JP4339400B2 - 突然変異体を単離する方法、およびその相補的遺伝子をクローン化する新しい方法 - Google Patents
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Description
本発明は微生物の突然変異および突然変異体の選択の分野に属する。さらに詳しくは、本発明は、簡便で、直接的かつ特異的な方法で代謝突然変異体を得ることに向けられている。好ましい態様においては、より簡略な法の手続きのために、組み換えDNAを含まない所望の突然変異体を得ることにより、ヒトが消費する産物またはヒトに適用する産物中へのその組込みを容易にすることもできる。本発明の方法は、ランダム突然変異および所望の代謝突然変異体の特異的選択を含む。該方法は適切には自動的に行うことができる。かかる突然変異体は、代謝活性の増大または減少いずれかを示し得る。該方法の特異性は適用する選択条件にある。得られた突然変異体は、代謝の所定の一部に関するその調節機能が突然変異されている。該選択条件に応じて、過剰発現を示すであろう抑制解除された突然変異体を単離でき、あるいは特定の代謝酵素活性が排除された突然変異体を見出すことができる。かくして、望ましくない代謝酵素活性を排除し、あるいは所望の代謝活性を増強することが可能となる。
本発明の方法は、産業において既に広く用いられている十分に特徴づけられた供給源に対して、適切に実施することができる。例えば、過剰発現突然変異体は、低コストで大量生産する酵素の主要な供給源として使用することができる。変異を誘発すべき最初の株は、効果的な蛋白質分泌、大規模生産プロセスの利用可能性、発酵液の後処理に関する経験、広範な遺伝学的知識および安全な微生物の使用に関する保証のごとき当業者に公知のいくつかの要素に依拠するであろう。
また、本発明のもう1つの態様において、今や、機能を調節する特異的代謝遺伝子を突きとめ同定することも可能となった。
現在まで、産業的に応用でき且つ自動化できた突然変異体の調製方法は、修正されるべきであった特徴、突然変異体の選択およびそれに続く分析を行うことなく突然変異体誘発を行う方法であった。選択を用いる別法は、通常、富化行程に、続いて増殖また非増殖に基づく選別を必要とした。このことは、多数の望ましくない突然変異体を最初に除去すべきことを意味した。また、現存する方法は不適切な表現型を有する非常に多数の突然変異体を生じ、かくして低選択性を示す。
数年前、Gist-Brocadesは、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のためのpluGBugマーカー遺伝子を用いない技術を開発し、紹介した。G.SeltenによるGIST94/60p5−7において、それを調節する遺伝子の高い発現レベルを達成するためのグルコアミラーゼ調節領域を含む、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のためのベクターについての説明がなされている。これは天然アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)によるグルコアミラーゼの本来的に高い発現に基づいて調節領域として選択された。組換えDNA技術を用いて、選択マーカーであるアスペルギルス(Aspergillus)AmdSと同様に注目する遺伝子に該調節領域を適切に融合させ、A. ニゲール(A.niger)ホストへ発現カセットを導入した後、所望の形質転換体の選択を可能とした。次いで、該発現カセットの複数のコピーはランダムにA. ニゲール(A.niger)ゲノムに組込まれた。該論文に記載されたごとく、生産された酵素はフィターゼであった。ひき続いて、マーカーを含まない形質転換体の創生を達成できる。公知の系において、amdS遺伝子は二方向性に使用できるので、マーカーを含まない組換え株の創生は実際には2段階プロセスである。まず形質転換工程で、提供された発現カセットを有する最初の形質転換体を選択し、次いで第二の工程で、amdS遺伝子を再び喪失した最終の組換え株を逆選択する。amdS遺伝子はアセトアミドをアンモニウムおよびアセテートへ変換できる酵素をコードする。アセトアミドは形質転換工程で唯一のN源として用いられる。組換え工程において、例えば尿素のごとき第二の適当なN源と共に、フルオロアセトアミドを選択的N源として用いる。生成物フルオロアセテートは他の細胞に対して毒性であるので、その増殖は、発現カセット中のDNAリピートにわたる内部組み換えによってamdS遺伝子を喪失した細胞に限られるであろう。この公知の方法に伴う最大の問題は、その結果得られた系が組換え株であるという事実である。所望の特性は「外来」核酸の組込みによって導入されなければならず、これは法的認可に要する期間を遅延させる可能性があり、また時には法的認可を妨げることすらある。加えて、該方法は修正された代謝を有する株の確立には適していない。酵素カスケードおよび複数のフィードバックループの存在のため、特定遺伝子の単純な組込みは常には所望の結果につながるとは限らない。コードされた特定の生成物の過剰発現は別の生成物の付随した過剰発現によって補償され、あるいは下方調節されて、かくして、組み込まれた遺伝子の効果が無くなる可能性がある。それゆえDNAの組込みは、所望の核酸の組込みは選択可能であるが所望の表現型が必ずしも付随して達成されないという試行錯誤の場合がしばしばであろう。さらに、マーカー遺伝子の喪失は時間を要する自然発生的なプロセスであり、該核酸カセットを含む全ての形質転換体に生じることを保証することはできない。
微生物における株の改良は様々なレベルで生物を修飾することにより達成できることが知られている。転写レベルでの遺伝子発現の改良は、ほとんどの場合、発現カセットの遺伝子量の増加と組み合わせて、注目する生成物をコードする高レベルのmRNAを生じさせる強力なプロモーターの使用により達成される。これは形成された生成物の増加につながり得るが、この戦略は原則的に不利な点を有する。プロモーターの複数コピーが存在するため、転写を駆動する転写レギュレーターの量は限られ、レギュレーターの標的遺伝子または複数の該遺伝子の発現が減少する結果となる。これはamdS遺伝子の多数のコピーを有するアスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)株の場合(KellyおよびHynes,1987:AndrianopoulosおよびHynes,1988)およびalcAプロモーターの制御下で異種遺伝子の複数コピーを有するA.トゥランス(A.nidulans)株の場合(Gwynneら,1987)に観察された。後者の場合において、alcA遺伝子の転写レギュレーターをコードするalcR遺伝子の増加は、該発現カセットの発現を増加させる結果となった(Gwynneら,1987;Davies,1991)。アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)において判明した効果と類似して、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)においては、転写を駆動する転写レギュレーターの制限に起因して、グルコアミラーゼ(glaA)プロモーターの使用において同様の制限が観察された(Verdoesら,1993;Verdoesら,1995;Verdoes,1994)。glaA調節遺伝子のクローニングは選択戦略の欠如によりこれまで導入を妨げられてきた。
アラビナーゼ遺伝子発現の場合において、アラビナーゼ遺伝子投与量の増加に際し、転写レギュレーターに対する明確な競合が見出されたが(Flipphiら,1994)、このことは、研究された3つの遺伝子のすべてに共通の転写レギュレーターの制限を反映している。
前記した技術水準の欠点に加え、ほとんどの調節蛋白質が細胞中に非常に低濃度でしか存在せず、どの物質が調節を担うのかの決定を困難にさせているという事実に起因して、レギュレーター遺伝子の単離および測定は今まで大変困難であった。さらに、一般的に、調節生成物は酵素ではなく、DNA結合アッセイによってスクリーニングすることしかできず、その結果、同定および単離は困難で、且つ大変時間のかかるものとなっている。調節遺伝子をクローン化するためにこれまで使用されている戦略は、例えば次の通りである:
−相補性によるもの。しかしながら、これは利用可能な突然変異体を要する;
−調節蛋白質の精製によるもの。該蛋白質はDNA結合特性によって特徴付けするしかないので、これは非常に面倒である。これらの精製のいくつかはマトリックスとして結合DNA断片を用いるアフィニティークロマトグラフィーを含む。このタイプの精製における欠点の一つは、しばしば断片に対して1を越えるタンパク質が特異的ならびに非特異的に結合するということである。
−遺伝子のクラスター形成に基づくもの。ここに該調節遺伝子は、その遺伝子生成物、例えばprnクラスター、alcクラスターなどによって調節される構造遺伝子とゲノム的にクラスターを形成する。
発明の詳細な説明
本発明者らは、今回、特定の望ましい酵素を過剰発現できる突然変異体微生物の法的認可に必要な時間を短縮するために使用できる系を達成した。該系は「外来」核酸の複数のランダムな挿入の問題、特に選択マーカー遺伝子の挿入の問題を克服する。それは、所望の特性を達成するために外来核酸ですら必要としない。その結果得られた突然変異体株は異種核酸を含まないであろう。さらに本発明の系は、特異的な代謝突然変異を可能とし、望ましくない表現型につながる大量の実験を回避する。
本発明は二方向性マーカーをコードする核酸配列を含む核酸カセットであって、該核酸カセットはさらに該二方向性マーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結された基本転写ユニットを含むことと、該二方向性マーカーは更に、該基本転写ユニットに連結された誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列を含み、該エンハンサーまたはアクチベーター配列は、その誘導の際に二方向性マーカーをコードする核酸配列が発現されるように連結されていることと、該誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は代謝の一部の活性に関連する遺伝子に由来することと、該誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は代謝に関連する遺伝子に由来することを特徴とする核酸カセットを目的とする。
基本転写ユニットは転写がリンクされている遺伝子の転写に必要ないずれの要素をも具備している。それはエンハンサー配列を含むプロモーターあるいは含まないプロモーターも具備し得る。基本転写ユニットはホスト微生物において作動しなければならない。基本転写ユニットはそれがその転写のための二方向性マーカー遺伝子に作動可能に連結されるように位置しなければならない。適当な例は、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、フサリウム(Fusarium)、サッカロミセス(Saccaromyces)、クルベロミセス(Kluyveromyces)およびラクトバチルス(Lactobacillus)のごとき多数のホスト細胞でよく知られている。実施例において、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)goxC転写ユニットに由来する基本転写ユニットtGOX(Whittingtonら1990)が本発明の実施可能な態様で示されている。
誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は、好ましくは、通常、酵素カセットの調節に正常に関与し、または1以上のフィードバックループを伴う代謝の一部に関与する。さらなる態様において、本発明の核酸カセットは、炭素代謝に正常に関与する誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列を具備する。本発明の核酸カセットに使用される誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列の適当な例は、以下の核酸断片のいずれかに含まれる上流活性化配列(UAS)である:
+++−各々アラビノフラノシダーゼA、アラビノフラノシダーゼBおよびエンドアラビナーゼをコードするabfA、abfBおよびabnA遺伝子のプロモーターに由来する断片、
−グルコアミラーゼをコードするglaA遺伝子に由来する断片、
−alcRおよびalcAプロモーター上のごときalcR結合部位を有する断片、
−CUPI遺伝子に由来する断片、
−PHO5遺伝子に由来する断片、
−GAL1、GAL7またはGAL10遺伝子に由来する断片、
−xlnA遺伝子に由来する断片、
−pgaII遺伝子に由来する断片。
例として、これらの断片は文献に記載されているごとく以下の生物から誘導されることができる:
−各々アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のアラビノフラノシダーゼA、アラビノフラノシダーゼBおよびエンドアラビナーゼをコードするabfA、abfBおよびabnA遺伝子のプロモーターに由来する断片(Flipphi M.J.A.ら1994)、
−アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のグルコアミラーゼをコードするglaA遺伝子に由来する断片(Fowler T.ら1990)、
−アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)のalcRプロモーター上のalcR結合部位を含有する断片(Felenbok B.ら1994),
−サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のCUP1遺伝子に由来する断片(Hinnen A.ら1995)、
−サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のPHO5遺伝子に由来する断片(Hinnen A.ら1995)、
−サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のGAL1、GAL7またはGAL10遺伝子に由来する断片(Hinnen A.ら1995)、
−アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)のxlnA、xlnB、xlnCまたはxlnD遺伝子に由来する断片、
−アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のxlnB、xlnCまたはxlnD遺伝子に由来する断片(本明細書の他所参照)、
−アスペルギルス・トゥービゲンシス(Aspergillus tubigensis)のxlnAまたはxlnD遺伝子に由来する断片(de Graaffら1994)、
−アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のpgaII遺伝子に由来する断片(本明細書の他所参照)。
実施例において、xlnAのUASが本発明の実施可能な態様において示されている。
二方向性マーカーは当該分野で認められた用語である。それは使用した選択条件に基いて、発現の存在または不存在を示すために使用できる選択マーカーからなる。好ましい二方向性マーカーは、致死性または極度の増殖低下に基いて、選択性を付与する。別法として、二方向性マーカー遺伝子の発現また欠如に基づく異なるコロニーの着色も可能な態様である。公知の二方向性マーカーの適当な例は、facB、NiaD、AmdS、Can1、Ura3、Ura4およびPyrA遺伝子よりなる群で見い出されるべきものである。これによって本発明者らはまた、PyrA相同体が文献中でPyrG、Ura3、Ura4、Pyr4およびPyr1と呼ばれていることも指摘する。これらの遺伝子は例えば、以下の生物において見出すことができる。アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)におけるfacB遺伝子、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)におけるNiaD遺伝子、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzaeにおけるNiaD遺伝子、アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)におけるAmdS遺伝子、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)におけるCan1遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)におけるUra3遺伝子、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)におけるUra4遺伝子およびアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、フサリウム(Fusarium)、サッカロミセス(Saccharomyces)およびクルベロミセス(Kluyveromyces)におけるPyrA遺伝子である。
facB突然変異体、すなわち陰性表現型を用いた選択は、フルオロアセテート耐性に基いて起こり得る。FAC B+、すなわち、陽性表現型についての選択は炭素源としてのアセテートに基いて起こり得る(Katz,M.E.およびHynes M.J.1989)。niaD突然変異体、すなわち、陰性表現型を用いた選択は、塩素酸塩耐性に基いて起こり得る。NIA D+、すなわち、陽性表現型についての選択は、窒素源としての硝酸塩に基いて起こり得る(Unkles S.E.ら1989aおよび1989b)。amdS突然変異体、すなわち、陰性表現型を用いた選択は、フルオルアセトアミド耐性に基いて起こり得る。AMD S+、すなわち、陽性表現型についての選択は、窒素源としてのアセトアミドに基いて起こり得る。ほとんどの真菌類はアセトアミダーセ機能をコードする遺伝子を有しないので、AMD Sはかかる真菌類についての優性マーカーである。それはとりわけ、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニゲール・バール・チュービゲネシス(Aspergillus niger var.tubigensis)、アスペルギルス・バール・アワモリ(Aspergillus var.awamori)、アスペルギルス・フェティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・スブドウィー(Aspergillus svdowii)、アスペルギルス・ヤポニカス(Aspergillus japonicas)、アスペルギルス・アクレトゥス(Aspergillus aculeatus)、ペニシリウム属(Penicillum)、トリコデルマ属(Trichoderma)においてそれ自体用いられてきた(KellyおよびHynes1985、およびBaileyら1991)。can1突然変異体、すなわち、陰性表現型を用いた選択は、カナバニン耐性に基いて起こり得、ここにカナバニンはアルギニン類縁体である。CAN 1+、すなわち、陽性表現型についての選択は、アルギニンに基いて起こり得る(Ekwall K.1991)。オロチジン5’−P−デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、pyrA、pyrGまたはura3として知られている。それは例えば、アスパルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ペニシリウム属(Penicillum)、フサリウム属(Fusarium)、サッカロミセス属(Saccharomyces)およびクリベロシセス属(Kluyveromyces)の種々の生物について見出されてきた。pyrA突然変異体、すなわち、陰性表現型を用いる選択はまた、pyrGまたはura3としても記載され、フルオロオロチニ酸耐性に基いて起こり得る。PYR A+およびその相同体、すなわち、陽性表現型についての選択は、ウリジンまたはウラシルの原栄養性に基いて成し得る。実施例において、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)からのpryA(Wilsonら1988)が本発明の実施可能な態様で示されている。他の例も当業者に知られ、容易に文献中で見い出すことができる。用いられる選択マーカーは、突然変異させるホスト生物、および選択性、信頼性ならびになかでも使用される基質のコストのごとき他の二次的な考慮に依存する。
また、形質転換ベクターまたは発現ベクターに組み込まれた核酸カセットも、本発明の範囲に含まれる。また、形質転換法および選択法におけるかかる核酸カセットまたはベクターの適用も含まれる。特に、代謝の所定の部分に関与する酵素の過剰発現を呈する突然変異体を作出する方法、代謝の所定の部分に関与する酵素の発現の減少または阻害を呈する突然変異体を作出する方法、および代謝の所定の部分に関与する調節遺伝子を測定および単離する方法における適用である。
かくして、微生物の突然変異株の調製および選択する方法、該突然変異は、非変異誘発株と比較して代謝の所定の部分を増強し、該方法は、
−前記請求項のいずれか1項による核酸カセットをホストに導入し、
該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連する表現型を呈さず、
−得られた微生物を、該核酸カセットに含まれたエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動する条件下であって、二方向性マーカーが発現され、好ましくは該二方向マーカーの発現が増殖に連結された、および非発現が非増殖に連結された条件下で培養し、
−前記培養条件下で二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体を選択し、
−選択された形質転換体に自体公知の方法で突然変異に付しし、
−得られた株を二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーの非発現の結果となる、該核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、および代謝の所定の部分についての代謝可能な基質の存在下で培養し、
−突然変異誘発に続く培養工程から得られた、二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株を、本発明の範囲内にある二方向性マーカーの非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親のための選択条件下で選択することを含む。
この方法の適当な態様において、
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は、遺伝子xlnAに由来する上流活性化配列(UAS)であり、
−代謝の所定の部分が、炭素代謝のキシラン分解部分であり、
−得られた微生物をエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現する条件下で培養する培養工程が、UASのインデューサーの存在下であってUASのリプレッサーおよび代謝可能な炭素源の不在下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が前記した培養条件下で生じる
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、すなわち、UASのリプレッサーの存在下であって代謝可能な炭素源の存在下かつ所望によりUASのインデューサーの存在下でも起こり、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株の突然変異誘発に続く培養工程かリプレッサーから得られた株の選択が、二方向性マーカーの非発現の結果を導く核酸カセットを含む非突然変異親のための選択条件下で起こる。
この方法のさらなる態様において、
−該核酸カセットは、二方向マーカーpyrAをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは、該核酸カセットの導入に先立って、二方向性マーカーの発現に関連するpyrA+表現型を呈さず、
−得られた微生物をエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現される条件下で培養する培養工程が、エンハンサーまたはアクチベーターが正常に作動する条件下、すなわち、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの存在下であってエンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの不存在下、かつ二方向性マーカーが発現される条件下で培養することを含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、すなわち、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの不在下、またはエンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの存在下、かつ代謝の所定の部分についての代謝可能な基質の存在下で起こり、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株の突然変異誘発に続く培養工程から得られた株の選択が、二方向性マーカーの非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親につての選択条件下、すなわち、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの不在下、またはエンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの存在下で起こる。
適当には前記した適した態様はさらに
−核酸カセットが二方向性マーカーpyrAをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連するpyrA+表現型を呈さず、
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列が遺伝子xlnAに由来するUASであり、
−得られた微生物がエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現される条件下で培養される培養工程が、UASが正常に作動する条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときUASのインデューサーの存在下であって、UASのリプレッサーの不存在下、すなわち、グルコースの不在下、および二方向性マーカーが発現される条件下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときUASのインデューサーの不在下、またはUASのリプレッサーの存在下、すなわち、グルコースの存在下、および代謝可能な炭素源の存在下で起こり、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株の突然変異誘発に続く培養工程から得られた株の選択が、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親についての選択条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときUASのインデューサーの不存在下、またはUASのリプレッサーの存在下、すなわち、グルコースの存在下で起こる
によって特徴付けられる。
さらに、微生物の非組み換え突然変異株を調製および選択する方法、非突然変異株と比較して代謝の所定の部分を増強する該突然変異は、本発明の好ましい範囲内である。この方法は、先の段落に記載したごとく、本発明の方法の工程を実施し、続いて、導入された核酸カセットの核酸を自体公知の方法で交差させることよりなる。
従前に示したごとく微生物の突然変異株を調製および選択する方法、該突然変異は非突然変異誘発株と比較して、炭素代謝の所定の部分を阻害し、該方法は、
−前記したごとく本発明の核酸カセットをホストに導入し、
該ホストは、核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連する表現型を呈さず、該ホストは代謝の所定の部分を特徴付けるタイプの低下したまたは阻害された活性を呈し、
−得られた微生物を、核酸カセットのエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、核酸カセットの二方向性マーカーの非発現が、得られた微生物の増殖および検出の結果となり、該二方向性マーカーの発現が好ましくは致死的であるかるいは強力に増殖を阻害する条件下で培養し、
−前記培養条件の下で、二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体を選択し、
−選択された形質転換体に自体公知の方法で突然変異誘発に付し、
−突然変異誘発から得られた株を二方向性マーカーの非発現に対応する表現型を持つ株の増殖に許容される条件下であって、代謝可能な基質の存在下、かつ核酸カセットを含むまたは含まないいずれかの非突然変異ホストと比較して、代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す条件下で培養し、
−代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性に対応する表現型を示す、突然変異誘発に続く培養工程から得られた株を、それに対する活性が低下または阻害されるべき、代謝の部分についての基質として働く基質上での増殖に基づく清澄ゾーンの減少のごとき、核酸カセットを含むまたは含まない非突然変異ホストと比較して、代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す選択条件下で選択すること
からなる。
かかる方法のさらなる態様において
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は、遺伝子xlnAに由来する上流活性化配列(UAS)であり、
−代謝の所定の部分は、炭素代謝のキシラン分解部分であり、
−得られた微生物が、エンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現される条件下で培養される培養工程が、核酸カセットのUASのリプレッサーの不在下、代謝可能な炭素源の存在下、およびまた好ましくはUASのインデューサーの存在下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの非発現に対応する表現型を持つ株の増殖および検出に許容される条件下、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株の増殖および検出に許容されない条件下、すなわち、ウリジンおよびフルオロオロチン酸の存在下であって、炭素代謝の所定の部分の活性の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親についての条件下、すなわち、UASのインデューサーおよび代謝可能な炭素源の存在下、およびUASのリプレッサーの不在下、例えばソルビトール、またはインデューサー様キシランもしくはD−キシロースと組み合わせた別の非抑制炭素源の存在下で起こり、
−突然変異誘発に続く培養から得られた、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性に対応する表現型を呈する株の選択が、キシラン上での増殖に際しての清澄ゾーンの減少のごとき、核酸カセットを含むまたは含まないいずれかの非突然変異体ホストに比較して、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す選択条件下で起こる。
先の段落による方法の例が提供され、ここに、
−該核酸カセットは二方向性マーカーpyrAをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現と関連するPYRA+を表現型を呈さず、
−得られた微生物が、エンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーpyrAが発現される条件下で、培養される培養工程は、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの存在下であって、エンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの不在下、および二方向性マーカーpyrAが発現される条件下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子pyrAの発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択は、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程は、二方向性マーカーの非発現に対応する表現型、すなわちPYRA-表現型を持つ株の増殖および検出に許容される条件下、PYRA+表現型を持つ株の増殖および検出に許容されない条件下、かかる表現型は、二方向性マーカーの発現、すなわちウリジンおよびフルオロオロチン酸の存在を含むかかる条件に対応し、および代謝の所定の部分の活性結果となる核酸カセットを含む非突然変異親についての条件下、すなわちエンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーおよび代謝可能な基質の存在下であって、アクチベーターまたはエンハンサーのリプレッサー、またはインデューサーと組み合わせた別の非抑制基質の不在下で起こる。
好ましい態様において、2段落前による本方法はさらに、
−該核酸カセットが二方向性マーカーpyrAをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連したPYRA+表現型を呈さず、
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は遺伝子xlnAに由来するUASであり、
−得られた微生物が−エンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーpyrAが発現される条件下で培養される培養工程が、UASが正常に作動する条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときUASのインデューサーの存在下であって、UASのリプレッサーの不在下、すなわち、グルコースの不在下および二方向性マーカーpyrAが発現する条件下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子pyrAの発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの非発現に対応する表現型、すなわちpyrA-表現型を持つ株の増殖および検出に許容される条件下、PYRA+表現型を持つ株の増殖および検出に許容されない条件下で、かかる表現型は、二方向性マーカーの発現型、すなわちウリジンおよびフルオロオロチン酸の存在を含むかかる条件に対応し、および炭素代謝の所定の部分の活性となる該核酸カセットを含む非突然変異親についての条件下、すなわち、UASのインデューサーおよび代謝可能な炭素源の存在下、およびUASのリプレッサーの不存在下、例えばソルビトールまたは、インデューサー様キシランもしくはD−キシロースと組み合わせた別の非抑制炭素源の存在下で起こり、
−突然変異誘発に続く培養工程から得られた、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性に対応する表現型を呈する株の選択は、キシラン上での増殖に際しての清澄ゾーン減少のごとき、核酸カセットを含むまたは含まないいずれかの非突然変異誘発ホストと比較して、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す選択条件下で起こる
方法である。
前記した方法は該核酸カセットの導入に先立って特徴づけられたホストで有利に実施され、それは少なくとも二方向性マーカーをコードする核酸配列の一部に一致する核酸を含み、該一致は該核酸カセットに含まれる核酸をコードする二方向性マーカーの染色体において相同種組換えさせるに十分な程度である。この態様は、予め決定された位置での該核酸カセットの組込みを確実にする。
さらに好ましい態様において、該核酸カセットは、このままではマーカー陰性表現型およびマーカー陽性表現型数の低下を検出する際に不正確な結果となるので、突然変異に誘発工程が該二方向性マーカーを不活化しないことを保証するために複数コピーにて組込まれるであろう。
本発明の好ましい態様において、核酸カセットは代謝の所定の部分に関与する酵素の過剰発現を呈する突然変異体を作出する方法、代謝の所定の部分に関与する酵素の低下したまたは阻害された発現を呈する突然変異体を作出する方法、および代謝の所定の部分に含まれる調節遺伝子を同定および単離する方法で使用できるように構築された。特に、本発明者らは、炭素代謝における突然変異体のために使用されるごとき系を例示する。実施例において改変されたキシラン分解特性を有する突然変異体、ならびにアラビノース溶菌およびペクチン分解経路における突然変異体につながるアラビナーゼおよびポリガラクチュロナーゼ突然変異体が記載される。実施例において、突然変異させる株としてアスペルギルス属(Aspergillus)が用いられているが、他のいずれの産業的に許容される微生物でも十分である。かかる微生物の例は、サッカロミセス属(Saccaromyces)、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccaromyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccaromyces pombe)、アスペルギルス属(Aspergillus)、例えばアスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ペニシリウム属(Penicillium)、フサリウム属(Fusarium)、クリベロミセス属(Kluvyeromyces)およびレクトバチルス属(Lectobacillus)である。他の例は当業者において自明であり、また多くは本明細書の他所で記載されている。今回、代謝の所定の部分についての過剰発現または発現を無効にする株が作出できた。また、本発明者らは、誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列の活性化レギュレーターの同一特性および核酸配列を決定できた。特に、かかる活性化レギュレーターが代謝に関与する場合、より具体的には、かかる活性化レギュレーターが酵素カスケードまたはフィードバックループまたは複数フィードバックループを有する代謝の部分に関与する場合である。ひき続いて、かかる調節遺伝子の核酸配列を、標的遺伝子の発現を増強するために使用できる。該標的遺伝子とは、調節遺伝子によって調節される遺伝子である。好ましい態様において、かかる標的遺伝子は調節遺伝子の発現生成物に対する結合部位を有するであろう。通常、発現カセットにおいて、レギュレーターの標的遺伝子に関連したプロモーターを該調節遺伝子と組み合わせ、該プロモーターを発現させる同種または異種蛋白質またはペプチドをコードする同種または異種配列に作動可能なように連結して、同種のおよび異種の蛋白質またはペプチドの発現にすら極めて有用な発現カセットとすることができる。レギュレーターをコードする遺伝子は、その天然プロモーターまたは選択したホスト細胞において発現可能ないずれの他のプロモーターの制御下にあり得る。該プロモーターは構成的または誘導性であり、どんなものでも特定の作出工程には最も望ましい。かかるカセットからなるベクターまたはプラスミドがそうであるように、かかる組合せ発現カセットは、本発明の範囲内にある。発現の程度はレギュレーターの存在量が非常に少なくとももはや制限されず、かくして発現させるべき遺伝子の発現の程度は、同一のプロモーターであるが調節遺伝子の付加的存在を持たないプロモーターの制御の下で遺伝子が発現する相当するホスト細胞よりもずっと高くなる。かかる増加した発現は、好ましくは通常、影響されるべき代謝経路の部分の成分を含む生物の細胞において達成される。適当なホスト細胞は糸状菌細胞である。レギュレーターの標的遺伝子を含むホスト細胞において、現に前記したタイプの組合せ発現カセットの組込みは、標的遺伝子の発現の増加、すなわちもし複数標的遺伝子が存在するならば、標的遺伝子の発現の増加につながり得る。好ましくは、該標的遺伝子はホスト細胞にとって内因性であろう。該組合せ発現カセットを含むホスト細胞は、本発明の範囲内にある。
実施例において、キシラン分解経路のxylRのレギュレーターの核酸配列xlnRが提供されている。このレギュレーターに対する標的遺伝子は、遺伝子xlnA、xlnB、xlnCおよびxlnDならびにaxeAを含むことが判明した。キシラナーゼA発現における増加が例示され、これはxylRレギュレーターの標的遺伝子に対するxylR作用の一般的な適用性を示すために役立ち得る。多数の配列が当該技術水準で公知であり、それは前記したxlnA、B、CおよびD遺伝子およびaxeA遺伝子を含み、かかる情報は当業者ならば容易に入手でき、これらは本明細書の一部であるとみなされる。xlnR核酸と組み合わせて用いられる好ましい注目するプロモーターは、xlnA、xlnB、xlncおよびxlnDから選択できる。また、axeAプロモーターの使用は、本発明の適切な態様をなす。該プロモーターは当業者にとって当該技術水準で公知であり、本明細書の一部とみなされる。該xlnAプロモーターはGraaffら1994に記載されている。該xlnBプロモーターはKinoshitaら1995によって記載されている。該xlnDプロモーターはEP95201707.7に記載され、本明細書の配列番号8の配列において配列リストに含まれている。該プロモーター配列は、公知の配列を基にして容易に合成すること、また自体公知の標準法でそれらを含む生物またはベクターから誘導することのいずれかが可能である。プロモーター、エンハンサーまたはレギュレーターなる語は本来用いられ、プロモーター、エンハンサーまはたレギュレーターを含む断片は、かかる実施性が損なわれない限り使用可能である。本発明の構築体では、単なる関連配列の組み込みは必ずしも必要とせず、いずれの隣接する干渉配列も存在しない。本発明によって包含される発現生成物xylRをコードする核酸配列xlnRばかりではなく、同等発現生成物および突然変異体発現生成物ならびに本発明の核酸配列自身の発現生成物をコードする配列がある。xylRすなわち本明細書に記載した配列(=xlnR)をコードするxylRのいずれの適用も突然変異体およびかかる突然変異体をコードする核酸配列に対し適用可能であり、それはmutatis mutandiの一部とみなされる。
本発明の核酸配列およびカセットの発現のために用いられる適した真菌類細胞の例は、Aspergillus niger、Aspergillus tubiegensis、Aspergillus aculeatus、Aspergillus awamori、Aspergillus oryzae、Aspergillus nidulans、Aspergillus carbonarium、Aspergillus foetidus、Aspergillus terreus、Aspergillus sydowii、Aspergillus kawachii、Aspergillus japonicusのごときAspergilliおよびTrichoderma、PenicillumならびにFusarium属の種である。また植物細胞のごとき他の細胞も実施可能なホスト細胞であり、また本明細書の他所で別のホスト細胞についても記載されている。
本発明の発現カセットを用いた発現のための、また本発明の核酸配列との組み合わせにおいて特に興味深い遺伝子は、酵素をコードする遺伝子である。発現のための適した遺伝子は、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ヘキソースオキシダーゼのごとき酸化還元酵素、α−グルクロニダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼおよびプロテアーゼをコードする遺伝子である。これらは所望の発現生成物例を限定するものではない。前記した遺伝子を含む多くの配列が当該分野で公知であり、かかる情報は当業者ならば容易に入手でき、これらも本明細書の一部とみなされる。該遺伝子は文献またはデータベースにおいて公知の配列を基にして容易に合成するか、または自体に公知の標準法にてそれらを含む生物またはベクターから誘導するかのいずれかが可能であり、それは当業者ならばさらなる説明を必要とぜずに容易に利用できる知見であると考えられる。
配列番号9に従うxylRのアミノ酸配列と80%−100%の一致を示す発現生成物、または配列番号9(948のヌクレオチド由来)のxlnRの核酸配列によりコードされたごとき発現生成物は、本発明のキシラナーゼレギュレーター(xylR)の同等発現生成物であるとみなされ、従って本発明の範囲内にある。該同等発現生成物は、DNA結合活性を有するはずである。好ましくは、該発現生成物は標的遺伝子の核酸と結合するはずなので、かかるDNA結合活性は、該発現生成物が配列番号9で提供されたアミノ酸配列に結合するのと同等またはそれ以上になる。結合活性を決定するために好ましい標的遺伝子は、xylA、xylB、xylCおよびxynDをコードする遺伝子、すなわち、xlnA、xlnB、xlnCおよびxlnD遺伝子である。
また、xlnR遺伝子発現生成物xylRの突然変異体および少なくとも同程度の標的結合活性を維持している配列番号9に従う核酸配列xlnRコードも請求される。同等発現生成物の定義内にあるとみなされる突然変異体は、配列番号9に従うアミノ酸配列に比してアミノ酸変化を有する特定の突然変異体を含む。かかる同等体はそれらをコードする核酸配列なので、本発明の適した態様とみなされる。1−15個のアミノ酸置換を有する突然変異体が適切であり、例えば、1−5個のアミノ酸置換もまた同等発現生成物を形成する本発明の特に適した態様をなすとみなされる。特定のアミノ酸の同種の他のアミノ酸での置換はそのペプチド活性に顕著な影響を及ぼさないということは、当業者にとって一般的な知見である。水治療法(hydropathy)の側面を基礎として、当業者はその置換が実施可能であることを認識しているであろう。例えば、疎水性アミノ酸の他の疎水性アミノ酸による置換および、疎水性アミノ酸の他の親水性アミノ酸による置換は、本発明の適した実施例である発現生成物が結果として生じるであろう。かかる置換は同等なる語の下に、本発明の範囲によって包含されるとみなされる。配列番号9に従う核酸配列コードにおける点突然変異の結果、本発明の範囲内にある核酸配列が生じると考えられる。かかる点突然変異の結果、アミノ酸レベルでのサイレント突然変異または前記したごとき置換突然変異体が生じ得る。また置換突然変異も本発明によって包含され、ここで置換はいずれのタイプについても可能である。好ましくは突然変異体の一致は配列番号9に従うアミノ酸配列に比し85−100%であり、より好ましくは90−100%であり、最も好ましくは95−100%である。配列番号9に従うアミノ酸配列と80−100%の一致を示す、すでに前記で請求したアミノ酸配列は、同等なる語により包含されるので、アミノ酸配列の20%まで欠失および/または置換が、好ましくは15%より少ない、より好ましくは10%より少ない、最も好ましくは5%より少ない本発明のアミノ酸配列が含有される。かかる突然変異体は1以上のアミノ酸配列部分において欠失および/または置換を含む。しかしながら、かかる欠失および/または置換突然変異体は、亜鉛フィンガー結合部位に対応するアミノ酸配列およびRRRLWWモチーフに対応するアミノ酸配列を含むであろう。1−5個のアミノ酸欠失突然変異体は本発明の範囲内にあるとみなされる。5個より多いアミノ酸欠失および/または5個より多い置換および/または点突然変異を有する欠失突然変異もDNA結合活性を維持し得る。好ましくは、かかるより多数の欠失および/または置換および/または点突然変異は、該アミノ酸配列のおよび該核酸配列のコードに対応する部分のN末端半分において生じる。調節および活性化に関わると考えられる最も重要な領域は、亜鉛フィンガー結合領域由来の該アミノ酸配列のC末端半分に存在し、欠失突然変異体それ自体は好ましくは、少なくともこのアミノ酸配列部分を含む。好ましくは、ヌクレオチド1110ないし1260位のヌクレオチド由来の配列番号9でコードされたものに対応する亜鉛フィンガー結合領域に突然変異が存在しないことであろう。もし突然変異が存在する場合は、好ましくは、それは亜鉛に配位する6個のシステイン間のスペーシングを含むべきではなく、最も好ましくは、いずれの突然変異も6個のシステインそれ自身のいずれをも含むべきではない。さらに好ましくは、配列番号9に従うアミノ酸配列に存在するRRRLWWモチーフに突然変異が存在しないことである。欠失はアミノ酸配列の1以上の断片で起こってもよい。しかしながら、かかる欠失突然変異体は亜鉛フィンガー結合領域に対応するアミノ酸配列およびRRRLWWモチーフに対応するアミノ酸配列を含む。1−15個のアミノ酸の欠失、好ましくは1−10個のアミノ酸の欠失、最も好ましくは1−5個のアミノ酸の欠失は、同等性を保証する適当した態様である。
同等核酸配列の態様は、配列番号9に従うxylRののごとき、または配列番号9に従うxlnRの核酸配列によってコードされるごとき同一のアミノ酸配列を有する発現生成物コードする核酸配列である。配列番号9に従うxylRのアミノ酸配列と80−100%の一致を示す発現生成物をコードする核酸配列、または配列番号9に従うxylRをコードする核酸配列によってコードされたごとき核酸配列もまた、xlnRの同等核酸配列であるとみなされ、これも本発明の範囲内にある。本発明の同等核酸配列のもう一つの態様は、核酸配列番号9から誘導されたプライマーまたはプローブに対して実施例で定義したごとき特異的最小ストリンジェンシィー条件の下でハイブリッド形成可能な核酸配列であり、該プライマーまたはプローブは非亜鉛フィンガー結合領域から誘導され、該プライマーまたはプローブは少なくとも20個のヌクレオチドの長さを有している。一般的にプローブおよびプライマーに適した長さは20−60個のヌクレオチドの間であり、好ましくは25−60個である。好ましくは、プローブまたはプライマーは、該Zincフィンガー結合領域由来の配列番号9に従う半分をコードするC−末端から誘導される。本発明の核酸配列の好ましい態様は、核酸配列番号9に対する実施例で例示された、少なくともストリンジェントの特異的条件の下でハイブリッド形成が可能であろう。同等核酸配列は、例えば、前記したごとき核酸配列番号9に基づくプライマーを用いるPCRによって他の生物から誘導できよう。また、現に定義したごとき同等核酸配列の発現生成物も本発明の範囲内にあるとみなされる。逆にまた、本発明の同等アミノ酸配列をコードする核酸配列も同等核酸配列なる語の範囲内であるとみなされる。特に、同等核酸配列および糸状菌および植物から誘導可能なかかる配列の発現生成物は、本発明の好ましい態様である。好ましくは、同等核酸配列は1110ないし1260位からのヌクレオチド由来の配列番号9でコードされたものに対応する亜鉛フィンガー結合領域をコードする核酸配列を含むであろう。好ましい態様において、該同等核酸配列は亜鉛に配位する6個のシステインをコードするはずである。さらなる態様において、システイン間のスペーシングが配列番号9に従うそれに対応するはずである。
また、前記した同等核酸配列および発現生成物の種々の態様の特性の組み合わせからなる態様も本発明の範囲内にある。また、該亜鉛フィンガー結合ドメインにおける突然変異を有する突然変異体も、DNA結合の増加を示し得るので請求される。また、DNA結合の減少を示す突然変異体も、本発明の範囲内にあるとみなされる。かかる突然変異体は該Zincフィンガー結合ドメインに突然変異を有するかもしれない。特に、配列番号9にて提供されたアミノ酸配列の突然変異体を請求する。
また、少なくとも15個のヌクレオチドの配列番号9に従う核酸配列の断片も、本発明の範囲内にある。かかる断片は同等配列を検出および単離するためにプローブまたはプライマーとして使用できる。特に、2個以上のかかる断片の組み合わせが、かかる同等配列を検出するおよび/または単離するためのキットにおいて有用であり得る。好ましくは、断片は配列番号9に従うアミノ酸配列のC末端半分から誘導されよう。適したキットの態様において、一つの断片は該亜鉛フィンガードメインを形成する核酸配列の一部からなるのではない。実施例において、プライマーとして使用される断片の適した組み合わせを例示した。これらのプライマーとともに実施例に例示したごとき、PCRを介して得られたいずれの配列も、本発明の範囲内にあるとみなされる。実施例で用いられたハイブリッド形成条件は、選択のために必要な最小ストリンジェンシィーを提供する。さらなるストリンジェンシィー条件は、配列番号9で得られた配列の相同性を高めるために、Sambrookらによって記載されたストリンジェントハイブリッド形成条件のごときを適用できる。一般的により低い塩濃度はよりストリンジェントな条件を意味する。また、完全配列の標的遺伝子結合活性を示すポリペプチドである、またはそれをコードする配列番号9に従う配列断片はいずれも、ハイブリッド形成および/または突然変異および/または完全配列に対する遺伝的コードの同義性の点で、前記に定義されたごときに定義された同等性をもって同等核酸配列またはそのアミノ酸配列であるとして、本発明の範囲内に含まれる。
また、前記したごときxylRまたはその同等配列をコードする核酸配列を含むベクターまたはプラスミドも、かかる配列を含むベクターまたはプラスミドおよびかかる付加的配列を含むホスト細胞をなすので、本発明の範囲内にある。配列番号9またはその同等体の核酸配列をコードする少なくとも一つの付加的コピーを運ぶ微生物または植物細胞のごとき、形質転換されたホスト細胞は、本発明の範囲内にある。好ましくは、種々の態様は体系づけられ、該配列はベクター、プラスミドまたはホスト細胞で発現可能である。該調節遺伝子は完全な配列番号9または単にその配列コードをホスト細胞で作動可能な別のプロモーターと組み合わせて含み得る。ホスト細胞の適切な例は、本明細書の他所で提供した。配列番号9に従う配列コードを組み込み得る種々のホスト細胞のための適切で作動可能なプロモーターは当業者には明らかであろう。特に、本明細書に明確に記載したホスト細胞に対する構成的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターは公知であり、過度の負担無く本発明の研究に利用できる。
同種または異種蛋白質あるいはペプチドの生産のための工程が提供され、該工程はホスト細胞において同種蛋白質またはペプチドをコードする核酸配列の発現からなり、該ホスト細胞はさらにxlnRまたはそれもまた発現されるその同等体のごとき調節遺伝子をコードする核酸配列の付加的コピーからなる。現に記載したごとき工程は、好ましくは、組合せ核酸発現カセットを用いて実施され、これは第一のプロモーターに作動可能なように連結された調節遺伝子を含み、該カセットはさらに第二のプロモータを含み、該第二のプロモーターは通常該レギュレーターの標的遺伝子と関連づけられ、該標的遺伝子プロモーターは発現する同種または異種蛋白質あるいはペプチドですらコードする核酸配列に作動可能なように連結される。第一のプロモーターは該調節遺伝子と本質的に関連づけられたプロモーターであり得るが、またホスト細胞において作動可能なように選択されたプロモーターであってもよい。発現の程度は、レギュレーターが非常に少量しか存在しなくとももはや制限されず、かくして発現すべき遺伝子の発現の程度は、調節遺伝子の付加的な存在を持たずに遺伝子が発現するホスト細胞に比して、ずっと高くなる。かかる発現の増加は、好ましくは、通常、影響する代謝経路の部分の成分を含む生物の細胞において達成される。適したホスト細胞は植物細胞または微生物である。適切には、該微生物は真菌類であり得、特にそれは糸状菌であり得る。適したホスト細胞の例は、本明細書の他所に与えられ、これも本明細書の一部とみなされてよい。レギュレーターの標的遺伝子を含むホスト細胞において、現に前記した種の組み合わせ発現カセットの組み込みは、標的遺伝子の発現の増加すなわち、複数標的遺伝子が存在すれば、標的遺伝子の発現の増加につながる。好ましくは、該標的遺伝子は該レギュレーターに本来備わっている。好ましくは、かかる標的遺伝子は該ホスト細胞にとって内因性である。実施例において、キシラン分解経路xlnRのレギュレーターの核酸配列を提供した。このレギュレーターについて本来備わっている標的遺伝子は、遺伝子xlnA、xlnB、xlnCおよびxlnDならびにaxeAを含むことが判明し、これらの遺伝子それ自身は好ましくは標的遺伝子である。他の標的も存在し、それも標的遺伝子なる語に含められるとみなされる。本発明のホスト細胞についての種々の態様が、本請求に包含される。もし調節配列および標的遺伝子の双方が該ホスト細胞に本来存在していれば、該調節配列は複数コピー中に存在することになる。かかる微生物は自然の微生物に比して、該標的遺伝子プロモーターによって調節された遺伝子を過剰に発現するであろう。
今、キシラナーゼレギュレーターについての配列が知られているので、キシラナーゼレギュレーターをノックアウトできるようになった。ひとたびノックアウトされるべき遺伝子の核酸配列が公知となれば、ノックアウトホスト細胞の作出は標準的な技術となる。この方法はBerkaら(1990)およびEP95201707.7の実施例11(これは、そのコピーが本文書を提出する際に含まれ、その実施例自身も実施例として本明細書にコピーされた、同時係属欧州特許出願である。)において記載された方法に類似して実施できる。かかるノックアウトはキシラン分解活性をなくし得たホスト細胞を与える。xlnR遺伝子のノックアウトのためにキシラン分解活性をなくしたホスト細胞は、キシラン分解活性が無いことを選択する同種または異種発現生成物を生産するために使用できる。ノックアウトされたxlnR遺伝子を有するホスト細胞は、本発明の範囲内にある。かかるホスト細胞は好ましくは、植物細胞または糸状菌である。かかる糸状菌は好ましくは、Aspergillusである。多くの適したホスト細胞における実施例は、本明細書の他所で提供された。
本発明の選択および突然変異誘発法用いて到達し得る調節遺伝子における突然変異を有するホスト細胞は、該調節遺伝子の正常な活性を持つコピーで補足を受け得る。かかる補足された株は次いで、該レギュレーターによって調節されるいずれの標的遺伝子の産物も発現するであろう。これらの標的遺伝子産物は、補足を受けないレギュレーター陰性突然変異体の場合においては存在しないであろう。両株からそれ自身公知の方法で得られた蛋白質バンドを比較すれば、いずれの標的遺伝子が該レギュレーターによって調節されるかが明らかになるであろうし、ひとたびその発現生成物が同定されれば、次いで、自体公知の方法でそれに対応する新規標的遺伝子が同定できる。この方法において、既に知られているもの以外の他の標的遺伝子を、即時の実施例においてキシラナーゼレギュレーターxylRに対して見いだすことができる。
実施例
実施例1:プラスミドの構築
実施例1.1:選択プラスミドpIM130の構築
選択プラスミドpIMI30は図1に示したごとくに構築した。PCR1にて、オリゴヌクレオチド1(配列番号:1)
およびオリゴヌクレオチドA(配列番号:2)
を用いて、プラスミドpIM120(de Graaffら、1994)から断片を生じさせた。オリゴヌクレオチド1はAspergillus tubigensis xlnAプロモーター(de Graaffら、1994)から誘導し、600−619位(配列番号:5)にNsiI部位を含む10個のヌクレオチドを付加した。オリゴヌクレオチドAの3’末端は、転写開始部位(708−723位)(配列番号:6)の直前で終わる、Aspergillus niger goxC転写ユニット(Whittingtonら、1990)から誘導し、一方5’末端は、転写開始部位で始まる(341ないし359、配列番号:7)A.niger pyrA遺伝子の暗号領域から誘導した(Wilsonら、1988)。
断片Aは、最終容量100μl中に10μl*反応緩衝液(100mMトリス−HCl、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01%ゼラチン)、1.25mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸各々16μl、プラスミドpIM120 DNA1ng、オリゴヌクレオチド1およびA各々1μgを含むPCRによって生じさせた。この反応混合液を混合し、1μlのTAQポリメラーゼ(5U/μl)(Life Technologies)を添加した。該DNAを92℃3分間のインキュベーション、次いで92℃1分、48℃1分、72℃1分の25サイクルによって変性させた。25サイクル後、混合液を72℃で5分間インキュベートした。アガロース電気泳動による該反応生成物の分析は、約250bpの断片を明らかにし、これは該遺伝子の配列を基に推定されたサイズに一致する。
PCR2にて、オリゴヌクレオチド2(配列番号:3)
およびオリゴヌクレオチドB(配列番号:4)
を用いて、プラスミドpGW635(Goosenら、1987)から断片を生じさせた。オリゴヌクレオチドBの5’末端は、A.niger goxC基本転写ユニット(708−723位、配列番号:6)(Whittingtonら、1990)から誘導し、一方、3’末端は転写開始部位で始まるA.niger pyrA遺伝子の暗号領域から誘導した。オリゴヌクレオチド2はpyrA暗号領域(339−359位、配列番号:7)から誘導し、602位(配列番号:7)にてEcoRV制限部位をつないだ。
断片Bは、この場合においては反応混合液にオリゴヌクレオチド2およびBを各々1μg、ならびにプラスミドpGW635DNA1ngを含んだ以外は、断片Aと同一の方法で生じさせた。アガロース電気泳動による反応生成物の分析は、約250bpの断片を明らかにし、これはpyrA遺伝子の配列を基に推定されたサイズに一致する。
電気泳動後、断片AおよびBをアガロースゲルから単離した。該断片をアガロースゲルから切り取り、その後ISCOカップを用いた電気溶出によりアガロース片からそれらを回収した。このカップの大および小容器双方に透析膜を設置し、該カップを0.005×TAE(1000mlにつき50×TAE緩衝液:242.0gトリズマベース(Sigma)、7.1ml氷酢酸、100mlの0.5M EDTA pH8.0)で満たし、カップの大容器中にアガロース片を置いた。次いで、1*TAEを含む陽極チャンバーに大容器、1*TAE/3M NaAcを含んだ陰極に小容器として、カップを電気溶出装置に置いた。断片を100Vで1時間電気溶出した。この期間の後、カップを電気溶出装置から取り出し、大容器から緩衝液を除去し、他方、小容器からは緩衝液は上部からのみ除去した。DNA断片を含む残りの緩衝液(200μl)をカップ中で蒸留水に対し30分間透析した。最終的にDNAは、0.1容量の3M NaAc、pH5.6および2容量の冷(−20℃)エタノールの添加により沈殿させた。DNAを4℃にて14,000×gで30分間の遠心分離(エッペンドルフ遠心機)によって集めた。上清を除去した後、DNAペレットをSavant Speedvac真空遠心機を用いて乾燥させた。DNAを10μlのTE緩衝液(TE:10mMトリス/HCl pH7.2、1mM EDTA pH8.0)に溶解させ、標準として既知濃度のラムダDNAおよびDNA検出のためのエチジウムブロマイド染色を用いて、該濃縮液をアガロースゲル電気泳動によって同定した。
断片AおよびBは、この場合においては反応混合液にオリゴヌクレオチド1および2を各々1μg、ならびに断片AおよびBを各々およそ50μg含んだ以外は、PCR1と同一であるPCR3にて融合させた。アガロースゲル電気泳動による反応生成物の分析は、約500bpの断片を明らかにし、これは該遺伝子の配列を基に推定されたサイズに一致する。
得られた断片Cを記載したごときにアガロースゲルから単離し、次いで制限酵素NsiIおよびEcoRVを用いて消化した。DNAを次の溶液からなる反応混合液中で37℃にて3時間消化させた;5μl(≒0.5μg)DNA溶液;2μlのおよそ10×反応緩衝液(Life Technologies);10U反応酵素(Life Technologies)および滅菌蒸留水で最終容量20μlにする。消化後、DAN断片をアガロースゲル電気泳動によって分析し、次いで記載したごときにゲルから単離した。
pIM130の最終構築体に対し、5μgのプラスミドpGW635を、最終容量500μl中50Uの制限酵素EcoRVおよびXbaIを用いて、記載したごとくに消化した。生成物の分離後、2.2kb EcoRV/XbaI断片(断片D)を電気溶出によってアガロースゲルから単離した。同様に1μgベクターpGEM−7Zf(+)(Promega)を制限酵素NisI/XbaIを用いた消化により調製し、消化後これを電気泳動にかけ、電気溶出によりアガロースゲルから単離した。
プラスミドpIM130を下記の連結反応によって構築した:100ng pGEM−7Zf(+)NisI/XbaI断片を50ng断片Cおよび50ng断片Dおよび4μl5*連結反応緩衝液(成分;500mMトリス−HCl、pH7.6;100mM MgCl2;10mM ATP;10mMジチオスレイトール;25%PEG−6000)および1μl(1.2U/μl)のT4DNAリガーゼ(Life Technologies)を最終容量20μl中にこの混合液を添加した。14℃16時間のインキュベーション後、該混合液を滅菌水で100μlに希釈した。該希釈混合液10μlを、Sambrookら、1989によって記載されたごときに調製し、大腸菌(E.coli)DH5a感応細胞を形質転換するために使用した。
得られた2つのコロニーをアンピシリン100μg/mlを含むLB培地(1000ml当たりのLB培地:10gトリプチカーゼペプトン(BBL)、5g酵母抽出物(BBL)、10gNaCl、0.5mMトリス−HCl pH7.5)中で一晩増殖させた。培養物からプラスミドDNAをManiatisら(1982)によって記載されたごときアルカリ溶菌法によって単離し、これを所望のプラスミドpIM130をかくまうクローンを選択するための制限酵素分析に用いた。100mg/mlのアンピシリンを含むLB培地で増殖させたpIM130を含む大腸菌(E.coli)DH5a培養物500mlから大スケールでプラスミドDNAを単離した(Maniatisら、1982)。該プラスミドをCsCl遠心分離により精製し、フェノール溶菌させ、エタノール沈殿させおよび400μlTEに溶解させた。収量はおよそ500μgであった。
実施例1.2:プラスミドpIM135の構築
プラスミドpIM120から、pyrA暗号領域および末端領域に融合させたgoxC基本転写ユニットを含む二次プラスミドを構築した。PCR4にて、NsiI部位を含む10個のヌクレオチドを付加したgoxC基本転写ユニット(640−660位、配列番号:6)から誘導したオリゴヌクレオチド3、
およびオリゴヌクレオチド2(式3)を用いて、プラスミドpIM120から断片を生じさせた。生じた断片をゲルから単離し、NsiIおよびEcoRVで消化し、プラスミドpGEM−7Zf(+)にてpGW635の2.2kb EcoRV/XbaI断片とともにクローン化し、これを実施例1.1に記載したごときにXbaI/NsiIで消化して、結果としてプラスミドpIM135を得た。
該プラスミドpIM135は、いずれの所望の誘導可能なエンハンサーまたはアクチベーター配列、代謝を含む遺伝子のUASも有する、本発明のベクターを調製するための構築伝達体として使用できる。pIM135は二方向性マーカー遺伝子(pyrA)に作動可能なように連結された基本転写ユニット(tGOX)を含む。
実施例2:プラスミドpIM130を用いたA.nigerの形質転換
Aspergillus最小培地(MM)(1リットル当たり含量:6.0g NaNO3、1.5g KH2PO4、0.5g MgSO4・7H2O、0.5g KCl、示されたごとき炭素源、pH6.0および1mlのVishniac溶液(1リットル当たり含量10g EDTA、4.4g ZnSO4・7H2O、1.0g MnCl2・4H2O、0.32gCoCl2・6H2O、0.32g CuSO4・5H2O、0.22g(NH4)6Mo7O24・4H2O、1.47g CaCl2・2H2O、1.0g FeSO4・7H2O、pH4.0)からなる培地250mlに2%グルコース、0.5%酵母抽出物、0.2%カザミノ酸(ビタミンフリー)、10mM L−アルギニン、10μMニコチンアミド、10mMウリジンを添加し、株NW205(cspA1、pyrA6、nicA1、argB13)1×106胞子/mlとともにインキュベートし、オービタルNew Brunswickシェーカーにて250rpm、30℃で16−18時間菌糸体を増殖させた。該菌糸体をブフナー漏斗および穏やかな吸引を用いてミラクロス(ナイロンガーゼ)上で収穫し、SP6(SP6:0.8%NaCl、10mM Na−リン酸緩衝液pH6.0)で数回洗浄した。150mgのノボザイム234を20ml SMC(SMC:1.33Mソルビトール、50mM CaCl2、20mM MES緩衝液、pH5.8)に溶解し、そこへ1g(湿潤重量)の菌糸体を加え注意深く懸濁させた。この懸濁液を30℃で1−2時間緩やかに振とうしながらインキュベートし、30分毎に菌糸を注意深く再懸濁させ、プロトプラストを計数するためのヘマチトメーターを用いてプロトプラスト形成をモニターするため試料を採取した。十分なプロトプラストが存在した時(1×103以上)、これらを注意深く再懸濁させ滅菌ガラスウールプラグ上での濾過により菌糸残渣を除去した。該プロトプラストをベンチ遠心機で4℃3000rpmにて10分間の遠心分離によって集め、5mlのSTC(STC:1.33Mソルビトール、50mM CaCl2、10mMトリス/HCl、pH7.5)中に注意深く再懸濁した。この洗浄工程を2回繰り返し、該プロトプラストを最終的にSTCに1×103/mlの密度で再懸濁させた。
形質転換は、1μgのpIM130DNA(10−20μlTE中に溶解)を50μのPEG緩衝液(PEG緩衝液:25%PEG−6000、50mM CaCl2、10mMトリス/HCl pH7.2)とともに200μlのプロトプラスト懸濁液に添加しすることにより実施し、ピペッティングにより数回上下させて穏やかに混合し、室温で20分間インキュベートした。この後、2mlのPEG緩衝液を添加し、該溶液を穏やかに混合し、室温でさらに5分間インキュベートし、次いで4mlのSTCを添加してボルテックスミキサーで穏やかに混合した。また、5μg pIM130ならびに、1および5μgのプラスミドpGW635DNAを用いてこれを行った。陰性対照としては、20μlのTEを該プロトプラストに添加した。
次いで、この懸濁液の一部1mlを4mlの浸透圧を安定化させた上層寒天に添加し、炭素源として100mMD−グルコースまたは100mMD−キシロースのいずれかを有するMMSを含むプレートに注いだ(上層寒天で穏やかに回し入れてプレートを被覆する)。これらの培地は(MMS)は0.8M KClを用いてまたは1.33Mソルビトールを用いることによって浸透圧を安定化させた。
再分化のパーセンテージを決定するために、該プロトプラストの連続希釈を形質転換の前(未処理のプロトプラストは氷上で維持された)、および形質転換後(陰性対照から得られた)に調製した。100μlの10-3、10-4、10-5および10-6希釈を10mMウリジンを添加したMMSプレートに2づつ(duplicate)にて平板培養した。
そこで菌類がプラスミドpGW635を用いて形質転換された陽性対照については、すべてのプレートでコロニーが見られた。しかしながら、KClで安定化させた培地での形質転換頻度は(1−10形質転換体/μgプラスミドDNA)、ソルビトールで安定化させた培地(100−1000形質転換体/μgプラスミドDNA)よりもずっと低かった。このことは後者の培地で再分化頻度が非常に高かったことにより、これはKClで安定化させた培地における2−5%に比して、約90%であった。
プラスミドpIM30を用いた形質転換の場合は、炭素源としてD−キシロースを含む培地では形質転換体は見られたが、D−グルコースを含む培地では見られなかった。ソルビトールで安定化させた培地での頻度は約100/μgプラスミドDNAであったが、KClで安定化させた培地での頻度は1/μgDNAより低かった。
実施例3 形質転換体の分析
100mM D−グルコース、100mM D−グルコース/1%オートスペルト・キシラン(Sigma #X0627)および1%オートスペルト・キシランを含有するMM上で平板培養することによって、実施例2で得られたpIM130からの形質転換体を分析した。選択した形質転換体をこれらの培地にレプリカ平板培養し、30℃でインキュベートした。形質転換体の約75%はキシラン含有培地上で増殖しており、他方、D−グルコースを含有する培地上では増殖は見い出されなかった。コロニーの残りの25%は全ての3つのテストした培地上で増殖した。
予測された表現型(キシラン含有培地上の増殖、D−グルコース含有培地上の非増殖)を有する5つの形質転換体の選択は、サザン分析によって行った。実質的にGraaffら,1988によって記載されているごとく植物RNAを単離するのに使用される修飾手法によって菌類DNAを単離した。培養基中で一晩増殖させた菌糸体を収穫し、冷生理食塩水で洗浄し、液体窒素中で凍結し、−80℃で貯蔵した。マクイロディスメンブレーター(Braun)を用いて0.5gの凍結菌糸体を破壊することによって単離した。得られた菌糸体粉末を新たに調製した抽出緩衝液で抽出した。抽出緩衝液を以下のごとくに調製した:1mlトリ−イソプロピルナフタレンスルホン酸(TNS)(20mg/ml)を1mlのp−アミノサリチル酸(PAS)(120mg/ml)と徹底的に混合し、0.5ml 5×RNB緩衝液を添加した(5×RNBは1リットル(pH8.5)中に121.10gトリス、73.04g NaClおよび95.10g EGTAを含有した)。1.5mlフェノールの添加の後に、抽出緩衝液を55℃で10分間平衡化させた。次いで、暖かい緩衝液を菌糸体粉末に添加し、ボルテックスミキサーを用いて懸濁液を徹底的に1分間混合した。1mlのクロロホルムの添加後、懸濁液を1分間再混合した。ソルボール(Sorvall)高速遠心機を用いる104×gでの10分間の遠心の後、水相を等容量のフェノール/クロロホルム(1:1)でもう1回抽出し、次いで、クロロホルムで2回抽出した。以下の手法を用い、DNAを水相から単離した:DNAを室温にて2容量のエタノールで水相から直ちに沈殿させ、続いて、104×gにて10分間、Sorvall高速遠心機を用いる遠心によって収集し、DNAを蒸留した滅菌水に再溶解させ、それを再度エタノールで沈殿させることによって洗浄し、RNAseA(20gμg/ml)を最終溶液に添加することによってRNAを除去した。
野生型としてのA.ニゲール(A. niger)N402(cspA1)および前記した5種のpIM130形質転換体から単離した高分子量DNA(1−2μg)を製造業者の指示に従ってHpaI(Life Technologies)で消化した。得られた断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、Maniatisら(1982)によって記載された高結合(High−bond)N膜に移した。A.ニゲール(A. niger)pyrA遺伝子をプローブとして含有する、Sambrookら(1989)によって記載されているごとくに調製した、32P−標識した3.8kb XbaI断片を用いるハイブリダイゼーションを以下の手法に従って行った(Sambrookら;68℃における3−5時間の6×SSC(1000ml当たり20×SSC:175.3g NaCl、107.1gクエン酸ナトリウム・5.5H2O、pH7.0)、0.1%SDS、0.05ピロリン酸ナトリウム、5*デンハート溶液(500ml当たり100×デンハート溶液:10gFicoll−400、10gポリビニルピロリドン、10gウシ血清アルブミン(PentaxフラクションV)および20μg/ml変性ニシン精子DNA)中でのプレハイブリダイゼーションおよび68℃における15−18時間の変性放射性標識プローブを含有する同一緩衝液中でのハイブリダイゼーション、続いての68℃における3×SSC、0.1%SDS中での2回の洗浄、および68℃における0.2×SSC、0.1%SDS中での2回の洗浄。膜をサランラップで被覆し、コニカ製X−線フィルムおよび正規増感スクリーンを備えたコダックX−オステック(Omatic)カセットを用い、−70℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
その結果、10kbのハイブリダイジングバンドがN402レーンで見い出され、他方、このバンドは形質転換体NW205::130#1およびMW205::130#2およびMW205::130#3では失われる。形質転換体NW205::130#1およびMW205::130#3においては、15kbハイブリダイジング断片が見い出され、他方、MW205::130#2では、20kbバンドが見い出される。これらの結果は、各々、相同pyrA遺伝子座における単一および二重コピー組込みに対応する。形質転換体MW205::130#4およびMW205::130#5においては、該プラスミドが非相同遺伝子座に取り込まれた。形質転換体NW205::130#2を突然変異誘発につき選択した。
pIM130のUAS断片はUASの刺激活性を呈するための陽性レギュレーターに必要な結合部位を含む。かくして、pIM130を含むホスト細胞におけるxlnRの阻害の結果、pIM130に存在するに方向マーカーの陰性発現となった。xlnRの発現はキシランまたはキシロースによって誘導される。かくして、かかる基質の存在の結果、もしホストがxlnRを保有するならば、pIM130の二方向マーカーの発現となる。
pIM130のUAS断片は、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)xlnA遺伝子の天然UASに存在するcreAの阻害活性に必要な部位を含まない。かくして、グルコースの存在は、A.ニゲールをCRE A*とし、引き続いて、xlnAのUASおよびxlnDおよびaxeAのごときキシラン分解酵素をコードする遺伝子を阻害し、また、前記したキシラン分解酵素をコードする遺伝子のUASのアクチベーターをコードするxlnR遺伝子を阻害する、すなわち、pIM130の陰性発現の結果となるキシラン分解酵素発現を抑制する。
実施例4:突然変異体の選択
実施例4.1:抑制された突然変異体の選択
NW205::130#2の胞子を5ml ST(ST:0.8% NaCl、0.05%Tween20)中で収穫し、高周波数で振盪し、菌糸体デブリスを滅菌ガラスウールプラグ上の濾過によって除去した。ベンチ遠心機にての室温における3000rpmでの10分間の遠心によって胞子を収集し、5ml生理食塩水に再懸濁させた。この洗浄工程を2回反復し、胞子を最終的に1ml当たり1*107の密度にて生理食塩水に再懸濁させた。10mlの胞子懸濁液をガラスペトリ皿に分散させ、UVを用いて18エルグ/mm2/分の線量で2分間照射した。突然変異誘発の後、105および106胞子を、3%D−グルコースを含有するMM+10mM L−アルギニン+10μMニコチンアミド上、および3%D−グルコース/3%オートスペント・キシラン(Sigma #X0627)を含有するプレートで平板培養した(各10プレート)。
4−7日後に、その形態に基づいて、3つのクラス:大きくて胞子形成されたコロニー、中程度のサイズのよく胞子形成されたコロニーおよび小さくて貧弱な胞子形成のコロニーに分けることができる、プレート当たり5−10突然変異体コロニー(接種した106胞子)が見い出された。これらの突然変異体から20をランダムに選択し、選択された突然変異体を、異なる炭素源または基質を含有する培地でテストした。突然変異体コロニーは、D−グルコース、D−グルコース/キシランおよびキシランを含有する培地で成長できることが判明し、一方、親株のNW205::130#2のみは、炭素源としてキシランを含む培地で成長することが出来た。加えて、これらの突然変異体を異なる色原体基質:4−メチルウンベリフェリル−β−D−シキロシド(β−キシロシダーゼ、エンドキシラナーゼ)(Sigma #M7008)、4−メチルウンベリフェリルアセテート(アセチル−キシランエステラーゼ)(Sigma #M0883)、4−メチルウンベリフェリル−α−L−アラビノフラノシド(アラビノフラノシダーゼ)(Sigma #M9519)上で、およびレマゾールブリリアントブルー修飾キシラン(エンド−キシラナーゼ)(Sigma #M5019)上でテストした。メチルウンベリフェル誘導体は、D−グルコース、D−グルコース/キシランおよびキシランを含有する培地最終濃度に1mMで添加し、他方、RBB−キシランをD−グルコース/キシランおよびキシランを含有する培地に最終濃度1mg/mlで添加した。テストした全てのこれらの基質につき、D−グルコース含有培地上での増殖後の突然変異体で酵素活性が見い出され、他方、親株NW205::pIM130#2で発現は見い出されなかった。キシランを含有する培地で、NW205::pIM130と比較してこれらの酵素の増大した発現が見い出された。テストした突然変異体のうち、突然変異体5Bは最高レベルの発現を有していた。この場合において、選択は、キシラノリシスの阻害剤、すなわちグルコースとして正常に活性な基質で起こった。発現が抑制の不存在下で起こり得るかを確認するために、キシラン分解遺伝子xylanのインデューサーも含ませた。かかる対照テストは、好ましくは、本発明の方法に含まれる。突然変異体は明らかに抑制を示した。
生産された活性レベルの比較のために、A.ニゲールN402および突然変異体5Bを共に炭素源として1.5%粗製小麦アラビノ−キシランを含有するMM上で培養した。試料を24、42、72および96時間に採取し、α−L−アラビノフラノシダーゼ、エンド−キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を測定した。結果(図2A、B、C)は、全ての3種の酵素に対する突然変異体株につき活性の増大を示した。α−L−アラビノフラノシダーゼおよびエンド−キシラナーゼ活性は最も強く増加した。
実施例4.2:非発現突然変異体の選択
株NW205::130#2の胞子を収穫し、実施例4.1に記載したごとくに突然変異させ、引き続いて、10mMウリジン、10mML−アルギニンおよび0.8mg/mlの5−フルオロオロチン酸(Sigma #F5013)を含有するMM上で平板培養した。これらのプレートを30℃で4−7日間インキュベートした。PYR−表現型を有する64の増殖コロニーを、1%キシラン+10mMウリジン+10mML−アルギニン+10μMニコチンアミドを含有するMM上で平板培養することによってキシリナーゼ発現につき分析した。テストしたこれらの64の突然変異体のうち、10はキシラン含有プレート上で清澄ゾーンの減少を与え、潜在的キシラナーゼレベルの低下を有した。これらの突然変異体の表現型を、ウリジンの存在および不在下で、D−グルコース、D−グルコース/キシランおよびキシランを含有する培地上で確認した。全ての10の突然変異体はウリジンを含まない培地では増殖しなかった。
さらなる分析のため、これらの突然変異体を、50mMフラクトース+10mMウリジン+10mM L−アルギニン+10μMニコチンアミドを含有するMM上にて、30℃で18時間前培養し、しかる後、菌糸体を収穫し、1gの湿潤菌糸体を、1%キシランを含有するMMおよび10mM D−キシロース+10mMウリジン+10mM L−アルギニン+10μMニコチンアミドを含有するMMに移した。30℃における5.5時間のインキュベーションの後、菌糸体および培養濾液を収穫した。培養濾液を1mM NaPipH5.6に対して透析し、しかる後、キシラナーゼ(Baileyら,(1991))を測定し、β−キシロシダーゼ活性を測定した(表1)。キシラナーゼならびにβ−キシロシダーゼ発現レベルが共にこれらの選択した突然変異体では強く減少することが判明した。
実施例5 非発現突然変異体の相補性
5.1 A.ニゲール・ゲノミックプラスミドライブラリーの構築
プラスミドライブラリーの構築のために、最終容量100μl中の3.5U Sau3A(Life-Technologies)を用い、製造業者の指示に従って、実施例3に記載したごとくに単離した、A.ニゲールNM128(cspA1、nicA1、pyrA6、goxC17)のゲノムDNA10μgを37℃で30分間部分的に消化した。アガロースゲル電気泳動による断片の分離の後、6.7kbないし9.4kbのサイズ範囲の断片を、低融点アガロースゲルから切断し、Sambrookら(1989)が記載したごとくに単離した。合計6つの消化物から4μgの断片を最終濃度100ng/μlにて単離した。得られた断片600ngを製造業者の指示に従って100ngのBamHI消化のpUC18(Pharmacia #27526201)中で連結した。連結後、4μgの得られた連結混合物を用いて、製造業者の指示に従って、100μlの大腸菌(E.Coli)DH5α混在能力の充分な(Max Efficiency)細胞(Life Technologies)を形質転換させた。6つの引き続いての形質転換実験の結果、約5*104コロニーが得られた。これらのコロニーの再懸濁および100μg/mlアンピシリンを含有するTY培地(100ml当たりの培地:16g上級ペプトン(select peptone)140(Life Technologies)、10gのNaClおよび10gの酵母エキス)中での37℃での3時間の培養の後、プラスミドDNAを単離し、CsCl遠心によって精製した。
5.2 非発現突然変異体の相補性
非発現突然変異体の相補性のため、選択した3種の突然変異体、NW205::130Ac1−4、NW205::130 Ac1−15およびNW205::130Ac4−4につきこれらの株のプロトプラストを調製し、実施例2に記載したごとくに形質転換させた。これらの形質転換実験においては、108プロトプラストを用い、これを実施例5.1に記載したA.ニゲールプラスミドライブラリーの20μg DNAと組み合わせ、また自律複製プラスミドpHELP1(GemsおよびClutterbuck, 1993)の10μgDNAと合わせたプラスミドライブラリーの10μgと組み合わせ、また自律複製プラスミドpHELP1の10μgDNAと合わせたプラスミドライブラリーの20μgDNAとを組み合わせた。陽性対照として、2μgのpGW635を用いた。形質転換手法の後、10μMニコチンアミドおよび10mM L−アルギニンを補足した炭素源としての50mM D−キシロースを含有する1.33Mソルビトールで安定化させたMM上で混合物を平板培養した。約4日後、コロニーが陽性対照プレートに出現し、これを計数し、他方、6日後に相補性プレートからコロニーを拾うことができた。
1%オートスペルトキシラン、1mM 4−メチルウンベルフェリル−β−D−キシロシド、10μMニコチンアミドおよび10mM L−アルギニンを含有する培地上で平板培養することによって、得られた形質転換体コロニーを分析した。30℃での6−7時間のインキュベーションの後に、xx蛍光コロニーを検出した。2−3日後、これらのコロニーのまわりのキシランの清澄化が出現した。
実施例6:A.ニゲールxlnR遺伝子のクローニング
実施例6.1:A.ニゲールxlnR遺伝子の単離
A.ニゲールxlnR遺伝子を得られた形質転換体から単離し、実施例5.2に記載したごとくに選択した。NW205::130 Ac1−4、NW205::130 Ac1−15およびNW205::130 Ac4−4から得られた13の形質転換体から、全DNAを、Graffら,1988によって記載されているごとくに単離した。C源としての1.5%粗製小麦アラビノ−キシラン上でのpyrAおよびキシラン分解発現のための選択(すなわち、誘導)条件下で菌糸体を培養した後、遊離複製プラスミドをNucleobond AX100カラム(Machery & Nagel)を用いて単離した。400μlの滅菌水中に溶解させた200μgの全DNAを2mlのS1緩衝液(50μMトリス−HCl pH8.0、10mM EDTA、100μg RNaseA)、2mlのS2(200mM NaOH、1%SDS)と混合し、続いて、室温でインキュベートし、2mlのS3(2.60M KAc、pH5.2)と混合し、続いて氷上で5分間インキュベートした。15,000gにおける30分間の懸濁液の清澄化の後、全て「プラスミドおよびコスミドの精製のための実験手法」(5.3修飾アルカリ性/SDS溶解)についての製造業者の指示に従って、プラスミドの吸着、洗浄、溶出および沈殿を行った。150μlの滅菌水に溶解させた20μlの得られたプラスミドDNAを大腸菌(E.Coli)DH5α形質転換で用いた。(Sambrookら,1989)。各プラスミド調製物から得られた12の大腸菌(E.Coli)のコロニーを、50μg/mlアンピシリンを含有する250ml LB培地中、37℃で9−12時間培養し、しかる後、Sambrooko, 1989によって沸騰溶解プロトコルにつき記載されている1.5ml培養で、ミニプレププラスミドDNA単離を行い、遠心によって細胞をペレット化し、−20℃で貯蔵した。アガロース電気泳動によるHindIII消化後におけるこれらのDNA調製物の分析により、3つのクラスのプラスミド:pHELPタイプのプラスミド、ゲノミックライブラリータイプのプラスミドおよび大きい複合体タイプのプラスミドが明らかとされた。後者のタイプのプラスミドを含有するコロニーから、修飾されたアルカリ性/SDS溶解(Macherey-Nagel)についての製造業者の指示に従ってヌクレオボンド(Nucleobond)AX100カラムを用いる大規模プラスミド単離を、250mlの培養の凍結ペレットで行った。この結果、各々、2つのプラスミドタイプAおよびB、相補体AおよびBが単離された。これらの両プラスミドをSalI、PstI、EcoRI、HindIIIを用いて消化し、アガロース電気泳動の後、変性放射性標識pHELP1、プラスミドAおよびプラスミドBを用いるサザン分析によって、断片を三連で分析した。これは、両プラスミドAおよびBは、pHELP部分以外に、同一のゲノム領域を有することを示した。ベクターおよびAMA1配列を示す、pHELPプラスミドを用いて見い出されたハイダリダイゼーションシグナルおよびプラスミドAおよびBシグナルの間の差異に基づき、プラスミドAおよびB双方とハイブリダイズするが、pHELP1とハイブリダイズしない断片を同定し、サブクローンした。プラスミドBの4kb EcoRI断片および6.5kb HindIII断片、およびプラスミドAの3kb PstI断片はプラスミドAおよびB双方とハイブリダイズすることが判明し、pGEM7/EcoRI、pGEM7/HindIIIおよびpBluescript/PstIにサブクローニングし、その結果、各々、プラスミドpNP1、2および3が得られた。増殖および精製の後、これらのプラスミドを、実施例5.2に記載した突然変異体NW205::130 Ac4−4を用いる相補性実験で使用した。これらの実験において、pHELP1を用いることなく突然変異体を直接形質転換した。これらの実験において、6.5kb HindIII断片を含有するプラスミドpNP2は、突然変異の相補性を生起した。pNP2−由来のプラスミドのさらなるサブクローニングおよび形質転換により、pBluescriptにサブクローンされた5kb BamHI−XbaI断片が明らかとなり、プラスミドpNP8が得られ、株NW205::130 Ac4−4相補鎖が生起した。
実施例6.2:
A.ニゲールxlnR遺伝子のサブクローニング
xlnR遺伝子のサブクローニングのために、Harmsenら,1990によって記載されているごとくに構築したA.ニゲールのゲノミックライブラリーを、プローブとしてpNP1の4kb EcoRI断片を用いることによって、xlnR領域を含有するファージにつきスクリーニングした。平板培養細菌として大腸菌(E.Coli)LE392を用い、記載されているごとく(Maniatisら,1982)5つの85−mm直径NZYCM(1.5%寒天)プレート上、0.7%アガロースを含有するNZYCM頂部−アガロース中で、プレート当たり3×103pfuを平板培養した。37℃におけるプレートの一晩のインキュベーションの後、二連の各プレートをManiatisら(1982)に記載されているようにHybondN+フィルター(Amersham)上で作成した。3×SSC中でフィルターを湿らせた後、該フィルターを3×SSC中、室温にて60分間洗浄した。Sambrookら,1989によって記載されているごとくに調製した32P-標識4kb EcoRI断片を用いるハイブリダイゼーションを以下の手法(Sambrookら,1989)に従って行った:68℃における3−5時間の6×SSC(1000ml当たり20×SSC:175.3g NaCl、107.1gクエン酸ナトリウム・5.5H2O、pH7.0)、0.1%SDS、0.05%ピロリン酸ナトリウム、5*デンハートの溶液(500ml当たり100×デンハート溶液:10gのFicoll−400、10gのポリビニルピロリドン、10g胎児ウシ血清アルブミン(ペンタックスフラクションV)および20μg/ml変性ニシン精子DNA中でのプレハイブリダイゼーションおよび68℃における15−18時間の変性放射性標識プローブを含有する同一緩衝液中でのハイブリダイゼーション、続いての68℃における2×SSC、0.1%SDS中での2回の洗浄、および68℃における0.2×SSC、0.1%SDS中での2回の洗浄。膜をサランラップで被覆し、コニカX−線フィルムおよび正規増感スクリーンを備えたコダックX−Omaticカセットを用い、−70℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
このスクーリニングの結果、約12の陽性ファージが得られ、そのうち8つを精製した。パスツールピペットを用いて各陽性プラークをプレートから拾い、Maniatisら(1982)により記載されているごとく、ファージを、20μlクロロホルムを含有する1mlのSM緩衝液にて寒天栓から溶出させた。得られたファージを、50−100プラグの単離ファージを含有するプレートからのフィルターレプリカを用いて前記した手法を反復することによって精製した。
精製の後、NZYCM培地上で5×103ファージを平板培養することによってファージを増殖させた。37℃での一晩のインキュベーションの後、密集プラークが得られ、それから、5ml SM緩衝液を添加することによってファージを溶出させ、間欠的に振盪しつつ、4℃で2時間プレートを保存した。ピペットを用いる上清の収集の後、4℃にて4000×gで10分間遠心することによって細菌を溶液から除去した。上清に0.3%クロロホルムを添加し、pfuの数を決定した。これらのファージストック(A−R/H−R)はほぼ109pfu/mlを含有する。
Sambrookら(1989)により記載されているごとくに単離した5種のファージ、A−R、B−R、C−R、E−R、F−RからのDNAをサザン分析によって分析した。以下の溶液:5μl(〜1μg)DNA溶液;2μlの適当な10×反応緩衝液(Life Technologies):10U制限酵素(Life Technologies)および滅菌蒸留水よりなる反応混合物中でDNAを37℃で5時間消化して最終容量20μlを得た。試料を65℃で10分間インキュベートし、1*TAE緩衝液にての0.6%アガロースゲル上に負荷する前に氷上で迅速に冷却した。DNA断片を25Vにて15−18時間の電気泳動によって分離した。
電気泳動の後、DNAを移し、バキュジーン(VacuGene)XL指示マニュアル(25−26頁)に記載されているごとくにナイロン膜(Hybond N,Amersham)にアルカリ性真空ブロッティング(VacuGene XL, Pharmacia LKB)によって変性し、引き続いて、プレハイブリダイズさせ、前記したハイブリダイゼーション条件にてプラスミドpNP8の変性放射性標識5kb BamHI−XbaIを用いてハイブリダイズさせた。正規増感スクリーンを用い、−70℃で18時間コダックXAR-5 X−線フィルムに暴露することによってハイブリダイゼーションパターンを得た。全ての5つのクローンにおいて、同一ゲノム領域に由来する断片が見い出され、それにつき制限パターンが作成された。
制限地図に基づき、5kb BamHI−XbaI断片をサブクローニングのために選択した。100ngのpBluescript BamHI−XbaI消化ベクターを250ngのファージB−Rの5kb BamHI−XbaI DNAと混合し、4μlの5*連結緩衝液(組成;500mM トリス−HCl、pH7.6;100mM MgCl2;10mM ARP;10mM ジチオスレイトール;25%PEG−6000)、および1μl(1.2U/μl)T4 DNAリガーゼ(Life Technologies)を最終容量20μlにてこの混合物に添加した。14℃で16時間のインキュベーション後、混合物を滅菌水100μlに希釈した。10μlの希釈混合物を用いて、Sambrookら(1989)によって記載されているごとくに調製した大腸菌(E.Coli)DH5α能力細胞を形質転換させた。得られたコロニーのうち6つを、100μg/mlアンピシリンを含有するLB培地(1000ml当たりLB培地:10gトリプティカーゼペプトン(BRL)、5g酵母エキス(BRL)、10g NaCl、0.5mM トリス−HCl pH7.5)中で一晩培養した。該培養より、Maniatisら(1982)によって記載された沸騰溶解方法によって、プラスミドDNAを単離し、これを制限分析で用いて所望のプラスミドpIM230を保有するクローンを選択した。100μg/mlアンピシリンを含有するLB培地中で培養したpIM230を含有する500mlの培養大腸菌(E.Coki)DH5αから大規模にプラスミドDNAを単離した(Maniatisら,1982)。CsCl遠心によってプラスミドを精製し、エタノール沈殿させ、400μlのTEに溶解させた。収率はほぼ500μgであった。pIM230を含有する大腸菌(E.Coli)を、1996年6月に、ブダペスト条約の条件下で、CBS678.96の受託番号にてCBSに寄託した。
実施例6.3
A.ニーガーxlnR cDNAのサブクローニング
xlnR遺伝子の亜鉛フィンガー領域の一部のcDNAクローンを得るために、ZAPTM−cDNA合成キット(Stratagene)に記載された方法と同様に、1476−1496位で開始するオリゴヌクレオチド(配列番号9)にて、30時間キシラン上で培養したA.ニーガーN402野生型株からの1μgのポリA*+RNAで逆転写酵素および第2ストランド合成反応を行った。第2ストランド反応のアリコット(1/50)を、順次95℃、58℃および72℃の60分、続いて72℃の5分のインキュベーションの35サイクルにてのプライマーRO26およびRO25(配列番号9の946−970位な由来する)を用いるPCRで鋳型として使用した。500bpの得られた断片をpGEN−Tベクター(Promega)にサブクローンし、配列決定した。
実施例7:
xlnR遺伝子の一次構造
実施例7.1
xlnR遺伝子の配列分析
配列決定反応において特異的オリゴヌクレオチドのプライマーとしての使用と組み合わせ、pNP8およびpIM230双方からの断片をサブクローニングすることによって、A.ニゲールxlnR遺伝子、そのプロモーター/調節領域、該遺伝子の構造部分および終止領域の配列を決定した。
ヌクレオチド配列分析のため、制限断片を単離し、次いで、適当な制限酵素で消化したpEMBL、pUC、pBluescript、pGEM DNAベクターにクローン化した。ファルマシア ALF エクスプレス自動シーケンサーおよびサーモシークエンス(Thermosequenase)配列決定キット(Amersham)を用い、ジデオキシヌクレオチド鎖停止手法(Sangerら,1997)によって、ヌクレオチド配列を決定した。遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの場合には、ファルマシアCy5内部標識キットを、T7 DNAポリメラーゼ配列決定キット(Pharmacia)と組み合わせて用いた。反応および電気泳動は、製造業者の指示に従って行った。コンピューター解析はPC/GENEプログラム(Inteligenetics)を用いて行った。決定された配列を配列番号9に示す。
実施例7.2
xlnR遺伝子の記載
xlnR構造遺伝子を含む配列番号9で与えられる配列には、947ヌクレオチド長の上流領域が先行する。上流非コード領域においては、CT−リッチ配列が見い出されるが、TATAAボックスは見いだされない。xlnR遺伝子の構造部分は948位から3690位までの範囲であり、2つのイントロンによって中断される。1174位から1237位のイントロンは、実施例6.2に記載されたpIM230中のゲノム断片および実施例6.3に記載されたcDNAの一部を配列決定することによって確認した。第2のイントロンは3496位から3549位までに示される。第2イントロン配列は、スプライス連結および投げ縄(lariat)配列のための、通常は菌類に見い出される、保存されたイントロン配列に続く。
xlnR遺伝子は長さが875のアミノ酸の一部をコードする。誘導されたポリペプチドは、亜鉛に配位する典型的な6つのシステインと共に、1110位から1260位のヌクレオチドによってコードされる典型的なN−末端亜鉛二核クラスタードメインを含有する。この領域においては、ここに引用して本明細書の一部とみなすKraulisら(1992)の図1にリストされたごとく、他の菌類調節蛋白質とのさらに多数の類似点が示される。
典型的なRRRLWWモチーフが2623位ないし2649位に見い出され、このモチーフは、Suarezら(1995)によって記載された多数の二核亜鉛クラスター調節蛋白質中にわずかに変形されて見い出される。
実施例7.3
A.ニゲール突然変異体におけるxlnRの配列分析
実施例4.2に記載されたキシラン分解システムを発現しないA.ニゲール突然変異体の場合において、突然変異がxlnRに位置するか否かを判断するために、これらの突然変異体のxlnR遺伝子の配列を決定した。このため、5.5kb BamHI xlnRを含有する断片に富んだライブラリーを、NW205::130Ac突然変異体の各々を作成した。このxlnRに富んだライブラリーの構築のため、BamHI、HinDIII、XhoI、SstIおよびKpnI消化のゲノムDNAの5.5kb断片を各株から単離した。これらの断片をBamHI消化した脱リン酸化pUC18ベクター(Ready-To-GOTM pUC18 BamHI/BAP+リガーゼ、Pharmacia)と混合し、連結した。連結混合物を用いて、大腸菌(E.Coli)DH5α(MAX Efficiency DH5 αTM能力細胞、Gibco-BRL)を、Amp耐性につき、製造業者のプロトコルに従って形質転換し、その結果、5*102−103コロニーの一次ライブラリーを得た。マスタープレート上で一次ライブラリーを再平板培養した後、これらのA.ニゲールxlnR富化ライブラリーを、プローブとしてのpIM230の変性放射性標識BamHI−XbaIインサートを使用して、標準的なプロトコル(Sambrookら,1989)に従って、コロニーフィルターハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。
各突然変異株につき、陽性コロニーを爪楊枝でマスタープレートから拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する5mlのLB培地中、37℃で15−18時間培養し、しかる後、Sambrookら(1989)によって沸騰溶解のために記載されているごとくにミニプレププラスミドDNA単離を行った。アガロース電気泳動によるこれらのDNA調製の分析およびxlnR特異的パターンと消化パターンとの比較により、正しい5.5kb BamHI xlnR断片を含有するマロニーが明らかとされた。実施例7.2に記載された配列決定反応においてプライマーとして特異的xlnRオリゴヌクレオチドを使用して、A.ニゲール突然変異体の配列を決定した。突然変異体NW205::130 Acl−15については、単一塩基対置換が3479位に決定され、その結果、配列番号9の823位のロイシンがセリンに変化した。突然変異体NW206::130 Ac2−5については、単一塩基対置換が3655位に決定され、その結果、配列番号9の864位のチロシンがアスパラギン酸に変化した。これらの突然変異は両突然変異体をxlnR突然変異体として同定する。
実施例8
A.ニゲールにおけるxlnRの発現
キシラン分解系を発現しないA.ニゲールの相補性
全ての非発現突然変異体における相補性において、形質転換頻度についての対照としてのプロトプラストおよびpGW635とpIM230の相補性をテストするためのpIM230とを組み合わせることによって、実施例4に記載した全ての10のNW205::130 Ac突然変異体を、本明細書の実施例2に記載したごとくに形質転換した。
得られた形質転換体コロニーをキシラン分解活性につき分析し、C源として1%オートスペルトキシランを含有する適当な培地でそれらを平板培養することによってそれらの親突然変異体と比較し、2−3日後に親突然変異体株ではなく形質転換体コロニーの回りの清澄化が10全てにつき出現し、それにより、キシラン活性の回復を示した。
実施例9
A.ニゲールキシラン系の発現に対するxlnR遺伝子用量の効果
増大したキシラン分解発現についての株改良に対するxlnR遺伝子の潜在的使用を実験するために、プラスミドpIM230を保有する19μgのxlnRおよびエイ・ニドゥランス(A. nidulans)argB遺伝子(Johnstoneら,1985)を有するプラスミドpIM650の2μgを用いて、本明細書の実施例2に記載したごとくに、β−キシシダーゼをコードするエイ・ニゲールxlnD遺伝子の複数コピー(約6)を保有する株N902::200−18を共トランスフェクション実験においてアルギニン原栄養可体に形質転換した。得られた形質転換体を、1%オートスペルトキシランを含有するMMプレート上にて、増大したエンド−キシリナーゼ発現につきスクリーニングした。最速かつ最大ハロー形成を有する4つのコロニーを選択して、xlnRコピー数を決定した。このために、これらの形質転換体および受容体株のDNAを単離し、系列希釈をハイボンド(Hybond)N膜にスポットした。xlnR遺伝子の暗号配列にわたる放射性標識4.5kb SmaI/XbaI断片を用い、ハイブリダイゼーション後に見い出されたシグナルからコピー数を見積もった。受容体株に対する比較に基づいて、xlnRコピー数はN902::200−18−R14では8と、N902::200−18−R16では32と判断された。両方のこれらの形質転換体につき、株を液状培養にて培養した後に、xlnRの増大した遺伝子投与量の効果をノーザン分析によって分析した。これは、1%フラクトース中での18時間のプレ培養の後に、炭素源としての2%オートスペルトキシランへの導入実験で行った。菌糸体試料を導入より8および24時間後に採取し、それから、製造業者の指示に従い、TriZol(Life technologies)を用いて全RNAを単離し、ノーザンブロット分析(Sambrookら,1989)によって分析した。キシラナーゼB発現レベルは、A.ニゲールxlnB(Kinoshitaら,1995)の放射性標識1kb EcoRI/XhoI断片を用いるハイブリダイゼーション後に検出して、受容体株と比較して、これらの形質転換体において強く増加した。
増大したエンド-キシリナーゼ発現についての株改良のためのxlnR遺伝子の潜在的使用をさらに実験するために、エイ・ニゲールを以下のスキームに従って、本明細書の実施例2に記載されたごとくに形質転換した;1.pGW635(pyrA)(陽性対照)、2.pDB−X(XA)、3.pDB−X(XA)+pINM230)および4.pGW635+pIM230。プラスミドpDB−X(XA)は、ベクターpEMBL18中のA.トゥービゲンシス(A. tubigensis)からのA.ニゲールpyrA遺伝子およびエイ・ニゲール・キシリナーゼA遺伝子を共に含有する。形質転換体は使用した全ての条件につき得られ、エンド−キシリナーゼを過剰発現する株を、オートスペルトキシリナーゼ上でのプレートスクリーニングにおいてハローサイズによって選択した(各群からの20形質転換体をテストした)。
各群から1の形質転換体を選択し、活性アッセイのために増殖させた。株をフラクトースを含有する培地で18時間プレ増殖させ、しかる後、菌糸体(50ml中、2.5g湿潤重量)を1.4%粗製アラビノキシランを含有する培地に移した。全ての培養は振盪フラスコ中で行った。インキュベーションは30℃で40時間行い、キシリナーゼAレベルをHPLC分析によって測定し、他方、β−キシロシダーゼおよびエンド−キシリナーゼ活性は双方につき測定した。1.5ml/分にてソース(SOURCE)15Q.HR5/5−カラムで流す標準的ファルマシア-LKB HPLC装置(Uppsala, スウェーデン)でクロマトグラフィーを行った。緩衝液A=20mMトリス−緩衝液、pH7.5および緩衝液B=1M NaClを含む20mMトリス−緩衝液、pH7.5。30分にわたる0−50%緩衝液Bからのグラジエント。280nmにおける検出、ファルマシア-LKB UV−MII、0.1−0.2の吸光度範囲、図3参照。100μl培養培地を1000μl 20mMトリス−緩衝液、pH7.5で希釈し、1000μl希釈試料をカラムに適用した。次いで、キシラナーゼAがほぼ30%B−緩衝液にて溶出するピークで観察された。形質転換体の各群から、HPLC分析における最高キシラナーゼA活性/ピークを示すものを図3に示す。エンド−キシラナーゼ活性は、Megazyme, Warriewood, オーストラリアからのアズリン-染色架橋小麦アラビノキシラン(Xylazyme錠剤)の放出を測定することによって測定した。キシラナーゼ活性は、0.1M酢酸緩衝液pH3.4中、40℃にて100XU/グラム(キシラナーゼ−ユニット)の内部標準酵素と比較することによって計算した。同一の4種の形質転換体をpHにて水不溶性アラビノキシランでアッセイし、キシラナーゼAのみがエオンドキシラナーゼ活性に寄与し、この分析の結果を表2に与える。
図3および表2に示す結果から、予測されるキシラナーゼAをコードする遺伝子での形質転換は、キシラナーゼA酵素活性において大きな増加を与えることが明らかである。より驚くべきことに、アクチベーター遺伝子xlnRを用いる形質転換後においても、キシラナーゼAのレベルの大きな増加も見い出される。これは、未形質転換親におけるアクチベーターXYL R(=xlnr遺伝子産物)のレベルにおける制限を示す。従って、pDB−K(XA)マルチコピー形質転換体において、トランス作用レギュレーターの量はより制限されていると予測される。これは、pDB−K(XA)マルチコピー形質転換体の2倍高いキシラナーゼAレベルを有する、pDB−K(XA)/pIM230形質転換体についての結果によって確認される。
実施例10:xlnR遺伝子についての糸状菌のスクリーニング
xlnR遺伝子の4.5kb SmaI/XbaI断片をプローブとして用いる、異種ハイブリダイゼーションによってxlnRカウンターパートを他の菌類を単離することが可能か否かを分析するために、DNAを以下の株から単離した:A.ニゲールN902(argB15、cspA1、fwnA1、metB10、pyrA5)、A.ドゥービゲンシスNW184(cspA1、fwnA1、pyrA22)、FGSC187からのA.ニデュランス(A. nidulans)WG096(pabaA1、yA2)、CBS101.43のA.アクレアトゥス(A. aculeatus)NW240(pyrA3)、CBS115.80からのA.アクレアトゥスNW217(fwnA1、cspA1、pyrA4、lysA1)、CBS115.52からのA.フェティダス(A. foetidus)(awamori)NW183(cspA1、fwnA1、pyrA13、lysA1)、A.ジャポニカス(A. japonicus)CBS114.51およびトリコデルマ・レエセイ(Trichodermareesei)QM9414。1−2μgのDNAをBamHIまたはXhoIで消化し、引き続いて、実施例3に記載したごとくにサザン分析によって分析した。使用したハイブリダイゼーション条件は:56℃における18−24時間の6×SSC(1000ml当たりの20×SSC:175.3g NaCl、107.1gクエン酸ナトリウム・5.5H2O、pH7.0)、0.1%SDS、0.05%ピロリン酸ナトリウム、5*デンハート溶液(500ml当たり100×デンハート溶液:10gFicoll−400、10gのポリビニルピロリドン、10gウシ血清アルブミン(PentaxフラクションV)および20μg/ml変性ニシン精子DNA中でのハイブリダイゼーション、続いての68℃における5×SSC、0.1%SDSにおける2回の30分間の洗浄および56℃における2×SSC、0.1%SSCにおける2回の30分間の洗浄であった。ハイブリダイゼーションの後、膜をサランラップで被覆し、コニカX−線フィルムおよび正規増感スクリーンを備えたコダックX−Omaticカセットを用い、−70℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
その結果、ハイブリダイズする断片が分析した全ての菌類で見い出され、非常に強いハイブリダイゼーションシグナルがA.ニゲール、A.チュービゲンシス、A.フェティダスで見い出され、他方、調査した他の株でははっきりしたハイブリダイゼーションシグナルが見い出された。
実施例11:他のプロモーター断片を用いる選択系の適用
A.ニゲールabfA遺伝子(Flipphiら,1994)およびA.ニゲールabfB遺伝子(Flipphiら,1993)からのプロモーター断片を含有するプラスミドを構築した。abfAプロモーター断片を含有する構築体については、pIM900(Flipphiら,1994)からの1.4kb XhoI/PstI断片を、実施例1に記載したごとくにSalI/PstI消化pAlter(Promega)に連結した。Altered SitesIIイン・ビトロ突然変異誘発系(Promega)を用い、XhoI制限部位を翻訳開始部位に対して−83位から−88位に創製した(Flipphiら,1994)。得られたプラスミドから、953bp SstI/XhoI断片を単離した。この断片およびpIM130からの1.5kb XhoI断片を、SstI/XhoIで消化したpBluescript(Stratagene)に連結した。1.5XhoI断片の正しい向きを含有するプラスミドを、BglIIを用いる消化によって同定した。得られたプラスミドはpAP8である。
同様に、abfBプロモーターからの910bp PstI断片をpIM991(Flipphiら,1993)から単離し、PstI消化のpEMBL19に連結した。SalIを用いて得られたプラスミドを消化し、プラスミドpIM130からの1.5kb XhoI断片と連結した。正しい向きの両断片を含有するプラスミドを、BamHIを用いる消化によって同定した。得られたプラスミドはpIM132である。
1450 bp XbaI/XhoI断片をベクターpAlterにクローニングすることによって、A.ニゲールpgaIIからの断片を含有する第3のプラスミドを構築した。改変部位(altered sites)IIイン・ビトロ突然変異誘発系(Promega)を用い、翻訳開始部位に対して−107ないし−112位にXhoI制限部位を創製した(Bussinkら,1991)。得られたプラスミドから、1.2kb XbaI/XhoI断片を単離した。この断片およびpIM130からの1.5kb XhoI断片を、XbaI/XhoIで消化したpBluescript(Stratagene)に連結した。1.5XhoI断片の正しい向きを含有するプラスミドを、HinDIIIを用いる消化によって同定した。得られたプラスミドはpIIP7である。同一pgaII遺伝子から、223bp HinDIII/PstI断片(Bussinkら,1992)を単離し、消化したpEMBL19のHinDIII/PstIに連結した。得られたプラスミドをSalIを用いて消化し、プラスミドpIM130からの1.5kb XhoI断片と連結した。正しい向きの両断片を含有するプラスミドを、indIIIを用いる消化によって同定した。得られたプラスミドはpHPIIである。
pgaII断片を保有するプラスミドの場合に、abfプロモーター断片(プラスミドAP8およびpIM132)および1%ポリガラクツロン酸(USB Chemicals)を有する構築体を用いる形質転換実験でインデューサーとして10mM L−アラビトールを用い、実施例2に記載した形質転換によって、全ての4種のプラスミドをA.ニゲールNW219に導入した。プラスミドAP8およびpIM132については、形質転換体が高頻度で見い出され、プラスミドpIIP7およびpHPIIを含有するpgaIIプロモーター断片を用いる形質転換実験では、5および7の形質転換のみが各々見い出された。
プラスミドpAB8およびpIM132(abfプロモーター断片)を用いる形質転換実験から得られた形質転換体を、10mM L−アラビノース/50mMソルビトール、10mM L−アラビトール/50mM D−グルコースおよび50mM D−グルコースを含有するMMを用い、実施例3に記載したごとくに表現型により分析した。予測された表現型:10mM L−アラビトール/50mMソルビトールでの増殖、10mM L−アラビトール/50mM D−グルコースおよび50mM D−グルコースでの非増殖が、プラスミドpAP8から得られた29の形質転換体からの10で、およびプラスミドpIM132から得られた30の形質転換体のうちの13で見い出された。プラスミドpII7およびpHPIIから得られた形質転換体を、1%ポリガラクツロン酸、1%ポリガラクツロン酸/50mM D−グルコースおよび50mM D−グルコースを含有するMMでテストした。しかしながら、形質転換体の両クラスは、予測された表現型を示さず、全ての形質転換体は全ての3つの培地で増殖できた。これは、これらの形質転換体がpyrA遺伝子座における二重交差に由来することを示唆する。
プラスミドを含有するpgaIIプロモーター断片についての結果に基づき、本発明者らは、誘導を改良することによって形質転換頻度を改良し得るか否かをテストした。本発明者らは、ポリガラクツロナーゼに対するモノマーインデューサーが利用できず、かくして、ポリマーは分解されてインデューサーを放出して発現を与える必要があるので、インデューサーの欠如のため形質転換は多かれ少なかれ失敗したと推定した。本発明者らは、少量のウリジンを用いる培地の補充がこの問題を克服し得るか否かをテストした。このため、各々、0、0.001、0.005、0.01、0.1、1、5および10mMの増大させる量のウリジンと組み合わせた、abfBの誘導を与える、1%オートスペルトキシランを含有する培地で、NW219および形質転換体NW219::pIM132#30をテストした。本実験では、受容体株NW219は0.01mM未満のウリジンを含有する培地では増殖せず、他方、NW219::pIM132#30形質転換体株は使用したすべての条件下で増殖した。しかしながら、胞子形成の程度およびコロニー形態は変化し、野生型様胞子形成を与える最低のウリジン濃度は0.01mMウリジン程度である。
これらの結果に基づき、1%レモンペクチン(エステル化の程度45%)(Copenhagem Pectin factory)を含有する実施例2に記載したMMSおよび、各々、ウリジン補充0.01mMおよび0.005mMの対する条件を用いて、プラスミドpIIP7およびpHPIIを用いるA.ニゲールNW219形質転換を反復した。この結果、判明した増大する数の形質転換体が得られた。前記した1%レモンペクチン、1%レモンペクチン/50mM D−グルコースおよび50mM D−グルコースを含有するこれらの形質転換体をテストし、それにつき予測される表現型は、各々、増殖、非増殖および非増殖である。30の形質転換体のうちpIIP7の得られた形質転換体10につき、および30の形質転換体のうちpHPII形質転換体9つにつき、予測された表現型が見い出された。
予測される表現型を示す形質転換体の選択は、サザン分析によって分析した。DNAを単離し、実施例3におけるごとくに分析した。プラスミドpAP8を含有するabfAプロモーター断片から得られた形質転換体については、ClaIを用いて、pIM132(abfB)由来形質転換体についてはClaIを用い、およびpgaIIプラスミドpIIP7およびpHPIIに由来する形質転換体についてはClaIを用いてDNAを消化した。以下の放射性断片:pyrA遺伝子の3.8kb XbaIおよび1.2kb ClaI断片を用いるハイブリダイゼーション後に得られたオートラジオグラフィーに基づき、見積もられたコピー数に基づいて形質転換体を選択した。以下の形質転換体を選択した;AP8/16(abfA)、NW219::132#8(2コピー)およびNW219::132#30(3−4コピー)(abfB)、NW219::pIIP7#3(2コピー)およびNW219::pHPII#9(2コピー)(pgaII)。
選択した形質転換体を実施例4に記載したごとくに突然変異誘発に付した。アラビノフラノシダーゼ抑制突然変異体はMM+50mM D−グルコースおよびMM+10mM L−アラビトール/50mM D−グルコースで選択し、他方、ポリガラクツロナーゼ抑制突然変異体はMM+50mM D−グルコースおよびMM+1%レモンペクチン/50mM D−グルコースで選択した。4−7日後に、プレート当たり5−10の突然変異体コロニーが見い出され、これは、その形態に基づき、3つのクラス:大きくて十分胞子形成するコロニー、中程度のサイズで十分胞子形成するコロニーおよび小さくて貧弱な胞子形成コロニーに分けられる。これらの突然変異体のうちの20のランダム選択をなし、選択した突然変異体を、異なる炭素源または基質を含有する培地でテストした。アラビノフラノシダーゼ突然変異体コロニーは、D−グルコース、D−グルコース/L−アラビトールおよびL−アラビトールを含有する培地で増殖でき、他方、親株は炭素源としてL−アラビトールを含有する培地でのみ増殖できることが判明した。同様に、ポリガラクツロナーゼ突然変異体はMM+50mM D−グルコース、MM+1%レモンペクチン/50mM D−グルコース、およびMM+1%レモンペクチンでも増殖できた。加えて、アラビノフラノシダーゼ突然変異体(各々の20)を、実施例4に記載されているごとくに色原体基質メチルウンベリフェリル−α−L−アラビノフラノシダーゼでテストした。親株は基質の蛍光によって検出してD−グルコース/L−アラビトールを含有する培地のいずれのアラビノフラノシダーゼ発現も示さなかったが、突然変異体は種々のレベルの発現を示し、最高レベルはD−グルコース培地で選択された突然変異体で見い出された。
ポリガラクツロナーゼ突然変異体はMM+1%レモンペクチン/50mMグルコースでテストし、プレートの接種から2および3日後に、RiedおよびCollmer(1985)によって記載されているごとく染色することによって、ポリガラクツロナーゼ活性を可視化した。この場合、親株については、小さいハロー(halo)が見出され、他方、突然変異体では、増大したハロー形成についての種々の程度が検出された。
実施例4に従い、FOAを含有する培地で非発現突然変異体も選択された。この株については、この株については、NW219:132#30(abfB)を突然変異させ、MM+10mM L−アラビトール+1mg/ml FOA+10mMウリジンで平板培養した。7−10日後、突然変異体を選択し、10mM L−アラビトール/50mMソルビトール、10mMウリジンを含有し、エンド−アラビナン発現の検出のための0.5%AZCL−アラビナン(Megazyme, Dydney、オーストラリア)を含有する頂部寒天を有するMM上で平板培養した。テストした30の形質転換体のうち2つ、132/30 F12およびF26は、エンド−アラビナン活性の不存在の指標である、基質からの色素の放出ができなかった。10mM L−アラビトールおよび10mMウリジンを含有する液状MMにおけるこれらの形質転換体の培養および培養濾液中でのアラビノフラノシダーゼ活性の測定に際して、少なくとも4倍の活性の減少が見い出された。
株NW219::pIIP7#3を突然変異させ、1%レモンペクチン/50mMソルビトール、10mMウリジンおよび1mg/ml FOAを含有するMMで平板培養した。6−10日間のプレートのインキュベーションの後、突然変異体を拾い、前記したごとくにポリガラクツロナーゼ活性につきスクリーニングした。選択した65の突然変異体のうち、3つの突然変異体がポリガラクツロナーゼ活性染色の後に低下したハロー形成を有することが見い出され、ポリガラクツロナーゼ発現の減少を示した。
本明細書を出願する際にそのコピーを含ませ、その実施例も本明細書にコピーした同時係属欧州特許出願であるEP 95201707.7の実施例7、8および11
EP 95201707.7の実施例7
プラスミドpIM200を用いるA.ニゲールの形質転換
2%グルコース、0.5%酵母エキス、0.2%カザミノ酸(無ビタミン)、2mMロイシン、10μMニコチンアミド、10mMウリジンを補足したMMよりなる250mlの培養基に、株NW155(cspA1、argB13、pyrA6、nicA1、leuA1、prtF28)(NE228由来、Van den Homberghら,1995)1ml当たり1*106胞子を接種し、オービタルNew Brunswick振盪機中、30℃および250rpmにて16−18時間増殖させた。Buchner漏斗および温和な吸引を用い、菌糸体をMyracloth(ナイロンゲージ)上に収穫し、SP6(SP6:0.8% NaCl、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0)で数回洗浄した。150mgのNovozyme 234を、1g(湿潤重量)の菌糸体を添加し、注意深く再懸濁した20mlのSMC(SMC:1.33Mソルビトール、50mMCaCl2、20mM MES緩衝液、pH5.8)に溶解させた。この懸濁液を30℃にて1−2時間温和に振盪しつつインキュベートし、各30分毎に菌糸体を注意深く再懸濁し、試料を採取して、血球計を用いてプロトプラスト形成をモニターし、プロトプラストを計数した。十分なプロトプラストが存在すれば(1*108を超える)、これらを注意深く再懸濁し、菌糸体デブリスを滅菌ガラスウール栓での濾過によって除去した。ベンチ遠心機にて、3000rpmおよび4℃における10分間の遠心によってプロトプラストを収集し、上清を除去し、ペレットを注意深く5mlのSTC(STC:1.33Mソルビトール、50mM CaCl・、10mMトリス/HCl、pH7.5)に再懸濁させた。この洗浄工程を2回反復し、プロトプラストを最終的に1ml当たり1*108の密度にてSTCに再懸濁させた。
A.ニゲール遺伝子(10−20μl TEに溶解)を含有する20μgのpIM200 DNAおよび5μgのpGW635を50μlのPEG緩衝液(PEG緩衝液:25%PEG−6000、50mM CaCl2、10mMトリス/HCl pH7.2)と共に200μlのプロトプラスト懸濁液に添加することによって形質転換を行い、ピペットで数回吸い上げたり降ろしたりすることによって温和に混合し、室温で20分間インキュベートした。この期間の後、2ml PEGを添加し、撹拌ミキサーで緩慢に混合して、室温で5分間インキュベートし、次に4mlのSTCを添加して、緩やかにボルテックスミキサーで混合した。次いで、この懸濁液の1ml分を、4mlの0.95Mスクロースで浸透圧的に安定化させた頂部寒天に添加し、浸透圧的に安定化させたプレート上に注いだ。対照として、pGW635を用い、A.ニゲールも形質転換した。
EP 95201707.7の実施例8:形質転換体の分析
1%オートスペルトキシランおよび1mM 4−メトルウンベリフェリル−β−D−キシロシドを含有するMM上で平板培養することによって、実施例7で得られたpIM200からの形質転換体を表現型により分析した。テストした26の形質転換体のうち、5つは増大した蛍光を有した。参照としてのPYR+と共にこれらの形質転換体を、1%オートスペルトキシランを含有するMM上で20、27および42時間増殖させ、しかる後、PNP−Xに向かうβ−キシロシダーゼ活性を測定した。結果を表Cにまとめる。
増大したレベルのβ−キシロシダーゼ活性が5つの選択した形質転換体全てで見い出され、最高レベルは野生型活性の30倍を超えていた。これらの結果は、EP 95201707.7の実施例3に記載したごとくに調製した抗β−キシロシダーゼ抗体を用いるウェスタンブロット分析、および供給業者の指示によるBio−RadイムノブロットGAR−APアッセイによって確認した。
EP 95201707.7の実施例11:A.ニゲールxlnR遺伝子の破壊
実施例11.1:破壊プラスミドpIM203およびpIM204の構築
PCRによりxlnD遺伝子の内部断片を生じさせることによって、遺伝子破壊プラスミドpIM203およびpIM204を構築した。xlnR配列(配列番号8)に由来するオリゴヌクレオチドを用い、断片を生じさせた。キシロース001は、1157位ないし1176位に由来し、キシロース004は3147位ないし3164位に由来した。最終容量100μl中の10μlの10*反応緩衝液(100mM トリス−HCl、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01%ゼラチン)、16μlの1.25mMの各4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、1ngのプラスミドpIM200 DNAおよび1μgの各オリゴヌクレオチドを含有するPCRによって断片を生じさせた。この反応混合物を混合し、1μlのTAQポリメラーゼ(5U/μl)(Life Technologies)を添加した。92℃における3分間のインキュベーションによってDNAを変性させ、続いて1分間の92℃、1.5分間の52℃および1.5分間の72℃の25サイクルを行った。これらの25サイクルの後、混合物を72℃で5分間インキュベートした。アガロース電気泳動による反応生成物の分析により、約2000bpの断片が明らかとなり、これは遺伝子の配列に基づくと、予測されるサイズに対応する。得られた断片をベクターpGEM−T(Promega)にサブクローニングし、プラスミドpIM202が得られた。プラスミドpIM203は、A.ニジュランスargB遺伝子(Upshallら,1986)を含有するpILJ16のSmaI/PstI断片(Johnstoneら,1985)を、EcoRI/PstI消化のpIM202ベクターに連結することによって構築した。プラスミドpIM204は、A.トゥービゲネシスのxlnAプロモーターのUASの制御下にあるpyrA遺伝子を含有するpIM130のNsi1/Xba1断片(本明細書、Ep 95202346.3)を、SpeI/Nsi1消化のpIM202ベクターに連結することによって構築した。
実施例11.2:A.ニゲールにおけるxlnD遺伝子の破壊
形質転換における選択マーカーとして、同時係属EP出願の実施例11.1に記載されたごとき、xlnD内部断片ならびにargB遺伝子(pIM203)またはpyrA遺伝子(pIM204)を含有するプラスミドを用いて、A.ニゲールxlnD遺伝子を破壊した。このために、各々、アルギニンまたはウリジン原栄養体につき選択するプラスミドpIM203およびpIM204を用い、A.ニゲールN902(argB15、cspA1、fwnA1、metB10、pyrA5)を、本明細書の実施例2に記載したごとくに形質転換した。得られた形質転換体を、同時係属EP出願の実施例8に記載したごとくに、1%キシランプレート上のメチルウンベリフェリル−β−D−キシロシドに対する活性につきスクリーニングした。形質転換体の両群について、20をスクリーニングした。これらの形質転換体のうち、各群の1つは24時間の増殖の後にMUX活性のひどく低下したレベルを有した。同時係属出願の実施例3に記載したごとき、選択した形質転換体のサザン分析は、pIM203形質転換体につき、同種xlnD遺伝子座における複数のコピー取込みを示した。pIM204形質転換体の場合において、xlnD遺伝子座における単一の同種取込みが起こった。これらの形質転換体の、同時係属EP出願の実施例8に記載したごとき、PNP−X活性についての分析は、β−キシロシダーゼ活性における少なくとも100倍の減少であることを明らかとした。
実施例11.3:A.ニゲールのキシラン分解系の発現におけるxlnD遺伝子座の過剰発現および不活化の効果
キシラン分解スペクトルの発現におけるxlnD発現の効果を測定するために、A.ニゲールN902、N902における2つのxlnD複数のコピー−形質転換体ならびにxlnD遺伝子破壊株を液体培地中で培養した。これは、18時間の1%フルクトース中の予備培養の後に、炭素源としての2%オートスペルトキシランまたは3%D−キシロースへの導入実験で行った。ベータ−キシロシダーゼ活性は、培養濾液におけるPNP−X活性として決定した。両C源に関し、両(pIM203およびpIN204)不活化形質転換体に対するPNP−X活性のほとんどの不存在に対するpIM200形質転換体につきはっきりした過剰発現がスクリーニングできた。xlnD遺伝子破壊形質転換体はエンド−キシラナーゼ発現の最初の低下したレベルを示し、しかしながら、これは最終的に16時間後には時間内に増大し、A.ニゲール野生型と比較して増大した活性レベルとなった。かくして、β−キシロシダーゼの無いキシラナーゼ調製が得られた。
培養濾液は、Dinex系およびパルスド・アンペロメトリック(Pilsed Amperometric)検出を用い、HPLC分析によって引き続いて分析した。このために、1mlの培養濾液を収穫後に直ちに沸騰させて、キシラン分解酵素を不活化し、しかる後、試料を10分間遠心した(4℃における14,000rpm、Eppendorf遠心機)。得られた上清をビデスト(bidest)中に5倍希釈し、20μlをディオネックスカルノパック(Dionex CarboPac)100カラムを用いるHPLCによって分析した。分析は、野生型および過剰発現形質転換体においては、初期段階でのみ、キシロースオリゴマーが培養濾液で、破壊突然変異体キシロビオースで検出でき、小エクステント(lesser extent)キシロトリオースが培養濾液で蓄積し、かくして、キシロオリゴマーのための源、特にキシロビオースおよびキシロトリオースが得られた。
参考文献
配列表
(1)一般情報
(i)出願人
(A)名称:アグリカルチュラル・ユニバーシティー・ワーヘニンヘン
(B)通り:コスターウェッフ50
(C)市:ワーヘニンヘン
(D)国:オランダ国
(E)郵便コード(郵便番号):6701BH
(ii)発明の名称:突然変異体を単離する方法、およびその相補的遺伝子をクローン化する新しい方法
(iii)配列の数:9
(v)コンピュータ読取り可能な形態:
(A)媒体タイプ:フロッピーディスク
(B)コンピュータ:IBM・PCコンパチブル
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウエア:Patent In リリース #1.0,バージョン#1.25(EPO)
(2)配列認識番号:1のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:30塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列の記載:配列認識番号:1:
(2)配列認識番号:2のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列の記載:配列認識番号:2:
(2)配列認識番号:3のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列の記載:配列認識番号:3:
(2)配列認識番号:4のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列の記載:配列認識番号:4:
(2)配列認識番号:5のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:2054塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(vi)起源
(A)生物名:アスペルギルス・トゥービゲンシス(Aspergillus tubigensis)
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:TATA-signal
(B)存在位置:848...854
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:exon
(B)存在位置:950...1179
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:intron
(B)存在位置:1179...1228
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:exon
(B)存在位置:1229...1631
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:連結部(join)(950..1179, 1229..1631)
(D)他の情報:/酵素番号=3.2.1.8.
/生成物=「1,4-ベータ-キシランキシラノヒドロラーゼ」
/遺伝子=「xlnA」
/標準名=「エンド−キシラナーゼ」
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:mat peptide
(B)存在位置:1031...1631
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:sig peptide
(B)存在位置:950...1031
(xi)配列の記載:配列認識番号:5:
(2)配列認識番号:6のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:3026塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(vi)起源
(A)生物名:アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)
(B)株名:N400(CBS 120.49)
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:TATA-signal
(B)存在位置:643..648
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:724...2538
(C)他の情報:/酵素番号=1.1.3.4.
/生成物=「グルコース オキシダーゼ」
/遺伝子=「goxC」
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:mat peptide
(B)存在位置:790...2538
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:sig peptide
(B)存在位置:724...790
(xi)配列の記載:配列認識番号:6:
(2)配列認識番号:7のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:1517塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(vi)起源
(A)生物名:アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)
(B)株名:L112
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:exson
(B)存在位置:339...495
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:intron
(B)存在位置:496...563
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:exson
(B)存在位置:564...1237
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:連結部(join)(339..495, 564..1237)
(D)他の情報:/生成物=「オロチジン-5’-フォスフェート ジカルボキシラーゼ」
(xi)配列の記載:配列認識番号:7:
(2)配列認識番号:8のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:4108塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(vi)起源
(A)生物名:アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)(CBS 120.49)
(B)株名:NW147
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:TATA-signal
(B)存在位置:787..794
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:855..3266
(D)他の情報:/酵素番号=3.2.1.37
/生成物=「1,4-ベータ-D-キシラン キシラノヒドロラーゼ」
/遺伝子=「xlnD」
/標準名=「ベータ-キシロシダーゼ」
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:sig peptide
(B)存在位置:855...932
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:mat peptide
(B)存在位置:933..3266
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:polyA site
(B)存在位置:3383
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:polyA site
(B)存在位置:3404
(xi)配列の記載:配列認識番号:8:
(2)配列認識番号:9のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:4173塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(vi)起源
(A)生物名:アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)
(B)株名:CBS 120.49
(C)個体・単離クローン名:N400
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:連結部(join)(948..1173, 1238..3495, 3550..3690)
(C)特徴を決定した方法:実験
(D)他の情報:/機能=「キシラン分解遺伝子の転写アクチベーター」
/生成物=「二核ZnフィンガーDNA結合タンパク」
/遺伝子=「xlnR」
/標準名=「XYL R」
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:exon
(B)存在位置:948..1173
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:intron
(B)存在位置:1174..1237
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:exon
(B)存在位置:1238..3495
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:intron
(B)存在位置:3496..3549
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:exon
(B)存在位置:3550..3690
(xi)配列の記載:配列認識番号:9:
Claims (16)
- 1)標的遺伝子プロモーター、ここで該標的遺伝子は、キシラン分解レギュレーターxylRの標的遺伝子xlnAである、
2)第2のプロモーターに作動可能に連結した前記レギュレーターをコードする核酸、
3)キシラナーゼAをコードする核酸、
を含み、
該標的遺伝子プロモーターは(3)のコード核酸に作動可能に連結し、ここにおいて、該レギュレーターをコードする核酸はキシラン分解レギュレーターxylRをコードすることを特徴とする、組合せ核酸カセット。 - 前記レギュレーターをコードする核酸に作動可能に連結した前記第2のプロモーターが、前記レギュレーターをコードする核酸のプロモーターである、請求項1に記載の組合せ核酸カセット。
- 請求項1又は2に記載の組合せ核酸カセットであって、前記核酸がコードする前記活性化レギュレーターが、
(a)配列番号9のxylRと、又は、配列番号9の核酸配列によってコードされるアミノ酸と、同じアミノ酸配列を有する発現産物をコードする核酸である組合せ核酸カセット。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の組合せ核酸カセットを含むベクター。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組合せ核酸カセットおよび/または請求項4に記載のベクターを含むホスト細胞。
- 請求項1に記載の成分を含むホスト細胞であって、該ホスト細胞が、天然にまたは組換えDNA技術によりレギュレーターの標的遺伝子を含み、但し、該標的遺伝子およびレギュレーターがホスト細胞に天然のものである場合、該レギュレーターが複数コピーで存在するホスト細胞。
- 微生物および植物細胞よりなる群から選択される請求項5又は6に記載のホスト細胞。
- 前記ホスト細胞が真菌細胞である請求項7に記載のホスト細胞。
- 前記ホスト細胞が糸状菌細胞である、請求項8に記載のホスト細胞。
- 前記ホスト細胞が、アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フサリウム(Fusarium)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、クルベロミセス(Kluvveromyces)属およびラクトバチルス(Lactobacillus)属から選択される、請求項7に記載のホスト細胞。
- 前記ホスト細胞が、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)、アスペルギルス・テュービゲネシス(Aspergillus tubigenesis)、アスペルギルス・アクレトゥス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・フェティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、アスペルギルス・シドウィー(Aspergillus sydowii)、アスペルギルス・カワチィー(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・カルボナリウス(Aspergillus carbonarius)およびアスペルギルス・ヤポニカス(Aspergillus japonicas)からなる群から選択される株である、請求項10に記載のホスト細胞。
- 前記ホスト細胞が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびサッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)からなる群から選択される株である請求項10に記載のホスト細胞。
- 前記標的遺伝子が前記ホスト細胞に内因性のものである、請求項5〜12のいずれか1項に記載のホスト細胞。
- 前記標的遺伝子が複数コピーで存在する、請求項5〜13のいずれか1項に記載のホスト細胞。
- 蛋白質またはペプチドの生産のための、ホスト細胞における請求項1〜3のいずれか1項に記載の組合せ核酸カセットの使用。
- 蛋白質またはペプチドの生産のための、請求項5〜14のいずれか1項に記載のホスト細胞の使用。
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