KR20120044929A - 암에 대한 병용 면역요법 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

면역요법 조성물들, 및 치료적 면역 반응의 개선된 유도, 및/또는 이에 제한되지 않으나, 암 및 전염성 질병을 포함하는 질병의 예방, 개선 및/또는 치료를 위한, 그러한 조성물들의 조합의 동시 사용이 개시된다.

Description

암에 대한 병용 면역요법 조성물 및 방법{COMBINATION IMMUNOTHERAPY COMPOSITIONS AGAINST CANCER AND METHODS}
정부 권리
본 발명은 미국 보건 복지부 국립 보건원의 협력연구 및 개발 협약의 실행으로 창출된 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.
공동 연구 협약에 대한 진술
본 발명은 2008, 5, 8 실행된 협력연구 및 개발 협약에 대한 당사자에 의하여 또는 이를 대표하여 이루어졌다. 상기 협력연구 및 개발 협약의 당사자는 다음과 같다: GlobeImmune, Inc. 및 미국 국립 보건원의 연구소, 센터 또는 분과인 국립 암 연구소로 대표되는 미국 보건 복지부.
서열 목록에 대한 참조
본원은 EFS-Web에 의하여 파일링되는 텍스트로서 전자 제출되는 서열 목록을 포함한다. "3923-24-PCT_ST25"로 명명되는 텍스트 파일은 48KB의 크기를 가지며, 2010, 4, 16에 기록되었다. 상기 텍스트 파일 내의 정보는 37 CFR §1.52(e)(5)에 따라 그 전체로서 참조로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 치료 면역 반응의 유도 향상 및/또는 이에 제한되지 않으나 암 및 전염성 질병을 포함하는 질병의 예방, 개선 및/또는 치료를 위한 두 가지 상이한 면역요법 조성물의 동시 사용에 관한 것이다.
백신을 포함하는 면역요법 조성물은 질병 예방 및 치료를 위한 건강 관리 산업에 유용한 가장 비용 효율적인 방법 중 하나이다. 그러나, 병원체에 의한 감염에 의하여 야기되거나 이와 관련되는 질병, 암, 유전적 결함 및 기타 면역체계 장애를 포함하는 다양한 질병에 대한 안전하고 효과적인 면역요법 전략 및 보조제를 개발할 긴급한 요구가 남아 있다. 암 및 바이러스 질병 및 세포내 병원균에 의하여 야기되는 질병을 포함하는 많은 전염성 질병 치료를 위하여, 세포-중재 (세포성) 면역 반응을 유발하는 면역요법을 제공하는 것이 바람직하나, 많은 백신이 체액성 면역 유발에 주로 또는 전적으로 관련된다. 과연, 많은 치사되거나 약화된 병원체 백신뿐 아니라 많은 서브유닛 백신의 불리한 점은 이들이 강한 체액성 면역 반응을 자극하는 것으로 보이는 반면 보호적 세포-중재 면역을 유발시키지 못한다는 점이다.
암은 전세계적으로 주된 사망 원인이며, 효과적인 암 치료법의 개발은 여전히 가장 활발한 연구 영역 중 하나이다. 암의 치료 및 예방을 위한 다양한 혁신적 접근법이 제안되어 왔으나, 많은 암이 여전히 높은 치사율을 가지며 치료하기 어렵거나 전통적인 치료법에 상대적으로 비-반응성이다. 암 생물학에 있어서의 새로운 발견은 표적-특이적 항암제를 고안할 기회를 제공하여 왔으며, 약물 및 면역요법 개발을 진전시켜 왔다. 이러한 발견은 암 세포 내 특정 표적에 대한 높은 선택도를 가지는 분자 및 치료 조성물의 고안을 가능케 한다.
동일한 항원을 표적화하는 백신 플랫폼을 그들의 면역 세포 활성을 유도하는 능력 및 항종양 효과 측면에서 비교하는 무수한 면역요법 연구들이 보고되어 왔다 (예를 들어, Weide et al., Immunol Lett 2008 Jan 15;115(1):33-42; Riezebos-Brilman et al., Gene Ther 2007 Dec;14(24):1695-704; Naslund et al., J Immunol 2007 Jun 1;178(11):6761-9; Mylin et al., J Virol 2000 Aug;74(15):6922-34; Millar et al., Cell Immunol 2007 Nov-Dec;250(1-2):55-67; Hodge et al., Cancer Res 2003 Nov 15;63(22):7942-9; Chan et al., Gene Ther 2006 Oct;13(19):1391-402; Casimiro et al., J Virol 2003 Jun;77(11):6305-13; and Bos et al., J Immunol 2007 Nov 1;179(9):6115-22). Millar et al. showed that the functionality of T-cell populations induced by two different vectors (rV and recombinant adenovirus) targeting the same antigen did not differ (Millar et al., Cell Immunol 2007 Nov-Dec;250(1-2):55-67 참조).
인간 암배아 항원 (CEA) 유전자 (rV/F-CEA/TRICOM) 뿐 아니라 쥐 B7-1, ICAM-1 및 LFA-3 유전자를 함유하는 재조합 백시니아 (rV) 및 재조합 파울폭스 (rE) 바이러스의 다양한 프라임 및 부스트 백신 요법의 항종양 효과가 이전에 선임상 모델 내에서 보고되었다 (Hodge et al., Cancer Res 2003 Nov 15;63(22):7942-9; Hodge et al., Cancer Res 1999 Nov 15;59(22):5800-7; Hodge et al., Clin Cancer Res 2003 May;9(5):1837-49; Grosenbach et al., Cancer Res 2001 Jun 1;61(11):4497-505; Greiner et al., Cancer Res 2002 Dec 1;62(23):6944-51; Arlen et al., Crit Rev Immunol 2007;27(5):451-62). 최근에, 재조합 Saccharomyces cerevisiae (효모-CEA) 백신의 항종양 효과가 또한 선임상 모델 내에서 보고되었다 (Bernstein et al., Vaccine 2008 Jan 24;26(4):509-21; Wansley et al., Clin Cancer Res 2008 Jul 1;14(13):4316-25). rV/FCEA/TRICOM 또는 효모-CEA로의 백신 접종 후 면역 반응 유도가 보고되었으며, 상기 백신에 의하여 유발되는 항종양 효과는 주로 CEA-특이적 T-세포 집단의 유도에 기인한다.
몇몇 연구는 더 다양한 T-세포 집단의 유도가 암을 포함하는 다양한 질병 모델 내에서 면역 반응을 증가시킴에 있어 유리함을 입증하였다 (Dudley et al., Cancer J 2000 Mar-Apr;6(2):69-77; Dutoit et al., Cancer Res 2001 Aug 1;61(15):5850-6; Echchakir et al., Int Immunol 2000 Apr;12(4):537-46; Ferradini et al., Cancer Res 1992 Sep 1;52(17):4649-54; Messaoudi et al., Science 2002 Nov 29;298(5599):1797-800; Nikolich-Zugich et al., Nat Rev Immunol 2004 Feb;4(2):123-32; Sportes et al., J Exp Med 2008 Jul 7;205(7):1701-14; Zhou et al., Cancer Res 2005 Feb 1;65(3):1079-88). 그러나, 동일한 항원을 표적화하는 백신들의 동시 사용에 대한 보고는 없다. 상기 기재된 것들과 같은 동일한 항원을 표적화하는 연구에 따라, 조사가들은 추후 연구를 위하여 가장 효과적인 백신을 역사적으로 선택하거나, 또는 T-세포 반응을 증폭시키기 위한 다각적 프라임 및 부스트 전략을 사용한다. 예를 들어, 최초 백신에 대한 면역 반응은 동일한 벡터를 이용하는 연이은 백신 접종의 효과를 감소시키는 것으로 보여져 왔으므로 (Naslund et al., 2007, supra; Grosenbach et al., 2001, supra, Hodge et al., 1997, supra, and Wu et al., J Virol 2005 Jul;79(13):8024-31.), CEA를 표적화하는 재조합 백시니아 및 파울폭스 벡터를 이용하는 다양한 프라임-부스트 백신 접종 전략 (Hodge et al., Vaccine 1997 Apr-May;15(6-7):759-68; Marshall et al., J Clin Oncol 2000 Dec 1;18(23):3964-73)을 이용하였다. 다각적프라임-부스트 전략의 분명한 이점을 입증하는 유사한 결과가 다양한 암 및 HIV 및 말라리아를 포함하는 기타 질병 모델 내에서 기재되었다 (Wu et al, 2005, supra; Pancholi et al., J Infect Dis 2000 Jul;182(1):18-27; Barnett et al., AIDS Res Hum Retroviruses 1998 Oct;14 Suppl 3:S299-309; Dunachie et al., J Exp Biol 2003 Nov;206(Pt 21):3771-9; McMichael, Annu Rev Immunol 2006;24:227-55; Moore et al., Immunol Rev 2004 Jun;199:126-43). 이러한 연구에서 관찰된 증진된 반응은 항원-특이적 T-세포의 적합한 집단의 증폭에 기인하였으나, 다시, 다각적 프라임-부스트 접근법을 사용하여 이러한 결과에 도달하였다.
따라서, 암 치료 및 전염성 질병 면역요법/백신 기법에 있어서의 이점에도 불구하고, 이러한 질병 치료에 대한 안전하고 효과적인 면역요법에 대한 절실한 요구가 남아 있다.
발명의 개요
본 발명의 일 구현예는 개체 내에서 암의 적어도 하나의 증상을 예방, 개선 또는 치료하거나, 암을 가지는 개체의 생존률을 증가시키거나, 및/또는 상기 개체 내에서 하나 이상의 암 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 적어도 하나의 공동 자극 분자를 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 상기 개체에 동시에 투여된다. 일 측면에서, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 공동자극 분자 B7-1, ICAM-1 및 LFA-3를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 개체 내에서 암의 적어도 하나의 증상을 예방, 개선 또는 치료하거나, 암을 가지는 개체의 생존률을 증가시키거나, 및/또는 상기 개체 내에서 하나 이상의 암 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) (i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스; 및 (ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 상기 개체에 동시에 투여된다. 상기 구현예의 일 측면에서, 상기 최초 투여 후 적어도 1주일 후에, 상기 방법은 (a) (i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스; 및 (ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스를 포함하는 제3 면역요법 조성물; 및 (b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 제2 및 제3 면역요법 조성물은 상기 개체에 동시에 투여된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 개체 내에서 적어도 하나의 암의 증상을 예방, 개선 또는 치료하거나, 암을 가지는 개체의 생존률을 증가시키거나, 및/또는 상기 개체 내에서 하나 이상의 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하기 위한, 개체에 동시 투여를 위한 약제 제조에 있어서의 면역요법 조성물의 조합의 용도에 관한 것이다. 상기 면역요법 조성물은 (a) (i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스; 및 (ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 포함한다. 일 측면에서, 상기 면역요법 조성물은 (i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스; 및 (ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스를 포함하는 제3 면역요법 조성물을 추가로 포함한다.
본 발명의 일 구현예는 개체 내에서 질병 또는 상태의 적어도 하나의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 상기 개체에 동시에 투여된다.
본 발명의 다른 구현예는 개체 내에서 하나 이상의 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 상기 개체에 동시에 투여된다.
본 발명의 다른 구현예는 질병 또는 상태를 가지는 개체의 생존률을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 상기 개체에 동시에 투여된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 개체 내에서 질병 또는 상태의 적어도 하나의 증상을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 개체에 동시 투여를 위한 약제의 제조에 있어서의 면역요법 조성물의 조합의 용도에 관한 것이다. 상기 면역요법 조성물은 (a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 동시 투여를 위하여 제형화된다.
본 발명의 다른 구현예는 개체 내에서 하나 이상의 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하기 위한 개체에 동시 투여를 위한 약제의 제조에 있어서의 면역요법 조성물의 조합의 용도에 관한 것이다. 상기 면역요법 조성물은 (a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 포함한다. 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 중 하나 또는 둘 모두는 적어도 하나의 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함한다. 상기 조성물은 동시 투여를 위하여 제형화된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 개체의 생존률을 증가시키기 위하여 질병 또는 상태를 가지는 개체에 동시 투여하기 위한 약제의 제조에 있어서의 면역요법 조성물의 조합의 용도에 관한 것이다. 상기 면역요법 조성물은 (a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 포함한다. 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 중 하나 또는 둘 모두는 적어도 하나의 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함한다. 상기 조성물은 동시 투여를 위하여 제형화된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 (a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 중 하나 또는 둘 모두는 적어도 하나의 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함한다. 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 혼합되어 제공된다.
본 발명의 다른 구현예는 다음 면역요법 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다: (a) 적어도 하나의 공동자극 분자를 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물. 일 측면에서, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 공동 자극 분자 B7-1, ICAM-1 및 LFA-3를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 측면에서, 상기 항원은 암 항원이다. 일 측면에서, 상기 항원은 CAP-1-D를 포함하는 변형된 CEA이다. 본 발명의 키트의 다른 측면들이 이하 기재된다.
본 발명의 다른 구현예는 다음 면역요법 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다: (a) (i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스; 및 (ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및 (b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물. 일 측면에서, 상기 키트는 (i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스; 및 (ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스를 포함하는 제3 면역요법 조성물을 추가로 포함한다. 일 측면에서, 상기 항원은 암 항원이다. 일 측면에서, 상기 항원은 CAP-1-6E 에피토프를 포함하는 변형된 CEA이다. 본 발명의 키트의 다른 측면들이 이하 기재된다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예를 포함하는 본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 구현예들 중 임의의 것에서, 제1 및 제2 면역요법 조성물 중 하나 또는 둘 모두 (및/또는 제3 면역요법 조성물, 특정 구현예)는 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 모두 (및/또는 제3 면역요법 조성물, 특정 구현예)는 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 상기 제1 및 면역요법 조성물은 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하고, 상기 제2 면역요법 조성물은 그러하지 않다. 일 측면에서, 상기 제2 면역요법 조성물은 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하고, 상기 제1 면역요법 조성물은 그러하지 않다. 일 측면에서, 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 각각은 동일한 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 상기 제1 및 제2 면역원성 조성물 (및/또는 제3 면역원성 조성물, 특정 구현예)은 상이한 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함한다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예를 포함하는 본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 임의의 구현예의 일 측면에서, 상기 제1 및/또는 제3 면역원성 조성물은 하나 이상의 면역자극 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 포함한다. 일 측면에서, 상기 제1 및/또는 제3 면역원성 조성물은 바이러스 게놈 또는 그 일부 및 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스, 및 하나 이상의 면역자극 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 포함한다. 일 측면에서, 상기 제1 및/또는 제3 면역원성 조성물은 상기 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 및 하나 이상의 면역자극 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 포함한다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예를 포함하는 본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 임의의 구현예의 일 측면에서, 상기 제1 및/또는 제3 면역요법 조성물 내 상기 재조합 바이러스 또는 바이러스들은 폭스바이러스이다. 일 측면에서, 상기 제1 및/또는 제3 면역요법 조성물 내 상기 재조합 바이러스 또는 바이러스들은 백시니아 바이러스이다. 일 측면에서, 상기 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 앙카라 (MVA)이다. 일 측면에서, 상기 제1 및/또는 제3 면역요법 조성물 내 상기 재조합 바이러스 또는 바이러스들은 파울폭스 바이러스이다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예를 포함하는 본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 임의의 구현예의 일 측면에서, 상기 면역자극 분자는 하나 이상의 공동 자극 분자를 포함한다. 일 측면에서, 상기 면역자극 분자는 이에 제한되지 않으나 B7.1 (B7-1), B7.2 (B7-2), ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD40L 및/또는 CD70를 포함한다. 일 측면에서, 상기 면역자극 분자는 B7-1, ICAM-1, 및LFA-3. 중 하나, 두 개 또는 세 개를 포함한다. 일 측면에서, 상기 면역자극 분자는 이에 제한되지 않으나 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터류킨-6 (IL-6), 과립 대식세포 집락 자극인자 (CM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ), IFN-α, IFN-λ, 인터류킨-12 (IL-12), RANTES, 및 인터류킨-2 (IL-2)를 포함하는 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 일 측면에서, 상기 사이토카인은 과립 대식세포 집락 자극인자 (CM-CSF)이다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예를 포함하는 본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 임의의 구현예의 일 측면에서, 상기 제2 면역요법 조성물은 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 발현하는 효모 베히클을 포함한다. 일 측면에서, 상기 제2 면역요법 조성물 내 효모 베히클은 전체 효모이다. 일 측면에서, 상기 제2 면역요법 조성물 내 효모 베히클은 전체, 가열-치사된 효모이다. 일 측면에서, 상기 제2 면역요법 조성물 내 효모 베히클은 Saccharomyces로부터이다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예를 포함하는 본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 임의의 구현예의 일 측면에서, 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 (및/또는 특정 구현예에서 제3 면역 요법 조성물)은 개체에 상이한 부위에 투여된다. 다른측면에서, 상기 제1 및 제2 (및/또는 제3) 면역 요법 조성물은 개체 내 동일한 부위 또는 인접하는 부위에 투여된다.
본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 본 발명의 임의의 방법 또는 용도 구현예 또는 측면들의 다른 측면에서, 상기 방법 또는 용도는 상기 개체에 면역요법 조성물 중 하나 또는 둘 모두 (또는 특정 구현예에서 셋 모두)를 부스팅하는 단계를 추가로 포함한다. 일 측면에서, 상기 개체에 제1 면역요법 조성물보다 제2 면역요법 조성물을 더 자주 부스팅한다.
제1 및 제2 면역요법 조성물이 있는, 본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 본 발명의 임의의 방법 또는 용도 구현예들 또는 측면들의 다른 측면에서, 상기 방법 또는 용도는 상기 개체에 상기 제1 면역요법 조성물과 다른 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제3 면역요법 조성물을 부스팅하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일 측면에서, 상기 제1 면역요법 조성물은 재조합 백시니아 바이러스를 포함하고, 상기 제3 면역요법 조성물은 파울폭스 바이러스를 포함한다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예를 포함하는 본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 임의의 구현예들의 일 측면에서, 상기 제1 또는 제2 면역요법 조성물 중 어느 하나는 다른 것보다 더 자주 투여된다. 예를 들어, 일 측면에서, 상기 제1 면역요법 조성물이 바이러스-기제 면역요법 조성물이고, 상기 제2 면역요법 조성물이 효모-기제 면역요법 조성물일 때, 상기 제2 면역요법 조성물이 상기 제1 면역요법 조성물보다 더 자주 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 측면에서, 상기 제1 및 제2 면역요법 조성물의 동시 투여 사이에, 상기 제2 면역요법 조성물이 1, 2, 3 또는 그 이상의 추가적인 횟수로 투여될 수 있다.
본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 임의의 방법 또는 용도 구현예 또는 측면의 다른 측면에서, 상기 방법은 상기 개체에 다른 급원의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 부스팅하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 임의의 방법 또는 용도 구현예 또는 측면의 다른 측면에서, 상기 방법은 적어도 하나의 생체반응 조절 인자를 상기 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예를 포함하는 본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 임의의 구현예들의 일 측면에서, 상기 개체는 암을 가진다. 일 측면에서, 상기 방법 또는 용도는 종양 적하 중량을 감소시키거나 개체 내에서 종양 성장을 저해한다. 본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예들을 포함하는 본 발명의 임의의 구현예의 일 측면에서, 상기 항원은 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종(angiosarcomas, hemangiosarcomas), 비만세포종, 백혈병, 림프종, 원발성 간암, 폐암, 췌장암, 위장관암, 신장암, 조혈 종양 및 이의 전이암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암으로부터 일 수 있다. 일 측면에서, 상기 항원은 암배아 항원 (CEA), 점 돌연변이 Ras 종양 단백질, 브라큐리(Brachyury), MUC-1, EGFR, BCR-Abl, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GAGE, GP-100, MUC-2, 정상 및 점 돌연변이 p53 종양단백질, PSMA, 티로시나아제, TRP-1 (gp75), NY-ESO-1, TRP-2, TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c-erb/B2, hTERT, p73, B-RAF, 선종성 용종 유전자 (APC), Myc, von Hippel-Lindau protein (VHL), Rb-1, Rb-2, 안드로겐 수용체 (AR), Smad4, MDR1, Flt-3, BRCA-1, BRCA-2, pax3-fkhr, ews-fli-1, HERV-H, HERV-K, TWIST, 메소텔린, NGEP, 이러한 항원의 변형, 이러한 항원의 스플라이스 변이체, 및 이러한 항원의 에피토프 작용제, 및 이러한 항원 및/또는 이의 면역원성 도메인의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 일 측면에서, 상기 항원은 암배아 항원 (CEA)이고, 일 구현예에서, 이는 CAP1-6D 에피토프를 포함한다. 일 측면에서, 상기 CEA는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 포함한다 (SEQ ID NO:1로서 본원에 나타내어지는 핵산 서열에 의하여 인코딩됨). 다른 측면에서, 상기 항원은 돌연변이된 Ras이다. 일 측면에서, 상기 항원은 각각의 단편이 Ras의 포지션 12, 13, 59, 61 및/또는 76에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 Ras 단편을 포함하는 복수 도메인 융합 단백질이다. 일 측면에서, 상기 Ras 융합 단백질은 SEQ ID NO:4 (본원에서 SEQ ID NO:3로 나타내어지는 핵산 서열에 의하여 인코딩됨), SEQ ID NO:6 (본원에서 SEQ ID NO:5로 나타내어지는 핵산 서열에 의하여 인코딩됨), SEQ ID NO:8 (본원에서 SEQ ID NO:7로 나타내어지는 핵산 서열에 의하여 인코딩됨), 및/또는 SEQ ID NO:10 (본원에서 SEQ ID NO:9로 나타내어지는 핵산 서열에 의하여 인코딩됨)의 아미노산 서열을 가진다. 일 측면에서, 상기 항원은 브라큐리이다. 일 측면에서, 상기 항원은 MUC-1이다. 일 측면에서, 상기 항원은 EGFR이다. 일 측면에서, 상기 항원은 BCR-Ab1이다.
본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 본 발명의 임의의 방법 또는 용도 구현예들 또는 측면들의 일 측면에서, 상기 방법 또는 용도는 상기 개체를 화학요법으로 처리하는 단계, 및/또는 상기 개체를 방사선 요법으로 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재되는 (상기 또는 이하) 본 발명의 임의의 방법 또는 용도 구현예들 또는 측면들의 다른 측면에서, 상기 개체는 병균체에 의하여 야기되거나 이와 관련된 질병을 가진다. 일 측면에서, 상기 방법 또는 용도는 병원체에 의한 개체의 감염을 감소시키거나 예방한다. 일 측면에서, 상기 방법 또는 용도는 개체 내에서 병원체 역가를 감소시킨다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 또는 키트에 대한 임의의 구현예들을 포함하는 본 발명의 임의의 구현예의 일 측면에서, 상기 항원은 바이러스 항원, 균류 항원, 박테리아 항원, 장내 기생충 항원, 기생충 항원, 체외 기생충 항원, 원생동물 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 측면에서, 상기 항원은 아데노바이러스, 아레나 바이러스, 뷰나바이러스, 코로나바이러스, 콕삭키 바이러스, 거대세포 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 플라비바이러스, 헤파드나 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 렌티바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 믹소바이러스, 종양 바이러스, 오르토믹소바이러스, 유두종 바이러스, 파포바바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 파라믹소바이러스, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스 바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 레오바이러스, 랍도바이러스, 풍진 바이러스, 토가바이러스, 수두 바이러스, 및 T-림프영양성 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스로부터이다. 일 측면에서, 상기 항원은 Aspergillus , Bordatella , Brugia , Candida , Chlamydia , Coccidia , Cryptococcus, Dirofilaria , Escherichia , Francisella , Gonococcus , Histoplasma , Leishmania , Mycobacterium , Mycoplasma , Paramecium , Pertussis , Plasmodium, Pneumococcus , Pneumocystis , Rickettsia , Salmonella , Shigella , Staphylococcus , Streptococcus, Toxoplasma , Vibriocholerae, 및 Yersinia로 이루어지는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 전염성 항원으로부터이다. 일 측면에서, 상기 항원은 Pseudomonas , Bordetella , Mycobacterium, Vibrio , Bacillus , Salmonella , Francisella , Staphylococcus , Streptococcus , Escherichia, Enterococcus , Pasteurella , 및 Yersinia로부터 선택되는 속으로부터의 박테리아로부터이다.
면역요법 조성물들, 및 치료적 면역 반응의 개선된 유도, 및/또는 이에 제한되지 않으나, 암 및 전염성 질병을 포함하는 질병의 예방, 개선 및/또는 치료를 위한, 그러한 조성물들의 조합의 동시 사용이 개시된다.
도 1의 (A)-(I)는 rV-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로의 백신 접종이 차등 혈청 사이토카인 프로필을 유도함을 보이는 그래프이다 (도 1의 (A) = MIP1α 도 1의 (B) = RANTES, 도 1의 (C) = GM-CSF, 도 1의 (D) = IL-6, 도 1의 (E) = IL-12p70, 도 1의 (F) = IL-13, 도 1의 (G) = IL-1α 도 1의 (H) = IL-1β 및 도 1의 (I) = IL-5).
도 2의 (A)-(G)는 구분된 TCR 레퍼토리가 rV/F-CEA/ TRICOM 또는 효모-CEA로의 백신 접종으로부터 유도됨을 보인다 (Vα 프로필이 미처리(도 2의 (A)), rV/F-CEA/TRICOM (도 2의 (B)), 및 효모-CEA (도 2의 (C))에 도시되고, Vβ프로필이 미처리 (도 2의 (D)), rV/F-CEA/TRICOM (도 2의 (E)), 및 효모-CEA (도 2의 (F))에 대하여 도시된다).
도 3의 (A)는 CEA의 도메인 III의 A3 루프 상에 별개의 중복되지 않는 CEA-526 및 CEA-572 에피토프를 도시한다.
도 3의 (B)-(C)는 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로의 백신 접종이 두 개의 별개의 CEA-특이적 에피토프, CEA-526 (도 3의 (B)) 및 CEA-572 (도 3의 (C))로의 시험관내 자극에 반응하여 구분된 사이토카인 프로필을 유도함을 보인다.
도 4의 (A)-(D)는 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 CEA-572 에피토프에 대하여 특이적인 T-세포주가 구분된 TCR Vα을 가짐을 보인다 (CEA-526 펩타이드 (도 4의 (A)) 및 CEA-572 펩타이드 (도 4의 (B))의 존재 하에 유지되는 rV/F-CEA/TRICOM T-세포주 (검정색 막대)의 VαTCR 레퍼토리; CEA-526 펩타이드 (도 4의 (C)) 및 CEA-572 펩타이드 (도 4의 (D))의 존재하에 유지되는 효모-CEA T 세포주 (흰색 막대)의 VαTCR 레퍼토리).
도 5의 (A)-(F)는 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터 생성되는 에피토프 특이적 T-세포주가 유사한 수준의 용균 활성 그러나 고유의 활성을 가짐을 보인다 (도 5의 (A) 및 (C)는 rV/F-CEA/TRICOM 백신접종으로부터 생성되고 CEA-526 펩타이드 (도 5의 (A)) 및 CEA-572 펩타이드 (도 5의 (C))에 특이적인 T 세포주를 도시하고; 도 5의 (B) 및 (D)는 효모-CEA 백신접종으로부터 생성되고 CEA-526 펩타이드 (도 5의 (B)) 및 CEA-572 펩타이드 (도 5의 (D))에 특이적인 T-세포주를 도시하고; 도 5의 (E) 및 (F)는 rV/F-CEA/TRICOM (도 5의 (E)) 또는 효모-CEA (도 5의 (F))로 백신접종된 마우스로부터 생성되는 CEA-572 에피토프에 특이적인 T-세포주를 도시한다.
도 6은 동소성 폐 전이 모델 내에서 rV/F-CEA/TRICOM 및 효모-CEA 백신의 동시 투여가 항종양 효과를 증가시킴을 보인다.
본 발명은 치료 면역 반응의 유도 및/또는 이에 제한되지 않으나 암 및 전염성 질병을 포함하는 질병의 예방, 개선 및/또는 치료를 위한 두 개의 면역요법 조성물 (이하 본원에서 백신으로도 언급함)의 동시 사용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 각가 동일한 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 표적화하는 재조합 바이러스 면역요법 백신 및 효소-기제 면역요법 백신을 사용하여, 백신 벡터 및 항원 모두 공통의 및 고유한 사이토카인 반응, 유전자 발현 프로필 및 T-세포 수용체 표현형을 가지는 T-세포 집단의 유도에 있어서 역할을 가지는 것으로 입증된다. 따라서, 항원 및 벡터 모두 뚜렷한 T-세포 집단 유도에 있어서 역할을 한다. 본원에 제시되는 연구는 표현형으로 및 기능적으로 뚜렷한 T-세포 집단이 동일한 항원을 표적화하는 두 개의 벡터 플랫폼에 의하여 유도됨을 나타낸다. 최종적으로, 본 발명자들은 두 개의 백신이 동시 조합되어 치료 효과를 향상시킴을 입증하였으며, 이는 백신의 동시 투여가 본원에 기재되는 실험에서 항종양 효과를 향상시켰음을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 보다 다양한 T-세포 집단의 유도 및 향상된 치료 효과로 인한, 단일 항원을 표적화하는 두 개의 구분된 벡터 플랫폼의 동시 투여로부터의 치료 이점을 나타낸다.
본 연구는 동일 항원을 표적화하는 두 개의 상이한 백신 벡터의 효과적인 동시 투여를 최초로 입증한 것으로 믿어진다. 이전에 본 연구에 사용되는 백신 각각이 개별적으로 유사한 수준의 CD4+ T-세포 증식 및 CD8+ T-세포 세포용해 활성을 유도하는 것이 입증되었으나 (Wansley et al., Clin Cancer Res, 2008 Jul 1;14(13):4316-25), 이들 백신이 표현형적으로 및 기능적으로 구분되는 T-세포 집단을 유도하고, 이들 백신이 동시 조합되어 항종양 효과를 상당히 증진시킬 수 있다는 발견은 알려지거나 예상되지 않았다.
동일한 항원 (OVA)를 표적화하는 두 개의 상이한 백신 플랫폼 (rV 및 재조합 아데노바이러스)에 의하여 유도되는 T-세포 집단의 기능이 다르지 않음을 보이는 종래 연구 ((Millar et al., 2007, Cell Immunol 250(1-2):55-67)와 대조적으로, 본 발명은 벡터 및 항원 모두 하나는 바이러스-기제 면역요법 조성물 (본원에서 rV-CEA/TRICOM로 언급됨)이고 하나는 효모-기제 면역요법 조성물 (본원에서 효모-CEA로 언급됨)인 두 개의 상이한 면역요법 백신에 의하여 유도되는 T-세포 집단의 기능에 영향을 미친다는 증거를 제공한다. 두 백신에 의하여 유도되는 T-세포 집단을 사이토카인 생산, 유전자 발현 및 TCR 프로파일링 측면에서 비교하여, 본원에 제시되는 연구는 rV-CEA/TRICOM가 Th1 반응 및 Tc1 표현형을 가지는 CD8+ T-세포를 유도하는 반면, 효모-CEA가 혼합 Th1/Th2 반응 및 혼합 Tc1/Tc2 표현형을 가지는 CD8+ T-세포를 유도함을 밝혔다 (도 1 및 도 3). 면역 세포 이동 및 TCR 시그널링에 수반되는 유전자 및 T-세포 증식의 상향 조절을 두 백신에 의하여 관찰하였다 (표 1). 흥미롭게도, 이들 백신은 분명히 불리한 방식으로 다양한 세포 경로 내에 수반되는 유전자 발현을 조절하나, 항원-특이적 면역 반응 또는 항종양 효과가 없어지지 않는다 (Wansley et al., Clin Cancer Res 2008 Jul 1;14(13):4316-25). 또한, 본원에서 어느 하나의 백신에 의하여 유도되는 T-세포 집단이 공통의 및 고유의 Vα 및 VβTCR 유전자 사용을 가지며 (도 2), 두 개의 CEA 에피토프 중 하나에 특이적인 백신접종된 CEA-Tg 마우스로부터 형성되는 T-세포주가 차등 결합활성 및 항원 특이적 세포용해 활성을 나타내는 것이 (도 5) 입증된다. 이를 함께 고려하면, 본 연구는 상기 두 개의 면역요법 백신이 구분되는 T-세포 집단을 유도하고, 이들 T-세포 집단의 표현형 및 기능 차이는 벡터 및 항원 모두에 기인할 수 있는 것임을 입증한다. 이러한 발견은 면역요법 조성물 측면에서 임의의 항원의 사용에 적용될 수 있다.
어느 하나의 백신 플랫폼에 의한 항원 전달 방식은 이러한 구분된 반응의 생성에 영향을 미칠 수 있다. 효모-CEA가 면역 반응을 주로 활성화하는 메커니즘은 CEA-발현 효모의 업테이크 및 연이은 수지상 세포 (DCs)에 의한 CEA 항원의 프로세싱 및 제시를 통한 것인 반면 (Bernstein et al., Vaccine 2008 Jan 24;26(4):509-21), rV/F-CEA/TRICOM 벡터는 세포를 감염시켜, CEA 항원이 프로세싱되고 제시되는 것을 허용하는 세포내 발현을 유도한다 (Hodge et al., Cancer Res 1999 Nov 15;59(22):5800-7). 다른 관찰된 차이점은 rV/F-CEA/TRICOM 백신접종은 CEA-특이적 항체 생산을 유도하는 반면 효모-CEA는 그러하지 않다는 점이다 (데이터 도시하지 않음). 면역 체계의 세포성 및 체액성 암의 활성화에 있어서 이러한 메커니즘의 차이는 또한 구분된 T-세포 집단의 벡터- 및 항원-특이적 유도에 영향을 미칠 수 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 동일한 항원을 표적화하는 두 개의 백신을 투여하는 것이 구분된 T-세포 집단을 유도하고 쥐 동소성 폐 전이 모델 내에서 상당히 더 높은 항종양 면역력을 야기함을 발견하였다 (도 6). 본 연구는 또한 동일한 항원을 표적화하는 두 개의 백신 플랫폼이 그들의 구분되는 T-세포 집단의 유도로 인하여 동시 투여될 수 있음을 최초로 보였다. 나아가, 이러한 데이터는 두 개의 백신의 동시 투여는 동일한 항원을 표적화하는 더 다양한 T-세포 집단의 유도로 인하여 상당히 증가된 항종양 효과를 야기함을 보인다. 이러한 발견은 이러한 백신의 동시 조합을 이용하여 항원 특이적 면역력을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 본원에 기재되는 면역요법 백신의 동시 사용은 두 백신 모두로부터 생성되는 T-세포로 이루어지는 더 다양한 T-세포 집단을 유도하여, 다각적인 프라임-부스트 스케쥴을 본원에 기재된 동시 투여 프로토콜과 조합하는 것이 효과적인 면역 반응을 더욱 증진시킬 수 있으나, 본 발명의 이전에 사용되었던 다각적인 프라임-부스트 스케쥴을 불필요하게 한다. 본 발명은 각각의 연이은 백신 접종으로 부스팅되고 규모가 확대되는 더 다양한 T-세포 집단을 유도함으로써 초기 백신접종으로 시작하는 면역 반응을 최대화한다. 이러한 전략은 더 다양한 T-세포 집단이 만성 전염성 질병 및 암 치료에 있어서 초기에 유도되므로, 만성 전염성 질병 환자 및 암 환자에 있어서 효과적일 것이다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도 및/또는 암 또는 전염성 질병을 포함하는 질병 또는 상태를 예방, 개선 및/또는 치료하기 위한, 두 개 이상의 상이한 면역요법 조성물의 동시 사용에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 두 개 이상의 상이한 면역요법 조성물은 동일한 항원(들)을 표적화한다. 다른 구현예에서, 상기 두 개 이상의 상이한 면역요법 조성물 중 하나는 하나 이상의 항원을 표적화하고, 상기 면역요법 조성물의 다른 하나는 항원을 반드시 표적화할 필요없이 또는 동일한 항원을 다른 조성물로서 반드시 표적화할 필요없이 보조제로서 제공된다 (즉, 일 구현예에서, 두번째 조성물은 상이한 항원을 표적화한다). 상기 구현예들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 일 구현예에서, 상기 두 개 이상의 면역요법 조성물은 동시에 투여되나, 환자 내 상이한 물리적 부위에 투여된다. 상기 구현예들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 다른 구현예에서, 상기 두 개 이상의 상이한 면역요법 조성물들은 동시에 및 환자 내 동일하거나 실질적으로 인접한 부위에 투여된다.
본원 발명에 사용되는 상기 두 개 이상의 상이한 면역요법 조성물은 각각 개별적으로 면역반응 및 바람직하게 적어도 세포성 면역 반응, 및 더 바람직하게, T 세포-중재 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 일 측면에서, 상기 조성물 중 적어도 하나는 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포-중재 면역 반응 및 더 바람직하게, CD8+ 및 CD4+ T 세포-중재 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따라 동시 사용되는 조성물들 모두는 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포-중재 면역 반응 및 더 바람직하게, CD8+ 및 CD4+ 면역 반응을 유도할 수 있다. 임의로, 상기 조성물 중 적어도 하나는 체액성 면역 반응을 유발할 수 있다. 바람직하게, 상기 면역요법 조성물 중 하나에 의하여 유발되는 상기 T 세포-중재 면역 반응은 상기 다른 면역요법 조성물에 의하여 유발되는 T 세포-중재 면역 반응과 하나 이상의 측면에서 표현형적으로 및/또는 기능적으로 구분된다. 일 측면에서, 상기 면역요법 조성물은 다음 특성 중 하나 이상을 가진다: (a) 항원 제시 세포를 활성화하는데 효과적인 하나 이상의 패턴 인식 수용체를 자극; (b) 항원 제시 세포 상에서 부착 분자, 공동 자극 분자, 및 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자를 상향조절; (c) 항원 제시 세포에 의한 친염증성 사이토카인 생산을 유도; (d) T 세포에 의한 Th1-타입 사이토카인 생산을 유도; (e) T 세포에 의한 Th17-타입 사이토카인 생산을 유도; (f) Treg를 저해 또는 하향조절; 및/또는 (g) MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II, 항원 특이적 면역 반응을 유발. 적합한 면역요법 조성물은 효모-기제 면역요법 조성물, 바이러스-기제 면역요법 조성물, 항체-기제 면역요법 조성물, DNA 면역요법 조성물, 서브유닛 백신, 및 TLR 작용제, 사이토카인, 증강제 및 기타 제제와 같은 면역 반응을 자극 또는 조절하는데 유용한 임의의 성분 또는 보조제, 및 이의 조합을 포함할 수 있으며, 이들 중 많은 것이 이하 더욱 상세히 기재된다. 일 측면에서, 본 발명에 사용되는 면역요법 조성물는 재조합 바이러스-기제 조성물 및 효모-기제 조성물 (이하 상세히 기재함)을 포함한다.
바이러스-기제 면역요법 조성물
본 발명의 일 측면은 재조합 바이러스-기제 면역요법 조성물 (이 문구는 "바이러스-기제 면역요법 생성물", "바이러스-기제 조성물", "바이러스-기제 면역치료제", "바이러스-기제 백신", "재조합 바이러스 또는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 면역요법 조성물" 또는 이들 문구의 유사어와 상호 교환가능하게 사용될 수 있다)에 관한 것이다. 본원에 사용되는 용어 "바이러스-기제 면역요법 조성물"은 바이러스 벡터 성분 (예를 들어, 재조합 바이러스 또는 바이러스 벡터를 구성하기에 효과적인 그 일부)을 포함하고 대상 내에서 적어도 하나의 치료적 이점을 달성하기에 충분한 면역 반응을 유발하는 조성물을 의미한다. 바이러스-기제 면역요법 조성물 및 이의 제조 및 일반적인 이용 방법은 예를 들어, 미국 특허 제 6,045,802호, 미국 특허 제 6,893,869호, 미국 특허 제 6,548,068호, 및 미국 특허 제 6,969,609호 에 상세히 기재되며, 이들 문헌 각각은 그 전체로서 본원에 포함된다. 일 측면에서, 본 발명에 유용한 바이러스-기재 면역요법 조성물은 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포-중재 면역 반응, 일 측면에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포-중재 면역, 및 일 측면에서, 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명에 유용한 바이러스-기제 면역요법 조성물은 예를 들어 개체 내에서 상기 개체의 질병 또는 상태를 치료하도록 또는 상기 질병 또는 상태로부터 초래되는 증상을 개선 또는 치료하도록 면역 반응을 유발할 수 있다.
바이러스-기제 면역요법 조성물은 전형적으로 바이러스 게놈 또는 그의 일부 (예를 들어,재조합 바이러스) 및 질병 야기 제제 또는 질병 상태로부터 적어도 하나의 항원(예를 들어, 암 항원, 전염성 질병 항원, 및/또는 그의 적어도 하나의 면역원성 도메인)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 일 부 구현예에서, 바이러스-기제 면역요법 조성물은 하나 이상의 면역자극 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역자극 분자 및 항원을 인코딩하는 유전자를 동일한 바이러스 벡터 내로 삽입한다 (동일한 재조합 바이러스).
본 발명의 면역요법 조성물 내 사용될 수 있는 바이러스는 세포를 감염시켜 항원의 프로세싱 및 제시를 허용하는 바이러스에 의하여 운반되는 항원의 세포내 발현을 유도하는 임의의 바이러스이다. 이들 바이러스 중 Th1 반응 및 Tc1 표현형을 가지는 CD8+ T-세포를 유도하는 것들이 바람직하다. 본 발명의 조성물 내 사용될 수 있는 바이러스는 그 게놈의 일부가 결실되어 그 바이러스의 전염성을 파괴하지 않고 새로운 유전자를 도입할 수 있는 바이러스를 포함한다.
본 발명의 바이러스 벡터 생산에 유용한 모바이러스 (즉, 바이러스 벡터/재조합 바이러스가 이로부터 생산되고, 유도되고, 이에 근거한 바이러스)는 이에 제한되지 않으나 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 알파바이러스, 레트로바이러스, 피코르나바이러스, 바큘로바이러스, 및 이리도바이러스를 포함한다. 본 발명에서 유용성을 가지는 폭스바이러스 (Poxviridae과의 멤버)는 복제 및 비복제 벡터를 포함한다. 이러한 폭스바이러스는 이에 제한되지 않으나 백시니아 바이러스 (Perkus et al., Science 229:981-984, 1985; Kaufman et al., Int . J. Cancer 48:900-907, 1991, Moss, Science 252:1662, 1991), 라쿤 폭스, 래빗 폭스 등과 같은 오르토폭스 (Orthopoxvirus 속), 파울폭스 바이러스, suipox (Suipoxvirus 속), 카프리폭스 (Capripoxvirus속) 등을 포함하는 아비폭스 (Avipoxvirus속)을 포함한다. 폭스 바이러스는 백시니아 코펜하겐, 백시니아-와이어스 균주, 매우 약독화된 백시니아 바이러스 (백시니아-MVA 균주), 변형된 백시니아 앙카라 (Sutter and Moss, Proc . Nat'l Acad . Sci . U.S.A. 89:10847-10851; Sutter et al., Virology 1994), NYVAC, TROVAC, 카나리폭스, ALVAC (Baxby and Paoletti, Vaccine 10:8-9, 1992; Rinns, M. M. et al., (Eds) Recombinant Poxviruses CRC Press, Inc., Boca Raton 1992; Paoletti, E., Proc . Nat'l Acad . Sci. USA 93:11349-11353, 1996), 스와인폭스 등으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 백시니아-와이어스 균주의 유도체는 이에 제한되지 않으나 기능적 K1L 유전자를 결여한 vTBC33를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 바이러스는 질병관리 본부, Atlanta, Gerogia로부터 스몰폭스 백신으로 유용한 Dry-Vax이다. 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 백시니아 바이러스이다. 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 파울폭스 바이러스부터이다. 파울폭스 바이러스의 한 균주는 예를 들어 POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation)이다.
본 발명에서 유용성을 가지는 재조합 폭스바이러스는 (i) 유전자의 항원 제시 세포 (APC) 및 종양 세포를 포함하는 복수 세포 유형으로 효율적인 전달; (ii) 높은 수준의 단백질 발현; (iii) 면역 체계에 최적의 항원 제시; (iv) 항체 반응뿐 아니라 세포 중재 면역 반응을 유발하는 능력; (v) 영구적이라기보다 일시적인 세포의 유전적 변형, 및 (vi) 그들이 면역학적으로 교차반응성이 아니므로 상이한 속으로부터 폭스바이러스의 사용 조합 능력을 포함하는 많은 속성을 가진다.
재조합 백시니아 (r, rMVA) 및 재조합 파울폭스 (rF) 바이러스는 본 발명의 바이러스-기제 면역요법 조성물 내 사용하기 위한 예시적인 두 개의 바이러스이다. 쥐 B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3 유전자 및 인간 CEA 유전자(rV/F-CEA/TRICOM)를 함유하는 재조합 백시니아 및 파울폭스 바이러스가 기재되었으며 (Hodge et al., Cancer Res 1999 Nov 15;59(22):5800-7; Grosenbach et al., Cancer Res 2001 Jun 1;61(11):4497-505; and Hodge et al., Cancer Res 2003 Nov 15;63:7942-7949), 상기 문헌 각각은 본원에 참조로 그 전체로서 포함된다. 쥐 GM-CSF-발현 rF 바이러스 (rF-GM- CSF) 가 이전에 기재되었다 (Kass et al., Cancer Res 2001 Jan 1;61(1):206-14). 본 발명의 목적을 위하여, "rV/F-CEA/TRICOM"로 명명되는 백신은 rF-GM-CSF와 혼합된 rF-CEA/TRICOM (B7-1, ICAM-1, LFA-3 및 CEA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 파울폭스)로 7일마다 부스티팅되는, rF-GM-CSF (GM-CSF를 인코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 파울 폭스)와 혼합된 rV-CEA/TRICOM (B7-1, ICAM-1, LFA-3 및 CEA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 백시니아)로 프라이밍(priming)을 포함하는 완전 백신 프로토콜을 의미한다. CEA는 본 발명의 하나 이상의 면역요법 조성물과 관련하여 사용되는 적합한 항원 (이 경우, 종양 관련 또는 암 항원)의 일 예일 뿐임을 이해하여야 한다.
본 발명의 바이러스 벡터는 핵산 서열에 작동가능하게 결합되는 적어도 하나의 발현 조절 요소를 포함한다. 상기 발현 조절 요소는 벡터 내에 삽입되어 핵산 서열의 발현을 조절한다 (Ausubel et al, 1987, in "Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N.Y.). 발현 조절 요소는 당업계에 알려져 있으며, 프로모터를 포함한다. 본 발명에 사용가능한 프로모터는 폭시바이러스 프로모터이며, 이는 이에 제한되지 않으나 30K, I3, sE/L, 7.5K, 40K, 및 C1를 포함한다. 상기 30K 프로모터의 핵산 서열은 GenBank Accession No. M35027에 염기 번호 28,012 내지 28,423 (안티센스)로 개시되어 있다. 상기 13의 핵산 서열은 GenBank Accession No. J03399에 염기 번호 1100 내지 1301 (안티센스)로 개시되어 있다. 상기 7.5K 프로모터의 핵산 서열은 GenBank Accession No. M35027에 염기 번호 186550 내지 186680으로 개시되어 있다. 상기 40K 프로모터의 핵산 서열은 GenBank Accession No. M13209에 염기 번호 9700 내지 9858로 개시되어 있다. 상기 C1 프로모터의 핵산 서열은 GenBank Accession No. M59027에 염기 번호 1 내지 242로 및 미국 특허 제 5,093,258호에 개시되어 있다. 상기 sE/L 프로모터의 핵산 서열은 당업계에 공지되어 있다. Davison and Moss (J. Mol . Biol. 210:749-769. (1989)에 기재된 것과 같은 기타 폭스바이러스 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 프로모터 중 임의의 것은 당업계의 표준 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 적절한 프로모터의 선별은 그 발현 타이밍 및 수준에 근거한다. 초기 또는 초기/후기 프로모터가 일 측면에서 사용된다. 일 구현예에서, 사용되는 프로모터 또는 프로모터들의 조합은 감염된 숙주 내 각각의 항원 및/또는 공동자극 분자의 최적의 발현을 허용하여 상승적인 면역 반응을 제공한다. 일 구현예에서, 항원 또는 공동자극 분자를 인코딩하는 각각의 핵산 분자는 별도의 구분된 프로모터에 의하여 조절된다.
본 발명에 사용하기 위한 면역요법 조성물과 함께 사용되는 면역자극성 분자는 이에 제한되지 않으나 사이토카인 및 공동자극 분자를 포함한다. 예를 들어, 사이토카인은 이에 제한되지 않으나 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터류킨-6 (IL-6), 과립 대식세포 집락 자극인자 (CM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ), IFN-α, IFN-λ, 인터류킨-12 (IL-12), RANTES, 및 인터류킨-2 (IL-2)를 포함한다. 공동자극 분자는 이에 제한되지 않으나 B7.1 (본원에서 B7-1로도 언급), B7.2 (본원에서 B7-2로도 언급), ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD40L 및 CD70를 포함한다. 면역자극성 분자는 본 발명의 면역요법 조성물 단독 내에 및/또는 다양한 조합 내에 제공될 수 있으며, 하나 이상의 바이러스 벡터 또는 기타 백신 벡터에 의하여 발현될 수 있다. 일 측면에서, 본 발명의 재조합 벡터는 단일 또는 이중 공동자극 분자의 사용에 의하여 얻을 수 없는 면역 반응의 상승적 증진을 위한 적어도 세 개의 공동자극 분자를 인코딩하는 유전자들을 포함한다. 다양한 조합의 공동자극 분자를 인코딩하는 유전자들은 재조합 벡터 내 사용하기 위한 본 발명의 요소이며, 원하는 면역 반응 및 치료될 질병 또는 상태에 따라 다음과 같은 조합을 포함할 수 있다: B7.1, B7.2, ICAM-1, 및 LFA-3; B7.1, ICAM-1, 및 LFA-3; B7.1, B7.2, ICAM-1, 및 4-1BBL; B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, 및 4-1BBL; CD59 및 VCAM-1; 및 B7.1 및 B7.2; CD59, CD40, 4-BBL, CD70 및 VCAM-1, B7.1, B7.2; OX-40L, 4-1BBL.
B7.1 (CD80) 은 T- 및 B-세포 부착을 중재하는 T-세포 항원, CD28에 대한 천연 리간드이다. B7.1은 활성화된 B-세포 및 감마-인터페론-자극된 단핵구 상에서 발현된다. CD80의 CD28 및 CTLA04에의 결합은 T-세포에 공동자극 신호를 제공하며 상향조절된 림포카인 생산을 야기한다. B7.2 (CD86)는 CD28 및 CTLA-4의 대안적인 리간드이다.
CD54로도 알려진 ICAM-1 (세포내 부착 분자 1)은 백혈구- 및 내피-관련 세포내 부착 분자이며, LFA-1 (인테그린), 백혈구 수용체에 대한 리간드이다. ICAM-1은 사이토카인 자극에 따라 상향조절되며 세포 상호작용, 백혈구 내피 트랜스마이그레이션, 친염증성 면역 세포의 모집과 관련된 시그널링에 수반된다.
LFA-3 (림프구 기능 관련 항원-3), 또는 CD58은 항원 제시 세포 (APCs)에 의하여 발현되는 부착 분자이며, 공동 자극 신호를 CD2, T 세포 및 자연 살해 (NK) 세포 상에 발견되는 부착 분자를 통하여 중재한다. 이러한 상호 작용은 T 세포의 세포내 부착 및 활성화를 촉진한다.
4-1BBL은 활성화된 항원 제시 세포 (APCs) 상에서 발현되며, 활성화된 CD4 및 CD8 T 세포 상에서 발현되는 종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 공동자극 일원인 4-1BB에 대한 리간드이다. 이들 분자의 상호 작용은 T 세포 증식 및 생존을 증진시키고, CD8+ T 세포 메모리를 팽창 및 활성화할 수 있다 (Bukczynski et al., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 2004, 101(5):1291-6).
CD59는 보체조절 단백질이다. 백시니아 바이러스, 백시니아를 포함하는 바이러스는 숙주 세포 CD59를 그들 자신의 바이러스 엔빌로프 내로 혼입시켜 보체에 의한 용해를 예방한다 (Bohana-Kashtan et al., 2004, Mol . Immunol . 41 (6-7): 583-97).
VCAM-1 (혈관세포 부착 분자-1), 또는 CD106은 내피 세포에 의하여 발현되는 부착 분자이며 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구의 혈관 내피에의 부착을 중재한다. 이는 또한 백혈구-내피 세포 신호 전달에 있어서도 작용한다.
CD40은 항원 제시 세포 (APCs)에 의하여 발현되는 공동자극 단백질이다. T 세포 상에서 CD40의 그 천연 리간드 CD40L에의 결합은 APC를 활성화하고 다양한 면역 및 염증성 반응을 중재하는 시그널링 케스케이드를 개시한다.
CD70은 장기 T 세포 면역력 생성 및 유지에 요구되는 수용체인 CD27에 대한 리간드이다.
OX40-L은 활성화된 B 세포, T 세포, 수지상 세포 및 내피 세포 표면에서 발현되고, 주로 활성화된 CD4+ 세포에 의하여 발현되는 그 천연 수용체 OX40에 결합하며, 따라서, 이러한 상호작용은 T 세포 활성화와 관련된다.
GM-CSF (과립 대식세포 집락 자극인자)는 T 세포, 대식 세포 및 기타 세포에 의하여 생산되는 백혈구 성장 인자로서 작용하는 사이토카인이다. GM-CSF는 줄기세포를 자극하여 과립구 (호중구, 호산구, 및 호염기구) 및 단핵구를 생산하며, 따라서 이는 면역 체계 활성화 및 발달 과정의 일부이다.
바이러스 복제/감염 부위에서 (어떠한 경우에도, 항원 생산 부위) 면역자극 분자 및 항원의 동시 생산은 특정 이펙터 생산을 증진시킨다. 특정 면역자극 분자에 따라, 상이한 메커니즘이 증진된 면역원성: 헬프 시그널 (IL-2)의 증가, 전문적 APC (GM-CSF) 모집, CTL 주기 (IL-2) 증가, 및/또는 항원 프로세싱 경로 및 MHC 발현 (IFN-γ 및 TNFα)에 대한 영향에 책임이 있을 것이다. 몇몇 경우, 다가 백신을 가지기 위하여 하나 이상의 해당 항원을 포함하는 재조합 바이러스를 생산하는 것이 이로울 것이다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 내에 복수 공동자극 분자를 인코딩하는 핵산 분자를 함유하는 재조합 바이러스 (예를 들어, 폭스바이러스)를 포함한다. 상기 재조합 바이러스는 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하거나, 또는 대안적으로, 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 제2 재조합 바이러스 (예를 들어, 폭스바이러스)가 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 사용가능한 바이러스-기제 면역요법 조성물은 B7.1 또는 B7.2를 인코딩하는 핵산 서열, ICAM-1를 인코딩하는 핵산 서열, 및 LFA-3을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스 (예를 들어, 재조합 폭스바이러스) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 상기 B7, ICAM-1, LFA-3 구조물 외에, 상기 약학적 조성물의 재조합 바이러스는 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 부가적으로 포함하거나, 또는 대안적으로, 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인이 제2 재조합 바이러스에 의하여 상기 조성물 내에 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 부가적인 면역 반응의 상승 또는 증진을 위하여, 이에 제한되지 않으나 공동자극 분자 B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L 및/또는 이러한 면역자극 분자에 결합하는 항체, 및/또는 이러한 면역자극 분자의 작용제 또는 길항제, 및/또는 이에 제한되지 않으나 IL-2, GM-CSF, TNF-α IFN-γ IFN-α IFN-λ IL-12, RANTES, MIP-1α Flt-3L (U.S. Pat. Nos. 5,554,512; 5,843,423) 등을 포함하는 사이토카인 및 케모카인을 포함하는, 당업계에 공지된 외인성 첨가 면역자극 분자를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 30K 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 LFA-3 또는 이의 기능적 부분을 인코딩하는 핵산 서열, I3 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 ICAM-1 또는 이의 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및 sE/L 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 B7.1 또는 이의 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폭스바이러스가 제공된다. 상기 재조합 폭스바이러스는 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, sE/L 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 B7.1을 인코딩하는 핵산 서열, I3 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 LFA-3 또는 그의 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및 7.5K 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 ICAM-1 또는 그의 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폭스바이러스가 제공된다. 임의로, 상기 구조물을 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 재조합 파울폭스 바이러스는 sE/L 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 B7.1을 인코딩하는 핵산 서열, I3 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 LFA-3 또는 그의 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및 7.5K 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 ICAM-1 또는 그의 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 재조합 파울폭스 바이러스는 40K 폭스바이러스 프로모터와 같은 폭스바이러스 프로모터의 조절하에 표적 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 재조합 바이러스-기재 면역요법 조성물은 항원을 발현하지 않으나, 이러한 경우, 이와 같은 조성물의 재조합 바이러스 벡터(들)은 여전히 본원의 다른 곳에 기재된 하나 이상의 면역자극 분자를 여전히 발현한다. 본 발명의 이러한 구현예에서, 상기 항원은 효모-기제 면역요법 조성물과 같은 본원에 기재된 하나 이상의 다른 면역요법 조성물에 의하여 제공된다. 본 발명에 사용되는 면역요법 조성물 각각은 몇몇 고유한 "위험 신호" 또는 공동자극 신호를 면역 체계에 제공할 수 있으므로, 조성물 중 단지 하나만이 항원을 포함하나 벡터의 기여를 제공하기에 충분할 것이다.
본 발명은 항원 및/또는 복수 공동자극 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스의 생산 방법을 추가로 제공한다. 재조합 폭스바이러스의 한가지 생산 방법은 모 폭스바이러스 게놈 DNA와 삽입될 이종 서열을 운반하는 플라스미드 벡터 사이의 생체 내 상동 재조합을 통하여 달성된다. 외부 서열의 폭스바이러스 내로의 삽입을 위한 플라스미드 벡터는 재조합 DNA 기법의 표준 방법에 의하여 작제된다. 상기 플라스미드 벡터는 하나 이상의 키메릭 외부 유전자를 함유하며, 이들 각각은 폭스바이러스 게놈의 비필수 영역으로부터의 바이러스 서열에 의하여 플랭킹된 단백질 코딩 서열에 연결되는 폭스바이러스 프로모터를 포함한다. 상기 플라스미드는 승인된 형질감염 방법을 이용하여 모 폭스바이러스로 감염된 세포 내로 형질감염되고, 상기 플라스미드 상의 폭스바이러스 서열과 모 바이러스 게놈 내 상응하는 DNA 사이의 재조합은 상기 프라스미드로부터 키메릭 외부 유전자의 바이러스 게놈 내로의 삽입을 야기한다. 재조합 바이러스가 당업계에 공지된 다양한 선별 또는 스크리닝 시스템 중 임의의 것을 이용하여 선별 및 정제된다. 외부 유전자의 백시니아 게놈 내로의 삽입은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 분석에 의하여 확인된다. 외부 유전자 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의하여 입증된다. 대안적인 재조합 폭스바이러스 생산 방법은 직접 결찰에 의하여 달성된다 (Pleiderer et al., J. Gen . Virol. 76:2957-2962, 1995; Merchlinsky et al., Virol. 238:444-451, 1997).
효소-기제 면역요법 조성물
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 "효모-기제 면역요법 조성물" (이러한 표현은 "효모-기제 면역요법 생성물", "효모-기제 조성물", "효모-기제 면역치료제", "효모-기제 백신", "효모 베히클을 포함하는 면역요법 조성물", 또는 이러한 표현의 유사어와 상호교환적으로 사용될 수 있다)의 용도를 포함한다. 본원에 사용되는 표현 "효모-기제 면역요법 조성물"은 효모 베히클 성분을 포함하고 대상 내에서 적어도 하나의 치료 이점을 달성하기에 충분한 면역 반응을 유발하는 조성물을 의미한다. 보다 구체적으로, 효모-기제 면역요법 조성물은 효모 베히클 성분을 포함하고, 제한없이 T 세포-중재 세포성 면역 반응을 포함하는 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응을 유발 또는 유도할 수 있는 조성물이다. 일 측면에서, 본 발명에 사용가능한 효모-기제 면역요법 조성물은 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포-중재 면역 반응, 일 측면에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포-중재 면역 반응을 유도하 수 있다. 임의로, 효모-기제 면역요법 조성물은 체액성 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 효모-기제 면역요법 조성물은 예를 들어 개체의 질병 또는 상태가 치료되도록 또는 상기 질병 또는 상태로부터 야기되는 증상을 개선 또는 치료하도록 개체 내에서 면역 반응을 유발할 수 있다.
전형적으로, 효모-기제 면역요법 조성물은 효모 베히클 및 상기 효모 베히클에 의하여 발현되거나 이에 부착되거나 또는 이와 혼합되는 적어도 하나의 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 또는 그 면역원성 도메인은 융합 단백질로서 제공된다. 본 발명의 일 측면에서, 융합 단백질은 두 개 이상의 항원을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 상기 융합 단백질은 하나 이상의 항원의 두 개 이상의 면역원성 도메인, 또는 하나 이상의 항원의 두 개 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. TARMOGEN®은 본 발명에 사용가능한 효모-기제 면역요법 조성물의 비제한적 일 예이다. TARMOGEN® (TARgeted MOlecular immunoGEN, GlobeImmune, Inc., Louisville, Colorado) 은 일반적으로 하나 이상의 비상동 항원을 세포 외 (그 표면 상에), 세포 내 (내부적으로 또는 세포질) 또는 세포외 및 세포외 모두 발현하는 효모 베히클을 의미한다.
효모-기제 면역요법 조성물, 및 이의 제조 및 일반적 이용 방법은 예를 들어 미국 특허 제 5,830,463 호, 미국 특허 제 7,083,787 호, 미국 특허 제 7,465,454호, 미국 특허 공보 제 2007-0224208호, 미국 특허 공보 제 US 2008-0003239호, 및 Stubbs et al., Nat . Med . 7:625-629 (2001), Lu et al., Cancer Research 64:5084-5088 (2004), 및 Bernstein et al., Vaccine 2008 Jan 24;26(4):509-21에 기재되어 있으며, 상기 문헌들 각각은 본원에 전체로서 참조로 포함된다. 이러한 효모-기제 면역요법 생성물은 세포성 및 체액성 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 유발하는 것으로 입증되었다. 효모-기제 면역요법 생성물은 다양한 동물 종 내에서 생체 내에서 다양한 항원을 발현하는 표적 세포를 치사할 수 있으며, 이는 항원-특이적 CD8+ 및/또는 CD4+ 중재 면역 반응을 통하여 일어난다. 추가적인 연구는 효모가 활발히 식균작용되고 수지상 세포를 직접적으로 활성화하며, 이는 효모-관련 단백질을 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 매우 효율적인 방식으로 제시함을 보였다. 예를 들어, Stubbs et al. Nature Med. 5:625-629 (2001) 및 미국 특허 제 7,083,787호를 참조한다.
본 발명에 사용되는 효모-기제 면역요법 조성물 중 임의의 것에서, 효모 베히클과 관련되는 다음 측면들이 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따르면, 효모 베히클은 본 발명의 치료 조성물 내에 하나 이상의 항원, 그의 면역원성 도메인 또는 그의 에피토프와 함께 사용될 수 있는 임의의 효모 세포 (예를 들어, 전체 또는 미손상 세포) 또는 그 유도체 (이하 참조)이거나, 또는 일 측면에서, 상기 효모 베히클은 단독으로 또는 보조제로서 사용될 수 있다. 따라서, 효모 베히클은 이에 제한되지 않으나, 생 미손상 효모 미생물 (즉, 세포벽을 포함하는 그 성분 모두를 가지는 효모 세포), 다음을 포함하는 살해된 (죽은) 또는 불활성화된 미손상 효모 미생물 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다: 효모 스페로플라스트 (즉, 세포벽을 결여한 효모 세포), 효모 사이토플라스트 (즉, 세포벽 및 핵을 결여한 효모 세포), 효모 고스트 (즉, 세포벽, 핵 및 세포질을 결여한 효모 세포), 세포내 효모막 추출물 또는 그의 분획 (효모막 입자로도 언급되며 이전에 세포내 효모 입자로도 언급됨), 임의의 기타 효모 입자, 또는 효모 세포벽 제제.
효모 스페로플라스트는 전형적으로 효모 세포벽의 효소적 분해에 의하여 생산된다. 이러한 방법은 예를 들어, Franzusoff et al., 1991, Meth . Enzymol . 194, 662-674에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 그 전체로서 참조로 포함된다.
효모 사이토플라스트는 전형적으로 효모 세포의 제핵에 의하여 생산된다. 이러한 방법은 예를 들어, Coon, 1978, Natl . Cancer Inst . Monogr . 48, 45-55에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 그 전체로서 참조로 포함된다.
효모 고스트는 전형적으로 투과화되거나 용균된 세포를 재밀봉함으로써 생산되며, 그 세포소기관의 적어도 일부를 함유할 수 있으나 반드시 그러할 필요는 없다. 이러한 방법은 예를 들어, Franzusoff et al., 1983, J. Biol . Chem . 258, 3608-3614 및 Bussey et al., 1979, Biochim . Biophys . Acta 553, 185-196에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 그 전체로서 참조로 포함된다.
효모막 입자 (세포내 효모막 추출물 또는 그의 분획)는 천연 핵 또는 세포질을 결여하는 효모 막을 의미한다. 상기 입자는 천연 효모막의 크기로부터 음파처리 또는 기타 당업계에 공지된 막 균열 후 재밀봉에 의하여 생산되는 미세입자 범위의 크기를 포함하는 임의의 크기일 수 있다. 세포내 효모막 추출물의 제조 방법은 예를 들어 Franzusoff et al., 1991, Meth . Enzymol . 194, 662-674에 기재되어 있다. 효모막 부분을 함유하는 효모막 입자의 분획, 및 항원 또는 기타 단백질이 효모막 입자의 제조 전에 효모에 의하여 재조합에 의하여 발현될 때, 상기 항원 또는 기타 단백질을 이용할 수 있다. 해당 항원 또는 기타 단백질은 상기 막 내부에, 상기 막의 표면 상에, 또는 이들 조합으로 (즉, 상기 단백질은 상기 막 내부 및 외부 모두에 및/또는 효모막 입자의 막에 걸쳐 있을 수 있다) 운반될 수 있다. 일 구현예에서, 효모막 입자는 미손상, 균열된 재조합 효모막 입자이거나, 또는 적어도 하나의 원하는 항원 또는 기타 단백질을 막 표면에 또는 적어도 부분적으로 막 내에 넣어져 포함하는 균열되고 재밀봉된 효모막이다.
효모 세포 벽 제제의 예는 상기 표모 세포벽 제제가 동물에 투여될 때 질병 표적에 대하여 원하는 면역 반응을 자극하도록 그 표면 상에 또는 적어도 부분적으로 세포벽 내에 넣어진 항원은 운반하는 분리된 효모 세포벽이다.
임의의 효모 균주를 이용하여 본 발명의 효모 베히클을 생산할 수 있다. 효모는 세 개의 강: 자낭균류, 담자균류 및 불완전 균류 중 하나에 속하는 단세포 미생물이다. 면역 조절 인자로서 사용하기 위한 효묘 유형의 선별을 위하여 고려할 한가지 사항은 효모의 병원성이다. 일 구현예에서, 상기 효모는 Saccharomyces cerevisiae와 같은 비-병원성 균주이다. 비-병원성 효모 균주의 선별은 상기 효모 베히클이 투여되는 개체에 대한 부작용을 최소화한다. 그러나, 효모의 병원성이 당업자에게 공지된 임의의 수단 (예를 들어, 돌연변이 균주)에 의하여 무효화 될 수 있다면, 병원성 효모를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따라, 비병원성 효모 균주가 사용된다.
본 발명에 사용될 수 있는 효모 균주의 속은 이에 제한되지 않으나 Saccharomyces, Candida (병원성일 수 있음), Cryptococcus , Hansenula , Kluyveromyces, Pichia , Rhodotorula , Schizosaccharomyces 및 Yarrowia를 포함한다. 일 측면에서, 효모 종은 Saccharomyces , Candida , Hansenula , Pichia or Schizosaccharomyces로부터 선택되고, 일 측면에서, Saccharomyces 가 사용된다. 본 발명에 사용될 수 있는 효모 균주의 종은 이에 제한되지 않으나 Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis , Candida albicans , Candida kefyr , Candida tropicalis , Cryptococcus laurentii , Cryptococcus neoformans , Hansenula anomala , Hansenula polymorpha , Kluyveromyces fragilis , Kluyveromyces lactis , Kluyveromyces marxianus var . lactis , Pichia pastoris , Rhodotorula rubra , Schizosaccharomyces pombe, 및 Yarrowia lipolytica를 포함한다. 다수의 이들 종이 상기한 종 내에 포함되는 다양한 아종, 유형, 아류형 등을 포함한다. 일 측면에서, 본 발명에 사용되는 효모 종은 S. cerevisiae , C. albicans , H. polymorpha, P. pastoris and S. pombe를 포함한다. S. cerevisiae가 비교적 조작하기 용이하며 "일반적으로 안전한 것으로 인식(Generally Recognized As Safe)"되거나 음식 첨가물로서 사용하기에 "GRAS" (GRAS, FDA 상정된 Rule 62FR18938, April 17, 1997)하므로 유용하다. 본 발명의 일 구현예는 S. cerevisiae cir°균주와 같이, 플라스미드를 특히 높은 복제수로 복제할 수 있는 효모 균주이다. 상기 S. cerevisiae는 하나 이상의 표적 항원 및/또는 항원 융합 단백질 및/또는 기타 단백질이 높은 수준으로 발현되도록 허용하는 발현 벡터를 지지할 수 있는 균주 중 하나이다. 또한, 본 발명에서, N-결합 글리코실화를 연장하는 효소 내 돌연변이와 같은, 발현되는 표적 항원 또는 기타 단백질의 감소된 번역후 변형을 나타내는 것들을 포함하는 임의의 돌연변이 효모 균주를 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 효모 베히클은 수지상 세포 또는 대식세포와 같은 효모 베히클 및 항원/제제가 전달되는 세포 유형과 융합함으로써, 효모 베히클의 특히 효율적인 전달을 실행할 수 있으며, 많은 구현예에서, 상기 항원(들) 또는 기타 제제를 세포 유형과 융합한다. 본원에 사용되는 효모 베히클의 표적화된 세포 유형과의 융합은 효모 세포막 또는 그 입자의 표적화된 세포 유형 (예를 들어, 수지상 세포 또는 대식세포)의 막과 융합하여 융합세포(syncytia) 형성을 초래할 수 있는 능력을 의미한다. 본원에 사용되는 융합세포(syncytium)는 세포의 병합에 의하여 생산되는 원형질의 다핵성 매스이다. 많은 바이러스 표면 단백질 (HIV, 인플루엔자 바이러스 폴리오바이러스 및 아데노바이러스와 같은 면역결핍 바이러스의 것들을 포함) 및 기타 융합생성제(fusogens) (난자와 정자 사이의 융합에 수반되는 것들과 같은)가 두 막 사이의 (즉, 바이러스 및 포유동물 세포막 사이 또는 포유동물 세포막 사이) 융합을 실행할 수 있는 것으로 보여졌다. 예를 들어, HIV gp120/gp41 이종 항원을 그 표면에 생산하는 효모 베히클은 CD4+ T-림프구와 융합할 수 있다. 그러나, 표적 부분을 효모 베히클 내로 혼입은 어떠한 경우 바람직할 수 있으나 필수적이지 않음을 주목한다. 항원을 세포외 발현하는 효모 베히클의 경우, 이는 본 발명의 효모 베히클의 추가적인 이점일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 사용가능한 효모 베히클은 수지상 세포 (및 대식 세포와 같은 기타 세포)에 의하여 쉽게 테이크업될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 효모-기제 면역요법 조성물은 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인 또는 그의 에피토프를 포함한다. 본 발명에 사용이 고려되는 항원은 이에 대한 면역 반응을 유발하는 것이 요구되는 임의의 항원을 포함한다 (이하 보다 상세히 기재함).
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 효모-기제 면역요법 조성물은 항원을 발현 또는 함유 또는 나타내지 않으나, 이러한 경우, 효모 베히클은 임의로 하나 이상의 면역자극성 분자를 발현할 수 있다. 이러한 본 발명의 구현예에서, 상기 항원은 바이러스-기제 면역요법 조성물과 같은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 상이한 면역요법 조성물에 의하여 제공된다. 본 발명에 사용되는 각각의 면역요법 조성물은 몇몇 고유한 "위험 신호" 또는 공동자극 신호를 면역 체계에 제공할 수 있으므로, 상기 조성물 중 단지 하나만이 항원을 포함하지만 벡터의 기여를 제공하기에 충분할 것이다.
본 발명에 의하면, 용어 "효모 베히클-항원 복합체" 또는 "효모-항원 복합체"는 일반적으로 효모 베히클과 항원의 회합을 기재하기 위하여 사용되며, 그러한 조성물이 상기한 바와 같은 면역 반응을 유발하는데 이용되는 경우 "효모-기제 면역요법 조성물"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 이러한 회합은 효모 (재조합 효모)에 의한 항원 발현, 항원의 효모 내로의 도입, 항원의 효모에의 물리적 부착, 및 완충액 또는 기타 용액 또는 제제 내에서와 같은 효모 및 항원의 혼합을 포함한다. 이러한 유형의 복합체는 이하 상세히 기재한다.
일 구현예에서, 효모 베히클 제조에 사용되는 효모 세포 (예를 들어, 전체 효모) 또는 효모 베히클이 단백질 (예를 들어, 항원 또는 제제)을 인코딩하는 이종 핵산 분자로 형질감염되어, 상기 단백질이 효모 세포에 의하여 발현된다. 이러한 효모는 또한 본원에서 재조합 효모 또는 재조합 효모 베히클로 언급된다. 그 다음, 상기 효모 세포가 투여되거나, 또는 효모 세포가 치사되거나, 또는 효모 스페로플라스트, 사이토플라스트, 고스트 또는 세포내 입자 형성에 의한 것과 같이 유도체화될 수 있다. 효모 스페로플라스트는 또한 재조합 핵산 분자로 직접 형질감염되어 (예를 들어, 스페로플라스트가 전체 효모로부터 생산된 다음, 형질감염된다) 항원 또는 기타 단백질을 발현하는 재조합 스페로플라스트를 생산할 수 있다.
일 측면에서, 효모 베히클 제조에 사용되는 효모 세포 또는 스페로플라스트는 항원 또는 기타 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질감염되어, 상기 항원 또는 기타 단백질이 상기 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트에 의하여 재조합적으로 발현된다. 이러한 측면에서, 항원 또는 기타 단백질을 재조합 발현하는 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트를 사용하여 효모 사이토플라스트, 효모 고스트 또는 효모 막 입자 또는 효모 세포벽 입자 또는 그의 분획을 포함하는 효모 베히클을 생산한다.
본 발명의 효모 베히클에 의하여 생산되는 많은 항원 및/또는 기타 단백질은 효모 베히클에 의하여 상당히 생산될 수 있는 임의의 수의 항원 및/또는 기타 단백질이며, 전형적으로 약 2 내지 약 6 이종 항원 및/또는 기타 단백질을 포함하는 적어도 1 내지 적어도 약 6 이상의 범위이다.
본 발명의 효모 베히클 내 항원 또는 기타 단백질의 발현은 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 달성될 수 있다. 간략하게, 일 측면에서, 적어도 하나의 원하는 항원 또는 기타 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 상기 핵산 분자가 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 방식으로 발현 벡터 내로 삽입하여, 숙주 효모 세포 내로 형질전환될 때 핵산 분자의 구성적 또는 조절 발현을 실행할 수 있도록 한다. 하나 이상의 항원 및/또는 기타 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합되는 하나 이상의 발현 벡터일 수 있다. 특히 중요한 발현 조절 서열은 프로모터 및 업스트림 활성화 서열과 같은 전사 개시를 조절하는 것들이다. 임의의 적절한 효모 프로모터를 본 발명에서 사용할 수 있으며, 다양한 이러한 프로모터가 당업자에게 공지되어 있다. Saccharomyces cerevisiae 내 발현을 위한 프로모터는 이에 제한되지 않으나 다음 효모 단백질을 인코딩하는 유전자의 프로모터를 포함한다: ADH2/GAPDH 및 CYC1/GAL10 프로모터와 같은 하이드리브 프로머터를 포함하고, 세포 내 글루코오스 농도가 낮을 때 (예를 들어, 약 0.1 내지 약 0.2%) 도입되는 ADH2/GAPDH 프로모터 및 CUP1 프로모터 및 TEF2 프로모터를 포함하는, 알콜 디하이드로게나아제 I (ADH1) 또는 II (ADH2), CUP1, 포스포글리세레이트 카이나아제 (PGK), 트리오스 포스페이트 이소머라아제 (TPI), 번역 신장 인자 EF-1 알파 (TEF2), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제 (GAPDH: 트리오스 포스페이트 디하이드로게나아제에 대하여 TDH3으로도 언급), 갈락토카이나아제 (GAL1), 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜-트랜스퍼라아제 (GAL7), UDP-갈락토오스 에피머라아제 (GAL10), 사이토크롬 c1 (CYC1), Sec7 단백질 (SEC7) 및 액시드 포스파타아제 (PHO5). 마찬가지로, 인핸서로도 불리우는 다수의 업스트림 활성화 서열 (UASs)이 공지되어 있다. Saccharomyces cerevisiae 내 발현을 위한 업스트림 활성화 서열은 이에 제한되지 않으나 다음 단백질을 인코딩하는 유전자의 UASs를 포함한다: GAL4 유전자 생성물에 의하여 활성화되는 기타 UASs뿐 아니라, PCK1, TPI, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 및 GAL10, 일 측면에서 ADH2 UAS 가 사용된다. ADH2 UAS 는 ADR1 유전자 생성물에 의하여 활성화되므로, 이종 유전자가 ADH2 UAS에 작동가능하게 연결될 때 ADR1 유전자를 과발현시키는 것이 바람직할 것이다. Saccharomyces cerevisiae 내 발현을 위한 전사 종결 서열은 α-인자, GAPDH, 및 CYC1 유전자의 종결 서열을 포함한다.
메틸트로픽 효모 내에서 유전자 발현을 위한 전자 조절 서열은 알콜 옥시다아제 및 포르메이트 디하이드로게나아제를 인코딩하는 유전자의 전사 조절 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 효모 세포 내로 핵산 분자의 형질 감염은 이에 의하여 핵산 분자가 세포 내로 투여되는 임의의 방법에 의하여 달성될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 확산, 능동수송, 욕(bath) 음파처리, 전기천공법, 미량주입법, 리포펙션, 흡착 및 원형질체 융합을 포함한다. 형질감염된 핵산 분자는 당업자에게 공지된 임의의 기법을 이용하여 효모 염색체 내로 통합되거나 염색체외 벡터 상에 유지될 수 있다. 이러한 핵산 분자를 운반하는 효모 베히클의 예는 본원에 상세히 개시되어 있다. 상기 논의한 바와 같이, 미손상 효모 미생물 또는 효모 스페로플라스트를 원하는 핵산 분자로 형질감염시켜 그 안에 항원을 생산한 다음 상기 미생물 또는 스페로플라스트를 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 조작하여 사이토플라스트, 고스트 또는 원하는 항원 또는 기타 단백질을 함유하는 세포내 효모 막 추출물 또는 이의 분획을 생산함으로써, 효모 사이토플라스트, 효모 고스트, 및 효모 막 입자 또는 세포벽 제제를 또한 재조합 생산할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 효모 베히클은 상기 항원이 상기 효모 베히클 표면 상에서 (세포외 발현) 부분적으로 또는 전체적으로 발현된 단백질 생성물의 전달 또는 전좌에 의하여 발현되거나 제공되도록 조작된다. 본 발명의 이러한 측면을 달성하기 위한 한가지 방법은 효모 베히클 표면 상에 하나 이상의 단백질을 포지셔닝하기 위한 스페이서 암을 사용하는 것이다. 예를 들어, 스페이서 암을 이용하여 효모 세포벽에 항원(들) 또는 해당 단백질과 상기 항원(들) 또는 기타 해당 단백질을 표적화하는 단백질과의 융합 단백질을 만들 수 있다. 예를 들어, 기타 단백질을 표적화하는데 사용될 수 있는 이러한 단백질 중 하나는 효모 단백질 (예를 들어, 항원(들) 또는 기타 단백질의 효모 세포벽에 표적화를 가능케 하여 상기 항원 또는 기타 단백질이 효모 표면 상에 위치하도록 하는 세포벽 단백질 2 (cwp2), Aga2, Pir4 또는 Flo1 단백질)이다. 효모 단백질 이외의 단백질을 스페이서 암을 위하여 사용할 수 있다; 그러나, 임의의 스페이서 암 단백질에 대하여, 면역원성 반응이 스페이서 암 단백질보다 표적 항원에 대하여 유발되도록 하는 것이 가장 바람직하다. 이와 같이, 기타 단백질이 스페이서 암을 위하여 사용된다면, 사용되는 스페이서 암 단백질은 표적 항원(들)에 대한 면역 반응이 압도될 정도로 스페이서 암 단백질 자체에 큰 면역 반응을 생성하지 말아야 한다. 당업자는 표적 항원(들)에 대한 면역 반응에 비하여 스페이서 암 단백질에 대한 작은 면역 반응을 목적으로 하여야 한다. 스페이서 암은 원하는 경우 항원이 효모로부터 쉽게 제거되거나 프로세싱되는 것을 허용하는 절단 부위 (예를 들어, 프로테아제 절단 부위)를 가지도록 작제될 수 있다. 면역 반응 크기를 결정하는 임의의 공지의 방법을 사용할 수 있으며 (예를 들어, 항체 생산, 용균 분석 등), 이는 당업자에게 공지되어 있다.
표적 항원(들) 또는 기타 단백질들을 효모 표면에 노출되도록 포지셔닝하는 다른 방법은 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI)과 같은 시그널 서열을 이용하여 표적을 효모 세포벽에 고정하는 것이다. 대안적으로, 포지셔닝은 상기 항원(들) 또는 기타 해당 단백질을 항원이 세포벽에 결합되어 있는 단백질(예를 들어, cwp)에 결합하도록 소포체 (ER) 내로 전좌를 통하여 분비 경로 내로 표적화하는 시그널 서열을 첨부함으로써 달성될 수 있다.
일 측면에서, 상기 스페이서 암 단백질은 효모 단백질이다. 상기 효모 단백질은 약 2 내지 약 800 효모 단백질 아미노산으로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 효모 단백질은 약 10 내지 700 아미노산이다. 다른 구현예에서, 상기 효모 단백질은 약 40 내지 600 아미노산이다. 본 발명의 기타 구현예는 적어도 250 아미노사, 적어도 300 아미노산, 적어도 350 아미노산, 적어도 400 아미노산, 적어도 450 아미노산, 적어도 500 아미노산, 적어도 550 아미노산, 적어도 600 아미노산, 또는 적어도 650 아미노산인 효모 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 효모 단백질은 적어도 450 아미노산 길이이다.
효모 단백질의 사용은 효모 베히클 내 융합 단백질의 발현을 안정화하고, 발혀된 융합 단백질의 번역후 변형을 방지하고, 및/또는 융합 단백질을 효모 내 특정 구획으로 표적화(예를 들어, 효모 세포 표면 상에 발현되도록)할 수 있다. 효모 분기 경로 내로 전달을 위하여, 사용되는 예시적인 효모 단백질은 이에 제한되지 않으나 Aga (이에 제한되지 않으나 Aga1 및/또는 Aga2를 포함); SUC2 (효모 전화효소); 알파 인자 시그널 리더 서열; CPY; 세포벽 내 편재화 및 유지를 위한 Cwp2p; 딸세포 형성의 초기 단계 동안 효모 출아세포에서 편재화를 위한 BUD 유전자; Flo1p; Pir2p; 및 Pir4p.
기타 서열을 이용하여 상기 단백질을 예를 들어 시토졸 또는 미토콘드리아 내에서 효모 베히클의 다른 부분으로 표적화, 유지 및/또는 안정화할 수 있다. 상기 구현예들 중 임의의 것에 사용될 수 있는 적합한 효모 단백질의 예는 이에 제한되지 않으나 SEC7; 글루코오스 및 시토졸 내 억압가능한 발현을 위한 포스포에놀피루베이트 카르복시카이나아제 PCK1, 포스포글리세로카이나아제 PGK 및 트리오스 포스페이트 이소머라아제 TPI 유전자 생성물; 그 발현이 유도되고 그 단백질이 세포의 열 처리에의 노출에 따라 더 열안정성인 열 충격 단백질 SSA1, SSA3, SSA4, SSC1; 미토콘드리아 내로 이송을 위한 미토콘드리아 단백질 CYC1; ACT1을 포함한다.
일 구현예에서, 효모 글리코실화의 양 조절을 이용하여 특히 표면 상의 효모에 의하여 항원 발현을 조절한다. 슈가 부분이 벌키하는 경향이 있으므로 효모 글리코실화의 양은 표면 상에 발현되는 항원의 면역원성 및 항원성에 영향을 미칠 수 있다. 이와 같이, 효모 표면 상에 슈가 부분의 존재 및 그의 표적 항원(들) 주위의 3-차원 공간에 대한 영향을 본 발명에 따른 효모의 조절에서 고려하여야 한다. 임의의 방법을 이용하여 효모의 글리코실화 양을 감소 (또는 원하는 경우 증가)시킬 수 있다. 예를 들어, 낮은 글리코실화를 가지도록 선택된 효모 돌연변이 균주 (예를 들어, mnn1, och1 및 mnn9 돌연변이)를 사용하거나, 또는 표적 항원 상의 글리코실화 억셉터 서열을 돌연변이에 의하여 제거할 수 있다. 대안적으로, 생략된 글리코실화 패턴을 가지는 효모, 예를 들어, Pichia를 사용할 수 있다. 또한, 글리코실화를 감소 또는 변경시키는 방법을 이용하여 효모를 처리할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 효모 베히클 내 항원 또는 기타 단백질을 재조합에 의하여 발현하는 대안으로서, 효모 베히클은 단백질 또는 펩타이드와 함께, 또는 항원으로서 역할을 하고/하거나 면역조절제 또는 생체반응 조절제로서 유용한 탄수화물 또는 기타 분자와 함께 세포내 적재된다. 이어서, 이제 항원 및/또는 기타 단백질을 세포 내 함유하고 있는 효모 베히클을 환자에 투여하거나 수지상 세포와 같은 담체 내로 적재한다. 펩타이드 및 단백질을 확산, 능동 수송, 리포오솜 융합, 전기천공법, 식균작용, 동결-해동 사이클 및 욕 음파 처리와 같은 당업자에게 공지된 기법에 의하여 본 발명의 효모 베히클 내로 직접 삽입할 수 있다. 펩타이드, 단백질, 탄수화물 또는 기타 분자와 함께 직접 적재될 수 있는 효모 베히클은 생산 후 항원 및 기타 제제와 함께 적재될 수 있는 미손상 효모, 및 스페로플라스트, 고스트 또는 사이토플라스트를 포함한다. 대안적으로, 미손상 효모를 항원 및/또는 제제와 함께 적재한 다음, 스페로플라스트, 고스트, 사이토플라스트 또는 세포내 입자를 이로부터 제조할 수 있다. 임의의 수의 항원 및/또는 기타 제제를 이러한 구현예에서 미생물 또는 그의 일부의 적재에 의하여 제공되는 것과 같이 적어도 1, 2, 3, 4 또는 임의의 정수 내지 수백 또는 수천 개의 항원 및/또는 기타 제제로부터 효모 베히클 내로 적재할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항원 및/또는 기타 제제가 효모 베히클에 물리적으로 부착된다. 항원 및/또는 기타 제제의 효모 베히클에의 물리적 부착은, 이에 제한되지 않으나, 항원 및/또는 기타 제제를 효모 베히클 외표면에 화학적으로 가교결합시키거나, 예를 들어 항체 또는 기타 결합 파트너를 이용함으로써, 항원 및/또는 기타 제제를 효모 베히클의 외표면에 생물학적으로 결합시키는 것을 포함하는, 공유 및 비-공유 결합 방법을 포함하는 당업계에 적절한 임의의 방법에 의하여 달성될 수 있다. 화학적 가교 결합은 예를 들어 글루타르알데하이드 결합, 광친화성 표지, 카보디이미드 처리, 디설파이드 결합을 연결할 수 있는 화학물질 처리, 및 당업계의 기타 가교결합 표준 화학물질 처리를 포함하는 방법에 의하여 달성될 수 있다. 대안적으로, 세포벽의 효모막 또는 조성의 지질 이중층의 전하를 변화시키는 화학물질을 효모 베히클과 접촉시켜, 효모의 외표면이 특정 전하 특성을 가지는 항원 및/또는 기타 제제에 융합 또는 결합될 수 있도록 한다. 항체, 결합 펩타이드, 가용성 수용체 및 기타 리간드와 같은 표적화 제제를 또한 융합 단백질로서 항원 내로 혼입시키거나 또는 항원의 효모 베히클에의 결합을 위하여 항원과 결합시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 예를 들어 완충액 또는 기타 적합한 제제 내에서 (예를 들어, 혼합물) 효모 베히클과 항원 또는 기타 단백질을 함께 가볍게 혼합함으로써, 효모 베히클 및 항원 또는 기타 단백질을 더 수동적이고 비-특이적 또는 비-공유결합 메커니즘에 의하여 서로 결합시킨다.
본 발명의 일 구현예에서, 효모 베히클 및 항원 또는 기타 단백질이 수지상 세포 또는 대식세포와 같은 담체 내로 모두 세포내 적재되어 본 발명의 치료 조성물 또는 백신을 형성한다.
일 구현예에서, 미손상 효모 (이종 항원 또는 기타 단백질 발현이 있거나 없이)를 효모 세포벽 제제, 효모 막 입자 또는 효모 단편 (즉, 미손상이 아님)을 생산하는 방식으로 분쇄 또는 프로세싱할 수 있으며, 일부 구현예에서 상기 효모 단편은 항원 (예를 들어, DNA, 백신, 단백질 서브유닛 백신, 치사 또는 불활성화된 병원체)를 포함하는 기타 조성물과 함께 제공되거나 투여되어 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 효소 처리, 화학적 처리 또는 물리적 힘 (예를 들어, 기계적 전단 또는 음파처리)을 이용하여 효모를 보조제로서 사용되는 부분들로 분해할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 유용한 효모 베히클은 치사되거나 불활성화된 효모 베히클을 포함한다. 효모의 치사 또는 불활성화는 당업계에 적절한 방법 중 임의의 것에 의하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 효모의 열 불활성화는 효모를 불활성화시키는 표준 방식이며, 당업자는 원한다면 당업계에 공지된 표준 방법에 의하여 표적 항원의 구조적 변화를 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 화학적, 전기적, 방사성 또는 UV 방법과 같은 기타 효모의 불활성화 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, Methods of Enzymology, Vol. 194, Cold Spring Harbor Publishing (1990)과 같은 표준 효모 배양 텍스트북에 개시된 방법학을 참조한다. 사용되는 임의의 불활성화 전략은 표적 항원의 2차, 3차 또는 4차 구조를 고려하고 이러한 구조를 그 면역원성을 최적화하도록 보존하여야 한다.
효모 베히클에 의한 재조합 효모 베히클의 생산 및 항원 및/또는 기타 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 제제)의 발현을 위한 효과적 조건은 효모 균주가 배양될 수 있는 효과적인 배지를 포함한다. 효과적인 배지는 전형적으로 동화할 수 있는 탄수화물, 질소 및 포스페이트 급원 및 적절한 염, 미네랄, 금속 및 비타민 및 성장 인자와 같은 기타 영양소를 포함하는 수성 배지이다. 상기 배지는 복합 영양소를 포함하거나 소정의 최소 배지일 수 있다. 본 발명의 효모 균주는 이에 제한되지 않으나 생물반응기, 삼각 플라스크, 시험관, 미세적정 디쉬, 및 페트리 플레이트를 포함하는 다양한 용기 내에서 배양될 수 있다. 배양은 효모 균주에 적합한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행된다. 이러한 배양 조건은 당업자의 전문 지식 이내이다 (예를 들어, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego를 참조).
본 발명의 일부 측면에서, 효모는 중성 pH 조건 하에, 및 특히 적어도 5.5의 pH 수준으로 유지되는 배지 내에서 성장된다, 즉, 배지의 pH는 pH 5.5 이하로 떨어지도록 허용되지 않는다. 다른 측면에서, 효모는 약 5.5로 유지되는 pH 수준에서 성장한다. 당업자는 배양 프로세스가 효모 배양의 출발뿐 아니라 배양의 유지를 포함하는 것을 인지할 것이다. 효모 배양은 시간 경과에 따라 산성으로 변화하는 것으로 알려져 있으므로 (즉, pH를 저하시킴), 배양 프로세스 중 pH 수준 모니터링에 유의하여야 한다. 이러한 프로세스는 2008, 4, 14 공개된 WO2008/097853에 기재되어 있다.
효모 베히클은 당업자에게 공지된 다수의 기법을 이용하여, 대상에 직접 투여되거나 담체 내로 먼저 적재되는 제제를 포함하는, 본 발명의 효모-기제 면역요법 조성물 또는 생성물로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 효모 베히클은 동결 건조에 의하여 건조될 수 있다. 효모 베히클을 포함하는 제제는 베이킹 또는 양조 작업에 사용되는 효모에 대하여 행하여지는 것과 같이, 효모를 케이크 또는 정제 내로 패킹함으로써 제조될 수 있다. 또한, 효모 베히클을 숙주 또는 숙주 세포에 의하여 견뎌지는 등장 완충액과 같은 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합할 수 있다. 이러한 부형제의 예는 물, 염분, 링거액, 덱스트로오스 용액, 행크 용액, 및 기타 수성 생리학적으로 밸런싱된 염 용액을 포함한다. 고정 오일, 세서미 오일, 에틸 올레이트, 또는 트리글리세라이드와 같은 비수성 베히클 또한 이용할 수 있다. 기타 유용한 제제는 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨, 글리세롤 또는 덱스트란과 같은 점도 증진제를 함유하는 현탁액을 포함한다. 부형제는 또한 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질과 같은 소량의 첨가제를 함유할 수 있다. 완충액의 예는 인산 완충액, 중탄산 완충액 및 Tris 완충액을 포함하는 반면, 방부제의 예는 티메로살, m- 또는 o-크레졸, 포르말린 및 벤질 알콜을 포함한다. 표준 제형은 주사가능 액체 또는 현탁액 또는 주사용 용액으로서 적합한 액체 내에 테이크업될 수 있는 고체일 수 있다. 따라서, 비-액체 제형 내에, 부형제는 예를 들어 멸균수 또는 염분이 투여 전에 첨가될 수 있는 덱스트로오스, 인간 혈청 알부민 및/또는 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 면역요법 조성물 내 유용한 항원
본 발명에 따르면, 일반적으로 사용되는 용어 "항원"은 다음을 의미한다: 그 단백질이 천연 발생 또는 합성적으로 유도된 것인 단백질의 임의의 부분 (펩타이드, 부분 단백질, 전장 단백질), 세포성 조성물 (전 세포, 세포 용해물 또는 분열된 세포), 유기체 (전체 유기체, 용해물 또는 분열된 세포) 또는 탄수화물, 또는 기타 분자, 또는 그의 일부. 일부 구현예에서, 항원은 면역 체계의 요소 (예를 들어, T 세포, 항체)가 접하는 동일 또는 유사한 항원에 대하여 항원 특이성 면역 반응 (예를 들어, 체액성 및/또는 세포-중재 면역 반응)을 유발한다. 용어 "암 항원"은 "종양-특이성 항원", "종양-관련 항원", "암-관련 표적" 또는 "종양-관련 표적"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
항원은 단일 에피토프와 같이 작거나, 또는 클 수 있으며, 복수 에피토프를 포함할 수 있다. 이와 같이, 항원의 크기는 약 5-12 아미노산 (예를 들어, 펩타이드)와 같이 작을 수 있고, 멀티머 및 융합 단백질, 키메릭 단백질 또는 작용제 단백질 또는 펩타이드를 포함하는, 부분 단백질, 전장 단백질과 같이 클 수 있다. 또한, 항원은 탄수화물을 포함할 수 있다.
면역 반응의 자극에 있어서, 용어 "면역원"은 용어 "항원"의 부분집합이며, 따라서, 어떠한 경우에는 "항원"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 면역원은 그 면역원의 개체에의 투여가 상기 개체의 면역 체계가 접하는 동일 또는 유사한 항원에 대한 항원-특이적 면역반응을 증가시키도록, 체액성 및/또는 세포-중재 면역 반응을 유발하는 (즉, 면역원성) 항원을 기재한다.
소정의 항원의 "면역원성 도메인"은 동물에 투여될 때 면역원으로 작용하는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 항원의 임의의 부분, 단편 또는 에피토프 (예를 들어, 펩타이드 단편 또는 서브유닛 또는 항체 에피토프 또는 기타 구조적 에피토프)일 수 있다. 예를 들어, 단일 단백질은 복수의 상이한 면역원성 도메인을함유할 수 있다. 면역원성 도메인은 체액성 면역 반응의 경우에서와 같이 단백질 내 선형 서열일 필요는 없다.
본원에서 "에피토프"는 면역 반응을 유발하기에 충분한 소정의 항원 내 단일 면역원성 부위로서 정의된다. 당업자는 T 세포 에피토프가 B 세포 에피토프와 크기 및 조성에 있어서 다르며, Class I MHC 경로를 통하여 제시되는 에피토프는 Class II MHC 경로를 통하여 제시되는 에피토프와 다르다는 것을 인지할 것이다. 에피토프는 선형 서열 또는 구조적 에피토프 (보전된 결합 영역)일 수 있다.
본원에 기재되는 면역요법 조성물에 사용가능한 항원은 이에 대하여 면역 반응을 유발하는 것일 바람직한 임의의 항원(들) 또는 그의 면역원성 도메인(들), 특히 그러한 항원에 대한 치료 면역 반응이 개체에 이로운 임의의 항원(들) 또는 그의 면역원성 도메인(들)을 포함한다. 상기 항원은 이에 제한되지 않으나 다음을 포함한다: 암 항원, 바이러스 항원, 과발현된 포유동물 세포 표면 분자, 박테리아 항원, 균류 항원, 원생동물 항원, 장내 기생충 항원, 체외 기생충 항원, 하나 이상의 돌연변이된 아미노산을 포함하는 포유동물 세포 분자, 포유동물 세포에 의하여 정상적으로 산전 또는 신생아-발현되는 단백질, 그 발현이 역학 제제 (예를 들어, 바이러스)의 삽입에 의하여 유도되는 단백질, 그 발현이 유전자 전좌에 의하여 유도되는 단백질, 및 그 발현이 조절 서열의 돌연변이에 의하여 유도되는 단백질.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 하나 이상의 면역요법 조성물에 사용가능한 항원은 임의의 암 또는 종양-관련 항원을 포함한다. 일 측면에서, 상기 항원은 종양발현전 또는 과형성 상태와 관련된다. 상기 항원은 또한 암과 관련되거나 그 원인일 수 있다. 이러한 항원은 종양-특이성 항원, 종양-관련 항원 (TAA) 또는 조직-특이성 항원, 그의 에피토프 또는 그의 에피토프 작용제일 수 있다. 암 항원은 이에 제한되지 않으나 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종(angiosarcomas, hemangiosarcomas), 비만세포종, 백혈병, 림프종, 원발성 간암, 폐암, 췌장암, 위장관암 (대장암을 포함), 신장암, 조혈 종양 및 이의 전이암을 포함하는 종양 또는 암으로부터의 항원일 수 있다.
적합한 암 항원은 이에 제한되지 않으나, CAP-1, CAP-1-6D (GenBank Accession No. M29540 또는 Zaremba et al., 1997, Cancer Research 57:4570-4577), MART-1 (Kawakami et al, J. Exp . Med . 180:347-352, 1994), MAGE-1 (U.S. Pat. No. 5,750,395), MAGE-3, GAGE (U.S. Pat. No. 5,648,226), GP-100 (Kawakami et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 91:6458-6462, 1992), MUC-1 (e.g., Jerome et al., J. Immunol., 151:1654-1662 (1993)), MUC-2, 돌연변이 Ras 종양 단백질 (예를 들어, 미국 특허 제 7,465,454호 및 제 7,563,447호를 참조), 정상적 및 돌연변이 p53 종양 단백질 (Hollstein et al Nucleic Acids Res. 22:3551-3555, 1994), PSMA (전립선 특이적 막 항원; Israeli et al., Cancer Res. 53:227-230, 1993), 티로시나아제 (Kwon et al PNAS 84:7473-7477, 1987), TRP-1 (gp75) (Cohen et al Nucleic Acid Res . 18:2807-2808, 1990; U.S. Pat. No. 5,840,839), NY-ESO-1 (Chen et al PNAS 94: 1914-1918, 1997), TRP-2 (Jackson et al., EMBOJ, 11:527-535, 1992), TAG72, KSA, CA-125, PSA (prostate specific antigen; Xue et al., The Prostate , 30:73-78 (1997)), HER-2/neu/c-erb/B2, (U.S. Pat. No. 5,550,214), EGFR (epidermal growth factor receptor; Harris et al., Breast Cancer Res . Treat, 29:1-2 (1994)), hTERT, p73, B-RAF (B-Raf proto-oncogene serine/threonine-protein kinase; Sithanandam et al., (1990), Oncogene 5(12):1775-80), 선종성 용종 유전자 (adenomatous polyposis coli: APC), Myc, von Hippel-Lindau 단백질 (VHL), Rb-1, Rb-2, 안드로겐 수용체 (AR), Smad4, MDR1 (P-글리코단백질로도 알려짐), Flt-3, BRCA-1 (유방암 1; 미국 특허 제 5,747,282호), BRCA-2 (유방암 2; 미국 특허 제 5,747,282호)), Bcr-Abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, 브라큐리(Brachyury) (GenBank Accession Nos. NP_003172.1 or NM_003181.2; Edwards et al., 1996, Genome Res . 6:226-233), HERV-H (인간 내생 레트로바이러스 H), HERV-K (인간 내생 레트로바이러스 K), TWIST (GenBank Accession Nos. NM_000474 and NP_000465), 메소텔린 (Kojima et al., 1995, J. Biol. Chem . 270(37):21984-90; Chang and Pastan, 1996, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 93(1):136-40), NGEP (전립선 내 발현되는 새로운 유전자; Bera et al., 2004, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 101(9):3059-3064; Cereda et al., 2010, Cancer Immunol . Immunother . 59(1):63-71; GenBank Accession Nos. AAT40139 또는 AAT40140), 이러한 항원의 변형, 이러한 항원의 스플라이스 변이체, 및/또는 이러한 항원의 에피토프 작용제와 같은 암배아 항원 (CEA) 및 그의 에피토프를 포함한다. 기타 암 항원은 당업계에 공지되어 있다. 기타 암 항원이 미국 특허 제 4,514,504 호에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 방법에 의하여 동정, 분리 및 클로닝될 수 있다. 암 항원은 또한 하나 이상의 성장 인자 및 각각의 스플라이스 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 암 항원은 암배아 항원 (CEA), CAP-1, CAP-1-6D와 같은 그의 에피토프를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩타이드 (GenBank Accession No. M29540 or Zaremba et al., 1997, Cancer Research 57:4570-4577), 변형된 CEA, CEA의 스플라이스 변이체, 이러한 CEA 단백질의 에피토프 작용제, 및/또는 CEA의 적어도 하나의 면역원성 도메인 또는 이의 작용제 에피토프를 포함하는 융합 단백질이다. 일 측면에서, 상기 CEA는, SEQ ID NO:45의 핵산 서열에 의하여 인코딩되는, 2007, 3, 1 공개된 미국특허 제 US 2007_0048860호에 SEQ ID NO:46로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 변형된 CEA에 상응하는 변형된 CEA이다. 일 측면에서, 상기 항원은 SEQ ID NO:1로 표시되는 핵산 서열에 의하여 인코딩되는 SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 변형된 CEA이다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 항원은 돌연변이된 Ras 종양 단백질이다. 예시적인 Ras 종양 단백질이 예를 들어 미국 특허 제 7,465,454호 및 제 7,563,447호에 기재되어 있다. Ra는 몇몇 개의 돌연변이가 특정 포지션에서 일어나며 하나 이상의 유형의 암의 발달과 관련있는 것으로 알려진 종양단백질의 일 예이다. 따라서, 몇몇 또는 모든 알려진 돌연변이를 그 부위에서 커버하기 위하여 각각의 도메인이 그 부위에서 상이한 돌연변이를 함유하는, 특정 암에서 돌연변이되는 것으로 알려진 특정 잔기를 함유하는 펩타이드로 구성되는 융합 단백질을 작제할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 융합 단백질은 각각의 도메인이 특정 단백질 (동일 또는 상이한 단백질)로부터의 펩타이드로 구성되며, 각각의 펩타이드가 양면을 플랭킹하는 적어도 4 아미노산으로 구성되고 돌연변이가 특정 질병 (예를 들어, 암)과 관련되는 단백질 내 발견되는 돌연변이된 아미노산과 같은 돌연변이된 아미노산을 포함하는 적어도 4 아미노산 잔기로 구성되는, 1, 2 또는 복수 도메인을 가질 수 있다. 예를 들어, Ras에 대하여, 각각의 도메인이 비-돌연변이된 Ras 단백질 내에서 정상적으로 발생하는 글리신에 대한 상이한 치환 (예를 들어, 글리신을 발린, 시스테인, 아르기닌, 아스파르테이트, 세린 또는 알라닌으로 치환)을 가지는, 양면에 적어도 4 아미노산을 포함하고 포지션 12를 포함하는 1, 2, 3 또는 그 이상의 면역원성 도메인을 제공할 수 있다. 다른 실시예로서, 각각의 도메인이 비-돌연변이된 Ras 단백질 내 정상적으로 발생하는 글리신에 대한 상이한 치환 (예를 들어, 글리신을 아스파르테이트로 치환)을 가지는, 양면에 적어도 4 아미노산을 포함하고 포지션 13을 포함하는 1, 2, 3 또는 그 이상의 면역원성 도메인을 제공할 수 있다. 또 다른 실시예로서, 각각의 도메인이 비-돌연변이된 Ras 단백질 내 정상적으로 발생하는 글루타민에 대한 상이한 치환 (예를 들어, 글루타민을 류신, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환)을 가지는, 양면에 적어도 4 아미노산을 포함하고 포지션 61을 포함하는 1, 2, 3 또는 그 이상의 면역원성 도메인을 제공할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 암 항원은, 포지션 12, 13, 59, 61 또는 76에서의 아미노산 잔기가 야생형 Ras 단백질에 대하여 돌연변이된, 야생형 Ras 단백질에 대하여 아미노산 포지션 12, 13, 59, 61 또는 76을 함유하는 야생형 Ras 단백질의 적어도 5-9 인접 아미노산 잔기의 단편을 포함한다. 일 측면에서, 융합 단백질 구조물은 다른 돌연변이된 종양 항원과 프레임 내에서 융합되는 적어도 하나의 펩타이드로 구성되며 (예를 들어, Ras 다냅ㄱ질은 야생형 Ras 단백질 서열에 대하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함), 상기 펩타이드는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: (a) 야생형 Ras와 비교하여 야생형 Ras에 대하여 포지션 12에서 아미노산 잔기가 돌연변이되는, 야생형 Ras (인간 또는 쥐 K-Ras, N-Ras 또는 H-Ras)의 적어도 포지션 8-16을 포함하는 펩타이드; (b) 야생형 Ras와 비교하여, 야생형 Ras에 대하여 포지션 13에서 아미노산 잔기가 돌연변이되는, 야생형 Ras의 적어도 포지션 9-17을 포함하는 펩타ㅌ이드; (c) 야생형 Ras와 비교하여 SEQ ID NO:3에 대하여 포지션 59에서의 아미노산 잔기가 돌연변이되는, 야생형 Ras의 적어도 포지션 55-63을 포함하는 펩타이드; (d) 야생형 Ras와 비교하여 야생형 Ras에 대하여 포지션 61에서 아미노산 잔기가 돌연변이되는 야생형 Ras의 적어도 포지션 57-65를 포함하는 펩타이드; 또는 (e) 야생형 Ras와 비교하여 야생형 Ras에 대하여 포지션 76에서 아미노산 잔기가 돌연변이되는 야생형 Ras의 적어도 포지션 72-80을 포함하는 펩타이드. 인간과 마우스 서열이 상기 단백질의 영역 내에서 동일하고 K-Ras, H-Ras 및 N-Ras가 상기 영역 내에서 동일하므로, 이러한 포지션들은 인간 및 마우스 K-Ras, N-Ras 및 H-Ras 중에서 동일하다. 일 측면에서, 본 발명의 항원으로 사용하기에 적합한 Ras 융합 단백질은 다음으로부터 선택된다: SEQ ID NO:4 (본원에서 SEQ ID NO:3으로 표시되는 핵산 서열에 의하여 인코딩됨), SEQ ID NO:6 (본원에서 SEQ ID NO:5으로 표시되는 핵산 서열에 의하여 인코딩됨), SEQ ID NO:8 (본원에서 SEQ ID NO:7로 표시되는 핵산 서열에 의하여 인코딩됨), 및/또는 SEQ ID NO:10 (본원에서 SEQ ID NO:9로 표시되는 핵산 서열에 의하여 인코딩됨).
본 발명의 일 측면에서, 상기 항원은 인간 Brachyury이다. 인간 Brachyury에 대한 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO:15으로 표시되며, 이는 SEQ ID NO:14로 표시되는 핵산 서열에 의하여 인코딩된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 하나 이상의 면역요법 조성물에 유용한 항원은 병원체 또는 병원체에 의하여 야기되거나 이와 관련되는 질병 또는 상태와 관련된 임의의 항원을 포함할 수 있다. 그러한 항원은 이에 제한되지 않으나, 바이러스 항원, 균류 항원, 박테리아 항원, 장내 기생충 항원, 기생충 항원, 체외 기생충 항원, 원생동물 항원, 또는 다른 전염성 제제로부터의 항원을 포함한다.
일 측면에서, 상기 항원은 이에 제한되지 않으나, 아데노바이러스, 아레나 바이러스, 뷰나바이러스, 코로나바이러스, 콕삭키 바이러스, 거대세포 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 플라비바이러스, 헤파드나 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 렌티바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 믹소바이러스, 종양 바이러스, 오르토믹소바이러스, 유두종 바이러스, 파포바바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 파라믹소바이러스, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스 바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 레오바이러스, 랍도바이러스, 풍진 바이러스, 토가바이러스, 및 수두 바이러스를 포함하는 바이러스로부터이다. 기타 바이러스는 인간 T-세포 림프영양성 바이러스 (HTLV-1 및 HTLV-II와 같은 HTLVs)와 같은 T-림프영양성 바이러스, 소 백혈병 바이러스 (BLVS) 및 고양이 백혈병 바이러스 (FLVs)를 포함한다. 상기 렌티바이러스는 이에 제한되지 않으나, 인간 (HIV-1 또는 HIV-2를 포함하는 HIV), 원숭이 (SIV), 고양이 (FIV) 및 개 (CIV) 면역결핍 바이러스를 포함한다. 일 구현예에서, 바이러스 항원은 비-종양 바이러스로부터의 것들을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 항원은 다음으로부터 선택되는 속으로부터의 전염성 제제로부터일 수 있다: Aspergillus, Bordatella, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus, Dirofilaria, Escherichia, Francisella, Gonococcus, Histoplasma, Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Toxoplasma, Vibriocholerae, 및 Yersinia. 일 측면에서, 상기 전염성 제제는 Plasmodium falciparum 또는 Plasmodium vivax로부터 선택된다.
일 측면에서, 상기 항원은 다음으로부터 선택되는 과(family)로부터의 박테리아로부터이다: Enterobacteriaceae, Micrococcaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae, Mycoplasmataceae, 및 Rickettsiaceae. 일 측면에서, 상기 박테리아는 다음으로부터 선택되는 속(genus)이다: Pseudomonas , Bordetella , Mycobacterium, Vibrio , Bacillus , Salmonella , Francisella , Staphylococcus , Streptococcus , Escherichia, Enterococcus , Pasteurella , 및 Yersinia . 일 측면에서, 상기 박테리아는 다음으로부터 선택되는 종(species)으로부터이다: Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas mallei , Pseudomonas pseudomallei , Bordetella pertussis , Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae , Francisella tularensis , Vibrio cholerae , Bacillus anthracis, Salmonella enteric , Yersinia pestis , Escherichia coli 및 Bordetella bronchiseptica.
일 측면에서, 상기 항원은 이에 제한되지 않으나 Saccharomyces spp ., Aspergillus spp ., Cryptococcus spp ., Coccidioides spp ., Neurospora spp ., Histoplasma spp ., 또는 Blastomyces spp로부터의 균류를 포함하는 균류와 같은 균류로부터이다. 일 측면에서, 상기 균류는 다음으로부터 선택되는 종으로부터이다: Aspergillus fumigatus , A. flavus , A. niger , A. terreus , A. nidulans , Coccidioides immitis , Coccidioides posadasii 또는 Cryptococcus neoformans. 침습 질병을 야기하는 가장 통상적인 Aspergillus 종은 A. fumigatus , A. flavus , A. niger , A. terreus 및 A. nidulans를 포함하며, 예를 들어 면역억제 또는 T-세포 또는 대식세포 손상을 가지는 환자 내에서 발견될 수 있다. San Joaquin Valley Fever로도 알려져 있는 콕시디오이데스 진균증은 Coccidioides immitis에 의하여 야기되는 진균병이며, 급성 호흡기 감염 및 만성 폐 질환 또는 뇌막, 골 및 관절로 전염을 야기할 수 있다. 크립토구균(Cryptococcosis)-관련 상태는 또한 예를 들어 비-면역억제된 또는 HIV 감염된 대상과 같은 면역억제된 대상 내에서 본 발명의 방법의 표적이다.
일부 구현예에서, 상기 항원은 융합 단백질이다. 본 발명의 일 측면에서, 융합 단백질은 2 이상의 항원을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 상기 융합 단백질은 2 이상의 면역원성 도메인 및/또는 하나 이상의 항원의 2 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 항원, 그의 면역원성 도메인, 및/또는 그의 에피토프의 임의의 조합을 본 발명의 조성물 내 사용을 위하여 고려할 수 있다. 이러한 항원, 그의 면역원성 도메인 및/또는 그의 에피토프를 함유하는 면역요법 조성물은 광범위한 환자 내에서 항원 특이적 면역화를 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용가능한 융합 단백질은 복수 도메인을 가질 수 있으며 (2 이상의 도메인), 각각의 도메인은 특정 단백질로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드로 구성되고, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 양면을 플랭킹하는 적어도 4 아미노산 잔기로 구성되고 돌연변이가 특정 질병 또는 상태와 관련 있는 단백질 내 발견되는 돌연변이된 아미노산을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 사용가능한 효모-기제 면역요법 조성물의 성분으로서 사용되는 융합 단백질은 효모 내 이종 항원 발현에 특히 유용한 구조물을 이용하여 생산된다. 전형적으로, 원하는 항원 단백질(들) 또는 펩타이드(들)이 그들의 아미노-말단에서 (a) 효모 베히클 내 융합 단백질의 발현을 안정화하거나 발현된 융합 단백질의 번역후 변형을 방지하는 특정 합성 펩타이드 (이러한 펩타이드는 예를 들어 2004, 4, 12에 공개되고 본원에 참조로 그 전체로서 포함되는 미국 특허 제 2004-0156858 A1 호에 상세히 기재되어 있음); (b) 융합 파트너가 효모 내에서 단백질 발현의 상당히 증진된 안정성을 제공하고/하거나 효모 세포에 의한 단백질의 번역후 변형을 방지하는, 내생 효모 단백질의 적어도 일부 (이러한 단백질 또한 미국 특허 공보 제 2004-0156858 A1에 상세히 기재되어 있음); 및/또는 (c) 효모 표면에서 융합 단백질의 발현을 야기하는 효모 단백질의 적어도 일부 (예를 들어, WO 2008/019366에 상세히 기재되어 있는 Aga 단백질)에 융합된다. 또한, 본 발명은 특히 단백질의 선별 및 동정에 사용하기 위한, 항원-인코딩 구조물의 C-말단에 융합되는 펩타이드의 용도를 포함한다. 이러한 펩타이드는 이에 제한되지 않으나, 펩타이드 태그 (예를 들어, 6X His) 또는 임의의 기타 짧은 에피토프 태그와 같은 합성 또는 천연 펩타이드를 포함한다. 본 발명에 따른 항원의 C-말단에 부착되는 펩타이드는 상기 논의한 N-말단 펩타이드의 부가와 또는 부가없이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 일 구현예에서, 2 이상의 상이한 면역요법 조성물은 바람직하게 동일한 항원(들)을 표적화한다. 이러한 구현예에서, 동일한 항원(들) 또는 그의 면역원성 도메인(들)은 전형적으로 각각의 면역요법 조성물 벡터에 의하여 발현되나, 상기 항원(들) 및/또는 그의 면역원성 도메인(들)은 상기 조성물 중 하나 또는 둘 모두와 혼합될 수 있으고, 및/또는 효모-기제 면역요법 조성물의 경우, 상기 항원은 효모 베히클에 부착되고 및/또는 효모 베히클 내에 운반될 수 있다. 일 구현예에서, 두 조성물 모두 동일한 항원(들)을 표적화하나, 각각의 조성물은 동일한 항원 내 상이한 에피토프(들) 또는 면역원성 도메인(들)을 표적화할 수 있다. 일 구현예에서, 각각의 면역요법 조성물은 상이한 항원(들) 및/또는 그의 면역원성 도메인 및/또는 에피토프를 표적화한다. 예를 들어, 하나의 조성물을 이용하여 Ras와 같은 하나의 항원을 표적화하고, 다른 면역요법 조성물을 이용하여 CEA와 같은 동일한 암 또는 동일한 암의 서브세트 내에 발현되는 다른 암 항원을 표적화하는 것이 유리할 것이다. 다른 구현예에서, 동일한 유형 내에 적어도 두개 상이한 항원 조성물이 있는 일 유형의 면역요법 조성물의 조합이 제공된다 (예를 들어, 돌연변이된 Ras 또는 돌연변이된 Ras의 복수 면역원성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 효모-기제 면역요법 조성물과, CEA 또는 변형된 CEA를 발현하는 효모-기제 면역요법 조성물의 조합). 이러한 조합은 동일 또는 상이한 항원(들)을 발현하는 다른 유형의 면역요법 조성물 (예를 들어, 바이러스-기제 조성물)과 동시에 투여된다. 이러한 구현예의 일 측면에서, 다양한 조합을 혼합할 수 있거나, 또는 다른 측면에서, 물리적으로 혼합할 필요가 없으나 동일 부위 또는 상이한 부위에 또는 동일 투여 기간 이내에 동시 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 2 이상의 상이한 면역요법 조성물 중 하나는 하나 이상의 항원을 표적화하고, 면역요법 조성물 중 다른 하나는 임의의 항원을 표적화할 필요없이 보조제로서 (즉, 조성물이 비-항원-특이적 면역요법을 위하여 사용됨) 또는 다른 조성물로서 동일 암 항원을 표적화할 필요없이 제공된다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 면역요법 벡터 각각은 벡터-특이적 효과가 조성물의 효과의 원인이 되는 것으로 보여졌으므로, 일부 구현예에서, 단지 하나의 벡터만이 항원과 결합되거나 항원을 발현시킬 수 있으며, 다른 벡터를 동시 사용하여 비-항원-특이적 면역요법 효과에 기여한다.
본 발명의 조성물의 이용 방법
본 발명의 방법에서, 본원에 기재된 2 이상의 면역요법 조성물이 먼저 개체에 동시 투여된다. 본원에서 조성물의 투여와 관련하여 사용되는 용어 "동시에"는 각각의 조성물, 특히, 이러한 조성물의 제1 투여량을 실질적으로 동시에 또는 동일 투여 기간 내에, 또는 면역요법 조성물에 의한 면역 체계의 프라이밍의 초기 효과가 일어나는 시간 기간 이내에 (예를 들어, 1-2일 및 바람직하게 그 이하) 투여하는 것을 의미한다. 명확하게 하기 위하여, 동시 투여는 모든 조성물을 정확하게 동일한 순간에 투여하는 것을 필요로 하지 않으며, 그보다, 모든 조성물의 투여가 각각의 조성물로 면역 체계를 동시에 프라이밍하기 위하여 환자의 스케쥴된 1 투여 이내에 일어난다 (예를 들어, 한 조성물이 먼저 투여된 후, 즉시 또는 인접하여 제2 조성물이 투여될 수 있다). 조성물이 동일 부위에 투여될 때와 같은 경우, 조성물은 혼합되어 제공될 수 있으나, 동일 부위에 투여될 때에도, 동일 투여 기간 동안 각각 조성물의 순차적 투여가 바람직하다. 일 측면에서, 상기 조성물은 동일한 1-2일 이내, 일 측면에서 동일한 날에, 일 측면에서 동일한 12 시간 기간 이내에, 및 일 측면에서 동일한 8 시간 기간 이내에, 및 일 측면에서 동일한 4 시간 기간 이내에, 및 일 측면에서 동일한 1, 2 또는 3 시간 이내에, 및 일 측면에서 동일한 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 또는 10 시간 이내에 투여된다.
어떠한 경우, 제1 또는 제2 면역요법 조성물이 다른 것보다 더 자주 투여된다. 예를 들어, 일 측면에서, 제1 면역요법 조성물이 바이러스-기제 면역요법 조성물이고 제2 면역요법 조성물이 효모-기제 면역요법 조성물일 때, 상기 제2 면역요법 조성물은 제1 면역요법 조성물보다 자주 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 측면에서, 제1 및 제2 면역요법 조성물의 동시 투여 사이에, 제2 면역요법 조성물이 1, 2, 3 또는 그 이상의 부가적인 횟수로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이러스-기제 면역요법 조성물로의 면역화는 항원의 연장된 제시를 야기하므로, 이러한 조성물을 더 짧은 주기로 투여하는 것은 불필요하거나 이롭지 않을 것인 반면, 효모-기제 면역요법 조성물은 항원의 구분된 볼루스를 제시하므로, 이들은 면역 반응을 저해할 위험없이 더 자주 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 측면에서, 바이러스-기제 면역요법 조성물은 2, 3, 또는 4주 마다 또는 그 이상 투여되는 반면, 효모-기제 면역요법 조성물은 1주 간격으로 투여되며, 이는 치료의 총 기간이 증가함에 따라 더 긴 간격 (2, 3, 또는 4주 또는 그 이상)으로 연장될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 2 이상의 면역요법 조성물은 동시 투여되나, 환자 내 상이한 물리적 부위에 투여된다. 예를 들어, 하나의 조성물은 개체의 신체의 일 면 상의 부위에 투여되고, 다른 조성물은 개체의 신체의 다른 면 상의 부위에 투여될 수 있다. 다른 예로서, 한 조성물은 특정 유출 림프절 (draining lymph node)에 인접한 부위에 투여되고, 다른 조성물은 상이한 유출 림프절에 인접한 부위에 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 2 이상의 상이한 면역요법 조성물은 동시에 및 환자 내 동일하거나 실질적으로 인접한 부위에 투여된다. 실질적으로 인접한 부위는 제1 조성물이 투여되는 것과 정확히 동일한 주사 부위는 아니지만, 제1 주사 부위와 아주 근접한 (옆 또는 가까운) 부위이다. 일 구현예에서, 상기 2 이상의 상이한 면역요법 조성물은 혼합되어 투여된다. 본 발명의 일 측면에서, 바이러스-기제 면역요법 조성물은 피하, 근육 내 또는 종양 내 투여되고, 효소-기제 조성물은 피하 투여된다.
일부 구현예는 투여 접근법의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 효모-기제 면역요법 조성물 (제1 조성물)과 바이러스-기제 면역요법 조성물 (제2 조성물)의 동시 투여의 예시적 경우를 이용하여, 효모-기제 조성물의 투여량의 일 부분 (예를 들어, 효모-기제 조성물의 총 투여량의 일 분획)을 바이러스-기제 면역요법 조성물의 전부 또는 일부와 혼합하여, 또는 동일 또는 인접한 부위에 그 일부로서 투여된 다음, 효모-기제 면역요법 조성물의 투여량의 나머지 부분(들)을 개체 내에 다른 부위(들)에 투여할 수 있다. 유사하게, 바이러스-기제 조성물의 투여량의 일부를 효모-기제 조성물의 전부 또는 일부와 혼합하여 또는 동일 또는 인접한 부위에 그 일부로서 투여한 다음, 바이러스-기제 면역요법 조성물의 나머지 부분(들)을 개체 내 다른 부위(들)에 투여한다. 일 구현예에서, 개체 상의 상이한 부위에 부분적으로 투여될 바이러스-기제 및/또는 효모-기제 면역요법 조성물의 단일 투여량 이내에서, 어떤 부분은 표적 항원을 함유하거나 발현하고 다른 부분들은 그렇지 않을 수 있다 (즉, 다른 부분들은 빈 벡터이거나 공동자극 분자, 사이토카인 또는 기타 비-항원 제제를 인코딩할 수 있다)
백신 또는 조성물의 투여는 전신, 점막 및/또는 표적 부위에 근접(예를 들어, 종양에 인접)할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 예방 또는 치료될 상태의 유형, 사용되는 항원 및/또는 표적 세포 집단 또는 조직에 따라 당업자에게 분명할 것이다. 다양한 허용가능한 투여 방법은 이에 제한되지 않으나, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 노드내 (intranodal) 투여, 관동맥내 투여, 동맥내 투여 (예를 들어, 경동맥 내로), 피하 투여, 경피 전달, 기관내 투여, 관절내 투여, 뇌실내 투여, 흡입 (예를 들어, 에어로졸), 두개내, 척수내, 안내, 귀내, 비내, 경구, 폐 투여, 카테터 주입, 및 조직 내 직접 주입을 포함한다. 일 측면에서, 투여 경로는 정맥내, 복강내, 피하, 경피, 노드내, 근육내, 경피, 흡입, 비내, 경구, 안내, 관절내, 두개내, 및 척수내를 포함한다. 비경구 전달은 경피, 근육내, 복강내, 흉막내, 폐내, 정맥내, 피하, 심방 카테터 및 정맥 카테터 경로를 포함한다. 귀 전달은 점이액을 포함할 수 있으며, 비내 전달은 점비약 또는 비내 주사를 포함하고, 안내 전달은 점안액을 포함할 수 있다. 에어로졸 (흡입) 전달은 당업계의 표준 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 본원에 그 전체로서 참조로 포함되는, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992를 참조). 점막 면역력을 조절하는 다른 투여 경로가 바이러스 감염 치료에 유용하다. 이러한 경로는 기관지, 경피, 근육내, 비내, 기타 흡입, 직장, 피하, 국소, 경피, 질 및 요도 경로를 포함한다. 일 측면에서, 본 발명의 면역요법 조성물은 피하 투여된다. 바람직한 투여 방법은 이에 제한되지 않으나, 정맥내, 복강내, 피하, 경피, 노드내, 근육내, 경피 또는 종양내를 포함한다. 투여량이 적어도 1회 투여된다. 연이은 투여량이 지시되는 바와 같이 투여될 수 있으며, 전형적으로 이용된다.
보다 구체적으로, 일 구현예에서, 본 발명의 2 이상의 상이한 면역요법 조성물의 초기 동시 투여에 이어 면역요법 조성물 중 하나를, 및 일 구현예에서 면역요법 조성물 둘 또는 모두를, 부스터 투여할 수 있다. 부스터 투여(부스트)는 임의의 적합한 기간을 두고 투여될 수 있으며, 전형적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주 떨어져 투여된다. 2 이상의 면역요법 조성물의 부스터 투여는 원하는 대로 동시 또는 개별적으로 투여될 수 있으나, 가장 전형적으로 프라임(priming) 투여와 함께 동시 투여된다. 프라임 투여와 함께로서, 투여 방법은 프라임 투여를 위하여 앞서 기재한 바와 같은 부위 및 투여 전략의 임의의 조합을 사용할 수 있으나, 프라임 투여와 동일한 투여 프로토콜에 제한되지 않는다. 예를 들어, 프라임 투여량이 두 개의 상이한 부위에 투여될 경우 (각각의 부위에 하나의 면역요법 조성물), 부스팅 투여는 동일한 두 부위, 단일 부위 또는 인접한 부위, 또는 두개의 상이한 부위에, 또는 상기한 분주 스케쥴을 이용하여 투여될 수 있다.
또한, 부스터 투여량은 프라임 투여량과 반드시 동일한 방식으로 제형화될 필요는 없다. 예를 들어, 프라임 투여량 내 면역 요법 조성물 각각이 항원(들) 및/또는 그 면역원성 도메인(들)을 제공한다면, 부스터 투여량 내, 두 면역원성 조성물은 다시 상기 항원(들) 및/또는 그 면역원성 도메인(들)을 제공하거나, 또는 상기 면역요법 조성물 중 하나만이 상기 항원(들) 및/또는 그 면역원성 도메인(들)을 제공하고 다른 하나의 면역요법 조성물은 빈 벡터이거나 비-항원성 제제 (예를 들어, 면역자극 분자 또는 기타 제제)를 제공할 수 있다. 사용되는 바이러스 벡터의 변형 또는 변화 (예를 들어, 프라이밍 내 백시니아 바이러스 및 부스팅 조성물 내 파울폭스 바이러스를 사용하거나, 그 반대), 효모 베히클 내 변형 또는 변화 (예를 들어, 효모 균주 변화, 효모 생산방법 변화, 발현되는 vs. 혼합되는 것과 같은 효모가 항원을 제공하는 방법 변화), 투여량, 하나 이상의 조성물에 의하여 제공되는 항원 또는 도메인, 및 면역자극성 분자 또는 기타 제제의 포함 또는 제거 또는 치환을 포함하는 기타 본원에 기재되는 조성물의 가능한 변형이 부스팅 단계 동안 고려된다.
본 발명의 조성물의 접종물에 관한 용어 "단위 투여량"은 각각의 단위가 요구되는 희석액과 함께 원하는 면역원성 효과를 생산하도록 계산되는 소정량의 면역요법 조성물을 함유하는 포유동물에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 의미한다. 본 발명의 접종물의 신규한 단위 투여량에 대한 사양은 특정 면역요법 조성물의 고유한 특성 및 달성하고자 하는 특정 면역 효과에 의하여 지시되며 이에 의존한다. 개체, 바람직하게 인간에 본 발명의 면역요법 조성물을 제공함에 있어서, 투여되는 재조합 벡터의 투여량은 개체의 연령, 체중, 키, 성별, 일반적 의학적 상태, 이전 의학적 히스토리, 질병 진전, 종양 적하 중량, 병원체 적하 중량 등과 같은 요인에 따라 변화할 것이다.
상기 접종물은 전형적으로 식염수, 인산 완충 식염수 또는 기타 생리학적으로 허용되는 희석액 등과 같은 견딜 수 있는 (허용가능한) 희석액 내 용액으로서 제조되어 수성 약학적 조성물을 형성한다.
본 발명의 재조합 바이러스-기제 면역요법 조성물에 대하여, 일반적으로, 수령인에게 약 105 내지 약 1010 플라크 형성 단위 범위의 재조합 바이러스 투여량을 제공하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않으나 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 1010, 1011 또는 그 이상의 플라크 형성 단위를 포함하는 더 낮거나 더 높은 투여량을 투여할 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 개체에 투여하는 방법의 예는 이에 제한되지 않으나, 생체외 종양 세포의 재조합 바이러스에 노출, 또는 바이러스의 정맥내, 피하 (S.C.), 경피 (I.D.) 또는 근육내 (I.M.) 투여에 의한 재조합 벡터의 병에 걸린 숙주 내로의 주입을 포함한다. 대안적으로, 상기 재조합 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터의 조합을 암성 병변 또는 종양 내로 직접 주입 또는 약학적으로 허용되는 담체 내 국소 적용에 의하여 국소 투여할 수 있다. 투여될 복수 공동자극 분자를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 하나 이상의 항원의 핵산 서열을 운반하는 재조합 벡터의 양은 바이러스 입자의 역가에 근거한다. 투여될 항원의 바람직한 범위는 포유동물, 바람직하게 인간 당 105 내지o 1010 바이러스 입자이나, 이에 제한되지 않으나 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 1010, 1011 또는 그 이상의 플라크 형성 단위를 포함하는 더 낮거나 더 높은 투여량이 투여될 수 있다.
본 발명의 효모-기제 면역요법 조성물에 대하여, 일반적으로, 적합한 단일 투여량은 효모 베히클 및 항원 (포함된다면)을 적절한 시간 기간에 걸쳐 1회 이상 투여될 때 항원-특이적 면역 반응을 유발시키기에 효과적인 양으로 환자 신체의 소정의 세포 유형, 조직 또는 영역에 효과적으로 제공할 수 있는 투여량이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 효모 베히클의 단일 투여량은 상기 조성물이 투여되는 유기체의 체중 kg 당 약 1 x 105 내지 약 5 x 107 효모 세포 당량이다. 더 바람직하게, 본 발명의 효모 베히클의 단일 투여량은 0.1 x 106 세포 (즉, 1.1 x 106, 1.2 x 106, 1.3 x 106...) 증가로, 중간 투여량을 포함하여, 투여량 당 (즉, 유기체 당) 약 0.1 Y.U. (1 x 106 세포) 내지 약 100 Y.U. (1 x 109 세포)이다. 바람직한 투여량은 1 Y.U 내지 40 Y.U, 더 바람직하게 10 Y.U 내지 40 Y.U 사이의 투여량을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 투여량은 개체 상에 상이한 부위에 그러나 동일한 투여 기간 동안 투여된다. 예를 들어, 10 Y.U. 투여량을 단일 투여 기간 동안 개체 상의 4 개의 상이한 부위에 주입함으로써 40 Y.U. 투여량을 투여할 수 있다.
면역화될 포유동물이 이미 질병에 걸렸다면 (예를 들어, 암 또는 전이암 또는 만성 병원체 감염), 상기 백신은 본원에 기재되는 상이한 면역요법 조성물의 동시 투여 외에 상기 질병을 치료하는데 사용되는 기타 치료제 처리 (예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 소분자 요법, 사이토카인 요법, 항바이러스 요법, 생체반응 조절 요법, 수술 등)와 함께 투여될 것이다.
본 발명의 면역요법 조성물의 이용 방법은 개체가 질병 또는 상태로부터 또는 상기 질병 또는 상태로부터 초래되는 증상으로부터 보호되도록 개체 내에서 면역 반응을 유발시킨다. 본원에 사용되는 표현 "질병으로부터 보호됨"은 질병을 예방, 상기 질병의 적어도 하나의 증상을 예방, 질병 개시 지연, 상기 질병의 하나 이상의 증상을 감소, 상기 질병 발생 감소, 및/또는 상기 질병의 심각성 감소를 의미한다. 암에 대하여, 본 발명의 면역요법 조성물의 동시 투여는 바람직하게 다음 중 하나 이상의 초래한다: 종양 성장 예방, 질병 개시 지연, 종양 적하 중량 감소, 종양 성장 감소, 증가된 생존, 향상된 기관 기능, 및/또는 향상된 개체의 일반적 건강. 전염성 질병 및 기타 질병에 대하여, 상기 면역요법 조성물의 동시 투여는 바람직하게 다음 중 하나 이상을 초래한다: 질병 또는 상태 예방, 감염 예방, 질병 개시 지연, 증가된 생존, 병원체 적하 중량 감소 (예를 들어, 바이러스 역가 감소), 개체 내 감염으로부터 초래되는 적어도 하나의 증상 감소, 상기 감염 또는 질병으로부터 초래되는 기관 또는 전진 손상 감소, 및 기관 또는 전신 기능 향상.
본 발명의 치료 방법에 있어서, 본 발명의 면역요법 조성물의 투여는 "예방적" 또는 "치료적"일 수 있다. 예방적으로 제공될 때, 본 발명의 면역요법 조성물은 질병 또는 상태의 임의의 증상 전에 제공된다. 면역요법 조성물의 예방적 투여는 연이은 질병을 예방 또는 개선 또는 그 개시를 지연시킨다. 치료적으로 제공될 때, 면역요법 조성물은 질병의 증상 개시시에 또는 그 후에 제공된다. 용어 "질병"은 동물의 정상적 건강으로부터 벗어남을 의미하며, 질병 증상이 존재하는 상태 및 이상 (예를 들어, 종양 성장, 감염 등)이 일어났으나 증상이 아직 나타나지 않은 상태를 포함한다.
본 발명의 임의의 구현예에서, 본 발명의 면역요법 조성물의 개체에의 투여 이외에, 치료되는 상태에 따라, 부가적인 외생 면역조절제 또는 면역자극성 분자, 화학요법제, 항생제, 항균약, 항바이러스약, 암 치료제, 사이토카인, 및 기타 치료제, 치료 조성물, 또는 치료 프로토콜을 단독으로 또는 조합하여 투여할 수 있다. 본 발명의 면역요법 조성물과 함께 사용될 수 있는 적합한 생체 반응 조절제는 이에 제한되지 않으나, 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 지질 유도체, 펩타이드, 단백질, 폴리사카라이드, 소분자 약물, 항체 및 그의 항원 결합 단편 (이에 제한되지 않으나, 안티-사이토카인 항체, 안티-사이토카인 수용체 항체, 안티-케모카인 항체를 포함), 비타민, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 결합 부분, 앱타머, 및 성장 조절인자를 포함한다. 외생적으로 첨가되는 제제 및 생체 반응 조절제의 예는 이에 제한되지 않으나, Flt-3L, 시클로포스파미드, 시스플라티늄, 간시클로비르, 암포테리신 B, 5 플루오로우라실, 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), IL-6, 인터류킨 10 (IL-10), 인터류킨 12 (IL-12), 타입 I 인터페론 (IFN-α를 포함) 또는 타입 I 인터페론의 작용제 또는 길항제 또는 그의 수용체; 타입 II 인터페론 (IFN-γ를 포함) 또는 타입 II 인터페론의 작용제 또는 길항제 또는 그의 수용체; 타입 III 인터페론 (IFN-λ를 포함) 또는 타입 III 인터페론의 작용제 또는 길항제 또는 그의 수용체; 종양 괴사 인자-α (TNF-α); 형질전환 성장인자-β (TGF-β); 안티-CD40; CD40L; 안티-CTLA-4 항체 (예를 들어, 면역성 결여 T 세포 방출); T 세포 공동 자극인자 (예를 들어, 안티-CD137, 안티-CD28, 안티-CD40); 알렘투주맵 (예를 들어, CamPath®), 데니류킨 디피톡스 (예를 들어, ONTAK®); 안티-CD4; 안티-CD25; 안티-PD-1; 안티-PD-L1; 안티-PD-L2; FOXP3를 블록킹하는 제제 (예를 들어, CD4+/CD25+ T 조절 세포 활성을 제거/치사); Flt3 리간드, 이미퀴모드 (AldaraTM), 과립 대식세포 집락 자극인자 (GM-CSF); 과립구 집락 자극인자 (G-CSF), 사그라모스팀 (Leukine®); 제한없이 프로락틴 및 성장 호르몬을 포함하는 호르몬; 이에 제한되지 않으나 TLR-2 작용제, TLR-4 작용제, TLR-7 작용제, 및 TLR-9 작용제를 포함하는 톨 유사 수용체 (TLR) 작용제; 이에 제한되지 않으나 TLR-2 길항제, TLR-4 길항제, TLR-7 길항제, 및 TLR-9 길항제를 포함하는 TLR 길항제; 이에 제한되지 않으나 COX-2 저해제 (예를 들어, Celecoxib, NSAIDS), 글루코코티코이드, 스타틴, 및 탈리도미드 및 IMiDTMs (탈리도미드의 구조적 및 기능적 유사체 (예를들어, REVLIMID® (레날리도마이드), ACTIMID® (포말리도마이드))를 포함하는 그의 유사체를 포함하는, 소염제 및 면역조절제; 균류 또는 박테리아 성분 또는 친염증성 사이토카인 또는 케모카인과 같은 친 염증성 제제; 이에 제한되지 않으나 바이러스-기제 백신, 박테리아-기제 백신 또는 항체-기제 백신을 포함하는 면역요법 백신; 및 기타 면역조절제, 면역강화제, 소염제 및/또는 친 염증성 제제를 포함한다.
이러한 외생 제제 및 치료제는 본 발명의 면역요법 조성물과 동시에 또는 상이한 시간 지점에 투여될 수 있다. 예를 들어, 화학요법과 함께 개체에 제공될 때, 화학요법 투여 사이에 "휴일" 동안 면역요법 조성물을 투여하는 것이 면역요법 조성물의 효과를 최대화하기 위하여 바람직할 것이다.
본 발명의 조성물 및 치료 백신은 병원체 감염을 포함하는 특정 질병 또는 상태로부터 대상을 보호하는데에 유용한 임의의 기타 화합물, 또는 이러한 감염의 증상을 치료 또는 개선하는 임의의 화합물, 및 암 치료 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 조성물 및 치료 조성물은 임의의 척추동물을 포함하는 동물에, 특히 제한없이 영장류, 설치류, 가축 및 애완동물을 포함하는 척추동물강, 포유동물강의 멤버에 투여될 수 있다. 가축은 섭취되거나 또는 유용한 생성물을 생산하는 (예를 들어, 양모 생산을 위한 양) 포유동물을 포함한다. 보호할 포유동물은 인간, 개, 고양이, 쥐, 래트, 염소, 양, 소, 말 및 돼지를 포함한다.
본 발명에 유용한 일반적 기술
본 발명의 실행은 달리 기재하지 않는 한, 당업자에게 잘 알려져 있는 전통적인 분자 생물학 (재조합 기술을 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics : a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (본원에서 "Sambrook"으로 함께 언급됨); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, 2001까지 증보판을 포함); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (본원에서 "Harlow and Lane으로 함께 언급됨), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); Casarett and Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed., 6th edition (2001), 및 Vaccines, S. Plotkin and W. Orenstein, eds., 3rd edition (1999)와 같은 문헌에 상세히 설명되어 있다.
일반적 정의
"면역요법 조성물"은 대상 내에서 적어도 하나의 치료 이점을 달성하기에 충분한 면역 반응을 유발시키는 조성물이다.
일반적으로, 용어 "생물학적으로 활성"은 생체 내 (즉, 자연 생리학적 환경 내에서) 또는 시험관 내 (즉, 실험실 조건 하에) 측정되거나 관찰될 때, 화합물이 세포 또는 유기체의 대사 또는 기타 프로세스에 영향을 미치는 적어도 하나의 탐지가능한 활성을 가짐을 나타낸다. 따라서, 단백질의 생물학적으로 활성인 부분 또는 단편 또는 도메인은 예를 들어 전장 단백질의 생물학적 활성을 가지기에 충분한 크기인 부분, 단편 또는 도메인을 의미한다. 이러한 활성은 전체로서 모든 단백질의 활성보다는 그 단백질에 특정한 활성이다.
상호교환적으로 사용될 수 있는 "개체" 또는 "대상" 또는 "환자"는 바람직하게 포유 동물, 더 바람직하게 인간이다. 포유동물은 이에 제한되지 않으나 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 쥐 및 래트를 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "조절"은 일반적으로 특정 활성의 상향조절 또는 하향조절을 의미한다. 본원에 사용되는 용어 "상향조절"은 일반적으로 다음 중 임의의 것을 기재하기 위하여 사용된다: 특정 활성에 대한 유발, 개시, 증가, 증대, 부스팅, 향상, 증진, 증폭, 촉진 또는 제공. 유사하게, 용어 "하향조절"은 일반적으로 다음 중 임의의 것을 기재하는데 사용될 수 있다: 특정 활성에 대한 감소, 저해, 개선, 저감, 줄임, 블로킹 또는 예방.
본 발명에서 분리된 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 참조는 전장 단백질, 융합 단백질 또는 이러한 단백질의 임의의 단편, 도메인, 구조적 에피토프 또는 유사체를 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 분리된 단백질은 그 천연 환경으로부터 제거되고 (즉, 인간 조작이 가하여진) 정제된 단백질, 부분적으로 정제된 단백질, 재조합에 의하여 생산된 단백질, 및 합성적으로 생산된 단백질을 포함할 수 있는 단백질 (폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함)이다. 이와 같이, "분리된"은 단백질이 정제되는 정도를 반영하지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 분리된 단백질은 재조합에 의하여 생산된다. 본 발명에 따르면, 용어 "변형" 및 "돌연변이"는 특히 본원에 기재된 단백질의 아미노산 서열 또는 그의 일부 (또는 핵산 서열)에 대한 변형/돌연변이에 대하여, 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "유사체"는 자연 발생 단백질 또는 펩타이드에의 약간의 변형에 의하여 자연 발생 단백질 또는 펩타이드 (즉, "원형" 또는 "야생형" 단백질)과 다르나, 천연 발생 형태의 기본 단백질 및 측쇄 구조를 유지하는 단백질 또는 펩타이드를 의미하는데 사용된다. 이러한 변화는 이에 제한되지 않으나, 하나 또는 몇몇 개의 아미노산 측쇄 변화; 결실 (예를 들어, 단백질 또는 펩타이드의 절단된 버젼), 삽입 및/또는 치환을 포함하는 하나 또는 몇몇 개의 아미노산 변화; 하나 또는 몇몇 개의 원자의 입체화학 변화; 및/또는 이에 제한되지 않으나 메틸화, 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미트화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜 이노시톨 첨가를 포함한다. 유사체는 자연 발생 단백질 또는 펩타이드와 비교하여 증진된, 감소된 또는 실질적으로 유사한 특성을 가질 수 있다. 유사체는 단백질의 작용제 또는 단백질의 길항제를 포함할 수 있다. 유사체는 이에 제한되지 않으나 분리된 자연 발생 단백질에 대한 직접적인 변형, 직접적 단백질 합성, 또는 예를 들어 무작위 또는 표적화된 돌연변이 유발을 실행하기 위한 전통적인 또는 재조합 DNA 기법을 이용하는, 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 대한 변형을 포함하는 단백질 제조를 위하여 당업계에 공지된 기법을 이용하여 생산될 수 있다.
소정의 단백질의 유사체는 참조 단백질의 아미노산 서열과 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 동일한 (또는 전체 정수 증가분 내에 45% 내지 99% 사이의 임의의 백분율) 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 유사체는 참조 단백질의 자연 발생 아미노산 서열과 약 70% 미만까지 1% 증가분으로, 100% 미만 동일, 약 99% 미만 동일, 약 98% 미만 동일, 약 97% 미만 동일, 약 96% 미만 동일, 약 95% 미만 동일한 등의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
본원에서, 달리 명시하지 않는 한, 백분율(%) 특성에 대한 참조는 다음을 이용하여 수행되는 상동성 평가를 의미한다: (1) 표준 디폴트 파라미터로 아미노산 검색을 위한 blastp 및 핵산 검색을 위한 blastn을 이용하는 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동순서 검색, 여기서 쿼리 서열은 디폴트에 의하여 낮은 복잡성 영역으로 필터링됨 (Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 기재됨, 상기 문헌은 그 전체로서 참조로 본원에 포함됨); (2) BLAST 2 정렬 (이하 기재되는 파라미터를 사용); 및/또는 (3) 표준 디폴트 파라미터로 PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST). BLAST 2.0 Basic BLAST와 BLAST2 사이의 표준 파라미터의 몇몇 차이로 인하여, 두 개의 특정 서열이 BLAST2 프로그램을 이용하여 상당한 상동성을 가지는 것으로 인지될 수 있는 반면, 쿼리 서열로서 상기 서열 중 하나를 이용하는 BLAST 2.0 Basic BLAST에서 수행되는 검색은 두번째 서열을 탑 매치에서 확인하지 않을 수 있다. 또한, PSI-BLAST는 자동화된 사용하기 쉬운 버젼의 "프로필" 검색을 제공하며, 이는 서열 상동성을 검색하기 위한 세심한 방식이다. 상기 프로그램은 먼저 gapped BLAST 데이터베이스 검색을 수행한다. 상기 PSI-BLAST 프로그램은 반송되어진 상당한 정렬로부터의 정보를 이용하여 포지션-특이적 스코어 매트릭스를 작제하며, 이는 다음 라운드의 데이터베이스 검색을 위한 쿼리 서열을 대체한다. 따라서, 백분율 특성은 이들 프로그램 중 임의의 하나를 이용하여 결정될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
두 개의 특정 서열을, 본원에 참조로 그 전체로서 포함되는 Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250에 기재된 바와 같이 BLAST 2 서열을 이용하여 서로 정렬할 수 있다. BLAST 2 서열 정렬은 BLAST 2.0 알고리즘을 이용하여 blastp 또는 blastn에서 수행되어, 두 서열 간의 Gapped BLAST 검색 (BLAST 2.0)을 수행하여 결과 생성되는 정렬 내에 갭 (결실 및 삽입)의 도입을 허용한다. 본원에서 명확성을 위하여, BLAST 2 서열 정렬은 다음과 같은 표준 디폴트 파라미터를 이용하여 수행된다:
For blastn, using 0 BLOSUM62 matrix:
Reward for match = 1
Penalty for mismatch = -2
Open gap (5) and extension gap (2) penalties
gap x_dropoff (50) expect (10) word size (11) filter (on)
For blastp, using 0 BLOSUM62 matrix:
Open gap (11) and extension gap (1) penalties
gap x_dropoff (50) expect (10) word size (3) filter (on).
본원에 사용되는 "작용제"는 제한없이 수용체 또는 리간드에 결합하거나 다른 분자와 또는 화학적 또는 생물학적 시스템 내에서 상호작용하고 반응을 생산 또는 유발하는, 소분자, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 결합 제제 등을 포함하는 임의의 화합물 또는 제제이며, 이는 자연 발생 물질의 작용을 모방하는 제제 (예를 들어, 단백질 또는 펩타이드의 작용제)를 포함할 수 있다. "길항제"는 제한없이 작용제 또는 자연 발생 물질의 작용을 블록킹 또는 저해 또는 감소시키는, 소분자, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 결합 제제 등을 포함하는 임의의 화합물 또는 제제이다.
분리된 핵산 분자는 핵산 분자가 자연적으로 발견되는 게놈 또는 염색체인 그 자연 환경으로부터 제거된 (즉, 인간 조작이 가하여진) 핵산 분자이다. 이와 같이, "분리된"은 핵산 분자가 정제된 정도를 반드시 반영할 필요는 없으나, 상기 분자가 핵산 분자가 자연에서 발견되는 전체 게놈 또는 전체 염색체를 포함하지 않음을 나타낸다. 분리된 핵산 분자는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 분리된 핵산 분자는 이러한 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니라, 상기 유전자와 결합되는 코딩 영역 및 조절 영역을 포함하고 동일한 염색체 상에서 자연적으로 발견되는 부가적인 유전자를 포함하지 않는다. 분리된 핵산 분자는 또한 정상적으로는 자연에서 명시된 핵산 서열을 플랭킹하지 않는 부가적인 핵산에 의하여 플랭킹된 (즉, 서열의 5' 및/또는 3' 말단에서) 명시된 핵산 서열 (즉, 이종 서열)을 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 DNA, RNA (예를 들어, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA의 유도체 (예를 들어, cDNA)를 포함할 수 있다. "핵산 분자"는 주로 물리적 핵산 분자를 의미하고, "핵산 서열"은 주로 핵산 분자 상의 뉴클레오티드 서열을 의미하나, 두 표현은 특히 단백질 또는 단백질의 도메인을 인코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열에 대하여 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 또한 용어 "핵산 분자" 또는 "핵산 서열"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
재조합 핵산 분자는 형질감염될 세포 내에서 핵산 분자(들)의 발현을 효과적으로 조절할 수 있는 임의의 전사 조절 서열 중 적어도 하나에 작동가능하게 결합되는 본원에 기재된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있는 분자이다. "핵산 분자"라는 용어는 주로 물리적 핵산 분자를 의미하고 "핵산 서열"이라는 용어는 주로 핵산 분자 상의 뉴클레오티드 서열을 의미하나, 상기 두 용어들은 특히 단백질을 인코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열에 대하여 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "재조합 분자"는 전사 조절 서열에 작동가능하게 결합되는 핵산 분자를 의미하나, 동물에 투여되는 "핵산 분자"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
재조합 핵산 분자는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산 분자에 작동가능하게 연결되고, 상기 융합 단백질의 재조합 생산을 가능케 하며, 본 발명에 따른 숙주 세포 내로 핵산 분자를 전달할 수 있는 핵산 서열, 전형적으로 이종 서열인 재조합 벡터를 포함한다. 이러한 벡터는 벡터 내로 삽입되는 분리된 핵산 분자에 인접하여 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 상기 벡터는 RNA 또는 DNA, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있으며, 바람직하게 본 발명에서, 바이러스 또는 플라스미드이다. 재조합 벡터는 핵산 분자의 클로닝, 시퀀싱 및/또는 조작에 사용될 수 있으며, 이러한 분자 (예를 들어, DNA 조성물 또는 바이러스 벡터-기제 조성물 내에서와 같은)의 전달에 사용될 수 있다. 재조합 벡터는 바람직하게 핵산 분자의 발현에 사용되며, 발현 벡터로도 언급될 수 있다. 바람직한 재조합 벡터는 형질감염된 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다.
본 발명의 재조합 분자 내에, 핵산 분자는 전사 조절 서열, 번역 조절 서열, 복제 기원, 및 숙주 세포와 상용가능하고 본 발명의 핵산 분자의 발현을 조절하는 기타 조절 서열과 같은 조절 서열을 함유하는 발현 벡터에 작동가능하게 결합된다. 특히, 본 발명의 재조합 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합되는 핵산 분자를 포함한다. 용어 "작동가능하게 결합되는"은 핵산 분자를 상기 분자가 숙주 세포 내로 형질감염될 때 (즉, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염될 때) 발현되도록 하는 방식으로 발현 조절 서열에 결합되는 것을 의미한다.
본 발명에 따라, 용어 "형질감염"은 외생 핵산 분자 (즉, 재조합 핵산 분자)가 세포 내로 삽입될 수 있는 방법을 의미한다. 용어 "형질전환"은 그러한 용어가 핵산 분자의 조류, 박테리아 및 효모와 같은 미생물 세포 내로의 도입을 의미하기 위하여 사용될 때, 용어 "형질감염"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 미생물 시스템 내에서, 용어 "형질전환"은 미생물에 의한 외생 핵산의 습득으로 인한 유전 변화를 기재하기 위하여 사용되며, 용어 "형질감염"과 실질적으로 동의어이다. 따라서, 형질감염 기법은 이에 제한되지 않으나, 형질전환, 세포의 화학적 처리, 입자 폭탄, 전기천공법, 미세주입법, 리포펙션, 흡착, 감염 및 원형질체 융합을 포함한다.
이하 실험 결과가 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위의 제한을 의도하지 않는다.
실시예
다음 재료 및 방법을 이하 실시예에 사용하였다.
마우스 및 종양 세포주
시험관 내 림프구 자극을 위하여, 암컷 C57BL/6 (H-2b) 마우스를 National Cancer Institute, Frederick Cancer Research and Development Facility (Frederick, MD)로부터 얻었다. 인간 CEA 유전자 (CEA-Tg) 발현을 위한 C57BL/6 마우스 동형접합체의 브리딩 쌍을 Dr. John Shively (City of Hope, Duarte, CA)에 의하여 제공받았다. CEA 발현에 대한 동형접합성을 마우스 꼬리 DNA의 PCR 분석에 의하여 확인하였다 (Greiner et al., Cancer Res 2002 Dec 1;62(23):6944-51). 6주 내지 8주령의 암컷 마우스를 모든 실험을 위하여 사용하였으며, AAALAC 가이드라인에 따라 병원체가 없는 조건 하에 마이크로-아이솔레이터 케이지 내에서 수용하였다. 실험 연구는 NIH Intramural Animal Care and Use Committee의 승인 하에 수행되었다. 표적 종양 세포주 EL-4 (H-2b, 흉선종)를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)으로부터 얻었다. LL/2 6 쥐 폐 선암 종양 세포는 Dr. Chandan Guha (Albert Einstein College of Medicine, New York, NY)로부터 제공받았다. 인간 CEA (LL2-CEA)를 발현하는 LL/2 쥐 폐암 세포를 이전에 기재된 바와 같이 (Robbins et al., Cancer Res 1991 Jul 15;51(14):3657-62) CEA cDNA로 레트로바이러스 형질도입에 의하여 생성하였다. 세포를 완전 배지 (10% 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민, 100 유닛/ml 페니실린, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM) 내에 유지하였다.
백신 구조물
쥐 B7-1, ICAM-1 및 LFA-3 유전자 및 인간 CEA 유전자 (rV/F-CEA/TRICOM)를 함유하는 재조합 백시니아 (rV) 및 재조합 파울폭스 (rF) 바이러스는 이전에 기재되었다 (Hodge et al., Cancer Res 1999 Nov 15;59(22):5800-7; and Grosenbach et al., Cancer Res 2001 Jun 1;61(11):4497-505). 쥐 GM-CSF-발현 rF 바이러스(rFGM- CSF)는 이전에 기재되었다 (Kass et al., Cancer Res 2001 Jan 1;61(1):206-14). 전장 CEA 단백질 (효모-CEA)를 발현하는 재조합 Saccharomyces cerevisiae 구조물이 이전에 기재되었다 (Bernstein et al., Vaccine 2008 Jan 24;26(4):509-21). 효모-CEA를 생산하고, 이전에 기재된 바와 같이 (Haller et al., Vaccine 2007 Feb 9;25(8):1452-63) 연구를 위하여 열-치사시켰다.
백신 스케쥴
혈청 사이토카인 분석을 위하여, CEA-Tg 마우스 (n=2)를 이전에 기재된 바와 같이 (Wansley et al., Clin Cancer Res 2008 Jul 1;14(13):4316-25) 1x108 pfu rVCEA/ TRICOM 또는 4 YU/동물 (1 YU=107 효모 입자)의 효모-CEA로 백신접종하였다. 모든 다른 연구를 위하여, rV/F-CEA/TRICOM 백신군, CEA-Tg 마우스를 0 일째에 1x107 pfu rF-GM-CSF와 혼합된 1x108 pfu rV-CEA/TRICOM으로 프라이밍(prime)하고, 1x107 pfu rF-GM-CSF과 혼합된 1x108 pfu rF-CEA/TRICOM 으로 8일마다 부스팅하였다. 나머지 실시예 및 본원 명세서의 다른 곳을 위하여, 이러한 백신 프로토콜은 일반적으로 "rV/F-CEA/TRICOM"으로 명명한다. 상기 효모-CEA 백신군에서, CEA-Tg 마우스를 효모-CEA (4 YU/마우스)로 7일마다 백신접종하였다. rV/F-CEA/TRICOM과 효모-CEA 백신의 조합을 투여받은 마우스를 1x108 pfu rV-CEA/TRICOM으로 등쪽 우측 옆구리에 피하 투여하여 프라이밍하고, 4 YU/마우스의 효모-CEA로, 다리 안쪽 및 어깨뼈에 피하 전달하였다. 복수 부위에서 효모-CEA 투여량의 분리는 이전에 기재되었으며 (Wansley, 2008, supra), 본원에서 효모-CEA 백신뿐 아니라 rV/F-CEA/TRICOM 또한 분리하여 마우스 내 복수 유출림프절을 표적화하기 위하여 사용되었다. 조합군 내 마우스를 나머지 연구를 위하여 1x108 pfu rF-CEA/TRICOM 및 효모-CEA (4 YU/마우스)로 1주 간격으로 부스팅하였다.
사이토카인 발현 프로파일
혈청 사이토카인 분석을 위하여, 백신접종된 마우스 (상기 백신접종 스케쥴 참조)를 백신접종 후 0, 2 및 4 일에 피를 뽑고, 혈청을 분리하였다. 사이토카인 발현을 Th1/Th2 및 Linco Diagnostic Services (St. Charles, MO)에 의한 친염증성 사이토카인 패널을 이용하여 분석하였다. rV/F-CEA/ TRICOM 또는 효모-CEA (n=5)로 백신접종된 마우스로부터 CD8+ T-세포에 의하여 분비되는 사이토카인을 측정하기 위하여, CD8+ T-세포를 벌크 배양하고,제조업자 지시에 따라 이전에 기재된 바와 같이 (Wansley et al., 2008, supra). Cytokine levels were measured using the mouse Inflammatory Cytokine Cytometric Bead Array Kit and the mouse Th1/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array kit (BD Biosciences, San Jose, CA) CEA-572-579 펩타이드 (GIQNSVSA, CEA-572로 명명되고 본원에서 SEQ ID NO:11로 표시됨) 또는 CEA-526-533 펩타이드 (EAQNTTYL, CEA-526로 명명되고 본원에서 SEQ ID NO:12로 표시됨) (10 ㎍/ml) 의 존재 하에 재자극하였다.
T-세포 수용체 ( TCR ) 프로파일
RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA)를 이용하여 제조업자 지시에 따라 분리하였다. 그 다음, RNA를 Invitrogen SuperScript®First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, 8 Carlsbad, CA) 를 이용하여 제조업자 지시에 따라 RT-PCR 반응에 사용하였다. Vα 및 Vβ 유전자를 19 Vα 및 24 Vβ 유전자에 대하여 이전에 기재된 프라이머 및 조건(Pannetier et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1993 May 1;90(9):4319-23; Arden et al., Nature 1985 Aug 29-Sep 4;316(6031):783-7.)을 이용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 Agilent 2100 Bioanalyzer 및 Agilent DNA 1000 Reagent Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 이용하여 제조업자 지시에 따라 온-칩 전기영동에 의하여 분석하였다. Agilent 2100 Expert Software (version B.02.06SI418 [Patch 01])을 이용하여 PCR 생성물을 크기 (bp) 및 양 (nmol/L)으로 동정하였다. 각각의 표본에 대하여, 각각의 존재하는 유전자의 양을 합하고, 각각의 유전자에 대하여, 총 TCR Vα 또는 Vβ 레퍼토리의 백분율을 계산하였다.
마우스 TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 및 5.2, 6, 7, 8.1 및 8.2, 8.3, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 17에 특이적인 모노클로날 항체로 구성되는 마우스 Vβ TCR 스크리닝 패널 (BD Pharmingen, San Jose, CA) 를 이용하여 TCR Vβ 발현을 FACScan 세포측정기 (Becton Dickinson)를 이용하여 유세포분석에 의하여 단백질 수준으로 동정하였다.
cDNA 올리고어레이
CEA-Tg 마우스를 미처리하거나 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 1주 간격으로 3회 백신접종하였다. 33일째에, 비장세포를 수확하고 RNA를 분리하였다. T- 및 B-세포 활성화, 케모카인 및 케모카인 수용체, 및 공통 사이토카인 cDNA 올리고어레이 (SABiosciences, Frederick, MD)를 이용하여 유전자 발현 변화를 조사하였다. 유전자의 정규화된 강도 비율이 >2 또는 <0.5이면 (2-배 컷오프), 제조업자 권고에 따라 각각 유전자가 상향조절되거나 하향조절된 것으로 간주되었다.
CEA -특이적 CTL 세포주 및 시험관 내 분석
rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터 생성된 CEA-526-특이적 및 CEA-572-특이적 T-세포주를 새롭게 조사된 APCs와 CEA-527 또는 CEA-572 펩타이드 (1 ㎍/ml) 및 IL-2 (10 U/ml)를 가지는 배양액 내에 유지하였다. T-세포주가 111In-표지된 표적을 용해하는 능력을 측정하기 위하여, 다양한 비율의 T 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 96-웰 U-바닥 플레이트 내에서 3중으로 표지된 표적과 함께 인큐베이션하였다. 특정 연구에서, 안티-MHC 클래스 I 블록킹 항체 (H2Db, BD Pharmingen)를 사용하여 TCR-중재 및 NK-유사 세포독성을 구별하였다. 상청액 내 방사능을 감마카운터 (Corba Autogamma, Packard Instruments, Downers Grove, IL)를 이용하여 측정하였다. 종양 용해 백분율을 다음과 같이 계산하였다: % 종양 용해 = [(실험적 cpm - 자발적 cpm)/)(최대 cpm - 자발적 cpm)] x 100. CEA-특이적 CTL 주의 결합력을 평가하기 위하여, 종양-치사 활성을 이전에 기재된 바와 같이 시험하였다 (Hodge et al, 2005, J Immunol 174(10):5994-6004). 데이터의 평균을 구하고 △% 특이적 용해로서 그래프로 나타내었다. 각각의 실험 내 군을 정규화하기 위하여, 데이터를 또한 최대 용해 대 펩타이드 농도의 백분율로서 나타내었다. 최종적으로, 정규화된 데이터의 자연 로그를 펩타이드 농도에 대하여 곡선으로 나타내었다. 각각의 T-세포 집단의 결합력을 50% 최대 표적 용해를 초래하는 펩타이드 농도의 음의 로그로서 정의하였으며 (Hodge et al., 2005, supra and Derby et al, 2001, J Immunol 166(3):1690-1697), nM으로 나타내었다. 상기 HIV-gag-390-398 펩타이드 (SQVTNPANI, HIV-gag 펩타이드로 명명되며 본원에서 SEQ ID NO:13로 표시됨)을 본 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다. CEA-526 및 CEA-572에 특이적인 MHC 클래스 I-펩타이드 테트라머를 Beckman Coulter (Fullerton, CA)로부터 얻었다. 나타내어지는 곳에, CTL 활성을 Wunderlich et al. (1994, "Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity." In: Coligan J, Kruisbeek A, Margulies D, Shevach E, Strober W (eds) Current Protocols in Immunology, Wiley, Hoboken, NJ)에 기재된 바와 같이 용균 유니트 (LU)로 변환하였다.
종양 치료법 연구
LL2-CEA 종양을 수반하는 치료법 연구를 위하여, 6 내지 8주령 암컷 CEA-Tg 마우스에 꼬리에 3x105 LL2-CEA 세포를 100㎕ 부피로 주입하였다. 종양 이식 4일 후에, 상기한 바와 같이 마우스를 프라이밍한 다음 부스팅하였다. 폐 전이를 계산하기 위하여, 희생된 마우스로부터의 폐를 부풀리고, India 잉크로 염색하고, Fekete's 용액 내에 고정시켰다 (Wexler, J Natl Cancer Inst 1966 Apr;36(4):641-5).
통계학적 분석
Macintosh 용 GraphPad Prism version 4.0a (GraphPad Software, San Diego, CA)을 이용하여 생체 내 데이터에 대한 통계학적 분석을 수행하였다. 45일에 마우스 당 종양의 평균 수에 대하여 양측, 비모수 Mann-Whitney 검정을 수행하였다. ≤1주 생존할 것으로 여겨지는 45일에 > 10 폐 종양 결절을 가지는 마우스에 대하여 로그-순위 (Mantel-Cox) 검정을 수행하였다. 모든 값은 95% 신뢰 구간에서 계산되었으며, ≤0.05 p 값은 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 1
다음 실시예들은 연이어 CEA-특이적 T-세포 반응에 영향을 미칠 수 있는 사이토카인 및 케모카인 숙주 선천적 면역 반응을 유도함에 있어서 면역요법 벡터의 역할을 보인다.
본 실험에서, 연이어 CEA-특이적 T-세포 반응에 영향을 미칠 수 있는 사이토카인 및 케모카인 숙주 선천적 면역 반응을 유도함에 있어서 면역요법 벡터의 역할을 조사하였다. 간략하게, CEA-Tg 마우스 (n=2)를 rV-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종하였다. 혈청을 0, 2 및 4일에 수집하고, 풀링하고 Th1/Th2을 이용하는 사이토카인의 패널 및 친염증성 사이토카인 패널에 대하여 분석하였다. 도 1에 도시되는 바와 같이, rV-CEA/TRICOM (검정색 정사각형)는 MIP1α, RANTES, GM-CSF, 및 IL-12p70 수준은 높고 IL-5 수준은 낮은 Th1-형 사이토카인 프로파일을 유도한다 (각각 도 1의 (A), (B), (F) 및 (I)). 데이터를 각각의 일에 pg/ml 사이토카인으로서 제시한다. 이러한 데이터는 rV-CEA/TRICOM vs. 효모-CEA로 백신접종이 상이한 사이토카인 발현을 유도함을 보이며, 이는 상이한 T-세포 집단이 각각의 백신 플랫폼에 의하여 유도됨을 나타내는 것이다.
실시예 2
다음 실시예는 rV-CEA/TRICOM vs. 효모-CEA로 백신접종이 별개의 TCR 레퍼토리를 유도함을 입증한다.
본 실험은 어느 플랫폼으로 백신접종이 뚜렷한 TCR 레퍼토리를 가지는 CD8+ T-세포 집단을 유도하는지 여부를 결정하고자 한다. CEA-Tg 마우스 (군 당 n = 5)를 상기 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종하였다. 미처리된 마우스는 음성 대조군으로 사용하였다 (도 2의 (A) 및 (D)). 백신접종 14일 후 백신접종된 마우스로부터 비장을 수확하고 풀링하였다. 19 Vα-특이적 및 24 Vβ-특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR 반응을 수행하였다. 그 다음, PCR 생성물을 분석하고, 총 TCR 레퍼토리의 백분율을 각각의 유전자에 대하여 계산하였다 (도 2; 별표는 다른 하나와 비교하여 한 백신으로 백신접종된 마우스로부터의 T-세포 내 고유하게 발현되는 유전자를 나타낸다). 미처리 마우스 및 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 비장세포의 TCR Vα프로필은 각각의 군이 뚜렷한 TCR Vα발현 프로필을 가짐을 나타낸다 (도 2의 (A) 내지 (C)). 12 내지 19 Vα유전자 발현은 두 백신 모두에 의하여 유도되는 T-세포 사이에 유사한 반면, 7 Vα유전자는 다른 하나와 비교하여 하나의 백신으로부터의 T-세포 집단에 고유하다 (도 2의 (B) 및 (C)). 이들 동일 동물로부터의 Vβ레퍼토리는 약간의 예외는 있으나, 상기 Vβ프로필이 또한 마우스 두 군 사이에 다름을 나타낸다 (도 2의 (D) 내지 (E)). 14 내지 24 Vβ유전자 발현은 두 백신 모두에 의하여 유도되는 T-세포 간에 유사하나, 상기 백신들은 고유한 Vβ유전자 또한 유도한다. 도 2의 (E) 및 (F)에 도시되는 바와 같이, 10 Vβ유전자가 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA-백신접종된 CEA-Tg 마우스로부터의 T-세포에 의하여 고유하게 발현되었다 (Vβ1, Vβ4, Vβ5.1, Vβ5.2, Vβ5.3, Vβ8.1, Vβ8.3, Vβ9, Vβ10, 및 Vβ20). 이러한 데이터는 미처리 마우스 및 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 T-세포의 Vα및 VβTCR 레퍼토리가 공통된 및 고유한 TCR 유전자 발현 패턴을 모두 가짐을 나타낸다. 그러나, 이러한 차이가 상이한 벡터-감염된 세포에 의한 CEA 항원의 상이한 프로세싱 및 제시, 또는 벡터 자체로 인한 것인지는 알려져 있지 않다. 상기 두 벡터 플랫폼으로 백신접종된 CEA-Tg 마우스로부터 생성되는 두 개의 상이한 CEA 에피토프가 이하 실시예에 기재된다.
실시예 3
이하 실시예는 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종이 벡터 및 항원에 대하여 공통된 및 고유한 유전자 발현 모두를 유도함을 보인다.
두 벡터 및 항원의 비장세포의 유전자 발현에 대한 영향을 조사하기 위하여, cDNA 올리고어레이를 이용하여 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종에 의하여 유도되는 T-세포 집단을 추가로 동정하였다. rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종CEA-Tg 마우스의 비장세포에 의한 T- 및 B-세포 활성화, 케모카인, 케모카인 수용체, 및 사이토카인에 수반되는 252 유전자 발현을 조사하였다. 표 1은 각각의 어레이에 대하여, rV/F-CEA/TRICOM 및 효모-CEA 모두, 대부분 사이토카인 시그널링에 수반되는, 26 유전자의 적어도 2배 상향 조절을 포함하는, 동일 유전자 발현에 있어서의 변화를 유도함을 보인다. 또한, 두 백신 모두, 분비된 포스포단백질-1 (Spp1, 또는 오스테오폰틴), 및 종양 억제제 Inha와 같은 T-세포 증식에 수반되는 유전자인, 면역세포의 주화(chemotaxis)에 수반되는 류코트리엔 수용체 Ltb4r2을 상향조절하였다. 동시에, 각각의 백신 플랫폼은 몇몇 유전자 발현에 있어서 고유한 변화를 유도한다 (표 1, 굵은 글씨). 효모-CEA는 Ccl12, Cxcl9, Ccr9와 같은 면역 세포의 주화에 수반되는 유전자를 하향조절하는 반면, rV/F-CEA/TRICOM는 이들 유전자 중 임의 것의 발현을 변경시키지 않는다. 이 실험으로부터의 결과는 상기 두 백신 플랫폼이 공통의 및 고유한 유전자 발현 모두의 변화를 유도함을 나타낸다.
Figure pct00001
굵은 글씨의 유전자가 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 비장세포에 의하여 특이적으로 상향조절된/하향조절되나, 이들 모두에 의해서는 그러하지 않다. >3배의 배수 변화는 괄호 안에 나타낸다.
실시예 4
이하 실시예는 rV/F-CEA/TRICOM 및 효모-CEA가 기능적으로 구분된 T-세포 집단을 유도함을 입증한다.
백신에 의하여 유도되는 T-세포 집단의 항원-특이적 반응을 결정하기 위하여, 두 개의 구분된 CEA 에피토프 (CEA-572 및 CEA-526) 중 하나로 시험관 내 자극 후 백신접종된 동물로부터의 T-세포에 의하여 생산되는 사이토카인을 조사하였다. 도 3의 (A)는 도메인 III의 A3 루프 상에 구분된 비-중복 CEA-526 및 CEA-572 에피토프를 나타내는 CEA 단백질을 예시한다.
도 3을 참조로 하여, CEA-Tg 마우스 (n=5)를 0일에 rV-CEA/TRICOM (검은 막대)로 프라이밍하고 7일 및 14일에 rFCEA/ TRICOM로 부스팅하였다; CEA-Tg 마우스 (n=5)를 효모-CEA로 0일에 프라이밍하고 7일 및 14일에 부스팅하였다 (흰 막대). 33일에, 마우스를 희생시키고, 비장을 풀링하고 CEA-526 (도 3의 (B)) 또는 CEA-572 (도 3의 (C)) 펩타이드로 7일 동안 벌크 배양액 내로 넣었다. 림프구를 CEA-특이적 펩타이드 또는 VSVN 펩타이드 대조군으로 24 시간 동안 재자극한 후, IL-2, IL-10, TNF-α, IFN-γ, IL-5 및 IL-4를 사이토카인 비드 어레이 (pg/ml/L x 106 세포)에 의하여 측정하였다. 모든 데이터를 VSVN 펩타이드 대조군에 대하여 정규화하였다.
두 개의 상이한 CEA 에피토프는 백신접종된 동물로부터의 T 세포로부터 상이한 수준의 사이토카인 생산을 유도하는 것으로 관찰되었다. 효모-CEA와 비교하여 rV/F-CEA/TRICOM 백신접종 후 더 높은 수준의 TNF-α가 CEA-526에 대하여 분비되었으나 (도 3의 (B), 검은 막대), 효모-CEA 백신접종은 T 세포가 CEA-572 펩타이드로 재극될 때 유의하게 더 높은 수준의 TNF-α를 생산한다 (도 3의 (C), 흰 막대). 또한, CEA-526 및 CEA-572 펩타이드로 재극될 때, 효모-CEA 백신접종 세포는 rV/F-CEA/TRICOM 백신접종으로부터의 T 세포와 비교하여 더 높은 수준의 IL-2를 유도한다 (도 3의 (B) 및 (C), 흰 막대) 유사하게, rV/F-CEA/ TRICOM로 백신접종 후, 효모-CEA 백신접종과 비교하여 T 세포는 CEA-526 및 CEA-572 펩타이드에 대하여 더 높은 수준의 IFN-γ를 유도한다 (도 3의 (B) 및 (C), 검은 막대).
상기 데이터는 또한 백신접종된 동물로부터의 T 세포가 단일 CEA 에피토프에 대하여 상이한 수준의 다양한 사이토카인을 분비함을 보인다. 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 T-세포는 CEA-572 에피토프에 대하여 IL-4, IL-10, TNF-α, IFN-γ, IL-5 및 IL-2를 분비한다 (도 3의 (C), 흰 막대). 한편, rV/F-CEA/TRICOM로 백신접종된 마우스로부터의 T 세포는 효모-CEA와 비교하여 CEA-572 펩타이드에 대하여 유의하게 더 높은 수준의 IFN-γ를 분비하고, CEA-572 에피토프에 대하여 더 낮은 수준의 IL-10 및 TNF-α를 분비한다 (도 3의 (C), 검정 막대). 이러한 결과는 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종에 의하여 유도되는 T-세포 집단이 항원-특이적이고 기능적으로 구분됨을 나타낸다.
실시예 5
이하 실시예는 rV/F-CEA/TRICOM 대 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터 발달된 T-세포주가 14 구분된 TCR 레퍼토리 및 기능적 친화성을 가짐을 입증한다.
rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 T 세포의 기능성의 잠재적인 차이를 추가로 조사하기 위하여, CEA-526 또는 CEA-572 펩타이드에 특이적인 T-세포주를 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 백신접종된 CEA-Tg 마우스로부터 생성하였다. 간략히, CEA-Tg 마우스 (군 당 n=5)를 상기한 바와 같이 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종하였다. 최종 백신접종 2주 후, 비장을 수확하고 풀링하고, 비장세포를 CEA-526 또는 CEA-572 펩타이드로 7일 동안 벌크 배양하였다. 림프구를 새로운 펩타이드 IL-2 및 조사된 APCs로 7일마다 재자극하고, 시험관내 실험을 위하여 배양액 내 유지하였다. 18 자극 사이클 후 TCR 프로필 분석을 수행하였다.
4 세포주로부터의 Vα TCR은 T-세포 집단이 공통의 및 구분되는 Vα TCR 레퍼토리를 가짐을 나타낸다. 도 4에, CEA-526 (도 4의 (A)) 및 CEA-572 펩타이드 (도 4의 (B)) 존재하에 유지되는 rV/F-CEA/TRICOM T-세포주 (검정 막대)의 Vα TCR 레퍼토리를 도시한다. 도 4는 또한 CEA-526 (도 4의 (C)) 및 CEA-572 펩타이드 (도 4의 (D)) 존재하에 유지되는 효모-CEA T 세포주 (흰색 막대)의 Vα TCR 레퍼토리를 도시한다. 결과를 총 Vα TCR 레퍼토리의 백분율로서 나타낸다. 별표는 다른 하나와 비교하여 하나의 백신으로 백신접종된 마우스로부터의 T 세포 내에 고유하게 발현되는 31 유전자를 나타낸다.
CEA-526 에피토프로 백진접종되고 자극된 마우스로부터의 T-세포 내에서, 상기 T-세포는 19 Vα 유전자 중 16의 공통 발현 및 3 Vα 유전자의 고유한 발현을 가진다 (도 4의 (A) 및 (C)). CEA-572 에피토프로 백진접종되고 자극된 마우스로부터의 T-세포 내에서, 상기 T-세포는 19 Vα 유전자 중 15의 공통 발현 및 4 Vα 유전자의 고유한 발현을 가진다 (도 4의 (B) 및 (D)). Vβ TCR 프로필을 분석할 때 유사한 결과가 보여졌다 (데이터 도시하지 않음). 또한, T-세포주의 선별된 Vβ TCR 유전자 발현이 상용가능한 모노클로날 항체를 이용하는 유세포 분석법에 의하여 확인되었다 (데이터 도시하지 않음). 이러한 데이터는 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 T-세포 집단이 벡터- 및 항원-특이적이라는 추가적인 증가를 제공한다.
두 벡터로부터의 T-세포 간의 기능적 차이를 규명하기 위하여, rV/FCEA/TRICOM로부터 생성된 T-세포의 CEA-특이적 세포용균 활성을 효모-CEA 백신접종으로부터 생성된 것과 비교하였다. T-세포주 배양액의 순도를 모노클로날 항체로 세포 표면 염색을 통하여 확인하여, CD8, CD4 및 NK 세포를 동정하고 이어서 유세포를 측정하였다 (데이터 도시하지 않음). 또한, CEA-526 또는 CEA-572에 특이적인 MHC 클래스 I-펩타이드 테트라머를 이용하는 테트라머 염색은 T-세포주에 대한 펩타이드 특이성을 확인하였다 (데이터 도시하지 않음).
간략히, rV/F-CEA/TRICOM 백신접종으로부터 생성되고 CEA-526 펩타이드 (도 5의 (A)) 및 CEA-572 펩타이ㄷ (도 5의 (C))에 특이적인 T 세포주를 펩타이드-펄스된 111In-표지된 EL-4 세포 표적과 함께 4 시간 동안 지시된 비율로 인큐베이션하였다. 효모-CEA 백신접종으로부터 생성되고 CEA-526 헵타이드 (도 5의 (B)) 및 CEA-572 펩타이드 (도 5의 (D))에 특이적인 T-세포주를 또한 111In-표지된 EL-4 세포 표적과 함께 4 시간 동안 지시된 비율로 인큐베이션하였다. 도 5를 참조하면, CEA-572 및 CEA-526 펩타이드로 펄스된 111In-표지된 EL-4 세포가 실선에 의하여 연결된 검정색 정사각형으로 표시되고, VSVNP으로 펄스된 111In-표지된 EL-4 세포(음성 대조군)가 점선으로 연결된 빈 원으로 표시된다. T-세포 결합력을 측정하기 위하여, (도 5의 (B), 삽입) rV/F-CEA/TRICOM (검정색 정사각형) 및 효모-CEA (흰 원)으로부터 CEA-526 특이적 T-세포주를 1 μM 내지 0 μM에 이르는 다양한 농도의 CEA-526 (또는 HIV-gag 대조군)의 존재하에 4 시간 동안 111In-표지된 EL-4 세포와 인큐베이션하였다. rV/F-CEA/TRICOM (도 5의 (E)) 또는 효모-CEA (도 5의 (F))로 백신접종된 마우스로부터 생성된 CEA-572 에피토프에 특이적인 T-세포주를 또한 111In-표지된 LL2-CEA를 이용하여 세포용해 T-세포 분석에 사용하였으며, 다양한 비율로 LL2 (음성 대조군) 종양 표적으로 정규화하였다. 막대는 삼중 웰로부터 표준 오차를 나타낸다.
도 5의 (A) 및 (B)는 rV/F-CEA/TRICOM로부터 생성된 CEA-526 펩타이드-특이적 T-세포주가 효모-CEA 백신접종으로부터 생성된 T-세포주와 비교하여 더 높은 용해 활성을 가짐을 보인다. CEA-572 에피토프에 특이적인 T-세포주는 모두 유사한 수준의 세포용해 활성을 나타낸다 (도 5의 (C) 및 (D)). 도 5의 (B) 삽입 그래프는 rV/F-CEA/TRICOM 백신접종으로부터 생성된 CEA-526-특이적 T-세포주가 효모-CEA 백신접종으로부터 생성된 CEA-526-특이적 T-세포주보다 23.3배 더 높은 결합력을 가짐을 보인다.
CEA-572-특이적 T-세포주를 또한 111In-표지된 LL2-CEA 세포를 표적화하는 CTL 분석에 사용하였다. rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 CEA-572-특이적-T 세포를 분석에 앞서 20 주 동안 배양하였다. 두 T-세포주 모두 LL2-CEA 표적을 용해하고, 이펙터 세포 (LLS-CEA 표적)에 대한 T-세포의 비율이 감소함에 따라 용해가 감소한다 (도 5의 (E) 및 (F)). 이러한 결과는 두 T-세포주 모두 CEA-발현 세포를 용해할 수 있으나, LLS-CEA 세포 용해를 LL2 세포의 것에 대하여 정규화할 때, 효모-CEA (도 5의 (F))로 백신접종된 마우스로부터의 T-세포주가 rV/FCEA/ TRICOM (도 5의 (E))로 백신접종된 마우스로부터의 T-세포주와 비교하여 더 높은 수준의 활성을 가짐을 나타낸다.
도 5의 (E) 및 (F)에서 관찰된 세포 용해가 TCR-중재이며 NK 세포 활성으로 인한 것이 아님을 확인하기 위하여, MHC 클래스 I 분자에 특이적인 모노클로날 항체를 블록킹하면서 CTL 실험을 LL2-CEA 종양 표적을 이용하여 수행하고, 대조군으로서 LL2 표적 세포에 정규화하였으며, 이는 MHC 클래스 I 블록킹 항체의 존재가 세포 용해를 없앰을 보였다. NK 세포-중재 용해의 결여를 YAK1 표적을 이용하는 CTL에서 더욱 확인하였으며, 이는 MHC 클래스 블록킹 항체의 존재가 YAK1 세포 용해를 다양한 T-세포주에 의하여 없앰을 밝혔다. 이러한 결과들은 함께 동일한 CEA-에피토프를 표적화하는 상이한 벡터로부터 형성된 T-세포주의 용해 활성이 TCR-중재이며, 펩타이드-펄스된 표적 세포를 표적화할 때, CEA-발현 종양 표적을 용해하는 능력은 상이하나 세포 용해의 수준은 유사함을 나타낸다. 부가적으로, rV/F-CEA/TRICOM-유도된 T-세포주의 결합력은 효모-CEA 백신접종으로부터 형성되는 T-세포주의 것보다 더 높을 수 있다. 이러한 결과는 rV/F-CEA/TRICOM 또는 효모-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 T-세포 집단을 플랫폼-특이적인 것으로 더욱 규명한다.
실시예 6
이하 실시예는 rV/F-CEA/TRICOM 및 효모-CEA의 조합이 쥐 동소성 폐 전이 모델에서 효과적인 항종양 치료법임을 입증한다.
두 백신의 동시 투여가 어느 한 백신 플랫폼 단독으로 백신접종에 비하여 우수한 항종양 활성을 생성하는지 여부를 결정하기 위한 연구를 수행하였다. 간략히, CEA-Tg 마우스에 LL2-CEA 종양세포를 i.v. 주입하였다. 4일째에, 마우스를 rV/F-CEA/TRICOM (n = 10), 효모-CEA (n = 14), 또는 rV/F-CEA/TRICOM 및 효모-CEA (n = 10)로 프라이밍 하고; 대조군 (n=17)은 미처리하였다. 마우스를 실험 기간 동안 7일 마다 부스팅하였다. 상기 rV/F-CEA/TRICOM 군은 rV/F-CEA/TRICOM로 부스팅하였다. 상기 효모-CEA 군은 효모-CEA 만으로 부스팅하였다. 조합 군은 rV/F-CEA/TRICOM 및 효모-CEA로 부스팅하였다. 이러한 연구를 위하여, rV/F-CEA/TRICOM를 등쪽 우측 옆구리에 s.c. 주입하고, 1YU 효모-CEA를 각각 다리 안쪽 및 어깨뼈에 s.c. 전달하여 복수 유출 림프절을 표적화하였다. 45일째에, 마우스를 희생시키고, 폐를 수확하고 염색하고 고정시켰다. 도 6에 도시되는 데이터는 두 개의 별개의 실험 (빈 vs. 검정색 기호로 나타냄)으로부터의 마우스 당 폐 전이 수를 나타낸다. 막대는 미처리 마우스를 rV/F-CEA/TRICOM 및 효모-CEA 조합군과 비교하여, 마우스 당 평균 전이 수 p = 0.015를 나타낸다.
미처리 마우스는 마우스 당 평균 10.84 종양을 가졌다 (+2.41). rV/FCEA/TRICOM로 백신접종된 마우스는 마우스 당 평균 7.50 전이를 가졌고 (+2.02), 효모-CEA로 백신접종된 마우스는 마우스 당 평균 9.71 전이를 가졌다 (+1.22). 그러나, rV/FCEA/TRICOM와 효모-CEA의 조합으로 백신접종된 마우스는 마우스 당 2.80 전이를 가졌으며 (+0.77); 이러한 조합군은 미처리 대조군과 비교하여 유의하게 더 낮은 수의 전이를 가지는 유일한 군이었다 (p=0.015). 또한, 미처리, rV/FCEA/TRICOM 및 효모-CEA 군에 대한 마우스 당 최대 전이수는 각각 36, 24 및 18인 반면, 조합군에서 최대 전이수는 7이었다. 더욱이, 로그-순위 검정 (45일에 >9 폐 종양 결절을 가지는 마우스; <1 주 생존할 것으로 추정)은 미처리 마우스와 rV/FCEA/TRICOM 및 효모-CEA의 조합을 투여받은 마우스 간의 통계학적 유의성을 보였다 (p = 0.0027). 또한, rV/FCEA/TRICOM 단독 대 rV/FCEA/TRICOM 및 효모-CEA의 동시 백신접종 처리된 마우스 간에 통계학적 유의성이 있었다 (p = 0.0293). 또한, 효모-CEA 단독 대 rV/FCEA/TRICOM 및 효모-CEA의 동시 백신접종 처리된 마우스 간의 통계학적 유의성이 있었다 (p = 0.0017). 이러한 결과들은 함께, rV/FCEA/TRICOM 및 효모-CEA 백신의 동시 투여가 항종양 효과를 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
상기 논의한 바와 같이, 백신 플랫폼을 비교하는 공개된 보고서들은 면역 체계를 자극함에 있어 하나가 다른 하나보다 더 효과적이라고 역사적으로 결론내렸으며, 따라서 임상적 연구를 위하여 더 효과적인 플랫폼의 추가적 개발을 권유하여 왔다 (Riezebos-Brilman et al., Gene Ther 2007 Dec;14(24):1695-704; and Casimiro et al., J Virol 2003 Jun;77(11):6305-13). 본원에 제공되는 결과는 각각의 플랫폼에 의하여 유발되는 T-세포 집단이 상이한 CEA 에피토프에 대하여 고유한 및 공통적인 표현형적 및 기능적 반응을 나타냄을 입증하였다. 본원에 제시되는 결과는 (a) 동일한 항원을 표적화하는 2 백신이 구분된 T-세포 집단을 유도하고, (b) 이러한 T-세포 집단의 유도가 벡터- 및 항원-특이적이며, (c) 상기 백신들을 항종양 모델 내에 동시 사용하여 항종양 효과를 개선시킬 수 있음을 최초로 보였다.
본 발명의 다양한 구현예가 상세히 기재되었으나, 이러한 구현예에 대한 변형 및 변화가 일어날 수 있음이 당업자에게 분명하다. 그러나, 이러한 변형 및 변화는 이하 청구범위에 기재되는 바와 같은 본 발명의 범위 내인 것으로 분명히 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> GlobeImmune, Inc. United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Hodge, James Schlom, Jeffrey Franzusoff, Alex <120> Combination Immunotherapy Compositions and Methods <130> 3923-24-PCT <150> 61/170,530 <151> 2009-04-17 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2124 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> CDS <222> (7)..(2109) <400> 1 gaattc atg gag tct ccc tcg gcc cct ccc cac aga tgg tgc atc ccc 48 Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro 1 5 10 tgg cag agg ctc ctg ctc aca gcc tca ctt cta acc ttc tgg aac ccg 96 Trp Gln Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro 15 20 25 30 ccc acc act gcc aag ctc act att gaa tcc acg ccg ttc aat gtc gca 144 Pro Thr Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala 35 40 45 gag ggg aag gag gtg ctt cta ctt gtc cac aat ctg ccc cag cat ctt 192 Glu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu 50 55 60 ttt ggc tac agc tgg tac aaa ggt gaa 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gtg aat aat agt gga tcc tat acg tgc caa gcc cat 912 Pro Asn Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His 290 295 300 aac tca gac act ggc ctc aat agg acc aca gtc acg acg atc aca gtc 960 Asn Ser Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val 305 310 315 tat gag cca ccc aaa ccc ttc atc acc agc aac aac tcc aac ccc gtg 1008 Tyr Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val 320 325 330 gag gat gag gat gct gta gcc tta acc tgt gaa cct gag att cag aac 1056 Glu Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn 335 340 345 350 aca acc tac ctg tgg tgg gta aat aat cag agc ctc ccg gtc agt ccc 1104 Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro 355 360 365 agg ctg cag ctg tcc aat gac aac agg acc ctc act cta ctc agt gtc 1152 Arg Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val 370 375 380 aca agg aat gat gta gga ccc tat gag tgt gga atc cag aac gaa tta 1200 Thr Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu 385 390 395 agt gtt gac cac agc gac cca gtc atc ctg aat gtc ctc tat ggc cca 1248 Ser Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro 400 405 410 gac gac ccc acc att tcc ccc tca tac acc tat tac cgt cca ggg gtg 1296 Asp Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val 415 420 425 430 aac ctc agc ctc tcc tgc cat gca gcc tct aac cca cct gca cag tat 1344 Asn Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr 435 440 445 tct tgg ctg att gat ggg aac atc cag caa cac aca caa gag ctc ttt 1392 Ser Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe 450 455 460 atc tcc aac atc act gag aag aac agc gga ctc tat acc tgc cag gcc 1440 Ile Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala 465 470 475 aat aac tca gcc agt ggc cac agc agg act aca gtc aag aca atc aca 1488 Asn Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr 480 485 490 gtc tct gcg gag ctg ccc aag ccc tcc atc tcc agc aac aac tcc aaa 1536 Val Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn 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Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met 65 70 75 80 agg gac cag tac atg aga act ggg gag ggc ttt ctt tgt gta ttt gcc 288 Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala 85 90 95 ata aat aat act aaa tca ttt gaa gat att cac cat tat aga gaa caa 336 Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr Arg Glu Gln 100 105 110 att aaa aga gta aag gac tct gaa gat gtg cct atg gtc ctg gta ggg 384 Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val Leu Val Gly 115 120 125 aat aag tgt gat ttg cct tct aga aca gta gac acg aaa cag gct cag 432 Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys Gln Ala Gln 130 135 140 gag tta gca agg agt tac ggg att ccg ttc att gag acc tca gca aag 480 Glu Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr Ser Ala Lys 145 150 155 160 aca aga cag ggt gtt gac gat gcc ttc tat aca tta gtc cga gaa att 528 Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val Arg Glu Ile 165 170 175 cga aaa tag 537 Arg Lys <210> 4 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic 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gtg cct atg gtc ctg gta ggg 384 Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val Leu Val Gly 115 120 125 aat aag tgt gat ttg cct tct aga aca gta gac acg aaa cag gct cag 432 Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys Gln Ala Gln 130 135 140 gag tta gca agg agt tac ggg att ccg ttc att gag acc tca gca aag 480 Glu Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr Ser Ala Lys 145 150 155 160 aca aga cag ggt gtt gac gat gcc ttc tat aca tta gtc cga gaa att 528 Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val Arg Glu Ile 165 170 175 cga aaa tag 537 Arg Lys <210> 6 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Thr Glu 1 5 10 15 Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr 35 40 45 Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys 50 55 60 Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr 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Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr 35 40 45 Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys 50 55 60 Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met 65 70 75 80 Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala 85 90 95 Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr Arg Glu Gln 100 105 110 Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val Leu Val Gly 115 120 125 Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys Gln Ala Gln 130 135 140 Glu Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr Ser Ala Lys 145 150 155 160 Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val Arg Glu Ile 165 170 175 Arg Lys <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 11 Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 12 Glu Ala Gln Asn Thr Thr Tyr Leu 1 5 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Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu 15 20 25 cag gcg ggc agc gag aag ggc gac ccc aca gag cgc gaa ctg cgc gtg 625 Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val 30 35 40 ggc ctg gag gag agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag ctc acc aat 673 Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn 45 50 55 60 gag atg atc gtg acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg gtg ctg aag 721 Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys 65 70 75 gtg aac gtg tct ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc ttc ctg ctg 769 Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu 80 85 90 gac ttc gtg gcg gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg aac ggg gaa 817 Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu 95 100 105 tgg gtg ccg ggg ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc tgc gtc tac 865 Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr 110 115 120 atc cac ccc gac tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg aag gct ccc 913 Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly 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cttacagatg aacccaactg tggagatgat gcagttggcc caacctcact 2071 gacggtgaaa aaatgtttgc cagggtccag aaactttttt tggtttattt ctcatacagt 2131 gtattggcaa ctttggcaca ccagaatttg taaactccac cagtcctact ttagtgagat 2191 aaaaagcaca ctcttaatct tcttccttgt tgctttcaag tagttagagt tgagctgtta 2251 aggacagaat aaaatcatag ttgaggacag caggttttag ttgaattgaa aatttgactg 2311 ctctgccccc tagaatgtgt gtattttaag catatgtagc taatctcttg tgttgttaaa 2371 ctataactgt ttcatatttt tcttttgaca aagtagccaa agacaatcag cagaaagcat 2431 tttctgcaaa ataaacgcaa tatgcaaaat gtgattcgtc cagttattag tgaagcccct 2491 ccttttgtga gtatttactg tttattg 2518 <210> 15 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn 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275 280 285 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Ser 355 360 365 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 Pro Ser Met 435

Claims (78)

  1. a) 적어도 하나의 공동 자극 분자를 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및
    b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물
    을 개체에 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 상기 개체에 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는, 개체 내에서 암의 적어도 하나의 증상을 예방, 개선 또는 치료하거나, 암을 가지는 개체의 생존률을 증가시키거나, 및/또는 상기 개체 내에서 하나 이상의 암 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 백시니아 바이러스는 공동 자극 분자 B7-1, ICAM-1 및 LFA-3을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. a) i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스; 및
    ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스
    를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및
    b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물
    을 개체에 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 상기 개체에 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는, 개체 내에서 암의 적어도 하나의 증상을 예방, 개선 또는 치료하거나, 암을 가지는 개체의 생존률을 증가시키거나, 및/또는 상기 개체 내에서 하나 이상의 암 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 최초 투여 후 적어도 1 주 후에, 상기 개체에
    a) i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스; 및
    ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스
    를 포함하는 제3 면역요법 조성물; 및
    b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물
    를 투여하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 제2 및 제3 면역요법 조성물은 상기 개체에 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 항원은 CAP-1-6D 에피토프를 포함하는 변형된 CEA인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 개체 내에서 적어도 하나의 암의 증상을 예방, 개선 또는 치료하거나, 암을 가지는 개체의 생존률을 증가시키거나, 및/또는 상기 개체 내에서 하나 이상의 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하기 위한, 개체에 동시 투여를 위한 약제 제조에 있어서의 면역요법 조성물들의 조합의 용도로서,
    상기 면역요법 조성물들은
    a) i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스; 및
    ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스
    를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및
    b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물을 포함하는 것인 면역요법 조성물들의 조합의 용도.
  7. 제6항에 있어서,
    i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스; 및
    ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스
    를 포함하는 제3 면역요법 조성물을 추가로 포함하는 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 앙카라 (MVA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및
    b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물
    를 개체에 투여하는 단계를 포함하고;
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물이 상기 개체에 동시에 투여되며;
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 중 하나 또는 둘 모두가 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    개체 내에서 질병 또는 상태의 적어도 하나의 증상을 예방, 개선 또는 치료하거나, 상기 질병 또는 상태를 가지는 개체의 생존률을 증가시키거나, 및/또는 상기 개체 내에서 하나 이상의 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하는 방법.
  10. 개체 내에서 질병 또는 상태의 적어도 하나의 증상을 예방, 개선 또는 치료하거나, 상기 개체의 생존률을 증가시키거나, 및/또는 상기 개체 내에서 하나 이상의 항원에 대한 치료 면역 반응을 유도하기 위한, 동시 투여를 위한 약제의 제조에 있어서의 면역요법 조성물들의 조합의 용도로서,
    상기 면역요법 조성물들은
    a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및
    b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물
    을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 중 하나 또는 둘 모두가 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물은 하나 이상의 면역자극성 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물은 바이러스 게놈 또는 그의 일부 및 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스, 및 하나 이상의 면역자극성 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물은 적어도 하나의 항원 또는 그 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 및 하나 이상의 면역자극성 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물 내 재조합 바이러스 또는 바이러스들은 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물 내 재조합 바이러스 또는 바이러스들은 재조합 백시니아 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 앙카라 (MVA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물 내 재조합 바이러스 또는 바이러스들은 파울폭스 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역자극성 분자는 하나 이상의 공동자극 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 면역자극성 분자는 B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역자극성 분자는 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 사이토카인은 과립 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF)인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 면역요법 조성물은 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 발현하는 효모 베히클을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 면역요법 조성물 내 상기 효모 베히클은 전체 효모(whole yeast)인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 면역요법 조성물 내 상기 효모 베히클은 전체, 열-치사된 효모인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 면역요법 조성물 내 상기 효모 베히클은 사카로마이세스(Saccharomyces)로부터인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 상기 개체 내에 상이한 부위에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 상기 개체 내에 동일한 부위 또는 인접하는 부위에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 각각은 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 각각은 동일한 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물은 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하고, 상기 제2 면역요법 조성물은 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 면역요법 조성물은 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하고, 상기 제1 면역요법 조성물은 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에 상기 면역요법 조성물 중 하나 또는 모두를 부스팅하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 개체에 상기 제2 면역요법 조성물을 상기 제1 면역요법 조성물보다 더 자주 부스팅하는 것을 포함하는 방법.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에, 상기 제1 면역요법 조성물과 상이한, 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제3 면역요법 조성물을 부스팅하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물은 재조합 백시니아 바이러스를 포함하고, 상기 제3 면역요법 조성물은 파울폭스 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에 다른 급원의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 부스팅하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 생체반응 조절물질을 상기 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 암을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 방법은 상기 개체 내에서 종양 적하 중량을 감소시키거나 종양 성장을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 항원은 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종(angiosarcomas, hemangiosarcomas), 비만세포종, 백혈병, 림프종, 원발성 간암, 폐암, 췌장암, 위장관암, 신장암, 조혈 종양 및 이의 전이암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암으로부터인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제38항에 있어서,
    상기 항원은 암배아 항원 (CEA), 돌연변이 Ras 종양 단백질, 브라큐리(Brachyury), MUC-1, EGFR, BCR-Abl, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GAGE, GP-100, MUC-2, 정상 및 점 돌연변이 p53 종양단백질, PSMA, 티로시나아제, TRP-1 (gp75), NY-ESO-1, TRP-2, TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c-erb/B2, hTERT, p73, B-RAF, 선종성 용종 유전자 (APC), Myc, von Hippel-Lindau protein (VHL), Rb-1, Rb-2, 안드로겐 수용체 (AR), Smad4, MDR1, Flt-3, BRCA-1, BRCA-2, pax3-fkhr, ews-fli-1, HERV-H, HERV-K, TWIST, 메소텔린, NGEP, 이러한 항원의 변형, 이러한 항원의 스플라이스 변이체, 및 이러한 항원의 에피토프 작용제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제38항에 있어서,
    상기 항원은 암배아 항원 (CEA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 CEA는 CAP1-6D 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 CEA는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제38항에 있어서,
    상기 항원은 돌연변이 Ras인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 항원은 각각 Ras의 포지션 12, 13, 59, 61 및/또는 76에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 Ras 단편을 포함하는 복수 도메인 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 항원은 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, 및/또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제38항에 있어서,
    상기 항원은 브라큐리(Brachyury)인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제38항에 있어서,
    상기 항원은 MUC-1인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제38항에 있어서,
    상기 항원은 EGFR인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제38항에 있어서,
    상기 항원은 BCR-Abl인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제38항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체를 화학요법으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제38항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체를 방사선 요법으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  54. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 병원체에 의하여 야기되거나 이와 관련되는 질병을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 방법은 상기 병원체에 의한 상기 개체의 감염을 감소시키거나 예방하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제54항에 있어서,
    상기 방법은 상기 개체 내에서 병원체 역가를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제54항에 있어서,
    상기 항원은 바이러스 항원, 균류 항원, 박테리아 항원, 장내 기생충 항원, 기생충 항원, 체외 기생충 항원, 원생동물 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제54항에 있어서,
    상기 항원은 아데노바이러스, 아레나 바이러스, 뷰나바이러스, 코로나바이러스, 콕삭키 바이러스, 거대세포 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 플라비바이러스, 헤파드나 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 렌티바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 믹소바이러스, 종양 바이러스, 오르토믹소바이러스, 유두종 바이러스, 파포바바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 파라믹소바이러스, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스 바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 레오바이러스, 랍도바이러스, 풍진 바이러스, 토가바이러스, 수두 바이러스, 및 T-림프영양성 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스로부터인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제54항에 있어서,
    상기 항원은 Aspergillus , Bordatella , Brugia , Candida , Chlamydia , Coccidia , Cryptococcus, Dirofilaria , Escherichia , Francisella , Gonococcus , Histoplasma , Leishmania , Mycobacterium, Mycoplasma , Paramecium , Pertussis , Plasmodium , Pneumococcus , Pneumocystis, Rickettsia , Salmonella , Shigella , Staphylococcus, Streptococcus , Toxoplasma , Vibriocholerae , 및 Yersinia로 이루어지는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 전염성 제제로부터인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제54항에 있어서,
    상기 항원은 Pseudomonas , Bordetella , Mycobacterium , Vibrio , Bacillus , Salmonella, Francisella , Staphylococcus , Streptococcus , Escherichia , Enterococcus , Pasteurella , 및 Yersinia로부터 선택되는 속으로부터의 박테리아로부터인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. a) 바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및
    b) 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물
    을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물 중 하나 또는 둘 모두는 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 면역요법 조성물은 혼합되어 제공되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물은 하나 이상의 면역자극성 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 제61항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물은 바이러스 게놈 또는 그의 일부 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스, 및 하나 이상의 면역자극성 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  64. 제61항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물은 상기 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 및 하나 이상의 면역자극성 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 면역요법 조성물 내 상기 재조합 바이러스 또는 바이러스들은 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
  66. 제61항에 있어서,
    상기 제2 면역요법 조성물은 상기 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 발현하는 효모 베히클을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  67. 제61항 또는 제66항에 있어서,
    상기 제2 면역요법 조성물 내 효모 베히클은 전체, 가열-치사된 효모인 것을 특징으로 하는 조성물.
  68. 제61항, 제66항 또는 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 면역요법 조성물 내 효모 베히클은 사카로마이세스(Saccharomyces)로부터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 암 항원인 것을 특징으로 하는 조성물.
  70. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 병원체로부터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  71. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 생체반응 조절인자를 추가로 포함하는 조성물.
  72. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 화학요법제를 추가로 포함하는 조성물.
  73. 다음 면역요법 조성물을 포함하는 키트:
    a) 적어도 하나의 공동자극성 분자를 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및
    b) 적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물.
  74. 제73항에 있어서,
    상기 재조합 백시니아 바이러스는 공동자극성 분자 B7-1, ICAM-1 및 LFA-3를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  75. 다음 면역요법 조성물을 포함하는 키트:
    a) i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스; 및
    ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스
    를 포함하는 제1 면역요법 조성물; 및
    b) 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 포함하는 효모 베히클을 포함하는 제2 면역요법 조성물.
  76. 제75항에 있어서,
    i) B7-1, ICAM-1 및 LFA-1 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 암 항원 또는 그의 면역원성 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스; 및
    ii) GM-CSF 또는 그의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 파울폭스 바이러스
    를 포함하는 제3 면역요법 조성물을 추가로 포함하는 키트.
  77. 제73항 또는 제76항에 있어서,
    상기 항원은 암 항원인 것을 특징으로 하는 키트.
  78. 제73항 또는 제76항에 있어서,
    상기 항원은 CAP-1-6D 에피토프를 포함하는 변형된 CEA인 것을 특징으로 하는 키트.
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