JP2019194261A

JP2019194261A - 酵母−ｍｕｃ１免疫療法用組成物およびその使用

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Publication number: JP2019194261A
Application number: JP2019145946A
Authority: JP
Inventors: フランズソフ、アレックス; Alex Franzusoff; グオ、ジミン; zhi-min Guo; シュロム、ジェフリー; Jeffrey Schlom; ツァン、クウォン−ヨク; Kwong-Yok Tsang
Original assignee: US Department of Health and Human Services; GlobeImmune Inc
Current assignee: US Department of Health and Human Services; GlobeImmune Inc
Priority date: 2011-08-17
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2019-11-07
Also published as: BR112014003477A2; CA2844500A1; CN104024429B; AU2012296425A1; WO2013025972A1; EP2744918A4; US9533031B2; US20190231859A1; JP2018115173A; CA2844500C; SG10201607663YA; AU2020200137A1; US20130315941A1; RU2642300C2; JP2017122120A; EP2744918A1; JP6306238B2; CN114617958A; KR102049928B1; IL257533B

Abstract

【課題】ＭＵＣ１の発現または過剰発現に関連付けられる癌を効果的に治療および／または予防する新しい組成物を提供する。【解決手段】酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、ａ）酵母媒体と、ｂ）前記酵母媒体により発現されたかつ少なくとも１つのＭＵＣ１抗原を含む融合タンパク質と、を含む。前記ＭＵＣ１抗原は、Ｎ末端からＣ末端の方向に順に、ＭＵＣ１ＳＥＡ／細胞外ドメイン（ＥＤ）、少なくとも２つの可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）ドメイン、ＭＵＣ１膜貫通（ＴＭ）ドメイン、およびＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）で構成され、前記ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤドメインは、ＭＵＣ１ＳＥＡドメインの非ＥＤ部分の１つまたは複数のアミノ酸によりＮ末端がフランキングされたＭＵＣ１ＥＤを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、一般的には、ムチン−１（ＭＵＣ１：ｍｕｃｉｎ−１）の発現または過剰発現により特徴付けられる癌を予防および／または治療するための酵母ベースの免疫療法用組成物および方法に関する。

癌は、世界的に主要な死亡原因であり、癌の効果的療法の開発は、依然として、研究および臨床開発の最も活発な分野の１つである。癌を治療および予防するためのさまざまな革新的手法が提案されてきたが、多くの癌は、依然として、高い死亡率を有し、治療が困難でありうるかまたは従来の療法に対して比較的不応性でありうる。

多数のヒト癌腫および血液学的悪性疾患は、少なくとも部分的には、毒素、微生物、および他のタイプの外部環境ストレスから上皮細胞を保護するのを助けることが正常な機能であるムチン−１（ＭＵＣ１）として知られるタンパク質の異常な過剰発現により特徴付けられる（非特許文献１）。ＭＵＣ１は、単一の転写物によりコードされ次いで翻訳後にＭＵＣ１−ＮおよびＭＵＣ１−Ｃとして知られるサブユニットにプロセシングされる２つのサブユニットの非共有結合性相互作用から形成されるヘテロ二量体タンパク質である。ＭＵＣ１は、分泌上皮細胞の頂端側境界に通常では見いだされ、細胞がストレスに反応して極性を失った時（正常細胞では可逆過程）、ＭＵＣ１は、基底側境界に通常は局在化する分子と相互作用することが可能である。それに加えて、広範にわたりＯ結合グリカンによりグリコシル化された可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ：ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ）を含有する大きいタンパク質であるＭＵＣ１−Ｎサブユニットは、ストレス環境に反応してシェディングされうる。ＭＵＣ１−Ｃとして知られるＭＵＣ１の他方のサブユニットは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインと細胞質内テールとを有し、ＭＵＣ１と上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）（非特許文献２、非特許文献３）との、さらにはＭＵＣ１と他の受容体チロシンキナーゼ（ＥｒｂＢ２−４，２０ＦＧＦＲ３２１、ＰＤＧＦＲなど）（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）との、物理会合に関与するリガンドに結合することが可能である。それに加えて、ＭＵＣ１−Ｃは、ＥｒｂＢ受容体、ｃ−Ｓｒｃ、β−カテニン、転写因子（ｐ５３、ＥＲα）、および他のエフェクターたとえばＧｒｂ２／ＳＯＳを含むさまざまなシグナリング経路に関連付けられてきた（非特許文献７、非特許文献８）。

形質転換上皮細胞では、細胞膜極性は、不可逆であり、ＭＵＣ１発現は、癌腫細胞の全表面にわたりアップレギュレートされる（非特許文献１）。ＭＵＣ１過剰発現は、ＭＵＣ１−ＮのＯグリコシル化の減少に関連付けられ、細胞表面の高レベルのＭＵＣ１−Ｎは、細胞−細胞間および細胞−細胞外マトリックス間の相互作用を立体的にブロックし、これは、悪性表現型に関連付けられる（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。ＭＵＣ１−Ｃサブユニットは、現在では、腫瘍化に関連付けられるさまざまなシグナリング経路に関与することから、オンコプロテインであると考えられており、その過剰発現は、ＤＮＡ損傷（非特許文献１２、非特許文献１３）、酸化ストレス（非特許文献１４、非特許文献１５）、および低酸素（非特許文献１６）に反応したアポトーシスの誘導のブロッキング、さらには足場非依存性増殖および腫瘍原性の付与（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０）に関与することが示されてきた。

以上で考察したように、種々の実験室からのデータから、ＭＵＣ１−Ｎ（αサブユニット）は、免疫回避および潜在的転移の広がりを可能にする細胞性を付与することにより癌の一因となることが示唆される。ＭＵＣ１−Ｃ（βサブユニット）は、腫瘍の開始および進行に関与するシグナリング経路に関係する。ＭＵＣ１のこれらの二元機能により、この抗原がさまざまな癌徴候で果たすと思われるさまざまな役割を説明しうる。たとえば、ＭＵＣ１は、乳癌や大腸癌などの癌では、早期マーカであると思われるが（たとえば、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３を参照されたい）、ＭＵＣ１は、膵臓癌や食道癌などの癌では、上皮間葉転換（ＥＭＴ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）経路および転移の広がりに関連付けられ（たとえば、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７を参照されたい）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ：ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ）では、反応性酸素種による最終分化を阻害し（たとえば、非特許文献２８、非特許文献２９を参照されたい）、それにより、これらの癌細胞の無制限自己複製を可能にする。

癌細胞の悪性表現型におけるＭＵＣ１の見掛けの役割を考慮して、ＭＵＣ１とくにＭＵＣ１−Ｎは、抗癌療法の対象となってきた。実際に、療法の大多数は、ＭＵＣ１ヘテロ二量体の細胞外部分であるＭＵＣ１−Ｎを標的としてきた。しかしながら、ＭＵＣ１−Ｎを標的とするそのような手法は、これまでのところ、おそらく細胞からシェディングされるＭＵＣ１−Ｎの干渉が原因で、診療では成功していない。より最近の研究では、細胞外ドメインに対する抗体を用いて、またはペプチド、炭水化物ポリマーとコンジュゲートされたペプチド、小分子を用いて、ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞の調製物を用いて、および樹状細胞／腫瘍細胞融合体を用いて、ＭＵＣ１−Ｃサブユニットを標的とすることが提案された。

クフェ（Ｋｕｆｅ）ら著、ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、１９８４年、第３巻、ｐ．２２３〜３２リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ）、２００１年、第２７６巻、ｐ．３５２３９〜４２シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ）、２００１年、第２７６巻、ｐ．１３０５７〜６４リー（Ｌｉ）ら著、モレキュラー・キャンサー・リサーチ（ＭｏｌＣａｎｃｅｒＲｅｓ）、２００３年、第１巻、ｐ．７６５〜７５レン（Ｒｅｎ）ら著、モレキュラー・キャンサー・リサーチ（ＭｏｌＣａｎｃｅｒＲｅｓ）、２００６年、第４巻、ｐ．８７３〜８３シン（Ｓｉｎｇｈ）ら著、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ）、２００７年、第６７巻、ｐ．５２０１〜１０パンデイ（Ｐａｎｄｅｙ）ら著、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ）、１９９５年、第５５巻、ｐ．４０００〜３キンロウ（Ｋｉｎｌｏｕｇｈ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ）、２００４年、第２７９巻、ｐ．５３０７１〜７リヒテンベルグ（Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ）ら著、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ）、１９９２年、第５２巻、ｐ．２２３〜３２ファン・デ・ビール−ファン・ケメナデ（ｖａｎｄｅＷｉｅｌ−ｖａｎＫｅｍｅｎａｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノロジー（ＪＩｍｍｕｎｏｌ）、１９９３年、第１５１巻、ｐ．７６７〜７６ベッセリング（Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇ）ら著、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ）、１９９６年、第７巻、ｐ．５６５〜７７レン（Ｒｅｎ）ら著、キャンサー・セル（ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ）、２００４年、第５巻、ｐ．１６３〜７５ライナ（Ｒａｉｎａ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ）、２００４年、第２７９巻、ｐ．２０６０７〜１２イン（Ｙｉｎ）およびクフェ（Ｋｕｆｅ）著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ）、２００３年、第２７８巻、ｐ．３５４５８〜６４イン（Ｙｉｎ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ）、２００４年、第２７９巻、ｐ．４５７２１〜７イン（Ｙｉｎ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ）、２００７年、第２８２巻、ｐ．２５７〜６６リー（Ｌｉ）ら著、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、２００３年、第２２巻、ｐ．６１０７〜１０ホワーン（Ｈｕａｎｇ）ら著、キャンサー・バイオロジー・セラピー（ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌＴｈｅｒ）、２００３年、第２巻、ｐ．７０２〜６ホワーン（Ｈｕａｎｇ）ら著、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ）、２００５年、第６５巻、ｐ．１０４１３〜２２シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、２００４年、第２３巻、ｐ．５７３９〜４７クレッチマー（Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ）ら著、モレキュラー・キャンサー（ＭｏｌＣａｎｃｅｒ）、２０１１年２月１１日、第１０巻、第１号、ｐ．１５ムコパディヤイ（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ）ら著、バイオシミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ）、２０１１年４月、第１８１５巻、第２号、ｐ．２２４〜４０サエキ（Ｓａｅｋｉ）ら著、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、２０１１年３月、第１４０巻、第３号、ｐ．８９２〜９０２シュイ（Ｘｕ）ら著、ライフ・サイエンス（ＬｉｆｅＳｃｉ．）、２０１１年６月６日、第８８巻、第２３〜２４号、ｐ．１０６３〜９ベスマー（Ｂｅｓｍｅｒ）ら著、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．）、２０１１年７月１日、第７１巻、第１３号、ｐ．４４３２〜４２ロイ（Ｒｏｙ）ら著、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、２０１１年３月２４日、第３０巻、第１２号、ｐ．１４４９〜５９イエ（Ｙｅ）ら著、ラボラトリー・インベスティゲーション（ＬａｂＩｎｖｅｓｔ．）、２０１１年５月、第９１巻、第５号、ｐ．７７８〜８７イン（Ｙｉｎ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２０１１年５月５日、第１１７巻、第１８号、ｐ．４８６３〜７０ファトライ（Ｆａｔｒａｉ）ら著、エクスペリメンタル・ヘマトロジー（ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ．）、２００８年１０月、第３６巻、第１０号、ｐ．１２５４〜６５

しかしながら、現在のところ、ＭＵＣ１を特異的に標的とする認可された癌療法は存在しない。したがって、ＭＵＣ１の発現または過剰発現に関連付けられる癌を効果的に治療および／または予防する新しい製品の必要性が、当技術分野に依然として存在する。

本発明の一実施形態は、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）該酵母媒体により発現されたかつ少なくとも１つのＭＵＣ１抗原を含む融合タンパク質と、を含む酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物に関する。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、Ｎ末端からＣ末端の方向に順に、ＭＵＣ１ＳＥＡ／細胞外ドメイン（ＥＤ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎ）（ただし、このＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤドメインは、ＭＵＣ１ＳＥＡドメインの非ＥＤ部分の１つまたは複数のアミノ酸によりＮ末端がフランキングされたＭＵＣ１ＥＤを含む）と、少なくとも２つの可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ：ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ）ドメインと、ＭＵＣ１膜貫通（ＴＭ：ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）ドメインと、ＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ：ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｄｏｍａｉｎ）と、で構成される。

一態様では、抗原は、２つのＶＮＴＲドメインを含む。一態様では、ＶＮＴＲドメインは、配列番号１１の位置１２６〜１４５、配列番号１１の位置６１〜１０２０の任意の連続した２０個のアミノ酸、配列番号１１の位置１２６〜９６５の任意の連続した２０個のアミノ酸、配列番号１２、配列番号１４の位置９０〜１３０の任意の連続した２０個のアミノ酸、配列番号１５の位置６０〜１００の任意の連続した２０個のアミノ酸、および異なるヒトＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＶＮＴＲドメインは、配列番号１４の位置９０〜１３０の任意の連続した２０個のアミノ酸または配列番号１５の位置６０〜１００の任意の連続した２０個のアミノ酸に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、融合タンパク質は、２つのＶＮＴＲドメインを有し、この２つのＶＮＴＲドメインのアミノ酸配列は、配列番号１４の位置９０〜１３０または配列番号１５の位置６０〜１００である。

一態様では、ＭＵＣ１ＥＤは、配列番号２の位置１１６〜１７３、配列番号４の位置１０７〜１６４、配列番号６の位置１０７〜１６４、配列番号８の位置９８〜１５５、配列番号１１の位置１０９８〜１１５５、配列番号１４の位置３２〜８９、配列番号１５の位置２〜５９、および異なるヒトＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１ＥＤは、配列番号１４の位置３２〜８９または配列番号１５の位置２〜５９に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１ＥＤは、配列番号１４の位置３２〜８９または配列番号１５の位置２〜５９のアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤは、配列番号２の位置１１５〜１７３、配列番号４の位置１０６〜１６４、配列番号６の位置１０６〜１６４、配列番号８の位置９７〜１５５、配列番号１１の位置１０９７〜１１５５、配列番号１４の位置３１〜８９、配列番号１５の位置１〜５９、および異なるヒトＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤは、配列番号１４の位置３１〜８９または配列番号１５の位置１〜５９のアミノ酸配列を有する。

一態様では、ＭＵＣ１ＴＭドメインは、配列番号２の位置１７４〜２０１、配列番号４の位置１６５〜１９２、配列番号６の位置１６５〜１９２、配列番号８の位置１５６〜１８３、配列番号１１の位置１１５６〜１１８３、配列番号１４の位置１３１〜１５８、配列番号１５の位置１０１〜１２８、および異なるヒトＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１ＴＭドメインは、配列番号１４の位置１３１〜１５８または配列番号１５の位置１０１〜１２８に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１ＴＭドメインは、配列番号１４の位置１３１〜１５８または配列番号１５の位置１０１〜１２８のアミノ酸配列を有する。

一態様では、ＭＵＣ１ＣＤドメインは、配列番号２の位置２０２〜２７３、配列番号４の位置１９３〜２６４、配列番号６の位置１９３〜２６４、配列番号８の位置１８４〜２５５、配列番号１１の位置１１８４〜１２５５、配列番号１４の位置１５９〜２３０、配列番号１５の位置１２９〜２００、配列番号１７の位置７〜７８、配列番号１７の位置７９〜１５０、配列番号１７の位置１５１〜２２２、配列番号１８の位置１〜７２、配列番号１８の位置７３〜１４４、配列番号１８の位置１４５〜２１６、および異なるヒトＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１ＣＤドメインは、配列番号１４の位置１５９〜２３０または配列番号１５の位置１２９〜２００のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１ＣＤドメインは、配列番号１４の位置１５９〜２３０または配列番号１５の位置１２９〜２００のアミノ酸配列を有する。

本発明のこの実施形態の一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号１５に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号１５、または配列番号１５に対して少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。

本発明のこの実施形態の一態様では、融合タンパク質は、ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤのＮ末端に付加されたＭＵＣ１シグナル配列をさらに含む。一態様では、ＭＵＣ１シグナル配列は、配列番号２の位置１〜２７、配列番号４の位置１〜３２、配列番号６の位置１〜３２、配列番号８の位置１〜２７、配列番号１１の位置１〜２３、配列番号１４の位置１〜３０、および異なるヒトＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１シグナル配列は、配列番号１４の位置１〜３０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１シグナル配列は、配列番号１４の位置１〜３０のアミノ酸配列を有する。一態様では、融合タンパク質は、配列番号１４に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、融合タンパク質は、配列番号１４、または配列番号１４に対して少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列を含む。一態様では、融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。

本発明のこの実施形態の一態様では、ＭＵＣ１抗原は、ＭＵＣ１抗原内に１〜１１個のアゴニストエピトープを形成するように、野生型ＭＵＣ１配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、またはそれを超える数のアミノ酸置換を含み、本明細書では、ＭＵＣ１アゴニスト抗原としても参照される。本発明のこの実施形態の一態様では、アミノ酸置換は、配列番号１４または配列番号１５のＭＵＣ１抗原部分を基準にして、Ａ９６Ｙ、Ｐ９７Ｌ、Ｇ１０４Ｖ、Ｓ１０５Ｙ、Ｔ１０６Ｌ、Ａ１４７Ｙ、Ｃ１６１Ｖ、Ｔ１９９Ｌ、Ｄ２００Ｆ、Ｓ２１５Ｙ、およびＴ２３９Ｌから選択される。一態様では、ＭＵＣ１アゴニスト抗原は、配列番号２３に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号２３、または配列番号２３に対して少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する。請求項１に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物においてＭＵＣ１抗原は、ＭＵＣ１アゴニスト抗原を形成するように１〜１１個のアミノ酸置換を含む。

本発明の他の実施形態は、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）該酵母媒体により発現されたかつ少なくとも１つのＭＵＣ１抗原を含む融合タンパク質と、を含む酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物に関する。ＭＵＣ１抗原は、２つ以上のＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）で構成される。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、３つのＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）で構成される。一態様では、３つのＣＤは、同一ＭＵＣ１タンパク質に由来する。一態様では、各ＣＤドメインは、配列番号２の位置２０２〜２７３、配列番号４の位置１９３〜２６４、配列番号６の位置１９３〜２６４、配列番号８の位置１８４〜２５５、配列番号１１の位置１１８４〜１２５５、配列番号１４の位置１５９〜２３０、配列番号１５の位置１２９〜２００、配列番号１７の位置７〜７８、配列番号１７の位置７９〜１５０、配列番号１７の位置１５１〜２２２、配列番号１８の位置１〜７２、配列番号１８の位置７３〜１４４、配列番号１８の位置１４５〜２１６、および異なるヒトＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を含む。一態様では、各ＣＤドメインは、配列番号１５の位置１２９〜２００、配列番号１７の位置７〜７８、配列番号１７の位置７９〜１５０、配列番号１７の位置１５１〜２２２、配列番号１８の位置１〜７２、配列番号１８の位置７３〜１４４、および配列番号１８の位置１４５〜２１６から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を含む。

この実施形態の一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号１８に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列または配列番号１８に対して少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。一態様では、融合タンパク質は、配列番号１７に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７に対して少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を有する。

本発明の他の実施形態は、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）該酵母媒体により発現されたかつ少なくとも１つのＭＵＣ１アゴニスト抗原を含む融合タンパク質と、を含む酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物に関する。本発明のこの実施形態の一態様では、ＭＵＣ１アゴニスト抗原は、ＭＵＣ１抗原内に１〜１１個のアゴニストエピトープを形成するように、野生型ＭＵＣ１配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、またはそれを超える数のアミノ酸置換を含み、本明細書では、ＭＵＣ１アゴニスト抗原としても参照される。一態様では、ＭＵＣ１アゴニスト抗原は、配列番号２３または配列番号２５に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性であるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号２３もしくは配列番号２５、または配列番号２３もしくは配列番号２５に対して少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、配列番号２３または配列番号２５のアミノ酸配列を有する。

本発明のさらに他の実施形態は、腫瘍負荷を低減する、腫瘍増殖を阻害する、および／またはＭＵＣ１を発現する癌を有する個体の生存率を増大する、方法に関する。この方法は、以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物を個体に投与する工程を含む。一態様では、ＭＵＣ１発現は、組成物が最初に投与された時点で個体の癌で検出される。一態様では、個体は、Ｉ期癌を有する。一態様では、個体は、ＩＩ期癌を有する。一態様では、個体は、ＩＩＩ期癌を有する。一態様では、個体は、ＩＶ期癌を有する。

本発明の他の実施形態は、疾患を治療するための本明細書に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物のいずれかの使用に関する。一態様では、疾患は癌である。
本発明のさらに他の実施形態は、癌を有する個体における癌の転移進行を低減、阻止、逆転、または予防するための本明細書に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物のいずれかの使用に関する。

本発明のさらに他の実施形態は、ＭＵＣ１発現癌の発症を予防または遅延するための本明細書に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物のいずれかの使用に関する。
本発明の他の実施形態は、癌を治療するための免疫療法用組成物の組合せの使用に関する。この免疫療法用組成物は、（ａ）本明細書に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物のいずれかである第１の組成物と、（ｂ）酵母媒体とＭＵＣ１抗原でない抗原とを含む少なくとも１つの追加の免疫療法用組成物と、を含む。一態様では、ＭＵＣ１抗原でない抗原は、突然変異Ｒａｓ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、および／またはブラキュリーから選択される。

本明細書に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物に関連する方法または使用に関連する実施形態のいずれかの一態様では、個体は、限定されるものではないが、化学療法、標的癌療法、放射線療法、養子Ｔ細胞移入、個体からの腫瘍の外科的切除、および／または１つまたは複数の追加の免疫療法用組成物の投与をはじめとする他の癌療法により、治療されるかまたは治療されてきた。一態様では、追加の免疫療法用組成物は、ＭＵＣ１抗原である第２の癌抗原またはＭＵＣ１抗原でない癌抗原を含む。一態様では、追加の免疫療法用組成物は、酵母媒体と、ＭＵＣ１抗原を含まない第２の癌抗原と、を含む。一態様では、追加の免疫療法用組成物は、限定されるものではないが、突然変異Ｒａｓ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）、ブラキュリー、ＥＧＦＲ、ＢＣＲ−Ａｂｌ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ、ＧＰ−１００、ＭＵＣ−２、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−２、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２、ｈＴＥＲＴ、ｐ７３、Ｂ−ＲＡＦ、腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ：ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓｐｏｌｙｐｏｓｉｓｃｏｌｉ）、Ｍｙｃ、フォンヒッペル・リンダウタンパク質（ＶＨＬ：ｖｏｎＨｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｒｂ−１、Ｒｂ−２、アンドロゲン受容体（ＡＲ：ａｎｄｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｓｍａｄ４、ＭＤＲ１、Ｆｌｔ−３、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＴＷＩＳＴ、メソテリン、および／またはＮＧＥＰをはじめとする第２の癌抗原を含む。一態様では、第２の癌抗原は、突然変異Ｒａｓ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、およびブラキュリーからなる群から選択される。一態様では、追加の免疫療法用組成物は、ウイルスベクターワクチンである。一態様では、追加の免疫療法用組成物は、樹状細胞／腫瘍細胞融合体である。

本発明のさらに他の実施形態は、ＭＵＣ１発現癌の発症を予防または遅延する方法に関する。この方法は、本明細書に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物のいずれかを個体に投与する工程を含む。一態様では、癌は、個体において検出されていない。一態様では、個体は、癌を発生する高いリスクがある。一態様では、個体は、前癌病変を有する。一態様では、個体は、癌を有するが、ＭＵＣ１発現癌細胞は、癌で検出されていない。

本明細書に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物に関連する方法または使用のいずれかにおいて、一態様では、癌は、上皮細胞起源である。一態様では、癌は、限定されるものではないが、乳癌、小腸癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、黒色腫、多発性骨髄性白血病（ＭＭＬ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ：ｃｈｒｏｎｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、分泌組織癌、およびそれらの転移癌を含みうる。一態様では、癌は、乳癌および大腸癌から選択される。一態様では、癌は、乳癌、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌、食道癌、およびＡＭＬから選択される。一態様では、癌は、ＡＭＬであり、かつ酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、骨髄移植（ＢＭＴ：ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）療法のドナーおよびレシピエントの両方に投与される。一態様では、癌は、ＡＭＬであり、かつ酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、シタラビンおよびアントラサイクリン療法と組み合わされて個体に投与される。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態のいずれかにおいて、一態様では、酵母媒体は、酵母菌体である。一態様では、酵母媒体は、熱不活性化される。一態様では、酵母媒体は、野生型酵母株と比較して低グリコシル化タンパク質を産生する突然変異酵母株に由来する。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、酵母媒体の細胞壁上に発現される。一態様では、ＭＵＣ１抗原は、酵母媒体の周辺質中または細胞質中で発現される。一態様では、酵母媒体は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。一態様では、酵母媒体は、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態のいずれかにおいて、一態様では、免疫療法用組成物は、５．５〜８のｐＨレベルに維持された培地中でＭＵＣ１抗原を発現する酵母菌体を培養することにより作製された。一態様では、培地は、緩衝剤で緩衝化された。一態様では、酵母は、６〜８のｐＨレベルに維持された培地中で培養された。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態のいずれかにおいて、一態様では、組成物は、少なくとも１種の生物学的反応修飾剤をさらに含む。
以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態のいずれかにおいて、一態様では、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態のいずれかにおいて、一態様では、組成物は、注射用として製剤化された。

全長ＭＵＣ１タンパク質の構造を示す概略図。ＧＩ−６１０１として知られる酵母ベースの免疫療法用組成物中で発現される融合タンパク質の構造を示す概略図。ＧＩ−６１０４として知られる酵母ベースの免疫療法用組成物中で発現される融合タンパク質の構造を示す概略図。（Ａ）は、ＧＩ−６１０１によるＭＵＣ１融合タンパク質の発現を示すディジタル化画像であり、（Ｂ）は、脱グリコシル化の前および後のＧＩ−６１０１および６１０４からのＭＵＣ１融合タンパク質の発現を示すディジタル化画像であり、（Ｃ）は、ＧＩ−６１０４によるＭＵＣ１融合タンパク質の発現を示すディジタル化画像。ＧＩ−６１０５によるＭＵＣ１融合タンパク質の発現を示すディジタル化画像。

本発明は、一般的には、ムチン−１（本明細書では一般的には「ＭＵＣ１」として参照されうるが、「ＤＦ３抗原」または「ＨＭＦＧ」としても知られるかまたは知られてきた）を発現または過剰発現する癌を予防および／または治療するための酵母ベースの免疫療法用組成物および方法に関する。本発明は、酵母ベースの免疫療法用組成物（酵母ベースの免疫療法組成物または生成物としても参照される）の使用を包含し、当該酵母ベースの免疫療法用組成物は、酵母媒体と、新規なＭＵＣ１抗原とを含む（本明細書では「酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物」、「酵母−ＭＵＣ１免疫療法生成物」、または「酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物」としても参照される）。本発明者らは、新規な酵母−ＭＵＣ１免疫療法生成物の構築および生成を本明細書に記載し、酵母−ＭＵＣ１免疫療法が、ヒト樹状細胞（ＤＣ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）を成熟し、腫瘍の治療に有利であると予想される免疫反応に関連付けられるＤＣからのサイトカイン産生を増大し、かつＭＵＣ１特異的Ｔ細胞系の活性化を誘発することを実証する。まとめると、本明細書に提示されたデータから、酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、ＭＵＣ１特異的細胞免疫反応の誘発に有用であり（ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋）、かつ酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、ＭＵＣ１発現腫瘍の予防および治療に有用であると予想されることが示される。

酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、同一酵母組成物内での追加の腫瘍抗原の使用に、または他の腫瘍抗原を標的とする他の酵母ベースの免疫療法剤もしくは他の免疫療法剤および癌治療／癌療法と組み合わせた使用（逐次的もしくは併行的）に、容易に適合化可能である。したがって、酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、癌のタイプ、癌の病期、癌の悪性度、腫瘍により発現される抗原、および個体の全体的医学的状態に適合化可能であり（すなわち、療法は、容易に個人化される）、すでに癌を有している個体のために、さまざまな腫瘍病期で最大の有効性を提供すべく、個体における癌の進行に合わせて、その使用に変更を加えることが可能である。酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、広範囲の癌の広範にわたる予防処置および／または治療処置の機会を提供する。

実際に、酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、各タイプの癌徴候でこの抗原が果たす特定の役割に合わせて酵母−ＭＵＣ１免疫療法を調整することにより、種々のＭＵＣ１陽性癌を治療すべく柔軟に使用可能である。たとえば、ＭＵＣ１は、乳癌や大腸癌などの癌で早期マーカとして記載されているので、酵母ベースの免疫療法は、ＭＵＣ１陽性の前癌性乳房過形成または大腸ポリープの患者で予防用に使用しうる。他の例として、ＭＵＣ１は、膵臓癌、卵巣癌、食道癌などの癌で上皮間葉転換（ＥＭＴ）経路および転移の広がりに関連付けられてきたので、酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、ＭＵＣ１陽性の３期の膵臓癌、卵巣癌、および食道癌で転移の広がりの阻止を促進すべく、これらの癌で標準療法への追加療法として使用可能である。さらに他の例として、ＭＵＣ１は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で反応性酸素種による最終分化を防止するにより、これらの癌細胞の無制限自己複製を可能にすることが示されているので、酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、アポトーシスを促進して悪性細胞の無制限自己複製を防止すべく、ＭＵＣ１陽性ＡＭＬで標準療法への追加として使用可能である。ＡＭＬ患者で酵母−ＭＵＣ１免疫療法を用いた臨床試験は、実施例に記載されている。

本明細書に記載の酵母−ＭＵＣ１組成物は、すべて、毒性問題を有するものが多い外因性アジュバント、サイトカイン、または他の免疫刺激性分子を用いることなく、ＣＤ４依存性ＴＨ１７およびＴＨ１Ｔ細胞反応および抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞反応（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）反応を含む）を含む、標的抗原（ＭＵＣ１）に対する先天性免疫反応さらには適応免疫反応を誘導する。それに加えて、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数および／または機能を阻害することにより、たとえば、通常は腫瘍の存在により抑制されると思われるエフェクターＴ細胞反応を促進する。さらに、抗体反応を引き起こすことにより免疫化する免疫療法用組成物と比較して、酵母−ＭＵＣ１免疫療法により誘発される抗原特異的な、広範にわたる、かつ強力な細胞免疫反応は、腫瘍細胞を標的とするのにとくに有効であると考えられる。実際に、多くの研究から、ＭＨＣクラスＩ分子との関連で腫瘍ペプチドを認識するＣＤ８^＋ＣＴＬを介して腫瘍細胞が標的とされる場合に、免疫療法が促進されることが示されてきた。酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、抗原提示細胞の活性化にきわめて有効であり、かつ免疫反応をクロスプライミングする特異能力を有し、その結果、たとえ他の場合に抑制的な環境あったとしてもそれに対抗して、典型的には腫瘍に対して有効なＣＤ８^＋ＣＴＬ反応を引き起こす。このタイプの免疫療法は、関連免疫原を提示する抗原提示細胞の自然能力を利用するので、本発明に係る効果的免疫療法剤を生成するためにＭＵＣ１のＣＴＬエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープが何であるかを正確に知る必要がない。実際に、単一の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物で複数のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを標的としうるので、本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法剤は、短いペプチドの使用に限定されるものではない。実際に、これらの組成物で標的抗原の複数のドメインを含有する、より長いポリペプチドおよび融合タンパク質を使用することは、有効である。したがって、酵母−ＭＵＣ１免疫療法を使用することにより、推定Ｔ細胞エピトープを同定するアルゴリズムおよび複雑な式の使用は、回避される。

酵母−ＭＵＣ１は、外因性アジュバント、免疫刺激剤もしくは分子、共刺激分子、またはサイトカインを用いることなく、免疫化プロトコル（予防用または療法用）で効果的に利用可能であるが、所望により、そのような作用剤を含めてもよい。さらに、酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、他のタイプの免疫療法では問題になりうる有効性の喪失を伴うことなく、繰返し投与が可能である。

本発明に係る組成物
本発明の一実施形態は、ＭＵＣ１の発現または過剰発現により特徴付けられる癌（初期には検出可能なＭＵＣ１を発現する細胞を含有しえないが癌の発生の後期にはＭＵＣ１を発現する細胞を含有しうるまたは含有するであろう癌を含む）の予防および／または治療に使用可能な酵母ベースの免疫療法組成物に関する。この組成物は、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）１つまたは複数のＭＵＣ１抗原および／またはその免疫原性ドメインを含む癌抗原と、を含む酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物である。ＭＵＣ１抗原またはその免疫原性ドメインは、最も典型的には、酵母媒体により（たとえば、任意選択で、酵母細胞質体、酵母ゴースト、もしくは酵母膜抽出物、またはそれらの一部にさらにプロセシング可能な無傷酵母または酵母スフェロプラスト）により、組換えタンパク質として発現されるが、本明細書に記載されるように、１つまたは複数のＭＵＣ１抗原を酵母媒体中に充填して、さもなければ酵母媒体と複合体化して、それと結合させて、それと混合して、もしくはそれと共に投与して、本発明に係る組成物を形成することは、本発明の一実施形態である。

「酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物」は、少なくとも１つのＭＵＣ１抗原またはその免疫原性ドメインを含有する特定のタイプの「酵母ベースの免疫療法用組成物」である。「酵母ベースの免疫療法用組成物」という表現は、「酵母ベースの免疫療法生成物」、「酵母ベースの免疫療法組成物」、「酵母ベースの組成物」、「酵母ベースの免疫療法剤」、「酵母ベースのワクチン」、またはこれらの表現の派生語と同義的に使用しうる。「免疫療法用組成物」は、被験体において少なくとも１つの治療効果を達成すのに十分な免疫反応を誘発する組成物である。本明細書で用いられる場合、酵母ベースの免疫療法用組成物とは、酵母媒体成分を含む、かつ被験体において少なくとも１つの治療効果を達成するのに十分な免疫反応を誘発する、組成物を意味する。より特定的には、酵母ベースの免疫療法用組成物は、酵母媒体成分と典型的には抗原成分とを含む組成物であり、限定されるものではないがＴ細胞媒介細胞免疫反応をはじめとする細胞免疫反応などの免疫反応を誘発または誘導することが可能である。一態様では、本発明に有用な酵母ベースの免疫療法用組成物は、ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞媒介免疫反応、一態様では、とくに標的抗原（たとえば癌抗原）に対するＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞媒介免疫反応を誘導可能である。ＣＤ４^＋免疫反応は、ＴＨ１免疫反応、ＴＨ２免疫反応、ＴＨ１７免疫反応、または以上の任意の組合せを含みうる。酵母ベースの免疫療法剤は、特定的には、ＴＨ１およびＴＨ１７反応を引き起こすことが可能である。ＣＤ８^＋免疫反応は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を含むことが可能であり、酵母ベースの免疫療法剤は、そのような反応を引き起こすことが可能である。一態様では、酵母ベースの免疫療法用組成物は、被験体において調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数および／または機能を変調する。酵母ベースの免疫療法はまた、たとえば、サイトカイン、抗体の添加により、および／または酵母の作製プロセスの調整により、一方のタイプの反応を他方のタイプの反応よりも促進するように変更を加えることが可能である。任意選択で、酵母ベースの免疫療法用組成物は、体液性免疫反応を誘発可能である。

本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、「予防用」または「療法用」のいずれかでありうる。予防用に提供される場合、本発明に係る組成物は、個体におけるＭＵＣ１発現腫瘍の発生の予防、阻害、もしくは遅延および／またはそのような腫瘍の転移の予防、阻害、もしくは遅延および／または一般的には癌の進行の予防もしくは阻害を目標として、ＭＵＣ１を発現する癌の発生前または発生の検出前に提供される。本明細書で考察されるように、ＭＵＣ１は、いくつかの癌で発現される。したがって、予防用組成物は、癌でないと思われる個体（健常または正常な個体）に、前癌状態（前悪性病変）の個体に、さらには癌を有しているがＭＵＣ１がまだ検出されていない個体に（すなわち、癌中での腫瘍細胞によるＭＵＣ１発現の前に）、投与することが可能である。癌、とくにＭＵＣ１発現および／または転移が典型的には関連する癌を発生する高いリスクがある個体は、本発明に係る組成物を用いて予防的に治療しうる。療法的に提供される場合、免疫療法組成物は、たとえば、個体における腫瘍負荷の低減、個体における腫瘍増殖の阻害、個体の生存率の増大、および／または個体における癌の進行の予防、阻害、逆転、もしくは遅延により、癌を寛解させることを目標として、ＭＵＣ１発現癌を有する個体に提供される。

典型的には、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、酵母媒体と、ＭＵＣ１抗原またはその免疫原性ドメインを含む少なくとも１つの癌抗原と、を含み、この癌抗原は、酵母媒体との結合、その中への充填、またはそれとの混合により発現される。いくつかの実施形態では、癌抗原、ＭＵＣ１抗原、またはそれらの免疫原性ドメインは、融合タンパク質として提供される。本発明に係る組成物および方法で使用するのに好適ないくつかのＭＵＣ１タンパク質および融合タンパク質は、以下に記載される。いくつかの実施形態では、癌抗原およびＭＵＣ１抗原は、同一エレメントである。いくつかの実施形態では、癌抗原は、ＭＵＣ１抗原に加えて、他の癌抗原をはじめとする他の抗原を含む。本発明の一態様では、癌抗原として有用な融合タンパク質は、２つ以上の抗原、たとえば、ＭＵＣ１抗原とＭＵＣ１抗原でない他の癌抗原、または２つの異なるＭＵＣ１抗原を含みうる。一態様では、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗原の２つ以上の免疫原性ドメイン、たとえば、ＭＵＣ１抗原の２つ以上の免疫原性ドメイン、または１つまたは複数の抗原の２つ以上のエピトープ、たとえば、ＭＵＣ１抗原の２つ以上のエピトープを含みうる。

本発明によれば、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物で使用される酵母媒体は、本発明に係る組成物（たとえば、療法用または予防用の組成物）において１つまたは複数の抗原、その免疫原性ドメイン、またはそのエピトープと組み合わせて使用することが可能な任意の酵母細胞（たとえば、全細胞もしくは無傷細胞）またはそれらの派生物（以下を参照されたい）である。したがって、酵母媒体は、限定されるものではないが、生存無傷（菌体）酵母微生物（すなわち、細胞壁を含むすべてのその成分を有する酵母細胞）、死滅（死亡）もしくは不活性化無傷酵母微生物、あるいは酵母スフェロプラスト（すなわち、細胞壁が欠如している酵母細胞）、酵母細胞質体（すなわち、細胞壁および核が欠如している酵母細胞）、酵母ゴースト（すなわち、細胞壁、核、および細胞質が欠如している酵母細胞）、細胞レベル下の酵母細胞膜抽出物もしくはその一部（酵母細胞膜粒子としても参照され、以前は、細胞レベル下の酵母粒子としても参照された）、任意の他の酵母粒子、または酵母細胞壁調製物をはじめとする無傷酵母の派生物を含む。

酵母スフェロプラストは、典型的には、酵母細胞壁の酵素消化により作製される。そのような方法は、たとえば、フランズソフ（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ）ら著、１９９１年、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第１９４巻、ｐ．６６２〜６７４．（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

酵母細胞質体は、典型的には、酵母細胞の除核により作製される。そのような方法は、たとえば、クーン（Ｃｏｏｎ）著、１９７８年、ナショナル・キャンサー・インスティチュート・モノグラフス（Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．）、第４８巻、ｐ．４５〜５５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

酵母ゴーストは、典型的には、透過化細胞または溶解細胞の再封により作製されるが、その細胞のオルガネラの少なくとも一部を含有しうる（その必要があるわけではない）。そのような方法は、たとえば、フランズソフ（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ）ら著、１９８３年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５８巻、ｐ．３６０８〜３６１４およびブッセイ（Ｂｕｓｓｅｙ）ら著、１９７９年、バイオシミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、第５５３巻、ｐ．１８５〜１９６（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

酵母細胞膜粒子（細胞レベル下の酵母細胞膜抽出物またはその一部）は、天然の核または細胞質が欠如している酵母細胞膜を意味する。粒子は、天然酵母細胞膜のサイズから、超音波処理法または当業者に公知の他の膜破壊法およびそれに続く再封により作製されるマイクロ粒子まで、の範囲内のサイズを含めて、任意のサイズでありうる。細胞レベル下の酵母細胞膜抽出物の作製方法は、たとえば、フランズソフ（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ）ら著、１９９１年、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第１９４巻、ｐ．６６２〜６７４に記載されている。また、酵母細胞膜部分を含有する酵母細胞膜粒子の一部と、酵母細胞膜粒子の調製前に抗原または他のタンパク質が酵母により組換え発現された場合には対象の抗原または他のタンパク質と、を使用してもよい。対象の抗原または他のタンパク質は、膜内、膜のいずれかの表面上、またはそれらの組合せに担持可能である（すなわち、タンパク質は、膜内および膜外の両方にならびに／または酵母細胞膜粒子の膜をまたいで存在可能である）。一実施形態では、酵母細胞膜粒子は、膜の表面上にまたは少なくとも部分的に膜内に埋め込んで少なくとも１つの所望の対象の抗原または他のタンパク質を含む、無傷の、破壊された、または破壊かつ再封された酵母細胞膜でありうる組換え酵母細胞膜粒子である。

酵母細胞壁調製物の例は、動物に投与した時に酵母細胞壁調製物が疾患標的に対して所望の免疫反応を刺激するように、その表面上にまたは少なくとも部分的に細胞壁内に埋め込んで抗原を担持する単離された酵母細胞壁の調製物である。

任意の酵母株を用いて、本発明に係る酵母媒体を作製することが可能である。酵母は、３クラス、すなわち、子嚢菌、担子菌、および不完全菌の１つに属する単細胞微生物である。免疫変調剤として使用するための酵母タイプの選択の一考慮点は、酵母の病原性である。一実施形態では、酵母は、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非病原性株である。非病原性酵母株の選択により、酵母媒体が投与される個体に及ぼすいかなる悪影響も、最小限に抑えられる。しかしながら、当業者に公知のなんらかの手段により酵母の病原性を打ち消すことが可能であれば、病原性酵母を使用してもよい（たとえば、突然変異株）。本発明の一態様によれば、非病原性酵母株が使用される。

本発明に使用しうる酵母株の属としては、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（病原性のこともある）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一態様では、酵母の属は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、またはシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され、一態様では、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が使用される。本発明に使用しうる酵母株の種としては、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａｋｅｆｙｒ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・ラウレンティイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａａｎｏｍａｌａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアナス変種ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓｖａｒ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｒｕｂｒａ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの種のいくつかは、以上に挙げた種に含まれるとみなされるさまざまな亜種、タイプ、サブタイプなどを含むことを認識すべきである。一態様では、本発明で使用される酵母種は、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）を含む。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、操作が比較的簡単であるので、かつ食品添加物として使用するうえで「一般に安全であると認められる」または「ＧＲＡＳ」であるので（ＧＲＡＳ、ＦＤＡ提案規則６２ＦＲ１８９３８、１９９７年４月１７日）、有用である。本発明の一実施形態は、とくに高いコピー数にプラスミドを複製可能な酵母株、たとえば、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｃｉｒ°株である。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、１つまたは複数の標的抗原および／または抗原融合タンパク質および／または他のタンパク質の高レベルでの発現を可能にする発現ベクターを支持可能な株の１つである。本発明に有用な他の酵母株は、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３αである。それに加えて、Ｎ結合グリコシル化を増加させる酵素中の突然変異のように、発現された標的抗原または他のタンパク質の翻訳後修飾の低減を呈する株をはじめとする任意の突然変異酵母株を、本発明に使用することが可能である。本発明の一態様では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、野生型株（正常なグリコシル化を有する）により作製される同一の抗原と比較して、低グリコシル化されたタンパク質としてＭＵＣ１抗原を産生する突然変異酵母株を用いて、作製される。そのようなＭＵＣ１抗原は、腫瘍細胞により発現されるＭＵ１抗原に、より類似する可能性があり、抗原提示細胞によって特異Ｔ細胞エピトープにその後プロセシングされうるので、特定の抗腫瘍反応を促進する。

本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、ＭＵＣ１抗原を含む少なくとも１つの癌抗原を含む。本発明によれば、「抗原」という用語の本明細書での一般的使用は、タンパク質（このタンパク質は、天然に存在するか、もしくは合成的に誘導されるか、もしくは設計される）の任意の部分（たとえば、ペプチド、部分タンパク質、全長タンパク質）、細胞組成物（全細胞、細胞溶解物、もしくは破壊細胞）、生物（全生物体、溶解物、もしくは破壊細胞）、あるいは炭水化物もしくは他の分子またはそれらの一部を意味する。抗原は、免疫系の要素（たとえば、Ｔ細胞、抗体）がｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏ、またはｅｘｖｉｖｏで遭遇する同一または類似の抗原に対して、抗原特異的免疫反応（たとえば、体液性および／または細胞媒介性の免疫反応）を誘発しうる。

抗原は、単一のエピトープ程度に小さいものでありうるか、単一の免疫原性ドメイン以上でありうる。また、複数のエピトープまたは免疫原性ドメインを含みうる。したがって、抗原のサイズは、約８〜１１アミノ酸程度に小さいものでありうる（すなわち、ペプチド）。また、タンパク質のドメイン、全長タンパク質、多量体、融合タンパク質、キメラタンパク質、全細胞、全微生物体、またはそれらの任意の一部（たとえば、タンパク質断片（ポリペプチド）全細胞の溶解物、または微生物の抽出物）程度に大きいものでありうる。本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法剤に有用な抗原は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質サブユニット、全長タンパク質、多量体、融合タンパク質、およびキメラタンパク質である。それに加えて、抗原は、酵母媒体中または本発明に係る組成物中に充填可能な炭水化物を含みうる。いくつかの実施形態では（たとえば、抗原が組換え核酸分子から酵母媒体により発現される場合）、抗原が、全細胞や微生物ではなく、タンパク質（断片、ドメイン、サブユニット、および全長タンパク質を含む）、融合タンパク質、キメラタンパク質、またはそれらの断片であることは、わかるであろう。酵母中での発現の場合、一実施形態では、抗原が酵母により発現される全タンパク質である場合、抗原は、酵母中で組換え発現可能な最小サイズであり（言い換えれば、抗原を含みうるまたはそれで構成されうる、酵母により発現されるタンパク質は、好ましくは、少なくとも２５アミノ酸長である）、典型的には、少なくとも２５アミノ酸長もしくは２５アミノ酸長超、または少なくとも２６アミノ酸長もしくは２６アミノ酸長超、２７アミノ酸長もしくは２７アミノ酸長超、２８アミノ酸長もしくは２８アミノ酸長超、２９アミノ酸長もしくは２９アミノ酸長超、３０アミノ酸長もしくは３０アミノ酸長超、３１アミノ酸長もしくは３１アミノ酸長超、３２アミノ酸長もしくは３２アミノ酸長超、３３アミノ酸長もしくは３３アミノ酸長超、３４アミノ酸長もしくは３４アミノ酸長超、３５アミノ酸長もしくは３５アミノ酸長超、３６アミノ酸長もしくは３６アミノ酸長超、３７アミノ酸長もしくは３７アミノ酸長超、３８アミノ酸長もしくは３８アミノ酸長超、３９アミノ酸長もしくは３９アミノ酸長超、４０アミノ酸長もしくは４０アミノ酸長超、４１アミノ酸長もしくは４１アミノ酸長超、４２アミノ酸長もしくは４２アミノ酸長超、４３アミノ酸長もしくは４３アミノ酸長超、４４アミノ酸長もしくは４４アミノ酸長超、４５アミノ酸長もしくは４５アミノ酸長超、４６アミノ酸長もしくは４６アミノ酸長超、４７アミノ酸長もしくは４７アミノ酸長超、４８アミノ酸長もしくは４８アミノ酸長超、４９アミノ酸長もしくは４９アミノ酸長超、または少なくとも５０アミノ酸長もしくは５０アミノ酸長超、または少なくとも２５〜５０アミノ酸長、少なくとも３０〜５０アミノ酸長、または少なくとも３５〜５０アミノ酸長、または少なくとも４０〜５０アミノ酸長、または少なくとも４５〜５０アミノ酸長であるが、より小さいタンパク質が発現されてもよく、また、かなり大きいタンパク質（たとえば、何百アミノ酸長、さらには数千アミノ酸長）が発現されてもよい。一態様では、全長タンパク質またはＮ末端および／またはＣ末端から１〜２０アミノ酸が欠如しているタンパク質のドメインが発現されうる。融合タンパク質およびキメラタンパク質もまた、本発明で発現されうる抗原である。「標的抗原」とは、本発明に係る免疫療法用組成物が特異的に標的とする抗原（すなわち、免疫反応の誘発が望まれる抗原、通常は天然の抗原）のことである。「癌抗原」とは、癌に関連付けられた少なくとも１つの抗原を含む抗原であり、たとえば、腫瘍細胞により発現される抗原である。これにより、そうした抗原を標的とすることは腫瘍細胞および／または癌をも標的とする。癌抗原は、１つまたは複数の腫瘍関連タンパク質を含む１つまたは複数のタンパク質の１つまたは複数の抗原を含みうる。「ＭＵＣ１抗原」とは、ＭＵＣ１タンパク質（ＭＵＣ１−Ｎ、ＭＵＣ１−Ｃ、またはＭＵＣ１−ＮとＭＵＣ１−Ｃの両方を含む）から誘導、設計、または産生される抗原のことである。

免疫反応の刺激について言及する場合、「免疫原」という用語は、「抗原」という用語の一部であるので、いくつかの場合には、「抗原」という用語と同義的に用いられうる。免疫原は、本明細書で用いられる場合、個体への免疫原の投与により、個体の免疫系が遭遇する同一または類似の抗原に対して抗原特異的免疫反応が開始されるように、体液性および／または細胞媒介性の免疫反応を誘発する抗原を記述する（すなわち、免疫原性である）。一実施形態では、免疫原は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞反応（たとえば、ＴＨ１、ＴＨ２、および／またはＴＨ１７）および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞反応（たとえば、ＣＴＬ反応）をはじめとする細胞媒介性免疫反応を誘発する。

所与の抗原の「免疫原性ドメイン」または「免疫学的ドメイン」は、動物に投与した時に免疫原として作用可能な少なくとも１つのエピトープを含有する抗原の任意の部分、断片、またはエピトープ（たとえば、ペプチド断片またはサブユニットまたは抗体エピトープまたは他のコンフォメーショナルエピトープ）でありうる。したがって、免疫原性ドメインは、単一のアミノ酸よりも大きく、かつ少なくとも、免疫原として作用可能な少なくとも１つのエピトープを含有するのに十分なサイズである。たとえば、単一のタンパク質は、複数の異なる免疫原性ドメインを含有可能である。コンフォメーショナルドメインが想定される体液性免疫反応の場合などでは、免疫原性ドメインは、タンパク質内において線状配列である必要はない。

エピトープとは、本明細書では、免疫系の適切な共刺激性シグナルおよび／または活性化細胞との関連で免疫系に提供された時に免疫反応を誘発するのに十分な所与の抗原内の単一免疫原性部位として定義される。言い換えれば、エピトープは、免疫系の成分により認識される抗原の一部であり、抗原決定基として参照されうる。Ｔ細胞エピトープが、Ｂ細胞エピトープや抗体エピトープとはサイズおよび組成が異なること、およびクラスＩＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープが、クラスＩＩＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープとはサイズおよび構造属性が異なることは、当業者であればわかるであろう。たとえば、クラスＩＭＨＣ分子により提示されるＴ細胞エピトープは、典型的には、８〜１１アミノ酸長であるが、クラスＩＩＭＨＣ分子により提示されるエピトープは、長さにそれほど制限がなく、２５アミノ酸までまたは２５アミノ酸超でありうる。それに加えて、Ｔ細胞エピトープは、エピトープにより結合される特定のＭＨＣ分子に依存する予測構造特性を有する。エピトープは、線状配列エピトープまたはコンフォメーショナルエピトープ（保存結合領域）でありうる。ほとんどの抗体は、コンフォメーショナル（立体配置的）エピトープを認識する。

ＭＵＣ１（「ムチン−１」さらには「ＤＦ３抗原」または「ＨＭＦＧ１」としても参照されうる）は、基礎レベルでほとんどの上皮分泌組織により発現される大きい糖タンパク質であり、上皮細胞起源の悪性疾患によって高レベルで発現される。ＭＵＣ１は、最も典型的には、Ｏ結合を介して高グリコシル化された可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ、典型的には２０〜１２５リピート）を含む大きい細胞外ドメイン（ＭＵＣ１−Ｎサブユニットとしても参照される）を有する多型Ｉ型膜貫通タンパク質として見いだされる。ＭＵＣ１タンパク質は、単一の転写物としてコードされ、そのうえ、それぞれ、ＭＵＣ１−ＮおよびＭＵＣ１−Ｃまたはαおよびβサブユニットとして知られるサブユニットに翻訳後にプロセシングされ、次いで、２つのサブユニットの強力な非共有結合性相互作用によりヘテロ二量体タンパク質を形成する。ＭＵＣ１は、高度に保存されたタンパク質ドメインである「ウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン」（ＳＥＡ）ドメイン内でＮおよびＣサブユニットに切断される。このドメインは、それが最初に精子タンパク質中、エンテロキナーゼ中、およびアグリン中で同定されたことに因んで命名されたものであり、典型的には膜テザー連結されたいくつかの高グリコシル化ムチン様タンパク質中に見いだされる。ＭＵＣ１タンパク質は、ＳＥＡドメイン内の配列ＧＳＶＶＶ（たとえば、配列番号１１の位置１０９７〜１１０１）中に存在するグリシン残基とセリン残基との間で切断される（リレホジ（Ｌｉｌｌｅｈｏｊ）ら著、２００３年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、第３０７巻、ｐ．７４３〜７４９、パリー（Ｐａｒｒｙ）ら著、２００１年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、第２８３巻、ｐ．７１５〜７２０、レシュナー（Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ）ら著、２００２年、プロテイン・サイエンス（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．）、第１１巻、ｐ．６９８〜７０６）。

ＭＵＣ１−Ｃサブユニットは、細胞外ドメイン（ＥＤ）を含み、これは、グリコシル化されかつガレクチン−３リガンドに結合し、次に、架橋として機能して、ＭＵＣ１を上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）およびおそらく他の受容体チロシンキナーゼに物理会合させる。ＭＵＣ１−Ｃはまた、膜貫通（ＴＭ）ドメインと細胞質内ドメイン（ＣＤ）とを含み、細胞質内ドメイン（ＣＤ）は、リン酸化される時に、ＳＨ２ドメインを有するタンパク質に対する結合モチーフとして作用可能ないくつかのチロシン残基を含有する（ＭＵＣ１タンパク質の詳細な考察ならびに既知および推定の機能については、クフェ（Ｋｕｆｅ）著、２００８年、キャンサー・バイオロジー・アンド・セラピー（ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌ．＆Ｔｈｅｒ．）、第７巻、ｐ．８１〜８４を参照されたい）。ＭＵＣ１の代替スプライス変異体（たとえば、ＭＵＣ１／ＹおよびＭＵＣ１／Ｘとして知られる）は、ＭＵＣ１の「短い」変異体であり、これは、大きいＶＮＴＲ領域を含めてＭＵＣ１−Ｎのほとんどが欠如しているが、ＥＤ、ＴＭ、およびＣＤ領域さらにはＳＥＡドメインおよびＮ末端領域のシグナル配列領域の部分を含む。ＳＥＡドメイン内での切断は、この短い変異体では起こらないこともありうる。

ヒトＭＵＣ１をコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡの単離および配列決定は、報告されている（たとえば、シッディクイ（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ）ら著、１９９８年、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第８５巻、ｐ．２３２０〜２３２３、アベ（Ａｂｅ）およびクフェ（Ｋｕｆｅ）著、１９９３年、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第９０巻、ｐ．２８２〜２８６、ハレウベニ（Ｈａｒｅｕｖｅｎｉ）ら著、１９９０年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１８９巻、第３号、ｐ．４７５〜４８６、ジェンドラー（Ｇｅｎｄｌｅｒ）ら著、１９９０年、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６５巻、第２５号、ｐ．１５２８６〜１５２９３、ラン（Ｌａｎ）ら著、１９９０年、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６５巻、第２５号、ｐ．１５２９４〜１５２９９、ツァルファティー（Ｔｓａｒｆａｔｙ）ら著、１９９０年、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第９３巻、第２号、ｐ．３１３〜３１８、ランカスター（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）著、１９９０年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、第１７３巻、第３号、ｐ．１０１９〜１０２９を参照されたい）。ＭＵＣ１−Ｎ領域とＭＵＣ１−Ｃ領域の両方を含有する全長ヒトＭＵＣ１前駆体タンパク質の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１５９４１．３（ＧＩ：２９６４３９２９５）に記載されており、本明細書では配列番号１１により表される。代替転写物スプライシングにより、配列番号１１をコードする遺伝子から１０個の異なるＭＵＣ１アイソフォームを形成することが可能である。たとえば、ＭＵＣ１／Ｙとして知られるアイソフォームは、配列番号１１の位置５４〜１０５３が欠如している。種々の他のアイソフォームは、このタンパク質のデータベース説明に記載されている。

任意のヒトＭＵＣ１タンパク質さらには他の哺乳動物ＭＵＣ１タンパク質に適用可能なＭＵＣ１タンパク質内のドメインの同定の例示を目的として、以下のドメインを配列番号１１中で容易に同定することが可能である。本明細書ではリーダー配列としても参照されるＭＵＣ１シグナル配列は、配列番号１１のほぼ位置１〜２３に位置する（ＭＵＣ１シグナル配列は、いくつかのＭＵＣ１変異体ではより長いものとして同定され、位置１〜３２のように追加のアミノ酸を含みうる）。ＭＵＣ１−Ｎサブユニットまたはαサブユニットは、配列番号１１のほぼ位置２４〜１０９７を含み、ＭＵＣ１−Ｃサブユニットまたはβサブユニットは、配列番号１１のほぼ位置１０９８〜１２５５を含む。

ＭＵＣ１−Ｎサブユニット内では、この特定のタンパク質中に複数のリピートを含むＶＮＴＲ（可変数タンデムリピート）ドメインを見いだしうる。これは、配列ＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲ（たとえば、配列番号１１の位置１２６〜１４５）の２０アミノ酸リピートを４２個含有するほぼ位置１２６〜９６５の領域を含み、一般に認識されるＶＮＴＲ配列である（この配列内の共通多型を表す以下の配列番号１２もまた、参照されたい）。これらは反復配列であるので、１つのＶＮＴＲ中の２０個のアミノ酸のいずれか１つからカウントを開始し、次いで、その最初のアミノ酸のリピートを用いて番号付けを再開しうる。より特定的には、単一ＶＮＴＲドメインは、多数のそのような反復配列内に含まれうる、他の同一の、ほぼ同一の、または相同の２０アミノ酸配列が先行および／または後続する約２０アミノ酸配列であるので、ＶＮＴＲ領域内の単一ＶＮＴＲを記述する目的では、所与のＶＮＴＲの「位置１（１位）」をＶＮＴＲ中の２０個のアミノ酸のいずれか１つであるとみなすことができ、次いで、先行および後続のフランキングアミノ酸は、それに従って番号付けられるであろう。この場合、位置１の上流（前）にあるアミノ酸は、先行ＶＮＴＲの最後のアミノ酸（位置２０）であるか、またはＶＮＴＲに結合された配列の最後のアミノ酸（そのような先行配列が同様にＶＮＴＲではない場合）であり、位置１の下流にあるアミノ酸は、そのＶＮＴＲの位置２であり、それに続くのが位置３であり、そして配列がその次のＶＮＴＲで反復されるまで続く。

配列番号１１の位置６１〜１１２０は、以上で考察されたＶＮＴＲ領域に「反復領域」として表される追加の領域を加えたものを含む。たとえば、配列番号１１の位置８１〜１００、位置１０１〜１２０、位置１２１〜１４０、位置１４１〜１６０、位置１６１〜１８０、位置１８１〜２００、位置２０１〜２２０、位置２２１〜２４０、位置２４１〜２６０、位置２６１〜２８０、位置２８１〜３００、およびそれに続いて２０アミノ酸の増分で位置１００１〜１１２０までは、このタンパク質中の反復領域を表す。

配列番号１１（サブユニットに切断される前）により表される全長ＭＵＣ１タンパク質では、ＳＥＡドメインは、配列番号１１の位置１０３４〜１１５２の範囲にわたる。配列番号１１のアミノ酸１０９７〜１０９８のＳＥＡドメインの切断により、ＭＵＣ１−Ｃドメインが生成される。ＭＵＣ１−Ｃドメイン内では、配列番号１１のほぼ位置１０９８〜１１５５に細胞外ドメイン（ＥＤ）が見いだされる。膜貫通（ＴＭ）ドメインは、配列番号１１のほぼ位置１１５６〜１１８３に見いだされ、細胞質内ドメイン（ＣＤ、細胞質内テールとも呼ばれる）は、配列番号１１のほぼ位置１１８４〜１２５５に見いだされる。

所与のＭＵＣ１−Ｎサブユニット中のＶＮＴＲの数は、きわめて多型性であり、たとえば２０〜１２５個のリピートなど、さまざまでありうる。タンデムリピートイコサペプチドは、典型的には、３つの位置（配列番号１２の位置９、１８、および１９）の１つまたは複数で多型を有する。すなわち、ＰＡＰＧＳＴＡＰ［Ｐ／Ａ／Ｑ／Ｔ］ＡＨＧＶＴＳＡＰ［ＤＴ／ＥＳ］Ｒ（配列番号１２、括弧内の領域は共通多型を表す）、ここで、配列番号１２の位置１８および１９の多型は、ＤＴ＞ＥＳの優先度で起こり、位置９の単一交換は、次の優先度：Ｐ＞Ａ、Ｐ＞Ｑ、およびＰ＞Ｔで起こる。最も頻度の高い交換ＤＴ＞ＥＳは、リピートの５０％までで起こる。

ＭＵＣ１のさまざまな転写物変異体が知られているが、以上の例示的な配列番号１１に記載のＭＵＣ１サブユニット、ドメイン、または領域は、変異体中で容易に同定可能であるので、所与のＭＵＣ１配列または他のＭＵＣ１タンパク質からの対応する配列に基づいて、本発明に有用なＭＵＣ１抗原を設計または産生することが可能である。たとえば、ヒトＭＵＣ１タンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列は、本明細書では、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＭ＿００２４５６．４（ＧＩ：６５３０１１１６）に対応する配列番号１により表される。配列番号１は、２７３アミノ酸のヒトＭＵＣ１タンパク質（ＭＵＣ１／ＺＤとしても知られる転写物変異体１）をコードする。このアミノ酸配列は、本明細書では、配列番号２として表される（また、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＰ＿００２４４７．４；ＧＩ：６５３０１１１７にも見いだされる）。配列番号２内には、次のドメイン、すなわち、シグナル配列（配列番号２の位置１〜２７）、ＳＥＡドメイン（配列番号２の位置５５〜１７０）、ＥＤ（配列番号２の位置１１６〜１７３）、ＴＭドメイン（配列番号２の位置１７４〜２０１）、およびＣＤ（配列番号２の位置２０２〜２７３）が存在する。ＳＥＡドメインのＮ末端部からＥＤドメインを切断するＳＥＡドメイン内のタンパク質分解切断部位は、配列番号２の位置１１５〜１１６にある。この転写物変異体は、配列番号１１に示されるＶＮＴＲ領域を含有しない。

他のヒトＭＵＣ１タンパク質をコードする他のヌクレオチド配列は、本明細書では、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１０１８０１６．１（ＧＩ：６７１８９００６）に対応する配列番号３により表される。配列番号３は、２６４アミノ酸のヒトＭＵＣ１タンパク質（「ＭＵＣ１／Ｙ」としても知られる転写物変異体２）をコードする。このアミノ酸配列は、本明細書では、配列番号４（また、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１０１８０１６．１；ＧＩ：６７１８９００７にも見いだされる）として表される。配列番号４内には、次のドメイン、すなわち、シグナル配列（配列番号４の位置１〜３２）、ＳＥＡドメイン（配列番号４の位置４５〜１６１）、ＥＤ（配列番号４の１０７〜１６４）、ＴＭドメイン（配列番号４の位置１６５〜１９２）、およびＣＤ（配列番号４の位置１９３〜２６４）が存在する。ＳＥＡドメインのＮ末端部からＥＤドメインを切断するＳＥＡドメイン内のタンパク質分解切断部位は、配列番号４の位置１０６〜１０７にある。この転写物変異体は、配列番号１１に示されるＶＮＴＲ領域を含有しない。

他のヒトＭＵＣ１タンパク質をコードする他のヌクレオチド配列は、本明細書では、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＡＹ３２７５８７．１（ＧＩ：３３１５０００３）に対応する配列番号５により表される。配列番号５は、２６４アミノ酸のヒトＭＵＣ１タンパク質（「ＭＵＣ１／Ｙ」としても知られる転写物変異体２）をコードする。このアミノ酸配列は、本明細書では、配列番号６として表される（また、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＡＡＰ９７０１８．１（ＧＩ：３３１５０００４）にも見いだされる）。配列番号６内には、次のドメイン、すなわち、シグナル配列（配列番号６の位置１〜３２）、ＳＥＡドメイン（配列番号６の位置４５〜１６１）、ＥＤ（配列番号６の位置１０７〜１６４）、ＴＭドメイン（配列番号６の位置１６５〜１９２）、およびＣＤ（配列番号６の位置１９３〜２６４）が存在する。ＳＥＡドメインのＮ末端部からＥＤドメインを切断するＳＥＡドメイン内のタンパク質分解切断部位は、配列番号６の位置１０６〜１０７にある。この転写物変異体は、配列番号１１に示されるＶＮＴＲ領域を含有しない。配列番号６は、配列番号４に対して９９％の同一性であることから、異なる供給源に由来するＭＵＣ１配列間の高度の相同性が例示される。

他のヒトＭＵＣ１タンパク質をコードする他のヌクレオチド配列は、本明細書では、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１０１８０１７（ＧＩ：３２４１２０９５４）に対応する配列番号７により表される。配列番号７は、２５５アミノ酸のヒトＭＵＣ１タンパク質（転写物変異体３）をコードする。このアミノ酸配列は、本明細書では、配列番号８として表される（また、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１０１８０１７．１；ＧＩ：６７１８９０６９にも見いだされる）。配列番号８内には、次のドメイン、すなわち、シグナル配列（配列番号８の位置１〜２７）、ＳＥＡドメイン（配列番号８の位置３６〜１５２）、ＥＤ（配列番号８の位置９８〜１５５）、ＴＭドメイン（配列番号８の位置１５６〜１８３）、およびＣＤ（配列番号８の位置１８４〜２５５）が存在する。ＳＥＡドメインのＮ末端部からＥＤドメインを切断するＳＥＡドメイン内のタンパク質分解切断部位は、配列番号６の位置９７〜９８にある。この転写物変異体は、配列番号１１に示されるＶＮＴＲ領域を含有しない。

ヒトＭＵＣ１は、他の動物種のＭＵＣ１との高い相同性を有するので、配列の比較に基づいて、所与のＭＵＣ１タンパク質内のドメインを同定できると予想することが可能である。それに加えて、とくに、これらの配列が同一または実質的に相同である場合、およびこれら配列が、標的抗原（たとえば、腫瘍細胞により発現される天然のＭＵＣ１）に対して効果的免疫反応を誘発する場合、本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の調製で、他の動物種とくに哺乳動物種に由来するＭＵＣ１の特定の配列を利用することが可能である。たとえば、ネズミＭＵＣ１タンパク質は、本明細書では、配列番号９のアミノ酸配列により表される。配列番号９は、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＭ＿０１３６０５（ＧＩ：７３０５２９２）に対応する。配列番号９は、６３１アミノ酸のネズミＭＵＣ１タンパク質をコードする。このアミノ酸配列は、本明細書では、配列番号１０として表される（また、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＰ＿０３８６３３；ＧＩ：７３０５２９３にも見いだされる）。配列番号１０内には、次のドメイン、すなわち、シグナル配列（配列番号１０のほぼ位置１〜２０）、ＶＮＴＲ（配列番号１０の位置２１〜４２５内で同定可能）、ＳＥＡドメイン（配列番号１０の位置４２６〜５２８）、ＥＤ（配列番号１０の位置４７５〜５３６）、ＴＭドメイン（配列番号１０の位置５３１〜５５９）、およびＣＤ（配列番号１０の位置５６０〜６３１）が存在する。ＳＥＡドメインのＮ末端部からＥＤドメインを切断するＳＥＡドメイン内のタンパク質分解切断部位は、配列番号１０の位置４７４〜４７５にある。ドメイン内のＭＵＣ１配列の保存レベルを例示すると、配列番号１０のネズミＭＵＣ１ＳＥＡドメインは、配列番号１１のヒトＭＵＣ１ＳＥＡドメインに対して６２％の同一性および６８％の相同性、または陽性である（ＢＬＡＳＴにより定義される）。配列番号１０のネズミＭＵＣ１ＥＤは、配列番号１１のヒトＭＵＣ１ＥＤに対して５６％の同一性および７３％の相同性である。配列番号１０のネズミＭＵＣ１ＴＭドメインは、配列番号１１のヒトＭＵＣ１ＴＭドメインに対して８９％の同一性および９３％の相同性である。配列番号１０のネズミＭＵＣ１ＣＤは、配列番号１１のヒトＭＵＣ１ＣＤに対して８８％の同一性および８８％の相同性である。

ヒトＭＵＣ１は、本明細書に記載のヒトＭＵＣ１タンパク質およびＭＵＣ１抗原を含めて、種々のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを含有する。そのようなＴ細胞エピトープは、たとえば、米国特許第６，５４６，６４３号明細書、米国特許第７，１１８，７３８号明細書、米国特許第７，３４２，０９４号明細書、米国特許第７，６９６，３０６号明細書、および米国特許出願公開第２００８／００６３６５３号明細書に記載されている。

本発明の一実施形態では、ＭＵＣ１抗原は、ＭＵＣ１タンパク質の複数のドメインを含む融合タンパク質を含むかまたはそれらで構成される。一実施形態では、ＭＵＣ１抗原は、ＭＵＣ１−Ｃサブユニットの一部から誘導または設計される。一実施形態では、ＭＵＣ１抗原は、ＭＵＣ１−Ｎサブユニットの一部から誘導または設計される。一実施形態では、ＭＵＣ１抗原は、ＭＵＣ１−ＣおよびＭＵＣ１−Ｎサブユニットの両方の一部から誘導または設計される。

本発明の一実施形態では、本発明に係る酵母ベースの免疫療法用組成物に有用な融合タンパク質は、次のＭＵＣ１抗原の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つを含み、これらは、融合タンパク質内に任意の順序で配置され、かついずれも融合タンパク質内で２回以上反復されていてもよい（たとえば、２つ以上のＣＤセグメントの組合せ）：（１）ＭＵＣ１シグナル配列、（２）ＭＵＣ１ＳＥＡドメインの少なくとも一部および／またはＭＵＣ１細胞外ドメイン（ＥＤ）の少なくとも一部またはそれらの免疫原性ドメイン（一態様では、ＳＥＡドメイン由来の１つまたは複数のフランキングアミノ酸のフランキングに加えて、ＥＤのほとんどまたは全部を含んでいてもよい）、（３）少なくとも２つのＶＮＴＲドメイン、（４）少なくとも１つのＭＵＣ１膜貫通ドメインまたはその免疫原性ドメイン、および（５）少なくとも１つのＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）またはその免疫原性ドメイン。そのような融合タンパク質は、全長ＭＵＣ１タンパク質ではなく、かつそれを含まず（すなわち、完全ＭＵＣ１−Ｎサブユニットおよび完全ＭＵＣ１−Ｃサブユニットを含まない）、しかもそのような融合タンパク質は、全長ＭＵＣ１−Ｎサブユニットを含まない。一態様では、そのような融合タンパク質は、全長ＭＵＣ１−Ｃサブユニットを含まない。一態様では、融合タンパク質のセグメント（たとえば、免疫原性ドメインを含む、ＭＵＣ１タンパク質またはドメイン）は、それらが天然または野生型のＭＵＣ１タンパク質で生じるであろうセグメントの配置とは異なる順に配置される。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の融合タンパク質に有用なＭＵＣ１シグナル配列（またはリーダー配列）は、任意のＭＵＣ１タンパク質由来のシグナル配列であってもよく、一態様では、ヒトＭＵＣ１タンパク質由来である。本発明の一態様では、本発明に係る融合タンパク質で使用されるＭＵＣ１シグナル配列は、配列番号２の位置１〜２７、配列番号４の位置１〜３２、配列番号６の位置１〜３２、配列番号８の位置１〜２７、配列番号１１の位置１〜２３、配列番号１４の位置１〜３０、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、もしくは少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれらで構成されるアミノ酸配列を有する。ＭＵＣ１シグナル配列は、本発明の一態様では、本発明に有用な融合タンパク質のＮ末端に配置される。本発明の一態様では、ＭＵＣ１シグナル配列を置き換えて（代わりに）、本発明に係る融合タンパク質と併用される以下に記載のＮ末端合成ペプチドおよび酵母由来ペプチドの任意のものなどの非ＭＵＣ１配列が使用される。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の融合タンパク質に有用なＭＵＣ１ウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン（ＳＥＡ）ドメインは、任意のＭＵＣ１タンパク質由来の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＳＥＡドメインまたはその一部であってもよく、一態様では、ヒトＭＵＣ１タンパク質由来である。本発明の一態様では、本発明に係る融合タンパク質に有用なＭＵＣ１ＳＥＡドメインの一部は、少なくともＭＵＣ１の細胞外ドメイン（ＥＤ）由来のアミノ酸配列を含むが、ＥＤドメインの上流の配列を除外することが可能である。本発明の一態様では、本発明に係る融合タンパク質で使用されるＭＵＣ１ＳＥＡドメインは、配列番号２の位置５５〜１７０もしくは位置１１６〜１７０または少なくとも１つのそれらの免疫原性ドメイン、配列番号４の位置４５〜１６１もしくは位置１０７〜１６１または少なくとも１つのそれらの免疫原性ドメイン、配列番号６の位置４５〜１６１もしくは位置１０７〜１６１または少なくとも１つのそれらの免疫原性ドメイン、配列番号８の位置３６〜１５２もしくは位置９８〜１５２または少なくとも１つのそれらの免疫原性ドメイン、配列番号１１の位置１０３４〜１１５２もしくは位置１０９８〜１１５２または少なくとも１つのそれらの免疫原性ドメイン、配列番号１４の位置３１〜８６または少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１５の位置１〜５６または少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれらで構成されるアミノ酸配列を有する。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の融合タンパク質に有用なＭＵＣ１細胞外ドメイン（ＥＤ）は、任意のＭＵＣ１タンパク質由来の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＥＤまたはその一部であってもよく、一態様では、ヒトＭＵＣ１タンパク質由来である。本発明の一態様では、本発明に係る融合タンパク質で使用されるＭＵＣ１ＥＤは、配列番号２の位置１１６〜１７３もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号４の位置１０７〜１６４もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号６の位置１０７〜１６４もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号８の位置９８〜１５５もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１１の位置１０９８〜１１５５もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１４の位置３２〜８９もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１５の位置２〜５９もしくは少なくとも１つその免疫原性ドメイン、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれらで構成されるアミノ酸配列を有する。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の融合タンパク質に有用なＭＵＣ１単一可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）ドメインは、任意のＭＵＣ１タンパク質由来のＶＮＴＲドメインであってもよく、一態様では、ヒトＭＵＣ１タンパク質由来である。本発明の一態様では、本発明に係る融合タンパク質で使用されるＭＵＣ１ＶＮＴＲドメインは、配列番号１１の位置１２６〜１４５、配列番号１１の位置６１〜１０２０の任意の連続した２０個のアミノ酸、または配列番号１１の位置１２６〜９６５の任意の連続した２０個のアミノ酸、配列番号１２（以上に記載の配列番号１２内に多型のいずれかを含む）、配列番号１４の位置９０〜１３０の任意の連続した２０個のアミノ酸、配列番号１５の位置６０〜１００の任意の連続した２０個のアミノ酸、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応するＶＮＴＲ配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれらで構成されるアミノ酸配列を有する。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の融合タンパク質に有用なＭＵＣ１膜貫通（ＴＭ）ドメインは、任意のＭＵＣ１タンパク質由来の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＴＭドメインまたはその一部であってもよく、一態様では、ヒトＭＵＣ１タンパク質由来である。本発明の一態様では、本発明に係る融合タンパク質で使用されるＭＵＣ１ＴＭドメインは、配列番号２の位置１７４〜２０１もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号４の位置１６５〜１９２もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号６の位置１６５〜１９２もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号８の位置１５６〜１８３もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１１の位置１１５６〜１１８３もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１４の位置１３１〜１５８もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１５の位置１０１〜１２８もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれらで構成されるアミノ酸配列を有する。

以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の融合タンパク質に有用なＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）は、任意のＭＵＣ１タンパク質由来の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含むＣＤまたはその一部であってもよく、一態様では、ヒトＭＵＣ１タンパク質由来である。本発明の一態様では、本発明に係る融合タンパク質で使用されるＭＵＣ１ＣＤは、配列番号２の位置２０２〜２７３もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号４の位置１９３〜２６４もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号６の位置１９３〜２６４もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号８の位置１８４〜２５５もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１１の位置１１８４〜１２５５もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１４の位置１５９〜２３０もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１５の位置１２９〜２００もしくは少なくとも１つのその免疫原性ドメイン、配列番号１７の位置７〜７８もしくは位置７９〜１５０もしくは位置１５１〜２２２または少なくとも１つのそれらの免疫原性ドメイン、配列番号１８の位置１〜７２もしくは位置７３〜１４４もしくは位置１４５〜２１６またはそれらの免疫原性ドメイン、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれらで構成されるアミノ酸配列を有する。

本発明の一実施形態では、本発明に係る酵母ベースの免疫療法用組成物に有用な融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）ＭＵＣ１ＥＤのほとんどまたはすべてを含むＭＵＣ１ＳＥＡドメインおよびＭＵＣ１細胞外ドメイン（ＥＤ）の一部、（２）少なくとも２つのＶＮＴＲドメイン、（３）ＭＵＣ１膜貫通ドメイン、および（４）ＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）ＭＵＣ１シグナル配列、（２）ＭＵＣ１ＥＤのほとんどまたはすべてを含むＭＵＣ１ＳＥＡドメインおよびＭＵＣ１細胞外ドメイン（ＥＤ）の一部、（３）少なくとも２つのＶＮＴＲドメイン、（４）ＭＵＣ１膜貫通ドメイン、および（５）ＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）。本発明に係る融合タンパク質に組み込まれる追加または代替のエレメントとしては、融合タンパク質の発現もしくは安定性を改良もしくは支援する、かつ／またはその同定および／もしくは精製を可能にする、Ｎ末端および／またはＣ末端ペプチド、ならびに／あるいはクローニングを容易にする制限酵素部位を導入するために、宿主ファゴソームプロテアーゼの切断部位として、タンパク質または抗原のプロセシングを加速するために、および構築物の将来的操作のために、有用でありうる、融合タンパク質のセグメント間の短い介在リンカー配列（たとえば、１、２、３、４、または５アミノ酸のペプチド）が挙げられうる。そのようなエレメントは、以下に詳細に記載される。

本発明に係る酵母ベースの免疫療法用組成物に有用なそのような融合タンパク質の一例は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：
（１）野生型タンパク質中でＥＤの上流に存在するＳＥＡドメインの非ＥＤ部分由来の１、２、３、４、５個、もしくはそれ以上のフランキングアミノ酸がＮ末端に追加されていてもよいＭＵＣ１細胞外ドメイン（ＥＤ）、ただし、このＥＤセグメントは、配列番号２の位置１１６〜１７３、または配列番号４の位置１０７〜１６４、配列番号６の位置１０７〜１６４、配列番号８の位置９８〜１５５、配列番号１１の位置１０９８〜１１５５、配列番号１４の位置３２〜８９、配列番号１５の位置２〜５９、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成され、
（２）少なくとも２つのＶＮＴＲドメイン、ただし、このＶＮＴＲドメインのそれぞれは、配列番号１１の位置１２６〜１４５、配列番号１１の位置６１〜１０２０の任意の連続した２０個のアミノ酸、または配列番号１１の位置１２６〜９６５の任意の連続した２０個のアミノ酸、配列番号１２（以上に記載のように配列番号１２内に多型のいずれかを含む）、配列番号１４の位置９０〜１３０の任意の連続した２０個のアミノ酸、配列番号１５の位置６０〜１００の任意の連続した２０個のアミノ酸、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応するＶＮＴＲ配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成され、
（３）ＭＵＣ１膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ただし、このＴＭドメインは、配列番号２の位置１７４〜２０１、配列番号４の位置１６５〜１９２、配列番号６の位置１６５〜１９２、配列番号８の位置１５６〜１８３、配列番号１１の位置１１５６〜１１８３、配列番号１４の位置１３１〜１５８、配列番号１５の位置１０１〜１２８、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成され、および
（４）ＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）、ただし、このＣＤは、配列番号２の位置２０２〜２７３、配列番号４の位置１９３〜２６４、配列番号６の位置１９３〜２６４、配列番号８の位置１８４〜２５５、配列番号１１の位置１１８４〜１２５５、配列番号１４の位置１５９〜２３０、配列番号１５の位置１２９〜２００、配列番号１７の位置７〜７８もしくは位置７９〜１５０もしくは位置１５１〜２２２、配列番号１８の位置１〜７２もしくは位置７３〜１４４もしくは位置１４５〜２１６、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成される。

この実施形態の一態様では、本発明に係る酵母ベースの免疫療法用組成物に有用な融合タンパク質は、配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成される。配列番号１４は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）ＭＵＣ１シグナル配列（配列番号１４の位置１〜３０）、（２）ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤセグメント（配列番号１４の位置３１〜８９）、（３）２つのＶＮＴＲドメインを含むＶＮＴＲセグメント（配列番号１４の位置９０〜１３０）、（４）ＭＵＣ１ＴＭドメイン（配列番号１４の位置１３１〜１５８）、（５）ＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１４の位置１５９〜２３０）、および（６）ヘキサペプチドヒスチジンタグ（配列番号１４の位置２３１〜２３６）。配列番号１４は、配列番号１３により表されるヌクレオチド配列によりコードされる。配列番号１５は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤセグメント（配列番号１５の位置１〜５９）、（２）２つのＶＮＴＲドメインを含むＶＮＴＲセグメント（配列番号１５の位置６０〜１００）、（３）ＭＵＣ１ＴＭドメイン（配列番号１５の位置１０１〜１２８）、および（４）ＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１５の位置１２９〜２００）。任意選択で、配列番号１４または配列番号１５の融合タンパク質は、プロテアソーム分解に対する耐性を付与するようにかつ配列番号２１により表される発現を安定化するように設計された合成Ｎ末端ペプチドであるＮ末端ペプチド、または配列番号１９や配列番号２０などの酵母αリーダー配列由来のＮ末端ペプチド、または本明細書に記載の酵母ベースの免疫療法剤と併用するのに好適な他のＮ末端ペプチドを含む。同様に任意選択で、１、２、３またはそれを上回る数のアミノ酸の１つまたは複数のリンカーペプチド、たとえば、Ｔｈｒ−Ｓｅｒの２アミノ酸のリンカーを、融合タンパク質のセグメント間に挿入することが可能である。融合タンパク質のＣ末端のヘキサヒスチジンタグもまた、任意選択である。

本発明の一実施形態では、本発明に係る酵母ベースの免疫療法用組成物に有用な融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）少なくとも２つのＶＮＴＲドメイン、および（２）ＭＵＣ１ＥＤのほとんどまたはすべてを含むＭＵＣ１ＳＥＡドメインおよびＭＵＣ１細胞外ドメイン（ＥＤ）の一部。そのような融合タンパク質は、ＶＮＴＲドメインにフランキングするＭＵＣ１−Ｎ領域の追加部分を含みうる。そのような融合タンパク質は、全ＭＵＣ１−Ｎサブユニットを含むものではない。

本発明の他の実施形態では、本発明に係る酵母ベースの免疫療法用組成物に有用な融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）第１のＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）、（２）第２のＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）、および（３）第３のＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）。一実施形態では、そのような融合タンパク質に追加のＭＵＣ１細胞質内ドメインを組み込むことが可能である。一実施形態では、ＭＵＣ１ＣＤの少なくとも１つは、他のＭＵＣ１ＣＤの１つと異なる起源に由来する（たとえば、１つのＭＵＣ１ＣＤは、第１のヒトＭＵＣ１タンパク質に由来し、１つのＭＵＣ１ＣＤは、第２のＭＵＣ１タンパク質に由来し、第１および第２のＭＵＣ１ＣＤ間に配列差が存在しうる。一実施形態では、この融合タンパク質は、Ｎ末端にＭＵＣ１シグナル配列が追加される。他の実施形態では、この融合タンパク質は、融合タンパク質の発現もしくは安定性を改良もしくは支援する、かつ／またはその同定および／もしくは精製を可能にする、Ｎ末端および／またはＣ末端ペプチド、ならびに／あるいはクローニングを容易にする制限酵素部位を導入するために、宿主ファゴソームプロテアーゼの切断部位として、タンパク質または抗原のプロセシングを加速するために、および構築物の将来的操作のために、有用でありうる、融合タンパク質のセグメント間の短い介在リンカー配列（たとえば、１、２、３、４、または５アミノ酸のペプチド）を含みうる。

本発明に係る酵母ベースの免疫療法用組成物に有用なそのような融合タンパク質の例は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：
（１）第１のＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）、ただし、このＣＤは、配列番号２の位置２０２〜２７３、配列番号４の位置１９３〜２６４、配列番号６の位置１９３〜２６４、配列番号８の位置１８４〜２５５、配列番号１１の位置１１８４〜１２５５、配列番号１４の位置１５９〜２３０、配列番号１５の位置１２９〜２００、配列番号１７の位置７〜７８もしくは位置７９〜１５０もしくは位置１５１〜２２２、配列番号１８の位置１〜７２もしくは位置７３〜１４４もしくは位置１４５〜２１６、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成され、
（２）第２のＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）、ただし、このＣＤは、配列番号２の位置２０２〜２７３、配列番号４の位置１９３〜２６４、配列番号６の位置１９３〜２６４、配列番号８の位置１８４〜２５５、配列番号１１の位置１１８４〜１２５５、配列番号１４の位置１５９〜２３０、配列番号１５の位置１２９〜２００、配列番号１７の位置７〜７８もしくは位置７９〜１５０もしくは位置１５１〜２２２、配列番号１８の位置１〜７２もしくは位置７３〜１４４もしくは位置１４５〜２１６、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成され、
（３）第３のＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）、ただし、このＣＤは、配列番号２の位置２０２〜２７３、配列番号４の位置１９３〜２６４、配列番号６の位置１９３〜２６４、配列番号８の位置１８４〜２５５、配列番号１１の位置１１８４〜１２５５、配列番号１４の位置１５９〜２３０、配列番号１５の位置１２９〜２００、配列番号１７の位置７〜７８もしくは位置７９〜１５０もしくは位置１５１〜２２２、配列番号１８の位置１〜７２もしくは位置７３〜１４４もしくは位置１４５〜２１６、他のヒトＭＵＣ１タンパク質などの異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成される。

この実施形態の一態様では、本発明に係る酵母ベースの免疫療法用組成物に有用な融合タンパク質は、配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成される。配列番号１７は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）配列番号２１により表される合成ペプチド（配列番号１７の位置１〜６）、（２）第１のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１７の位置７〜７８）、（３）第２のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１７の位置７９〜１５０）、（４）第３のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１７の位置１５１〜２２２）、および（５）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１７の位置２２３〜２２８）。配列番号１７は、配列番号１６により表されるヌクレオチド配列によりコードされる。配列番号１８は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）第１のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１８の位置１〜７２）、（２）第２のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１８の位置７３〜１４４）、（３）第３のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１８の位置１４５〜２１６）。任意選択で、配列番号１７または配列番号１８の融合タンパク質は、プロテアソーム分解に対する耐性を付与するようにかつ配列番号２１により表される発現を安定化するように設計された合成Ｎ末端ペプチドであるＮ末端ペプチド、または配列番号１９や配列番号２０などの酵母αリーダー配列由来のＮ末端ペプチド、または本明細書に記載の酵母ベースの免疫療法剤と併用するのに好適な他のＮ末端ペプチドを含む。同様に任意選択で、１、２、３またはそれを超える数のアミノ酸の１〜３つまたはそれを上回る数のアミノ酸リンカー配列の１つまたは複数のリンカーペプチド、たとえば、Ｔｈｒ−Ｓｅｒの２アミノ酸のリンカーを、融合タンパク質のセグメント間に挿入することが可能である。融合タンパク質のＣ末端のヘキサヒスチジンタグもまた、任意選択である。

本発明に有用なＭＵＣ１抗原はまた、タンパク質の全長にわたり、またはタンパク質の一部を形成するその規定された断片もしくはドメイン（たとえば、免疫学的ドメインまたは機能性ドメイン（少なくとも１つの生物学的活性を有するドメイン））に関して、本明細書に記載のＭＵＣ１タンパク質、ドメイン、融合タンパク質、または抗原のいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性であるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。たとえば、本明細書に記載のＭＵＣ１タンパク質のドメインは、シグナル配列、ＶＮＴＲドメイン、ＳＥＡドメイン、細胞外ドメイン（ＥＤ）、ＴＭドメイン、および／または細胞質内ドメイン（ＣＤ）を含む。免疫学的ドメインは、以上で詳細に記載されている。本明細書に記載のＭＵＣ１融合タンパク質は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１８により表されるものを含む。したがって、本発明に係る酵母ベースの免疫療法剤に有用なＭＵＣ１抗原は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１８のいずれか１つ、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１８のいずれか１つに対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性であるアミノ酸配列、および／または異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列（たとえば、本明細書に提示された配列と比較してわずかな配列差が存在しうるように、融合セグメントの１つまたは複数が、異なるＭＵＣ１タンパク質の対応する配列に由来する、またはＭＵＣ１タンパク質アゴニスト配列由来する、融合タンパク質）を含むまたはそれらで構成されるＭＵＣ１抗原を含む。

本明細書に例示された以外の配列または供給源、特定的には同一動物種内の配列または供給源から誘導または取得されるＭＵＣ１タンパク質またはドメインのいずれかの対応する部分を使用して、本明細書に記載の融合タンパク質と類似または同一の全体構造を有する融合タンパク質を形成するのは、簡単である。例として、単純な配列アライメントツールまたはプロセスを用いて、任意の供給源由来の所与のヒトＭＵＣ１タンパク質中で、配列番号１１の位置１０３４〜１１５２に対応する対応配列を容易に同定することが可能である。したがって、本明細書に例示された配列とのわずかなおよび／または少しの差を有する配列は、本発明に明示的に包含される。

本発明のいくつかの態様では、得られるＭＵＣ１タンパク質が、本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物中で抗原として使用した時に野生型または参照のＭＵＣ１タンパク質として天然のＭＵＣ１タンパク質に対する免疫反応を誘発するのであれば、野生型または参照のＭＵＣ１タンパク質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、またはそれを超える数のアミノ酸に対して、アミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を行うことが可能である。この免疫反応は、増強された免疫反応、低減された免疫反応、または実質的に類似の免疫反応を含みうる。たとえば、本発明は、ＭＨＣ分子に対する、またはＭＨＣ提示との関連でエピトープを認識するＴ細胞受容体に対する、エピトープの結合性または親和性を向上させることなどにより、ＭＵＣ１アゴニストに対するＴ細胞反応を促進するように突然変異された１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含みうるＭＵＣ１アゴニスト抗原の使用を包含する。したがって、ＭＵＣ１アゴニストは、腫瘍細胞により発現される天然のＭＵＣ１に対するＴ細胞反応の効力または効率を向上させうる。アゴニストエピトープをはじめとするさまざまなＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープは、米国特許第６，５４６，６４３号明細書、米国特許第７，１１８，７３８号明細書、米国特許第７，３４２，０９４号明細書、米国特許第７，６９６，３０６号明細書、および米国特許出願公開第２００８／００６３６５３号明細書に記載されており、本明細書に記載の配列内で１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を行うなどにより、発表されたエピトープ配列にその位置で配列を整合させるように、これらのエピトープのいずれか１つまたは複数を本発明に係るＭＵＣ１抗原で使用することが可能である。

ＭＵＣ１アゴニスト抗原の例は、本明細書に提供されている（実施例３および４参照）。一実施形態では、本発明で使用するのに好適なＭＵＣ１アゴニスト抗原は、次の置換、すなわち、Ｔ９３、Ａ１６１、Ｐ１６２、Ｇ１６９、Ｓ１７０、Ｔ１７１、Ａ３９２、Ｃ４０６、Ｔ４４４、Ｄ４４５、またはＳ４６０のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または１１個すべてを含む。ただし、置換の位置は、受託番号ＮＰ＿００１１９１２１４により表される野生型ＭＵＣ１を基準にして提供される（ただし、同一または等価な位置は、任意の他の野生型ＭＵＣ１配列で容易に同定可能である）。一実施形態では、本発明に係る酵母ベースの免疫療法用組成物に有用なＭＵＣ１アゴニスト抗原は、配列番号２３または配列番号２５のアミノ酸配列を含むかまたはそれらで構成される。配列番号２３は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）ＭＵＣ１シグナル配列（配列番号２３の位置１〜３０）、（２）ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤセグメント（配列番号２３の位置３１〜８９）、（３）２つのＶＮＴＲドメインを含むＶＮＴＲセグメント（配列番号２３の位置９０〜１３０）、（４）ＭＵＣ１ＴＭドメイン（配列番号２３の位置１３１〜１５８）、（５）ＭＵＣ１ＣＤ（配列番号２３の位置１５９〜２３０）、（６）ＭＵＣ１アゴニストエピトープ（配列番号２３の位置２３１〜２４６）、および（７）ヘキサペプチドヒスチジンタグ（配列番号２３の位置２４７〜２５２）。配列番号２３は、配列番号２２により表されるヌクレオチド配列によりコードされる（酵母発現用にコドン最適化）。ＭＵＣ１シグナル配列（配列番号２３の位置１〜３０）は、プロテアソーム分解に対する耐性を付与するようにおよび／または発現を安定化させるように設計されたさまざまなＮ末端配列、たとえば、配列番号２１により表されるペプチドまたは配列番号１９や配列番号２０などの酵母αリーダー配列由来のＮ末端ペプチドで置換可能である。ヘキサヒスチジンＣ末端タグは、任意選択であり、タンパク質の同定および／または精製を容易にする。配列番号１４または配列番号１５のＭＵＣ１抗原と比較して、配列番号２３は、さまざまなアゴニストエピトープを形成するように次のアミノ酸置換を含有する（置換位置は、配列番号２３を基準にして、さらには受託番号ＮＰ＿００１１９１２１４により表される野生型ＭＵＣ１の置換位置を基準にして、与えられる）：Ａ９６Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置１６１）、Ｐ９７Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置１６２）、Ｇ１０４Ｖ（野生型ＭＵＣ１の位置１６９）、Ｓ１０５Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置１７０）、Ｔ１０６Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置１７１）、Ａ１４７Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置３９２）、Ｃ１６１Ｖ（野生型ＭＵＣ１の位置４０６）、Ｔ１９９Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置４４４）、Ｄ２００Ｆ（野生型ＭＵＣ１の位置４４５）、Ｓ２１５Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置４６０）、およびＴ２３９Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置９３）。

配列番号２５は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）配列番号１９により本明細書の他の箇所で開示されたα因子リーダー配列（配列番号２５の位置１〜８９）、（２）Ｔｈｒ−Ｓｅｒのリンカー配列（配列番号２５の位置９０〜９１）、（３）１１個のアゴニストエピトープの導入を除けば野生型タンパク質に対応する全長ＭＵＣ１アゴニストタンパク質（配列番号２５の位置９２〜５６６）、および（７）ヘキサペプチドヒスチジンタグ（配列番号２５の位置５６７〜５７２）。配列番号２５は、配列番号２４により表されるヌクレオチド配列によりコードされる（酵母発現用にコドン最適化）。αリーダー配列（配列番号２５の位置１〜８９）は、プロテアソーム分解に対する耐性を付与するようにおよび／または発現を安定化させるように設計されたさまざまなＮ末端配列、たとえば、配列番号２１により表されるペプチド、または配列番号２０などのさまざまな酵母αリーダー配列由来のＮ末端ペプチド、またはＭＵＣ１シグナル配列で置換可能である。ヘキサヒスチジンＣ末端タグは、任意選択であり、タンパク質の同定および／または精製を容易にする。テンプレートとして使用される野生型ＭＵＣ１タンパク質と比較して、ＧＩ−６１０６の配列は、さまざまなアゴニストエピトープを形成するように次のアミノ酸置換を含有する（置換位置は、配列番号２５を基準にして、さらには受託番号ＮＰ＿００１１９１２１４により表される野生型ＭＵＣ１の置換位置を基準にして、与えられる）：Ｔ１８４Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置９３）、Ａ２３２Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置１６１）、Ｐ２３３Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置１６２）、Ｇ２４０Ｖ（野生型ＭＵＣ１の位置１６９）、Ｓ２４１Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置１７０）、Ｔ２４２Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置１７１）、Ａ４８３Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置３９２）、Ｃ４９７Ｖ（野生型ＭＵＣ１の位置４０６）、Ｔ５３５Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置４４４）、Ｄ５３６Ｆ（野生型ＭＵＣ１の位置４４５）、およびＳ５５１Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置４６０）。

したがって、本発明に係る酵母ベースの免疫療法剤に有用なＭＵＣ１アゴニスト抗原は、配列番号２３もしくは配列番号２５またはこれらのより大きい融合タンパク質内のＭＵＣ１特異的配列、または配列番号２３、配列番号２５、およびこれらのより大きい融合タンパク質内のＭＵＣ１特異的配列のいずれか１つに対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性であるアミノ酸配列、および／または異なるＭＵＣ１タンパク質由来の対応する配列（たとえば、本明細書に提示された配列と比較してわずかな配列差が存在しうるように、融合セグメントの１つまたは複数が、異なるＭＵＣ１タンパク質の対応する配列に由来する、融合タンパク質）を含むかまたはそれで構成されるＭＵＣ１抗原を含む。

以上で考察したように、Ｎ末端発現配列およびＣ末端タグ、たとえば、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２３、または配列番号２５の融合タンパク質に対して以上に記載したものは、任意選択であるが、発現、安定性を改良もしくは支援するために、および／またはタンパク質の同定および／もしくは精製を可能にするために、本明細書の他の箇所に記載されるいくつかの異なる配列から選択されうる。また、酵母で使用するのに好適な多種多様なプロモーターは、当技術分野で公知である。さらに、短い介在リンカー配列（たとえば、１、２、３、４、または５アミノ酸のペプチド）は、さまざまな理由で、たとえば、クローニングを容易にする制限酵素部位を導入するために、宿主ファゴソームプロテアーゼ用の切断部位として、タンパク質または抗原のプロセシングを加速するために、および構築物の将来的操作のために、ＭＵＣ１抗原を含む融合タンパク質の一部間に導入可能である。

任意選択で、本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の成分として使用されるタンパク質は、融合タンパク質を含めて、酵母中で異種抗原の発現の改良または安定化を行うのにとくに有用な抗原構築物を用いて、作製される。一実施形態では、所望の抗原タンパク質またはペプチドは、それらのアミノ末端で、（ａ）酵母媒体中で融合タンパク質の発現を安定化させるか、または発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を防止する、特異的合成ペプチド（そのようなペプチドは、たとえば、２００４年８月１２日公開の米国特許出願公開第２００４／０１５６８５８Ａ１号明細書に詳細に記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、（ｂ）融合パートナーが、酵母中でタンパク質の発現の安定性改良を提供する、かつ／または酵母細胞によるタンパク質の翻訳後修飾を防止する、内因性酵母タンパク質の少なくとも一部（そのようなタンパク質は、たとえば、前掲の米国特許出願公開第２００４／０１５６８５８Ａ１号明細書に詳細に記載されている）、および／または（ｃ）酵母の表面上に融合タンパク質を発現させる酵母タンパク質の少なくとも一部（たとえば、より詳細に本明細書に記載されるＡｇａタンパク質）に融合される。それに加えて、本発明は、任意選択で、特定的にはタンパク質の選択および同定に使用するための、抗原コード構築物のＣ末端に融合されたペプチドの使用を包含する。そのようなペプチドとしては、任意の合成または天然のペプチド、たとえば、ペプチドタグ（たとえば、６×Ｈｉｓもしくはヘキサペプチド）または任意の他の短いエピトープタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に係る抗原のＣ末端に結合されるペプチドは、以上で考察されたＮ末端ペプチドの付加を併用してまたは併用せずに使用可能であり、その逆も同様である。

一実施形態では、酵母中で融合タンパク質を発現させるのに有用な合成ペプチドは、抗原のＮ末端に結合され、このペプチドは、抗原に対して異種である少なくとも２つのアミノ酸位置で構成され、このペプチドは、酵母媒体中で融合タンパク質の発現を安定化させるか、または発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を防止する。抗原の合成ペプチドおよびＮ末端部は、一緒になって、次の要件を有する融合タンパク質を形成する：（１）融合タンパク質の位置１のアミノ酸残基は、メチオニンであり（すなわち、合成ペプチド中の最初のアミノ酸は、メチオニンである）、（２）融合タンパク質の位置２のアミノ酸残基は、グリシンでもプロリンでもなく（すなわち、合成ペプチド中の第２のアミノ酸は、グリシンでもプロリンでもない）、（３）融合タンパク質の位置２〜６のアミノ酸位置は、メチオニンではなく（すなわち、位置２〜６のアミノ酸は、合成ペプチドまたはタンパク質の一部であるかにかかわらず、合成ペプチドが６アミノ酸よりも短くても、メチオニンを含まない）、および（４）融合タンパク質の位置２〜６のアミノ酸は、リシンでもアルギニンでもない（すなわち、位置２〜６のアミノ酸は、合成ペプチドまたはタンパク質の一部であるかにかかわらず、合成ペプチドが５アミノ酸よりも短くても、リシンもアルギニンも含まない）。合成ペプチドは、２アミノ酸程度に短いものでありうるが、一態様では、２〜６アミノ酸であり（３、４、５アミノ酸を含む）、整数で６アミノ酸超、約２００アミノ酸、３００アミノ酸、４００アミノ酸、５００アミノ酸まで、またはそれを超える数のアミノ酸でありうる。

一実施形態では、融合タンパク質は、Ｍ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６のアミノ酸配列を含む。ここで、Ｍは、メチオニンであり、Ｘ２は、グリシン、プロリン、リシン、またはアルギニンを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３は、メチオニン、リシン、またはアルギニンを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ４は、メチオニン、リシン、またはアルギニンを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ５は、メチオニン、リシン、またはアルギニンを除く任意のアミノ酸であり、かつＸ６は、メチオニン、リシン、またはアルギニンを除く任意のアミノ酸である。一実施形態では、Ｘ６残基は、プロリンである。酵母細胞中で抗原の発現の安定性を促進するおよび／または酵母中でタンパク質の翻訳後修飾を防止する例示的な合成配列は、配列Ｍ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｐを含む（本明細書では配列番号２１により表される）。発現産物の安定性の向上に加えて、この融合パートナーは、構築物中で免疫抗原に対する免疫反応に悪影響を及ぼさないように思われる。それに加えて、合成融合ペプチドは、抗体などの選択剤により認識可能なエピトープを提供するように設計可能である。

一実施形態では、ＭＵＣ１抗原は、α因子プレプロ配列（α因子シグナルリーダー配列としても参照され、そのアミノ酸配列は、本明細書では、配列番号１９または配列番号２０により例示される）などの酵母タンパク質にＮ末端で連結される。酵母α因子プレプロ配列の他の配列は、当技術分野で公知であり、本発明での使用に包含される。

本発明の一態様では、発現タンパク質産物の送達または移行により、抗原が、部分的にまたは全体的に、酵母媒体の表面上に発現または提供されるように、酵母媒体が操作される（細胞外発現）。本発明のこの態様を達成するための一方法は、酵母媒体の表面に１つまたは複数のタンパク質を配置するためのスペーサアームを使用することである。たとえば、スペーサアームを用いて、対象の抗原または他のタンパク質と、対象の抗原または他のタンパク質を標的とするタンパク質と、の融合タンパク質を酵母細胞壁に形成することが可能である。たとえば、他のタンパク質を標的とするように使用可能なそのようなタンパク質の１つは、抗原または他のタンパク質が酵母の表面上に位置するように、抗原または他のタンパク質が酵母細胞壁を標的とすることができるようにする酵母タンパク質（たとえば、細胞壁タンパク質２（ｃｗｐ２）、Ａｇａ２、Ｐｉｒ４、またはＦｌｏ１タンパク質）である。酵母タンパク質以外のタンパク質をスペーサアームに使用してもよいが、いかなるスペーサアームタンパク質でも、スペーサアームタンパク質にではなく標的抗原に対して免疫原性反応を有することが最も望ましい。したがって、他のタンパク質をスペーサアームに使用する場合、使用されるスペーサアームタンパク質は、標的抗原に対する免疫反応が制圧されるようにスペーサアームタンパク質自体に対する大きい免疫反応を引き起こしてはならない。当業者は、標的抗原に対する免疫反応と対比してスペーサアームタンパク質に対する免疫反応が小さくなるように目標設定すべきである。スペーサアームは、所望により、酵母から抗原を容易に除去またはプロセシングさせる切断部位（たとえば、プロテアーゼ切断部位）を有するように構築可能である。免疫反応の大きさを決定する任意の公知の方法を使用することが可能であり（たとえば、抗体産生アッセイ、細胞溶解アッセイなど）、当業者であれば容易にわかる。

標的抗原または他のタンパク質を酵母表面上に露出させるように配置する他の方法は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ：ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）などのシグナル配列を用いて標的を酵母細胞壁に固定することである。他の選択肢として、細胞壁に結合されるタンパク質（たとえばｃｗｐ）に抗原が結合するように、対象の抗原または他のタンパク質を小胞体（ＥＲ）中への移行を介する分泌経路にターゲッティングとするシグナル配列を追加することにより、配置を達成することが可能である。

一態様では、スペーサアームタンパク質は、酵母タンパク質である。酵母タンパク質は、約２〜約８００アミノ酸の酵母タンパク質で構成されうる。一実施形態では、酵母タンパク質は、約１０〜７００アミノ酸である。他の実施形態では、酵母タンパク質は、約４０〜６００アミノ酸である。本発明の他の実施形態は、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４５０アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも５５０アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、または少なくとも６５０アミノ酸の酵母タンパク質を含む。一実施形態では、酵母タンパク質は、少なくとも４５０アミノ酸長である。抗原表面発現の最適化に関する他の考慮点は、望まれるのであれば、抗原とスペーサアームとの組合せが、単量体としてまたは二量体としてまたは三量体としてまたはさらに多くの単位が結合一体化されて発現されるべきかどうかである。単量体、二量体、三量体などのこの使用により、抗原の適切なスペーシングまたはフォールディングを可能になるので、抗原のすべてではないにしても一部は、より免疫原性になるように酵母媒体の表面上に提示される。

酵母タンパク質の使用により、酵母媒体中での融合タンパク質の発現の安定化、発現された融合タンパク質の翻訳後修飾の防止、および／または酵母中の特定の区画への融合タンパク質の標的化（たとえば、酵母細胞表面上での発現）が可能になる。酵母分泌経路中への送達のために使用する例示的な酵母タンパク質としては、Ａｇａ（限定されるものではないが、Ａｇａ１および／またはＡｇａ２）、ＳＵＣ２（酵母インベルターゼ）、α因子シグナルリーダー配列、ＣＰＹ、細胞壁中への局在化および保持のためのＣｗｐ２ｐ、娘細胞形成初期の酵母細胞芽への局在化のためのＢＵＤ遺伝子、Ｆｌｏ１ｐ、Ｐｉｒ２ｐ、およびＰｉｒ４ｐが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

他の配列を用いて、酵母媒体の他の部分、たとえば、サイトゾルまたはミトコンドリアまたは小胞体または核に対して、タンパク質の標的化、維持、および／または安定化を行うことが可能である。以上の実施形態のいずれかに使用可能な好適な酵母タンパク質の例としては、ＴＫ、ＡＦ、ＳＥＣ７、グルコースの抑制的発現およびサイトゾル局在化のためのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼＰＣＫ１、ホスホグリセロキナーゼＰＧＫ、およびトリオースリン酸イソメラーゼＴＰＩ遺伝子産物、熱処理への細胞の暴露による発現が誘導されるおよびタンパク質の熱安定性がより高い熱ショックタンパク質ＳＳＡ１、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ミトコンドリア中への移入のためのミトコンドリアタンパク質ＣＹＣ１、ＡＣＴ１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

酵母ベースの免疫療法組成物を作製するための、酵母媒体の作製方法および発現方法、酵母媒体と、抗原および／または他のタンパク質および／または対象の作用剤と、の組合せ方法および／または会合方法は、本発明の対象である。

本発明によれば、「酵母媒体−抗原複合体」または「酵母−抗原複合体」という用語は、酵母媒体と抗原との任意の会合を記述するために総称的に用いられ、そのような組成物が以上に記載したように免疫反応を誘発するために使用される場合、「酵母ベースの免疫療法組成物」と同義的に用いられうる。そのような会合は、酵母による抗原の発現（組換え酵母）、酵母中への抗原の導入、酵母への抗原の物理結合、および緩衝液中または他の溶液中または製剤中などでの酵母と抗原との混合一体化を含む。これらのタイプの複合体は、以下に詳細に記載される。

一実施形態では、酵母媒体の調製に使用される酵母細胞は、タンパク質が酵母細胞により発現されるように、タンパク質（たとえば、抗原）をコードする異種核酸分子でトランスフェクトされる。そのような酵母もまた、本明細書では、組換え酵母または組換え酵母媒体として参照される。次いで、酵母細胞は、薬学的に許容可能な賦形剤を用いて製剤化し、患者に直接投与、後で投与するために貯蔵、または無傷細胞として樹状細胞中に充填することが可能である。酵母細胞はまた、死滅させることが可能であり、または酵母のスフェロプラスト、細胞質体、ゴースト、もしくは細胞レベル下の粒子を形成することなどにより、誘導体化することが可能であり、これらはいずれも、続いて、貯蔵、投与、または樹状細胞中への誘導体の充填に供しうる。また、抗原を発現する組換えスフェロプラストを作製するために、酵母スフェロプラストに組換え核酸分子を直接トランスフェクトすることが可能である（たとえば、スフェロプラストを酵母菌体から作製し、次いで、トランスフェクトする）。抗原を組換え発現する酵母細胞または酵母スフェロプラストを用いて、酵母細胞質体、酵母ゴースト、または酵母細胞膜粒子もしくは酵母細胞壁粒子を含む酵母媒体、あるいはそれらの一部を作製しうる。

一般的には、酵母媒体および抗原および／または他の作用剤は、本明細書に記載の任意の技術により、会合可能である。一態様では、酵母媒体に抗原および／または作用剤を細胞内充填した。他の態様では、抗原および／または作用剤を酵母媒体に共有結合または非共有結合により結合させた。さらに他の態様では、酵母媒体および抗原および／または作用剤を混合により会合させた。他の態様の一実施形態では、酵母媒体により、または酵母媒体が誘導された酵母細胞もしくは酵母スフェロプラストにより、抗原および／または作用剤を組換え発現させる。

本発明に係る酵母媒体により産生されるいくつかの抗原および／または他のタンパク質は、酵母媒体により適正に作製可能な、かつ典型的には、約２〜約６つの抗原およびまたは他のタンパク質を含めて少なくとも１つ〜少なくとも約６つ以上の範囲内の、任意の数の抗原および／または他のタンパク質である。

本発明に係る酵母媒体中での抗原または他のタンパク質の発現は、当業者に公知の技術を用いて達成される。簡潔に述べると、宿主酵母細胞にトランスフォームした時に核酸分子の構成発現または調節発現のいずれかを引き起こすことができるようにするために、核酸分子が転写制御配列に機能的に結合されるように、少なくとも１つの所望の抗原または他のタンパク質をコードする核酸分子を発現ベクター中に挿入する。１つまたは複数の抗原および／または他のタンパク質をコードする核酸分子は、１つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結された１つまたは複数の発現ベクター上に存在可能である。とくに重要な発現制御配列は、プロモーターや上流活性化配列などのように転写開始を制御するものである。任意の好適な酵母プロモーターを本発明に使用されることが可能であり、さまざまなそのようなプロモーターが当業者に公知である。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現用のプロモーターとしては、次の酵母タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない：アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｉ（ＡＤＨ１：ａｌｃｏｈｏｌ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１）またはＩＩ（ＡＤＨ２）、ＣＵＰ１、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ：ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅｋｉｎａｓｅ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ：ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、翻訳伸長因子ＥＦ−１α（ＴＥＦ２：ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼに対してＴＤＨ３としても参照される）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１：ｇａｌａｃｔｏｋｉｎａｓｅ）、ガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ（ＧＡＬ７）、ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、シトクロムｃ１（ＣＹＣ１）、Ｓｅｃ７タンパク質（ＳＥＣ７）、および酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）（ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨやＣＹＣ１／ＧＡＬ１０プロモーターなどのハイブリッドプロモーターおよび細胞内のグルコース濃度が低い場合（たとえば、約０．１〜約０．２パーセント）に誘導されるＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターを含む）、さらにはＣＵＰ１プロモーターおよびＴＥＦ２プロモーター。同様に、エンハンサーとしても参照されるいくつかの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、公知である。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現用の上流の活性化配列としては、次のタンパク質をコードする遺伝子のＵＡＳが挙げられるが、これらに限定されるものではない：ＰＣＫ１、ＴＰＩ、ＴＤＨ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＳＵＣ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０、さらにはＧＡＬ４遺伝子産物により活性化される他のＵＡＳ（一態様では、ＡＤＨ２ＵＡＳが使用される）。ＡＤＨ２ＵＡＳはＡＤＲ１遺伝子産物により活性化されるので、異種遺伝子がＡＤＨ２ＵＡＳに機能的に連結される場合、ＡＤＲ１遺伝子を過剰発現させることが好ましいこともある。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現用の転写終止配列としては、α因子、ＧＡＰＤＨ、およびＣＹＣ１遺伝子の終止配列が挙げられる。

メチルトローフ酵母中で遺伝子を発現するための転写制御配列としては、アルコールオキシダーゼおよびギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写制御領域が挙げられる。

本発明に係る酵母細胞中への核酸分子のトランスフェクションは、核酸分子を細胞内に導入可能な任意の方法により達成可能であり、拡散、能動輸送、浴超音波処理、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。トランスフェクト核酸分子は、酵母染色体中に組込み可能であるか、または当業者に公知の技術を用いて染色体外ベクター上の維持可能である。そのような核酸分子を担持する酵母媒体の例は、本明細書に詳細に開示される。以上で考察したように、酵母細胞質体、酵母ゴースト、および酵母細胞膜粒子または細胞壁調製物はまた、所望の核酸分子を無傷酵母微生物または酵母スフェロプラストにトランスフェクトして、その中で抗原を産生し、次いで、当業者に公知の技術を用いて微生物またはスフェロプラストをさらに操作して、所望の抗原または他のタンパク質を含有する細胞質体、ゴースト、もしくは細胞レベル下の酵母細胞膜抽出物、またはそれらの一部を作製することにより、組換え産生可能である。

組換え酵母媒体の作製ならびに酵母媒体による抗原および／または他のタンパク質の発現に有効な条件としては、酵母株を培養可能な効果的培地が挙げられる。効果的培地は、典型的には、同化可能な炭水化物源、窒素源、およびリン酸源、さらには適切な塩、ミネラル、金属、および他の栄養素、たとえば、ビタミンおよび増殖因子を含む水性培地である。培地は、複合栄養素を含んでいてもよいし、または規定の最少培地であってもよい。本発明に係る酵母株は、バイオリアクター、エルレンマイヤーフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリプレートをはじめとするさまざまな容器中で培養可能であるが、これらに限定されるものではない。培養は、酵母株に適した温度、ｐＨ、および酸素含有率で行われる。そのような培養条件は、十分に当業者の技能の範囲内にある（たとえば、グトリエ（Ｇｕｔｈｒｉｅ）ら編、１９９１年、メソッド・イン・エンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１９４巻、アカデミック・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、サンジエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）を参照されたい）。たとえば、一プロトコル下では、スタータープレートから取得される培養物および／または酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物のスターター培養物を用いて、好適な培地を含有する液体培養物を接種することが可能であり、そして２５０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で約２０時間増殖させる。次いで、所望により、初代培養物をより大量の培養物に増大させることが可能である。酵母にトランスフォームされたベクターからのタンパク質発現（たとえば、ＭＵＣ１発現）は、利用されるプロモーターが構成プロモーターであれば、構成的であってもよく、利用されるプロモーターが誘導プロモーターであれば、プロモーターに適した誘導条件（たとえば、ＣＵＰ１プロモーターの場合、硫酸銅）を加えることにより、誘導されてもよい。誘導プロモーターの場合、タンパク質発現の誘導は、培養物が好適な細胞密度に増殖した後、開始されうる。それは、約０．２Ｙ．Ｕ．／ｍｌ以上の密度でありうる。

本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の培養に好適な培地の例は、Ｕ２培地であるが、これに限定されるものではない。Ｕ２培地は、次の成分を含む：１５ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素源、ならびに各０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、トリプトファン、およびアデニン、ならびに０．０６ｍｇ／ｍｌのロイシン。本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の培養に好適な培地の他の例としては、ＵＬ２培地が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＵＬ２培地は、次の成分を含む：１５ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素源、および各０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、トリプトファン、およびアデニン。

本発明のいくつかの実施形態では、酵母は、中性ｐＨ条件下に増殖される。本明細書で用いられる場合、「中性ｐＨ」という用語の一般的使用は、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ８のｐＨ範囲、一態様では約ｐＨ６〜約８を意味する。ｐＨ計による測定時、わずかな変動（たとえば１／１０または１／１００）が起こりうることは、当業者であればわかるであろう。したがって、酵母細胞の増殖に中性ｐＨを使用するとは、培養中のほとんどの時間にわたり酵母細胞が中性ｐＨで増殖されることを意味する。一実施形態では、酵母は、少なくとも５．５のｐＨレベルに維持された培地中で増殖される（すなわち、培養培地のｐＨをｐＨ５．５未満に低下させない）。他の態様では、酵母は、約６、６．５、７、７．５、または８に維持されたｐＨレベルで増殖される。一態様では、中性ｐＨは、好適な緩衝液を用いて緩衝化培養物または増殖培地を形成することにより維持される。酵母の培養に中性ｐＨを使用すると、免疫変調用の媒体として酵母を使用するうえで望ましい特徴であるいくつかの生物学的作用が促進される。たとえば、中性ｐＨで酵母を培養すると、細胞世代時間に悪影響を及ぼすことなく（たとえば、倍加時間の減速）、酵母の良好な増殖が可能になる。酵母は、その細胞壁柔軟性を失うことなく高密度まで増殖を続けることが可能である。中性ｐＨを使用すると、柔軟な細胞壁を有する酵母および／またはあらゆる採取密度で細胞壁消化酵素（たとえば、グルカナーゼ）に対してより感受性のある酵母の生成が可能になる。柔軟な細胞壁を有する酵母は、より酸性の条件下に増殖された酵母と比較して、たとえば、酵母を貪食した抗原提示細胞によるサイトカインの分泌を促進することにより、さまざまなまたは改良された免疫反応を誘導できるので、この形質は望ましい（たとえば、ＴＨ１型サイトカイン、たとえば、限定されるものではないが、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、およびＩＬ−２、さらにはＩＬ−６などの炎症誘発性サイトカイン）。それに加えて、そのような培養方法により、細胞壁に位置する抗原へのより大きい到達性が与えられる。他の態様では、いくつかの抗原に対して中性ｐＨを使用すると、そのような抗原発現酵母をより低いｐＨ（たとえば、ｐＨ５）の培地で培養した時には可能でないジチオトレイトール（ＤＴＴ：ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）処理によるジスルフィド結合抗原の放出が可能になる。本発明で使用される酵母を培養するために中性ｐＨ条件を使用する例では、限定されるものではないが、以上に記載のＵＬ２培地は、たとえば、４．２ｇ／Ｌのビス−トリスを用いて緩衝化される。

本発明者らは、中性ｐＨ条件を用いて増殖させた本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物が、標準条件下（中性ｐＨが維持されない）で増殖させた同一の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物よりも、樹状細胞のより強力なアクチベーターでありかつＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞を活性化してより高レベルのＩＦＮ−γを産生することを本明細書で実証する（実施例参照）。

一実施形態では、酵母グリコシル化の量の制御を用いて、とくに表面上で、酵母による抗原の発現を制御する。糖部分は嵩高くなる傾向があるので、酵母グリコシル化の量は、抗原の免疫原性および抗原性（とくに表面上で発現されるもの）に影響を及ぼしうる。したがって、酵母の表面上の糖部分の存在および標的抗原の周りの三次元空間に及ぼすその影響は、本発明に係る酵母の変調で考慮すべきである。所望により、任意の方法を用いて、酵母のグリコシル化の量を低減または増加させることが可能である。たとえば、低いグリコシル化を有するように選択された酵母突然変異株（たとえば、ｍｎｎ１、ｏｃｈ１、およびｍｎｎ９突然変異体）を使用することが可能であるか、または突然変異により標的抗原上のグリコシル化受容体配列を排除することが可能である。他の選択肢として、グリコシル化パターンが短縮された酵母、たとえば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）を使用することが可能である。また、グリコシル化を低減または変化させる方法を用いて酵母を処理することが可能である。

本発明の一実施形態では、酵母媒体中で抗原または他のタンパク質を組換え発現する代わりに、タンパク質もしくはペプチド、あるいは抗原として機能するおよび／または本発明に係る免疫変調剤もしくは生物学的反応修飾剤として有用である炭水化物もしくは他の分子を、酵母媒体に細胞内充填する。続いて、この時点で抗原および／または他のタンパク質を細胞内に含有する酵母媒体を個体に投与可能であるか、または樹状細胞などの担体中に充填可能である。ペプチドおよびタンパク質は、当業者に公知の技術により、たとえば、拡散、能動輸送、リポソーム融合、エレクトロポレーション、食作用、凍結−解凍サイクル、および浴超音波処理により、本発明に係る酵母媒体に直接挿入することが可能である。ペプチド、タンパク質、炭水化物、または他の分子を直接充填可能な酵母媒体としては、無傷の酵母、さらには産生後に抗原および他の作用剤を充填可能な、スフェロプラスト、ゴースト、または細胞質体が挙げられる。他の選択肢として、無傷の酵母に抗原および／または作用剤を充填し、次いで、スフェロプラスト、ゴースト、細胞質体、または細胞レベル下の粒子をそれから調製することが可能である。この実施形態では、任意の数の抗原および／または他の作用剤、少なくとも１、２、３、４、または任意の整数から、たとえば、微生物またはその一部に充填することにより提供されるように、何百または何千まで、の抗原および／または他の作用剤を、酵母媒体中に充填することが可能である。

本発明の他の実施形態では、抗原および／または他の作用剤は、酵母媒体に物理結合される。酵母媒体への抗原および／または他の作用剤の物理結合は、当技術に好適な任意の方法により、たとえば、限定されるものではないが、酵母媒体の外表面への抗原および／もしくは他の作用剤の化学架橋、または抗体もしくは他の結合パートナーを用いるなどによる酵母媒体の外表面への抗原および／または他の作用剤の生物学的結合するをはじめとする共有結合および非共有結合による会合方法により、達成可能である。化学的架橋は、たとえば、グルタルアルデヒド結合、光親和性標識、カルボジイミド処理、ジスルフィド結合で連結可能な化学剤による処理、および当技術分野で標準的な他の架橋化学剤による処理を含む方法により、達成可能である。他の選択肢として、酵母の外表面が特定の電荷特性を有する抗原および／または他の作用剤に融合または結合しやすくなるように、酵母細胞膜の脂質二重層の電荷または細胞壁の組成を変化させる化学剤を酵母媒体に接触させることが可能である。また、抗原を酵母媒体に結合させるために、抗体、結合性ペプチド、可溶性受容体、他のリガンドなどの標的化剤を融合タンパク質として抗原中に組み込むか、または他の形で抗原に会合させることが可能である。

抗原または他のタンパク質を酵母の表面上に発現する場合またはその表面に物理結合する場合、スペーサアームは、一態様では、表面上での抗原または他のタンパク質の発現または含有量が最適化されるように、注意深く選択されうる。スペーサアームのサイズは、どのくらいの量の抗原または他のタンパク質が酵母の表面への結合で露出されるかに影響を及ぼしうる。したがって、どの抗原または他のタンパク質を使用するかに依存して、当業者は、酵母表面上の抗原または他のタンパク質の適切なスペーシングを行うスペーサアームを選択するであろう。一実施形態では、スペーサアームは、少なくとも４５０アミノ酸の酵母タンパク質である。スペーサアームは、以上で詳細に考察した。

さらに他の実施形態では、酵母媒体および抗原または他のタンパク質は、より受動な、非特異的な、または非共有結合的な結合機構により、たとえば、緩衝液中または他の好適な配合物（たとえば、混合物）中で酵母媒体と抗原または他のタンパク質とを温和に混合一体化することにより、互いに会合される。

一実施形態では、酵母細胞壁調製物、酵母細胞膜粒子、または酵母断片（すなわち、無傷でない）が作製されるように、無傷の酵母（異種抗原または他のタンパク質の発現を行うまたは行わない）を粉砕または処理することが可能であり、酵母断片は、いくつかの実施形態では、免疫反応を促進するために、抗原（たとえば、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、死滅または不活性化病原体、ウイルスベクターワクチン）を含む他の組成物を備えうるか、またはそれが投与されうる。たとえば、酵素処理、化学処理、または物理力（たとえば、機械的剪断もしくは超音波処理）を用いて、補助剤として使用される部分に酵母を破壊することが可能である。

本発明の一実施形態では、本発明に有用な酵母媒体は、死滅させたまたは不活性化された酵母媒体を含む。酵母の死滅または不活性化は、当技術分野で公知のさまざまな好適な方法のいずれかにより、達成可能である。たとえば、酵母の熱不活性化は、酵母の標準的不活性化方法であり、所望により、当業者であれば、当技術分野で公知の標準的方法により、標的抗原の構造変化をモニターすることが可能である。他の選択肢として、酵母の他の不活性化方法、たとえば、化学法、電気法、放射活性法、またはＵＶ法を使用することが可能である。たとえば、メソッド・オブ・エンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１９４巻、コールド・スプリング・ハーバー・パブリッシング（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、１９９０年などの酵母培養の標準的教科書に開示の方法を参照されたい。不活性化戦略のいずれを用いたとしても、標的抗原の二次構造、三次構造、または四次構造を考慮に入れて、その免疫原性が最適化されるように、そのような構造を維持すべきである。

酵母媒体は、当業者に公知のいくつかの技術を用いて、本発明に係る酵母ベースの免疫療法組成物または生成物の形態に製剤化可能である。たとえば、酵母媒体は、凍結乾燥により乾燥可能である。酵母媒体を含む製剤はまた、ベーキングまたは醸造の操作で使用される酵母に対して行われるように、ケーキまたはタブレットに酵母を充填することにより調製可能である。それに加えて、酵母媒体は、宿主または宿主細胞が耐えられる等張性緩衝液などの薬学的に許容可能な賦形剤と混合可能である。そのような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース液、ハンクス液、および他の水性生理的平衡塩類液が挙げられる。固定油、ゴマ油、エチルオレエート、またはトリグリセリドなどの非水性媒体を使用することも可能である。他の有用な製剤としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、グリセロール、またはデキストランなどの粘度増強剤を含有するサスペンジョン剤が挙げられる。賦形剤はまた、等張性および化学的安定性を向上させる物質などの添加剤を副次量で含有可能である。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝剤、およびトリス緩衝液が挙げられ、一方、保存剤の例としては、チメロサール、ｍまたはｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールが挙げられる。標準的製剤は、液体注射剤または注射用の懸濁液もしくは溶液として好適な液体中に溶解可能な固形剤のいずれかでありうる。したがって、非液体製剤では、賦形剤は、たとえば、投与前に無菌水または生理食塩水を添加しうるデキストロース、ヒト血清アルブミン、および／または保存剤を含みうる。

本発明の一実施形態では、組成物は、追加の作用剤を含みうる。この作用剤はまた、生物学的反応修飾剤化合物またはそのような作用剤／修飾剤を生成する能力としても参照されうる。たとえば、酵母媒体に少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの作用剤／生物学的反応修飾剤化合物をトランスフェクトもしくは充填することが可能であるか、または本発明に係る組成物を少なくとも１つの作用剤／生物学的反応修飾剤と組み合わせて投与することが可能である。生物学的反応修飾剤としては、免疫変調化合物として参照されうる免疫反応を変調可能なアジュバントおよび他の化合物、さらには他の化合物または作用剤の生物学的活性を修飾する化合物、たとえば、酵母ベースの免疫療法剤（そのような生物学的活性は、免疫系効果に限定されるものではない）が挙げられる。特定の免疫変調化合物は、防御免疫反応を刺激可能であり、一方、他のものは、有害免疫反応を抑制可能であり、免疫変調が所与の酵母ベースの免疫療法剤との組合せに有用であるかは、少なくとも部分的には、疾患状態または治療もしくは予防される病態および／または治療される個体に依存しうる。特定の生物学的反応修飾剤は、細胞媒介性免疫反応を優先的に促進し、一方、他のものは、体液性免疫反応を優先的に促進する（すなわち、体液性免疫と比較して、増大されたレベルの細胞媒介性免疫が存在する免疫反応を刺激可能であり、その逆も同様である）。特定の生物学的反応修飾剤は、酵母ベースの免疫療法剤の生物学的性質と共通した１つまたは複数の性質を有するか、または酵母ベースの免疫療法剤の生物学的性質を増強もしくは補完する。免疫反応の刺激もしくは抑制を測定するための、さらには細胞媒介性免疫反応と体液性免疫反応とを区別するための、一方のタイプの細胞媒介性反応と他方のタイプのものとを区別するための（たとえば、ＴＨ１７反応に対してＴＨ１反応）、当業者に公知のいくつかの技術が存在する。

本発明に有用な作用剤／生物学的反応修飾剤としては、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、脂質誘導体、ペプチド、タンパク質、ポリサッカリド、小分子薬剤、抗体およびその抗原結合フラグメント（限定されるものではないが、抗サイトカイン抗体、抗サイトカイン受容体抗体、抗ケモカイン抗体を含む）、ビタミン、ポリヌクレオチド、核酸結合部分、アプタマー、および増殖変調剤が挙げられうるが、これらに限定されるものではない。いくつかの好適な作用剤としては、下記が挙げられるが、これらに限定されるものではない：ＩＬ−１またはＩＬ−１アゴニストまたはＩＬ−１Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−１または他のＩＬ−１アンタゴニスト、ＩＬ−６またはＩＬ−６アゴニストまたはＩＬ−６Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−６または他のＩＬ−６アンタゴニスト、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２アゴニストまたはＩＬ−１２Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−１２または他のＩＬ−１２アンタゴニスト、ＩＬ−１７またはＩＬ−１７アゴニストまたはＩＬ−１７Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−１７または他のＩＬ−１７アンタゴニスト、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１アゴニストまたはＩＬ−２１Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２１または他のＩＬ−２１アンタゴニスト、ＩＬ−２２またはＩＬ−２２アゴニストまたはＩＬ−２２Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２２または他のＩＬ−２２アンタゴニスト、ＩＬ−２３またはＩＬ−２３アゴニストまたはＩＬ−２３Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２３または他のＩＬ−２３アンタゴニスト、ＩＬ−２５またはＩＬ−２５アゴニストまたはＩＬ−２５Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２５または他のＩＬ−２５アンタゴニスト、ＩＬ−２７またはＩＬ−２７アゴニストまたはＩＬ−２７Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２７または他のＩＬ−２７アンタゴニスト、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−αを含む）、Ｉ型インターフェロンのアゴニストまたはアンタゴニストまたはそれらの受容体、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−γを含む）、ＩＩ型インターフェロンのアゴニストまたはアンタゴニストまたはそれらの受容体、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）タンパク質および／またはＩＭＰ３２１（可溶形ＬＡＧ３に由来するＴ細胞免疫刺激因子）、抗ＣＴＬＡ−４抗体（たとえば、アネルギーＴ細胞を放出する）、Ｔ細胞共刺激剤（たとえば、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０）、アレムツズマブ（たとえば、カムパス（ＣａｍＰａｔｈ）（登録商標））、デニロイキンジフチトクス（たとえば、オンタック（ＯＮＴＡＫ）（登録商標））、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２、ＦＯＸＰ３をブロックする作用剤（たとえば、活性／死滅ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ調節細胞を抑止する）、Ｆｌｔ３リガンド、イミキモド（アルダラ（Ａｌｄａｒａ）（商標））、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、サルグラモスチム（ロイキン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）（登録商標））、限定されるものではないがプロラクチンおよび成長ホルモンを含むホルモン、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、限定されるものではないが、ＴＬＲ−２アゴニスト、ＴＬＲ−４アゴニスト、ＴＬＲ−７アゴニスト、およびＴＬＲ−９アゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、限定されるものではないが、ＴＬＲ−２アンタゴニスト、ＴＬＲ−４アンタゴニスト、ＴＬＲ−７アンタゴニスト、およびＴＬＲ−９アンタゴニスト、抗炎症剤および免疫変調剤、限定されるものではないが、ＣＯＸ−２阻害剤（たとえば、セレコキシブ、ＮＳＡＩＤＳ）、グルココルチコイド、スタチン、およびサリドマイド、ならびにそれらのアナログ、たとえば、イミド（ＩＭｉＤ）（商標）（サリドマイドの構造アナログおよび機能アナログである（たとえば、レブリミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ）（登録商標）（レナリドマイド）、アクチミド（ＡＣＴＩＭＩＤ）（登録商標）（ポマリドマイド）））、炎症誘発剤、たとえば、菌類成分もしくは細菌成分または任意の炎症誘発性サイトカインもしくはケモカイン、免疫療法用ワクチン、たとえば、限定されるものではないが、ウイルスベースのワクチン、細菌ベースのワクチン、または抗体ベースのワクチン、ならびに任意の他の免疫変調剤、免疫増強剤、抗炎症剤、炎症誘発剤、および抗原提示細胞の、またはＴＨ１７、ＴＨ１、および／もしくはＴｒｅｇ細胞の、数を変調する、活性化状態を変調する、および／または生存率を変調する、任意の作用剤。そのような作用剤の任意の組合せは、本発明の対象であり、酵母ベースの免疫療法剤と組み合わされた、またはそれを用いるプロトコルで（たとえば、併行的に、逐次的に、もしくは他の方式で）投与された、そのような作用剤はいずれも、本発明に包含される組成物である。そのような作用剤は、当技術分野で周知である。これらの作用剤は、単独でまたは本明細書に記載の他の作用剤と組み合わせて使用されうる。

作用剤は、所与のタンパク質もしくはペプチドまたはそれらのドメインのアゴニストおよびアンタゴニストを含みうる。本明細書で用いられる場合、「アゴニスト」とは、受容体またはリガンドに結合して反応を生成または開始する任意の化合物または作用剤のことであり、限定されるものではないが、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸結合剤などが含まれ、受容体またはリガンドに結合する天然に存在する物質の作用を模倣または増強する作用剤が含まれうる。「アンタゴニスト」とは、アゴニストの作用を、ブロックまたは阻害または低減する任意の化合物または作用剤のことであり、限定されるものではないが、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸結合剤などが含まれる。

本発明に係る組成物は、癌の予防もしくは治療に有用な任意の他の作用剤もしくは組成物もしくはプロトコル、または癌とくにＭＵＣ１の発現もしくは過剰発現に関連付けられる癌の任意の症状を治療もしくは寛解する任意の化合物、をさらに含みうるか、またはそれらと共に投与されうる（併行的に、逐次的に、または断続的に）。それに加えて、本発明に係る組成物は、予防用および／または療法用の免疫療法を含めて、他の免疫療法用組成物と一緒に使用可能である。癌の治療に有用な追加の作用剤、組成物、またはプロトコル（たとえば、療法プロトコル）としては、化学療法、腫瘍の外科的切除、放射線療法、同種異系もしくは自己由来の幹細胞移植、Ｔ細胞養子移入、他のタイプの免疫療法（ウイルスベクターベースの免疫療法および樹状細胞／腫瘍融合免疫療法および／または標的化癌療法を含む）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。（たとえば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする小分子薬剤、生物学、またはモノクローナル抗体療法、限定されるものではないが、選択的エストロゲン受容体変調剤（ＳＥＲＭ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、アロマターゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ：ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）阻害剤、レチノイド受容体活性化剤、アポトーシス刺激剤、血管新生阻害剤、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、または免疫刺激剤が含まれる）。これらの追加の療法剤および／または療法プロトコルはいずれも、本発明に係る免疫療法組成物の前に、それと同時に、それと交互に、もしくはその後に、またはさまざまな時点で、投与されうる。たとえば、化学療法または標的化癌療法と組み合わせて個体に投与する場合、免疫療法組成物の有効性を最大化するために、化学療法または標的化癌療法の実施の「休診日」間で、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を投与することが望ましいこともある。腫瘍の外科的切除は、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の投与に先行することが多いと思われるが、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の投与中または投与後に追加のまたは初回の手術を行ってもよい。

本発明はまた、本明細書に記載の組成物のいずれかまたは本明細書に記載の組成物の各成分のいずれかを含むキットを包含する。キットは、ＭＵＣ１の発現または過剰発現により特徴付けられる癌を予防または治療すべく本発明に係る組成物のいずれかを使用するための追加の試薬および書面の説明書または指示書を含みうる。

本発明に係る組成物の投与方法または使用方法
本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、ＭＵＣ１の発現または過剰発現に関連付けられるまたはそれにより特徴付けられる癌の予防または治療（そのような癌の発生の予防、そのような癌の進行の阻止、またはそのような癌の排除を含む）に使用すべく設計されている。より特定的には、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、ＭＵＣ１発現腫瘍の発生の予防、阻害、もしくは遅延、および／または腫瘍遊走の予防、阻害、もしくは遅延、および／または他の組織の腫瘍浸潤（転移）、および／または一般的には個体における癌の進行の予防もしくは阻害に使用可能である。酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物はまた、癌の少なくとも１つの症状を寛解させるために、たとえば、個体における腫瘍負荷の低減により、個体における腫瘍増殖の阻害により、個体の生存率の増大により、および／または個体における癌の進行の予防、阻害、逆転、もしくは遅延により、使用可能である。

本発明に係る組成物および方法に関連する癌は、上皮組織の癌を含めて、ＭＵＣ１を発現するもしくは発現しうる任意の癌、またはＭＵＣ１を発現するもしくは発現しうる癌に近接する癌であり、限定されるものではないが、乳癌、小腸癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、およびそれらの転移癌が挙げられる。それに加えて、ＭＵＣ１は、リンパ腫、白血病、骨髄腫などの血液癌、たとえば、限定されるものではないが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄性リンパ腫（ＭＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞、バーキットリンパ腫、およびホジキンリンパ腫で発現されるかまたは発現されうる。

一態様では、ＭＵＣ１は、組成物が最初に投与される時点で個体の癌で検出されない。ＭＵＣ１が個体の癌で検出されない場合、個体は、ＭＵＣ１発現がまだ出現していない（たとえば、Ｉ期もしくはＩＩ期）、またはＭＵＣ１発現がいずれにせよまだ検出可能でない（すなわち、ＭＵＣ１は、低レベルでもしくは少数の腫瘍細胞で発現されていてもされていなくてもよいが、標準的検出方法を用いてまだ容易に検出可能でない）、より早期の癌を有しうる。他の選択肢として、個体は、前癌病変もしくは前癌腫瘍を有することも、癌発生の素因を有することも知られうる（たとえば、家族歴、遺伝子マーカなどの知見による）。本発明のこれらの態様では、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞の発生は、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の使用により、予防、遅延、または阻害される。

他の態様では、ＭＵＣ１発現は、組成物が最初に投与された時点で個体の癌で検出されるかまたは検出可能である。個体は、本発明のこの態様では、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、またはＩＶ期の癌を有しうる。この態様では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の使用により、ＭＵＣ１を発現する腫瘍の増殖が低減、排除、減速、または停止され、その結果、個体における腫瘍負荷が低減可能になり、ＭＵＣ１発現腫瘍の増殖が阻害可能になり、かつ／または個体の生存率が増大可能になる。

本発明の他の実施形態は、癌とくにＭＵＣ１発現癌の治療方法に関する。この方法は、ＭＵＣ１発現癌を有する個体に本明細書に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物を投与することを含み、この組成物は、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）少なくとも１つのＭＵＣ１抗原を含む癌抗原と、を含む組成物を含みうる。一態様では、この方法は、患者において腫瘍負荷を低減する。一態様では、この方法は、患者の生存率を増加する。一態様では、この方法は、個体において腫瘍増殖を阻害する。

一態様では、個体は、癌の治療に有用な少なくとも１つの他の療法用化合物または療法プロトコルで、追加的に治療される。そのような療法剤およびプロトコルは、本明細書の他の箇所で詳細に考察された。たとえば、本明細書に記載の本発明に係る方法に関する実施形態のいずれでも、個体が癌を有する場合（腫瘍細胞で検出可能なＭＵＣ１発現の状態にかかわらず）、一態様では、個体は、他の癌療法で治療を受けているかまたは治療を受けてきた。そのような療法は、本明細書で以上に記載した療法用化合物または療法剤のいずれかの療法プロトコルまたは使用のいずれかを含みうる。たとえば、化学療法、放射線療法、標的化癌療法、腫瘍の外科的切除、幹細胞移入、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞移入、および／または第２の免疫療法用組成物の投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。第２の免疫療法用組成物を投与する場合、そのような組成物は、限定されるものではないが、追加の酵母ベースの免疫療法、組換えウイルスベースの免疫療法（ウイルスベクター、たとえば、ＰＣＴ国際公開第００／３４４９４号を参照されたい）、サイトカイン療法、免疫刺激療法（免疫刺激性を用いた化学療法を含む）、ＤＮＡワクチン、樹状細胞／腫瘍融合免疫療法（たとえば、ＰＣＴ国際公開第２００９／０６２００１号を参照されたい）、および他の免疫療法組成物を含みうる。

一態様では、第２の免疫療法用組成物は、ＭＵＣ１抗原でない第２の癌抗原を含む。たとえば、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物との組合せに有用な第２の免疫療法用組成物は、同一の腫瘍タイプによりまたは治療される個体が有するもしくは発生しうる他の腫瘍により発現される他の癌抗原を含む酵母免疫療法用組成物である。そのような癌抗原は、限定されるものではないが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、点突然変異Ｒａｓオンコプロテイン、ブラキュリー、ＥＧＦＲ、ＢＣＲ−Ａｂｌ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ、ＧＰ−１００、ＭＵＣ−２、正常および点突然変異ｐ５３オンコプロテイン、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−２、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２、ｈＴＥＲＴ、ｐ７３、Ｂ−ＲＡＦ、腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、Ｍｙｃ、フォンヒッペル・リンダウタンパク質（ＶＨＬ）、Ｒｂ−１、Ｒｂ−２、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、Ｓｍａｄ４、ＭＤＲ１、Ｆｌｔ−３、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＴＷＩＳＴ、メソテリン、ＮＧＥＰ、そのような抗原の修飾体、そのような抗原のスプライス変異体、およびそのような抗原のエピトープアゴニスト、さらにはそのような抗原の組合せ、および／またはそれらの免疫原性ドメイン、それらの修飾体、それらの変異体、および／またはそれらのエピトープアゴニストのいずれか１つまたは複数を含む。

本明細書で用いられる場合、癌を「治療」するまたはその任意の並べ替え（たとえば、「癌の治療を受けた」など）は、一般的には、腫瘍負荷の低減、腫瘍増殖の阻害、個体の生存率の増大、転移癌の発症もしくは発生の遅延、阻害、停止、もしくは予防（たとえば、腫瘍遊走の発生の発症および／または原発性癌外の組織の腫瘍浸潤および／または癌の転移進行に関連付けられる他の過程の遅延、阻害、停止、もしくは予防により）、原発性癌の進行の遅延もしくは停止、腫瘍に対する免疫反応の改善、腫瘍抗原に対する長期記憶免疫反応の改善、および／または個体の健康状態の向上を含む治療の少なくとも１つの療法目的で（この治療の不在下と比較して）、癌が発生した後（たとえば、個体において癌が診断または検出された後）、本発明に係る組成物を投与することを意味する。癌を「予防する」またはそれから「保護する」またはそれらの任意の並べ替え（たとえば、「癌の予防」など）は、一般的には、癌の発症もしくは発生の予防もしくは遅延、または万一治療後に癌が発生した場合、少なくとも癌の重症度の低下（たとえば、腫瘍増殖レベルの低下、癌進行の停止、癌に対する免疫反応の改善、転移過程の阻害など）、または個体における転帰の改善（たとえば、生存率の改善）を含む治療の少なくとも１つの目的で（この治療の不在下と比較して）、癌が発生する前、前癌細胞が検出される時、または癌の特定の病期もしくは癌の腫瘍抗原発現が発生する前（たとえば、ＭＵＣ１発現が癌で検出される前）、本発明に係る組成物を投与することを意味する。

本発明は、被験体または個体への本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の送達（投与、免疫化、ワクチン接種）を包含する。投与プロセスは、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏで行うことが可能であるが、典型的には、ｉｎｖｉｖｏで行われる。ｅｘ
ｖｉｖｏ投与とは、患者外で調節工程の一部を行って、たとえば、酵母媒体、抗原、および任意の他の作用剤または組成物が細胞内に充填されるような条件下で、本発明に係る組成物を患者から取り出された細胞集団（樹状細胞）に投与し、そしてその細胞を患者に戻すことを意味する。次いで、本発明に係る療法用組成物を患者に戻すか、または任意の好適な投与形態により患者に投与することが可能である。

組成物の投与は、全身、粘膜、および／または標的部位の近接位置（たとえば、腫瘍部位の近傍）でありうる。好適な投与経路は、予防もしくは治療される癌のタイプおよび／または標的細胞集団もしくは組織に依存するが、当業者には明らかであろう。種々の許容可能な投与方法としては、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、節内投与、冠脈内投与、動脈内投与（たとえば、頸動脈内）、皮下投与、経真皮送達、気管内投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（たとえば、エアロゾル）、頭蓋内投与、脊髄内投与、眼内投与、経耳投与、鼻腔内投与、経口投与、肺内投与、カテーテルの進入、および組織内への直接注入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一態様では、投与経路は、静脈内、腹腔内、皮下、真皮内、節内、筋肉内、経真皮、吸入、鼻腔内、経口、眼内、関節内、頭蓋内、および脊髄内を含む。非経口送達は、真皮内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、肺内、静脈内、皮下、心房カテーテル、および静脈カテーテルの経路を含みうる。経耳送達は、点耳剤を含んでもよく、鼻腔内送達は、点鼻剤を含んでもよく、または鼻腔内注入および眼内送達は、点眼剤を含んでもよい。エアロゾル（吸入）送達はまた、当技術分野で標準的な方法を用いて行うことも可能である（たとえば、ストリブリング（Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１８９巻、ｐ．１１２７７−１１２８１、１９９２年を参照されたい）。一態様では、本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、皮下投与される。一態様では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、腫瘍環境中に直接に投与される。

一般的には、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の好適な単回用量は、好適な期間にわたり１回または複数回投与した時、１つまたは複数のＭＵＣ１抗原またはエピトープに対する抗原特異的免疫反応を誘発する効果的な量で、患者の身体の所与の細胞型、組織、または領域に、酵母媒体およびＭＵＣ１抗原を効果的に提供可能な用量である。たとえば、一実施形態では、本発明に係る酵母−ＭＵＣ１の単回用量は、組成物が投与される生物のキログラム体重あたり約１×１０^５〜約５×１０^７酵母細胞等価物である。１酵母単位（Ｙ．Ｕ．）は、１×１０^７酵母細胞または酵母細胞等価物である。一態様では、本発明に係る酵母媒体の単回用量は、０．１×１０^６細胞の増分の任意の中間用量を含めて（すなわち、１．１×１０^６、１．２×１０^６、１．３×１０^６．．．）、単位用量あたり（すなわち、単位生物あたり）、約０．１Ｙ．Ｕ．（１×１０^６酵母細胞または酵母細胞等価物）〜約１００Ｙ．Ｕ．（１×１０^９細胞）である。一実施形態では、好適な用量は、１Ｙ．Ｕ．〜４０Ｙ．Ｕ．の用量を含み、一態様では、１０Ｙ．Ｕ．〜４０Ｙ．Ｕ．または１０Ｙ．Ｕ．〜８０Ｙ．Ｕ．である。一実施形態では、用量は、個体上の異なる部位に、ただし同一投与期間中に、投与される。たとえば、一投与期間中、個体の４つの異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．用量を注入することにより、４０Ｙ．Ｕ．用量を投与しうる。本発明は、単回用量を形成すべく、一定量の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０Ｙ．Ｕ．、またはそれを超える数）を、個体上の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える数の異なる部位に投与することを含む。

療法用組成物の「ブースター」または「ブースト」は、たとえば、抗原に対する免疫反応が弱くなった時、または免疫反応の提供もしくは特定の１つまたは複数の抗原に対する記憶反応の誘導が必要な場合、投与される。ブースターは、治療される個体の状態および投与時の療法の目的（たとえば、予防、積極療法、維持）に依存して、初回投与後、約１、２、３、４、５、６、７、もしくは８週間の間隔で、または毎月１回、２ヶ月に１回、４ヶ月に１回、毎年１回、および／または数年間隔で、投与可能である。一実施形態では、投与スケジュールは、何週間から何ヶ月間、何年間までにわたり、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを超える回数、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の用量が投与されるものである。一実施形態では、用量は、癌に対する所望の予防処置または治療処置を達成する必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０用量、またはそれを超える用量に対して、毎週１回または２週間に１回、続いて、２週間に１回または毎月１回の用量で、投与される。次いで、追加のブースターは、所望により、維持療法または寛解療法として、類似のまたはより長い間隔（何ヶ月間または何年間）で投与可能である。

本発明の一態様では、１つまたは複数の追加の療法剤または療法プロトコルは、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の投与を併用して逐次的におよび／または同時に投与または実施され、たとえば、腫瘍の外科的切除、化学療法の実施、放射線療法の実施、他の免疫療法組成物またはプロトコル、たとえば、ウイルスベクター療法および樹状細胞／腫瘍融合療法、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞移入（抗原および／または免疫療法組成物によりｅｘ
ｖｉｖｏで刺激されたＴ細胞の養子移入を含む）、または幹細胞移植の実施が行われる。一例では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、ＰＣＴ国際公開第００／３４４９４号に記載されるようなウイルスベクターベースの免疫療法を利用する療法と組み合わせて、実施される。他の例では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、樹状細胞／腫瘍細胞融合療法、またはＰＣＴ国際公開第２００９０６２００１号に記載されるような樹状細胞／腫瘍細胞融合で刺激された免疫系細胞（たとえば、Ｔ細胞）と組み合わせて、実施される。そのような実施形態では、非酵母ベースの免疫療法は、ＭＵＣ１または異なる腫瘍抗原を標的としうる。また、そのような療法は、他の作用剤、たとえば、サイトカイン、抗体、または他の作用剤の追加投与を含みうる。

一態様では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の初回用量の前または初回用量が投与された後、１つまたは複数の癌療法（本明細書に記載の、さもなければ当技術分野で公知の、任意の療法を含む）の投与または実施が可能である。一実施形態では、酵母−ＭＵＣ１組成物が化学療法または他の療法の１つまたは複数の連続した用量間で所定の間隔で投与されるプロトコルのように、１つまたは複数の療法を酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の投与と交互に実施可能である。一実施形態では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、追加の療法の開始前の一定期間にわたり一回以上の用量で投与される。言い換えれば、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、一定期間にわたり単独療法として投与され、次いで、追加の療法（たとえば、化学療法）は、酵母−ＭＵＣ１免疫療法の新しい用量と同時に、または酵母−ＭＵＣ１免疫療法と交互に、追加される。他の選択肢としてまたは追加として、他の療法は、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の投与の開始前の一定期間にわたり実施されうる。また、この考え方は、組み合わせうる（たとえば、腫瘍の外科的切除、続いて、数週間にわたる酵母−ＭＵＣ１免疫療法を用いた単独療法、続いて、何週間または何ヶ月間にわたる化学療法と酵母−ＭＵＣ１免疫療法との交互用量、任意選択で、続いて、酵母−ＭＵＣ１免疫療法および／または他の療法を用いた単独療法、または逐次的に、併行的に、もしくは交互に提供される療法の組合せの新しいプロトコル）。酵母−ＭＵＣ１免疫療法を用いた癌治療のための種々のプロトコルは、本発明の対象であり、これらの例は、種々の可能なプロトコルの例であるとみなされるべきであり、限定すべきものではない。

ウイルスベースの免疫療法組成物は、典型的には、ウイルスゲノムまたはその一部（たとえば、組換えウイルス）と、疾患誘発因子または疾患状態に由来する少なくとも１つ抗原をコードする核酸配列（たとえば、癌抗原、感染性疾患抗原、および／または少なくとも１つのそれらの免疫原性ドメイン）と、を含むウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベースの免疫療法組成物は、１つまたは複数の免疫刺激性分子をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む少なくとも１つのウイルスベクターをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫刺激性分子および抗原をコードする遺伝子は、同一ウイルスベクター内に挿入される（同一組換えウイルス）。

樹状細胞／腫瘍細胞融合免疫療法組成物は、典型的には、当技術分野で公知の融合方法を用いて、樹状細胞と、腫瘍抗原を発現する非樹状細胞（腫瘍細胞を含む）と、の融合により生成されたハイブリッド細胞である。融合細胞は、樹状細胞特性を有し、さらには腫瘍細胞由来の腫瘍抗原を発現および提示する。組成物は、個体に投与されうるか、またはＴ細胞移入法のためにｅｘｖｉｖｏでＴ細胞を刺激すべく使用されうる。

本発明の一態様では、ＭＵＣ１以外の追加の抗原もまた、ＭＵＣ１を標的とすることに加えて、酵母ベースの免疫療法を用いて標的としうる。そのような追加の標的抗原は、ＭＵＣ１抗原と同一の酵母媒体内に追加されうるか、または異なる抗原を標的とする追加の酵母ベースの免疫療法組成物を作製し、次いで、治療される個体、癌のタイプもしくは個体の特定の腫瘍により発現される抗原に依存して、および／または個体における癌の病期または個体の治療の時期に依存して、要望に応じて、組み合わせることが可能である。たとえば、次の範囲内に包含される抗原の組合せを選択しうる：（１）癌の発生で影響力の大きいイベントに関与する抗原、たとえば、突然変異Ｒａｓ、（２）細胞過程の調節不全に関与するまたは関連付けられる抗原、たとえば、ＣＥＡまたはＭＵＣ１、および（３）転移過程に関与するブラキュリー。たとえば、１つまたは複数の他の酵母ベースの免疫療法組成物は、限定されるものではないが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、点突然変異Ｒａｓオンコプロテイン、ブラキュリー、ＥＧＦＲ、ＢＣＲ−Ａｂｌ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ、ＧＰ−１００、ＭＵＣ−２、正常および点突然変異ｐ５３オンコプロテイン、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−２、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２、ｈＴＥＲＴ、ｐ７３、Ｂ−ＲＡＦ、腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、ｍｙｃ、フォンヒッペル・リンダウタンパク質（ＶＨＬ）、Ｒｂ−１、Ｒｂ−２、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、Ｓｍａｄ４、ＭＤＲ１、Ｆｌｔ−３、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＴＷＩＳＴ、メソテリン、ＮＧＥＰ、そのような抗原の修飾体、そのような抗原のスプライス変異体、およびそのような抗原のエピトープアゴニスト、さらにはそのような抗原の組合せ、および／またはそれらの免疫原性ドメイン、それらの修飾体、それらの変異体、および／またはそれらのエピトープアゴニストをはじめとする１つまたは複数の抗原を発現しうる。個体の腫瘍中の抗原への標的化を最適化するために、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の投与の前に、それと併行的に、もしくはそれと交互に、および／またはその後に、１、２、３、またはそれを超える数のこれらの酵母ベースの免疫療法組成物を、個体に投与しうる。以上のように、追加の療法もまた、そのようなプロトコルで使用可能である（たとえば、腫瘍の外科的切除、化学療法、標的化癌療法、放射線療法など）。

本発明の一実施形態では、癌の治療方法が提供される。この方法は、以下の工程、すなわち、（ａ）本明細書に記載されるように酵母媒体とＭＵＣ１抗原とを含む第１の免疫療法用組成物を、癌または前癌腫瘍を有する個体に投与する工程と、（ｂ）第１の免疫療法用組成物の投与の前に、それと同時に、またはそれに続いて、それぞれ酵母媒体を含むかつそれぞれＭＵＣ１抗原でない異なる癌抗原を含む、１つまたは複数の追加の免疫療法用組成物を、個体に投与する工程と、を含む。追加の癌抗原は、当技術分野で公知のものまたは本明細書に記載のものであってもよく、限定されるものではないが、突然変異Ｒａｓ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ブラキュリー、ＥＧＦＲなどが挙げられる。特定の個体の癌を治療するめに、必要に応じて工程を反復してもよく、特定の個体の癌に特異的に対処するめに、治療前または治療中に癌抗原を修飾してもよい。

本発明に係る方法では、組成物および療法用組成物は、任意の脊椎動物を含めて任意の動物に、特定的には、限定されるものではないが、霊長動物、齧歯動物、家畜、および家庭愛玩動物をはじめとする脊椎動物門哺乳綱の任意のメンバーに、投与可能である。家畜は、消費されるまたは有用品を生産する哺乳動物を含む（たとえば、羊毛生産用のヒツジ）。本発明を利用して治療または保護する哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびブタを含む。

「個体」とは、脊椎動物、たとえば、限定されるものではないが、ヒトをはじめとする哺乳動物である。哺乳動物は、家畜、競技用動物、愛玩動物、霊長動物、マウス、およびラットを含むが、これらに限定されるものではない。「個体」という用語は、「動物」、「被験体」、または「患者」という用語と同義的に使用可能である。
本発明に有用な一般的技術
本発明を実施する際、とくに指定がないかぎり、当業者に周知である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来技術が利用されるものとする。そのような技術については、のような文献中で十分に説明されている。酵素学の方法（ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１９４巻、グトリエ（Ｇｕｔｈｒｉｅ）ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）、１９９０年、生物学および酵母の活性（Ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｙｅａｓｔｓ）、スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）ら編、アカデミック・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、１９８０年、酵母遺伝学の方法：実験コースマニュアル（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｙｅａｓｔｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｃｏｕｒｓｅｍａｎｕａｌ）、ローズ（Ｒｏｓｅ）ら著、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）、１９９０年、酵母サッカロマイセス属：細胞周期および細胞生物学（ＴｈｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：ＣｅｌｌＣｙｃｌｅａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ）、プリングル（Ｐｒｉｎｇｌｅ）ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）、１９９７年、酵母サッカロマイセス属：遺伝子発現（ＴｈｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）、１９９３年、酵母サッカロマイセス属：ゲノム動力学（ＴｈｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：ＧｅｎｏｍｅＤｙｎａｍｉｃｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄＥｎｅｒｇｅｔｉｃｓ）、ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）、１９９２年、分子クローニング：実験マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、１９８９年、および分子クローニング：実験マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、第３版、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）、２００１年、（本明細書ではまとめて「サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」として参照される）、分子生物学の現用プロトコル（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、Ｆ．Ｍ．アウスベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、１９８７年、２００１年までの補遺を含む、ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら編、１９９４年、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）著、１９８８年、抗体、実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・パブリケーションズ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ニューヨーク、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）著、１９９９年、抗体の使用：実験マニュアル（ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（本明細書ではまとめて「ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）」として参照される）、ブューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら編、核酸化学の現用プロトコル（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、２０００年、カサレットおよびドウルの毒性学毒の基礎科学（ＣａｓａｒｅｔｔａｎｄＤｏｕｌｌ’ｓＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＴｈｅＢａｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅｏｆＰｏｉｓｏｎｓ）、Ｃ．クラーセン（Ｃ．Ｋｌａａｓｓｅｎ）編、第６版、２００１年、ならびにワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、Ｓ．プロトキン（Ｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ）、Ｗ．オレンスタイン（Ｗ．Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ）、およびＰ．オフィット（Ｐ．Ｏｆｆｉｔ）編、第５版、２００８年。

一般的定義
「タルモゲン（ＴＡＲＭＯＧＥＮ）（登録商標）」（グローブイミューン・インコーポレイテッド（ＧｌｏｂｅＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）、ルーイビル、コロラド州）は、一般的には、細胞外（その表面上）、細胞内（内部または細胞質ゾル内）、または細胞外および細胞内の両方で、１つまたは複数の異種抗原を発現する酵母媒体を意味する。タルモゲン（ＴＡＲＭＯＧＥＮ）（登録商標）は、概説されている（たとえば、米国特許第５，８３０，４６３号明細書を参照されたい）。特定の酵母ベースの免疫療法組成物ならびにその製造方法およびその一般的使用方法は、たとえば、米国特許第５，８３０，４６３号明細書、米国特許第７，０８３，７８７号明細書、米国特許第７，７３６，６４２号明細書、スタブス（Ｓｔｕｂｂｓ）ら著、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、第７巻、ｐ．６２５〜６２９、２００１年、ルゥ（Ｌｕ）ら著、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）、第６４巻、ｐ．５０８４〜５０８８、２００４年、およびベルンシュタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）ら著、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）、２００８年１月２４日、第２６巻、第４号、ｐ．５０９〜２１（それぞれそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。

本明細書で用いられる場合、「アナログ」という用語は、他の化合物に構造的に類似しているが組成がわずかに異なる化学化合物を意味する（１原子を異なる元素の原子によりまたは特定の官能基の存在で交換、１官能基を他の官能基と交換）。したがって、アナログは、機能および外観が類似または同程度であるが、参照化合物と比較して異なる構造または起源を有する化合物である。

「置換」、「置換誘導体」、および「誘導体」という用語は、化合物を記述するために用いられる場合、非置換化合物に結合された少なくとも１つの水素が、異なる原子または化学部分と交換されることを意味する。

誘導体は、親化合物に類似した物理構造を有するが、誘導体は、親化合物と異なる化学的および／または生物学的性質を有しうる。そのような性質としては、親化合物の活性の増加または減少、親化合物と比較して新しい活性、増強または低減された生物学的利用能、増強または低減された有効性、ｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏで増強または低減された安定性、および／または増強または低減された吸収性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

一般的には、「生物学的活性」という用語は、化合物（タンパク質またはペプチドを含む）が、ｉｎｖｉｖｏ（すなわち、天然生理学的環境中）またはｉｎｖｉｔｒｏ（すなわち、実験室条件下）で観測または測定したときに、細胞、組織、または生物の代謝過程、生理学的過程、化学的過程、または他の過程に影響を及ぼす少なくとも１つの検出可能な活性を有することを意味する。

本発明によれば、「変調」という用語は、「調節」と同義的に使用可能であり、一般的には、特定の活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを意味する。本明細書で用いられる場合、「アップレギュレート」という用語は、一般的には、特定の活性に関して、誘発、開始、増加、拡張、推進、改善、増強、増幅、促進、または提供のいずれかを記述するために使用可能である。同様に、「ダウンレギュレート」という用語は、一般的には、特定の活性に関して、低下、低減、阻害、寛解、減少、軽減、遮断、または防止のいずれかを記述するために使用可能である。

本発明の一実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸配列はいずれも、指定のアミノ酸配列のＣ末端および／またはＮ末端のそれぞれにフランキングする少なくとも１つ、かつ約２０までの追加の異種アミノ酸を有して、生成可能である。得られるタンパク質またはポリペプチドは、指定のアミノ酸配列で「本質的に構成される」として参照可能である。本発明によれば、異種アミノ酸とは、指定のアミノ酸配列にフランキングして天然に見いだされない（すなわち、ｉｎｖｉｖｏで本質的に見いだされない）、または指定のアミノ酸配列の機能に関連しない、または所与のアミノ酸配列が誘導された生物の標準的コドン使用頻度を用いて天然に存在する配列中のそのようなヌクレオチドが翻訳されたとしても、遺伝子中に生じる指定のアミノ酸配列をコードする天然に存在する核酸配列にフランキングするヌクレオチドによりコードされない、アミノ酸の配列のことである。同様に、「本質的に構成される」という表現は、本明細書の核酸配列に関連して用いられる場合、少なくとも１つ、かつ約６０程度までの追加の異種ヌクレオチドにより、指定のアミノ酸配列をコードする核酸配列の５’および／または３’末端のそれぞれがフランキングされうる、指定のアミノ酸配列をコードする核酸配列を意味する。異種ヌクレオチドは、天然の遺伝子中に生じる指定のアミノ酸配列をコードする核酸配列にフランキングして天然に見いだされないか（すなわち、ｉｎｖｉｖｏで本質的に見いだされない）、またはタンパク質になんらかの追加の機能を付与するもしくは指定のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能を変化させるタンパク質をコードしない。

本発明によれば、「選択的に結合する」という表現は、本発明に係る抗体、抗原結合フラグメント、または結合パートナーが指定のタンパク質に優先的に結合する能力を意味する。より特定的には、「選択的に結合する」という表現は、一方のタンパク質から他方のタンパク質への（たとえば、抗体、そのフラグメント、または結合パートナーから抗原への）特異的結合を意味し、結合のレベルは、任意の標準的アッセイ（たとえば、イムノアッセイ）により測定したときに、アッセイのバックグラウンド対照よりも統計的に有意に高い。たとえば、イムノアッセイを行う場合、対照は、典型的には、抗体または抗原結合フラグメントを単独で含有する反応ウェル／チューブを含み（すなわち、抗原の不在下）、抗原の不在下での抗体またはその抗原結合フラグメントによる反応性の量（たとえば、ウェルへの非特異的結合）は、バックグラウンドであるとみなされる。結合は、酵素イムノアッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロットアッセイなど）をはじめとする当技術分野で標準的であるさまざまな方法を用いて、測定可能である。

本発明に使用されるタンパク質またはポリペプチドへの一般的参照には、全長タンパク質、もしくは任意の断片、ドメイン（構造性、機能性、もしくは免疫原性）、コンフォメーショナルエピトープ、または所与のタンパク質の相同体もしくは変異体が含まれる。融合タンパク質もまた、一般的には、タンパク質またはポリペプチドとして参照されうる。単離されたタンパク質とは、本発明によれば、その天然環境から取り出された（すなわち、人為的操作を受けた）、かつたとえば、精製タンパク質、部分精製タンパク質、組換え産生タンパク質、および合成タンパク質を含みうる、タンパク質（ポリペプチドまたはペプチドを含む）のことである。したがって、「単離」は、タンパク質が精製された程度を反映しない。好ましくは、本発明に係る単離されたタンパク質は、組換え産生される。本発明によれば、「修飾」および「突然変異」という用語は、とくに本明細書に記載のタンパク質のアミノ酸配列もしくはその一部（または核酸配列）に対する修飾／突然変異に関して、同義的に使用可能である。

本明細書で用いられる場合、「相同体」または「変異体」という用語は、参照タンパク質またはペプチドに小変更を加えることにより参照タンパク質またはペプチド（すなわち、「プロトタイプ」または「野生型」タンパク質）と異なるが、天然に存在する基本タンパク質およびの側鎖の構造を維持する、タンパク質またはペプチドを意味すべく使用される。そのような変化としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：１つまたは少数のアミノ酸側鎖の変化、欠失（たとえば、タンパク質またはペプチドのトランケートのバージョン）、挿入、および／または置換を含む、１つまたは少数のアミノ酸の変化、１つまたは少数の原子の立体化学の変化、および／またはわずかな誘導体化、限定されるものではないが、たとえば、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加。相同体または変異体は、参照のタンパク質またはペプチドと比較して、向上した性質、低減された性質、または実質的に類似の性質を有しうる。相同体または変異体は、タンパク質のアゴニストまたはタンパク質のアンタゴニストを含みうる。相同体または変異体は、タンパク質を作製するための当技術分野で公知の技術を用いて、たとえば、限定されるものではないが、単離された参照タンパク質に対する直接修飾により、直接タンパク質合成により、またはたとえば、ランダム突然変異誘発もしくは標的突然変異誘発を行ってタンパク質変異体のコードをもたらす伝統的なまたは組換えによるＤＮＡ技術を用いた、タンパク質をコードする核酸配列の修飾により、作製可能である。それに加えて、参照タンパク質の天然に存在する変異体は、存在してもよく（たとえば、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、または個体差から生じうる他の天然変異体）、本発明で単離、作製、および／または利用されうる。

所与のタンパク質の相同体または変異体は、参照タンパク質のアミノ酸配列に（たとえば、本明細書に指定されたアミノ酸配列または指定のタンパク質のアミノ酸配列）に対して、少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％の同一性、または少なくとも約８７％の同一性、または少なくとも約８８％の同一性、または少なくとも約８９％の同一性、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％の同一性、または少なくとも約９２％の同一性、または少なくとも約９３％の同一性、または少なくとも約９４％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性、または少なくとも約９６％の同一性、または少なくとも約９７％の同一性、または少なくとも約９８％の同一性、または少なくとも約９９％の同一性（または整数増分で４５％〜９９％の間の任意の同一性パーセント）であるアミノ酸配列を含みうるか、それらで本質的に構成されうるか、またはそれらで構成されうる。一実施形態では、相同体または変異体は、参照タンパク質のアミノ酸配列に対して、１００％未満の同一性、約９９％未満の同一性、約９８％未満の同一性、約９７％未満の同一性、約９６％未満の同一性、約９５％未満の同一性など、およびそれに続いて１％の増分で約７０％未満までの同一性であるアミノ酸配列を含むか、それらで本質的に構成されるか、またはそれらで構成される。

本明細書で用いられる場合、とくに明記されていないかぎり、同一性パーセント（％）という用語の意味は、以下を用いて行われる相同性の評価を意味する：（１）標準的デフォルトパラメーターでアミノ酸検索に対してはｂｌａｓｔｐを用いるおよび核酸検索に対してはｂｌａｓｔｎを用いる基本的局所アライメント検索ツール（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）の基本的相同性検索（クエリー配列は、デフォルトにより低複雑性領域に対してフィルター処理される）（たとえば、アルチュル，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）、マッデン，Ｔ．Ｌ．（Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．）、シェーファー，Ａ．Ａ．（Ｓｃｈａｅａｅｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．）、チャン，Ｊ．（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．）、チャン，Ｚ．（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．）、ミラー，Ｗ．（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．）、およびリップマン，Ｄ．Ｊ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．）著、１９９７年、“ギャップ付きＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム（ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅ
ｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒａｍｓ）”、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９〜３４０２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）、（２）２つの配列のＢＬＡＳＴアライメント（たとえば、以下に記載のパラメーターを使用する）、（３）および／または標準的デフォルトパラメーターによるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（位置特異的反復ＢＬＡＳＴ）。２つの配列に対して基本的ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴとの間で標準的パラメーターにいくつかの差があるので、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、２つの特定配列が有意な相同性を有すると認識されることがあり、一方、クエリー配列として配列の１つを用いて基本的ＢＬＡＳＴで行った検索では、最大一致で第２の配列が同定されないことがある点に留意されたい。それに加えて、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、配列相同体を探索する感度の高い方法である「プロファイル」検索の自動化された使いやすいバージョンを提供する。このプログラムでは、最初にギャップ付きＢＬＡＳＴデータベース検索を行う。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムでは、戻された任意の有意なアライメントからの情報を用いて、位置特異的スコアマトリックスを構築し、これでクエリー配列を置き換えて、次のラウンドのデータベース検索を行う。したがって、これらのプログラムのいずれか１つを用いて同一性パーセントを決定可能であることを理解すべきである。

タツソバ（Ｔａｔｕｓｏｖａ）およびマッデン（Ｍａｄｄｅｎ）著、１９９９年、“Ｂｌａｓｔ２配列−タンパク質および核酸の配列を比較するための新しいツール（Ｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａｎｅｗｔｏｏｌｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）”、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ．）、第１７４巻、ｐ．２４７〜２５０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＢＬＡＳＴを用いて２つの特定配列を互いにアライメントすることが可能である。そのような配列アライメントは、得られたアライメントへのギャップ（欠失および挿入）の導入を可能にして２つの配列間でギャップ付きＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ２．０）を行うＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて、ｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎで行われる。ここで明確にすることを目的として、以下の標準的デフォルトパラメーターを用いて、２つの配列に対するＢＬＡＳＴ配列アライメントを行う。

ｂｌａｓｔｎでは、０ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いる：
マッチに対するリウォード＝１
ミスマッチに対するペナルティー＝−２
オープンギャップ（５）および伸長ギャップ（２）ペナルティー
ギャップｘ＿ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（１１）フィルター（オン）
ｂｌａｓｔｐでは、０ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いる：
オープンギャップ（１１）および伸長ギャップ（１）ペナルティー
ギャップｘ＿ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（３）フィルター（オン）
単離された核酸分子は、その天然環境から取り出された（すなわち、人為的操作を受けた）核酸分子であり、その天然環境は、核酸分子が天然に見いだされるゲノムまたは染色体である。したがって、「単離」は、必ずしも核酸分子の精製度を反映するわけではなく、分子が、全ゲノムまたは全染色体または核酸分子が天然に見いだされる１つ超の遺伝子を含有するゲノムセグメントを含まないことを示している。単離された核酸分子は、完全遺伝子を含みうる。遺伝子を含む単離された核酸分子は、そのような遺伝子を含む染色体の断片ではなく、遺伝子に関連付けられるコード領域および調節領域を含むが、同一染色体上に天然に見いだされる追加の遺伝子ではない。単離された核酸分子はまた、遺伝子の一部を含みうる。単離された核酸分子はまた、天然に指定の核酸配列を通常はフランキングしない追加の核酸（すなわち、異種配列）によりフランキングされた（すなわち、配列の５’および／または３’末端が）指定の核酸配列を含みうる。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体（たとえば、ｃＤＮＡ）を含みうる。「核酸分子」という表現は、主に物理的核酸分子を意味し、「核酸配列」という表現は、主に核酸分子上のヌクレオチド配列を意味するが、２つの表現は、とくに、タンパク質またはタンパク質のドメインをコードしうる核酸分子または核酸配列に関して同義的に使用可能である。

組換え核酸分子は、トランスフェクト細胞内で核酸分子の発現を効果的に調節可能な任意の転写制御配列の少なくとも１つに機能的に連結された、本明細書に記載のいずれか１つまたは複数のタンパク質をコードするいずれかの核酸配列の少なくとも１つを含みうる分子である。「核酸分子」という表現は、主に物理的核酸分子を意味し、「核酸配列」という表現は、主に核酸分子上のヌクレオチド配列を意味するが、２つの表現は、とくに、タンパク質をコードしうる核酸分子または核酸配列に関して同義的に使用可能である。それに加えて、「組換え分子」という表現は、主に転写制御配列に機能的に連結された核酸分子を意味するが、動物に投与される「核酸分子」という表現と同義的に使用可能である。

組換え核酸分子は、本発明に係る融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に機能的に連結された、任意の核酸配列、典型的には異種配列である組換えベクターを含み、融合タンパク質の組換え産生を可能にするとともに、本発明に従って宿主細胞内への核酸分子の送達を可能にする。そのようなベクターは、ベクターに挿入される単離された核酸分子に天然では近接して見いだされない核酸配列を含有可能である。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでも、原核または真核のいずれでも可能であり、本発明では、好ましくは、酵母にトランスフェクトするのに有用なプラスミドである。組換えベクターは、核酸分子のクローニング、配列決定、および／または他の操作で使用可能であり、そのような分子（たとえば、ＤＮＡ組成物またはウイルスベクターベースの組成物におけるように）の送達に使用可能である。組換えベクターは、好ましくは、核酸分子の発現に使用され、発現ベクターとしても参照可能である。好ましい組換えベクターは、酵母などのトランスフェクト宿主細胞内で発現可能である。

本発明に係る組換え分子では、核酸分子は、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、宿主細胞に適合可能であるかつ本発明に係る核酸分子の発現を制御する他の調節配列などの調節配列を含有する発現ベクターに機能的に連結される。特定的には、本発明に係る組換え分子は、１つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結された核酸分子を含む。「機能的に連結される」という表現は、宿主細胞内にトランスフェクト（すなわち、トランスフォーム、トランスデュース、またはトランスフェクト）した時、分子が発現されるように、核酸分子を発現制御配列に連結することを意味する。

本発明によれば、「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸分子（すなわち、組換え核酸分子）を細胞内に挿入可能な任意の方法を意味すべく使用される。そのような用語が、藻類、細菌、酵母などの微生物細胞内への核酸分子の導入を意味すべく使用される場合、「トランスフォーメーション」という用語は、「トランスフェクション」という用語と同義的に使用可能である。微生物系では、「トランスフォーメーション」という用語は、微生物による外因性核酸の獲得に起因して遺伝変化を記述すべく使用され、「トランスフェクション」という用語と本質的に同義である。したがって、トランスフェクション技術としては、トランスフォーメーション、細胞化学処理、粒子照射、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染、およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これに限定されない。

以下の実験結果は、例示を目的として提供されたものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
（実施例）
実施例１
以下の実施例では、ＧＩ−６１０１として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の作製を説明する。

この実験では、銅誘導プロモーターＣＵＰ１または構成的プロモーターＴＥＦ２の制御下でヒトＭＵＣ１抗原を発現させて酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を作製すべく、酵母（サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を遺伝子操作した。いずれの場合も、以下の配列エレメントをＮ末端からＣ末端の方向にインフレームで融合した単一のポリペプチドとして、配列番号１５により表される、ＭＵＣ１抗原を含む融合タンパク質を作製した：（１）ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤセグメント（配列番号１５の位置１〜５９）、（２）２つのＶＮＴＲドメインを含むＶＮＴＲセグメント（配列番号１５の位置６０〜１００）、（３）ＭＵＣ１ＴＭドメイン（配列番号１５の位置１０１〜１２８）、および（４）ＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１５の位置１２９〜２００）。この融合タンパク質は、ＭＵＣ１シグナル配列（配列番号１４の位置１〜３０）をさらに含んでいた。このＭＵＣ１シグナル配列は、プロテアソーム分解に対する耐性を付与するようにおよび／または発現を安定化させるように設計されたさまざまなＮ末端配列、たとえば、配列番号２１により表されるペプチドまたは配列番号１９もしくは配列番号２０などの酵母αリーダー配列由来のＮ末端ペプチドで置換可能である。Ｎ末端ＭＵＣ１シグナル配列と、タンパク質の同定および／または精製を容易にするヘキサヒスチジンＣ末端タグと、を含む完全融合タンパク質は、配列番号１４により表される、Ｎ末端からＣ末端の方向にインフレームで融合された次の配列エレメントを有する単一のポリペプチドである：（１）ＭＵＣ１シグナル配列（配列番号１４の位置１〜３０）、（２）ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤセグメント（配列番号１４の位置３１〜８９）、（３）２つのＶＮＴＲドメインを含むＶＮＴＲセグメント（配列番号１４の位置９０〜１３０）、（４）ＭＵＣ１ＴＭドメイン（配列番号１４の位置１３１〜１５８）、（５）ＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１４の位置１５９〜２３０）、および（６）ヘキサペプチドヒスチジンタグ（配列番号１４の位置２３１〜２３６）。配列番号１４は、配列番号１３により表されるヌクレオチド配列によりコードされる（酵母発現用にコドン最適化）。

簡潔に述べると、ＭＵＣ１抗原をコードするＤＮＡを合成し、次いで、酵母２μｍ発現ベクター中のＣＵＰ１プロモーター（ベクターｐＧＩ−１００）またはＴＥＦ２プロモーター（ベクターｐｌｕ０１１）の後のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩクローニング部位に挿入した。配列番号１４により表される完全融合タンパク質をコードするように、Ｃ末端ヘキサヒスチジンペプチドをコードするヌクレオチド配列をプラスミドベクターに追加した。得られたプラスミドを、プラスミドの貯蔵のためにＤＨ５αに、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の作製のために、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３αに、トランスフォームした。

サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へのトランスフォーメーションを酢酸リチウム／ポリエチレングリコールトランスフェクションにより行い、ウラシルの欠如した固体最小プレート（ＵＤＭ；ウリジンドロップアウト培地（ｕｒｉｄｉｎｅｄｒｏｐｏｕｔｍｅｄｉｕｍ））上で一次トランスフェクタントを選択した。Ｕ２（ウリジンドロップアウト培地）またはＵＬ２（ウリジンおよびロイシンドロップアウト培地）の培地中、３０℃で増殖することにより、コロニーを選択した。

ＴＥＦ２プロモーターの制御下にある配列番号１４により表されるヒトＭＵＣ１融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、本明細書ではＧＩ−６１０１としても参照される。

以上に記載のプレートおよびスターター培養物を用いてウリジンの欠如した液体培養物（Ｕ２）またはウリジンおよびロイシンの欠如した液体培養物（ＵＬ２）に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで約２４時間増殖させた。また、４．２ｇ／Ｌのビス−トリスを含有するｐＨ緩衝ＵＬ２培地（ＢＴ−ＵＬ２）に凍結酵母バンクから接種し、中性ｐＨ製造条件下で作製された酵母−ＭＵＣ１免疫療法剤を評価した（データは示されていない）。ｐＨ緩衝ＵＬ２培地中での培養により酵母細胞壁上にβ−グルカンが露出したので、抗原提示細胞上でのデクチン受容体との相互作用の修飾の結果として酵母により誘導される細胞免疫反応が修飾されると考えられる。Ｕ２、ＵＬ２、またはＢＴ−ＵＬ２のいずれを使用した場合にも、残りの培養条件は同一であった。初代培養物を用いて同一処方の最終培養物に接種した。

Ｕ２液体培地の処方：
１５ｇ／Ｌのグルコース
６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素源
各０．０４ｇ／Ｌのヒスチジン、トリプトファン、アデニン、および０．０６ｇ／Ｌのロイシン
ＵＬ２液体培地の処方：
１５ｇ／Ｌのグルコース
６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素源
各０．０４ｇ／Ｌのヒスチジン、トリプトファン、およびアデニン
異なるプロモーターの制御下にある酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物を比較する初期の実験では、ＣＵＰ１駆動（誘導発現）酵母−ＭＵＣ１発現を二工程または三工程の培養で引き起こした。すなわち、スターターまたは中間培養物が中間対数期（１．５〜４Ｙ．Ｕ．／ｍｌ）に達した後、中間培養物から０．１または０．２Ｙ．Ｕ．／ｍＬに希釈された最終培養物に０．３７５ｍＭの硫酸銅を添加することにより、発現を開始し、培養物が１．５〜３Ｙ．Ｕ．の密度に達するまで継続した。ＴＥＦ−２駆動酵母−ＭＵＣ１発現は構成的であり、培養物が１．１〜４．０Ｙ．Ｕ．／ｍｌの密度に達するまで、これらの細胞の増殖を継続した。次いで、各培養物からの細胞を採取し、洗浄し、ＰＢＳ中、５６℃で１時間熱死滅させた。

培養物の熱死滅後、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄した。ＴＣＡ沈殿／ニトロセルロース結合アッセイにより、および抗ｈｉｓタグモノクローナル抗体および抗ＭＵＣ１（ＶＮＴＲ）抗体（ｓｃ−７３１３、サンタクルーズ）を用いたウェスタンブロットにより、全タンパク質発現を測定した。半定量的ディジタルイメージング方法を用いてタンパク質含有量を定量した。ＧＩ−６１０１は、約２５ｋＤａの膜関連タンパク質としてＭＵＣ１融合タンパク質を発現すると予想された。

図２Ａは、検出用の抗ＭＵＣ１（ＶＮＴＲ）抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いたＧＩ−６１０１中のＭＵＣ１抗原の発現を示している。これらの結果から、ＭＵＣ１タンパク質の良好な発現が示された。図２Ｂは、ＥｄｏＨまたはＰＮＧａｓｅＦのいずれかによる脱グリコシル化の後のＧＩ−６１０１のＭＵＣ１抗原を示している。この図から、融合タンパク質のサイズは、脱グリコシル化前、推定よりも大きいが、ＥｄｏＨまたはＰＮＧａｓｅＦによる脱グリコシル化後、予想サイズ（２５ｋＤａ）に減少するので、ＧＩ−６１０１融合タンパク質は、グリコシル化産物として発現されることが示される。

標準的培養条件下で増殖させたＧＩ−６１０１の抗原発現の定量を、以上に記載の中性ｐＨ条件下で増殖させたＧＩ−６１０１と比較した。抗原発現のレベルは、いずれのプロセスを用いてもほぼ同一であった（データは示されていない）。これは、中性ｐＨプロセスは、酵母によるＭＵＣ１抗原発現のレベルを変化させないことを実証している。

実施例２
以下の実施例では、ＧＩ−６１０４として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の作製を説明した。

この実験では、銅誘導プロモーターＣＵＰ１または構成的プロモーターＴＥＦ２の制御下でヒトＭＵＣ１抗原を発現させて酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を作製すべく、酵母（サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を遺伝子操作した。いずれの場合も、以下の配列エレメントをＮ末端からＣ末端の方向にインフレームで融合した単一のポリペプチドとして、配列番号１８により表される、ＭＵＣ１抗原を含む融合タンパク質を作製した：配列番号１８は、Ｎ末端からＣ末端の方向に次の順に、次のＭＵＣ１抗原を含む：（１）第１のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１８の位置１〜７２）、（２）第２のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１８の位置７３〜１４４）、および（３）第３のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１８の位置１４５〜２１６）。この融合タンパク質は、プロテアソーム分解に対する耐性を付与するようにおよび／または発現を安定化するように設計されたＮ末端配列をさらに含んでいた（配列番号２１によりこの融合タンパク質中に示される）。他の選択肢として、融合タンパク質は、ＭＵＣ１シグナル配列（たとえば、配列番号１４の位置１〜３０）、本明細書に記載のさまざまな合成Ｎ末端ペプチド、または配列番号１９または配列番号２０などの酵母αリーダー配列由来のＮ末端ペプチドを用いて、設計しうる。Ｎ末端ペプチドと、タンパク質の同定および／または精製を容易にするヘキサヒスチジンＣ末端タグと、を含む完全融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向にインフレームで融合された次の配列エレメントを有する単一のポリペプチドである（配列番号１７により表される）：（１）配列番号２１により表される合成ペプチド（配列番号１７の位置１〜６）、（２）第１のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１７の位置７〜７８）、（３）第２のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１７の位置７９〜１５０）、（４）第３のＭＵＣ１ＣＤ（配列番号１７の位置１５１〜２２２）、および（５）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１７の位置２２３〜２２８）。配列番号１７は、配列番号１６により表されるヌクレオチド配列によりコードされる（酵母発現用にコドン最適化）。

簡潔に述べると、ＭＵＣ１抗原をコードするＤＮＡを合成し、次いで、酵母２μｍ発現ベクター中のＣＵＰ１プロモーター（ベクターｐＧＩ−１００）またはＴＥＦ２プロモーター（ベクターｐｌｕ０１１）の後のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔｌクローニング部位に挿入した。配列番号１７により表される完全融合タンパク質をコードするように、Ｃ末端ヘキサヒスチジンペプチドをコードするヌクレオチド配列をプラスミドベクターに追加した。得られたプラスミドを、プラスミドの貯蔵のためにＤＨ５αに、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の作製のために、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３αに、トランスフォームした。

サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へのトランスフォーメーションを酢酸リチウム／ポリエチレングリコールトランスフェクションにより行い、ウラシルの欠如した固体最小プレート（ＵＤＭ；ウリジンドロップアウト培地）上で一次トランスフェクタントを選択した。３０℃でＵ２（ウリジンドロップアウト培地）またはＵＬ２（ウリジンおよびロイシンドロップアウト培地）の培地中で増殖することにより、コロニーを選択した。

ＣＵＰ１プロモーターの制御下にある配列番号１７により表されるヒトＭＵＣ１融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、本明細書ではＧＩ−６１０４としても参照される。

以上に記載のプレートおよびスターター培養物を用いてウリジンの欠如した液体培養物（Ｕ２）またはウリジンおよびロイシンの欠如した液体培養物（ＵＬ２）（培地処方は実施例１に提供される）に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで約２４時間増殖させた。また、４．２ｇ／Ｌのビス−トリスを含有するｐＨ緩衝ＵＬ２培地（ＢＴ−ＵＬ２）に凍結酵母バンクから接種し、中性ｐＨ製造条件下で作製された酵母−ＭＵＣ１免疫療法剤を評価した（データは示されていない）。ｐＨ緩衝ＵＬ２培地中での培養により酵母細胞壁上にβ−グルカンが露出したので、抗原提示細胞上でのデクチン受容体との相互作用の修飾の結果として酵母により誘導される細胞免疫反応が修飾されると考えられる。ＵＬ２またはＢＴ−ＵＬ２のいずれを使用した場合にも、残りの培養条件は同一であった。初代培養物を用いて同一処方の最終培養物に接種した。

異なるプロモーターの制御下にある酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物を比較する初期の実験では、ＣＵＰ１駆動（誘導発現）酵母−ＭＵＣ１発現を二工程または三工程の培養で引き起こした。すなわち、スターターまたは中間培養物が中間対数期（１．５〜４ＹＵ／ｍｌ）に達した後、中間培養物から０．１または０．２ＹＵ／ｍＬに希釈された最終培養物に０．３７５ｍＭの硫酸銅を添加することにより、抗原発現を開始し、培養物が１．５〜３Ｙ．Ｕ．の密度に達するまで継続した。また、最終酵母−ＭＵＣ１培養物が約２Ｙ．Ｕ．／ｍｌの密度を達した後、０．３７５ｍＭの硫酸銅を添加することにより、ＣＵＰ１駆動（誘導発現）酵母−ＭＵＣ１発現を開始し、４〜６時間誘導した。ＴＥＦ２駆動酵母−ＭＵＣ１発現は構成的であり、培養物が１．１〜４．０Ｙ．Ｕ．／ｍｌの密度に達するまで、これらの細胞の増殖を継続した。次いで、各培養物からの細胞を採取し、洗浄し、ＰＢＳ中、５６℃で１時間熱死滅させた。

培養物の熱死滅後、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄した。ＴＣＡ沈殿／ニトロセルロース結合アッセイにより、および抗ｈｉｓタグモノクローナル抗体および抗ＭＵＣ１（Ｃ末端）抗体（ｓｃ−６８２７、サンタクルーズ）を用いたウェスタンブロットにより、全タンパク質発現を測定した。半定量的ディジタルイメージング方法を用いてタンパク質含有量を定量した。ＧＩ−６１０４は、約２５ｋＤａのサイトゾルタンパク質としてＭＵＣ１融合タンパク質を発現すると予想された。

図２Ｃは、検出用の抗ＭＵＣ１（Ｃ末端）抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いたＧＩ−６１０４中のＭＵＣ１抗原の発現を示している。これらの結果から、ＭＵＣ１融合タンパク質の良好な発現が示された。図２Ｂは、ＥｄｏＨよる脱グリコシル化の後のＧＩ−６１０４のＭＵＣ１抗原を示している。この図から、融合タンパク質のサイズがＥｄｏＨによる脱グリコシル化の前後で同一であるので、ＧＩ−６１０４融合タンパク質は、グリコシル化産物として発現されないことが示される。

標準的培養条件下で増殖させたＧＩ−６１０４の抗原発現の定量を、以上に記載の中性ｐＨ条件下で増殖させたＧＩ−６１０４と比較した。抗原発現のレベルは、いずれのプロセスを用いてもほぼ同一であった（データは示されていない）。これは、中性ｐＨプロセスは、酵母によるＭＵＣ１抗原発現のレベルを変化させないことを実証している。

実施例３
以下の実施例では、ＧＩ−６１０５として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の作製を説明する。

この実験では、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下でヒトＭＵＣ１抗原を発現させて酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を作製すべく、酵母（サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を遺伝子操作した。テンプレートとしてＧＩ−６１０１（実施例１参照）の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の抗原を用いて、ＭＵＣ１アゴニスト抗原を設計した。簡潔に述べると、以下の配列エレメントをＮ末端からＣ末端の方向にインフレームで融合した単一のポリペプチドとして、配列番号２３により表される、ＭＵＣ１アゴニスト抗原を含む融合タンパク質を作製した：（１）ＭＵＣ１シグナル配列（配列番号２３の位置１〜３０）、（２）ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤセグメント（配列番号２３の位置３１〜８９）、（３）２つのＶＮＴＲドメインを含むＶＮＴＲセグメント（配列番号２３の位置９０〜１３０）、（４）ＭＵＣ１ＴＭドメイン（配列番号２３の位置１３１〜１５８）、（５）ＭＵＣ１ＣＤ（配列番号２３の位置１５９〜２３０）、（６）ＭＵＣ１アゴニストエピトープ（配列番号２３の位置２３１〜２４６）、および（７）ヘキサペプチドヒスチジンタグ（配列番号２３の位置２４７〜２５２）。配列番号２３は、配列番号２２により表されるヌクレオチド配列によりコードされる（酵母発現用にコドン最適化）。ＭＵＣ１シグナル配列（配列番号２３の位置１〜３０）は、プロテアソーム分解に対する耐性を付与するようにおよび／または発現を安定化させるように設計されたさまざまなＮ末端配列、たとえば、配列番号２１により表されるペプチドまたは配列番号１９や配列番号２０などの酵母αリーダー配列由来のＮ末端ペプチドで置換可能である。ヘキサヒスチジンＣ末端タグは、任意選択であり、タンパク質の同定および／または精製を容易にする。ＧＩ−６１０１中の抗原（たとえば、配列番号１４または１５）と比較して、ＧＩ−６１０５中の配列は、さまざまなアゴニストエピトープを形成するように次のアミノ酸置換を含有する（置換位置は、配列番号２３を基準にして、さらには受託番号ＮＰ＿００１１９１２１４により表される野生型ＭＵＣ１の置換位置を基準にして、与えられる）：Ａ９６Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置１６１）、Ｐ９７Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置１６２）、Ｇ１０４Ｖ（野生型ＭＵＣ１の位置１６９）、Ｓ１０５Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置１７０）、Ｔ１０６Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置１７１）、Ａ１４７Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置３９２）、Ｃ１６１Ｖ（野生型ＭＵＣ１の位置４０６）、Ｔ１９９Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置４４４）、Ｄ２００Ｆ（野生型ＭＵＣ１の位置４４５）、Ｓ２１５Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置４６０）、およびＴ２３９Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置９３）。

ＧＩ−６１０５（配列番号２３）のＭＵＣ１アゴニスト抗原を含有するプラスミドをＷ３０３α酵母にトランスフェクトし、ウリジンドロップアウト寒天（ＵＤＡ：ｕｒｉｄｉｎｅｄｒｏｐｏｕｔａｇａｒ）上、３０℃で３日間増殖した後、形質転換体を選択した。単一のコロニーをウリジンおよびロイシンドロップアウト寒天（ＵＬＤＡ：ｌｅｕｃｉｎｅｄｒｏｐｏｕｔａｇａｒ）プレート上に再ストリークし、３０℃でさらに４日間インキュベートし、高プラスミドコピー数を有する細胞を選択した。

ＧＩ−６１０５の単一コロニーをＵＬＤＡプレートから取り出し、それを用いて２５ｍＬのＵＬ２液体培地（スターター培養物）に接種した。３０℃で振盪しながら３．７ＹＵ／ｍＬの密度までスターター培養物をインキュベートし、次いで、それを用いて０．３ＹＵ／ｍＬになるように中間培養物に接種した。中間培養物を３．０ＹＵ／ｍＬの密度まで増殖させ、次いで、それを用いて０．０４ＹＵ／ｍＬの密度になるように最終培養物に接種した。最終培養物を３．６ＹＵ／ｍＬの密度まで増殖させ、次いで、３０℃で０．５ｍＭ硫酸銅により３時間処理し、Ｍｕｃｌアゴニストｖ１．０抗原発現を誘導した。

誘導細胞をＰＢＳで１回洗浄し、５６℃１時間で熱死滅させ、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。熱死滅細胞の全タンパク質含有量をアミドシュワルツアッセイにより測定し、Ｃ末端ヘキサヒスチジンエピトープタグを認識するモノクローナル抗体を用いて抗原含有量をウェスタンブロットにより測定した。ｈｉｓタグ付けＨＣＶＮＳ３タンパク質で構成された標準曲線に対して補間により、抗原量を決定した。図３に示されるように、抗原が酵母により発現され、ＧＩ−６１０５の抗原含有量は、約２８０１Ｎｇ／ＹＵであると推定された。

実施例４
以下の実施例では、ＧＩ−６１０６として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物の作製を説明する。

この実験では、銅誘導プロモーターＣＵＰ１の制御下でヒトＭＵＣ１抗原を発現させて酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を作製すべく、酵母（サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を遺伝子操作した。受託番号ＮＰ＿００１１９１２１４を有する全長野生型ＭＵＣ１抗原を用いてＭＵＣ１アゴニスト抗原を設計したが、他の野生型ＭＵＣ１タンパク質を利用して類似のアゴニストを設計することが可能である。簡潔に述べると、以下の配列エレメントをＮ末端からＣ末端の方向にインフレームで融合した単一のポリペプチドとして、配列番号２５により表される、ＭＵＣ１アゴニスト抗原を含む融合タンパク質を作製した：（１）配列番号１９により本明細書の他の箇所で開示されたα因子リーダー配列（配列番号２５の位置１〜８９）、（２）Ｔｈｒ−Ｓｅｒのリンカー配列（配列番号２５の位置９０〜９１）、（３）１１個のアゴニストエピトープの導入を除けば野生型タンパク質に対応する全長ＭＵＣ１アゴニストタンパク質（配列番号２５の位置９２〜５６６）、および（７）ヘキサペプチドヒスチジンタグ（配列番号２５の位置５６７〜５７２）。配列番号２５は、配列番号２４により表されるヌクレオチド配列によりコードされる（酵母発現用にコドン最適化）。αリーダー配列（配列番号２５の位置１〜８９）は、プロテアソーム分解に対する耐性を付与するようにおよび／または発現を安定化させるように設計されたさまざまなＮ末端配列、たとえば、配列番号２１により表されるペプチド、または配列番号２０などのさまざまな酵母αリーダー配列由来のＮ末端ペプチド、またはＭＵＣ１シグナル配列で置換可能である。ヘキサヒスチジンＣ末端タグは、任意選択であり、タンパク質の同定および／または精製を容易にする。テンプレートとして使用される野生型ＭＵＣ１タンパク質と比較して、ＧＩ−６１０６の配列は、さまざまなアゴニストエピトープを形成するように次のアミノ酸置換を含有する（置換位置は、配列番号２５を基準にして、さらには受託番号ＮＰ＿００１１９１２１４により表される野生型ＭＵＣ１の置換位置を基準にして、与えられる）：Ｔ１８４Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置９３）、Ａ２３２Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置１６１）、Ｐ２３３Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置１６２）、Ｇ２４０Ｖ（野生型ＭＵＣ１の位置１６９）、Ｓ２４１Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置１７０）、Ｔ２４２Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置１７１）、Ａ４８３Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置３９２）、Ｃ４９７Ｖ（野生型ＭＵＣ１の位置４０６）、Ｔ５３５Ｌ（野生型ＭＵＣ１の位置４４４）、Ｄ５３６Ｆ（野生型ＭＵＣ１の位置４４５）、およびＳ５５１Ｙ（野生型ＭＵＣ１の位置４６０）。

ＧＩ−６１０６のＭＵＣ１アゴニスト抗原を含有するプラスミドをＷ３０３α酵母にトランスフェクトし、ウリジンドロップアウト寒天（ＵＤＡ）上、３０℃で３日間増殖した後、形質転換体を選択した。単一のコロニーをウリジンおよびロイシンドロップアウト寒天（ＵＬＤＡ）プレート上に再ストリークし、３０℃でさらに４日間インキュベートし、高プラスミドコピー数を有する細胞を選択した。

ＧＩ−６１０６の単一コロニーをＵＬＤＡプレートから取り出し、それを用いて２５ｍＬのＵＬ２液体培地（スターター培養物）に接種した。３０℃で振盪しながら約３ＹＵ／ｍＬの密度までスターター培養物をインキュベートし、次いで、それを用いて０．３ＹＵ／ｍＬになるように中間培養物に接種した。中間培養物を３ＹＵ／ｍＬの密度まで増殖させ、次いで、０．０４ＹＵ／ｍＬの密度になるように最終培養物に接種した。最終培養物を３ＹＵ／ｍＬの密度まで増殖させ、次いで、３０℃で０．５ｍＭ硫酸銅により３時間処理し、Ｍｕｃｌアゴニストｖ２．０抗原発現を誘導した。

誘導細胞をＰＢＳで１回洗浄し、５６℃１時間で熱死滅させ、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。熱死滅細胞の全タンパク質含有量をアミドシュワルツアッセイにより測定し、Ｃ末端ヘキサヒスチジンエピトープタグを認識するモノクローナル抗体を用いて抗原含有量をウェスタンブロットにより測定した。ｈｉｓタグ付けＨＣＶＮＳ３タンパク質で構成された標準曲線に対して補間により、抗原量を決定した。結果から、ＧＩ−６１０６酵母は、抗原を発現したことが示され（データは示されていない）、ＧＩ−６１０６の抗原含有量は、約２９４０Ｎｇ／ＹＵであると推定された。

実施例５
以下の実施例では、ヒト樹状細胞に及ぼす酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の影響の表現型分析および機能分析を説明する。

樹状細胞の表現型および機能に及ぼす実施例１および２に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の影響を評価するために、以下の実験を行った。
第１の実験では、ヒト樹状細胞（ＤＣ）を次のものと一緒に４８時間培養した：
（１）培地のみ（未処理）、（２）陽性対照としてＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍｌ）＋リガンド用エンハンサー（１μｇ／ｍｌ）、（３）対照酵母（対照酵母；空のベクターを含む酵母（ＭＵＣ１抗原挿入断片なし）、（４）ＧＩ−６１０１として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物、実施例１に記載の標準的増殖条件下で増殖させた（ＧＩ−６１０１）、（５）ＧＩ−６１０１として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物、実施例１に記載の中性ｐＨ増殖条件下で増殖させた（ＧＩ−６１０１（ＤＥＣ））、（６）ＧＩ−６１０４として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物（ＧＩ−６１０４）、実施例２に記載の標準的増殖条件下で増殖させた、または（７）ＧＩ−６１０４として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物、実施例２に記載の中性ｐＨ増殖条件下で増殖させた（ＧＩ−６１０４（ＤＥＣ））。樹状細胞および酵母を１：１０（ＤＣ：酵母）の比で組み合わせた。ＤＣを採取し、ＤＣ表面マーカ発現に関してフローサイトメトリーにより分析した。結果を陽性細胞のパーセントおよびＭＦＩ（括弧）として以下の表１に示す。

酵母（対照酵母およびＭＵＣ１抗原発現酵母）は、増殖方法にかかわらず、未処理細胞と比較して、樹状細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８３の発現をアップレギュレートしたことが、結果から示される。ＣＤ８０またはＢ７．１は、Ｔ細胞の活性化および生存に必要な共刺激分子であり、活性化樹状細胞上でアップレギュレートされる。ＣＤ８３は、樹状細胞成熟マーカである。したがって、この実験から、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、ＤＣ成熟マーカをアップレギュレート可能であることが示される。

第２の実験では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法剤と共に培養した後、樹状細胞サイトカインおよびケモカイン産生を評価した。簡潔に述べると、正常なドナー（癌でないと考えられたドナー）からのヒトＤＣを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）と共に５日間培養したか、またはＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍｌ、エンゾ・ライフ・サイエンス（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ））＋リガンド用エンハンサー（１μｇ／ｍｌ、エンゾ・ライフ・サイエンス（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ））で２４時間処理したか、または対照酵母（空のベクター）、標準的増殖条件下で培養されたＧＩ−６１０１（ＧＩ−６１０１）、中性ｐＨ条件下で培養されたＧＩ−６１０１（ＧＩ−６１０１（ＤＥＣ））、標準的増殖条件下で培養されたＧＩ−６１０４（ＧＩ−６１０４）、または中性ｐＨ条件下で培養されたＧＩ−６１０４（ＧＩ−６１０４（ＤＥＣ））で４８時間処理した（ＤＣ：酵母比＝１：１０）。培養上清を採取し、多重サイトカイン／ケモカインキットによりサイトカインおよびケモカイン産生に関してスクリーニングした。結果は、ｐｇ／ｍｌ単位で表され、表２に示される。

表２の結果から、実施例１および２に記載の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を用いて正常ドナーからの樹状細胞を処理すると、この細胞によるサイトカインおよびケモカインの産生が増大されることが示される。とくに、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生は、中性ｐＨ条件下で増殖された酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物への暴露後に増大され、ＴＨ１およびＣＤ８＋Ｔ細胞の反応を促進すると予想される。それに加えて、中性ｐＨ条件下で増殖された酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、ＤＣによるより高いサイトカインおよびケモカインの産生を誘導し、ＧＩ−６１０１（中性ｐＨ）として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、ＤＣサイトカインおよびケモカイン産生の最も高い刺激を示す。ボールド体で強調表示された数は、未処理の対照と比較して、統計的に有意に改善されたサイトカイン／ケモカイン誘導を示している（データは示されていない）。

さまざまな正常ドナーから単離された樹状細胞を用いて、表２に示される実験を反復した。結果（データは示されていない）は、表２に示されるものと同等であり、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、樹状細胞によるサイトカインおよびケモカインの産生を誘導し、中性ｐＨ増殖条件下で増殖されたＧＩ−６１０１として知られる酵母−ＭＵＣ１組成物は、各条件下で増殖された２つの酵母−ＭＵＣ１組成物で樹状細胞による最も高レベルのサイトカインおよびケモカインの産生を誘導することが確認される。

まとめると、これらの結果から、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、樹状細胞を活性化可能であり、生産的免疫反応に関連付けられるサイトカインおよびケモカインの産生を誘導可能であることが示される。

実施例６
以下の実施例では、本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物がＭＵＣ１特異的Ｔ細胞を活性化可能であることが示される。

Ｔ−３−Ｐ９３Ｌは、ＨＬＡ−Ａ２との関連でＰ９３Ｌと記されるＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞系である。Ｐ９３Ｌは、全長ＭＵＣ１タンパク質の位置９２〜１０１にわたるペプチドであるが（たとえば、ＡＴＷＧＱＤＶＴＳＶ、配列番号１１の位置９２〜１０１）、ただし、このペプチドの位置２（配列番号１１の位置９２〜１０１中の位置９３）のトレオニンは、ロイシンで置換されてアゴニストペプチドを形成する。Ｐ９３Ｌは、天然（野生型）ペプチドよりも高レベルでＨＬＡ−Ａ２に結合し、天然ペプチドよりも良好なＭＵＣ１特異的Ｔ細胞インデューサーである（より高いＴＨ１サイトカイン産生（米国特許出願公開第２００８／００６３６５３号明細書を参照されたい））。Ｔ細胞系Ｔ−３−Ｐ９３Ｌは、ｉｎｖｉｔｒｏでＨＬＡ−Ａ２陽性、ＭＵＣ１陽性の腫瘍標的を特異的に溶解可能である（データは示されていない）。このＴ細胞系は、ＭＵＣ１−Ｎサブユニット内にあるＭＵＣ１の一部に特異的である。

この実験では、実施例５に記載したように調製された正常ドナーからのＤＣを、以上の実施例５に記載の条件を用いて、実施例１および２に記載の酵母免疫療法組成物で、または対照酵母（空のベクター）、ＣＤ４０Ｌ（陽性対照）、もしくは未処理（陰性対照）で、処理した。対照酵母またはＣＤ４０Ｌで処理されたＤＣを、Ｐ９３Ｌペプチドを用いてまたは用いずにパルスした（Ｐ９３Ｌは、１０μｇ／ｍｌで使用した）。次いで、処理されたＤＣを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用し、ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞系Ｔ−３−Ｐ９３Ｌを刺激するその能力を評価した（Ｔ細胞：ＤＣ比＝１０：１）。２４時間培養上清を採取し、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の分泌に関してスクリーニングした。結果は、Ｔ細胞により産生されたＩＦＮ−γの量としてｐｇ／ｍｌ単位で表３に示されている。

結果から、標準条件下および中性ｐＨ条件下の両方で産生された、かつＭＵＣ１−ＮサブユニットのＶＮＴＲドメインを発現する、ＧＩ−６１０１で処理された樹状細胞は、ＭＵＣ１−Ｎ特異的Ｔ細胞を刺激して有意量のＩＦＮ−γを産生可能であったことが示される。ＭＵＣ１−Ｎタンパク質由来の抗原を発現しないＧＩ−６１０４（ＧＩ−６１０４は、細胞質内ドメイン（ＣＤ）由来のＭＵＣ１抗原のみを発現する）は、ＭＵＣ１−Ｎ特異的Ｔ細胞を刺激しなかった。

第２の実験では、Ｔ−１５−Ｐ１２４０（１Ｙ）と記されるＭＵＣ１−Ｃ−特異的Ｔ細胞株を、以上の実験と同様に処理されたＤＣで刺激して、本発明に係る酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物がこれらのＴ細胞を刺激可能であるかを調べた。Ｔ−１５−Ｐ１２４０（１Ｙ）細胞系は、ＨＬＡ−Ａ２との関連でＭＵＣ１−ＣペプチドであるＰ１２４０（１Ｙ）と記されるＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞系である。Ｐ１２４０（１Ｙ）は、全長ＭＵＣ１タンパク質の位置１２４０〜１２４８にわたるペプチドであるが（たとえば、ＳＬＳＹＴＮＰＡＶ、配列番号１１の位置１２４０〜１２４８）、ただし、このペプチドの位置１（配列番号１１の位置１２４０〜１２４８中の位置１２４０）のセリンは、リシンで置換されてアゴニストペプチドを形成する。Ｐ１２４０（１Ｙ）は、天然（野生型）ペプチドと同様にまたはそれよりも良好にＨＬＡ−Ａ２に結合し、天然ペプチドよりも良好なＭＵＣ１特異的Ｔ細胞インデューサーである（より高いＴＨ１サイトカイン産生）。Ｔ細胞系Ｔ−１５−Ｐ１２４０（１Ｙ）は、ｉｎｖｉｔｒｏでＨＬＡ−Ａ２陽性、ＭＵＣ１陽性の腫瘍標的を特異的に溶解可能である（データは示されていない）。このＴ細胞系は、ＭＵＣ１−Ｃサブユニット内にあるＭＵＣ１の一部、とくに細胞質内ドメイン（ＣＤ）に特異的である。

この実験では、健常ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーのＰＢＭＣからＤＣを生成し、実施例５に記載したように調製した。以上の実施例５に記載の条件を用いて、実施例１および２に記載の酵母免疫療法組成物で、またはＣＤ４０Ｌ（陽性対照）もしくは未処理（陰性対照）で、ＤＣを処理した。ＣＤ４０Ｌで処理されたＤＣを、Ｐ１２４０（１Ｙ）ペプチド（ペプチドは、１０μｇ／ｍｌで使用した）を用いてまたは用いずにパルスした。次いで、処理されたＤＣを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用し、ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞系Ｔ−１５−Ｐ１２４０（１Ｙ）（Ｔ細胞：ＤＣ比＝１０：１）を刺激するその能力を評価した。２４時間培養上清を採取し、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の分泌に関してスクリーニングした。結果は、Ｔ細胞により産生されたＩＦＮ−γの量としてｐｇ／ｍｌ単位で表４に示されている。

結果から、標準条件下または中性ｐＨ条件下に増殖されたＧＩ−６１０１およびＧＩ−６１０４は両方とも、ＭＵＣ１−Ｃ特異的Ｔ細胞を刺激して有意量のＩＦＮ−γを産生可能であったことが示される。中性ｐＨ条件下で増殖された酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物（ＧＩ−６１０１およびＧＩ−６１０４の両方）は、標準条件下で増殖された酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物よりも高レベルでＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を刺激した。

第３の実験では、以上の表４に記載の実験を反復したが、ただし、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物ＧＩ−６１０１およびＧＩ−６１０４で処理されたＤＣに対してさまざまなＤＣ：Ｔ細胞比を用いた。結果は以下の表５に示される。

この場合も、結果から、標準条件下または中性ｐＨ条件下で増殖されたＧＩ−６１０１およびＧＩ−６１０４は両方とも、ＭＵＣ１−Ｃ特異的Ｔ細胞を刺激して有意量のＩＦＮ−γを産生可能であったことが示されるとともに、中性ｐＨ条件下で増殖された組成物は、標準条件下で増殖された酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物よりも高レベルでＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を刺激したことが示される。結果からさらに、Ｔ細胞の数と対比してＤＣの数が増加する用量反応が示される。

まとめると、これら結果から、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物で処理されたＤＣにより刺激されたＴ細胞からのＩＦＮ−γ放出に例示されるように、抗原特異的にＭＵＣ１特異的Ｔ細胞を活性化可能であることが示される。また、これらの結果から、中性ｐＨ条件下で増殖された酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の使用の結果としてＴ細胞によるＩＦＮ−γの産生の利点が示される。

実施例７
以下の実施例では、本発明に係る酵母−ＭＵＣ１組成物が癌患者からのＭＵＣ１特異的Ｔ細胞を増加刺激することが可能であることを実証する。

この実験では、癌患者（化学療法もしくはウイルスワクチン治療を含みうる癌療法による後治療、および／または前治療）のＰＢＭＣからＤＣを調製する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下、５日間培養でＤＣを調製し、続いて、酵母の存在下でインキュベートする（標準条件下または中性ｐＨ条件下に培養されたＧＩ−６１０１および／またはＧＩ−６１０４）。４８時間共培養後、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン産生および／または増殖を測定することにより、ＤＣを自己Ｔ細胞刺激用のＡＰＣとして使用する。酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、癌患者からのＴ細胞を増加活性化すると予想される。

第２の実験では、癌患者（化学療法もしくはウイルスワクチン治療を含みうる癌療法による後治療、および／または前治療）のＰＢＭＣからＤＣを調製する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下、５日間培養でＤＣを調製し、続いて、酵母の存在下でインキュベートする（標準条件下または中性ｐＨ条件下に培養されたＧＩ−６１０１および／またはＧＩ−６１０４）。４８時間共培養後、ＤＣを自己Ｔ細胞刺激用のＡＰＣとして使用する。ＩＶＳの各サイクルは、ＩＬ−２の不在下で３日間、続いて、２０Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２の存在下で４日間で構成される。ＭＵＣ１ペプチドに特異的な四量体を用いて、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を用いた治療により増加されるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを検出する。酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、癌患者からのＴ細胞を増加活性化すると予想される。

第３の実験では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物を用いて、ＭＵＣ１発現標的を溶解するＰＢＭＣからのＭＵＣ１特異的ＣＴＬを産生する。この実験では、２サイクルのｉｎ
ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ：ｉｎｖｉｔｒｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）で酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物（ＧＩ−６１０１またはＧＩ−６１０４）と共にインキュベートされたＤＣを用いて、正常ドナーおよび／または癌患者（化学療法もしくはウイルスワクチン治療を含みうる癌療法による後治療、および／または前治療）からのＭＵＣ１特異的Ｔ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで増加させる。５日目、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離し、ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞に対する一晩ＣＴＬアッセイに使用する。これらの実験では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物は、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞を死滅させうるＭＵＣ１特異的ＣＴＬを生成しうることが実証されると予想される。

実施例８
以下の実施例では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物による免疫化がｉｎｖｉｖｏでＭＵＣ１発現腫瘍を低減することを実証する。

この実験では、尾静脈を介して、組換えヒトＭＵＣ１タンパク質を発現する腫瘍細胞をマウスに投与する（０日目）。腫瘍留置の４日後、酵母対照（ＹＶＥＣ、または空のベクター酵母）と酵母−ＭＵＣ１（ＧＩ−６１０１またはＧＩ−６１０４）とを対比して動物に毎週１回ワクチン接種する。動物は、４つの異なる部位に１部位あたり１ＹＵの用量で投与される（１回あたり合計４ＹＵ）。腫瘍留置の４０日後、動物を屠殺して肺腫瘍ノジュール数を評価する。酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物は、酵母のみが投与されたマウスと比較して（ＭＵＣ１抗原なし）、マウスにおけるＭＵＣ１発現腫瘍を低減可能であると予想される。

実施例９
以下の実施例では、ＭＵＣ１陽性癌の被験体における第１相臨床試験を説明する。
実施例１に記載のＧＩ−６１０１または実施例２に記載のＧＩ−６１０４として知られる酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を用いて（標準増殖条件下または中性ｐＨ条件下のいずれかで増殖させた）、オープンラベル段階的用量増加第１相臨床試験を行う。４Ｙ．Ｕ．（１Ｙ．Ｕ．×４部位）、１６Ｙ．Ｕ．（４Ｙ．Ｕ×４部位）、４０Ｙ．Ｕ．（１０Ｙ．Ｕ．×４部位）の用量範囲を利用する皮下投与の段階的用量コホート増加プロトコルにより、ＭＵＣ１陽性腫瘍の１２〜２４被験体に酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を投与する。３ヶ月間にわたり２週間間隔で、次いで、毎月１回、酵母−ＭＵＣ１免疫療法を実施する。最大耐用量（ＭＴＤ：ｍａｘｉｍｕｍｔｏｌｅｒａｔｅｄｄｏｓｅ）または観測最良用量の患者の拡大コホート（ｎ＝１０）を追加の試験のために選択する。主要エンドポイントとして安全性、および副次エンドポイントとして抗原特異的Ｔ細胞反応（たとえば、治療により発生または拡大するＭＵＣ１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、さらには臨床活性を、結果により監視する。

ＧＩ−６１０１およびＧＩ−６１０４は、有意な毒性を伴うことなく、安全かつ耐容性が良好であると予想される。それに加えて、ＧＩ−６１０１またはＧＩ−６１０４は、統計的に有意な数の患者において、治療で生じるＭＵＣ１特異的Ｔ細胞反応の生成または既存のＭＵＣ１特異的ベースラインＴ細胞反応の改善をもたらすと予想される。一部の患者では、疾患の安定化が予想される。

実施例１０
以下の実施例では、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物を用いた臨床試験（Ｐ１／Ｐ２）を説明する。

ＭＵＣ１発現の増加は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の約７０％で観測されてきたことから、高いＭＵＣ１レベルは、未成熟白血病区画の増殖能の調節に関与しうることが示唆される。

第１の臨床試験では、ＧＩ−６１０１（実施例１参照）として知られる酵母ベースの免疫療法生成物の第一選択の使用は、ＭＵＣ１陽性ＡＭＬの場合に行われる（この試験デザインはまた、ＧＩ−６１０４などの他の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物にも適用可能である）。ＧＩ−６１０１の使用は、ＭＵＣ１陽性白血病細胞の免疫死滅を促進することにより、さらには、最終分化（アポトーシス）経路を回避可能なＭＵＣ１白血病細胞を排除することにより、アドオン方式で、既存の細胞傷害標準治療レジメン、シタラビン、およびアントラサイクリン（たとえば、ダウノルビシン）を補完するように、デザインされる。エンドポイントとしては、寛解誘導さらには(移植前および移植後の)全生存の改善が挙げられる。

第２の試験では、ＧＩ−６１０１は、ＭＵＣ１陽性疾患の患者においてＡＭＬの再発を予防するために骨髄移植（ＢＭＴ）の現場で使用される（また、この試験デザインは、ＧＩ−６１０４などの他の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物にも適用可能である）。骨髄ドナーのワクチン接種（養子移入）および／または移植後の骨髄レシピエントのワクチン接種を評価する臨床戦略は、ＢＭＴ後の再発率を低減するために使用される。

（Ａ）標準治療単独と対比したＧＩ−６１０１＋シタリビンおよびダウノルビシンによるＭＵＣ１陽性ＡＭＬ患者の第一選択療法の臨床試験デザイン
患者は、毎日１００〜２００ｍｇ／ｍ２×７日間でシタリビン（シトシンアラビノシド）の連続的静脈内注入＋シタリビン療法の１、２、および３日目４５ｍｇ／ｍ２で静脈内ダウノリビシン（またはダウノマイシン（ダウノマイシンセルビジン））で構成される導入化学療法またはこのレジメンに許容された変更を加えた導入化学療法を受け、続いて、化学療法の導入サイクルの終了１４日後、ＧＩ−６１０１（またはプラセボ）投与を受ける。次いで、再導入療法の１４日後、または化学療法のすべての後続の地固めサイクルの１４日後、ＧＩ−６１０１（またはプラセボ）を投与する。導入、再導入、および地固め療法の後、寛解からの再発を予防することを主目的として、ＧＩ−６１０１（またはプラセボ）を毎月１回３年間まで投与する。

プラセボの投与を受けた患者と比較して、ＧＩ−６１０１の使用により、患者において寛解からの再発が促進されることが予想される。
（Ｂ）プラセボと対比したＧＩ−６１０１によるＭＵＣ１陽性ＡＭＬのＢＭＴ後療法の臨床試験デザイン
骨髄破壊療法に続いて骨髄移植を必要とするＭＵＣ１陽性ＡＭＬ患者では、骨髄提供の７〜１４日前にＧＩ−６１０１（またはプラセボ）を骨髄ドナーに投与し、骨髄移植の３年後まで毎月１回、ＧＩ−６１０１（またはプラセボ）を骨髄レシピエントに投与する。主目的は、ＡＭＬ再発率を低減することである。

プラセボの投与を受けた患者と比較して、ＧＩ−６１０１の使用により、ＡＭＬ患者において再発率の低下が予想される。
本発明の種々の実施形態を詳細に説明してきたが、これらの実施形態の変更および適合が行われるであろうことは、当業者には明らかである。しかしながら、次の例示的な特許請求の範囲に明記されるように、そのような変更形態および適合形態は本発明の範囲内であることをはっきりと理解すべきである。

Claims

酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物であって、前記免疫療法用組成物が、
ａ）酵母媒体と、
ｂ）前記酵母媒体により発現されたかつ少なくとも１つのＭＵＣ１抗原を含む融合タンパク質と、を含み、
前記ＭＵＣ１抗原は、Ｎ末端からＣ末端の方向に順に、ＭＵＣ１ＳＥＡ／細胞外ドメイン（ＥＤ）、少なくとも２つの可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）ドメイン、ＭＵＣ１膜貫通（ＴＭ）ドメイン、およびＭＵＣ１細胞質内ドメイン（ＣＤ）で構成され、
前記ＭＵＣ１ＳＥＡ／ＥＤドメインは、ＭＵＣ１ＳＥＡドメインの非ＥＤ部分の１つまたは複数のアミノ酸によりＮ末端がフランキングされたＭＵＣ１ＥＤを含む、酵母−ＭＵＣ１免疫療法用組成物。