 pl zawiesiny protoplastu razem z 50 pl bufora PEG (bufor PEG: 25% PEG-6000, 50 mM CaC^, 10 mM Tris/HCl, pH 7,2), mieszanej łagodnie przez pipetowanie kilka razy do dołu i do góry, i poddanej inkubacji w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut.

184 463

Po tym czasie dodano 2 ml buforu PEG, roztwór łagodnie mieszano i poddano inkubacji w temperaturze pokojowej w ciągu dalszych 5 minut, a następnie dodano 4 ml STC i mieszano łagodnie za pomocą mieszadła wirowego. Można to przeprowadzić również stosując 5 pg pIM130 oraz 1 i 5 pg DNA plazmidu pGW635. Jako kontrolę negatywną dodano do protoplastów 20 pl TE.

Jednomililitrowe porcje tej zawiesiny dodano następnie do 4 ml osmotycznie stabilizowanego agaru wierzchniego i wylano na płytki (wirować delikatnie w celu pokrycia płytki agarem) z MMS zawierającym albo 100 mM D-glukozy albo 100 mM D-ksylozy jako źródła węgla. Media te (MMS) były osmotycznie stabilizowane za pomocą 0,8 M KCl lub 1,33 M sorbitu.

Do oznaczenia regeneracji procentowej przygotowano szereg rozcieńczeń protoplastów przed transformacją (niepotraktowane protoplasty trzymane na lodzie) i po transformacji (uzyskane z kontroli negatywnej). Na płytkach z 10 mM urydyny uzupełnionej za pomocą MMS umieszczono 100 pl rozcieńczeń 10*3, 10'⁴, 10'⁵ i 10'⁶.

Przy kontroli pozytywnej, w której grzyby poddawano transformacji stosując plazmid pGW635, kolonie znaleziono na wszystkich płytkach. Jednakże częstość transformacji była znacznie niższa (1-10 transformantów na pg dNa plazmidu) na medium stabilizowanym za pomocą KCl niż na medium stabilizowanym sorbitem (100-1000 transformantów na pg DNA plazmidu). Jest to spowodowane znacznie wyższą częstością regeneracji w tym ostatnim medium, która wynosiła około 90% w porównaniu z 2-5% na medium stabilizowanym za pomocą KCl.

W przypadku transformacji ze stosowaniem plazmidu pIM130 transformanty znaleziono na medium zawierającym D-ksylozę jako źródło węgla, lecz nie na medium zawierającym D-glukozę. Częstość na medium stabilizowanym sorbitem wynosiła około 100 na pg DNA plazmidu, podczas gdy częstość na medium stabilizowanym za pomocą KCl była niższa niż jeden na pg DNA.

Przykład3: Analiza transformantów

Transformanty z plazmidu pIM130 uzyskanego w przykładzie 2 analizowano pod względem fenotypu przez umieszczenie na MM zawierającym 100 mM D-glukozy, 100 mM D-glukozy/1% ksylan owsiano-pszeniczny (Sigma #X0627) i 1% ksylanu owsiano-pszenicznego. Selekcją transformantów były repliki umieszczone na tych mediach i poddane inkubacji w temperaturze 30°C. Około 75% transformantów rozwijało się na medium zawierającym ksylan, podczas gdy nie odnotowano wzrostu na medium zawierającym D-glukozę. Pozostałe 25% kolonii wzrastało na wszystkich trzech badanych mediach.

Selekcję pięciu transformantów o spodziewanym fenotypie (wzrost na medium zawierającym ksylan, brak wzrostu na medium zawierającym D-glukozę) analizowano metodą Southerna. DNA grzybów wydzielono drogą zmodyfikowanego postępowania stosowanego do wydzielenia RNA roślin, w zasadzie tak jak opisano przez de Graaffa et al., 1988. Grzybnia, która była hodowana przez noc w medium kultury, została zebrana, przemyta chłodnym roztworem soli, zamrożona w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -80°C. Kwasy nukleinowe wydzielono przez rozerwanie 0,5 g zamrożonej grzybni, korzystając z mikrodysmembratora (Braun). Uzyskany proszek grzybni ekstrahowano świeżo przygotowanym buforem ekstrakcyjnym. Bufor ekstrakcyjny przygotowano następująco: 1 ml kwasu trójizopropylonaftalenosulfonowego (TNS) (20 mg/ml) zmieszano starannie z 1 ml kwasu p-aminosalicylowego (PAS) (120 mg/ml), po czym dodano 0,5 ml buforu 5 x RNB(5 x RNB zawiera 121,0 g Tris, 73,04 g NaCl oraz 95,10 g EGTA w 1 l, pH 8,5). Po dodaniu 1,5 ml fenolu bufor ekstrakcyjny doprowadzano do równowagi w ciągu 10 minut w temperaturze 55°C. Następnie ciepły bufor dodano do proszku grzybni i mieszano starannie zawiesinę w ciągu 1 minuty za pomocą mieszadełka wirowego. Po dodaniu 1 ml chloroformu zawiesinę mieszano jeszcze w ciągu 1 minuty. Po wirowaniu z szybkością K)4 x g w ciągu 10 minut za pomocą szybkobieżnej wirówki Sorvall, fazę wodną ekstrahowano jeszcze raz za pomocą równej objętości fenol/chloroform (1:1), a następnie ekstrahowano dwa razy chloroformem. DNA wydzielono z fazy wodnej stosując następującą procedurę:

184 463

DNA strącono natychmiast z fazy wodnej za pomocą 2 objętości etanolu w temperaturze pokojowej, a następnie oddzielono drogą wirowania za pomocą szybkobieżnej wirówki Sorvall z szybkością 10⁴ x g w ciągu 10 minut, przemyto dwukrotnie przez ponowne rozpuszczenie DNA w destylowanej, sterylnej wodzie i ponowne strącenie etanolem. RNA usunięto przez dodanie Rnase A (20 g pg/ml) do końcowego roztworu.

Wysokocząsteczkowy DNA (1-2 pg) wydzielony z N402 A. niger (cspA1) dzikiego typu oraz pięć transformantów pIM130, jak opisano, trawiono za pomocą Hpal (Life Technologies) zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskane fragmenty oddzielono drogą elektroforezy na żelu agarozowym i przeniesiono na membranę typu High-bond N, w sposób opisany przez Maniatisa et al. (1982). Hybrydyzację z użyciem fragmentu XbaI o długości 3,8 kz, znaczonego za pomocą ³²P, otrzymanego w sposób opisany przez Sambrooka et al, 1989, zawierającego gen pyrA A. niger jako sondę, przeprowadzono zgodnie z następującą procedurą (Sambrook et al:. hybrydyzacja wstępna w 6 x SSC (20xSSC na 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g cytrynianu sodowego 5,5 H2O, pH 7,0), 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodowego, roztwór 5* Denhardta (100 x roztwór Denhardta na 500 ml: 10 g Ficoll-400, 10 g poliwinylopirolidonu, 10 g albuminy osocza krwi bydlęcej (Pentax Fraction V) oraz 20 pg/ml denaturowanego DNA ze spermy śledzia w temperaturze 68°C w ciągu 3-5 godzin, oraz hybrydyzację w identycznym buforze, który zawierał denaturowaną znaczoną sondę, w temperaturze 68°C w ciągu 15-18 godzin, a następnie z dwukrotnym przemywaniem w 3 x SDS, 0,1% SDS w temperaturze 68°C oraz dwukrotnym przemywaniem w 0,2 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 68°C. Membranę pokryto Saranem i poddano autoradiografii w ciągu nocy w temperaturze -70°C za pomocą błon rentgenowskich Kodaka oraz kaset X-Omatic Kodaka z regularnie wzmacniającymi się ekranami.

W wyniku znaleziono prążek hybrydyzacyjny o długości 10 kz w torze N402, natomiast nie było tego prążka w transformantach NW205::130#1, NW205::130#2 i NW205::130#3. W transformantach NW205::130#1 i NW205::130#3 znaleziono fragment hybrydyzacyjny o długości 15 kz, natomiast w NW205::130#2 znaleziono prążek o długości 20 kz. Wyniki te odpowiadają odpowiednio integracji z kopią pojedynczą i podwójną w lokusie homologicznym pyrA. W transformantach NW205::130#4 i NW205::130#5 plazmid był zintegrowany w lokusie niehomologicznym. Do mutagenezy wybrano transformant NW205::130#2.

Fragment sekwencji UAS plazmidu pIM130 zawierał centrum wiążące konieczne dla regulatora pozytywnego do wykazania aktywności stymulacyjnej sekwencji UAS. Zatem inhibicja xlnR w komórce gospodarza zawierającej pMI130 daje w wyniku negatywną ekspresję znacznika dwukierunkowego obecnego na plazmidzie plM130. Ekspresja xlnR indukowana jest ksylanem lub ksylozą. Zatem obecność takich substratów powinna dać w wyniku ekspresję znacznika dwukierunkowego plazmidu pIM130, jeżeli gospodarz ma xlnR.

Fragment sekwencji UAS plazmidu pIM130 nie zawiera centrum koniecznego do aktywności inhibicyjnej creA, który jest obecny na rodzimej sekwencji UAS genu xlnA Aspergillus niger. Zatem obecność glukozy, która nadaje CRE A+ A. niger, a następnie hamuje sekwencję UAS xlnA, oraz inny enzym ksylanolityczny kodujący geny, taki jak xlnD i axeA, hamuje także gen xlnR kodujący aktywator sekwencji UAS wyżej wspomnianego enzymu ksylanolitycznego kodującego geny, to jest tłumi ekspresję enzymu ksylanolitycznego, co daje w wyniku negatywną ekspresję plazmidu pIM130.

Przykład 4: Selekcja mutantów

Przykład 4.1 Selekcja mutantów nie poddanych represji

Zarodniki NW205::130#2 zebrano w 5 ml ST (ST: 0,8% NaCl, 0,05% Tween 20), wstrząsano przy wysokiej częstości, a odłamki grzybni usunięto przez filtrację przez sterylny sączek z wełny szklanej. Zarodniki oddzielono przez wirowanie w ciągu 10 minut z prędkością 3000 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki stołowej, a następnie ponownie zawieszono w 5 ml roztworu soli. Ten etap przemywania powtórzono dwukrotnie, a na koniec zarodniki zawieszono ponownie w roztworze soli przy gęstości 1*10⁷na ml. 10 ml zawiesiny zarodników umieszczono w szklanej szalce Petriego i napromieniano

184 463 promieniami nadfioletowymi przy dawce 18 erg/mm²/mio w ciągu 2 minut. Po mutagenezie 10⁵i 10⁶ zarodników umieszczono (10 płytek każdego) na podłożu MM + 10 ml L-argininy + 10 pM nikotynoamidu, zawierającym 3% glukozy oraz na płytkach zawierających 3% D-glukozy/3% ksylanu owsiano-pszenicznego (Sigma #X0627).

Po 4-7 dniach znaleziono na każdej płytce 5-10 kolonii mutantów (10⁶ o^zczepionych zarodników), które na podstawie ich morfologii mogły być podzielone na trzy klasy: duże, dobrze zarodkujące kolonie, średnie, dobrze zarodnikujące kolonie oraz małe, słabo zarodnikujące kolonie. Przeprowadzono wybór losowy 20 z tych mutantów i wybrane mutanty badano oa medium zawierającym różne źródła węgla lub substraty. Ustalono, że kolonie mutantów zdolne są do wzrostu na medium zawierającym D-glukozę/ksylan oraz ksylan, natomiast szczep macierzysty NW205::130#2 mógł rozwijać się tylko na medium zawierającym ksylan jako źródło węgla. Mutanty te badano ponadto na różnych substratach chromogeniczoych: 4-mctyloumbellifcrylz-β-D-ksylzzyd (β-ksylozydazy, endoksylanazy)(Sigma #M7008), octan 4-metyloumbelliferylu (esterazy acetyloksylanowe) (Sigma #M0883), 4-metylzumbelliferylz-α-L-arabinzfuranozyd (arabinofuranozydazy) (Sigma #M9519) oraz na ksylanie modyfikowanym za pomocą błękitu Remazol Brilliant (endoksylanazy) (Sigma #M5019). Pochodne mctyloumbclliferylzwe przy stężeniu końcowym 1 mM dodawano do mediów zawierających D-glukozę, D-glukozę/ksylan oraz ksylan, natomiast ksylan RBB dodawano przy stężeniu 1 mg/ml do mediów zawierających D-glukozę/ksylan i ksylan. Dla wszystkich tych substratów badaną aktywność enzymatyczną stwierdzono u mutantów po rozwoju na medium zawierającym D-glukozę, natomiast nie stwierdzono ekspresji w szczepie macierzystym NM205::pIM130#2. Na mediach zawierających ksylan stwierdzono zwiększoną ekspresję tych enzymów w porównaniu z NM205::pIM130. Z tych badanych mutantów tylko mutant 5 B wykazywał najwyższe poziomy ekspresji. W danym przypadku selekcja miała miejsce na podłożu normalnie aktywnym jako inhibitor ksylanolizy, to jest na glukozie. Aby upewnić się, że ekspresja może mieć miejsce także przy braku represji, włączono także induktor genów ksylanolitycznych, ksylan. Taka próba kontrolna objęta jest również sposobem według wynalazku. Mutant w sposób wyraźny wykazywał derepresję.

Dla porównania wytworzonych poziomów aktywności zarówno N402 z A. niger, jak i mutant 5B hodowano na MM zawierających 1,5% surowego arabinoksylanu pszenicznego jako źródle węgla. Próbki pobrano po 24, 42, 72 i 96 godzinach i mierzono aktywności α-L-arabinofuranozydazy, endo-ksylanazy i β-ksylozydazy. Wyniki (fig. 2 A, B, C) wskazywały oa wzrost aktywności dla mutanta szczepu dla wszystkich trzech enzymów. Najsilniejszy wzrost aktywności odnotowano dla a-L-arabinofuranozydazy i eodo-ksylanazy.

Przykład 4.2: Selekcja mutantów nie dających ekspresji

Zarodniki szczepu NW205::130#2 zebrano i poddano mutacji w sposób opisany w Przykładzie 4.1, a następnie umieszczono na płytkach na MM zawierającym 100 mM D-ksylozy uzupełnionej 10 mM urydyny, 10 mM L-argininy i 0,8 mg/ml kwasu 5-fluoroorotowego (Sigma #F5013). Takie płytki poddawano inkubacji w ciągu 4-7 dni w temperaturze 30°C. 64 z tych rozwijających się kolonii, o fenotypie PYR-, analizowano na ekspresję ksylanazy przez umieszczenie na płytkach na MM zawierającym 1% ksylanu +10 mM urydyny + 10 mM L-argininy +10 pM nikotyooamidu. Z tych 64 badanych mutantów 10 dało zmniejszony obszar rozjaśnienia na płytkach zawierających ksylan i wykazywało silnie zmniejszone poziomy ksylanazy. Fenotyp tych mutantów sprawdzono na mediach zawierających D-glukozę, D-glukozę/ksylan i ksylan w obecności i przy braku urydyny. Wszystkie 10 mutantów nie rozwijało się na mediach bez urydyny⁷.

Dla celów dalszej analizy mutanty te poddano wstępnej hodowli w ciągu 18 godzin w temperaturze 30°C na MM zawierającym 50 mM fruktozy +10 mM urydyny + 10 mM L-argininy +10 pM nikotyooamidu, po czym zebrano grzybnię, 1 g wilgotnej grzybni przeniesiono do MM zawierającego 1% ksylanu oraz do MM zawierającego 10 mM D-ksylozy + 10 mM L-argininy +10 mM nikotynoamidu. Po 5,5 godzinach iOkubacji w temperaturze 30°C zebrano zarówno grzybnię, jak i przesącz kultury. Przesącz kultury poddano dializie

184 463 wobec 1 mM NaP_b pH 5,6, po czym oznaczano ksylanazę (Bailey et al., 1991) oraz aktywności β-ksylozydazy (Tabela 1). Ustalono, że w tych wybranych mutantach poziomy ekspresji zarówno ksylanazy, jak i β-ksylozydazy były silnie zmniejszone.

Aktywność	Eudd-ksylauaza	β-Ksylozydaza	α-L-AΓabiudfuraudzydaza
Szczep	Ksylan (nkat ml·¹)	Ksyloza (nkat ml'¹)	Ksylan (nkat ml·¹)	Ksyloza (nkat ml-¹)	Ksylan (nkat ml-')	Ksyloza (nkat ml¹)
NW205	5*10²	5*10'	0,35	0,40	0,33	0,37
NW205::130	5*10²	1*10²	0,36	0,51	0,40	0,29
NW205::130 2 Ac2-15	5*10²	1*10²	0,26	0,30	0,30	0,23
NW205::130 2 Ac1-4	2	1	0,01	0,01	0,36
NW205::130 2 Ac4-4	2	0,3	0,01	0,01	0,24
NW205::130 2 Ac4-6	2	0,3	0,01	0,01	0,31
NW205::130 2 Ac3-14	1	0,4	0,01	0,01	0,29
NW205:.130 2 Ac4-8	2	0,4	0,01	0,01	0,38
NW205:-130 2 Ac2-10	1	0,1	0,01	0,01	0,19
NW205::130 2 Ac2-8	1	0,3	0,01	0,01	0,29
NW205::130 2 Ac2-5	1	0,2	0,01	0,01	0,28
NW205::130 2 Ac1-15	2	0,2	0,01	0,01	0,23
NW205::130 2 Ac4-14	2	0,2	0,01	0,01	0,28

Przykład 5: Komplementowa mutantów nie dających ekspresji 5.1 Konstrukcja biblioteki geuomicznego plazmidu z A. niger

Do konstrukcji kartoteki plazmidu 10 pg gendmiczuego DNA z NW128 A. niger (cspA1, nicA1, pyrA6, goxC17), wydzielonego w sposób opisany w Przykładzie 3, trawiono częściowo w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C według instrukcji producenta stosując 3,5 jednostki Sau3A (Life Technologies) o objętości końcowej 100 pl. Po oddzieleniu fragmentów drogą elektroforezy na agarozie, fragmenty o wielkości od 6,7 kz do 9,4 kz wycięto z nisSctcpliwego żelu agardzowegd i wydzielono w sposób opisany przez Sambrooka et al. (1989). Z ogółem 6 trawień wydzielono 4 pg fragmentów o stężeniu końcowym 100 ng/ml. 600 ng uzyskanych fragmentów poddano ligacji w 100 ng pUC18 trawionego za pomocą BamHI (Pharmacia #27526201) zgodnie z instrukcją producenta. Po ligacji 4 pl otrzymanej mieszaniny ligacyjnej wykorzystano do transformacji 100 pl komórek DH5a E. coli o największej wydajności (Life Technologies #18258-012) zgodnie z instrukcją producenta. Sześć kolejnych doświadczeń z transformacjami dało w wyniku 5*10⁴ kolonii. Po ponownym zawieszeniu tych kolonii i hodowli w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C w medium TY (medium na 100 ml: 16 g Select Peptone 140 (Life Technologies), 10 g NaCl oraz 10 g wyciągu drożdżowego), zawierającym 100 pg/ml ampicyliny, wydzielono DNA plazmidu i oczyszczono drogą wirowania z CsCl

5.2 Komplementowa mutantów nie dających ekspresji

Dla dokonania komplementowi mutantów nie dających ekspresji dokonano selekcji protoplastów trzech mutantów, NW205:: 130Ac1-4, NW205::130Ac1-15 i NW205::13C^A^c^4^-^4-, tych szczepów i poddano transformacji w sposób opisany w Przykładzie 2. W tych doświadczeniach z transformacją wykorzystano 10⁸ protoplastów i pcłączdnd je z 20 Emug DNA plazmidu A. niger w sposób opisany w Przykładzie 5.1, z 10 pg DNA plazmidu połączonego z 10 pg DNA autonomicznie replikującego się plazmidu pHELP1 (Gems and Clutterbuck, 1993) oraz z 20 pg plazmidu połączonego z 10 pg autonomicznie replikującego się plazmidu pHELP1. Po transformacji mieszaniny umieszczono na płytkach na MM stabilizowanym za pomocą 1,33 M

184 463 sorbitu zawierającego 50 mM D-ksylozy, jako źródła węgla, uzupełnionej 10 pg nikotynamidu i 10 mM L-argininy. Po około 4 dniach na pozytywnych płytkach kontrolnych pojawiły się kolonie, które policzono, a po 6 dniach kolonie można było już pobrać z płytek komplementacyjnych.

Uzyskane kolonie transformantów analizowano przez umieszczenie ich na medium zawierającym 1% ksylan owsiano-pszeniczny, 1 mM 4-metyloumbelliferylo-3-D-ksylozyd, 10 pM nikotynamidu oraz 10 mM L-argininę. Po 6-7 godzinach inkubacji w temperaturze 30°C wykrywano kolonie fluoryzujące xx. Po 2-3 dniach ukazało się rozjaśnienie ksylanu dookoła tych kolonii.

Przykład 6: Klonowanie genu xlnR A. niger

Przykład 6.1: Wydzielanie genu xlnR A. niger

Gen xlnR A. niger wydzielano z transformantów uzyskanych i wyselekcjonowanych sposobem opisanym w Przykładzie 5.2. Z 13 transformantów uzyskanych zNW205::130Ac1-4, NW205::130Ac1-15 i NW205::130Ac4-4 wydzielono cały DNA w sposób opisany przez de Graaffa et al, 1988. Następnie grzybnię hodowano w warunkach selekcji (to jest indukcji) dla pyrA oraz ekspresji ksylanolitycznej na 1,5% surowym arabino-ksylanie pszenicznym jako źródle węgla, z którego wolne replikujące plazmidy wydzielono stosując kolumny Nucleobond AX100 (Macherey & Nagel). 200 pg całego DNA rozpuszczonego w 400 pl sterylnej wody zmieszano z 2 ml buforu S1 (50 ml Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 pg Rnase A), 2 ml S2 (200 mM NaOH, 1%o SDS), z inkubacją w temperaturze pokojowej w ciągu 5 minut, oraz 2 ml S3 (2,60 M Kac, pH 5,2) z inkubacją na lodzie w ciągu 5 minut. Po wyklarowaniu zawiesiny przy prędkowści wirowania 15000 x g w ciągu 30 minut, przeprowadzono adsorpcję, przemywanie, elucję i strącanie plazmidów, wszystko według instrukcji producenta „Postępowanie robocze przy oczyszczaniu plazmidów i kosmidów” (5.3, modyfikowana liza alkaliczna/SDS). 20 pl DNA otrzymanego z plazmidu, rozpuszczonego w 150 pl sterylnej wody, wykorzystano do transformacji DH5a E. coli (Sambrook et al, 1989). 12 kolonii E. coli otrzymanych z każdego z tych preparatów plazmidowych hodowano w ciągu 9-12 godzin w temperaturze 37°C w 250 ml medium LB, zawierającym 50 pl/ml ampicyliny, po czym przeprowadzono wydzielenie DNA plazmidu minipreparatu na 1,5 ml kultury w sposób opisany dla protokołu wrzącej lizy przez Sambrooka et al., 1989. Następnie komórki poddano pastylkowaniu przez wirowanie i przechowywano w temperaturze -20°C. Analiza takich preparatów DNA, po trawieniu za pomocą HinDlll, drogą elektroforezy na agarozie ujawniła trzy klasy plazmidów: plazmidy typu pHELP1, plazmidy typu biblioteki genomicznej oraz plazmidy typu dużych kompleksów. Z kolonii zawierających plazmidy tego ostatniego typu, z zamrożonych pastylek 250 ml kultur, przeprowadzono na dużą skalę izolację plazmidów, korzystając z kolumn Nucleobond AX100 według instrukcji producenta dla modyfikowanej lizy alkalicznej/SDS (Macherey-Nagel). Dało to w wyniku wydzielenie dwóch typów plazmidów, A i B, dopełniających odpowiednio A i B. Obydwa te plazmidy trawiono, stosując SalT, PstT, EcoRI, HindTTT, a po elektroforezie na żelu agarozowym fragmenty analizowano trzykrotnie metodą Southerna korzystając ze znaczonego promieniotwórczo pHELP1, plazmidu A i plazmidu B. Wykazało to, że obydwa plazmidy A i B, poza częścią pHELP, podzielały ten sam obszar genomiczny. W oparciu o różnice pomiędzy sygnałami hybrydyzacji stwierdzonymi za pomocą plazmidu HELP, pokazującymi sekwencje wektora i AMA1, oraz sygnałami plazmidów A i B, zidentyfikowano i subklonowano fragmenty hybrydyzujące z obydwoma plazmidami A i B, lecz nie z plazmidem pHELP1. Ustalono, że fragment EcoRI o długości 4 kz i fragment HinDITT o długości 6,5 kz plazmidu B oraz fragment PstT o długości 3 kz plazmidu A hybrydyzują z obydwoma plazmidami A i B. Po poddaniu ich subklonowaniu w pGEM7/EcoRT, pGEM7/HinDIIT i pBluescript/PstT, uzyskano odpowiednio plazmid pNP1, 2 i 3. Po propagacji i oczyszczeniu plazmidy te zostały wykorzystane w doświadczeniach komplementacyjnych stosując mutant NW205::130Ac4-4 w sposób opisany w Przykładzie 5.2. W doświadczeniach tych mutant poddano bezpośredniej transformacji bez korzystania z pHELP1. W doświadczeniach tych

184 463 plazmid pNP2, zawierający fragment HinDIII o długości 6,5 kz, powodował komplementację mutacji. Dalsze subklonowanie i transformacja plazmidów pochodzących od pNP2 ujawniły fragment BamHI-XbaI o długości 5 kz, subklonowany w pBluescript, i dający w wyniku plazmid pNP8, powodując komplementację szczepu NW205::130Ac4-4.

Przykład 6.2: Subklonowanie genu xlnR A. niger

Do subklonowania genu xlnR, bibliotekę A. niger, skonstruowaną w sposób opisany przez Harmsena et al., 1990, osłonięto przed fagami zawierającymi obszar xlnR wykorzystując fragment EcoRI o długości 4 kz plazmidu pNP1 jako sondę, w wierzchnim żelu agarozowym NZYCM, zawierającym 0,7% agarozę na pięciu 85 mm płytkach NZYCM (1,5% agar) umieszczono 3 x 10³ pfu w sposób opisany przez Maniatisa et al., 1982, korzystając z LE392 E. coli, jako bakterii powlekających. Po inkubacji płytek w ciągu nocy w temperaturze 37°C wykonano dwie repliki każdej płytki na filtrach HybondN* (Amersham) w sposób opisany przez Maniatisa et al., 1982. Po zwilżeniu filtrów w 3 x SSC przemywano je w ciągu 60 minut w temperaturze pokojowej w 3 x SSC. Hybrydyzację, z wykorzystaniem znaczonego promieniotwórcze za pomocą 3²P fragmentu EcoRl o długości 4 kz, przygotowanego w sposób opisany przez Sambrooka et al., 1989, przeprowadzono zgodnie z następującą procedurą (Sambrook et al., 1989): hybrydyzację wstępną prowadzono w 6 x SSC (20 x SSC na 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g cytrynianu sodowego.5,5H2O, pH 7,0), 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodowego, roztworze 5* Denhardta (100x roztwór Denhardta na 500 ml: 10 g Ficoll-400, 10 g poliwinylopirolidonu, 10 g albuminy osocza krwi bydlęcej (Pentax Fraction V) i 20 μμ/ηΜ DNA z denaturowanej spermy śledzia w temperaturze 68°C w ciągu 3-5 godzin, a hybrydyzację właściwą w identycznym buforze zawierającym denaturowaną znaczoną promieniotwórczo sondę w temperaturze 68°C w ciągu 15-18 godzin, a następnie z dwoma przemywaniami w 2 x SSC i 0,1% SDS w temperaturze 68°C i dwoma przemywaniami w 0,2 x SSC i 0,1% SDS w temperaturze 68°C. Membranę osłonięto Saranem i prowadzono autoradiografię w ciągu nocy w temperaturze -70°C korzystając z filmów Konica X-ray Kodaka i kaset X-Omatic Kodaka z regularnie wzmacniającymi się ekranami.

Takie ekranowanie dało w wyniku około 12 pozytywnych fagów, z których 8 oczyszczono. Każdą pozytywną plamkę wydłubano z płytki za pomocą pipety Pasteura, a fagi eluowano z płytki agarowej w 1 ml buforze SM zawierającym 20 μΐ chloroformu w sposób opisany przez Maniatisa et al., 1982. Uzyskane fagi oczyszczono powtarzając opisane wyżej postępowanie i korzystając z replik filtrowych z płytek zawierających 50-100 plamek wydzielonych fagów.

Po oczyszczeniu fagi poddano propagacji przez umieszczenie 5 x 103 fagów na medium NZYCM. Po inkubacji w ciągu nocy w temperaturze 37°C uzyskano płytki konfluentne, z których eluowano fagi przez dodanie 5 ml buforu SM przechowując płytki w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C z przerywanym wstrząsaniem. Po zebraniu klarowj cieczy za pomocą pipety, bakterie usunięto z roztworu przez wirowanie w ciągu 10 minut z prędkością 4000 x g w temperaturze 4°C. Do klarownej cieczy dodano 0,3% chloroform i oznaczono liczbę pfu. Takie roztwory podstawowe fagów (A-R/H-R) zawierały w przybliżeniu 10⁹ pfu/ml.

DNA pięciu wyselekcjonowanych fagów, A-R, B-R, C-R, E-R, F-R, wydzielonych w sposób opisany przez Sambrooka et al., 1989, analizowano metodą Southema. DNA trawiono w ciągu 5 godzin w temperaturze 37°C w mieszaninie reakcyjnej złożonej z następujących roztworów: 5 μΐ (=1 |tg) roztworu DNA, 2 μΐ właściwego buforu 10 x React (Life Technologies), 10 jednostek enzymu restrykcyjnego (Life Technologies) oraz sterylnej, destylowanej wody otrzymując objętość końcową 20 μΐ. Próbki poddawano inkubacji w ciągu 10 minut w temperaturze 65°C, a następnie szybko ochłodzono na lodzie przed umieszczeniem na 0,6% żelu agarozowym w buforze 1*TAE. Fragmenty DNA oddzielono drogą elektroforezy przy napięciu 25 V w ciągu 15-18 godzin.

Po elektroforezie DNA przeniesiono i poddano denaturacji drogą alkalicznego odciskania próżniowego (VacuGene XL, Pharmacia LKB) na nylonową membranę (Hybond N, Amersham) w sposób opisany w instrukcji VacuGene XL (strony 25-26), a następnie poddano

184 463 wstępnej hybrydyzacji i hybrydyzacji właściwej wykorzystując znaczony promieniotwórczo fragment BamHI-XbaI o długości 5 kz plazmidu pNP8 w opisanych warunkach hybrydyzaicji. Wzór hybrydyzacji uzyskano przez napromieniowanie w ciągu 18 godzin błony rentgenowskiej XAR-5 Kodaka w temperaturze -70°C korzystając z regularnego wzmacniającego się ekranu. We wszystkich 5 klonach znaleziono fragmenty pochodzące z tego samego obszaru genomicznego, dla którego skonstruowano wzór restrykcyjny.

Na podstawie mapy restrykcji wybrano do subklonowania fragment BamHI-XbaI o długości 5 kz. 100 ng wektora pBluesript trawionego za pomocą BamHI-XbaI zmieszano z 250 ng DNA BamHł-XbaI o długości 5 kz faga B-R oraz 4 pl bufora ligacji 5* (skład: 500 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM MgC^, 10mM ATP, 10 mM dwutiotreitolu, 25% PEG-6000), po czym do tej mieszaniny dodano 1 pl (1,2 jednostki/pl) ligazy DNA T4 (Life Technologies) uzyskując objętość końcową 20 pl. Po inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 14°C mieszaninę rozcieńczono sterylną wodą do 100 pl. 10 pl rozcieńczonej mieszaniny wykorzystano do transformacji odpowiednich komórek DH5a E. coli, przygotowanych w sposób opisany przez Sambrooka et al, 1989. Sześć z uzyskanych kolonii hodowano w ciągu nocy w medium LB (medium LB dla 1000 ml: 10 g peptonu tryptykazy (BBL), 5 g wyciągu drożdżowego (BBL), 10 g NaCl, 0,5 mM Tris-HCl, pH 7,5) zawierającym 100 pg/ml ampicyliny. Z kultur wydzielono DNA plazmidu drogą wrzącej lizy w sposób opisany przez Maniatisa. et al. (1982), który wykorzystano w analizie restrykcyjnej do wybrania klonu zabezpieczającego pożądany plazmid pIM230. DNA plazmidu wydzielano na dużą skalę z 500 ml kultur DH5a E. coli, zawierających pIM230 wyhodowany w medium LB, zawierającym 100 pg/ml ampicyliny (Maniatis et al., 1982). plazmid oczyszczono drogą wirowania z CsCl, strącono etanolem i rozpuszczono w 400 pl TE. Wydajność wynosiła w przybliżeniu 500 pg. Komórki E. coli zawierające pIM230 złożono w CBS na warunkach Treaty of Budapest w miesiącu czerwcu 1996 roku pod numerem akcesji CBS 678.96.

Przykład 6.3: Subklonowanie cDNA z xlnR A. niger

Dla uzyskania klonu cDNA części obszaru wiązania palca cynkowego genu xlnR, odwróconą reakcję transkryptazy i reakcję syntezy drugiej nici przeprowadzono na 1 pg polyA*RNA z N402 dzikiego szczepu A. niger hodowanego na ksylanie w ciągu 30 godzin z oligonukleotydem startującym w położeniu 1476-1496 (Seq id nr 9), analogicznie do sposobu opisanego w instrukcji zestawu ZAP™-cDNA do syntezy (Stratagene). Podwielokrotną część (1/50) z reakcji syntezy drugiej nici wykorzystano jako matrycę w PCR z primerem RO26 i RO25 (pochodzącym z położeń 946-970 Seq id nr 9) w 35 cyklach 60 sekundowych o kolejnych temperaturach 95°C, 58°C i 72°C, z następującą następnie inkubacją 5-minutową w temperaturze 72°C. Otrzymany fragment o długości 500 par zasad subklonowano w wektorze pGEM-T (Promega) i sekwencjonowano.

Prz yk ład 7: Struktura pierwotna genu xlnR

Przykład 7.1: Analiza sekwencyjna genu xlnR

Sekwencję genu xlnR A. niger, jego obszar promotora/regulacji, część strukturalną genu oraz obszar terminacji oznaczono przez subklonowanie fragmentów zarówno pNP8, jak i pIM230, w połączeniu z wykorzystaniem specyficznych oligonukleotydów jako primerów w reakcjach sekwencjonowania.

Dla celów analizy sekwencyjnej nukleotydów wydzielono fragmenty restrykcyjne, a następnie klonowano je w wektorach pEMBL, pUC, pBluescript, DNA pGEM, trawionych odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Sekwencje nukleotydów oznaczano drogą terminacji łańcuchów dwudezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977) za pomocą automatycznego sekwensera Pharmacia ALF express i zestawu do sekwencjonowania Thermosequenase (Amersham). W przypadku specyficznych oligonuklotydów genu stosowano zestaw Pharmacia Cy5 ze znakowaniem wewnętrznym w połączeniu z zestawem do sekwencjonowania polimerazy T7 DNA (Pharmacia). Reakcję oraz elektroforezę prowadzono zgodnie z instrukcją producenta. Analizę komputerową prowadzono korzystając z programu PC/GENE (Intelligenetics). Oznaczona sekwencja podana jest w SEQ ID Nr: 9.

184 463

Przykład 7.2: Opis genu xlnR

Sekwencja podana w SEQ ID Nr: 9, obejmująca gen strukturalny xlnR, poprzedzona jest długim przeciwprądowym obszarem nukleotydów. W przeciwprądowym niekodującym obszarze znaleziono sekwencje wzbogacone w Ct, lecz nie znaleziono segmentu TAtAa. Część strukturalna genu xlnR sięga od położenia 948 aż do położenia 3690, przerwanych dwoma intronami. Intron w położeniu od 1174 do położenia 1237 oznaczono przez sekwencjonowanie fragmentu genomicznego w pIM230, opisanym w Przykładzie 6.2 oraz część cDNA, jak opisano w Przykładzie 6.3. Drugi intron znajduje się od położenia 3496 do położenia 3549. Sekwencje drugiego intronu następują za zachowanymi sekwencjami intronu, znajdowanymi normalnie w grzybach, dla złączy splotowych i sekwencji linowej.

Gen xnR koduje proteinę o długości 875 aminokwasów. Pochodny polipeptyd zawiera typowy N-terminalny dwujądrowy cynkowy obszar skupiskowy kodowany przez nukleotydy od położenia 1110 do położenia 1260, z typowymi sześcioma cysteinami koordynującymi cynk. W tym obszarze wykazano ponadto pewną liczbę podobieństw z innymi grzybowymi proteinami regulatorowymi, jak przedstawiono na fig. 1 według Kraulisa et al. (1992), włączonymi tu jako referencje.

Typowy motyw RRRLWW znaleziono od położenia 2623 do położenia 2649, przy czym motyw ten, z nieznacznymi zmianami, znaleziono również w pewnej liczbie dwujądrowych cynkowych skupiskowych protein regulatorowych, jak zostało odnotowane przez Suareza et al. (1995).

Przykład 7.3: Analiza sekwencyjna xlnR w mutantach A. niger

Aby określić, czy mutacja, w przypadku mutantów A. niger, które nie dają ekspresji układu ksylanolitycznego, jak opisano w Przykładzie 4.2, jest zlokalizowana w xlnR, oznaczono sekwencję genu xlnR tych mutantów. W tym celu wykonano bibliotekę wzbogaconą dla fragmentów xlnR BamHI o długości 5,5 kz dla każdego z mutantów NW205: : 130Ac. Dla konstrukcji takiej biblioteki wzbogaconej w xlnR, dla każdego szczepu wydzielono fragmenty o długości 5,5 kz genomicznych DNA trawionych za pomocą BamHI, HinDIII, XhoI, Sstl i Kpnl. Takie fragmenty mieszano z wektorem pUC18 trawionym za pomocą BamHI i odfosforylowanym (Ready-To-Go™ pUC18 BamHI/BAP + Ligase, Pharmacia), a następnie poddawano ligacji. Mieszaninę ligacyjną stosowano do transformacji komórek DH5a E. coli (MAX Efficiency DH5a™ Competent Cells, Gibco-BRL) w postać odporną na ampicylinę, zgodnie z protokołem producenta, co dało w wyniku pierwotną bibliotekę 5*10²-103 kolonii. Takie biblioteki wzbogacone w xlnR A. niger, po rozłożeniu biblioteki pierwotnej na płytkach master, osłaniano przez hybrydyzację filtracyjną kolonii zgodnie ze standardowym protokołem (Sambrook et al., 1989), z wykorzystaniem denaturowanego, znaczonego promieniotwórczo insertu BamHI-XbalI plazmidu pIM230 jako sondy.

Dla każdego mutanta szczepu, z płytek master wydłubywano pozytywne kolonie za pomocą wykałaczki i poddawano je hodowli w ciągu 15-18 godzin w temperaturze 37°C w 5 ml medium Lb zawierającym 100 pg/ml ampicyliny, po czym przeprowadzano wydzielanie minipreparatu DNA plazmidu w sposób opisany dla lizy wrzącej przez Sambrooka et al. (1989). Analiza tych preparatów DNA drogą elektroforezy na żelu agarozowym oraz porównanie wzorów wytrawiania ze specyficznymi wzorami xlnR ujawniło kolonie zawierające prawidłowy fragment BamHI xlnR o długości 5,5 kz. Sekwencję mutantów A. niger oznaczono wykorzystując specyficzne oligonukleotydy xlnR jako primery w reakcjach sekwencjonowania, jak opisano w Przykładzie 7.2. Dla mutanta NW205::130Ac1-15 pojedyncze podstawienie parą zasad oznaczono w położeniu 3479, co daje w wyniku zamianę leucyny w położeniu 823 SEQ ID Nr: 9 na serynę. Dla mutanta NW205:::130Ac2-5 podstawienie pojedynczą parą zasad oznaczono w położeniu 3655, co dało zamianę tyrozyny w położeniu 864 SEQ ID Nr: 9 na kwas aspartowy. Te mutacje ide^^t^yfTkr^u^. obydwa mutanty jako mutanty xlnR.

184 463

Przykład 8: Ekspresja xlnRw A. niger

Przykład 8.1: Komplementacja mutantów A. niger nie dających ekspresji w układzie Ssylandlityczuym

Dla komplementami we wszystkich mutantach nie dających ekpresji, wszystkie 10 mutantów NW205::130Ac, jak opisano w Przykładzie 4, poddano transformacji, jak opisano w Przykładzie 2 niniejszego opisu, przez pcłączeuie protoplastów i pGW635, jako kontroli częstości transformacji, oraz DNA pIM230 dla zbadania zdolności Somplnmentacyjuej pIM230.

Otrzymane kolonie transformantów analizowano na aktywność ksylanolityczną i porównywano z ich macierzystym mutantem szczepu przez rozłożenie ich na odpowiednim medium zawierającym 1% ksylanu dwsiauo-pszeuiczuegd, jako źródła węgla. Po 2-3 dniach pojawiło się rozjaśnienie ksylanu dookoła kolonii transformantów, lecz nie macierzystego szczepu mutanta, dla wszystkich dziesięciu mutantów, wskazując zatem na przywrócenie aktywności ksylanolitycznej.

Przykład 9: Wpływ dawkowania genu xlnR na ekpresję układu ksylandlitycznego A. niger

Do zbadania potencjalnego zastosowania genu xlnR do poprawiania szczepu dla zwiększonej ekpresji ksylanclitycznej, szczep N902::200-18, zapewniający wielokrotne kopie (około 6) genu xlnRz4. niger, kodującego β-ksylozydazę, poddano transformacji do prototrdfii argininy w doświadczeniu współtransformacyjnym, jak opisano w Przykładzie 2 niniejszego opisu, stosując 19 pg plazmidu pIM230 zabezpieczającego xlnR oraz 2 pg plazmidu pIM650 zabezpieczającego gen argB A. nidulans (Johnslone et al., 1985). Uzyskane transformanty osłaniano na zwiększoną ekspresję endoksylanazy na płytkach z MM zawierającym 1% ksylan cwsianc-pszeuihzny. Cztery kolonie z najszybszym i największym tworzeniem się halo, wybrano do oznaczenia liczby kopii xlnR. W tym celu wydzielono DNA tych trausfdrmautów oraz odbierającego szczepu i odciśnięto szereg rozcieńczeń na membranie Hybond N. Liczbę kopii oceniono na podstawie sygnałów ustalonych po hybrydyzacji, korzystając ze znaczonego promieniotwórczo fragmentu SmaI/XbaI o długości 4,5 kz, obejmującego sekwencję kodującą genu xlnR. W oparciu o porównanie ze szczepem odbierającym liczbę kopii xlnR określono na 8 w N902::200-18-R14 i 32 w N902::200-18-R16. Dla obydwu tych transformantów wpływ zwiększonego dawkowania genu xlnR analizowano metodą odcisku Northern po hodowli szczepów w kulturze ciekłej. Prowadzono to w doświadczeniu z przeniesieniem do 2% ksylanu owsiano-pszenicznego jako źródła węgla, po wstępnej hodowli w 1%o fruktozie w ciągu 18 godzin. Próbki grzybni pobierano po 8 i 24 godzinach po przeniesieniu, z których wydzielano cały DNA korzystając z TriZolu (Life Technologies) według instrukcji producenta oraz analizowano metodą odcisku Northern (Sambrook et al., 1989). Poziomy ekspresji ksylanazy B były znacznie podwyższone w tych transformantach w porównaniu ze szczepem odbierającym, jak wykryto po hybrydyzacji stosując znakowany promieniotwórczo fragment EcoRUXhoI o długości 1 kz z xlnB A. niger (Kindshita et al., 1995).

Do dalszego badania potencjalnego zastosowania genu xlnR do poprawiania szczepu w kierunku podwyższenia ekspresji nndc-Ssylanazy, A. niger poddano transformacji w sposób opisany w Przykładzie 2 niniejszego dokumentu według następującego schematu: 1. pGW635 (pyrA) (kontrola pozytywna), 2. pDB-K(XA), 3. pDB-K(XA) + pIM230 oraz 4. pGW635 + pIM230. plazmid pDB-K(XA) zawiera zarówno gen pyrA A. niger, jak i gen ksylanazy A A. niger z A. tubigensis w wektorze pEMBL18. Transformatoy uzyskano dla wszystkich stosowanych warunków, przy czym szczepy dające nadekspresję endo-ksylanaz wybrano na podstawie wielkości halo na osłonie płytki na ksylanie owsiano-pszenicznym (badano 20 transformantów z każdej grupy).

Z każdej grupy wybrano jeden transformato i hodowano go dla prób aktywności. Szczepy hodowano wstępnie w ciągu 18 godzin na medium zawierającym fruktozę, po czym grzybnię (2,5 g mokrej wagi w 50 ml) przeuoszonc do medium zawierającego 1,4% surowego arabino-ksylanu. Wszystkie hodowle prowadzono we wstrząsanych kolbach. Inkubacje

184 463 prowadzono w ciągu 40 godzin w temperaturze 30°C, poziomy ksylanazy A oznaczano drogą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), natomiast aktywności β-ksylozydazy i endo-ksylanazy oznaczano dla obydwu. Chromatografię prowadzono na standardowym wyposażeniu HPLC firmy Pharmacia-LKB (Uppsala, Szwecja) z SOURCE 15 Q, w kolumnie HR 5/5-uzlumn przy prędkości 1,5 ml/min. Bufor A = 20 mM buforu Tris, pH 7,5, bufor B = 20 mM buforu Tris, pH 7,5, z 1M NaCl. Gradient od 0 do 50% buforu B w ciągu 30 minut. Detekcja przy długości fali 280 om, przyrząd UV-VII firmy Pharmacia-LKB, zakres absorbancji 0,1-0,2, patrz fig. 3. 100 pl medium kultury rozcieńczono za pomocą 1000 pl 20 mM buforu Tris, pH 7,5 i 1000 pl takiej rozcieńczonej próbki wykorzystano w kolumnie. Aktywność ksylanazy A jest wtedy widoczna w postaci piku eluującegz w przybliżeniu przy 30% buforze B. Z każdej grupy transformantów oa fig. 3 przedstawiono jeden wykazujący najwyższą aktywność/pik ksylanazy A w analizie HPLC.

Aktywność endo-ksylanazy oznaczono drogą pomiaru wydzielania się barwnych fragmentów zabarwionego azuryoą, sieciowanego arabinoksylanu pszenicznego (tabletki Xylazyme) z firmy Megazyme, Warriewood, Australia. Aktywność ksylanazy obliczono przez porównanie z wewnętrznym enzymem standardowym o stężeniu 100 XU/gram (jednostka ksylanazy) w temperaturze 40°C w 0,1 M buforze octanowym, pH 3,4. Te same cztery transformaoty badano oa arabinoksylaoie nierozpuszczalnym w wodzie przy takim pH, przy którym tylko ksylanaza A daje wkład do aktywności endoksylanazy. Wyniki tej analizy podano w tabeli 2.

Tabela 2

Transformant	XU/gram
pyr+ (kontrola)	4
DB-K(XA)-15	52
DB-K(XA)/pIM230-21	111
pIM230-26	24

Z wyników przedstawionych na fig. 3 i w tabeli 2 widoczne jest, że tak jak się spodziewano, transformacja za pomocą ksylanazy A kodującej gen daje znaczny wzrost aktywności enzymatycznej ksylanazy A. Niespodziewanie stwierdzono także znaczny wzrost poziomu ksylanazy po transformacji z użyciem genu xloR aktywatora. Wskazuje to na ograniczenie poziomu aktywatora XYL R (= produkt genu xlnR) w szczepie macierzystym nie poddanym transformacji. Zatem należy spodziewać się, że w wielzkopizwym transformancie pDB-K(XA) ilość transakcyjnego czynnika regulatorowego będzie czynnikiem nawet jeszcze bardziej ograniczającym. Potwierdzone jest to wynikiem dla transformanta pDB-K(XA)/pIM230, który ma poziom ksylanazy A dwa razy wyższy niż wielokopiowy transformant pDB-K(XA).

Przykład 10: Odsiewanie grzybów filamentowych dla genu xloR

Aby przenalizować, czy możliwe jest wydzielenie przeciwstawnej części xlnR z innych grzybów drogą hybrydyzacji heterolzgicznej wykorzystując fragment SmaI/Xba o długości 4,5 kz genu xlnR jako sondy, DNA wydzielono z następujących szczepów: N902 A. niger (argBI5, cspAl, ^nAl, metB 10, pyrA5, NW184 A. tubingensis (cspAl. fan Al. pyrA22), WG096 A. nidulans (pabaAl, yA1) z FGSC, NW240 A. aculeatus (pyrA3) z CBS 101.43, NW217 A. aculeatus (fwn A1, cspAl, pyrAl, lys Al) z CBS 115.80, NW183 A. foetidus (awamori) (cspAl, fwnAl, pyrAl3, ZysA1) z CBS 115.52, A. japonicus CBS114.51 oraz RM9414 Trichoderma reesei. 1-2 pg DNA trawiono za pomocą BamHI lub XhoI, a następnie analizowano metodą Southeroa w sposób opisany w Przykładzie 3. Warunki hybrydyzacji były następujące: hybrydyzacja w 6 x SSC (20 x SSC na 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g cytrynianu sodowego. 5,5h₂O, pH 7,0), 0,05% pirofosforanu sodowego, roztwór Denhardta 5* (100 x roztwór Denhardta na 500 ml: 10 g Ficoll-400, 10 g poliwinylopirolidonu, 10 g albuminy

184 463 osoczu krwi bydlęcej (Pentux Fruction V) oraz 20 jig/ml DNA z denaturowanej spermy śledzia w temperaturze 56°C w ciągu 18-24 godzin, a następnie przemywania dwu ruzy po 30 minut w 5 x SSC i 0,1% SDS w temperaturze 68°C oraz dwu przemywaniu po 30 minut w 2 x SSC i. 0,1% SSC w temperaturze 56°C. Po hybrydyzacji membranę owinięto Sarunem i poddano uoturadiografii w ciągu nocy w temperaturze -70°C korzystając błony rentgenowskiej Kodaka i kasety X-Omatic Kodaka z regularnymi wzmacniającymi ekranami.

W wyniku znaleziono fragmenty hybrydyzacyjne dla wszystkich analizowanych grzybów, przy czym bardzo silne sygnały znaleziono w A. niger, A. tubigensis i A foetidus, natomiast w innych badanych szczepach znaleziono czyste sygnały hybrydyzacyjne.

Przykład 11: Zastosowanie systemu selekcji z wykorzystaniem innych fragmentów promotora

Skonstruowano plazmidy zawierające fragmenty promotora z genu abfA A. niger (Flipphi et al., 1994) i genu abfB A. niger (Flipphi et al, 1993). Dla konstrukcji zuwierującej fragment promotora abfA, fragment Xhol/Pstl o długości 1,4 kz z pIM900 (Flipphi et al., 1994) poddano ligacji w pAlter trawionym zu pomocą SaBJPstl (Promega) w sposób opisany w Przykładzie 1. Stosując układ mutagenezy Altered Sites in vitro (Promega), utworzono centrum restrykcyjne Xhol w położeniach -83 do -88 względem centrum inicjucji translacji (Flipphi et al., 1994). Z otrzymanego plazmidu wydzielono fragment Sstl/Xhol z 953 parami zasad. Ten fragment oraz fragment z pIM130 poddano ligacji do pBluescript (Statagene) trawionego zu pomocą Sstl/Khol. plazmidy mające prawidłową orientację fragmentu Xhol o długości 1,5 kz zidentyfikowano przez trawienie za pomocą Bglll. Otrzymany plazmid był plazmidem pAP8.

Analogicznie fragment Pstl z 910 parami zasad z promotora abfB wydzielono z pIM991 (Flipphi et al., 1993), i poddano ligacji w pEMBL19 trawionym za pomocą Pstl. Otrzymany plazmid trawiono stosując Sall i poddano ligacji z fragmentem Xhol o długości 1,5 kz z plazmidu pIM130. plazmidy zawierające obydwa fragmenty o pruwidłowej orientacji zidentyfikowano przez truwienie zu pomocą BamHl. Otrzymany plazmid był plazmidem pIM132.

Trzeci plazmid zawierający fragment z pgaII A. niger skonstruowano przez klonowanie fragmentu XbaI/XhuI z 1450 parumi zasad do wektora pAlter. Korzystając z układu mutagenezy Altered Sites II in vitro (Promega), utworzono centrum restrykcyjne Xhol w położeniach -107 do -112 w odniesieniu do centrum inecjacyjnegu translacji (Bussink et al, 1991). Z otrzymanego plazmidu wydzielono fragment Xbal/Xhol o długości 1,2 kz. Ten fragment oraz fragment Xhol o długości 1,5 kz z pIM130 poddano ligacji do pBluescript (Stratagene) trawionego zu pomocą Xbal/Xhol.

Plazmidy mające prawidłową orientację fragmentu Xhol o długości 1,5 kz identyfikowano przez trawienie za pomocą HinDIII. Otrzymany plazmid był plazmidem pIIP7. Z tego samego genu pgall wydzielono fragment HinDlll/Pstl z 223 parami zasad i poddano go ligacji w pEMBL19 trawionym zu pomocą HinDlll/Pstl. Otrzymany plazmid trawiono stosując SalI i poddano ligacji z fragmentem Xhol o długości 1,5 kz z plazmidu pIM130. plazmidy zawierające obydwa fragmenty w pruwidłowej orientacji identyfikowano przez truwienie stosując HinDlll. Otrzymany plazmid był plazmidem pHPII.

Wszystkie cztery fragmenty wprowadzono do NW219 A. niger drogą transformacji opisanej w Przykładzie 2 stosując 10 mM L-arabitol jako induktor w doświadczeniuch transformacji z zastosowaniem konstrukcji zawierających fragmenty promotora abf (plazmidy AP8 i pIM132) i 1% kwas poligαlαktorunowy (USB Chemicals) w przypadku plazmidów zabezpieczających fragmenty pgall. Podczas gdy dla plazmidów AP8 i pIM132 transformanty znaleziono przy wysokiej częstości, to w doświadczeniu z transformacją z zastosowaniem fragmentu promotora pgall, zawierającego plazmidy pIIP7 i pHPII, znaleziono odpowiednio tylko 5 i 7 transformantów.

Transformanty uzyskane z doświadczenia transformacyjnego z zastosowaniem plazmidów pAP8 i pIM132 (fragmenty promotora abf analizowano pod względem fenotypu w sposób opisany w Przykładzie 3 stosując medium zawierające 10 mM L-arabitolu/50 mM

184 463 sorbitu, 10 mM L-arabitolu/50 mM D-glukozy oraz 50 mM D-glukozy. Spodziewany fenotyp: rozwój na 10 mM L-arabitolu/50 mM sorbitu, brak rozwoju na 10 mM L-arabitol/50 mM D-glukoz i 50 mM D-glukozie, znaleziono dla 10 z 29 transformantów otrzymanych z plazmidu pAP8 oraz 13 z 30 transformantów otrzymanych z plazmidu pIM132. Transformanty otrzymane z plazmidu pIIP7 i pHPII badano na medium zawierającym 1% kwas poligalakturonowy, 1% kwas poligalakturonowy/50 mM D-glukoza oraz 50 mM D-glukozy. Jednakże obydwie klasy transformantów nie wykazywały spodziewanego fenotypu i wszystkie były zdolne do rozwoju na wszystkich trzech mediach. Sugeruje to, że te transformanty pochodziły z podwójnego krzyżowania na lokusie pyrA..

W oparciu o wyniki dla fragmentu promotora pgaII, zawierającego plazmidy, zbadano czy można poprawić częstość transformacji przez poprawienie indukcji. Przypuszczano, że transformacja zawodzi w mniejszym lub większym stopniu z powodu braku induktora, ponieważ nie był dostępny żaden monomeryczny induktor poligalaturonaz, a zatem polimer musi ulec degradacji dla wydzielenia induktora i uzyskania ekspresji. Przebadano, czy uzupełnienie medium małą ilością urydyny może rozwiązać ten problem. W tym celu przebadano NW219 i transformant NW219:-:pIM132230 na medium zawierającym 1% ksylan owsiano-pszeniczny, wywołując indukcję abfB, w połączeniu ze wzrastającą ilością urydyny, odpowiednio 0, 0,001, 0,005, 0,1, 1,5 i 10 mM. W tym doświadczeniu przyjmujący szczep NW219 nie rozwijał się na mediach zawierających mniej niż 0,01 mM urydyny, natomiast szczep transformanta NW219::pIM132#30 rozwijał się we wszystkich zastosowanych warunkach. Jednakże stopień zarodnikowania i morfologia kolonii zmieniały się, przy czym najmniejsze stężenie urydyny dające zarodnikowanie dzikiego typu wynosiło około 0,01 mM urydyny.

W oparciu o te wyniki transformację NW219 A. niger z zastosowaniem plazmidów pIIP7 i pHPII powtórzono stosując MMS w sposób opisany w Przykładzie 2, zawierający 1% pektynę cytryny (stopień estryfikacji 45%) (Copenhagen Pectin factory), oraz dwa warunki uzupełnienia urydyny, odpowiednio 0,01 mM i 0,005 mM. Dało to w wyniku zwiększoną liczbę znalezionych transformantów, które przetestowano na mediach zawierających 1% pektynę cytryny, jak opisano wyżej, 1% pektynę cytryny/50 mM D-glukozę oraz 50 mM D-glukozę, dla których spodziewany fenotyp odpowiadał odpowiednio wzrostowi, brakowi wzrostu i brakowi wzrostu. Spodziewany fenotyp znaleziono dla 10 z 30 uzyskanych transformantów pIIP7 oraz dla 9 z 30 transformantów pHPII.

Wybór transformantów o spodziewanym fenotypie analizowano metodą Southerna. DNA wydzielano i analizowano w sposób opisany w Przykładzie 3. Dla transformantów pochodzących z fragmentu promotora abfA, zawierającego plazmid pAP8, DNA trawiono stosując ClaI, dla transformantów pochodzących z pIM132 (abfB) stosując ClaI a dla transformantów pochodzących z pgaII, plazmidów pIIP7 i pHPII stosując ClaI. w oparciu o autoradiografię uzyskaną po hybrydyzacji z zastosowaniem następujących znaczonych promieniotwórczo fragmentów: fragment Xbai o długości 3,8 kz oraz fragment ClaI o długości 1,2 kz genu pyrA, transformanty wyselekcjonowano na podstawie szacunkowej liczby kopii. Wyselekcjonowano następujące transformanty: AP8/16 (abfA) , WV219::322#8 22 kopie) oraz NW219::NW132#30 (3-4 kopie) (abfB), NW219::pIIP723 (2 kopie) i NW219::pHPIIP29 (2 kopie) (pgaII).

Wyselekcjonowane transformanty poddano mutagenezie w sposób opisany w Przykładzie 4. Mutanty poddane derepresji przez arabinofurankaydaaę selekcjonowano na medium + 50 mM D-glukozy oraz na medium + 10 mM L-arabitolu/50 mM D-glukozy, natomiast mutanty poddane derepresji przez poligalakturonazę selekcjonowano na medium + 50 mM D-glukozy i na medium + 1% pektyna cytryny/50 mM D-glukoza. Po 4-7 dniach ustalono 5-10 kolonii mutantów na każdej płytce, które na podstawie ich morfologii podzielono na trzy klasy: duże, dobrze, zarodnikujące kolonie, kolonie o średniej wielkości, dobrze zarodnikujące, oraz kolonie małe, słabo zarodnikujące. Przeprowadzono selekcję losową 20 z tych mutantów, a wybrane mutanty przebadano na mediach zawierających różne źródła węgla lub substraty. Ustalono, że kolonie mutantów arabinofuranoaydazowych były zdolne

184 463 do rozwoju na mediach zawierających D-glukozę, D-glukozę/L-arabitol oraz 1-arabitol, podczas gdy szczepy macierzyste zdolne były do rozwoju tylko na medium zawierającym L-arabitol jako źródło węgla. Analogicznie mutanty poligalakturonazowe także były zdolne do rozwoju na medium + 50 mM D-glukozy, na medium + 1% pektyna cytryny/50 mM D-glukoza oraz na medium +1% pektyna cytryny. Szczepy macierzyste mogły rozwijać się tylko na medium + 1% pektyna cytryny. Mutanty arabinofuranozydazowe (20 każdego) badano ponadto na chromogenicznym podłożu metyloumbelliferylo-^-L-arabinofhranozydu w sposób opisany w Przykładzie 4. Podczas gdy szczepy macierzyste nie wykazywały żadnej arabinofuranozydowej ekspresji mediów zawierających D-glukozę/L-arabitol, jak wykryto drogąfiuorescencji substratu, to mutanty wykazywały zmienne poziomy ekpresji, przy czym najwyższe poziomy stwierdzono w mutantach wyselekcjonowanych na medium D-glukozowym.

Mutanty poligalakturonazowe badano na medium + 1% pektyna cytryny/50 mM glukoza, a dwa i trzy dni po zaszczepieniu płytek aktywność poligalakturonazową poddano wizualizacji przez barwienie w sposób opisany przez Rieda i Collmera (1985). w tym przypadku, dla szczepu macierzystego, znaleziono małe halo, podczas gdy w mutantach wykryto tworzenie się zwiększonego halo o różnych stopniach.

Zgodnie z Przykładem 4 na medium zawierającym FOA wyselekcjonowano także mutanty nie dające ekpresji. Dla tych szczepów poddano mutacji NW219::132#30(abfB) i rozłożono na medium + 10 mM L-arabitol + 1 mg/ml FOA + 10 mM urydyna. Po 7-10 dniach wyselekcjnowano mutanty i rozłożono na medium zawierającym 10 mM L-arabitol/50 mM sorbit, 10 mM urydyna, z wierzchnim agarem zawierającym 0,5% arabinianu AZCL (Megazyme, Sydney, Australia) do wykrywania ekpresji endo-arabinianu. Dwa z 30 badanych transformantów, 132/30 F12 i F26, nie były zdolne do wydzielania barwnika z podłoża, co jest wskaźnikiem braku aktywności endo-arabinianu. Po hodowli tych transformantów w ciekłym medium zawierającym 10 mM L-arabitol i 10 mM urydynę, a następnie pomiarze aktywności arabinofuranozydazowej w przesączach kultur·, ustalono przynajmniej 4-krotny spadek aktywności.

Szczep NW219::pIIP7#3 poddano mutacji i rozłożono na medium zawierającym 1% pektynę cytryny/50 mM sorbit, 10 mM urydynę i 1 mg/ml FOA. Po inkubacji płytek w ciągu 6-10 dni mutanty wydłubano i osłonięte na aktywność poligalakturonazową w sposób opisany wyżej. Ustalono, że trzy mutanty wyselekcjonowane z 65 mutantów mają obniżone tworzenie się halo po barwieniu na aktywność poligalakturonazową, co wskazuje na spadek ekspresji poligalaturonazy.

Przykłady 7, 8 i 11 z europejskiego opisu patentowego nr EP 95201707,7, które jest biegnącym europejskim zgłoszeniem patentowym, którego kopia została włączona po wypełnieniu przedmiotowego dokumentu i którego przykłady zostały także skopiowane do niniejszego dokumentu.

Przykład 7 z europejskiego opisu patentowego nr 95201707.7: Transformacja A. niger z wykorzystaniem plazmidu pIM200.

250 ml medium kultury, składającego się z medium uzupełnionego 2% glukozy, 0,5% wyciągu drożdżowego, 0,2% kwasów Casamino (bez witamin), 2 mM leucyny, 10 pM nikotynoamidu, 10 mM urydyny, zaszczepiono za pomocą 1*10⁶ zarodników na ml szczepu NW155 (cspA1, argB13, pyrA6, nicA1, leuA1, prtF28) (pochodzące z NW228, Van den Hombergh et al., 1995), po czym grzybnię hodowano w ciągu 16-18 godzin w temperaturze 30°C w orbitalnej wstrząsarce New Brunswick przy prędkości 250 obrotów na minutę. Następnie grzybnię zebrano na Myracloth (gaza nylonowa) za pomocą lejka Buchnera z łagodnym ssaniem i przemyto kilka razy za pomocą SP6 (SP6: 0,8% NaCl, 10 mM buforu fosforanu sodowego, pH 6,0). 150 mg Novozyme 234 rozpuszczono w 20 ml SMC (SMC: 1,33 M sorbit, 50 mM CaCl2, 20 mM buforu MES, pH 5,8), do którego dodano 1 g (ciężar wilgotny) grzybni i który ostrożnie ponownie zawieszono. Taką zawiesinę poddawano inkubacji z delikatnym wstrząsaniem w ciągu 1-2 godzin w temperaturze 30°C, przy czym co każde 30 minut grzybnię ponownie ostrożnie zawieszano i pobierano próbkę do kontrolowania tworzenia się proto56

184 463 plastów, korzystając z hemocytometru do liczenia protoplastów. Gdy jest już obecna odpowiednia ilość protoplastów (więcej niż 1*10⁸), to zawiesza się je ponownie ostrożnie, a odłamki grzybni usuwa drogą filtracji przez sterylny sączek z wełny szklanej. Protoplasty oddzielono drogą wirowania w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C przy prędkości 3000 obrotów na minutę w wirówce stołowej, po czym usunięto klarowną ciecz, a pastylki ostrożnie ponownie zawieszono w 5 ml STC (STC: 1,33 M sorbit, 50 mM CaCl₂, 10 mM Tris/HCI, pH 7,5). Taki etap przemywania powtórzono dwukrotnie, po czym protoplasty na koniec ponownie zawieszono w STC przy gęstości 1*10⁸ na ml.

Transformacje przeprowadzono przez dodanie 20 pg DNApIM200 i 5 pg pGW635, zawierające gen pyrA A. niger (rozpuszczony w 10-20 pl TE), Do 200 pl zawiesiny protoplastów razem z 50 pl buforu PEG (bufor PEG: 25% PEG-6000, 50 mM CaCl₂, 10 mM Tris/HCl, pH 7,2), ostrożne mieszanie przez pipetowanie kilka razy do góry i Do dołu, a następnie poDDanie inkubacji w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie dodano 2 ml buforu PEG, roztwór ostrożnie mieszano i poddano inkubacji w temperaturze pokojowej w ciągu następnych 5 minut, po czym Dodano 4 ml STC i mieszano mieszaDełkiem wirowym. Jednomililitrowe porcje tej zawiesiny Dodano następnie Do 4 ml agaru wierzchniego stabilizowanego osmotycznie za pomocą 0,95 M sacharozy i wylano na osmotycznie stabilizowane płytki. Dla kontroli A. niger poddano także transformacji za pomocą pGW635.

Przykład 8 europejskiego opisu patentowego nr 95201707.7:

Analiza transformantów

Transformanty z plM200 uzyskane w Przykładzie 7 analizowano pod względem fenotypu przez rozłożenie na medium zawierającym 1% ksylan owsiano-pszeniczny i 1 mM 4-metyloumbelliferylo-P-D-ksylozydu. Z 26 badanych transformantów pięć wykazywało zwiększoną fluorescencję. Transformanty te wraz z transformantem PYR*, jako odnośnikiem, hodowano na medium zawierającym 1% ksylan owsiano-pszeniczny w ciągu 20, 27 i 42 godzin, po czym mierzono aktywność β-ksylozydazy w kierunku PNP-X. Wyniki zebrano w tabeli C.

Zwiększony poziom aktywności β-ksylozydazy stwierdzono we wszystkich pięciu wyselekcjonowanych transformantach, przy czym najwyższy poziom był większy ponad 30 razy niż aktywność z dzikiego typu. Wyniki te potwierdzono analizą odciskową Western, stosując przeciwciało anty-Eksylozydazy, przygotowane w sposób opisany w Przykładzie 3 europejskiego opisu patentowego nr EP 95201707.07, oraz za pomocą zestawu analitycznego Bio-Rad immun-blot GAR-AP, postępując według instrukcji dostawców

Tabela C

Aktywności β-ksylozydazy w transformantach A. niger aktywność (mU/ml przesączu kultur) po:

	20 godzinach	27 godzinach	42 godzinach
pGW 635	15	16	17
XlsA1	82	86	51
XlsA4	90	112	78
XlsA8	211	239	384
XlsA9	63	110	74
XIsA12	96	295	527

Przykład 11 europejskiego opisu patentowego nr EP 95201707.7:

Rozerwanie genu xlnD A. niger

Przykład 11.1: Konstrukcja rozciętych plazmidów plM203 i plM204

Rozcięte plazmidy genów plM203 i plM204 sktinstrukowano przez utworzenie fragmentu wewnętrznego genu xlnD drogą PCR. Fragment wytworzono wykorzystując oligonukleotydy

184 463 pochodzące z sekwencji xlnD (SEQ ID Nr: 8) . Xylos001 pochodził z położeń 1157 do 1176, natomiast xylos004 pochodził z położeń 3147 do 3164. Fragment generowano za pomocą PCR z 10 μΐ buforu reakcyjnego 10* (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl2, 0,01% żelatyny), 16 μΐ 1,25 mM każdego z czterech trójfosforanów dezoksynukleotydów, 1 ng DNA plazmidu pIM200 oraz 1 μ każdego z nukleotydów, o objętości końcowej 100 μΐ.

Taką mieszaninę reakcyjną mieszano, a następnie dodano do niej 1 μΐ polimerazy TAQ (5 jednostek/μΙ) (Life Technologies). DNA poddano denaturacji przez inkubację w ciągu 3 minut w temperaturze 92°C, z kolejnymi 25 cyklami, 1 minuta w temperaturze 92°C, 1,5 minuty w temperaturze 52°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C. Po takich 25 cyklach mieszaninę poddano inkubacji w ciągu 5 minut w temperaturze 72°C. Analiza produktów reakcji drogą elektroforezy na agarozie wykazała fragment z około 2000 parami zasad, co odpowiadało spodziewanej wielkości na podstawie sekwencji genu. Otrzymany fragment poddano subklonowaniu w wektorze pGEM-T (Promega) uzyskując w wyniku plazmid pIM202. plazmid pIM203 skonstruowano przez ligację fragmentu SmaI/PstI z pILJ16 (Johnstone et al., 1985), zawierającego gen argB A. nidulans (Upshall et al., 1986), w wektorze pIM202 trawionym za pomocą EcoRV/PstI. Plazmid pIM204 skonstruowano przez ligację fragmentu NsiHXbal z pIM130 (niniejszy dokument, EP 95202346.3), zawierającego gen pyrA pod kontrolą sekwencji UAS promotora xlnA A. tubigensis, w wektorze pIM202 trawionym za pomocą Spel/Nsil.

Przykład 11.2: Przerwanie genua/nD w A. niger

Plazmidy zawierające wewnętrzny fragment xlnD, jak również gen argB (pIM203) lub gen pyrA (pIM204), jak opisano w Przykładzie 11.1 zgłoszenia europejskiego, wykorzystano do rozerwania genu xlnD A. niger. w tym celu N902 A. niger (argB15, cspA1, fwnA\, metBIO, pyrA5) poddano transformacji, jak opisano w Przykładzie 2 tego dokumentu, korzystając z plazmidów pIM203 i pIM204, dających odpowiednio selekcję względem prototrofii argininowej i urydynowej. Otrzymane transformanty odsiewano na aktywność na metyloumbelliferylo-e-D-ksylozydzie na płytce 1% ksylanu, jak opisano w Przykładzie 8 współbiegnącego zgłoszenia europejskiego. W obydwu grupach osłaniano 20 transformantów. Z tych transformantów, jeden z każdej grupy miał bardzo silnie obniżony poziom aktywności MUX po 24 godzinach wzrostu. Analiza metodą Southerna wybranych transformantów, jak opisano w Przykładzie 3 biegnącego złoszenia, wykazała dla transformanta pIM203 wielokopiową integrację na lokusie homologicznym xlnD. w przypadku transformanta pIM204 pojawiła się pojedyncza homologiczna integracja na lokusie xlnD.

Analiza tych transformantów na aktywność PNP-X, jak opisano w Przykładzie 8 współbiegnącego zgłoszenia, wykazała co najmniej 100-krotny spadek aktywności β-ksylozydazy.

Przykład 11.3: Wpływ nadekspresji i inaktywacji genu xlnD na ekspresję układu ksylanolitycznego A. niger

Dla określenia wpływu ekspresji xlnD na ekspresję widma ksylanolitycznego N902 A. niger, dwa wielokopiowe transformanty xlnD w N902 oraz szczepy z rozerwanym, genem xlnD hodowano w ciekłej kulturze. Przeprowadzono to w doświadczeniu z przeniesieniem do 2% ksylanu owsiano-pszenicznego lub 3% D-ksylozy jako źródła węgla, po wstępnej kulturze w 1% fruktozie w ciągu 18 godzin. Aktywność beta-ksylozydazy oznaczono jako aktywność PNP-X w przesączu kultury. Za pomocą obydwu źródeł węgla powinna być widoczna wyraźna nadekspresja dla transformantów·', w przeciwieństwie do prawie braku aktywności PNP-X dla obydwu transformantów z inaktywacji (pIM203 i pIM204). Transformanty z rozerwanym genem xlnD wykazywały początkowo obniżony poziom ekspresji endo-ksylan^azy^, który jednakże wzrastał ostatecznie w czasie po 16 godzinach dając w wyniku zwiększone poziomy aktywności w porównaniu z A. niger typu dzikiego, a zatem dając w wyniku preparaty ksylanazowe wolne od β-ksylozydazy.

184 463

Przesącze kultur analizowano następnie drogą analizy HPLC, korzystając z układu DioneK i Pulsed Amperometric Detection. w tym celu 1 ml przesączu kultury gotowano bezpośrednio po zebraniu w celu inaktywacji enzymów ksylanolitycnych, po czym wirowano próbkę w ciągu 10 minut (14000 obrotów na minutę, wirówka Eopenddrfa). Otrzymaną klarowną ciecz rozcieńczono 5-krdtnie w bidest i analizowano 20 μΐ za pomocą HPLC korzystając z kolumny Dionex CarboPac 100. Analiza wykazała, że podczas gdy w typie dzikim oraz w transformantach nadekpresji oligomery ksylozy mogły być wykryte w przesączu kultury tylko w początkowym etapie, to w mutancie z rozerwaniem ksylobidza i w mniejszym stopniu ksylotrioza mogły nagromadzić się w przesączu kultury, a zatem dając w wyniku źródło ksylooligomerów, a zwłaszcza ksylobidzy i ksylctriozy.

184 463

Referencje

Audrianopoulos, A. and Hynes, M.J. (1988). Mol. Cell. Biol. 8:3532-3541.

Aviv, H. and Leder, P. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11:-1408-1412.

Balance D.J. and Turner G.C. (1985) Gene 36: 321-331.

Bailey, A.M., etal. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 5273-4278.

Bailey, A.M., Biely., P. and Po^ane^ K. (1992) J. Bidtechnol. 23: 257-270.

Berka. R.M., Ward. M., Wilson, L.J., Hayenga, K.J., Kodama. K.H., Carldmaguo,

L.P. and Thompson. S.A. (1990). Gene: 86: 153-162.

Bussink, H.J.D., van den Hombergh, J.P.T.W., van den IJssel, P.R.L.A. and Visser J. (1992). Appl. Microbiol. and Biotechuol.:37, 324-329.

Davies, R.W. (1991). Molecular biology of a high-level recdmbiuant protein production system in Aspergillus. In Leong, S.A. and Berka, R.M. (Eds), Molecular industrial Myco^gy: systems and apμlications for filanentous fungi, Marcel Dekker, Inc., pp 45-82.

Ekwall, K. and Ruusla, T. (1991). Nucl. Acids Res. 19: 1150.

Le^bo^ B. and Sealy-Lewis H.M. 91994). In: Aspergillus: 50 years on. Martinelli,

S.D. andKinghom, J.R. (Eds): 141-179).

Llipphi, M.J.A., van den Heuvel, M., van der Veen, P., Visser, J., and de Graaff, L.H. (1993) Curr. Genet. 24:525-532.

Llipphi, M.J.A., Visser, J., van der Veen, P. and de Graaff, L.H. (1994) Microbiology 140:2673-2682.

Fowler, T., et al. (1990). Curr. Genet. 18:537-545.

Gems, D.H. and Clutterbuck A.J. (1993) Curr. Genet. 24: 520-524.

Goosen T, Bldemheuvel G, Gysler C, Bie DA de, Broek HWJ van den, Swart K (1987) Curr Genet 11:499-503

Graaff LH de (1988) The structure and expressicu of the pyruvate kinase gene of Aspergillus nidulans and Aspergillus niger. PhD Thesis Landbouw Universiteit, Wageningen, The Netherlands

Graaff L.H. de, van den Broeck, H.C., van O^jen A.J.J. and Visser, J. (1994). Mol Microbiol. 12: 479-490.

Gwynne, D.I., Buxton, L.P., Gleeson, M.A. and Davies R.W. (1987) Genetically engineered secretion of foreign proteins from Aspergillus species. In: Burgess, R. (eds.), Protein Ourification: Micro to macro, Alan R. Liss, NY., pp 355-365.

Harmsen, J.A.M., Kusters-van Someren, M.A., Visser, J. (1990) Curr. Genet. 18:161-166. c.f. Hinnen, A., et al., (1995). In: Gene exoressiou in recom^^^ miyrdorgauisms.,

Smith, A. (ED) Marcel Dekker Inc. New York: 121-193).

c.f. Hinnen, A., et al., (1995). In: Gene exoression in recombinant microdrganisms.

Smith, A. (ED) Marcel Dekker Inc. New York: 121-193).

c.f. Hinnen, A., et al., (1995). In: Gene exoression in m^mbina^ microdrganisms.

Smith, A. (ED) Marcel Dekker Inc. New York: 121-193).

Hombergh van den, J.P.T.W., van de ^nder-yom-t, P.J.I., van der Heijden, N.C.B.A., and Visser, J. (1995) Curr·. Genet. 28:299-308.

-ohustone, I.L., Hughes, J. and Clutterbuck, A.J. (1985) EMBO J. 4: 1307-1331.

Katz, M.E. and Hynes, M.J. (1989). Mol. Cell. Biol. 9:5696-5701.

Kelly, J.M. and Hynes, M.J. (1985). EMBO J 4:475-479

Kelly, J.M. and Hynes, M.J. (1987). Curr. Genet. 12:21-31.

Kinoshita Krakano, M., Koseki, T., Ito. and Iwano, K. (1995). J. of

Ferment, and Bioe^.^, no 5, 422-428.

Kraulis, P.J., Raine, A.R., Gadhavi, P.L. and Laue E.D. (1992) Nature 356: 448-455.

Maniatis, T., Lritsch, E.L. and SaabrodS, J., (1982). Molecular Cloning:

A Laboratory Manual Cold Spring Habor, New York: Cold Spring Habor Laboratory

Press.

184 463

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2od edn. Cold Spring Habor, New York: Cold Spring Habor Laboratory Press.

Sanger, F., Nickelsen, S. and Coulson A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467.

Schutte, J.B. (1991), Nutritional value and physiological effects of D-xylose and L-arabinose io poultry and pigs. Datapress & Datavisions Wageningen, 173 pp.

Suarez, T., Vieira de Queiroz, M., Oestreicher, N. and ScazzoccOio, C. (1995). EMBO J. 14. no 7:1453-1467.

a) Uokles, S.E., et al. (1989). Gene 78: 157-166 and

b) Unkles, S.E., et al. (1989). Mol. Gen. Genet. 218:99-104.

Verdzes, J.C., Punt, P.J.. 5chrinckx, J.M., van Verseveld, H.W., Stouthamer A.H., and van den Hondel. C.A.M.J.J. (1993). Transgenetic res.: 2. 84-92.

Verdoes, J.C., Punt, P.J. and van den Hondel, C.A.M.J.J. (1995) Appl. Microbiol. Biotech^!. 43: 195-205

Verdoes, J.C., (1994) Molecular genetic studies of tle overproduction of gluczamylase in Aspergillus niger·. Thesis Vrije Universiteit Amsterdam.

TOc Netherlands.

Vislmiac, W. and Sanier, M. (1957) Bacteriol. Rev. 21: 195-213.

Wilson, L.J., Carmona, C.L. and Ward, M. (1988). Nucl. Acids Res. 16:

Whittington, H., Kerry-Williams, S., Bidgood, K., Dodsworth, N., Peberdy., J., Dobson,

M., HincOclifle, E., and Ballance, D.J. (1990). Curr. Genet. 18: 531-536.

184 463

Lista sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Zgłaszający:

(A) Nazwa: Agricultural University Wageningen (b) Ulica: Costerweg 50 (C) Miasto: Wageningen (e) Kraj: Holandia (F) Kod pocztowy (ZIP): 6701 BH (ii) Tytuł wynalazku: Nowy sposób wydzielania mutantów i klonowania genu dopełniającego (iii) Liczba sekwencji: 9 (iv) Postać komputerowa:

(A) Typ środowiska: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentin Release 21.0, wersja 21.25 (EPO) (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 1 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 1

CACAATGCAT CCCCTTTATC CGCCTGCCGT 30 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 2 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 37 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 2

CAATTGCGAC TTGGAGGACA TGATGGGCAG ATGAGGG 13 7 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 3 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 3

AGAGAGGATA TCGATGTGGG 20 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 4 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 37 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 4

CCCTCATCTG CCCATCATGT CCTCCAAGTC GCAATTG 31

184 463 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 5 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 2054 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (iii) Hipotetyczna: brak (iii) Antysensowna: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: Aspergillus tubigensis (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sygnał _TATA (B) Umiejscowienie: 848..854 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Umiejscowienie: 950..1179 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: intron (B) Umiejscowienie: 1179..1228 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: ekson (B) Umiejscowienie: 1229..1631 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Umiejscowienie:łącznie(950..1179, 1229.. 1631) (D) Inna informacj a: /numer EC = 3.2.1.8 /produkt = „1,4-betaksylanoksylanohydrolaza” /gen = „xlnA” /nazwa standardowa = „endoksylanaza” (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: peptyd mat (B) Umiejscowienie: 1031..1631 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: peptyd sig (B) Umiejscowienie: 950..1031 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 5

AACCTCTCCA GTCCCGTACT GTTTACCAAA ATGCCAGGCC ACTGGTGGAT ATACAACTTT	60
GTAATACGTT GCCGGAGTCA GCCCCTACTC CCTGATGGGT TCCCAĆTCCC TAGTTACITC	120
CTACTGGGTA GTAGGCTCCT AGAGTGGGGT AAAGTTTGCC AAGGGTTTAG CCCCAGTCTT	180
GTTTATGCTT GGCTAGGCAG GACCTGGGTA AGTTGATGGC TCCTGCATTC CTACCTGAGT	240
ATTTCCAGCT ATAAGCGAGA TTTGCCATAC TCTTCAGCGA GTCCGGATGG TCCGCGCCGA	300
GGTTGACCCT GCCTTCATCA CCTACACAAA GAACTCCTCG GCCAACTCCC GGTGGCCTTC	360
GAGCTCCAAA GTACCTTCGC GACCTTTGCC CAGTCTTTCT CGCAGCGTTT ACTGAGCCTA	420
AGGCITGCTA CAATAAATAA AGAGACATAA CCTTGCAGTA CATACGTCTT GTATGAGCGA	480

184 463

GGAACTGTGT TCAGTAGTAG ATCAGTGGGT ACATAATCAT GAACATGACT TCTGAGCCAG 540

AAAACCTTCT GCAGGGAACC CGTGAAGAAA CCCCACTTCC CCGCCTCCAC TAACTGCAGC 600

CCCTTTATCC GCCTGCCGTC CATTTAGCCA AATGTAGTCC ATTTAGCCAA GTGCGGTCCA 660

TTTAGCCAAG TCCAGTGCTT AGGTTGGTGG CTACACAGGA AACGGCCATG AATGTAGACA 720

CAACTATAGA ACTGTCCCTA GAAATAGGCT CGAGGTTGTT AGAGCGTTTA AGGTGATGCG 780

GCAAAATGCA TATGACTGAG TTGCTTCAAC GTGCAGGGGA AAGGGATAAA TAGTCITTTT 840

CGCAGAATAT AAATAGAGGT AGAGCGGGCT CGCAGCAATA TTGACCAGGA CAGGGCTTCT 900

TTTCCAGTTG CATACATCCA TTCACAGCAT TCAGCTTTCT TCAATCATC ATG AAG 955

Met Lys -27

GTC ACT GCG GCT TTT GCA GGT CTT TTG GTC ACG GCA TTC GCC GCT CCT 1003

Val Thr Ala Ala Phe Ala Gly Leu Leu Val Thr Ala Phe Ala Ala Pro

-25 -20 -15 -10

GCC CCA GAA CCT GAT CTG GTG TCG CGA AGT GCC GGT ATC AAC TAC GTG 1051

Ala Pro Glu Pro Asp Leu Val Ser Arg Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val

-5 1 5

CAA AAC TAC AAC GGC AAC CTT GGT GAT TTC ACC TAC GAC GAG AGT GCC 1099

Gln Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala

15 20

GGA ACA TTT TCC ATG TAC TGG GAA GAT GGA GTG AGC TCC GAC TTT GTC 114?

Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp Gly Val Ser Ser Asp Phe Val

30 35

GTT GGT CTG GGC TGG ACC ACT GGT TCT TCT AA GTGAGTGACT H89

Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Asn

45 50

GTATTCTTTA ACCAAGGTCT AGGATCTAAC GTCTTTCAG C GCT ATC ACC TAC TCT 1244 Ala Ile Thr Tyr Ser

GCC GAA TAC AGC GCT TCT GGC TCC GCT TCC TAC CTC GCT GTG TAC GGC 1292

Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly

65 70

TGG GTC AAC TAT CCT CAA GCT GAG TAC TAC ATC GTC GAG GAT TAC GGT 1340

Trp Val Asn Tyr Pro Gln Ala Glu Tyr Tyr lle Val Glu Asp Tyr Gly

80 85

GAT TAT AAC CCT TGC AGT TCG GCC ACA AGC CTT GGT ACC GTG TAC TCT 1388

Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser

95 100

GAT GGA AGC ACC TAC CAA GTC TGC ACC GAC ACT CGA ACA AAC GAA CCG 1436

Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys Thr Asp Thr Arg Thr Asn Glu Pro

105 110 115

184 463

TCC ATC ACG GGA ACA AGC ACG TTC ACG CAG TAC TTC TCC GTT CGA GAG 1148

Ser Ile Thr· Gly Thr Ser CTir PHe TTr Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu

120 125 130 135

AGC ACG CGC ACA TCT GGA ACG CTG ACT CTT GCC AAC CAT TTC ACC TTC 2-532

Ser Thr Arg Thr Ser Gly Tr VaJ. TTr Val Ala Asn His Phe Asn Phe

140 145 150

TGG GCG CAC CAT GGG TTC GGC AAT AGG dC TTC AAT TAT CAG CTC GTG 1580

Trp Ala His His Gly Phe Gly Asn Ser AAP Plre Asn Tyr Gnn Val Val

155 160 165

GCG GTG GAA GCA TGG AGC GCT GCT GGG Ad GCT AGT GTC ACA ATC TCT 1628

Ala Val Hu da Trp Ser Gly Ala dy Ser Ala Ser Val Tr Ile Ser

170 175 180

TCT TlCGClCTTC ΤTlCCATCΤT AGTGGGCCΤC TCTGCCAGCl lACΤΓΓTΤGT 1681

Ser

GTCAΤΤTΤΤT ΤTGCTlATCl ΤATCGΤCTCT ATGGσ<lTTCC ATr^dTC ΤΑΤΑ^'π! 1741

TΤTlGlΤAGl CΤCTΤTGCGG lGCTΤCΤTTT TCAlCTTlAA CACCTCTTCA ACTCTOCTTT 1801

TGTCTCTATT GAίTΠTGCTG lCTGCTTATG CTATAACTCl ATAACTATATT TGC CC ACTA 0 l86l

GAACCCTTGT TAGATT:GCCΤ TCΤTCCGTCA ΤAlGACΤlCC TTGGlΤCAΓG GGGClC’TGGGl 1921

GΤTlATΤGΤT AGCCTCTCCA GTClGGCATT TTAAAlΤCTC TTTACCGTCG AGATAnCTA 198l

TClCTACCΤC CTlGAΤΤTCC TATAΤCΤClG αΑΜΠΤΟΤΑ CCΤΓTAGCTl 2041

CAΤTTGCCTl CGA 2054 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 6 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 3026 pury zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (iii) Hipotetyczna: nie (iii) Antysensowna: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: Aspergillus niger (B) Szczep N400 (CBS 120.49)

184 463 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sygnał TATA (B) Umiejscowienie: 643..648 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Umiejscowienie: 724..2538 (D) Inna informacja: /numer EC = 1.1.3.4 /produkt = „oksydaza glukozy” /gen = „goxC” (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: peptyd mat (b) Umiejscowienie: 790..2538 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: peptyd sig (B) Umiejscowienie: 724..790 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 6

CTGCAGGTAC CTGAAGCCTG CCTACTTTGA TCACCCTGAA A^C/AC3C/\CCC3 CCTCGCTTCG 60

CCTTGGTGGT GAGTTTGCAC GTGGGCTGGC TGTTCAAATA MCTGCΓCCGGC TKWCCCCTC 120

CCCCGnOGAG AACACAGCAA ACACTATAGG CTrrCCATTG AGGGCATTLAA GAACGGCCTA l80

TGGTTTGTGC GGTCCGCTAC CGTTCGGGGG AGCACGAATC CGAMCrCAGA 2*40

TTCGATaTTC TCGGCATGCC GAAAGTCGCT ATTCCTTGGT GCCACCGTGG TrOCCCC 300

GGATrcGTAT AGTTCCΊTCT TTACCACCCT CTTTATCGΓT ΑααΠΚυσΟ ACGΓCGACGGGC 330

TATGGCCTCA ATAAGTCATT ATCACCATGA TATCCTTTCT ΑΟΛΑ^Ο^ AiCGCAGAG 422

CATCACCATC TTAATTCTCT CTTTTATCTC TTΓAACCATΓ CGCTTTCGGCCG CTATCCAGGG 480

ATTATCCTTT GGCATTGTGG TATTTCCCAT ATCCATCGCT GAGCACACGG Ασ^Τ^^ 540

TCAGTTCATC GTCTTTATTA GrATGA·!™ TGACCATGCT T’CCGTCCGGG ασΑ^Κ!

TGCATTATTC AATAACTTGG TTTTCCATTA TTCACTCCAG CGTATAACTA ACTΓC<CΓTCC 6&0

GTCCTTCTCT GAGTTCGGGG TTACCAATTA GC<TmCCTT TCATCTGCCC 720

ATC ATG CAG ACT CTC CCT GGG AGG TCC CTT GGG GGC TCC CTC GCT GCC 768

Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser· Leu Ala Ala

-22 -20 -15 -10

GCC CTG CCA CAC TTA ATC AGG AAG teA GGC AAT CGA GGC AGC CCC CTG 8l6

Ala Leu Pro His TTr Ile As Ser AAn Gly Ile GGu AAs Ser Leu Leu

-5 1 5

ACT GAT CCC AAG GGA CTC TC GCG CCG ACG CTC CGA TAC ATC ATC GCT 864

Asp Pro Lys Aap Val Ser GGy Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala

15 20 25

GGC GGA GCT CTG AAC GCG CTC ACC ACC GCT GCC CCT CTG ACG GAG AAC 912

Gly Gly Gly Leu TTr GGy Leu ITr 'Rir Ala AAs Arg Leu TTir Glu ten

35 40

184 463

CCC AAC ATC AGT GTG CTC GTC

ATC GAA AGT GGC TCT 'CAC GAG TCG GAC

996)

Pro Asn Ile Ser

Val Leu

Val

Ile

Glu Ser oo

G1g yeS TyT

GIg 55

GeS Asp

45

AGA

GGT

CCT

ATC

ATT

GAG

GAC

CTG

AAC

GCC

TAT

CGG

GAG

ATA

tt

GGT

1OC0J

Arg

Gly

Pro

Ile

Glu

Asp

Leu

Asn

Ala

TyT

GIg

ysA

piI

PhP

G1t

60

<55

70

AGC

AGT

GGC

GAC

CAC

GCC

TAC

GAG

ACC

GTG

GAG

GTC

CCT

TCC

CAA

1106

Ser

Val

Asp

H.s

Ala

Tyr

TLg

Thr

Val

Gic

ueL

Gic

ThG

Gsa

nsG

75

80

55

CAA

ACC

GCG

CTG

ATC

CGC

TCC

GGA

GCT

GGT

CTC

CGG

GGG

CCT'

GCG

TTC

110*ł

Gln

Thr

ALa

Leu

Ile

Arg

Ser

Gly

Asn

Gly

LeL

gig

GIg

G eS

GhT

GeL

90

95

100

105

GTG

AAT

GGT

GGC

ACC

TGG

ACT

CGC

CCC

CAC

AAG

GCG

GAC

GTG

GAT

cct·

1152

Val

Asn

Gly

Thr

Trp

Thr

Arg

Pro

His

Lys

Alc

G1t

Val

Asa

Ser

110

115

120

TGG

GAG

ACT

GTC

TTT

GGA

AAT

GAG

GGC

TGG

AAA

GGG

GAG

AAA*

TTT

GCT

1200

Trp

Glu

Thr

Val

Phe

Gly

Csn

Glu

Gly

Trp

Asa

Ti? Asa

Asa

ViV.

Alc

125 130 135

GCC Gla

TAC TTC CGG

CCC GTn

GGC GAG CTT GCG CCT GCA CCA MC GGC ACG CAG

1248

Tyr

Srr 140

Llu

Ala

GIg Arg 1*5

GLa Alg

Ala

Pio

Acn 150

Ma

Lsg

Gln

ATC

GCG

GGC

GGG

CCC

TAC

TTC AGC

GCG TCG

TGC

CAT

GCG

GTT

MT

GCT

1296

Ile

Gla 155

Ala

GTy

His

Tyr

Phe Gsn 160

Gla Ser

Cys

His 165

GTy

VaT

Asn dy

ACT

TTC

CAT

GCC

TGA

CCC

CGC TAC

GCC GGC

TAT

TCC

TTG

TTC

CAA

ACT

1144

Thr 170

Val

His

Gla

Tly

Pro 177

Arg Gsp

Thr Gly

Gsp 180

Gsp Ttg

Ssg

Ppo

IIe 185

TTC

AAG

GCT

CTC

ATT

AGC

TCT TTC

TAG GAC

CGG

GGC

GTT

CCC

ACA

AAA

1392

Val

Lys

Ala

Leu

Met 190

Sgg

GLa Val

Tlu Gsp 115

Arg Gly

VvT

Ppo

TTh 200)

Lsg

AGA

GAC

TGC

GTA

TGC

TTT

GAC CCC

CGT TTT

GTG

TCC

ACT

itt

CGA

AGC

1440

Lys

Asp

Phe

Gly 205

Cys

Gly

Asp Pro

His Gly 210

Val

Sgg

MMt

PPh 215

Ppo

Msin

ACC

TTG

CAC

GGA

GAC

CAG

TTG CTC

TCC TAT

GCC

GCT

CGT

GTC

TTG

CTT

1488

Thr

Leu

HLs 220

CLg

Asp

Tin

Val Arg 255

Sgg Asp

Gla

GLa

Acg 230

GTu

Trp

Ilu

CTT

CCC

AAC

TAC

CGG

CTT

CCC GAC

CTT CGG

TTC

CTG

ACC

GCT

CAG

TAC

1536

Lgg

Pro 235

Gsn

Tyr

dn

Arg

Pro Gsn 200

Leu Gln

VTL

Lgg 455

ITr

GTy

GTn

Tyr

TTT

GTT

AAT

TTT

GTC

CTT

AGC CAG

AGC GGC

ACC

GCC

CCT

cct·

GCC

CTT

Val 250

Gly

Lys

Val

Leu

Leu 255

Ser Gln

Gsn Gly

Thr 260

Tho

Pro

Alg

Ala

VoT 265

GGC'

TTG

GGA

TTC

GGC

ACC

CAC GAG

GGC AAC

GCC

CGC

MC

CTT?

TAC

GCG?

1632

dy

Val

Glu

Phe

Gly 270

Tho

His Lys

Gly Asn 275

Thr

His

Acn

VaT

Tyr 280

/Git

184 463

AAG

CAC i

GAG

GTC

CTC

CTG

GCC

GCG

GGC

TCC

GCT

GTC

TCT

CCC

ACA

ATC

1680

Lys :

His ¹

Glu

Val

Leu

Ala

Gly

Ser

Ala

Val

Ser

Pro

Thr

Ile

285

290

295

CTC

GAA '

TAT

TCC

GGT

ATC

CGA

ATG

AAG

TCC

ATC

CTG

GAG

CCC

CTT

GGT

1728

Leu

Glu

Tyr

Ser

Gly

Ile

Gly

Met

Lys

Ser

Ile

Leu

Glu

Pro

Leu

Gly

300

305

310

ATC

GAC

ACC

GTC

GTT

GAC

CTG

CCC

GTC

GGC

TTG

AAC

CTG

CAG

GAC

CAG

1776

Ile

Asp

Thr

Val

Asp

Leu

Pro

Val

Gly

Leu

Asn

Leu

Gln

Asp

Gln

315

320

325

ACC

GCT

ACC

GTC

CGC

TCC

CGC

ATC

ACC

TCT

GCT

GGT

GCA

GGA

CAG

1824

Thr

Ala

Thr

Val

Arg

Ser

Arg

Ile

Thr

Ser

Ala

Gly

Ala

Gly

Gln

330

335

340

345

GGA

CAG

GCC

CCT

TGG

TTC

GCC

ACC

TTC

AAC

GAG

ACC

TTT

GGT

GAC

TAT

1872

Gly

Gln

Ala

Trp

Phe

Ala

Thr

Phe

Asn

Glu

Thr

Phe

Gly

Asp

Tyr

350

355

360

TCC

GAA

AAG

GCA

CAC

GAG

CTG

CTC

AAC

ACC

AAG

CTG

GAG

CAG

TGG

GCC

1920

Ser

Glu

Lys

Ala

His

Glu

Leu

Asn

Thr

Lys

Leu

Glu

Gln

Trp

Ala

365

370

375

GAA

GAG

GCC

GTC

GCC

CGT

GGC

GGA

TTC

CAC

AAC

ACC

GCC

TTG

CTC

•1968

Glu

Ala

Val

Ala

Arg Gly

Gly

Phe

His

Asn

Thr

Ala

Leu

380

385

390

ATC

CAG

TAC

GAG

AAC

TAC

CGC

GAC

TGG

ATT

GTC

AAC

CAC

AAC

GTC

GCG

2016

Ile

Gln

Tyr

Glu

Asn

Tyr

Arg Asp

Trp

Ile

Val

Asn

His

Asn

Val

Ala

395

400

405

TAC

TCG

GAA

CTC

TTC

CTC

GAC

ACT

GCC

GGA

GTA

GCC

AGC

TTC

GAT

GTG

2064

Tyr

Ser

Glu

Leu

Phe

Leu

Asp

Thr

Ala

Gly

Val

Ala

Ser

Phe

Asp

Val

410

415

420

425

TGG

GAC

CTT

CTG

CCC

TTC

ACC

CGA

GGA

TAC

GTT

CAC

ATC

CTC

GAC

AAG

2112

Trp

Asp

Leu

Pro

Phe

Thr

Arg Gly

Tyr

Val

His

Ile

Leu

Asp

Lys

430

435

440

GAC

CCC

TAC

CTT

CAC

TTC

GCC

TAC

GAC

CCT

CAG

TAC

TTC

CTC

AAC

2160

Asp

Pro

Tyr

Leu

His

Phe

Ala

Tyr

Asp

Pro

Gln

Tyr

Phe

Leu

Asn

445

450

455

GAG

CTG

GAC

CTG

CTC

GGT

CAG

GCT

GCC

GCT

ACT

CAA

CTG

GCC

CGC

AAC

2208

Glu

Leu

Asp

Leu

Gly

Gln

Ala

Thr

Gln

Leu

Ala

Arg

Asn

460

465

470

ATC

TCC

AAC

TCC

GGT

GCC

ATG

CAG

ACC

TAC

TTC

GCT

GGG

GAG

ACT

ATC

2256

Ile

Ser

Asn

Ser

Gly

Ala

Met

Gln

Thr

Tyr

Phe

Ala

Gly

Glu

Thr

Ile

475

480

485

CCC

GGT

GAT

AAC

CTC

GCG

TAT

GAT

GCC

GAT

TTG

AGC

GCC

TGG

ACT

GAG

2304

Pro

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

Tyr

Asp

Ala

Asp

Leu

Ser

Ala

Trp

Thr

Glu

490

495

500

505

184 463

TAT Tyr

ATT TTT TAT TAT TTC

TCG TCT ATT GGT CAT AGC GCA GCT ATT TAC

2252

Ile

Pro

Tyr

H.s 510

Phe

Grg

Pro

Asn

Tyr 515

His

GCy

Vil

GCy TAh 520

Cys

TTT

ATC

TTC

GGC

CAC

ATC

CCT

CTT

dT

GAT

ATT

GCT GCO

CCT

2400

Ser

Met

Pro

Lys

Olu

Met

dy

Val

Ατρ

Ατη

AGa AGa

ATg

525

530

535

CTA

GAG

CCT

CTC

TGC

CCA

TTC

TCT

CTT

ATT

GATT

ACT

TCC

AAG CCT

CTT

24448

Val

Tyr

dy

Val

Cln

dy

Leu

Arg

Val

Ile

Asa

Gly

Ser

Ile Pro

Pro

540

545

550

ATC

TGG

GTC

TTC

TTO

TAT

CTT

ATC

GTC

CTC

tt:

TAT

CCT

ATG GCG

CCA

2496

Thr

Cln

Met

Ser

His

Val

Met

Thr

Val

Phe

Tgs

ATa

Mee AGa

Llu

555

560

565

GGG

AGA

TTC

CAT

CTT

ATT

GGC

CAG

CAT

TTG

CTT

ATT

AGC

TAC

2538

Lys

Ile

Ser

Asp

Ala

Ile

Leu

du

Asp

Tyr

da

Ser

Met

dn

570

575

58O

TGAGTGGTAT GATGGGGATA TGAGTGAGGA TATTAGGGGA TGGTACTTAG ATGCTGGGGA 2598

GGTATAATCA GGCGGGCGGG GCTGTTCTAG GCrrAATTAG ACAGTCTACA TGGTTTGGGT 2658 GTTTGGG’GGT CTCGCCGCGT GTGGTGGTTG AGGTTGCCCT ’ΓGGTGATTCG AG'CG(TCGGCC 21^ AGGGCATGGC GGTGTTGTCC TGTGTGGTTA TGGTGCTTGG GCATGTGTTC ZJ]!8 GACCCGCTGG GGGGGCGGAT GGTTCATTTG CTATTGOGTT CTTTTGACTG GCGTTTCATG 2838 GTGGACGTGC TGTCGCGCTG GTGTGCTCTG TACTGTAGCT ATGTGGCATG TGTTGTTCTT 28g8 TGGTAAGGTC GGCGGGTGTT CCTGTGCTTG TTAGATGCOT; CTGCTGCGGC AGGCTCTGTC 2958 GAGAGTGCCT CGGGGTGGTT TGGCTTGCGG GCTTAGTTGC CTTGTGTGCT GCTCTCTATG 3018 ATAGTCTT 3026

184 463 (2) Informacja dla SEQ ED Nr: 7 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1517 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (geoomiczny) (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: Aspergillus niger (B) Szczep: L112 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: ekson (b) Umiejscowienie: 339..495 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: intron (B) Umiejscowienie: 496..563 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: ekson (b) Umiejscowienie: 564..1237 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Umiejscowienie: łącznie (339..495, 564.. 1237) (D) Inna informacja:

/produkt = „dekarboksylaza 5'-zrtztydynzfzsforanu” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 7

GCAGGGAAAA ATACGAGCTC CAATGAACCT GGGTGTTGGCA GCTTCAATGG AAAGGAACTG 60

CCTTTGCAGG TGTGGCTCAT CCCCACACAT GCGGTAACAC GCGCCCATCCTCACCCGCCTTC Χ20

GCCTGCTGAG ATGTCCCACC CTSAG^GT CTT’Π'GCTCGACATOATGΓG :G8(0

TGCATTGTTC ACCTCATATA AGGGCCiAGTC GCTGGTAAAT TATTCGGTAG ’^y^TTTGCGCA 240

TCTCTGGATC TCCCCCAACA GAACTGTGAC TCGATCATGC TAACTACTCA TA'AGGCAGTG 3C00

GAAGATGAAA TCCCAAAC’TG AACCAATCAA AAACACAA ATG TCC TCC MG TCG 353

Met Ser Ser Lys Ser

5

CM TTG ACC TAC ACT

GCC CCT CCC AGC AAG GAC CCC MT GCT GCT! TCC

401

Gln

Leu Ήιγ

Tyr Trim 10

Ala

Arg

Ala

Ser Lys His 15

Pro

Asn

AAi

Glu 20

da

MG

CGG

CTG

TTC

GAA

TTT

GCT

GAG

GCC

MG

ACC

MT

CGG

ACC

GTC

449

Lys

Arg

Leu

Phe

Glu

iee

AJ.a

Glu

Ala

Lls

Lys

Tir

Mn

Val

ITr

Val

25

30

35

TCT

GCC

GAC

GTT

ACG

CCG

ACT

AAG

GAG

CCTA

CTA

GAT

CTT

GCT

GG^C

C

495

Ser

Ala

Asp

Vil

Thi

hlG

LyG

Glu

Leu

Asp

Leu

AAa

40

45

50

184 463

GTAGGCCGAC CCG<^^,ATrCT GCGTCjTrrAT GCTGCATACA AACTTATTAA CGGTGATACC 555

GGACTGAG	CT CTC GCT CCC TCC Arg Llu Gly Pro Tyr 55	ACC CCC GCG ATC GAA ACC CAC ATC CGT	Gt
00t Ala	Val iae Lvs Thr Hes XTe Asp
60	65
ATC CTC	TCT GAC TTC AGC GAC	GAG ACC	ATT GAG GGC	CTC AAG GCT CTT	662
Ile Leu	Ser Asp Phe Ser Asp 70	Glu Thr 75	Ile Glu Gly	Leu Lys da Leu 80
GCG CAG	AAG CAC AAC TTC CTC	ATC TTC	GAG GAC CGC	AAA TTC ATC GAC	700
Ala Gln	Lys His Asn Phe Leu 85	Ile Phe 99>	Glu Asp Arg	Lys Phe Ile Asp 95
ATT GGC	AAC ACT GTC CAG AAG	CAA TAC	CAC CGT GGT	ACC CTC CGC ATC	74 ii
Ile Gly 100	Asn Thr Val Gln Lys 1O0	Gln Tyr	Ais Arg Gly 110	Thr Leu Arg Ile
TCA GAA	TGG GCC CAT ATC ATC	AAC TGC	AGC ATC CTG	CCT GGC GAG GGT	796
Ser Glu 115	Trp Ala His Ile Ile 120	Asn Cys	Ser Ile Leu 125	Pro Gly Glu Gly 130
ATC GTC	GAG GCT CTC GCT CAG	ACG GCG	TCT GCA CCG	GCC TTC TCC TAC	&43
Ile Val	Glu Ala Leu Ala Gln 135	Thr da	Ser Ala Pro 140	Asp Phe Ser Tyr 145
GGC CCC	GAA CGT CGT CTG TTG	ATC TTG	GCG GAA ATG	ACC TCT AAG GGT	892
Gly Pro	Glu Arg Gly Leu Leu 150	Ile Leu 155	Ala Glu Met	Thr Ser Lys Gly 160
TCC TTG	GCC ACC GGC CAG TAC	CCT ACT	TCT TCG CTT	GT TAT GCC CGG	940
Ser Leu	Ala Thr Gly Gln Tyr 165	Thr Thr 1-70	Ser Ser Val	Asp Tyr da Arg 175
AAA TAC	AAG AAC TTC GTC ATG	GGA TTT	CTG TCG ACC	CGC TCG TTG GGT	988
Lys Tyr 180	Lyś Asn Phe V-al Met 185	Gly Phe	Val Ser Thr 1^0	Arg Ser Leu Gly

GAG GTG	CAG	TCT GAG CTG	CGA	CCT CCT	TTZG	GGA	GGA CGA	CGC	ΉΤ	CTG	1036
Glu Val	Gln	Ser G1g V al	S er	Ser Ppo	SSe	Acp	GGu Glu	dp	Phe	Vva
195		200				205				210
GTC TTC	ACG	ACT TCT TTG	GAC	CCT* TTC	TCC	AAA	GGG tGA	MG	CTC	GCG¹	1084
Val Phe	Thr	Thr Gir Vd	Asa	He Ser	SSe	Lls	Gly dp	Lys	Leu	Gly
		215			222				222
CAG CAG	TAC	CAG GCT TCC	GCA	TCG GGT	AAC	GGG	CGG GGG	GCT	GC	TTC	1132
Gln Gln	Tyr	Gln Thr Pro	Ala	Sexo AA a	Ile	QGy	Arg Gly	Ala	Acp	Phe
		230		235				240
ATT ATC	GCG	GGG CGC GCT	ATC	TAC GCCC	GCG	CCG	GC CCG	CTG	CAG	GCT	1180
Ile Ile	Ala	Gly Arg Gly	Ile	Tyr Ala	Ala	Pro	Asp Pro	Val	Gln	da
	245			250			255

184 463

CTC TGG TGC ATT TAC TAC CGG GCT GGT CGC GyG GAT TTC CTT TCG CTT 1223

Ala Cln dn Tyr dn Lys du dy Grp du Gla Gyr Leu Ala Arg lal

260 265 270

GGy GGG ATT GATOGTTATT GAAΌCAGCGG TGGAGTΓTTC GAGGTTGTGG 1277 dy dy Asn

275

TTTGΌTΌACG GT’ΓCyAATTT GyTCyTGyCT ΌAyGyGAGyG GTTOGAGCTT CTCTGTGCGG 1337

TGTyTCGTΌG yTGyATTGGT ΌTΌyGAGGyC GTAΌTGTΌTT GGyTTCyTTG GATTCCGTGT 1397

TTTCGGGTTT TGGyCGTAyG TyGA'GATGAT CyGGAXΆAGy ACCyAGTGTA GAGyTΌGT’ΓT 1457

T'ΓTιΓAATTyT GGTGTATGCT TGAΌTGyGGy GGTTTGyTGG ΌGAGCTGyGC TGGΌTTG<yΓT 1517 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 8 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4108 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nicidwość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (iii) Hipotetyczna: nie (iii) Autysensowna: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: Aspergillus niger (CBS 120.49) (B) Szczep: NW147 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: sygnał TATA (B) Umiejscowienie: 748..794 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Umiejscowienie: 855..3266 (D) Inna informacj a: /numer EC = 3.2.1.37 /produkt = ksylaudhydrolaza 1,4-beta-D-ksylauu” /gen = „xlnD” /nazwa standardowa - „beta-ksylozydaza” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 1 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: peptyd sig (b) Umiejscowienie: 855..932 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: peptyd mat (b) Umiejscowienie: 933..3266 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: centrum polyA (B) Umiejscowienie: 3883 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: centrum polyA (B) Umiejscowienie: 3404 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 8

184 463

ATGAAGGAAA TΤTCTCATlG GGAAGAGGGT C&CTGGTAGG ACCTAΤTCCA CATTGAGGCG 60

ΤAlCTGlAlC GGGCAGAGAT GGAAGCAGGT GGGTGGGCAA GGΤCΤAClAA _<ll^C^CC^A(A^(^¢AC HO

ACGGAGGAGG AΤCTGCΤTAT ACAAΤACGlA CTCGCCTTGC CGΤTTATGΤC Τσσθ<ΑΤΑΤΤ 118

TTGCAGGTGC AΤTTTGGGCG GGGGAAGGTG AAICHl/GG AGTTATTGTA TGGACTAGGG 220

ATGΤTGΤCAT ΤTCGlGCGGG CAAAGΤAΤAG (TTAATACCT lCΤClGAΤCl GCTCAAGATC 300

CAΤTTTlCll ATGGGGATGT GCTGGAGAAG TKnGTTlGA ΤACCAΤACΤl ACTCCATCCT 3(6)

GGGTTGAAGA AGGAlGAGGT ΤTTΤGCΤCCl TGGlΤCGGΤA ΤGΤCAGACGl GCTATTTCG 4^0

GAAGAGAGGG ATAAGCATAT CGAGGAGATC σIlΠΤGTΤCC TCTTAAAGTG GGAGCGATTKC 4480

GATGTΓTΓCT TΤΤlAΤCσTT GTTGAGGGAA GAGCGACTTTT AAGGGGACGA TTATACGTTT 540

ACGCACTTTl GdGGGGATG lCTTCATCTT TCCCdGCCCC TCΤCCCΤlGG &00

ACACGTACGG lΤrΤACTlAG GGAAACTACA CTTCGMGAG ACCGGAACCT TTTCCATCTC 66^0

TTΤΓTTTCAT TΤGTCCCTGG AAACA'TTGAA GGTCUITCCT ACCGlGAlGA CCCTAATTAC 720

GlATCCCAGA GAlClATlCC ΤTGCCTCGGT CATΓCTCCAG CAlACTATAC GCTATGAlCA 780

AAGGlCTATA CCCTATCGGC CAGATTCAGT CCCCGGCCAC CATTCAACCC GCCAAGACAG 840

AGACGGGATG AdC ATG GCG CCC TCC ATT TTC CCT CCC GTT GCT GGC ACT ACO

Met da His Ser Met Ser Arg Pro Val da da Thr

-26 -25 -20 -15

GCC GCT GCT CCT CTG GCT CTG GCT CTC TCT CAC ACT CU GCC CAG CCC 938 da da Ala Leu Leu Al a Lau AUa Leu Urp GIg Ala LeA Ala G1A AIg

-10 -5 1

CAG CCC GCC ACC GTC GAC TAC AAC AAT GGA GGC AAC CCG (GAC TTG TAT 986

Asn Thr ee r Trr Val Asp Tyr Am Ile Glu da Asn Pro Asp leu Trr

10 15

CCT TTG TGT CTA GAA AAC CCC CCA CTG GGC CTC CCC GAC TGC CTG AAT 1034

Pro Ueu CyC sIi Glu lhr hr e Pro Leu Ser Phe Pro Asp Cys Gln Asn

25 30

GTT CCC CTC GGG AGC GCT CTC TTe TCT TAT Gd ACA GCC ACC CCC TAT 1C^2

Tly Pro Lee Aig Ser His Leu Ile Cys Asa G-g Thr da Thr Pro Tyr

40 45 50

TCC CTC GCG AGA TCG CTC ACC TCT TTC CTC ACC CTG GAC GAG CTG AC' 1130

Asp Arg Ale AAa Ser Leu Ile Ser Leu Phe Thr Leu Asie Glu Leu IUe

60 65

GCC AAC ACA CGG AAC ACC CCC CTC CCT TTG TCC CGA CTG GGC CTC CCT II78 da Asn Thr Gly Asn Thr hi y Leu Gly Vd Ser· Arg Leu Gly Leu Puo

75 80

184 463

CTG GAT TTG d.a Tyr dn 85	TTG TAC	GTT Ser	CTT CTG TTG TGT TCT	TTT CAT CGG CTT TTT	1126
V£d	Trp	du Tla Leu H.s 90	dy	Leu	Gsp Grg Gla Gsn 95
TTC AGC TAT	GCA	GCG	GCC	GAC GAT TTT ACC	AGC	TCA	ICC CCT GAA TTT	1274
Phe Ser Asp 100	Ser	dy	Ala	Tyr Asn Trp Ala 115	Ghr	Ser 111	Phe Pro dn Pro
GTT TTC ATT	ATT	CTC	CTT	TTT GGT TCT GTT	TTT	GTT	TGC TGG GTT ATT	1322
Ile Leu Ghr 115	Ghr	da	Tla 120	Leu Tsn Trg Thr	Leu 125	Ile	His dn Ile Tla 113
ATT ATT GGT	TTT	TTT	TGG	tct tct Gyy gtt	TAT	GTT	CTT ATT TAT TTT	1370
Ser Ile Ile	Ser	Ghr 135	dn	dy Trg Tla Phe Ho	Asn	Gsn	Ala dy Trg Gyr 115
ATT CTT GGT	CTT	TAT	Gyy	TTT ATT ATT GAT	ATT	GTT	TCT TAT TTT ATT	1418
dy Leu Asp	Val 150	Tyr	Gla	Pro Asn Ile Tsn 115	Thr	Phe	Arg His Pro Val 160
TGG GGT CGC	GGA	CAA	GAA	ACC CCA GGA GAG	GAC	GTC	TCT CTC GCC GCC	1466
Trp Gly Arg 165	Gly	Gln	Glu	Thr Pro Gly Glu 170	Asp	Val	Ser Leu Ala Ala 2-705
GTy TAT CTC	GGT	CGG	TGT	ATT GTC CCT ATT	TGC	GCG	TTT CAT TTT ATG	1514
Val Gyr Ala 180	Gyr	du	Tyr	Ile Thr dy Ile 185	Cln	d.y 190	Pro Gsp Pro du
ATT GGT TTC	TAT	TTT	GTT	ATT GTC CTC TTG	CAT	TGT	ACT GCT TTT CTC	1562
Ser Tsn Leu 195	Lys	Leu	Gla 200	Tla Ghr Ala Lys	H.s 205	Gyr	Gla dy Tyr Asp 210
ATT AGC ATT	GGA	TGT	GAT	TAT ATT TAC TTC	CAT	TAT	GGT GTC GGT ATT	1610
Ile du Tsn	Trp	His 215	Gsn	His Ser Arg Leu 220	dy	Asn	Gsp Met Tsn Ile 225

ACT

TGA

TAG

ATT

TTT

AAG

TTT

TAT

GTC

TTT

GTT

TGT

CAT

TTT

1158

Thr

dn

Asp 230

Leu

Ser

du

Tyr Tyr 235

Tir

Pro

dn

Phe

His 22^0

Val

Ala

CTT

TCT

GGC

CTT

GGT

CTC

TAA

GGG

CAT

GTC

TCT

ATT

TGT

TTT

CAT

1706

ALa

Trg Asp 245

Tla

Lys

Val

dn

Ser 250

Val

Met

Tys

Gla

Tyr 255

Tsn

ALa

Val

TAT

CAT

CGC

TTT

CTT

TAT

ATT

GTT

ATT

GTT

TTT

TAC

ATT

TTT

1754

Asn

CLy 260

Val

Pro

Ala

Tys

Gla 265

Gsp

Ser

Gyr

Phe

Leu 270

dn

Thr

Leu

TCT

CTT

GCC

TTT

CCA

GTT

CTT

TAC

TTC

CCG

TGT

ATT

GTC

ACT

GTT

TAT

1802

Trg 275

Asp

Ghr

Phe

dy

Phe 280

Val

Gsp

His

Tly Tyr 225

Val

Ser

Gsp

Tys 220

ATG

CTT

CTC

TGT

TTT

TAT

GGT

TTC

TGT

ATT

TTT

CTC

TTT

TGA

11350

Asp

ALa

Ala

Tyr

Asn 205

Ile

Gyr

Gsn

Pro

His 3C03

dy

Tyr

ALa

Ser

Ser 300)

Aln

184 463

GCT

GCC

GCT

GCC

GCG

GAG

GCC

ATC

CTC '

GCC

GGC

ACC i

GAC .

ATC

GAC ¹

CGC

1898

Ala

Ala 310

Ala

Glu

Ala

Ile

Leu 3H

ALa

Gly

Thr .

Asp

Ile 332

Asp

Cys

GGT

ACC

TAC

CAA

TGG

CAC

CTG

AAC

GAG

TGC

AAC

GCT

GGC

GGG

GGT

1944

dy

Ghr

G^r 325

Tyr

Gln

Trp

His

Leu 330

Asn

Glu

SSe

IIe

ALa. 335

AAa

GGy

AAs

CTC

TCT

CCC

GAT

ATT

GAG

CAG

GCT

CTG

ATT

CCT

CTC

TTC

TAC

CAC

1994

Leu

Ser 340

Arg Asp

Asp

Ile

Glu 345

Gln

Gly

VAa

Ile

AS 350

Ceu

tyy

TTr

CCC

GIG

CAG

GCC

CGA

TAC

CTC

GAC

TCC

AAC

ACC

ACA

AAG

GCG

AAC

20041

Leu 355

aai

Gln

Ala

dy Tyr 360

Phe

Asp

Ser

ten

Thr 365

Thr

Lys

Ala

Asn

Asn 370

CCC

GAC

CGC

GAC

CTC

TCC

TGG

TCC

GAC

GTC

CCT

GGG

AAC

CGA

GGC

TCG

2090

Pro

Tyr

Arg

Asp

Leu 375

Ser

Trp

SSr

Asp

Val 380

Llu

GGu

TCh

AAs·

AAa 385

Ttp

AAC

AGC

GCC

TAC

CAA

GCC

GCG

ACG

CAG

GGC

ATT

GTC

CTT

CTC

AAG

AAC

2138

Asn

Ile

Ser

Tyr 390

Gln

Ala

ALa

Thr

Gln 395

Gly

Ile

aai

Leu

Leu 400

Lys

Asn

TCC

AAC

CTC

CCC

CTC

ACC

GAG

GGG

GCT

TAC

CCA

TCC

AAC

2186

Ser

Asn

Asn 405

Val

Leu

Pro

Leu

Thr 410

Glu

Lys

Ala

Tyr

Pro 415

Pro

Ser

Asn

ACC

GIC

GCC

CTC

ATC

GGT

CCC

TGG

GCC

AAC

GCC

ACC

CM

CTC

2234

Thr

Thr 420

aal

Ala

Leu

Ile

Gly 425

Pro

Trp

Ala

Asn

Ala 433)

Thr

Gln

Leu

CIO

GGC

AAC

TAC

GGC

AAC

GCT

CCC

GAC

ATG

ATC

AGC

CCC

CGC

GCC

2282

Leu 435

Gly

Asn

Tyr

Gly 440

Asn

ALa

Pro

^^r

Met 445

Ile

Ser

Pro

Arg

ALa 445

GCC

TTC

GAA

GM

GCC

GGA

TAC

AM

GTC

AAC

TTC

GCC

GAG

GGC

ACC

GGG

2330

A.a

Phe

Glu

Ala 455

Gly Tyr

Lys

Val

Asn 460

Phe

Ala

Glu

dy

Thr 465

GLy

ATC

CCC

TCC

ACA

AGC

ACC

TCG

GGC

TCC

GCT

GCC

TTA

TCC

GCC

GCA

231^8

Ile

Ser

Thr 470

Ser

Thr

Ser

Gly

Phe *475

Ala

Leu

Ser 480

Ala Ala

CM

GCC

GAC

GIG

ATA

ATC

TAC

GCC

GGT

AGC

GAC

AAT

ACC

CGG

2^Ν2ζ>

GLn

Ser

ALa 485

Asp

aal

Ile

Tyr 900

Ala

Gly

Ile

Asp 495

Asn

Thr

Leu

GM

GCG

GAG

GCA

CTG

GAT

CGA

GAG

AGT

ATC

GCG

TGG

CCG

GGT

AAC

CM

2474

Glu

ALa 500

Glu

Ala

Leu

Asp

Arg 555

Glu

Ser

Ile

Ala

Trp 510

Pro

Gly

Asn

dn

CTG

GAC

TTG

ATC

CAG

AAG

CTC

GCC

TCG

GCG

GCC

GGA

AAG

CCG

CTC

2522

Leu

Asp

Leu

Ile

Gln

Lys

Leu

Ala

Ser

Ala

Gly

Lys

Pro

Leu

515 520 525 530

184 463

ATC CTC Ile Val

CTC CM Leu Gln

ATG GGC GGC GAG CAA GTA CGT TCC TCT TCC CCC MG

2570

Met 535

Aly

Gly Aln VaV 540

App

Ser

Sei* Sei*

Leu Lys 545

AAC

MC

TCC

TTT

GTT

TCT

GCG

CTO

CTC

TGG

ATA

GCT

TT^G

CCC

GCC

CM

26l8

Asn

Thr

Csn

Val

Ser

All

Leu

Trp

CTy

Gly Tyr

Pio>

Gly

GCn

550

555

556

TCT

TGC

GGC

TTC

ACT

TTA

CGG

GAT

ATC

AlG

GGG

Ml

MG

MC

Ccc

2666

Ser

Gly

Phe

dl

Leu

Crg Csp

Ile

ITr

GCy

Lys

Mn

Pio

565

557

577

GCA

TCT

AGA

ACT

GTC

AGC

CCG

Td

CCC

GAC

AAC

Td

GCC

GAC

2714

dl

Gly

Arp

Llu

Vd

TTh

Gln

Tts

Ppo

da

Ssu

TTr

All.

Glu

GAu

580

585

550

TTC

CCT

ACC

CCC

GCT

TTG

ATC

CCC

CAT

CCT

CTG

GCT

CTT

MC

CCT

GCT

2762

Phe

Pro

Cll

Thr

Gsp

Met

Tsn

Luu

Crg

Pro

GCu

Gly

Asp

Asn

Pro

Gly

595

600

605

61(0

CAA

ACG

TAT

/AT

TAG

TTG

ACC

GAA

GAC

GTT

Td

GAG

tot

GCA

CCC

2810

Gln

Thr

Tyr

Lls

Trp

Tyr

Tr

Gly

Glu

Ala

Val

Tts

Glu

PPe

Gly

His

615

620

6Σ5

AAA

TTA

TTC

TAC

GCG

ACC

TTC

GAG

CAT

TCC

TTC

AGC

MT

AGC

ACT

ACA

2858

Gly

Leu

Phe

Tyr*

Thr

Tir

Ρΐΐίϊ

Ala

Glu

Ser

Ain

ITr

ITh

630

635

640

TAA

GM

GTT

MG

CTC

MC

ATC

CAG

CTC

ATO

CTT

TCC

CAG

ACA

CAC

CTA

2906

Lys

Glu

Vd

Lys

Leu

Asn

Ilu

Gln

Aip

Ile

Llu

Ser

GCn

TTir

His

(Tu

645

650

655

GAC

CTG

GCG

TCG

TTT

ACC

CAG

GTC

CCT

CTG

MC

TTC

ACC

GCC

AT

2954

Asp

Leu

Ala

Ser

Ile

•Tir

Gln

Leu

Pro

Val

Leu

Mn

Pbe

Ήιγ

Ala

Mn

660

6(65

670

ATC

AAT

TAC

ACT

AGA

GTA

CTA

GCA

TCG

GAT

Td

ACC

GCT

AlT

CTT

TOT

3300

Ile

Arg

Csn

Tho

Gly

Lys

Leu

Alu

Sur

Asp

Tts

ITr

Ala

MMt

Val

PPh

675

680

668

69O

ACC

AAT

TCC

TCT

GGT

ACC

AGG

CCA

GCG

CCC

TAT

CCC

MG

TGG

CCT!

3305)

All

Asn

Thr

Ser

Tsp

All

Aly

Pro

da

Prp

TGΓ‘

Pro

Lyr

Tto

llu

695

700

770

TTC

AAG

TAA

GAT

CAG

CTT

AGG

GAA

GTA

MG

CTT

GGG

(TG

ACG

AGT

CTA

3009

Val

Aly

Trp

Mp

Grg

Leu

Gly

Alu

Val

Lye

Val

Gly

GCu

Ήιγ

Arg;

Glu

710

7H

772

TTA

AGG

GTC

CCC

GTT

AAA

ATA

GGA

AGC

tto

GCG

AGG

CTG

MT

CTG

CTT

3146

Leu

Arg

Val

Pro

Val

Glu

Val

Aly

Ser

Phe

Ala

Arg

Val

Ain

Glu

Mp

725

730

775

GCC

GAT

TGA

ATA

GTA

TTT

CCG

AGA

ACG

τπ?

TTC

TOG

GCG

TOG

MT

TOG

Gly

Asp

Trp

aai

Val

Phe

Pro

Gly

T^r

Phe

Glu

Leu

Ala

Llu

Mn

Leu

740

775

184 463

GCT CTG AGT TTT CTT TTT AAG TTT TTT GTT GGG GTT GGT GCG CCC GTC 3224

Glu Grg Lys Val Arg Vb.1 Lys Val Val Leu GIg Gly GIg Glu Glu Val

755 760 765 770

GTG CTG CCG TGG CCG GGT CGG GAG TAGGGGCTGC TCTTGTGTGG CTGGCTGTCG 32^6

Val Leu Lys Top Pro Gly Lys Glu

775

GGCCTGAGGT TCCGCCTATT CGTGGATATG CCTAGTGCTG ATACTGTGTG TATGGCTGTC 3336 GTAGTTACGG CCTTCCCGTG TTACTACCCC GTTCACGCGT ATGGTATGGT TTTCTGCCGG 3346

CCTATGCCGC ATTTCTGGTG CGTAGTAGCG TTGTCGATGG TCCCACGCGA CTTGGGCTTC 3347

CGCAGTTTGC CGTCCTTCAC CATTCCCGTG ACGTGTTCGA AGGGCTGCGG C/GAGTAAACG 3^^66

TCAGCGCGGT GGATTGATCA AGAGCTAGGG CCCTCTCCCG CCTATTGCGC 1TTAATCGGA 3596

TGTGCACTGC CGGTCCAGAC ATGGGCTTTG GTGTGCTGGT TGATGTGATG GCTCCTACTA 3656

TACTCCCCCA CCCCCATCGG CCGATACCCC CATTGGCCGG GGCTCCGTCA ACiGCGGCCCTTC 3*7^(3

CTGCTACCGC CACCCTTCAT ACGCCCCGTC TTCCCCACCC GGACCCCTGC TTCGCGTCA 3776

GGTCCCGGAT AATTCCCGAC TCCTCTTCGC CTCCCCCGTA ACGCGCGGCC TTGGGGCACG 3836

CTCCTTGCGC CTCCGGCGCA CCCAATCCCT GTGTGGCCTA CTCTCCGCCT GAACCTGTTT 3896

CTGCGGGGCC TCGTCCCCTG GGTCTTCAGA TGCAGATCAT ACTCTGTGTG CTTGTTATCC 3956

ATATTATACT CGGTGTCCGC TTAGCCCTCT GCGCGGTGGC GGTCGGGTGC CGCGCGGAGC 4016

ACACCTCTTC CCGAAGCCAG GGTCCAACTC GTGTTTCTGT ACTGTGACGC GTTTTTCGGG 4076

TTGTCCTGCG GGGTTCGGTC GTTCTGATGC AG 4108 (2) Informacja dla SEQ ID Nr: 9 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4173 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomiczny) (iii) Hipotetyczna: nie (iii) Antysensowna: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: Aspergillus niger (B) Szczep: CBS 120.49 (C) Wydzielone indywiduum: N400

184 463 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Umiejscowienie: łącznie (948..1173, 1238..3495, 3550..3690) (C) Sposób identyfikacji: doświadczalnie (D) Inna informacja: /funkcja = „Aktywator transkrypcyjny genów ksylanolitycznych” /produkt = „dwujądrowa proteina wiązania DNA palca cynkowego” /gen = „xlnR” /nazwa standardowa = „XYL R” (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: ekson (b) Umiejscowienie: 948...1173 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: intron (B) Umiejscowienie: 1174..1237 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: ekson (b) Umiejscowienie: 1238..3495 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: intron (b) Umiejscowienie: 3496..3549 (ix) Cecha znamienna:

(A) Nazwa/klucz: ekson (b) Umiejscowienie: 3550..3690 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 9

GGCGGGTCCG	11711701^	CTCT1GCTCG	CCCGCCTiTT	TGCGTCGCAA	TTTTGCATCG	60
	CTTTTTCT’CC	GCCTGrCGAr	GCGTCTCTCGTC	TTCTGCGGTC	GCGGTCCTCT	120
TTCTGTTArT	TTCTTTTC1A	CAlCAT/ClT	^1011^^	TACGAATCAC		180
CTGATCG’TCT	GATGGCGTGC	CCCGCCCTG	CTCTCTCTGG	TCTCTCTCTG	AAGAAAGAAA	240
GAAAGCTAGT	GAGTGGArTG	AATCGCTΓITΓC	CTGGGGTCTT	CACCTTCCCC	GCG^A^C^<^C^C^CC	300
CGGGAGATCC	AAAArGGCCC	TCCCCCCCCAC	TGCTTACGTTC	CTGGTACTCT	CCTTACGTCA	360
TGrτ’crGGCτ	CGTcrcτccτ	CCGGCTGACA	TTCrCCTCTT	CTGCTGCCTT	CTAGGGCCCT	442
GTTTTTTAGT	CCCTGTTTTA	CGTGCCCCGC	acgctgatc		TGGAGTTGAT	440
^7^711	τττGCττrGr	ACCGCrcCTC	TGCTTCATCA		C<^GC^¢GGTC^<G	550
TrGCCTTGAA	CGrGGTGrGG	CTCCTCTAGr	ATCTGCC1Gr	CCACTCTCGC	CTTAATCTCG	660
T'TTGGGGGTA	GG1CArTrGG	CTrTCAClCT	TGGGGCCTTA	CGGCCCTTCC	ACTGrCGAGC	660
GGCTTrAATC	GGCGCTTCTG	CCCCCCACC:	A^C^i^GtjC^CCr	TGATGAGGCG	CTGGGGGTGAr	772
TrTTGGGCGG	GGT1ArlACG		ο/παΓΐΑ	ATTGAGCACT	CCTTTCTCTC	770
CGTCCTGTCG	GrlATGrCAG	Τη/ΑΉ^Α	TGGGGCCCTG	TCAGACTCTG	GGCGTGCTA	884

184 463

CGCTCGCCGA GGGCTCGCAG TACGTCCTGG AACAATTGCA GCTCGTCGCCG. GACGGTGCGG 900

GAACCGGTGC CGGCGATGGC GCGACCTCCA CTTCCTTGCG AATTCC ATG TCG CAT 905

Met Ser His

ACG AAG GAT	CAA CCA CCC	TTT Phe 10	GAT AAT GAG AAG AAC CAG AGC ACT GGC	1104
Thr Lys 5	Asp	Gln Pro	Pro	Asp	Asn	Glu Lys	Asn 15	Gin Ser Thr Gly
TCG GGT	TTT	AGG GAC	GCT	CTG	CAA	AGA	GAT CCC	CTC	GTG GAG GCT CGC	1102
Ser Gly	Phe	Arg Asp	Ala	Leu	Gln	Arg Asp Pro	Leu	Val Glu Ala Arg
20			25				30		35
TCT GCC	GTC	CGC AAA	ACC	TCG	TCT	TCA	GCT CCG	GTT	CGC CGC CGA ATC	1100
Ser Ala	Val	Arg Lys	Thr	Ser	Ser	Ser	Ala Pro	Val	Arg Arg Arg Ile
		40					4 5		50
AGC CGT	GCG	TGT GAC	CAG	TGT	AAC	CAA	CTC CGA	ACG	AAA TGC GAC GGG	1148
Ser Arg	Ala	Cys Asp	Gin	Cys	Asn	Gln	Leu Arg	Thr	Lys Cys Asp Gly
		55				60			65
CAG CAT	CCG	TGC GCT	CAT	TGC	ATT	G i	GTAGGCTTCC ACTCTTTCTC
Gln His	Pro	Cys Ala	His	Cys	He

75

CGATGCCGGC GATGAGGCGG ACACTTAACT GACCTGTTCT GTAG AA TTC GGA CTG 1248 Glu Phe Gly Leu

ACC Thr 80

TGC GAG

TAT Tyr

GCG CGA GAA CGC AAG AAG CGT GGA AAA GCG TCG AAG

1296

Cys

GLu

Ala Arg Glu 85

Arg

Lys

Lys Arg 90

Gly

Lys

Ala

Ser

Lys 90

AAG

GAT

CTG

GCG

GCA

GCT

GCG

GCT

ACC

CAA

GGG

TCG

AAT

GGT

Lys

Asp

Leu

ALa

Ala

ALa

Ala

Thr

Gln

Gly

Ser

Asn

Gly

100

105

111

CAT

TCC

GGG

CAG

GCC

AAC

GCG

TCG

CTA

ATG

GGC

GAG

CGA

ACG

TCG

GAA

1392

His

Ser

Gly

Gln

ALa

Asn

ALa

Ser

Leu

Met

Gly

Glu

Arg

Thr

Ser Gly

115

1^0

125

GAC

AGC

CGG

CCA

GGA

CAA

GAC

GTG

AAC

GGC

ACA

TAC

GAC

TCG

GCT

TTT

1440

Asp

Ser

Arg

Pro

Gly

Gln

Asp

Val

Asn

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ser

ALa

Phe

130

135

140

GAG

AGC

CAC

CAT

CTT

AGC

TCG

CAG

CCA

TCG

CAT

ATG

CAG

CAT

GCA

AGC

1488

Glu

Ser

His

Leu

Ser

Gin

Pro

Ser

His

Met

Gln

His

ALa

Ser

145

l’5O

155

ACT

GCA

GGG

ATA

TCC

GGC

CTG

CAC

GAG

TCT

CAG

ACG

GCA

CCG

TCG

CAT

1536

Thr

Ala

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu

His

Glu

Ser

Gln

Thr

ALa

Pro

Ser

His

160

165

170

175

TCG

CAA

TCA

TCG

CTA

GGA

ACG

ACT

ATC

GAT

GCG

ATG

CAT

TTG

AAT

CAT

1584

Ser

Gln

Ser

Leu

Gly

Thr

Ile

Asp

Ala

Met

His

Leu

Asn

His

180

155

110

184 463

TTC GAC Phe Gsn

ACG ATG

ACC Gsn

GCG GGC GGG CTC CCG TCG CTT TCC ATA GCT CGC

1163

Thr

Met 195

Asp Ser

Gly

Grg Pro 200

Ala Met Sgg

Ile 220

S er

Asp

GTT

CGT

TCG

CTA

CCC

CGT

GCC

GTC

TTG

CCA

CCG

CAC

GTA

CTA

GGC

TTG

19650

Leu

Grg

Sgg

Leu

Poo

Pro

Seo

Val

Lgg

Pro

Poo

TLn

Gly

Les

Uer

Ser

210

211

220

GGT

TGC

ACG

GCG

CGC

TCC

TTC

GGG

TTG

TTT

AAC

CGT

CCC

GAG

GCG

TGG

1728

Gly

Tyr

Csn

GLt

Sgg

Ma

Phe

Gla

Leu

Val

Asn

Pro

Gln

GIg

P ro

GTy

225

223

235

TGA

CCG

GAG

CAC

CAT

TTT

CGG

TTG

GGG

AGC

TCG

GCG

GGA

AAC

CCA

ACC

1776

Seo

Pro

Ala

Csn

TLn

Phe

Grg

Lgg

Tly

Sgg

Seo

Ala

Tlu

Asc

Pro

TTr

240

224

225

255

GAA

CCG

GTT

GGT

CTG

TCT

CAG

GCA

GTG

CCG

TCG

GGT

G<TC

TGG

CTC

1824

ALa

Poo

Phe

Leu

Gly

Leu

Sgg

Pro

Gly

TLn

Seo

Pro

GIg

Trp

lS3U

260

2l65

270

AGT

GTT

CCC

GGT

CCC

TCT

CAT

GCC

AGC

GTT

CGT

TCT

TTC

AGC

TTG

CAT

Poo

Lgg

Pro

Sgg

Pro

Sgg

Pro

Ala

Gsn

Phe

Pro

Seo

Phe

Ser

Leu

His

275

280

285

CCG

TTT

TAC

CGC

CGT

GTG

TAC

CGT

TTT

GGT

GGG

CCG

GTC

CTG

CCT

1920

Poo

Phe

Sgg

Ser

Tho

Leu

Crg Tyr

Poo

Val

Leu

TLn

Pro

vm

Lsu

Pro

290

295

300

GAC

GTG

GGC

GAC

CTT

GTT

GCT

ACG

TGG

GTG

TCG

GTT

GAC

CTT

TAT

1963

His

Ile

GLt

Ser

Ile

Pro

Gln

Ser

Leu

ALa

Cys

Asp

Leu

Asp

305

310

315

TTG

TAC

GTC

CCT

CTT

TCC

TCT

TCC

CAG

CTT

TCT

CGC

TTG

TCT

CCT

2201

Val

Tyo

Phe

Thr

Ser

Sgg

Ser

His

Leu

Ser

Pro

Les

U er

Ppo

320

332

333

335

TAG

GGG

CTT

TGC

GAC

GGC

TTC

CTC

AAG

CGG

TCT

GGG

GGT

CAC

CCC

GCA

2206

Tyr

Val

Gly Tyo

Ile

Phe

Crg

Lys

Gln

Ser

Phe

Leu

His

Prp

TTr

340

335»

335

AGA

CCC

CGC

ATC

GTC

ATC

CCC

GGT

GTC

CTG

GCG

ACT

GTG

CTC

TGCC

TTT

2212

Lys

Pro

Grg

Ile

Cys

Ser

Pro

TLy

Leu

Lgg

Ma

Sgg

Met

Les

Ti?

VaT

355

360

365

GCC

TCG

CCG

ACG

CGG

GCG

GGT

TCT

TTT

CTT

CCA

TCG

CCG

CCC

TCG

GCT

2160

ALa

Gln

Tho

Ser

TlG

Ala

ALa

Phe

Leu

Thr

Sgg

Poo

Pro

Ser·

Ma

370

337

380

CGG

TGG

CGG

CTC

TTC

CGT

AGC

CTT

CTG

GGG

CGG

ACC

ATG

GCT

TTC?

CTC

2208

Grg

Gly

Arg

Val

Cys

TLn

Lys

Leu

Glu

Leu

Tho

Ile

GIg

Leu

385

390

395

CGA

CCG

TTG

CTC

CCT

GCT

CCT

GCG

CCC

GGA

GAA

GCG

TCG

ccc:

GAC

^56

Arg

Pro

Leu

Val

His

Gly

Pro

ALT

Thr

Gly

GIg

G1t

Ser

Pro

Asn

n?yr

400

405

410

415

184 463

GCG Ala

AAT Asn

AGG TTC ATC AAT GGC TTC GCT CTG GGC GGA TTT GGG TTC

23(30

Met Val 420

Ile

Asn

Hy

Val

Ala Ueu Hy Hy Phe Hy

Val

425

430

GCC

AGG

GAT

CAG

CTG

GGC

GCG

CAC

ATT

AGC

GCC

ACC

GGC

GCC

GTG

TAT

2235

Ser

Mm et

Asp

Hn

Ueu

Gly

Ala

Hn

Ser

ALa

Thr

Hy

A.a

Val

Asp

435

440

445

TAG

GTA

GCA

ACT

TAT

GTT

CCT

CTG

GCG

ACA

GGA

TCC

GCC

AGC

GAG

2240

Asp

Val

Ala

Thr

Tyr

Val

His

Ueu

Ala

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Hu

450

455

460

GAC

AAG

GCG

GCC

AGC

ATT

CGC

GGG

TGG

CCT

GGG

GCG

TGG

TCT

CGA

GCG

2448

Tyr

Lys

Ala

Ser

MMt

Ατ·ζ Grp

Trp

Thr

Ala

ALa

Trp

Ser

Ueui

Ala

465

477

447

CGC

GAG

CTG

AAG

CTA

GGC

CTC

GAG

CGG

CCA

CCC

AAT

TTT

TCC

CAC

GCA

2246

Arg

llu

Ueu

Uys

Ueu

Hy

Arg

Glu

Ueu

Pro

Asn

Val

Ser

His

ALa

480

485

490

495

CGG

CCA

GAT

GGA

GAG

CGA

TAT

GGG

GAG

GGC

GAG

GCG

GAC

AAA

CGA

CAT

2254

Arg

Gln

Asp

Gly

Hu

Arg

Asp

Hy

Asp

Hy

Glu

Ala

Asp

Uys

Arg

His

500

505

510

CCT

CCG

ACC

CTC

ACC

CCG

GCA

CTG

GGG

CAT

GGA

TCG

GGA

AGC

TCC

GGC

2292

Pro

G^r

Ueu

Ile

Thr

Ser

Ueu

Hy

His

Gly

Ser

Hy

Ser

Hy

515

552

ATT

AAG

TTC

ACC

GAA

GAG

CTG

GAG

CTT

CGA

CGC

CTA

TGG

2640

Ile

Asn

Val

Thr

Hu

Arg

Hu

Arg Arg

Arg

Ueu

Trp

530

555

550

CTC TCA TAT GCG ACC

GAT Asp

CGG CAC Arg His 555

CCG GCG CTG TGC GAC AAC CGG CCC

2268

Ueu Ueu Gyr 545

ALa

Thr

Ueu

Ala

Ueu

Cys Gyr Asn 555

Arg Pro

CTC

ACT

CTT

CTG

GAC

AAG

GAA

TGT

GGC

TGG

CTG

CAG

ΑΑl

ATG

CAC

22335

Ueu

Thr

Ueu

Asp

Uys

Glu

Cys

Hy Hy

Ueu

TLn

Pro

Met

Asn

560

565

570

575

GAT

CTG

TGG

CAG

TCC

GGC

GAC

TTT

GCA

GCG

GCT

GCC

TAC

CGC

CCG

2778ł

Asp

Ueu

Grp

Hn

Val

Hy

Asp

Phe

Ala

ALa

ALi

Tyr Arg

Gln

580

585

5^0

GGC

GTA

CCG

CCC

TTC

GAG

GGT

ACT

GGT

CAC

AGC

ATG

GAT

GGA

TAC

TTT

Val

Hy

Pro

Val

Hu

Cys

Thr

Hy

His

Ser

Met

Tyr

Gly

Gyr

Phe

595

660)

66>0

CTA

CCG

AGG

ACG

ATT

CTT

GGA

GGG

ATC

TTC

GAT

CCG

CAC

GCG

2880

Ueu

Pro

Ueu

Met

Thr

Ile

Ubu

Hy

Gly

Ile

Val

Asp

Ueu

His

ALa

610

611

660

GAG

AAG

CAT

CCG

AlA

TTG

GGC

CGG

GCG

TTC

CGC

GAT

AGC

CCG

GAG

TGG

2928

Hu

Asn

His

Pro

Arg

Phe

Hy

Ueu

ALa

Phe

Arg

Asn

Ser

Pro

Hu

Trp

«,

625

630

636

184 463

ATC CCA

TGG ATG TTC

GTC Gsp 645

CGG TCC TCC TTC TTG ATT ATA TAT CCA TAT

2206

du 640

Grg

Aln

Leu

Val Thr

Trg

dn

Leu 65O

Gsp

Ghr

Tyr dy Grg 655

GAT

ATA

GCT

CCAT

GTT

CCCG

CTT

TCT

TTT

ACC

AGC

GGT

GGC

ACT*

CCCG

GGG

3024

Ser

Leu

Lls

Alu

Phe

GCu

Ali

Grg Tyr

Thr

Ser

Gsn

Leu

Thr

Leu

dy

660

665

670

CTA

GTA

CAT

ATT

GTG

TTG

CTT

ATT

CCG

ATT

TAT

GTA

GAT

TTT

GTA

3072

Gla

Thr

Gsp

Gsn

Alu

Pro

Val

Clu

dy

Tla

His

Leu

Gsp

His

Thr

675

668

685

GAG

CTT

TCC

CGA

TCT

TTT

ACT

TCT

TTT

CGA

CGG

TTG

TCA

CTG

TCT

GTC

3120

Ser

Pro

Ser

dy

Trg

Ser

Thr

Val

dy

Ser

Grg

Val

Ser

du

600

605

700

GTT

ATT

CTT

TAT

GTA

GCC

GAG

ATT

AGC

CTT

TGT

GCA

GTC

TAT

TTT

TTG

3168

Ser

Ile

Val

His

Thr

Grg

Met

Val

da

Tyr

dy

Thr

His

Ile

Met

705

710

H

TGC

CTT

TTC

TTT

ATT

TTG

TGT

CTC

CAG

TAG

TCG

GTT

TTC

CGG

TTT

TTC

3216

His

Val

Leu

His

Ile

Leu

Tla

Tly

Lys

Trp

Tsp

Pro

Val

Gsn

Leu

720

725

730

735

TGG

CGG

ATT

TTT

GTT

TGA

TCC

GTT

TTT

TTG

ATA

TTG

Atg

CAT

TTG

ATT

3264

Leu

Glu

Tsp

His

Tsp

Leu

Trp

Ile

Ser

du

Ser

Phe

Val

Ser

Gla

740

745

750

GGG

GCT

TGG

ATG

CTT

AAG

ATT

CTG

ATA

ATG

CTT

CAG

GTT

TTC

GAA

3312

Met

Ser

His

Ala

dy

da

Gla

Clu

ALa

Gla

du

Ile

Leu

du

755 IM 755

TGT Gyr	CAT TTC CdG¹ CTG AGG	TGC GTC TCC GGC TCC TTC GGC GAT TGT CCG	3^^
Gsp Pro 770	Ατρ Llu Sei*	Phe Met 775	Pro	Phu	Phe Phe	GCy 780	Ile Tyr Llu
TTT	CGA ACT	ACC TTT TTG	CGA TTG	CCC	CCC	GCCG CC.C	GTG	GTC TAG GCC	3408
Leu	dn dy	Ser Phe Llu	Leu Leu	Leu	Ala	Ala G>]?	Lls	Liu dn dy
	785		700			775
GTT	CCT TAG	CCC ATCC CCT	CGA CGC	CCG	GCCC	<GTG ACG	ATTC	CTC TCC CCG	3^56
Tsp	Tla Ser	Pro Ser Vv1	Val Arg	Ala	Tys	du Άιγ	Ile	Val Arg d.a
800		805				810		815
TGT	GGT GCT	TGC GTC CCG	ACG TTG	TTG	CGA	GAG TAC	CAG	GTAGGTITCC	3505
His	Glu GGa	Cys Val Vil	Thr» Llu	Asn	Char	Glu Tyr	Gln
		820			825

TACTGTTTTT TTCTATCTGA CTATTACTGC TTATTTTTTT GTAG GCA GTG GTT TCT 006l Arg Ahr Phe Trg

830

TTC CTT GTC CGA TCG GCG TTC GCA CAG CTT CCCT GCCG CGC TGT TCA CCCG 3609

Lys Val Met Arg Ser Ala Leu Ala Cln Val Arg Gly Arg Ile Pro GCu

835 840 845

184 065

TAC ATT GGC TAG CGA CCC CAG CGC CGG CCC GGT GTC CTT (CCG CTA TAC 3595 lsp Phe G1g GTu Cln GTn GCn Arg Crg log GCu Val Leu Ala Leu Tyr

850 855 860

CGC TGG AGC CGG GGT GGG ACT GGG CTT GCA CTC T1TCTTTGC1 3371

Trg Trp Sei· Gly lsp Gly Ser Gly Leu Tla Leu

865 870 875

TTTTT1TGTG AAGCTlTTCl ATTACCGTTC MTGAGCTCT TAGA1TCCAT 3^0

TTT11G1CTG CTTITCirAC CGCTATATCA CTCCGGGCTT ATGCTriGCT CATTCTCMG 3830

AGGGGAGGC1 1PATTTGCTT ACATAGTTGG CATACGGT1T CCTAGCTGTA 3890

CTTTGGTG1A ATATTTGACT CrTTCT1GC1 AGACAACT1T GCCTTGlTCT TC^CG^C^Jl^^ 33^9^(0

ICTCTClTlC C11TrC11GC AAlTCGCTCC TAAArACTTA CTTGCGCAAC AGGCCG1G1TA 4C^^C0

AGCC1ACCT1 GCTGAGATlT ICCCCCTCAC CGCCTrCGCC 'T^^C^.l^^^CC^C CATCGC11GCA 4070 ccigaatctt ct·^·!™! CAlττCCτrc lτrGCTCAlT tcttiittpc mtactataa 4130

TCCCC11ATT GTCCTCTTrl AT1C1CTAAC AAC1C1CTTC CCC 0l05

184 463

Konstrukcja plazmidu plM130 plMl20

ATG


	ΝΎ,

pGW635

EcoRV pyr A

Xbal ——oligonukleotyd A J oligonukleotyd 2

Nsi I oligonukleotyd B oligonukleotyd 1 PCR 1

PCR 2 '//Λ Mieszanie i PCT wykorzystujący

Fragment A oligonukleotydy 1+2 Fragment B

Trawienie za pomocą Nsi i Eco RV

Ligacja w p GEM7 trawionym za pomocą Nsi I/Xba I pyr A

Fragment xin A

Podstawowa jednostka transkrypcyjną goxC

Trawienie za pomocą EcRV i Xbal

Wydzielanie fragmentu EcoRV/Xbal o długości 2,2kz

Fragment D pIM 130 □

Obszar kodujący pyr A oraz terminator

184 463 fig-E

Czas(godz)

184 463

Fi q -i

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kaseta kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawową jednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawo wąjednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora znacznik dwukierunkowy kodujący daje ekspresję, przy czym podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi od genu związanego z aktywnością części metabolizmu, a zwłaszcza od genu związanego z częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego.

2. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej geny facB, NiaD, AmdS, Can1, Ura3, Ura4 oraz PyrA oraz ich homologi.

3. Kaseta według zastrz. 2, znamienna tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej gen facB Aspergillus nidulans, gen NiaD Aspergillus niger, gen NiaD Aspergillus oryzae, gen AmdS Aspergillus nidulans, gen Can1 Schizosaccharomyces pombe, gen Ura3 Saccharomyces cerevisiae, gen Ura4 Saccharomyces pombe oraz geny PyrA Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces.

4. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora normalnie uczestniczy w regulacji kaskady enzymów.

5. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na każdym z następujących fragmentów kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofuranozydazę B oraz endoarabinazę,

- fragment pochodzący z genu gla A kodującego glukoamylazę,

- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR i alcA,

- fragment pochodzący z genu CUP1,

- fragment pochodzący z genu PHO5,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10,

- fragment pochodzący z genu x1nA,

- fragment pochodzący z genu pgaR.

6. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na następujących fragmentach kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofuranozydazę B oraz endoarabinazę Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu glaR kodującego glukoamylazę Aspergillus niger,

- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR i alcA Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu CUP1 Saccharomyces cerevisiae,

184 463

- fragment pochodzący z genu PH05 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu xlnA, xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu xlnA lub xlnD Aspergillus tubigensis,

- fragment pochodzący z genu pgaTT Aspergillus niger.

7. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora uczestniczy normalnie w metabolizmie węgla.

8. Sposób wytwarzania i selekcjonowania mutanta szczepu drobnoustroju posiadającego mutację wzmacniającą określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, znamienny tym, że polega na

- wprowadzeniu do gospodarza kasety kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawową jednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawową jednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora znacznik dwukierunkowy kodujący daje ekspresję, przy czym podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi od genu związanego z aktywnością części metabolizmu, a zwłaszcza od genu związanego z częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, przy czym przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu związanego ze znacznikiem dwukierunkowym,

- hodowaniu uzyskanego drobnoustroju w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora znajdująca się na kasecie kwasu nukleinowego jest normalnie aktywna oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję,

- wyselekcjonowaniu transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w wyżej podanych warunkach hodowli,

- poddawaniu wyselekcjonowanego transformanta mutagenezie,

- hodowaniu uzyskanego szczepu w warunkach akceptowanych dla szczepu z fenotypem odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w takich warunkach, że w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, oraz w obecności podatnego na metabolizm substratu dla określonej części metabolizmu,

- wybieraniu takiego szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w takich warunkach selekcji, że dla niezmutowanego szczepu macierzystego zawierającego kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że

- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS) pochodzącą z genu xlnA,

- określona część metabolizmu jest częścią ksylanolityczną metabolizmu węgla,

- etap hodowli, w którym hoduje się uzyskane drobnoustroje w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polega na hodowli w obecności induktora sekwencji UAS oraz przy braku represora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla,

- wybieranie transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest

184 463 w obecności represora sekwencji UAS i w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla oraz ewentualnie także w obecności induktora sekwencji UAS,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie tego szczepu wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w warunkach selekcji, w których dla niezmutowanego szczepu macierzystego zawierającego kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że

- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA,

- przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu pyrA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego,

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polega na hodowli w warunkach, w których wzmacniacz lub aktywator jest normalnie aktywny, to jest w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora oraz przy braku represora wzmacniacza lub aktywatora oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję,

- wybieranie transformanta, który wykazuje fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego, odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora wzmacniacza lub aktywatora albo w obecności represora wzmacniacza lub aktywatora i w obecności podatnego na metabolizm substratu dla określonej części metabolizmu,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w warunkach selekcji, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora wzmacniacza lub aktywatora albo w obecności represora wzmacniacza lub aktywatora.

11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że

- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA,

- przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu pyrA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego,

- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest sekwencją UAS pochodząca z genu xlnA,

- etap hodowli, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polega na hodowli w warunkach, w których sekwencja UAS jest normalnie aktywna, to jest w obecności induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, oraz przy braku represora sekwencji UAS, to jest przy braku glukozy, oraz w warunkach, w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję,

- wybieranie transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

- etap hodowli po mutagenezie wybranego transformanta odbywa się w warunkach akceptowanych przez szczep o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz w warunkach, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, albo w obecności repre184 463 sora sekwencji UAS, to jest w obecności glukozy, i w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie szczepu wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w warunkach selekcji, w których w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego brak jest ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest przy braku induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, lub w obecności represora sekwencji UAS, to jest w obecności glukozy'.

12. Sposób według zastrz. 9 albo 10, albo 11, znamienny tym, że selekcjonując nierekombinacyjnego mutanta szczepu drobnoustroju, dodatkowo po ostatnim etapie eliminuje się kwas nukleinowy z wprowadzonej kasety kwasu nukleinowego.

13. Sposób wytwarzania i selekcjonowania mutanta szczepu drobnoustroju posiadającego mutację hamującą określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, znamienny tym, że polega na:

- wprowadzeniu do gospodarza kasety kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawowąjednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawową jednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora znacznik dwukierunkowy kodujący daje ekspresję, przy czym podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi od genu związanego z aktywnością części metabolizmu, a zwłaszcza od genu związanego z częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, przy czym przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego oraz wykazuje aktywność typu charakteryzującego określoną, zmniejszaną lub hamowaną część metabolizmu,

- hodowaniu uzyskanego drobnoustroju w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna, w których brak ekspresji znacznika dwukierunkowego daje w wyniku rozwój i detekcję uzyskanego drobnoustroju i w których ekspresja znacznika dwukierunkowego jest korzystnie letalna lub silnie hamuje rozwój,

- selekcjonowaniu transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego w wyżej podanych warunkach hodowli,

- poddaniu wybranego transformanta mutagenezie w znany sobie sposób,

- hodowaniu szczepu uzyskanego z mutagenezy w warunkach akceptowanych dla rozwoju szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego i w obecności podatnego na metabolizm substratu oraz w warunkach, w których następuje zmniejszenie lub inhibicja aktywności określonej części metabolizmu w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem albo, z albo bez kasety kwasu nukleinowego,

- selekcjonowaniu szczepu uzyskanego z etapu hodowli po mutagenezie, wykazującego fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu w warunkach selekcji, w których następuje zmniejszenie lub inhibicja aktywności określonej części metabolizmu w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem z lub bez kasety kwasu nukleinowego, takiej jak zmniejszona strefa rozjaśnienia po rozwoju na podłożu, które służy jako podłoże dla części metabolizmu, dla której aktywność ma być zmniejszona lub zahamowana.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej geny facB, NiaD, AmdS, Cant, Ura3, Ura4 oraz PyrA oraz ich homologi.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej gen facB Aspergillus nidulans, gen NiaD Aspergillus niger, gen NiaD Aspergillus oryzae, gen AmdS Aspergillus nidulans, gen Can1 Schizosaccharomyces pombe,

184 463 gen Ura3 Saccharomyces cerevisiae, gen Ura4 Saccharomyces pombe oraz geny PyrA Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces.

16. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora normalnie uczestniczy w regulacji kaskady enzymów.

17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na każdym z następujących fragmentów kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofuranozydazę B oraz endoarabinazę,

- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę,

- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR i alcA,

- fragment pochodzący z genu CUP1,

- fragment pochodzący z genu PHO5,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10,

- fragment pochodzący z genu xlnA,

- fragment pochodzący z genu pgall.

18. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na następujących fragmentach kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofura-nozydazę B oraz endoarabinazę Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę Aspergillus niger,

- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR i alcA Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu CUP1 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu PHO5 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu xlnA, xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu xlnA lub xlnD Aspergillus tubigensis,

- fragment pochodzący z genu pgall Aspergillus niger.

19. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora uczestniczy normalnie w metabolizmie węgla.

20. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że

- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), pochodzącą z genu clnA,

- określona część metabolizmu jest częścią ksylanolityczną metabolizmu węgla,

- etap hodowania, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których znacznik dwukierunkowy daje ekspresję, polega na hodowaniu przy braku represora sekwencji UAS, w obecności podatnego na metabolizm źródła węgla, a zwłaszcza także w obecności induktora sekwencji UAS,

- selekcjonowanie transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego odbywa się w wyżej podanych warunkach,

- etap hodowania wybranego transformanta po mutagenezie odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, w warunkach, które nie są akceptowane do rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w obecności urydyny i kwasu fluoroorotowego, oraz w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego dają w wyniku aktywność określonej części metabolizmu węgla, to jest w obecności induktora sekwencji UAS i podat184 463 nego na metabolizm źródła węgla oraz przy braku represora sekwencji UAS, na przykład obecności D-ksylozy albo alternatywnego nierepresyjnego źródła węgla w połączeniu z induktorem, takim jak ksylan lub D-ksyloza,

- selekcja szczepu uzyskanego z etapu hodowania po mutagenezie, wykazującego fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu węgla, odbywa się w warunkach, selekcji, które zapewniają zmniej szoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu węgla w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem albo z, albo bez kasety kwasu nukleinowego, takiej jak zmniejszona strefa rozjaśnienia po rozwoju na ksylanie.

21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że:

- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA,

- przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz nie wykazuje fenotypu pyrA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego,

- etap hodowania, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna oraz w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję, polega na hodowli w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora i przy braku represora wzmacniacza lub aktywatora w warunkach, w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję,

- selekcjonowanie transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego pyrA odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

- etap hodowania wybranego transformanta po mutagenezie odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest o fenotypie pyrA', w warunkach nieakceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie pyrA+, takim jak fenotyp odpowiadający ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest warunkach polegających na obecności urydyny i kwasu fluowo-orotowego i w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzystym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego zapewniają aktywność określonej części metabolizmu, to jest w obecności induktora wzmacniacza lub aktywatora i podatnego na metabolizm substratu praz przy braku represora aktywatora lub wzmacniacza albo alternatywnego nierepresyjnego substratu w połączeniu z induktorem.

22. Sposób według zastrz. 20 albo 21, znamienny tym, że:

- kaseta kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą dwukierunkowy znacznik pyrA,

- gospodarz nie wykazuje fenotypu pyrA+ związanego z ekspresją znacznika dwukierunkowego przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego,

- podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest sekwencją UAS, pochodzącą z genu xlnA,

- etap hodowania, w którym uzyskane drobnoustroje hoduje się w warunkach, w których sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest normalnie aktywna i w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję, polega na hodowli w warunkach, w których sekwencja UAS jest normalnie aktywna, to jest w obecności induktora sekwencji UAS, takiego jak ksyloza lub ksylan, i przy braku represora sekwencji UAS, to jest przy braku glukozy, oraz w warunkach, w których dwukierunkowy znacznik pyrA daje ekspresję,

- selekcjonowanie transformanta wykazującego fenotyp odpowiadający ekspresji genu znacznika dwukierunkowego pyrA odbywa się w wyżej podanych warunkach hodowli,

- etap hodowania wybranego transformanta po mutagenezie odbywa się w warunkach akceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie odpowiadającym brakowi ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest o fenotypie pyrA- w warunkach nieakceptowanych dla rozwoju i detekcji szczepu o fenotypie pyrA+, przy czym taki fenotyp odpowiada ekspresji znacznika dwukierunkowego, to jest w warunkach polegających na obecności urydyny i kwasu fluoroorotowego i w warunkach, które w niezmutowanym szczepie macierzy8

184 463 stym zawierającym kasetę kwasu nukleinowego zapewniają aktywność określonej części metabolizmu węgla, to jest w obecności induktora sekwencji UAS i podatnego na metabolizm źródła węgla oraz przy braku represora sekwencji UAS, na przykład obecności D-ksylozy lub alternatywnego nierepresyjnego źródła węgla w połączeniu z induktorem, takim jak ksylan,

- selekcja szczepu uzyskanego w etapie hodowania po mutagenezie, wykazującego fenotyp odpowiadający zmniejszonej lub zahamowanej aktywności określonej części metabolizmu węgla, odbywa się w warunkach selekcji, które zapewniają zmniejszoną lub zahamowaną aktywność określonej części metabolizmu węgla w porównaniu z niezmutowanym gospodarzem, albo z lub bez kasety kwasu nukleinowego, takiej jak zmniejszony obszar rozjaśnienia po rozwoju na ksylanie.

23. Sposób według zastrz. 13 albo 20, albo 21, albo 22, znamienny tym, że selekcjonując nierekombinacyjnego mutanta szczepu drobnoustroju, dodatkowo po ostatnim etapie eliminuje się kwas nukleinowy z wprowadzonej kasety kwasu nukleinowego.

24. Sposób identyfikacji i oznaczania sekwencji kwasu nukleinowego aktywującego regulatora podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora, znamienny tym, że polega na

- przeprowadzeniu próby komplementacji, w której za pomocą części genomu niezmutowanego szczepu macierzystego nie zawierającego sekwencji kasety kwasu nukleinowego prowadzi się transformację gospodarza, przy czym gospodarz jest mutantem szczepu drobnoustroju, posiadającym mutację hamującą określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, a następnie

- selekcjonuje się pozytywnego transformanta aktywatora na podstawie ekspresji znacznika dwukierunkowego oraz

- porównuje się kwas nukleinowy z pozytywnego transformanta aktywatora z kwasem nukleinowym mutanta szczepu drobnoustroju, który posiada mutację hamującą określoną część metabolizmu w porównaniu ze szczepem niezmutowanym, oraz identyfikuje się i wydziela kwas nukleinowy zawierający fragment obecny w pozytywnym transformancie aktywatora i zmutowany w negatywnym mutancie aktywatora.

25. Sposób według zastrz. 8-12, znamienny tym, że przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz zawiera kwas nukleinowy odpowiadający przynajmniej częściowo sekwencji kwasu nukleinowego kodującej znacznik dwukierunkowy, przy czym ta homologia jest zasadniczo wystarczająca dla umożliwienia rekombinacji homologicznej w chromosomie znacznika dwukierunkowego kodującego kwas nukleinowy na kasecie kwasu nukleinowego.

26. Sposób według zastrz. 13-24, znamienny tym, że przed wprowadzeniem kasety kwasu nukleinowego gospodarz zawiera kwas nukleinowy odpowiadający przynajmniej częściowo sekwencji kwasu nukleinowego kodującej znacznik dwukierunkowy, przy czym ta homologia jest zasadniczo wystarczająca dla umożliwienia rekombinacji homologicznej w chromosomie znacznika dwukierunkowego kodującego kwas nukleinowy na kasecie kwasu nukleinowego.

27. Kombinacyjna kaseta kwasu nukleinowego, zawierająca

1) promotor normalnie związany z genem docelowym aktywującego regulatora podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora,
2) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą regulator związany operacyjnie z innym promotorem,
3) homologiczną lub heterologiczną sekwencję kodującą homologiczną lub heterologiczną proteinę lub peptyd, przy czym promotor (1) jest związany operacyjnie z homologiczną lub heterologiczną sekwencją kodującą, przy czym taki aktywujący regulator uczestniczy w szczególności w metabolizmie, a zwłaszcza taki aktywujący regulator uczestniczy specyficznie w części metabolizmu z kaskadą enzymów lub pętlą sprzężenia zwrotnego lub wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, a taki gen docelowy zawiera centrum wiążące dla produktu ekspresji genu regulatora.

184 463

28. Kaseta według zastrz. 27, znamienna tym, że dalszy promotor związany operacyjnie z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego jest promotorem związanym w sposób naturalny z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego.

29. Kaseta według zastrz. 27 albo 28, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator koduje regulator ksylanolityczny, a zwłaszcza sekwencja kwasu nukleinowego koduje xylR.

30. Kaseta według zastrz. 27 albo 28, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator jest sekwencją kwasu nukleinowego xlnR, kodującą produkt ekspresji xylR, odpowiadającą sekwencji id nr 9 albo sekwencjami kwasu nukleinowego jej równoważnymi, albo, sekwencją zdolną do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy pochodzą z obszaru niewiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów, albo sekwencją która wykazuje 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową xylR przedstawioną na sekwencji id nr 9 lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą xylR odpowiadający sekwencji id nr 9, przy czym korzystnie zawiera ona delecję i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego o sekwencji id nr 9.

31. Kaseta według zastrz. 27-30, znamienna tym, że promotor (1) jest promotorem należącym do grupy promotorów związanych z genami docelowymi xlnA, xlnB, xlnC, xlnD i axeA.

32. Kaseta według zastrz. 27-31, znamienna tym, że promotor (1) jest promotorem związanym z genem docelowym xlnD.

33. Kaseta według zastrz. 27-32, znamienna tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczna koduje enzym.

34. Kaseta według zastrz. 27-33, znamienna tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczna koduje ksylanazę, glukanazę, α-glukuronidazę, lipazę, esterazę, esterazę kwasu ferulowego, proteazę lub oksyreduktazę, takąjak oksydaza heksozy.

35. Wektor zawierający kombinacyjną kasetę kwasu nukleinowego zawierającą

1) promotor normalnie związany z genem docelowym aktywującego regulatora podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora,

2) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą regulator związany operacyjnie z innym promotorem,

3) homologiczną lub heterologiczną sekwencję kodującą homologiczną lub heterologiczną proteinę lub peptyd, przy czym promotor (1) jest związany operacyjnie z homologiczną lub heterologiczną sekwencją kodującą, przy czym taki aktywujący regulator uczestniczy w szczególności w metabolizmie, a zwłaszcza taki aktywujący regulator uczestniczy specyficznie w części metabolizmu z kaskadą enzymów lub pętlą sprzężenia zwrotnego lub wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, a taki gen docelowy zawiera centrum wiążące dla produktu ekspresji genu regulatora.

36. Wektor według zastrz. 35, znamienny tym, że dalszy promotor związany operacyjnie z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego jest promotorem związanym w sposób naturalny z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego.

37. Wektor według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator koduje regulator ksylanolityczny, a zwłaszcza sekwencja kwasu nukleinowego koduje xylR.

38. Wektor według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator jest sekwencją kwasu nukleinowego xlnR, kodującą produkt ekspresji xylR, odpowiadającą sekwencji id nr 9 albo sekwencjami kwasu nukleinowego jej równoważnymi, albo sekwencją zdolną do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy pochodzą z obszaru niewiążącego

184 463 palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów, albo sekwencją która wykazuje 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową xylR przedstawioną na sekwencji id nr 9 lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą xylR odpowiadający sekwencji id nr 9, przy czym korzystnie zawiera ona delecję i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego o sekwencji id nr 9.

39. Wektor według zastrz. 35-38, znamienny tym, że promotor (1) jest promotorem należącym do grupy promotorów związanych z genami docelowymi xlnA, xlnB, xlnC, xlnD i axeA.

40. Wektor według zastrz. 35-39, znamienny tym, że promotor (1) jest promotorem związanym z genem docelowym xlnD.

41. Wektor według zastrz. 35-40, znamienny tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczna koduje enzym.

42. Wektor według zastrz. 35-41, znamienny tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczna koduje ksylanazę, glukanazę, α-glukuronidazę, lipazę, esterazę, esterazę kwasu ferulowego, proteazę lub oksyreduktazę, takąjak oksydaza heksozy.

43. Komórka gospodarza zawierająca kombinacyjną kasetę kwasu nukleinowego oraz ewentualnie wektor zawierający taką kasetę kwasu nukleinowego, przy czym kombinacyjna kaseta kwasu nukleinowego, zawiera

1) promotor normalnie związany z genem docelowym aktywującego regulatora podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora,

2) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą regulator związany operacyjnie z innym promotorem,

3) homologiczną lub heterologiczną sekwencję kodującą homologiczną lub heterologiczną proteinę lub peptyd, przy czym promotor (1) jest związany operacyjnie z homologiczną lub heterologiczną sekwencją kodującą przy czym taki aktywujący regulator uczestniczy w szczególności w metabolizmie, a zwłaszcza taki aktywujący regulator uczestniczy specyficznie w części metabolizmu z kaskadą enzymów lub pętlą sprzężenia zwrotnego lub wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, a taki gen docelowy zawiera centrum wiążące dla produktu ekspresji genu regulatora.

44. Komórka gospodarza według zastrz. 43, znamienna tym, że dalszy promotor związany operacyjnie z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego jest promotorem związanym w sposób naturalny z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego.

45. Komórka gospodarza według zastrz. 43 albo 44, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator koduje regulator ksylanolityczny, korzystnie xylR.

46. Komórka gospodarza według zastrz. 43 albo 44, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator jest sekwencją kwasu nukleinowego xlnR, kodującą produkt ekspresji xylR, odpowiadającą sekwencji id nr 9 albo sekwencjami kwasu nukleinowego jej równoważnymi, albo sekwencją zdolną do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy pochodzą z obszaru niewiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów, albo sekwencją która wykazuje 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową xylR przedstawioną na sekwencji id nr 9 lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą xylR odpowiadający sekwencji id nr 9, przy czym korzystnie zawiera ona delecję i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego o sekwencji id nr 9.

47. Komórka gospodarza według zastrz. 43-46, znamienna tym, że promotor (1) jest promotorem należącym do grupy promotorów związanych z genami docelowymi xlnA, xlnB, xlnC, xlnD i axeA.

184 463

48. Komórka gospodarza według zastrz. 43-47, znamienna tym, że promotor (1) jest promotorem związanym z genem docelowym xlnD.

49. Komórka gospodarza według zastrz. 43-48, znamienna tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczną koduje enzym.

50. Komórka gospodarza według zastrz. 43-49, znamienna tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczną koduje ksylanazę, glukanazę, α-glukuronidazę, lipazę, esterazę, esterazę kwasu ferulowego, proteazę lub oksyreduktazę, takąjak oksydaza heksozy.

51. Komórka gospodarza według zastrz. 43, znamienna tym, że komórka gospodarza zawiera gen docelowy regulatora albo w sposób naturalny albo wprowadzony techniką rekombinacyjnego DNA pod warunkiem, że gdy gen docelowy i regulator są rodzime dla komórki gospodarza, to regulator jest obecny w kopiach wielokrotnych.

52. Komórka gospodarza według zastrz. 43, znamienna tym, że zawiera wielokrotne kopie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej wspomniany regulator lub sekwencji kwasu nukleinowego zawierającej kasetę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję kodującą znacznik dwukierunkowy, przy czym kaseta kwasu nukleinowego zawiera ponadto podstawową jednostkę transkrypcyjną związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą znacznik dwukierunkowy oraz podatną na indukcję sekwencję wzmacniacza lub aktywatora związaną z podstawową jednostką transkrypcyjną w taki sposób, że po indukcji sekwencji wzmacniacza lub aktywatora znacznik dwukierunkowy kodujący daje ekspresję, przy czym podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora pochodzi od genu związanego z aktywnością części metabolizmu, a zwłaszcza od genu związanego z częścią metabolizmu z kaskadą enzymów lub z pętlą sprzężenia zwrotnego lub z wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego.

53. Komórka gospodarza według zastrz. 52, znamienna tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej geny facB, NiaD, AmdS, Can1, Ura3, Ura4 oraz PyrA oraz ich homologi.

54. Komórka gospodarza według zastrz. 53, znamienna tym, że znacznik dwukierunkowy należy do grupy obejmującej gen facB Aspergillus nidulans, gen NiaD Aspergillus niger, gen NiaD Aspergillus oryzae, gen AmdS Aspergillus nidulans, gen Can1 Schizosaccharomyces pombe, gen Ura3 Saccharomyces cerevisiae, gen Ura4 Saccharomyces pombe oraz geny PyrA Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Saccharomyces i Kluyveromyces.

55. Komórka gospodarza według zastrz. 52, znamienna tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora normalnie uczestniczy w regulacji kaskady enzymów'.

56. Komórka gospodarza według zastrz. 52, znamienna tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), taką jaka znajduje się na każdym z następujących fragmentów kwasu nukleinowego:

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA. kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofuranozydazę B oraz endoarabinazę,

- fragment pochodzący z genu glaA kodującego glukoamylazę,

- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR i alcA,

- fragment pochodzący z genu CUP1,

- fragment pochodzący z genu PHO5,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10,

- fragment pochodzący z genu xlnA,

- fragment pochodzący z genu pgaR.

57. Komórka gospodarza według zastrz. 52, znamienna tym, że podatna na indukcję sekwencja wzmacniacza lub aktywatora jest Przeciwprądową Sekwencją Aktywującą (UAS), takąjaka znajduje się na następujących fragmentach kwasu nukleinowego:

184 463

- fragment pochodzący z promotorów genów abfA, abfB i abnA kodujących odpowiednio arabinofuranozydazę A, arabinofuranozydazę B oraz endoarabinazę Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu glaA. kodującego glukoamylazę Aspergillus niger,

- fragment zawierający centrum wiążące alcR, takie jak na promotorze alcR i alcA Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu CUP1 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu PHO5 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genów GAL1, GAL7 lub GAL10 Saccharomyces cerevisiae,

- fragment pochodzący z genu xlnA, xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus nidulans,

- fragment pochodzący z genu xlnB, xlnC lub xlnD Aspergillus niger,

- fragment pochodzący z genu xlnA lub xlnD Aspergillus tubigensis,

- fragment pochodzący z genu pgall Aspergillus niger.

58. Komórka gospodarza według zastrz. 43, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wspomniany regulator lub sekwencję kwasu nukleinowego będącą sekwencją, kodującą produkt ekspresji xylR, odpowiadaj ącą sekwencji id nr 9 albo sekwencjami kwasu nukleinowego jej równoważnymi, albo sekwencją zdolną do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy pochodzą z obszaru niewiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów, albo sekwencją którą wykazuje 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową xylR przedstawioną na sekwencji id nr 9 lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą xylR odpowiadający sekwencji id nr 9, przy czym korzystnie zawiera ona delecję i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego o sekwencji id nr 9 oraz wspomniany promotor, przy czym promotor jest promotorem związanym z genem docelowym xlnD.

59. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że należy do grupy obejmującej drobnoustroje i komórki roślinne.

60. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że należy do grupy obejmującej komórki grzybów, a zwłaszcza komórki filamentowe grzybów;

61. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że należy do grupy obejmującej rodzaj Aspergillus, Trichoderma, Penicillium i Fusarium.

62. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że należy do szczepu obejmującego Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus foetidus, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowii, Aspergillus kawachii, Aspergillus carbonarius oraz Aspergillus japonicus.

63. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że jest szczepem należącym do rodzaju obejmującego Saccharomyces, Kluyveromyces i Lactobacillus.

64. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że jest szczepem należącym do Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces pombe.

65. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że gen docelowy jest endogeniczny względem komórki gospodarza.

66. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że gen docelowy jest obecny w kopiach wielokrotnych.

67. Zastosowanie kombinacyjnej kasety kwasu nukleinowego do wytwarzania homologicznej lub heterologicznej proteiny lub peptydu do wytwarzania proteiny lub peptydu z sekwencji kwasu nukleinowego kodujących proteinę lub peptyd, przy czym kombinacyjna kaseta kwasu nukleinowego, zawiera

1) promotor normalnie związany z genem docelowym aktywującego regulatora podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora,

2) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą regulator związany operacyjnie z innym promotorem,

184 463

3) homolooiconą iub heterologirzną sckwescję kodującą uomolooiczną iub heterologiczną proteinę lub peptyd, przy czym promotor (1) jest związany operacyjnie z homologiczną lub OetcrzIogiczną sekwencją kodującą, przy czym taki aktywujący regulator uczestniczy w szczególności w metabolizmie, a zwłaszcza taki aktywujący regulator uczestniczy specyficznie w części metabolizmu z kaskadą enzymów lub pętlą sprzężenia zwrotnego lub wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, a taki gen docelowy zawiera centrum wiążące dla produktu ekspresji genu regulatora.

68. Zastosowanie według zastrz. 68, znamienne tym, że dalszy promotor związany operacyjnie z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego jest promotorem związanym w sposób naturalny z regulatorem kodującym sekwencję kwasu nukleinowego.

69. Zastosowanie według zastrz. 68, znamienne tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator koduje regulator ksylanolityczny, a zwłaszcza sekwencja kwasu nukleinowego koduje xylR.

70. Zastosowanie według zastrz. 68, znamienne tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca regulator jest sekwencją kwasu nukleinowego xlnR, kodującą produkt ekspresji xylR, odpowiai^^y^cią sekwencji id nr 9 albo sekwencjami kwasu nukleinowego jej równoważnymi, albo sekwencją zdolną do hybrydyzacji w specyficznych minimalnych warunkach ostrości, jak określono w Przykładach primerów lub sond pochodzących z sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, przy czym primery lub sondy pochodzą z obszaru niewiążącego palec cynkowy i mają długość co najmniej 20 nukleotydów, albo sekwencją która wykazuje 80-100% identyczności z sekwencją aminokwasową xylR przedstawioną na sekwencji id nr 9 lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą xylR odpowiadający sekwencji id nr 9, przy czym korzystnie zawiera ona delecju i ewentualnie substytucję w jednym lub więcej niż jednym fragmencie sekwencji w porównaniu z kodującą sekwencją kwasu nukleinowego o sekwencji id nr 9.

71. Zastosowanie według zastrz. 68, znamienne tym, że promotor (1) jest promotorem należącym do grupy promotorów związanych z genami docelowymi xlnA, xlnB, xlnC, xlnD i axeA.

72. Zastosowanie według zastrz. 68, znamienne tym, że promotor (1) jest promotorem związanym z genem docelowym xlnD.

73. Zastosowanie według zastrz. 68, znamienne tym, że sekwencja homologiczna lub heterologiczna koduje enzym.

74. Zastosowanie według zastrz. 68, znamienne tym, że sekwencja homologiczna lub 0etcrzlogiczoa koduje ksylanazę, glukanazę, α-glukuronidazę, lipazę, esterazę, esterazę kwasu ferulowego, proteazę lub oksyreduktazę, taką jak oksydaza heksozy.

75. Zastosowanie komórki gospodarza zawierającej kombinacyjną kasetę kwasu nukleinowego oraz ewentualnie wektor zawierający taką kasetę kwasu nukleinowego do wytwarzania homologicznej łub heterologiczoej proteiny lub peptydu do wytwarzania proteiny lub peptydu z sekwencji kwasu nukleinowego kodującej proteinę lub peptyd, przy czym kombinacyjna kaseta kwasu nukleinowego, zawiera

1) promotor normalnie związany z genem docelowym aktywującego regulatora podatnej na indukcję sekwencji wzmacniacza lub aktywatora,

2) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą regulator związany operacyjnie z innym promotorem,

3) homologiczną lub heterolzgiczną sekwencję kodującą homologiczną lub heterologiczną proteinę lub peptyd, przy czym promotor (1) jest związany operacyjnie z homologiczną lub heterologiczną sekwencją kodującą, przy czym taki aktywujący regulator uczestniczy w szczególności w metabolizmie, a zwłaszcza taki aktywujący regulator uczestniczy specyficznie w części metabolizmu z kaskadą enzymów lub pętlą sprzężenia zwrotnego lub wielokrotnymi pętlami sprzężenia zwrotnego, a taki gen docelowy zawiera centrum wiążące dla produktu ekspresji genu regulatora.

184 463

76. Fragment kwasu nukleinowego, wykorzystywany jako primer lub sonda, znamienny tym, że posiada sekwencję kwasu nukleinowego taką, jaka jest obecna w sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, lecz nie taką, jaka jest obecna w obszarze wiązania palca cynkowego sekwencji id nr 9, przy czym fragment ma długość co najmniej 20 nukleotydów.

77. Fragment według zastrz. 76, znamienny tym, że zawiera ponadto sekwencję kwasu nukleinowego taką jaka jest obecna w terminalu C kodującym połowę sekwencji id nr 9 z obszaru wiązania palca cynkowego.

78. Połączenie dwóch lub więcej fragmentów kwasu nukleinowego w zestawie analitycznym, znamienne tym, że służy do wykrywania i ewentualnie wydzielania sekwencji równoważnych sekwencji id nr 9, przy czym fragment jest wykorzystywany jako primer lub sonda i posiada sekwencję kwasu nukleinowego taką, jaka jest obecna w sekwencji kwasu nukleinowego id nr 9, lecz nie taką, jaka jest obecna w obszarze wiązania palca cynkowego sekwencji id nr 9, przy czym fragment ma długość co najmniej 20 nukleotydów.

79. Połączenie według zastrz. 78, znamienne tym, że fragment zawiera ponadto sekwencję kwasu nukleinowego taką jaka jest obecna w terminalu C kodującym połowę sekwencji id nr 9 z obszaru wiązania palca cynkowego.

80. Połączenie według zastrz. 78, znamienne tym, że jeden fragment zawiera część sekwencji kwasu nukleinowego nie kodującą obszaru palca cynkowego.

81. Mutant sekwencji aminokwasowej o sekwencji id nr 9 z mutacją w obszarze wiązania palca cynkowego, wykazującą zwiększone wiązanie DNA.

82. Mutant sekwencji aminokwasowej o sekwencji id nr 9 z mutacją wykazującą obniżone wiązanie DNA.

83. Mutant sekwencji aminokwasowej o sekwencji id nr 9 z mutacją w obszarze wiązania palca cynkowego, przy czym mutacja wykazuje obniżone wiązanie DNA.

* * *

Przedmiotowy wynalazek dotyczy dziedziny mutacji drobnoustrojów oraz wydzielania mutantów. Wynalazek jest ukierunkowany zwłaszcza na uzyskiwanie mutantów metabolicznych w prosty, bezpośredni i specyficzny sposób. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku możliwe jest uzyskiwanie pożądanych mutantów nie zawierających rekombinacyjnego DNA, ułatwiając przez to ich inkorporację do produktów spożywania i stosowania przez ludzi dzięki krótszej procedurze legislacyjnej. Sposób według wynalazku obejmuje przypadkową mutację oraz specyficzną selekcję pożądanego mutanta metabolicznego. Sposób można realizować automatycznie, a taki mutant może wykazywać albo podwyższoną albo obniżoną aktywność metaboliczną. Specyficzność sposobu polega na stosowanych warunkach selekcji. Uzyskiwane mutanty poddawane są mutacji w ich funkcji regulatorowej względem określonej części metabolizmu. W zależności od warunków selekcji można wydzielić mutanty z derepresją, które będą dawać zatem nadekspresję, lub można znaleźć mutanty, w których wyeliminowana jest szczególna metaboliczna aktywność enzymatyczna. Staje się zatem możliwe wyeliminowanie niepożądanej metabolicznej aktywności metabolicznej albo zwiększenie pożądanej aktywności metabolicznej.

Sposoby według wynalazku można odpowiednio realizować na dobrze scharakteryzowanych materiałach, które są już szeroko stosowane w przemyśle. Mutanty nadekspresyjne można na przykład wykorzystywać jako główne źródło enzymów wytwarzających olbrzymie ilości produktów przy niskich kosztach. Mutowany szczep wyjściowy będzie zależeć od szeregu czynników znanych specjalistom w tej dziedzinie, takich jak wydajne wydzielanie protein, dostępność procesów produkcyjnych na wielką skalę, doświadczenie z przetwarzaniem współprądowym fermentacyjnej pożywki bulionowej, obszerna wiedza genetyczna oraz pewność korzystania z bezpiecznych organizmów.

184 463

W innym aspekcie wynalazku stało się możliwe ustalenie i identyfikacja specyficznych funkcji regulujących gen metaboliczny.

Dotychczasowy sposób wytwarzania mutantów, który był stosowany na skalę przemysłową i mógł być zautomatyzowany, był sposobem mutowania bez selekcji i następującej potem analizy mutantów. Alternatywny sposób z selekcją wymagał zawsze etapu wzbogacania, a następnie selekcji na bazie hodowli lub bez hodowli. Oznaczało to usunięcie najpierw wielkiej liczby niepożądanych mutantów. Istniejący sposób dawał w wyniku wielką liczbę mutantów o nieprawidłowym genotypie, a zatem dawał niską selektywność.

Kilka lat temu firma Gist-Brocades opracowała i wprowadziła swobodną technologię z genem znacznikowym pluGBug dla Aspergillus niger. W GIST 94/60, strony 5-7, S. Selten podaje opis wektora dla Aspergillus niger, zawierającego obszary regulatorowe glukoamylazy dla uzyskania wysokich poziomów ekspresji genu, który je reguluje. Jako obszar regulatorowy zostało to wybrane na podstawie naturalnie wysokiej ekspresji glukoamylazy w naturalnym Aspergillus niger. Korzystając z techniki rekombinacyjnego DNA obszar regulatorowy został właściwie związany z przedmiotowym genem jako znacznik selekcyjny Aspergillus AmdS, umożliwiając selekcję pożądanych transformantów po przeniesieniu kasety ekspresji do gospodarza A. niger. Wiele kopii kaset ekspresji integruje się wtedy z genomem A. niger. Wytwarzany enzym, opisany w artykule, był fitazą. Z kolei można otrzymać generacje transformantów bez znacznika. W znanym układzie generacja szczepów rekombinacyjnych bez znacznika jest aktualnie procesem dwustopniowym, ponieważ gen amdS może być wykorzystany dwukierunkowo. Po pierwsze, w cyklu transformacyjnym dla wybrania wyjściowych transformantów, mających daną kasetę ekspresji, a następnie w drugim cyklu przez wybranie przeciwstawne dla końcowego szczepu rekombinacyjnego, który utracił gen amdS. Gem amdS koduje enzym, który jest zdolny do przekształcenia acetamidu w amoniak i octan. Acetamid stosowany jest jako jedyne źródło N w cyklu transformacyjnym. W cyklu rekombinacyjnym jako selektywne źródło N stosowany jest fluoroacetamid, z drugim odpowiednim źródłem N, takim jak na przykład mocznik. Fluorooctan jako produkt jest toksyczny dla innych komórek i rozmnażanie jest ograniczone tylko do tych komórek, które utraciły gen amdS przez wewnętrzną rekombinację na replikatach DNA w kasecie ekspresji. Największy problem w znanym sposobie polega na fakcie, że uzyskany szczep jest szczepem rekombinacyjnym. Pożądana charakterystyka musi być wprowadzona przez inkorporację “obcego” kwasu nukleinowego, który może wydłużyć wymagany do tego czas, a czasami nawet zapobiec zatwierdzeniu legislacyjnemu. Sposób nie nadaje się ponadto do opracowania szczepów z poprawionym metabolizmem. Dzięki obecności kaskad enzymatycznych i wielokrotnych pętli sprzężenia zwrotnego zwykła inkorporacja poszczególnego genu nie zawsze może prowadzić do pożądanego wyniku. Nadprodukcja szczególnego produktu, jeżeli jest zakodowaną, może być skompensowaną przez towarzyszącą nadekspresję innego produktu lub wyregulowana in minus, a zatem z anulowaniem skutku inkorporacji genu. Inkorporacja DNA będzie zatem często przypadkiem “prób i błędów” z inkorporacją pożądanego kwasu nukleinowego, dającego się oddzielać, przy czym nie musi być jednocześnie uzyskany pożądany fenotyp. Utrata genu znacznikowego jest ponadto procesem samorzutnym, który wymaga czasu, i nie daje gwarancji wystąpienia u wszystkich transformantów zawierających kasetę kwasu nukleinowego.

Wiadomo, że poprawienie szczepu mikroorganizmów można osiągnąć przez modyfikację organizmu na różnych poziomach. Polepszenie ekspresji genu na poziomie transkrypcji uzyskuje się głównie przez użycie silnego promotora, powodując wysoki poziom mRNA kodujący przedmiotowy produkt, w połączeniu ze wzrostem dawki genu kasety ekspresji. Chociaż może to prowadzić do wzrostu utworzonego produktu, to taka strategia może być w zasadzie niekorzystna. Na skutek obecności wielokrotnych kopii promotora ilość regulatora transkrypcyjnego kierującego transkrypcją może stać się ograniczona, co daje w wyniku zmniejszoną ekspresję genu docelowego lub genów regulatora. Zaobserwowano to w przypadku szczepów Aspergillus nidulans, zawierających wielką liczbę kopii genu amdS (Kelly and

184 463

Hynes, 1987; Andrianopoulos and Hynes, 1988) oraz w przypadku szczepów A. nidulans, zawierających kopie wielokrotne genu heterologicznego pod działaniem promotora alcA (Gwynne et al., 1987). W tym ostatnim przypadku przyrost genu alcR, kodującego regulator transkrypcyjny genu alcA, daje w wyniku wzrost ekspresji kasety ekspresji (Gwynne et al., 1987; Davies, 1991). Analogicznie do skutków odkrytych w Aspergillus nidulans, w Aspergillus niger podobne ograniczenia obserwowano stosując promotor glukoamylazowy (glaA) dzięki ograniczeniu regulatora transkrypcyjnego kierującego transkrypcją (Verdoes et al., 1993; Verdoes et al., 1995, Verdoes, 1994). Klonowanie genu regulatorowego glaA było utrudnione w znacznym stopniu przez brak strategii selekcji.

W przypadku ekspresji genu arabinazy stwierdzono wyraźną konkurencję dla regulatora transkrypcyjnego po zwiększeniu dawki genu arabinazy (Flipphi et al., 1994), co odzwierciedla ograniczenie regulatora transkrypcyjnego, powszechne u wszystkich trzech badanych genów.

Oprócz wyżej wymienionych niedogodności aktualnego stanu techniki, wydzielanie i oznaczenie genów regulatorowych było dotychczas nadzwyczaj trudne na skutek faktu, że większość protein regulatorowych istnieje w bardzo niskich stężeniach w komórce, co utrudnia określenie, która substancja jest odpowiedzialna za regulację. Produkt regulatorowy nie jest ponadto w ogólności enzymem i może być tylko odsiany dla prób wiązania DNA, co utrudnia oznaczenie i wydzielenie i jest bardzo czasochłonne. Zatem do strategii stosowanych na przykład przy klonowaniu genów regulatorowych należy:

- komplementacja, która jednakże wymaga dostępnego mutanta,

- oczyszczanie proteiny regulatorowej, co jest nadzwyczaj uciążliwe, ponieważ proteinę można scharakteryzować tylko jej właściwościami wiązania DNA. Niektóre z takich oczyszczań obejmują chromatografię z powinowactwem wykorzystując związany fragment DNA jako matrycę. Jedna z niedogodności takich oczyszczań polega na tym, że często więcej niż jedna proteina wiąże się zarówno specyficznie, jak i niespecyficznie, z fragmentem,

- oparcie się na ugrupowaniu genów, w którym gen regulatorowy jest genomicznie zgrupowany z genami strukturalnymi, które z kolei są regulowane przez swój produkt genowy, na przykład skupisko prn lub alc.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano układ, który można wykorzystać do skrócenia długości czasu koniecznego do rejestracji mutantów drobnoustrojów zdolnych do nadprodukcji poszczególnych pożądanych enzymów. Układ przezwycięża problem wielokrotnych przypadkowych insertów „obcego” kwasu nukleinowego, a zwłaszcza selekcyjnego genu znacznikowego. Do uzyskania pożądanej charakterystyki nie wymaga to nawet obcego kwasu nukleinowego. Uzyskany mutant szczepu nie zawiera heterologicznego kwasu nukleinowego. Układ według wynalazku umożliwia ponadto specyficzną mutację metabolizmu i nie jest konieczna wielka liczba doświadczeń prowadzących do pożądanych fenotypów.