HU211925A9 - Composition for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells - Google Patents

Composition for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells Download PDF

Info

Publication number
HU211925A9
HU211925A9 HU95P/P00694P HU9500694P HU211925A9 HU 211925 A9 HU211925 A9 HU 211925A9 HU 9500694 P HU9500694 P HU 9500694P HU 211925 A9 HU211925 A9 HU 211925A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
conjugate
adenovirus
virus
nucleic acid
Prior art date
Application number
HU95P/P00694P
Other languages
English (en)
Inventor
Bernd Oberhauser
Matthew Cotten
Kurt Zatloukal
Christian Plank
David Curiel
Ernst Wagner
Max L Birnstiel
Walter G M Schmidt
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Univ North Carolina
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Int, Univ North Carolina filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of HU211925A9 publication Critical patent/HU211925A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10261—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32761—Methods of inactivation or attenuation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

A találmány a DNS technológia területére vonatkozik. Pontosabban, a találmány nukleinsavaknak magasabb rendű eukarióta sejtekbe való bevitelére szolgáló új készítményekre vonatkozik.
Különösen a génterápiában szükség van egy hatékony rendszerre nukleinsavnak az élő sejtekbe történő bevezetésére. A géneket bejuttatják a sejtekbe annak érdekében, hogy terápiásán hatásos géntermékek in vivő szintézisét érjék el, például egy genetikai hiba esetében helyettesítsék a hibás gént. A „klasszikus” génterápia azon az elven nyugszik, hogy egy egyszeri kezelés által tartós gyógyulást érjenek el. Emellett fennáll az igény olyan kezelési módszerek iránt is, amelyeknél a terápiásán hatásos DNS-t (vagy akár mRNS-t), mint egy gyógyszert („génterapeutíkum”), igény szerint egyszer vagy ismételten adják be. Olyan genetikai eredetű megbetegedésekre, amelyeknél a génterápia ígéretes megközelítést képvisel, példa a hemofília. bétatalasszémia és a súlyos összetett immunhiány (Severe Combined Immuné Deficiency = SCID), egy szindróma, amelyet az adenozindezamináz enzim genetikai eredetű hiánya okoz. Alkalmazási lehetőségeket jelent továbbá az immunszabályozás, ahol egy szekretált antigén-fehérjét vagy egy nem-szekretált antigén-fehérjét kódoló, működőképes nukleinsav oltással történő beadása révén, humorális vagy intracelluláris immunitást émek el. További példák a genetikai hibákra, amelyeknél a kódoló nukleinsav a hibás gén helyett például egyéni igény által meghatározott formában beadható, az izom-disztrófia (Dystrophin gén), cisztikus fibrózis (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gén), hiperkoleszterinémia (LDLreceptor gén). A génterápiás kezelési módoknak továbbá akkor lehet jelentőségük, amikor hormonokat, növekedési Faktorokat vagy citotoxikus vagy immunszabályozó hatással rendelkező fehérjéket kell szintetizálni az élőlényben.
A génterápia a rák kezelésére is ígéretesnek tűnik úgynevezett „rákvakcinák” beadásával. A daganatsejtek immunogenitásának növelése céljából megváltoztatják azokat vagy erősebben antigén jellegűvé téve, vagy bizonyos citokinek termelésére ösztönözve őket annak érdekében, hogy immunválaszt váltsanak ki. Ezt úgy valósítják meg. hogy a sejteket olyan DNS-sel transzformálják, amely egy citokint, például IL-2-t, IL-4-et, IFN-gammát, TNF-alfát kódol. Eddig az autológ daganatsejtekbe retrovirális vektorok segítségével végezték el a géntranszfert.
A génterápia keretein belül, a nukleinsavak felhasználásában eddig legelőrehaladottabb technológiák retrovirális rendszereket használnak géneknek a sejtekbe történő bevitelére [Wilson J. M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 439—443 (1990); Kasid A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,473+177 (1990)]. Aretrovírusok felhasználása azonban problematikus, mivel ezek, legalábbis egy csekély százalékban, olyan mellékhatások veszélyét hordozzák magukban, mint a vírusfertőzés (endogén vírusokkal való rekombinálódás, vagy helper vírusokkal való szennyeződés és ezt követő, patogén formává való lehetséges mutáció révén) vagy rák kialakulása. Ezen kívül nem minden esetben kívánatos a beteg szomatikus sejtjeinek stabil transzformációja, mint ahogyan azt retrovírusok segítségével elérik, mivel ezáltal, például mellékhatások fellépése esetén, a kezelés csak nagy nehézségek árán fordítható vissza. Ezen kívül a terápiának ennél a formájánál nehéz elegendően magas titert elérni ahhoz, hogy elegendő sejtet fertőzzünk.
A nukleinsavak, mint terápiásán hatásos anyagok szintén alkalmazásra kerülnek meghatározott sejtfunkciók gátlásában, például antiszenz RNS-ek és DNS-ek meghatározott génszekvenciák szelektív gátlásában hatásosnak bizonyultak. Hatásmódjuk lehetővé teszi terapeutikumként való alkalmazásukat meghatározott gének (mint szabályozatlan onkogének vagy virális gének) kifejeződésének in vivő blokkolására. Bemutatták már, hogy rövid antiszenz oligonukleotidok bejuttathatok a sejtekbe, és ott kifejthetik gátló hatásukat [Zamecnik P. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4143-4146 (1986)] még akkor is, ha sejten belüli koncentrációjuk csekély a nukleinsavak erős negatív töltése miatt a sejtmembránon keresztüli korlátozott átjutásuk következtében. Egy további adalék a gének szelektív gátlásához a ribozimok alkalmazása. Itt is fennáll az igény az aktív ribozimok egy lehetőség szerinti magas koncentrációjának biztosítására a sejtben, amelynek egyik limitáló tényezője a sejtbe történő bevitel.
A génterápiának intracelluláris immunitás elérése céljából történő alkalmazása magában foglalja olyan gének transzdukcióját, amelyek vírusokkal szemben védő hatással rendelkeznek (úgynevezett protektív gének), például olyan gének transzdomináns mutációit, amelyek vírusfehérjéket kódolnak, vagy úgynevezett „RNS decoy’-okat kódoló DNS molekulákat. Következésképp szükség van olyan módszerekre, amelyek lehetővé teszik a DNS bejutását és kifejeződését a sejtben.
Az emlősök sejtjeinek in vitro géntranszformációjára különböző technikák ismeretesek, amelyeknek in vivő használhatósága mégis korlátozott (ide tartozik a DNS bevitele liposzómák, elektroporáció, mikroinjektálás, sejtfúzió, DEAE-dextrán vagy a kalcium-foszfát precipitációs eljárás segítségével).
A legutóbbi időben rekombináns vírus vektorokat fejlesztettek ki gének átvitelének megvalósítására, kihasználva víruseredőjük hatásos belépési mechanizmusát. Ezt a stratégiát alkalmazták rekombináns retrovírusos és adenovírusos vektorok összeállításánál, hogy nagy hatásfokú in vitro és in vivő géntranszfert érjenek el [Berkner K. L., BioTechniques 6, 616-629 (1988)]. Minden hatásosságuk mellett e vektorok, figyelembe véve a szállítandó DNS nagyságát és szerkezetét, korlátoknak vannak alárendelve. Ezenkívül ezek az anyagok az eredeti vírus életképes virális génelemeinek kotranszferei miatt, biztonsági kockázatokat hordoznak.
Ezeknek a korlátoknak a kiküszöbölésére alternatív stratégiákat fejlesztettek ki a géntranszfer számára azon mechanizmusok alapján, amelyeket a sejt makromolekulák transzportjához igénybe vesz. Egy példa erre gének bevitele a sejtbe a leghatékonyabb úton,
HU 211 925 A9 receptor-közvetítette endocitózissal [Wu G. Y. és Wu C. H., J. Bioi. Chem. 262, 4429-4432 (1987); Wagner
E.; et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414 (1990) és EP-A1 0 388 758 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés, amelyre itt hivatkozunk]. Ez a megközelítés bifunkciós molekuláris konjugátumokat vesz igénybe, amelyek egy DNS kötő doménnel és egy sejtfelszíni receptorra specifikus doménnel rendelkeznek [Wu G. Y. és Wu C. H., J. Bioi. Chem. 262,4429-4432 (1987); Wagner E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414 (1990)]. Ha az ismertetőjelet magán viselő domént a sejtfelszíni receptor felismeri, a konjugátum a receptor-közvetítette endocitózis útján intemalizálődik, amelynek következtében a konjugátumhoz kapcsolt DNS is átkerül. Ennek a módszernek az alkalmazásával részleges géntranszfereket tudtak elérni, amelyek legalább olyan jók voltak, mint amelyeket a hagyományos módszerekkel értek el [Zenke M„ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3655-3659 (1990)]. Továbbá kimutatták, hogy egy nukleinsav aktivitását, például egy ribozim gátló hatását nem gyengíti a transzport-rendszer.
A WO 91/17773 közzétételi számú nemzetközi bejelentés T-sejtekre nézve specifikus aktivitású nukleinsavak transzportjának rendszerére vonatkozik. Ez a rendszer felhasználja a T-sejt-eredővonal sejtfelületi fehérjéit, például CD4-et, a HÍV által használt receptort. A bejuttatandó nukleinsavat egy fehéije-polikation-konjugátummal komplexbe visszük, amelynek a fehéije része, azaz az ismertető jelet magán viselő dómén egy olyan fehérje, amely rendelkezik a T-sejt felületi fehérjéjéhez, például CD4-hez való kötődés képességével, és olyan sejteket, amelyek ezt a sejtfelületi fehérjét kifejezik, a kapott fehérjepolikation/ /nukleinsav-komplexekkel érintkezésbe hozzuk. Bebizonyítottuk, hogy ennek a rendszemek a segítségével sejtbe bevitt DNS kifejeződik.
Mindkét találmánynak közös jellemzője, hogy a nukleinsav sejtbe történő bevitelének lehetővé tételére vagy megkönnyítésére specifikus sejtfunkciókat használ fel. A felvételi mechanizmus mindkét esetben ismertető jelet magukon viselő domének részvételével megy végbe, amelyeket a jelen találmányban „internalizáló Faktorok” elnevezéssel jelölünk. Ez a kifejezés olyan ligandumokat jelöl, amelyek szúkebb vagy tágabb értelemben sejttípus-specifikusak, adott esetben további Faktorokkal együtthatva (például sejtfelületi fehérjékkel) a sejt felületéhez kötődnek és internalizálódnak. (A fent említett két találmány esetében az internál izáló Faktor transzferrin, illetve egy, a T-sejt egy felületi antigénjéhez kötődő fehérje, például egy antiCD4-antitest.) Az intemalizáló Faktort egy olyan polikation karakterű anyaggal konjugáljuk, amely nukleinsavak iránti affinitása alapján az intemalizáló Faktor és a nukleinsav között erős kapcsolatot hoz létre. (Ilyen típusú anyagokat a következőkben „nukleinsav-affin anyagok” vagy a DNS-sel való összefüggésre utalva „DNS-kötő domének” elnevezésekkel illetjük. Amennyiben egy ilyen anyag, mint a konjugátum része a nukleinsav és egy intemalizáló Faktor között kötést létesít, a következőkben „kötőFaktor”-ként jelöljük.)
E két találmány vonatkozásában akkor értek el optimumot a nukleinsavak sejtekbe történő felvételénél, ha a konjugátummukleinsav arányt úgy választották meg, hogy az intemalizáló Faktor-polikation/nukleinsav-komplexek közelítőleg elektroneutrálisak voltak. Ebből a megfigyelésből kiindulva javítottuk azokat a módszereket, amelyek nukleinsavak magasabb rendű eukarióta sejtekbe történő bevitelére intemalizáló Faktor/kötőFaktor/nukleinsav komplexeket használnak fel.
Wagner és munkatársai [Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259 (1991)] leírtak egy módszert, amelynek a segítségével javítható azoknak a rendszereknek a hatékonysága, amelyeknél a nukleinsavak felvétele intemalizáló Faktorok segítségével történik. E módszer szerint a sejtbe felvett nukleinsav mennyisége nem csökken, ha a transzferrinpolikationkonjugátumok egy részét nem-kovalensen kötött, „szabad” polikationnal helyettesítjük, sőt, bizonyos esetekben a DNS felvétel jelentős emelkedését érhetjük el. A transzferrin-polikationplazmid-DNS komplexek - amelyeket optimálisnak talált DNS/konjugátum arány szerint állítottunk elő - molekuláris állapotára vonatkozó vizsgálatok azt mutatták, hogy a plazmid-DNS a konjugátum jelenlétében körülbelül 80-100 nm átmérőjű, toroidális szerkezetekbe (fánkhoz hasonló) sűrítve található.
A T-sejtekhez kötődő fehérjékkel, mint internalizáló Faktorokkal végzett kísérletek hasonló eredményekre vezettek.
„Szabad” nukleinsav-affin anyag hozzáadása akkor is a beviteli rendszer hatékonyságának növelését eredményezi, ha más kötőFaktorokat alkalmazunk.
A Wagner és munkatársai [Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259 (1991)] által leírt komplexek, amelyeket intemalizáló Faktor közvetítette endocitózison keresztül felvesznek magasabb rendű eukarióta sejtek, olyan nukleinsavat tartalmaznak, amely egy intemalizáló Faktor-kötőFaktorkonjugátummal van komplexben. A komplexek kiegészítésként egy vagy több nukleinsav-affin anyagot tartalmaznak - amelyek adott esetben azonosak a kötő Faktorral - nem-kovalens kötésben oly módon, hogy a konjugátum révén elért internalizáció és/vagy a nukleinsav kifejeződés növekszik, amely első közelítésben egy kondenzáló hatásra, lehetséges azonban, hogy más mechanizmusra vezethető vissza.
Noha evvel a módszemel növelhetnénk a bevitt nukleinsav kifejeződés arányait, ez még korlátokba ütközik. Ennek a rendszernek a használhatóságát egy adott összefüggésben nem kizárólag a mindenkori, a rendszer számára meghatározó sejtfelszíni receptorok határozzák meg; azok a korlátok, amelyek ennek a rendszernek a használhatóságát meghiúsítják, valószínűleg abból következnek, hogy az endoszómákba intemalizált konjugátum-DNS-komplexek átjutnak a lizoszőmákba, ahol enzimesen lebomlanak. A sejtmagba bejutó és ott rendeltetésének megfelelően kifejeződő nukleinsavak arányának megnövelésére irányuló kísérletekben - amelyek megelőzték a jelen
HU 211 925 A9 találmányt - megpróbálták a sejtek transzfekcióját olyan anyagok jelenlétében véghez vinni, amelyek gátolják a lizoszómákban az enzimaktivitást, úgynevezett lizoszómatróp anyagok. Ennek az intézkedésnek a segítségével a bevitt DNS-nek egy megnövelt kifejeződését tudták elérni; az elért reakciók azonban az alkalmazott anyagoktól függően meglehetősen különböztek egymástól - a kiválasztott lizoszómatróp anyagok egy része a géntranszfer megerősítését eredményezte, míg mások ezt még gátolták is. Ily módon állapították meg például, hogy a DNS hatásos bevitele a gyenge bázis klorokin jelenlététől függ [Zenke M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659 (1990); Cotten M. et al„ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033-4037 (1990)]. Ezt a klorokin által elért hatást azonban nem szabad, illetve nem kizárólag, arra visszavezetni, hogy a klorokin megemeli a lizoszómákban a pH értékét; különböző kísérletek során megállapítást nyert, hogy más anyagok, amelyek a klorokinhez hasonlóan a pH módosításának képességével rendelkeznek, mint monenzin, ammónium-klorid vagy metil-amin, nem tudják a klorokint helyettesíteni, a különböző kísérletekben ezeknek az anyagoknak némelyike még gátló hatást is mutatott. Továbbá megállapítást nyert, hogy a különböző célsejtek ugyanarra a lizoszómatróp hatású anyagra különbözőképpen reagálnak.
Mivel a fiziológiai úton történő géntranszfer, mint azt a receptor közvetítette endocitózis nukleinsav komplexek alkalmazásával mutatja, nagy előnyökkel rendelkezik (a sejtmembránon való átlépés nem-toxikus mechanizmussal; biológiailag aktív nukleinsavak, mint gének, géndarabok vagy sejtfunkciókat specifikusan gátló nukleinsavak ismételt vagy folyamatos beadásának lehetősége; a sejtspecifikus célba juttatás lehetősége; a konjugátumok nagy mennyiségben történő előállíthatósága), szükség van e rendszernek hatásosabbá tételére.
Az ábrák leírása
1. ábra: Adenovírus fertőzés hatása a transzferrin polilizin-konjugátumokkal történő géntranszferre
2. ábra; Konjugátum-DNS komplex dózishatás
3. ábra: A transzferrin-polilizin közvetítette géntranszfer felerősítése adenovírusokkal történik receptorközvetítette endocitózissal
A) hatás a komplexben levő DNS-re
B) hatás a receptorhoz kötött DNS-re
C) hatás a transzferrin-polilizin-konjugátumokkal történő géntranszferre
4. ábra; Adenovírus fertőzés hatása a transzferrin polilizin-konjugátumokkal történő géntranszferre kiválasztott sejtvonalakban
5. ábra: Annak vizsgálata, vajon a génkifejeződés felerősödése a géntranszport vagy a transzaktiválódás működésében rejlik A) K562 sejtvonal
Β) K562 10/6 sejtvonal, amely szerkezetéből adódóan kifejezi a luciferázl
6. ábra: Tetra-galaktózpeptid-polilizin-konjugátum
7. ábra: Hep G2-sejtek transzfekciója adenovírus jelenlétében
8. ábra: Hep G2-sejtek transzfekciója adenovírus jelenlétében
9. ábra: TIB73-sejtek transzfekciója
A) összehasonlító értékek klorokinnal
B) adenovírus jelenlétében
10. ábra: T-sejtek transzfekciója adenovírus jelenlétében:
A) H9-sejtek
B) primer limfociták
11. ábra: Adenovírusok UV-inaktiválása:
A) a géntranszfer hatás felerősítése
HeLa-sejtekben UV-inaktivált vírusokkal
B) az UV-inaktiválás összevetése a géntranszferhatással
12. ábra: Adenovírusok inaktiválása formaldehiddel
13. ábra: NIH3T3-sejtek transzfekciója Moloney vírus jelenlétében
14. ábra: Annak vizsgálata, vajon a NIH3T3-sejtek transzferrin-polilizin-DNS komplexekkel történő transzfekciójánál a géntranszfer-hatás a Moloney vírusra vezethető-e vissza
15. ábra: A transzferrin és receptora közötti kölcsönhatások szerepet játszanak a Moloney vírus géntranszferhatásában
16. ábra: A pH érték befolyása retrovírusok géntranszferhatására
17. ábra: Influenza-hemagglutinin-peptid; liposzóma felszakítás meghatározása (Liposome Leakage Assay)
18. ábra: K562-sejtek transzfekciója influenzapeptidpolilizi n-konj ugátum, p 16pL jelenlétében
19. ábra: HeLa-sejtek transzfekciója influenzapeptidpolilizi n-konj ugátum, p 16pL jelenlétében
20. ábra: HeLa-sejtek transzfekciója transzferrinpolilizinkonjugátumokkal influenzapeptidpolilizi n-konj ugátum, p41 pL jelenlétében
21. ábra: (β-galaktozidáz kifejeződésének in situ kimutatása HeLa sejtek adenovírus jelenlétében történő transzfekcióját követően
22. ábra: Sejtek transzfekciója egy 48 kb kozmiddal adenovírus jelenlétében
A) HeLa-sejtek
B) Neuroblasztóma sejtek
23. ábra: Adenovírus-polilizin konjugátumok előállítása kémiai kapcsolással
24. ábra: K562-sejtek transzfekciója kémiailag kapcsolt adenovírus-konjugátumokkal
25. ábra: HeLa-sejtek transzfekciója kémiailag kapcsolt adenovírus-konjugátumokkal
26. ábra: Polilizin adenovírushoz kötése transzglutaminázzal
27. ábra: Egér hepatociták transzfekciója transzglutaminázzal kapcsolt adenovírus-konjugátumokkal
28. ábra: A transzglutaminázzal kapcsolt adenovíruskonjugátumokkal végzett transzfekció hatékonyságának felerősítése
HU 211 925 A9
29. ábra: HeLa-sejtek transzfekciója biotin-sztreptavidinnel kapcsolt adenovírus-konjugátumokkal
30. ábra: K562-sejtek transzfekciója biotin-sztreptavidinnel kapcsolt adenovírus-konjugátumokkal
31. ábra: Neuroblasztóma sejtek transzfekciója egy kb kozmiddal biotin-sztreptavidinnel kapcsolt adenovírus-konjugátumok segítségével
32. ábra: Hepatociták transzfekciója klorokin vagy adenovírus jelenlétében
33. ábra: K562-sejtek transzfekciója különböző endoszómalitikus anyagok jelenlétében
34. ábra: A β-galaktozidáz riportergénnel celluláris síkon folyó transzfekció összevetése különböző endoszómalitikus anyagok jelenlétében
35. ábra: Hosszantartó luciferáz kifejeződés összefüggő réteget alkotó, nem szaporodó hepatocitákban
36. ábra: Kifejeződés HeLa-sejtekben, amelyeknek a transzfekciója szabad és biotin-sztreptavidinnel polilizinhez kötött CELO vírus jelenlétében történt
37. ábra: Mioblasztok és miotubok transzfekciója
DNS/transzferrin-polilizin komplexekkel szabad és biotin-sztreptavidinnel polilizinhez kötött adenovírus jelenlétében
38. ábra: DNS bevitele egér primer mioblaszt- és miotubkultúrákba
39. ábra: dl312 adenovírus és CELO vírus összehasonlító elemzése HeLa-sejtek és C2C12 mioblasztok transzfekciójában
40. ábra: A CELO vírussal végzett mioblaszt transzfekció javítása egy lektin-ligandum alkalmazásával
41. ábra: VIII.. Faktor cDNS kifejeződése C2C12 mioblaszt- és miotub-kultúrákban
42. ábra: DNS-transzport felerősítése adenovírusfehétjékkel:
A) HeLa-sejtek
B) fibroblasztok
43. ábra: Galaktóz-influenzapeptid-konjugátumok a hepatocitákba történő DNS-transzporthoz
44. ábra: Galaktóz-adenovírus-konjugátumok a hepatocitákba történő DNS-transzporthoz
45. ábra: DNS-transzfer transzferrin-polilizinnel rhinovírus jelenlétében:
A) szabad rhinovírus
B) konjugált rhinovírus
46. ábra: Primer humán melanómasejtek transzfekciója adenovírus-konjugátumokat tartalmazó kombinációs komplexekkel
47. ábra: Amfipátiás peptidek liposzőma áteresztőképességének meghatározása (Liposome Leakage Assay)
48. ábra: Amfipátiás peptidek eritrocita áteresztőképességének meghatározása (Erithrocyte Leakage Assay)
49. ábra: BNL CL.2 sejtek transzfekciója amfipátiás peptidek jelenlétében
50. ábra: NIH3T3-sejtek transzfekciója amfipátiás peptidek jelenlétében
51. ábra: IFN-a kifejeződése különböző endoszómalitikus anyagok jelenlétében transzfekciónak alávetett HeLa-sejtekben
A jelen találmány célja nukleinsavak magasabb rendű eukarióta sejtekbe történő bevitelének megjavítása. (A „bevitel” illetve „transzfer” kifejezésekbe a jelen találmány keretei között beleértjük a nukleinsavkomplexnek a sejtmembránon keresztül történő sejtbe való belépésén kívül, a komplex illetve az abból szabaddá váló nukleinsav sejten belüli lokalizációját egy, a kifejeződésüknek megfelelő hely eléréséig.) A magasabb rendű eukarióta sejtek jólismertek, az élesztők nem tartoznak ide [Watson J. D. et al., Molecular Biology of the Gene, Benjamin/Cummings Publ. Company Inc., 676-677 (1987)]. A vírusok nagy része az eukarióta gazdasejtbe történő behatoláshoz felhasználja azokat a mechanizmusokat, amelyek a receptor-közvetítette endocitózis elvének felelnek meg. E mechanizmus alapján egy vírusfertőzés általában a víruspartikuláknak a sejtmembrán receptoraihoz való kötődésével kezdődik. Ezután következik a vírus internalizációja a sejtbe. Ez az internalizációs folyamat egy sajátságos utat követ, fiziológiás ligandumok vagy makromolekulák sejtbe való belépésének megfelelően: mindenekelőtt a receptorok a sejt felszínén csoportokba rendeződnek, a membrán betüremkedik és egy Clathrin-burokkal körülvett vezikulumot képez. Miután ez a vezikulum a Clathrin-burkától megszabadult, a belsejében egy, a membránban elhelyezkedő proton-pumpa segítségével kiváltott savasodás indul meg. Ez előidézi a vírus szabaddá válását az endoszómából. Attól függően, hogy a vírus rendelkezik-e lipidburokkal vagy sem, a vírus endoszómából történő szabaddá válásának két módját vették figyelembe: az úgynevezett „meztelen” vírusok esetében (például adenovírus, poliovírus, rhinovírus) azt feltételezték, hogy az alacsony pH érték konformáció változásokat okoz a vírusfehérjében. Ennek következtében hidrofób domének válnak szabaddá, amelyek fiziológiás pH értéknél nem hozzáférhetőek. Ezáltal ezek a domének megszerzik az endoszóma membránnal való kölcsönhatásba lépés, és evvel a vírusgenomnak az endoszómából a citoplazmába történő kiszabadítása képességét. A burokkal rendelkező vírusokról (például vesicular stomatitis vírus, semliki forest vírus, influenza vírus) azt tartják, hogy az alacsony pH érték néhány vírusfehérjének a szerkezetét vagy a konformációját módosítja, ezáltal elősegítve a vírusmembrán és az endoszóma-membrán fúzióját. Azok a vírusok, amelyek ezen mechanizmus segítségével hatolnak be a sejtbe, meghatározott molekuláris különlegességekkel rendelkeznek, amely lehetővé teszi számukra az endoszóma membrán felszakítását ahhoz, hogy beléphessenek a citoplazmába.
Más vírusoknak, például a burokkal rendelkező Sendai, HIV és néhány Moloney leukémia vírus törzsnek vagy a burokkal nem rendelkező SV40 és Polyo5
HU 211 925 A9 mavírusoknak nincs szükségük alacsony pH értékre a sejtbe történő behatoláshoz, közvetlen a sejtfelszínen elő tudnak idézni a membránnal egy fúziót (Sendai vírus, esetleg HÍV), vagy pedig olyan mechanizmust képesek kifejteni, hogy felszakítsák a sejtmembránt vagy átjussanak rajta. Azt feltételezik, hogy a pH értéktől független vírusok is igénybe tudják venni az endocitózis útját [Mc Clure Μ. O. et al., J. General Virol. 71, 767-773 (1990)].
A találmány szerinti probléma megoldásánál abból a meggondolásból indultunk ki, hogy bizonyos vírusoknak az eukarióta sejtekbe történő behatolásnál alkalmazott mechanizmusát felhasználjuk nukleinsav komplexek sejtbe történő bevitelének javítására és ezáltal a kifejeződés növelésére.
Már megpróbáltak fehérjéket vírusokkal együtt a sejtbe internalizálni [Otero M. J. és Carrasco L., Virology 160, 75-80 (1987)]. Megállapították, hogy a makromolekulák bejuttatásánál a vírusnak a sejtet permeábilizáló hatását használják ki. Az itt lejátszódó folyamatoknál folyadékfázis mechanizmusokról lehet szó.
A hám eredetű növekedési Faktor (Epidermal Growth Faktor, EGF) segítségével konjugált toxinról megállapították, hogy ez a természetes ligandum, amely a receptorához való kötődés után endocitózissal bekerül a sejtbe az adenovírussal együtt, amelyet a sejt szintén receptor közvetítette endocitózissal vesz fel, ugyanabba az endoszómába kerül és abból, szintén a vírussal együtt szabadul ki a citoszolba [Fitzgerald D. et al.. Cell 32, 607-617 (1983)].
Meglepő módon azt találták, hogy bizonyos ágensek (például vírusok, víruskomponensek vagy más hatóanyagok) - amelyek az eukarióta sejtekbe történő belépési mechanizmusuk tekintetében meghatározott vírusok sajátságaival rendelkeznek - jelenléte egy komplex részeként, a sejtbe bevitt nukleinsav kifejeződésének mértékében jelentős emelkedést okoz. Ez a tapasztalat mindenekelőtt azért volt meglepő, mert a sejtek által felvett nukleinsav-komplexek nagyon nagy méretűek.
A jelen találmány tárgyát képezi tehát egy készítmény magasabb rendű eukarióta sejteknek nukleinsavból és nukleinsav-affin anyagból álló komplexszel történő transzfekciójához, ahol a nukleinsav-affin anyag szabadon kapcsolódik egy intemalizáló Faktorral. A készítmény azzal jellemezhető, hogy olyan anyagot tartalmaz, amely per se vagy mint a nukleinsav-komplex alkotórésze rendelkezik a transzfekcióra kiszemelt sejtbe való felvétel és az endoszómák tartalmának amelyben a komplex a sejtbe lépés után lokalizálva van - a citoplazmába történő kiengedése képességével.
Ezt az anyagot a következőkben „endoszóma-litikus anyag” névvel jelöljük.
Az endoszóma-litikus anyagok azon képességét, hogy a transzfekcióra kiszemelt sejtbe bekerüljenek és az endoszómák tartalmát - amelyekben a sejtbe lépés után lokalizálva vannak - a citoplazmába kiengedjék, a továbbiakban „felvételi funkció”-nak nevezzük. Ez a felvételi funkció az aktív, receptor-függő endocitózis mechanizmusok révén vagy a passzív, folyadék-fázison keresztüli, vagy a nukleinsav-komplexek alkotórészeként a sejtbe történő intemalizálódás képességéből és az endoszómák felszakításának képességéből - amelyet általában endoszómalízis elnevezéssel jelölünk tevődik össze.
A találmány egy megvalósítási formájában az endoszómalítikus anyag egy vírus. Egy másik megvalósítási formájában az endoszóma-litikus anyag egy víruskomponens. A találmánynak ezekben a megvalósítási formáiban alkalmazott vírust illetve víruskomponenst a következőkben „szabad” vírus(komponens)-ként jelöljük.
A jelen találmány keretei között megvizsgáltuk növekvő mennyiségű szabad adenovírus hatását állandó mennyiségű transzferrinpolilizin-konjugátum géntranszferére HeLa-sejtekben, ahol riportergénként a luciferáz gént használtuk. A géntranszfer szabad adenovírus által okozott felerősödése sejtenként 1 x 104 vírusrészecske esetén ért el maximumot, amely a HeLa-sejtek adenovírus-receptorai hozzávetőleges számának felel meg. A luciferáz kifejeződés körülbelül 2000-szeres felerősödése szemben az egyedül transzferrin-polilizin-konjugátummal elért kifejeződéssel, megfelelt a nagyobb vírusmennyiségnek. Egy további kísérletsorozatban megvizsgáltuk korlátozott mennyiségű konjugátum-DNS komplexek kapacitását állandó szabad adenovírus mennyiség jelenlétében. Megállapítottuk, hogy az adenovírusok felvétele a sejtekbe a transzferrin-polilizin közvetítette géntranszfert a DNSadagolás széles tartományában felerősítette. A konjugátum-DNS komplexek révén elért génkifejeződés maximális erőssége megfelelt annak az erősségnek, amelyet 100-szor kevesebb DNS-sel értünk el adenovírusoknak a transzfekció hatásosságát felerősítő alkalmazásával.
Az adenovírus géntranszferre gyakorolt hatását megvizsgáltuk mind nem komplexben levő, mind polilizinnel vagy transzferrinpolilizin-konjugátummal komplexben levő DNS esetében (3A. ábra). Ezen analízis szerint adenovírus jelenléte a transzfekciónál a meztelen, nem komplexben levő DNS transzferét csak csekély mértékben erősítette. Ezzel ellentétben olyan DNS-ek transzferét, amelyek polilizinnel vagy transzferrin-polilizin-konjugátumokkal komplexben voltak, az adenovírus kiegészítés felerősítette. Ez a hatás azonban a transzferrin-polilizin-konjugátumok esetében lényegesen erősebben lépett föl. Mivel a polikation alkotórész a konjugátumban nem csak arra szolgál, hogy a DNS és a transzferrin között kötést hozzon létre, hanem a DNS szerkezetében nyilvánvaló szerkezeti változásokat is okoz [összesűrítés toroidális struktúrákba; Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 42554259 (1991)], ezek a kísérletek nem tudtak különbséget tenni, vajon a megfigyelt hatás a polikationon keresztül kondenzált DNS-nek a folyadék-fázisba történő felerősített transzportjára, vagy a receptorhoz kötött konjugátum-DNS komplex transzportjának a vírus által okozott fokozódására vezethető-e vissza. Ahhoz, hogy e két lehetőség között különbséget tegyünk, szekvenciális kötési próbákat végeztünk (3B. ábra). A transzferrin-polilizin-DNS vagy polilizin-DNS komplexek kö6
HU 211 925 A9 tése alacsonyabb hőmérsékleten intemalizálás nélkül lehetővé tette, hogy az adenovírussal való kezelés előtt a folyadék-fázisban fölöslegben levő komplexet eltávolítsuk [Fitzgerald D. et al., Cell 32, 607-617 (1983)]. Ha így jártunk el, a receptorhoz kötött transzferrin-polilizin-DNS komplexek transzportja adenovírus partikulák hozzáadásával jelentősen megnövekedett, amely a polilizin-DNS komplexek esetében nem érvényesült. Ezért tehát a DNS-nek receptor-közvetítette endocitózissal történő belépése a sejtbe az, amely specifikusan felerősödött.
A következőkben megvizsgáltuk, hogy az adenovírusnak melyik az a specifikus funkciója, amely a receptor-közvetítette gén-transzfert befolyásolja (3C. ábra). A virionok enyhe hővel való kezelése nem változtatja meg a célsejtek membránjához való kötődésük képességét, korlátozza azonban a sejtbe történő belépésük után az endoszómák felszakításának képességét [Defer C. et al., J. Virol. 64, 3661-3673 (1990)]. így tehát a vírus kötődésének és a vírus sejtbe való belépésének eltérő hatásait egymástól elválasztva tudtuk értékelni. Ennél az elemzésnél a hővel történő inaktiválás a vírusnak a receptor-közvetítette endocitózison keresztül lezajló, géntranszfert felerősítő képességét teljes mértékben megszüntette. Ebből az következik, hogy a transzferrin-polilizin-konjugátumok segítségével történő géntranszfer felerősítése az adenovírusnak specifikusan arra a képességére vezethető vissza, hogy felvételi funkciójának részeként képes az endoszómákat felszakítani. Az a tény, hogy egy replikációs mechanizmusában sérült vírustörzs képes volt a génkifejeződés növelésére, megerősíti azt a feltevést, hogy ez a jelenség nem a replikációs funkcióra, hanem a virion felvételi funkciójára vezethető vissza.
Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy a génkifejeződés felerősödése a bevitt gén vírus okozta esetleges transzaktiválására vezethető vissza, vizsgálatokat végeztünk egy olyan sejtvonallal, amely az RSV-LTR-luciferáz gént szerkezetéből adódóan (konstitutíve) kifejezi: az adenovírusok ebben a sejtvonalban semmilyen hatást nem mutattak, miközben a szülői sejtvonalban, amelybe a gént transzferrin-polilizin-konjugátumokkal vittük be, a génkifejeződés egyértelmű felerősödését idézték elő. Ez a tapasztalat világossá teszi, hogy az adenovírus azokat a folyamatokat befolyásolja, amelyek a transzkripció előtt zajlanak le, hogy a génbevitelre gyakorolt felerősítő hatása tehát a génbejuttatás és nem a génkifejeződés terén érvényesül (5. ábra).
A jelen találmány keretei között továbbá megvizsgáltuk, hogy a szabad adenovírus milyen kihatással van a transzferrinpolilizin-konjugátumok segítségével történő géntranszferre kiválasztott sejtvonalakban. Megállapítottuk, hogy a célsejteken szükséges a transzferrin-receptorok jelenléte, de nem minden esetben elégséges a transzferrin-polilizin-konjugátumok segítségével történő géntranszfer lehetővé tételéhez. Úgy tűnik, hogy olyan sejtspecifikus Faktorok, amelyek az endoszómákba internalizált konjugátum-DNS komplexek sorsával összefüggésben vannak, az ezen az úton végzett géntranszfer elérhető mértékében igen lényeges, meghatározó szerepet játszanak. Erre való tekintettel néhány kiválasztott sejtvonalat mind a transzferrinpolilizin-konjugátumok segítségével végzett géntranszferre, mind az adenovírusok által felerősített géntranszferre megvizsgáltunk (4. ábra). Egy cisztikus fíbrózis sejtvonal sejtjei (CFT1) közepes luciferáz-génkifejeződést mutattak transzferrin-polilizin-DNS komplexekkel való kezelés után. A génkifejeződés mértéke Ő1312 adenovírussal történt kezelés után jelentősen megnőtt. Egyértelmű ellentétben ezzel KBsejtek, amelyeket transzferrinpolilizin-DNS komplexekkel kezeltünk, a transzferrin receptorok megléte ellenére olyan luciferáz-gén kifejeződést mutattak, amely alig haladta meg a háttérszintet. Adl312 adenovírussal való kezelés azonban ezeknél a sejteknél egyértelműen kimutatható luciferáz aktivitást eredményezett. Hasonlóan hatott az adenovírusokkal való kezelés HeLa-sejtekre, ez a hatás ezeknél a sejteknél azonban még erősebb volt. Mivel a HeLa- és KB-sejtek körülbelül ugyanannyi adenovírus-receptorral rendelkeznek, a géntranszfer felerősítésében mutatkozó eltérés tükrözheti a transzferrin-receptorok számát, amely egy sejttípusra nézve jellemző érték. Ezektől az eredményektől azonban egyértelműen eltérően a WI-38 és MRC-5 sejtvonalak, amelyekről ismert, hogy adenovírussal való fertőzhetőségük gyenge [Precious B. és Russell W. C., Virology, ed. Mahy, B. W. J., IRL Press, Oxford, Washington, DC, 193-205 (1985)], a konjugátum-DNS komplexekkel egyedül elért génkifejeződésnek csak egy nagyon gyenge felerősödése érhető el dl312 adenovírussal. A szabad vírussal, például adenovírussal történő kezelés a konjugátum-DNS komplexek segítségével történő géntranszfert tehát azokban az esetekben erősítheti fel, amelyekben a géntranszfer receptor-közvetítette endocitózissal lehetséges, mint a CFTI-sejtek esetében, valamint egyes olyan esetekben, amelyekben a géntranszfer ezen az úton nem megy hatásosan, mint HeLa- és KB-sejteknél. Az, hogy a felerősítés mértéke különböző célsejteknél egyértelműen különbözik azt valószínűsíti, hogy ez a hatás mind egy bizonyos sejttípus vírusreceptorainak, például adenovírus-receptorainak számában, mind transzferrin-receptorainak számában rejlik.
Szabad vírus alkalmazása esetén a nukleinsav-affin anyag előnyösen egy szerves polikation, amely előnyösen egy intemalizáló Faktorral van konjugálva. A jelen találmány keretei között azonban megállapítottuk, hogy bizonyos körülmények között az olyan DNS, amely csak nukleinsav-affin anyaggal van komplexben, azaz intemalizáló Faktor nélkül, szabad vírus jelenlétében bevihető a sejtbe. Továbbá azt találtuk, hogy néhány sejtvonalnál a komplexek - amelyek nukleinsavból és nukleinsav-affin anyagból állnak - felvétele a folyadékfázison keresztül történhet, amennyiben a komplexek koncentrációja megfelelően magas. Azok a kísérletek, amelyeket a jelen és a megelőző találmányok keretében végeztünk, azt mutatták, hogy a nukleinsav-komplexek felvételi képességének egy lényeges eleme azok kompakt mivolta, amely a nukleinsavnak a nukleinsav-affin anyag révén történő kondenzálására vezethető vissza. Ha a nukleinsav-affin
HU 211 925 A9 anyag azon képessége mellett, hogy a komplexek meszszemenő elektroneutralitását előidézze és a nukleinsavat egy kompakt struktúrába sűrítse, elegendő képességgel rendelkezik a sejtfelszínhez való kötődéshez, hogy a vírussal együtt a sejtbe behatoljon, lemondhatunk arról, hogy a felvételi kapacitást megnöveljük egy internalizáló Faktornak kovelensen a nukleinsav-affin anyaghoz történő kötése révén, a komplexnek receptor-közvetítette endocitózissal való sejtbe szállítására. Sok sejt relatív magas affinitást mutat meghatározott nukleinsav-afifin anyagra olyannyira, hogy a nukleinsavból és kötő Faktorból álló konjugátumokat felveszi a sejt anélkül, hogy egy internalizáló Faktor közreműködésére szükség lenne. Ez a helyzet például a hepatocitáknál, amelyekről a jelen találmány keretei között megállapítottuk, hogy azok DNSpolilizin komplexeket felvesznek.
A találmánynak egy előnyben részesített megvalósítási formájában az endoszóm-alitikus anyag egy vírus. amely a nukleinsav-affin anyaghoz kötődik és rendelkezik a konjugátum/ /nukleinsav komplex sejtbe történő behatolásának és az endoszómák tartalmának amelyekben a komplex a sejtbe történő belépés után lokalizálva van - a citoplazmába való kiengedése képességével.
Egy további előnyben részesített megvalósítási formában az endoszóma-litikus anyag egy víruskomponens, amely egy nukleinsav-affin anyaghoz kötődik és rendelkezik a konjugátum/ /nukleinsav komplex sejtbe történő behatolásának és az endoszómák tartalmának amelyekben a komplex a sejtbe történő belépés után lokalizálva van - a citoplazmába való kiengedése képességével.
Az olyan vírusokat vagy víruskomponenseket, amelyek egy nukleinsav-kötő doménhez kötődnek, a következőkben a kötés módjától függetlenül „virális konjugátumok elnevezéssel jelöljük.
A virális konjugátumok, amelyek szintén tárgyát képezik a jelen találmánynak, működőképes szerkezeteik szerves alkotórészeként tartalmazzák a vírust vagy a víruskomponenseket és egyesítik az internalizáló Faktor/konjugátumokon alapuló vektorrendszerek előnyeit a vírusok által a rendszerbe bevitt előnyökkel.
Ezenfelül a virális konjugátumok a találmánynak e megvalósítási formái szerint azzal az előnnyel rendelkeznek, hogy kiküszöbölik azt az alapvető korlátot, amely a receptor-közvetítette endocitózissal történő géntranszfer konjugátum-rendszerének velejárója azáltal. hogy egy olyan specifikus mechanizmussal rendelkeznek, amely lehetővé teszi szabaddá válásukat a sejtvezikulum rendszerből.
A virális konjugátumokat használó vektor rendszer egy alapvető koncepciózus eltávolodást tartalmaz a rekombináns vírusvektoroktól azáltal, hogy a szállítandó idegen DNS-t a virion a felszínén hordozza. Ennek következtében a találmány szerinti konjugátumok egészen nagy génszerkezeteket is be tudnak vinni a sejtbe, ahol a szekvenciára nézve semmiféle korlátozás nem áll fenn.
Alkalmasságát egy vírusnak - amely felhasználható. mint szabad vagy kötött vírus vagy mint víruskomponens egy vírus részeként, a jelen találmány keretei között - felvételi funkciója által definiáljuk. Az alkalmas vírusok egyrészt olyanok, amelyek rendelkeznek a sejteknek a nukleinsav-komplexszel történő transzfekciója alatt receptor-közvetítette endocitózissal a sejtbe való behatolás képességével, és kiszabadulásukat - és ezzel együtt a nukleinsav szabaddá tételét - az endoszómából a citoplazmába előidézik. Ilyenek az itt közzétett vírusok ugyanúgy, mint más olyan vírusok, amelyek az egyes sejt által felvehetők és előidézik az endoszómák tartalmának a citoplazmába történő kiengedését.
Vírusokra és magasabb rendű eukarióta sejtekre, amelyekbe ezek behatolni képesek Fields és Knipe írtak le példákat [Fields Β. N. és Knipe D. M., Virology 2nd edition, Raven Press Ltd., New York (1990)]. Egy adott sejtvonal fogékonysága a transzformációra egy vírus által - amely „szabad vírus” formájában egy konjugátum belépésének elősegítője - a célsejtnek vírus számára megfelelő felületi receptorai előfordulásától és számától függ. Módszereket sejtfelületi adenovírus-receptorok számának meghatározására HeLa- és KB-sejtekre Svensson és Defer [Svensson U„ J. Virol., 55, 442—449 (1985); Defer C. et al., J. Virol., 64, 3661-3673 (1990)] írtak le. Feltételezik, hogy az adenovírus-receptorok meglehetősen elterjedtek.
Az alkalmas vírusok magukban foglalják egyrészt azokat, amelyek rendelkeznek a sejteknek a nukleinsav-komplexszel történő transzfekciója alatt receptorközvetítette endocitózissal a sejtbe való behatolás képességével, és kiszabadulásukat - és ezzel együtt a nukleinsav szabaddá tételét - az endoszómából a citoplazmába előidézik. Anélkül, hogy ezt az elméletet rögzíteni akarnánk, ez a mechanizmus szabad vírusok alkalmazása esetén kedvező lehetne a sejtbe bejuttatott nukleinsav-komplexeknek, amennyiben ezek a komplexek a vírusokkal együtt az endoszómából a citoplazmába szállítódnak, feltételezve, hogy az internalizálás során ugyanabba az endoszómába jutnak, mint a vírusok. Ha a nukleinsav-komplexek a vírust kötött formában tartalmazzák, hasznot húznak a vírus endoszómalitikus aktivitásából és az endoszómákból a citoplazmába kerülnek. Ez megakadályozza az endoszómák és lizoszómák fúzióját, és ezáltal az ezekben a sejtalkotókban normális körülmények között végbemenő enzimes lebontás elkerülhető. Azokhoz a vírusokhoz amelyek a találmány szerinti készítménynek megfelelnek és amelyeknél a fertőzés kezdetekor receptor-közvetítette endocitózissal lezajló felvételi funkció végbemegy - tartoznak egyrészt a lipidburok nélküli vírusok, mint adenovírus, poliovírus, rhinovírus, másrészt a burokkal rendelkező vesicular stomatitis vírus, semliki forest vírus, influenza vírus; ezenkívül megfelelnek a Moloney vírus pH értéktől függő törzsei. A jelen találmány gyakorlatában alkalmazható, különösen előnyben részesített vírusok közé tartoznak az adenovírus C alcsoport, 5 típus, semliki forest vírus, vesicular stomatitis vírus, poliovírus. rhinovírusok és Moloney leukémia vírus törzsek.
Jelen találmány számára olyan RNS vírusok alkal8
HU 211 925 A9 mazása, amelyeknek nincs reverz transzkriptáz enzimjük, azzal az előnnyel jár, hogy a transzfekciót egy ilyen vírus jelenléte nem eredményezi vírus-DNS képződését a sejtben. A jelen találmány keretei között kimutattuk, hogy a rhinovírus HRV2 a picomavírus csoportnak egy képviselője, amely egy riportergén kifejeződését megnöveli. A rhinovírus teljesítő képességét mind szabad, mind víruskonjugátum formában megmutattuk.
A jelen találmány keretei között vírus fogalom alatt értjük - feltéve, hogy a sejtbe bekerülnek és az endoszómák tartalmát, amelyekbe bejutottak szabaddá teszik - a vad típusokon kívül a mutánsokat is, amelyek a vad típusoknak a felvételi funkciótól különböző működéseit, különösen a replikáció képességét, egyszeri vagy többszöri mutációval elvesztették.
Mutánsokat állítunk elő hagyományos mutagén eljárásokat alkalmazva azon vírusfehérje régiókban, amelyek a replikációs funkciókért felelősek és a bevonathatáron keresztül komplementálhatók. Ide tartoznak például az adenovírus esetében a ts-mutánsok (temperatursensitive - hőmérsékletre érzékeny), EIA- és ElB-mutánsok, az MLP-hajtó génekben mutációt szenvedett mutánsok [Berkner K. L., Bio Techniques 6, 616-629 (1988)] és a bizonyos kapszidfehérjék terén mutációval rendelkező mutánsok. Továbbá alkalmasak olyan vírustörzsek, amelyek megfelelő spontán mutációt szenvedtek. A vírusok replikációs képességét például az irodalomból ismert tarfolt-meghatározással (plaque-assay) vizsgálhatjuk, amelynél különböző víruskoncentrációjú szuszpenziókat rétegezünk sejtkultúrákra, és a lizált sejtek számát, amelyek a plakkok révén láthatóak, állapítjuk meg [Dulbecco R., Microbiology, 3. Edition, Ed. Davis, B. D. et al., Harper and Row, The Natúré of Viruses, 853-884 (1980)].
A jelen találmány keretei között történő felhasználásra alkalmasak ezenkívül úgynevezett hibás vírusok, amelyeknek az önálló vírusreplikációhoz szükséges funkcióhoz hiányzó egy, vagy több gén erejéig helper (segítő) vírusokra van szükségük. Ennek a csoportnak a képviselői Dl-partikulák („defective interfering particles”), amelyek fertőző standard vírusból származnak, a standard vírussal azonos szerkezeti fehérjékkel rendelkeznek, mutációt szenvedtek, és a standard vírusra, mint helper vírusra van szükségük replikációjükhöz [Huang A. S., The Molecular Basis of Viral Replication, ed. Bercoff, R. P, Plenum Press New York and London, The Role of Defective Interfering (Dl) Particles in Viral Infection, 191-194 (1987); Holland J. J., Virology, 2. Edition, Ed. Fields, Β. N„ Knipe, D. M. et al. Raven Press Ltd., New York, Defective Viral Genomes, 151-165 (1990)]. Ennek a csoportnak a képviselői ezenkívül a szatellita vírusok [Holland J. J., Virology 2nd edition, Raven Press Ltd., New York, Defective Viral Genomes, 151-165 (1990)]. Egy másik csoport a parvovírusok osztálya, amelyet adenoszatellitaként („adeno-associated vírus”) jellemeznek [Berns K. I., Virology, 2. Edition, Ed. Fields, Β. N., Knipe, D. M. et al. Raven Press Ltd., New York, 1743-1759 (1990)].
Mivel sok vírusnak még nem teljesen tisztázott a sejtbe történő felvételi ciklusa, feltételezzük, hogy vannak még más vírusok, amelyek endoszóma-litikus aktivitással rendelkeznek, amely szükséges alkalmasságukhoz a jelen találmányban történő felhasználásukra.
A jelen találmány keretei között megfelelőek továbbá legyengített élő vakcinák [Ginsberg H.S., Microbiology, 3. Edition, Ed. Davis, B. D. et al., Harper and Row, Picornaviruses, 1095-1117 (1980)], vagy oltóanyagok.
Vírus fogalom alá tartoznak továbbá a jelen találmány keretei között az inaktivált vírusok, például kémiai kezeléssel, így formaldehides kezeléssel, UV-besugárzással, kémiai kezelés és UV-besugárzás kombinációjával, például psoralen/ UV- vagy brómdezoxiuridin/UV-kezeléssel, gamma-besugárzással vagy neutronbombával inaktivált vírusok. Inaktivált vírusokat, ahogyan például vakcinának használják azokat, az irodalomból ismert standard eljárások [Davis B. D. és Dulbecco R., Microbiology, 3. Edition, Ed. Davis, B.
D. et al., Harper and Row, Sterilization and Disinfection, 1264-1274 (1980); Hearst J. E. és Thiry L., Nucl. Acids Rés. 4, 1339-1347 (1977)] szerint állíthatunk elő, és a DNS-komplexek bevitelének megnövelésére szolgáló beépítésük szempontjából vizsgáljuk. A jelen találmány keretei között végzett kísérletekben adenovírus preparátumokat készítettünk egy szokásos UV-sterilező lámpa vagy formaldehid segítségével. Meglepő módon azt találtuk, hogy a vírusok inaktiválódásának mértéke jóval nagyobb volt, mint a géntranszferhatás csökkenése, amelyet akkor értünk el, ha az adenovírust hozzáadtuk a transzfekciós táptalajhoz. Azok a kísérletek is, amelyeket psoralen/UV-inaktivált, biotinezett adenovírus készítményekkel - amelyeket sztreptavidinhez kapcsolt polilizinnel kapcsoltunk össze - végeztünk el azt mutatták, hogy az inaktiválás következményeként a vírustiter sokkal erősebben visszaesett, mint a géntranszferkapacítás. Ez egyértelműen arra utal, hogy azok a mechanizmusok, amelyek az aktív vírusoknál a normális replikációs mechanizmussal vannak összefiigésben, tönkretehetők anélkül, hogy a géntranszfer számára lényeges hatás eltűnne.
„Víruskomponensek” fogalom a vírusoknak olyan részeit jelenti, például a nukleinsavtól megszabadított fehéqerészt (az üres vírus-kapszidot, amelyet rekombináns módszerek segítségével állíthatunk elő, lásd például [Ansardi D. C. et al., J. Virology 65, 2088-2092 (1991); UrakawaT. et al., J. Gén. Virol. 70, 1453-1463 (1989)], fehérjéket, amelyeket a frakcionálásnál kapunk vagy peptideket, amelyek rendelkeznek az intakt vírusnak a felvételi funkció számára lényeges endoszóma-litikus képességével. Ezeket a víruskomponenseket szintetikusan is előállíthatjuk, nagyságuktól függően vagy peptidszintézissel vagy rekombináns módszerekkel. A jelen találmányban meg tudtuk mutatni, hogy azok az adenovírus-fehérjék, amelyek biotin/sztreptavidinen keresztül polilizinnel konjugálva vannak, a géntranszfert fel tudják erősíteni. A példák adenovírusoktól különböző más vírusok fragmentumaira vagy fehérjéire, amelyek a vírus intemalizálása számára lényegesek, magukban foglalják az influenza vírus9
HU 211 925 A9 hemagglutinint (HA). Az influenza vírus-hemagglutinin HR-2 alegységének N-terminális szekvenciája felelős a vírusnak az endoszómából történő szabaddá tételéért. Kimutatták, hogy olyan peptidek amelyek ennek a szekvenciának 20 aminosavjából állnak, a lipidmembránt fúzionálni tudják és részben felszakíthatják/tönkre tehetik [Wharton S. A. et al., J. Gén. Virol. 69, 1847-1857 (1988)]. A jelen találmányban autentikus és módosított influenza-peptideket sikeresen alkalmaztunk különböző megvalósítási formákban. Egy további példa a retrovírusok burokfehérjéi, például HÍV gp41 [Rafalski M. et al., Biochemistry 29, 7917-7922 (1990)], illetve e vírusfehérjék részei.
Vírusok alkalmazása, amelyek magukban hordozzák a sejtekbe való per se behatolás képességét és ily módon intemalizáló Faktorokként működnek, csak egy vonatkozása a jelen találmánynak.
Azokat a vírusokat vagy víruskomponenseket, amelyek nem hordozzák magukban a sejthez kötődés és behatolás képességét, előnyösen a fent definiált virális konjugátumok formájában alkalmazzuk. A kapcsolódás egy DNS-kötő doménhez. például egy polikationhoz garantálja, hogy a vírus(komponens) a DNS molekulához egy erős affinitást kap, amely által komplexbe kerül és mint a DNS-komplex alkotórésze amely szintén tartalmaz egy intemalizáló Faktor/DNSkötő domén-konjugátumot - bejut a sejtbe. Ráadásul az így elért transzporthatáshoz, a vírus (komponens) kötődése egy nukleinsav-kötő doménhez endoszóma-litikus tulajdonságaiban is javulást eredményez.
Más intemalizáló Faktorok megválasztása révén gyakorlatilag minden magasabb rendű eukarióta sejt transzfekciója megoldható a találmány szerinti készítményekkel.
Azt. hogy egy adott vírus (komponens) rendelkezik-e felvételi funkcióval és alkalmazható-e a találmány gyakorlatában, egy egyszerű screening meghatározással eldönthető. Ennél a meghatározásnál, például hog\ egy vírust szabad vírusként történő felhasználására nézve teszteljünk, a célsejteket a vírus jelenlétében vagy távollétében hozzuk érintkezésbe egy DNSkomplexszel. A citoplazmába kiszabaduló DNS-komplex mennyiségét azután egyszerűen egy markerezett géntermék, például luciferáz kimutatásával határozzuk meg. Ha a vírus jelenléte azt eredményezi, hogy a DNS-komplex nagyobb mértékben kerül be a sejtbe és szabadul ki a citoplazmába, mint vírus nélkül, ez a vírus felvételi funkciójára vezethető vissza. Eljárhatunk úgy is, hogy a tesztvírust felvételi funkciójára nézve egy olyan vírussal hasonlítjuk össze, amelyről ismert, hogy megfelelő felvételi funkcióval rendelkezik. például 5 típusú C alcsoportba tartozó adenovírussal. Az ilyen jellegű teszteknél virális konjugátumokat is alkalmazhatunk, ahol kiegészítő paraméterek, mint különböző intemalizáló Faktor/konjugátumok, különböző menynyiségben alávethetők ilyen vizsgálatoknak. Továbbá az átlag szakember alkalmazhat ilyen jellegű meghatározásokat - adott esetben más tesztekkel öszszekötve, mint például liposzóma-áteresztőképesség meghatározásokkal („Liposomes Leakage Assays”) víruskomponensek vagy más, várhatóan endoszóma-litikus aktivitással rendelkező anyagok génkifejeződést növelő képességének tesztelésére.
Intakt vírusok alkalmazása esetén célszerűen párhuzamosan az előkísérletekkel, amelyekben a vírus géntranszfert felerősítő képességét vizsgáljuk megnézzük, vajon a vírus képes-e replikációra. A replikációs képesség vizsgálatát sejtpatogén vírusok esetében vagy olyan vírusoknál, amelyek a gazdasejt növekedését észrevehetően korlátozzák, tarfolt módszer (plaque assay) (vesd össze fent) vagy CPE meghatározás vagy késői génkifejeződés meghatározásának segítségével végezzük. Más vírusoknál a kérdéses vírusra speciális kimutatási módszereket alkalmazunk, például a hemagglutinációs tesztet vagy kémiaifizikai módszereket (elektronmikroszkópia).
A jelen találmány keretei között különösen olyan vírusokat részesítünk előnyben, amelyeket szabad vírusként alkalmazunk, magas titerrel állíthatók elő, stabilak, vad típusaik csekély patogenitást mutatnak, és amelyeknél lehetséges a replikációs funkció célzott kikapcsolása, különösen adenovírusokat. Amikor egy meghatározott sejtpopulációt kell transzformálni, azokat a vírusokat alkalmazhatjuk, amelyek specifikusan ezt a sejtpopulációt fertőzik. Abban az esetben, ha a transzfekciónak különböző sejttípusokra kell kiterjednie, olyan vírusokat alkalmazhatunk, amelyek a sejttípusok széles körére nézve fertőzőek.
A szabad vírus-készítmények előállításával szemben támasztott követelmények lényegében a lehető legnagyobb tisztaság, valamint a mindenkori vírusra meghatározott stabilizáló puffer.
A jelen találmány terápiás alkalmazása szempontjából minden esetben csak olyan vírusok vagy víruskomponensek jöhetnek szóba, amelyeknél a biztonsági kockázatokat, különösen a vírusnak a sejtben való replikálódását és a vírus DNS rekombinációját a gazdasejt DNS-sel a lehető legalacsonyabbra csökkentjük.
Előnyös módon felhasználhatjuk azoknak a vírusoknak a belépési mechanizmusát, amelyek az embertől eltérő állatokat fertőznek, DNS bevitelének és szabaddá tételének felerősítésére magasabb rendű eukarióta sejtekben, különösen humán sejtekben, amennyiben a vírus a sejtekben az endoszómák felszakítására képesnek bizonyul. Az adenovírus család tagjait izoláltuk madárfajtákból, kétéltűekből és különbözű más állatokból [Laver W. G. et al., Virology 45, 598-614 (1971); Bragg R. R. et al., Onderstepoort J. Vet. Rés. 58, 309-310 (1991); Akopian T. A. et al., Nucl. Acids Rés. 79, 424 (1991); Takase K. et al., Nippon Juigaki Zasshi 52, 207-215 (1990); Khang C. és Nagaraji K. V, Am. J. Vet. Rés. 50, 1466-1470 (1989) és Reece R.
L. et al., Aust. Vet. J. 64, 365-367 (1987)]. Kétéltűek, madarak, szarvasmarhák, kutyák, egerek, birkák, disznók és majmok adenovírusai ugyanúgy, mint humán adenovírusok beszerezhetők az amerikai törzsgyűjteményből (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) [lásd American Type Culture Collection Catalogue of Animál Viruses and Antisera, Chlamydae and Rickettsiae, 6, 1-17 (1990)].
HU 211 925 A9
Egy távoli faj vírusának, például adenovírusának alkalmazása olyan lehetséges előnnyel jár, hogy csökkent toxicitású a célsejtben (például csirke vagy béka adenovírusától nem várnánk, hogy emlősök sejtjeiben replikálódjon vagy korai gének kifejeződését serkentse), a humán adenovírussal összehasonlítva csökkent kockázatot jelent a kutató számára, aki e távoli faj vírusát előkészíti és csökkent zavarást okoz a cél-szervezetben a humán vagy egér adenovírussal szembeni antitestekkel. A humán vagy egér antitestek révén fellépő zavarás elmaradása nagyon fontos, ha a vírusokat emberben vagy egérben használjuk génterápia számára.
A csirke adenovírus CELO (Chick Embryo Lethal Orphan Vírus - csirke embriót elölő vírus) nem mutat reaktivitást azokkal az antitestekkel, amelyek olyan adenovírusok főcsoport-epitópjait ismerik fel, amelyek emlősállatok sejtjeit fertőzik. Ezenkívül CELO-vírusok tenyészthetők embrionált tojásokban nagy vírusmenynyiségek előállítása céljából (0,5 mg/tojás; [Laver W. G. et al., Virology 45, 598-614 (1971)]). Amint azt a kísérletekben bemutatjuk, CELO-polilizin-konjugátumok olyan mértékben erősítik fel a DNS transzportját HeLa-sejtekben, amely a humán dl312 adenovírussal összemérhető. Ennélfogva CELO-konjugátumok felhasználása a DNS bevitel felerősítésére a humán génterápia számára igen sokatígérő.
Távoli fajok vírusait előnyben részesítjük virális konjugátumok alkotórészeiként kombinációs komplexekben (ahogyan itt definiáljuk).
A találmány szerinti konjugátumokban, amelyek egy vírust tartalmaznak, a vírus kötődése a nukleinsavkötő doménhez lehet kovalens vagy nem-kovalens, például egy biotin/sztreptavidin hídon keresztül, vagy abban az esetben, ha a vírus a felületi fehérjéiben olyan régiókkal rendelkezik, amelyek savasak és ezáltal egy polikationt kötni tudnak, ionos kötéssel.
A jelen találmány keretein belül elvégzett kísérletekben komplexeket képeztünk olyan körülmények között, amelyek az ionos kölcsönhatást az adenovírus és a polilizin között a DNS-sel való komplexképzés előtt lehetővé teszik. Kontrollként olyan körülmények között végeztünk kísérleteket, amelyekben a polilizint először DNS-sel semlegesítettük és ezáltal nem tudott az adenovírushoz kötődni. Ezekben a kísérletekben az ionosán kötött adenovírust tartalmazó komplexek bizonyultak erősebbnek.
Példák víruskomponensekre a találmány szerinti endoszómalitikus aktivitással rendelkező konjugátumokban az üres víruskapszidok vagy virális peptidek. A víruskomponenseknek a nukleinsav-kötő doménhez való kötődése lehet kovalens, például a víruspeptid kémiai kapcsolódása a polilizinnel, vagy nemkovalens, például ionos abban az esetben, ha a víruskomponens rendelkezik savas maradékokkal a polikationhoz való kötődéshez.
A vírus vagy víruskomponens és a nukleinsav-affin anyag aránya változó lehet. A jelen találmány keretei között az influenza-hemagglutinin-peptid/polilizinkonjugátum esetében azt találtuk, hogy a gén transzfer nagyobb mértékben erősíthető fel, ha a virális peptid tartalom a konjugátumokban magasabb.
A jelen találmány tárgyát egy további vonatkozásban a találmány szerinti víruskonjugátumok előállítására irányuló módszerek képezik.
A vírusból vagy víruskomponensből és nukleinsavaffin anyagból álló konjugátumok (mint az internalizáló Faktor-polikation-konjugátumok) előállíthatók a komponensek összekapcsolásával, vagy ha a víruskomponens és a nukleinsav-kötő dómén polipeptid, akkor rekombináns úton, az előállítási módokat illetően az EP 388 758 számú európai szabadalmi leírás közzétételére hivatkozunk.
A vírus, vírusfehéijék vagy víruspeptidek összekapcsolása poliamin vegyületekkel kémiai úton, a peptidek egymással való kapcsolódásának ismert módja szerint történhet, ahol amennyiben szükséges, az egyes komponenseket a kapcsolási reakció előtt kapcsoló (linker) anyagokkal látjuk el (erre a műveletre akkor van szükség, ha eleve nem áll rendelkezésre a kapcsoláshoz megfelelő funkciós csoport, például egy merkapto- vagy alkoholcsoport). A kapcsoló anyagoknál olyan bifunkciós vegyületek jönnek szóba, amelyeket mindenekelőtt az egyes komponensek funkciós csoportjaival léptetünk reakcióba, ezt követően a módosított komponensek kapcsolását végezzük el.
A kapcsolás történhet:
a) Diszulfid-hidakon keresztül, amelyek redukált körülmények között újra szétválhatnak (például szukcin-imidil-piridil-ditiopropionát felhasználásával [Jung et al., Biochem. Rés. Commun. 707, 599 (1981)]).
b) Biológiai közegben messzemenően stabil vegyületeken keresztül (például a második komponenshez szulfhidril-csoportokkal kötődő linkerek maleimidolinkerekkel való reakciója révén keletkezett tioéter).
c) Biológiai közegben labilis hidakon keresztül, például észterkötések vagy gyenge savas közegben instabil acetál- vagy ketál-kötések.
A jelen találmány keretei között elvégzett kísérletekben endoszóma-litikus influenza-hemagglutinin HA-2 peptideket kapcsoltunk össze polilizinnel szukcin-imidil-piridil-ditiopropionát (SPDP) segítségével kémiai úton. Kimutattuk, hogy a peptidnek polilizinnel való módosítása megemeli az endoszóma-litikus aktivitást. Transzfekciós kísérletek azt mutatták, hogy a transzferrin-polilizin közvetítette géntranszfer hatékonysága jelentősen megnő, ha az influenza-peptid/polilizin-konjugátumok a transzferrin-polilizinnel együtt állnak rendelkezésre a DNSkomplexben.
A jelen találmány keretei között továbbá különböző módszerek segítségével a polilizinhez kapcsoltuk az adenovírust. A vírus polilizinnel való konjugálásának egy útját a hibás, dl312 adenovírusnak egy heterobifunkciós reagenssel való módosítását követő transzferrin-polilizin-konjugátumok [Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)] előállításához hasonlóan oldottuk meg. A nem kötődött polilizint centrifugálással választottuk el. A DNS kötőképességét egy kötési kísérletben radioaktív jelzett DNS segítségével bizonyítottuk. (K562 sejtekben, klorokin nélkül olyan komplexekkel, amelyek DNS-ből, adenovírus-polilizinből és transzferrin-polilizinből állnak,
HU 211 925 A9 lényegesen magasabb géntranszfert tapasztaltunk, mint módosítatlan adenovírus esetében, amely nem a DNShez kötötten áll rendelkezésre. Továbbá azt találtuk, hogy polilizin/módosított adenovírus segítségével csupán 0,0003 gg DNS felhasználásával 5 x 105 HeLasejtben jelentős génkifejeződés jött létre.)
Abban az esetben, ha a vírus vagy víruskomponens (vagy a kiegészítő intemalizáló Faktor, mint például transzferrin esetében) megfelelő szénhidrát-láncokkal rendelkezik, összekapcsolódhat a nukleinsav-affin anyaggal a glikoprotein egy vagy több szénhidrát-láncán keresztül.
Egy további előnyben részesített eljárás a találmány szerinti víruskonjugátumok előállítására, a vírus vagy víruskomponens enzimes kapcsolása egy nukleinsavaffin anyaghoz, különösen egy poliaminhoz egy transzglutamináz segítségével.
A transzglutaminázok csoportja több olyan különböző enzimet foglal magában, amelyek többek között a hámrétegben (epidermális transzglutamináz), a vérben (XIII Faktor) és a különböző szövetek sejtjeiben (szöveti transzglutamináz, például máj transzglutamináz) fordulnak elő [Főik J.E., Methods Enzymol. 1J3, 358375 (1985)]. A transzglutaminázok Ca** jelenlétében és NH3 keletkezése mellett katalizálják az e-(y-glutamil)-lizin kötéseket. Ennek az a feltétele, hogy a fehérjékben megfelelő glutamin és lizin forduljon elő, amelyeket az enzim át tud alakítani. A lizin ε-amino-csoportja mellett (poli)aminok, mint etanol-amin, putreszcin. spermin vagy spermidin is szolgálhatnak szubsztrátként [Clarké D. D. et al., Arch. Biochem. Biophys. 79, 338-354 (1959)]. Eddig még nem tisztázott milyen Faktoroktól függ, hogy egy fehérjéből egy glutamint vagy lizint, vagy egy poliamint tud átalakítani az enzim. Ismert, hogy számtalan sejtfehérjéhez, mint a citokeratinhoz [Zatloukal K. et al.. Láb. Invest. 61, 603608 (1989)]. tubulinhoz, sejtmembrán-fehérjékhez és az influenza vírusok sejtfelszíni fehérjéihez [Iwanij V., Eur. J. Biochem. 80, 359-368 (1977)] transzglutamináz segítségével poliaminok hozzáköthetők.
A jelen találmány keretei között megmutattuk, hogy a polilizin transzglutamináz segítségével adenovírusokhoz kapcsolható. Megállapítottuk, hogy a kapcsolás glicerin jelenlétében végezhető el. Ez azzal az előnnyel jár, hogy egy olyan víruskészítmény, például adenovírus-készítmény, amely a pufferben stabilizáló ágensként glicerint tartalmaz, közvetlen felhasználható a kapcsoláshoz. Olyan adenovírus-polilizin-konjugátumok segítségével, amelyek transzferrin-polilizin-konjugátumokkal együtt plazmid-DNS-sel komplexben vannak, a génkifejeződésnek többszörösét tudtuk elérni, mint transzferrin-polilizin-konjugátumokkal polilizinhez nem kapcsolt adenovírus jelenlétében.
Egy további, a jelen találmány keretei között előnyben részesített eljárás a találmány szerinti konjugátumok előállítására abban áll, hogy a vírus vagy víruskomponens egy biotinfehérje hídon keresztül, előnyösen egy biotin-sztreptavidin hídon keresztül kapcsolódik a polikationhoz.
A biotin és a sztreptavidin ismerten erős kapcsolatát [Wilchek M. et al., Anal. Biochem. 777, 1 (1988)] használtuk ki az adenovírusnak a polilizinhez való kötésére azáltal, hogy az adenovírust biotinnal módosítottuk és a sztreptavidint a transzferrin-polilizin-konjugátumok előállításához hasonló módon [Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)], kémiailag polilizinnel konjugáltuk. A DNS-ből és a biotinnal módosított vírushoz kötött sztreptavidin-polilizinből álló komplexek és adott esetben nem-kovalensen kötött polilizin, nagyon magas transzfekciós hatékonyságot mutatnak alacsony DNS koncentrációknál is. Különösen nagy hatékonyságú komplexek képződnek, ha a biotinnal módosított vírust először a sztreptavidin-polilizinhez kötjük és csak a második lépcsőben következik a DNS megkötése.
Ha kívánatos, a biotinhoz való kötés avidinen keresztül is történhet.
Továbbá előállíthatjuk a vírus(komponensek) és a polilizin közötti kötést azáltal, hogy egyrészt a vírust biotinilezzük, másrészt egy antibiotin-antitestet polilizinnel konjugálunk és a vírus és polilizin közötti kötést a biotin/antitest-kötésen keresztül állítjuk elő, ahol standard, kereskedelemben kapható poliklonális vagy monoklonális antibiotin antitesteket alkalmazunk.
A vírus és a polilizin közötti kötést úgy is előállíthatjuk, hogy a polilizint egy olyan lektinnel kapcsoljuk össze, amelynek egy vírus felületi glikoproteinhez affinitása van, ahol a kötés egy ilyen konjugátumban a Jektin és a glikoprotein között jön létre. Amennyiben a vírus eleve nem rendelkezik megfelelő szénhidrát oldalláncokkal, megfelelően módosítható.
Vírust köthetünk egy nukleinsav-affin anyaghoz is azáltal, hogy először módosítjuk a felületét egy vírusidegen antigénnel (például digoxigeninnel, DIG, kapható a Boehringer Mannheim cégnél; vagy biotinnal) és a módosított vírus és a nukleinsavaffín anyag közötti összeköttetést egy olyan antitesten keresztül valósítjuk meg, amely ehhez az antigénhez kötődik. Az, hogy melyik eljárást alkalmazzuk a találmány szerinti konjugátumok előállítására, különböző kritériumok függvénye. így például a biotinon keresztül történő kapcsolás a legkevésbé specifikus és ebből következően a legszélesebb körben alkalmazható módszer, mialatt a biotinközvetítette kötés egy nagyon erős, nemkovalens kötést képvisel. Az enzimes reakció transzglutaminázzal azzal az előnnyel jár, hogy nagyon kis mennyiségnél is elvégezhető. A kémiai kapcsolás általában akkor jön számításba, ha nagyobb mennyiségű konjugátumot kell szintetizálni, és ez a módszer általában a legcélszerűbb akkor is, ha vírusfehérjéket vagy -peptideket kell kapcsolni. Inaktív vírusok alkalmazása esetén az inaktiválást általában a kapcsolás előtt végezzük el, amennyiben az inaktiválás nem akadályozza a kapcsolás létrejöttét.
Ha egy vírus, például adenovírus vagy annak egy endoszóma-litikus komponense hozzáférhető kötő doménekkel rendelkezik, például polikation kötéséhez savas doménekkel, a vírus (komponens) kötődése a polikationhoz ionos is lehet. Ebben az esetben az internalizáló Faktorral konjugált polikation pozitív töltéseit a
HU 211 925 A9 vírus (komponens) savas doménjei részben semlegesítik, a maradék pozitív töltéseket pedig lényegében a nukleinsav semlegesíti.
Amennyiben nukleinsav-affin anyagként egy közbenső anyagot viszünk be, módosítjuk azt az egyes vírus (komponens) kapcsolásához megfelelő linkerrel, például transzglutaminázzal való kapcsoláshoz sperminnel vagy egy, a kémiai kapcsoláshoz megfelelő bifunkciós csoporttal, például egy aktív észterrel.
A vírus (komponens):nukleinsav-affin anyag aránya változhat, általában empirikusan állapítjuk meg, például úgy, hogy állandó mennyiségű vírust(komponenst) különböző mennyiségű polilizinnel konjugálunk és a transzfekcióhoz optimális konjugátumot kiválasztjuk.
A találmánynak egy további megvalósítási formájában a víruskomponenst, például egy endoszóma-litikus virális peptidet módosíthatjuk, hogy a DNS-hez közvetlen hozzáköthessük. E célból a peptid maga rendelkezhet egy DNS-kötő doménnel, amelyet úgy kaphatunk, hogy a peptidet peptidszintézis segítségével állítjuk elő, és egy szakaszt pozitív töltésű aminosavakkal tervezünk meg, előnyösen a peptid meghosszabbításával, különösen előnyben részesítve a C-terminálist.
A találmánynak egy további megvalósítási formájában az endoszóma-litikus anyag egy nem virális, adott esetben szintetikus peptid. A találmány szerinti készítmény egy ilyen típusú peptidet előnyösen oly módon tarialmaz, hogy az ionosán kötődik a nukleinsav-affin anyaghoz, például DNS/internalizáló Faktor/polilizinkomplexek esetén polilizinhez. így történik az endoszóma-litikus peptid beépítése a nukleinsav-komplexbe azáltal, hogy a peptid a savas aminosavmaradékai révén a pozitív töltésű nukleinsav-kötő doménhez, előnyösen polilizinhez kapcsolódik.
A peptid kémiai szerkezetétől függően, különösen végcsoportjára vonatkozóan, a polilizinhez való kötődés történhet a peptidek polilizinhez való kötődésének itt leírt módszerei szerint is. E célból, ha egy a természetben előforduló peptidet viszünk be, ezt a peptidet egy megfelelő terminális aminosavval, mint egy nyéllel módosíthatjuk a konjugációhoz.
Egy másik mód nem-virális endoszómalitikus peptidek nukleinsav-komplexekbe történő beépítésére abból áll, hogy olyan szekvenciákkal látjuk el azokat, amelyek a DNS-hez kötődnek. Egy ilyen szekvencia helyzete olyan kell legyen, hogy a peptid endoszómalitikus aktivitását ne zavarja. Ezért például az olyan peptideket, amelyeknek N-terminálisa felelős ezért az aktivitásért, a C-terminálison hosszabbítjuk meg DNSkötő szekvenciákkal. Az ilyen módon történő meghoszabbítások homológ vagy heterológ kationos oligopeptidek lehetnek, például egy oligolizin farok vagy egy természetes DNS-kötő dómén, például egy hisztonból levezetett peptid. Ezek az endoszóma-litikus peptid szerves részét képező DNS-kötő szekvenciák előnyösen körülbelül 10-40 aminosavat foglalnak magukban. A találmánynak ez a megvalósítási formája lehetőséget ad az endoszóma-litikus szekvencia:DNSkötőszekvencia nagyobb arányára, mint a peptid-konjugátumokban, amelyek nagyobb részben tartalmaznak polikationokat a komplexek nagyobb teljesítő képességének elérésére.
A nem-virális endoszóma-litikus peptideknek a következő követelményeknek kell eleget tenniük:
Az endoszóma-litikus aktivitásra való tekintettel a lipidmembránok peptid okozta áteresztőképességének alacsonyabb pH értéknél (5-6) magasabbnak kell lennie, mint 7-es pH értéknél. Továbbá a felszakított membrán-területeknek elég nagynak kell lenniük ahhoz, hogy nagyobb DNS-komplexek átlépését lehetővé tegyék (kis pórusok nem elegendőek). Annak megállapítására, hogy egy peptid megfelel-e ezeknek a követelményeknek, in vitro teszteket végezhetünk, amelyekben a peptideket szabad vagy kötött formában és/vagy egy DNS-komplexbe beépítve alkalmazzuk. Ilyen tesztek magukban foglalhatják liposzómák vagy eritrociták áteresztő-képességének vizsgálatát („leakage assays”) és olyan sejtkultúra kísérleteket, amelyekben meghatározzuk a génkifejeződés felerősödését. Ilyenfajta kísérleteket a példák ismertetésénél írunk le. Az optimális peptidmennyiséget előzetes titrálásokkal állapíthatjuk meg, az eredményezett géntranszfer teljesítő képességének meghatározásával. Ezeknél arra kell ügyelni, hogy a különböző peptidek teljesítő képessége és a komplex optimális összetétele függhet a sejttípustól.
Azok a peptidek, amelyek felszakítják a membránokat, általában kétféle viselkedésű (amfipátiás) szekvenciákat tartalmaznak, nevezetesen egy hidrofób oldalt, amely a lipidmembránnal kölcsönhatásba tud lépni és egy hidrofil oldalt, amely a membrán felszakadási helyén a vizes fázist stabilizálja.
A természetben van néhány példa olyan peptidekre, amelyek membránokat szakítanak fel, általában kis peptidek vagy nagyobb polipeptidek peptid-doménjei. Az ilyen peptidek a természetes környezetben betöltött funkciójuk szerint osztályozhatók, nevezetesen vagy membránokat felszakító peptidek (például meztelen vírusok peptidjei) és/vagy membránokkal fúzionáló peptidek (például burokkal rendelkező vírusok peptidjei). Az endoszómák felszakítására a szintetikus peptidekkel összhangban a peptidszekvenciák mindkét vállfája felhasználható. A legtöbb természetes peptid tud amfipátiás α-hélixeket képezni.
Egy feltehetően amfipátiás α-hélix hidrofil oldalára savas maradékok oly módon történő beépítése révén érhetünk el pH specificitást, hogy a hélix csak savas pH értéknél képződhessen, de semleges pH-nál ne, ahol a töltésből adódó taszítás a negatív töltésű savas maradékok között a hélixképzést megakadályozza. Ez a sajátság a természetben előforduló szekvenciáknál is megtalálható (például az influenza HA-2 peptidek Nterminálisa).
Egy teljes egészében szintetikus, ésszerűen tervezett amfipátiás peptidet, amely pH-specifikus membrán felszakító sajátságokkal rendelkezik, írnak le Subbarao és Parente [Subbarao N. K. et al., Biochemistry 26, 2964-2972 (1987); Parente R. A. et al., Biochemistry 29, 8720-8728 (1990)]. Erről a peptidről (szabad formában) bebizonyították, hogy membránokban csak
HU 211 925 A9 olyan kis pórusokat képez, amelyek csak kisméretű készítmények szabaddá tételét teszik lehetővé [Parente R. A. et al., Biochemistry 29, 8720-8728 (1990)].
A jelen találmány megvalósítási formája szerint, amely nem virális, adott esetben szintetikus peptideket használ fel, általában a következő lépéseket tesszük: a természetben előforduló vagy mesterséges peptidek csoportjából egy amfipátiás peptidszekvenciát választunk ki. Az ilyen típusú peptidek ismertek a szakmában; a 2. táblázatban példákról adunk egy áttekintést. Ha szükséges, savas maradékokat (Glu, Asp) viszünk be annak érdekében, hogy a peptidek aktivitását membránok felszakítására jobban pH érték specifikussá tegyük (például az influenza hemagglutinin-peptidek kétszeresen savanyú, P50 jelű mutánsai a 35. példának megfelelően). Ha szükséges, bevezethetünk savas maradékokat a peptid polilizinhez való kötődésének megkönnyítésére is. Egy mód ilyen polikation-kötő dómén előállítására, hogy a C-terminálisra savas meghosszabbításokat, például egy oligo-Glu-farkot viszünk be.
A jelen találmány számára megfelelő endoszómalitikus peptideket úgy is kaphatunk, hogy természetben előforduló és mesterséges szekvenciákat egyesítünk. A jelen találmány vonatkozásában példákat végeztünk a Parente és munkatársai [Parente R. R. et al., Biochemistry 29. 8720-8728 (1990)] által leírt, szintetikus GALA peptidből levezetett különböző peptidekkel. Néhány, a jelen találmány példáiban felhasznált származékot oly módon állítottunk elő, hogy a GALA peptidet vagy annak módosításait az influenza peptid vagy annak módosított szekvenciáival kombináltuk, például az EALA-Inf és EALA-P50 peptideket. a 35. példának megfelelően.
A peptidszekvencia hossza az amfipátiás hélix stabilitására nézve kritikus lehet; rövid domének - amelyeket természetes fehérjékből vezetünk le és amelyeknél hiányzik a stabilizáló fehérje tartalom - stabilitásának megnövelését elérhetjük a hélix meghosszabbításával.
A peptid endoszóma-litikus aktivitásának megerősítésére homodimereket, heterodimereket vagy oligomereket képezhetünk; a jelen találmány példáiban megmutattuk, hogy egy P50 dimer sokkal magasabb aktivitással rendelkezik, mint a monomer.
Bemutattuk szintetikus peptidek hatását a transzferrin-polilizin-konjugátumok közvetítette DNS felvételre. Több különböző peptidet szintetizáltunk, meghatároztuk képességüket a liposzómák és az eritrociták áteresztővé tételére, és teszteltük hatásukat a luciferáz kifejeződésre TIB 73-sejtekben és NIH 3T3-sejtekben.
A találmánynak egy további megvalósítási formájában az endoszóma-litikus anyag lehet egy nem-peptid amfipátiás vegyülel. Azok a követelmények, amelyeket egy ilyen anyagnak teljesítenie kell ahhoz, hogy a jelen találmány keretein belül megfeleljen, lényegében ugyanazok, mint az amfipátiás peptidekre vonatkozók, nevezetesen a nukleinsav-komplexbe való beépülés, pH-specificitás stb. képessége.
A találmány tárgyát egy további vonatkozásban olyan komplexek képezik, amelyeket magasabb rendű eukarióta sejtek felvesznek, nukleinsavat és egy olyan konjugátumot tartalmaznak, amely rendelkezik a nukleinsavval való komplexképzés képességével a magasabb rendű eukarióta sejtekbe történő bevezetéshez. A komplexek azzal jellemezhetők, hogy egy nukleinsavaffin anyagból és egy ahhoz hozzákötött endoszóma-litikus anyagból álló konjugátumot tartalmaznak, amely egy konjugátum/nukleinsav-komplex alkotórészeként rendelkezik a sejtbe való bejutás és az endoszómák tartalmának - amelyekben a komplex a sejtbe lépés után lokalizálva van - a citoplazmába történő kiengedése képességével.
A jelen találmány keretein belül alkalmazásra kerülő nukleinsav-komplexek előnyösen olyanok, amelyekben a nukleinsav egy nukleinsav-affin anyaggal oly módon van komplexben, hogy a komplexek lényegében elektroneutrálisak.
A találmánynak egy előnyben részesített megvalósítási formájában az endoszóma-litikus anyag egy vírus vagy egy víruskomponens, amely kovalensen kötődik egy polikationhoz.
A jelen találmány keretein belül az endoszóma-litikus konjugátumok magukban foglalják - kiegészítésként azon konjugátumok mellett, amelyekben az endoszóma-litikus anyag ionosán kötődik egy DNS-kötő doménhez - azokat az endoszóma-litikus anyagokat is, amelyek közvetlenül a DNS-hez kötődnek, például bázikus meghosszabbításukon keresztül, jóllehet az ilyen fajta „konjugátumokat” szigorúan véve nem konjugáció révén, azaz két komponens egymással való kötődésével kaptuk. A találmány szerinti összetétel alkotórészeit képező ilyen típusú endoszóma-litikus anyagok funkciója független attól, hogy egy endoszóma-litikus anyag és egy DNS-kötő dómén konjugációjával szintetizáltuk azokat vagy az endoszóma-litikus anyag eredetileg rendelkezett egy DNS-kötő doménnel.
A találmánynak egy másik előnyben részesített megvalósítási formájában az endoszóma-litikus konjugátum mellett a komplexek kiegészítésként egy további konjugátumot tartalmaznak, amelyben egy nukleinsav-affin anyag - endoszóma-litikus polikation konjugátum esetében általában ugyanaz, mint a konjugátumé - egy, a célsejtre affin intemalizáló Faktorhoz kapcsolódik. A jelen találmánynak ezt a megvalósítási formáját mindenekelőtt akkor használjuk, ha a célsejt nem, vagy csak kevés receptorral rendelkezik arra a vírusra, amely mint az endoszóma-litikus konjugátum alkotórésze, alkalmazásra kerül. E megvalósítási formának egy további alkalmazása, amikor egy víruskomponenst, például egy természetben előforduló, adott esetben módosított peptidet, egy nem virális, adott esetben szintetikus endoszóma-litikus peptidet vagy egy távoli faj vírusát használjuk fel, amelyek maguktól nem képesek a transzfekcióra kiszemelt sejtekbe behatolni. Egy további intemalizáló Faktor/kötőFaktorkonjugátum jelenlétében ezek az endoszóma-litikus konjugátumok kihasználják a második konjugátum intemalizáló képességét azáltal, hogy azzal együtt képeznek komplexet a nukleinsavval és az így keletkezett komplex - a
HU 211 925 A9 következőkben „kombinációs komplexének vagy „hármas komplexének nevezve - alkotórészeként bejutnak a sejtbe. Anélkül, hogy ezt az elméletet rögzíteni akarnánk, a kombinációs komplexeket a sejtek vagy a kiegészítő internalizáló Faktorra specifikus felületi receptorhoz történő kötés révén, vagy például vírus vagy egy víruskomponens alkalmazása esetén a vírusreceptorhoz vagy mindkét receptorhoz történő kötés révén, receptor-közvetítette endocitózis útján veszik föl. Az endoszóma-litikus anyagnak az endoszómákból történő szabaddá válásakor a komplexekben levő DNS is kikerül, és ezáltal megmenekül a lizoszomális lebontástól.
A jelen találmány során HeLa-sejtekkel végzett kísérletekben szabad adenovírussal csaknem minden sejtet meg tudtunk fertőzni.
Hepatocitáknál még tovább tudtuk növelni a teljesítő képességet, amikor hármas DNS-komplexeket alkalmaztunk, amelyekben a riporter-DNS polilizin-transzferrin-konjugátumokkal van komplexben és adenovírushoz kapcsolódik. Itt az endoszóma-litikus vírus és a ligandum/receptor-komplex együttes lokalizációja az endoszómában, garantált transzfekciót eredményez gyakorlatilag minden sejtre kiterjedően a BNL.CL2- és HepG2-sejteknél. Ebben az esetben mind a vírus, mind a transzferrin sejtfelszíni receptorok szerepet játszhatnak a hármas DNS komplexek megkötésében. Az is előrelátható azonban, hogy a hármas DNS komplexek egyedül a celluláris ligandum/receptor kapcsolat révén is intemalizálhatók. Egy ilyen helyzetet közelíthetnénk olyan kísérletekben, ahol a transzferrint tartalmazó hármas DNS komplexek inkább a transzferrin receptor útvonalon férhetnek hozzá K562 sejtekhez, mint az adenovírus receptoron keresztül.
Meglepő módon hármas komplexek nagyon kis mennyiségű DNS-t is átvittek. 30 pg DNS 3 x 105 sejtre történő bevitelénél 1,8 x 104 fényegységet (egy plazmidon található, luciferázt kódoló szekvencia kifejeződése eredményeként) mértünk. Egy ilyen bevitelnél egy sejtre mindössze 60 DNS molekula és 1 PFU („plaque farming unit”= tarfolt egység) vírus jut. Öszszehasonlításképpen: a kevésbé hatékony kalcium-precipitációs módszer sejtenként 2 x 105 DNS molekulát ír elő [Sambrook J. et al., Molecular Cloning, 2nd Edition 3, 1639-1640 (1989)]. Ennélfogva a jelen találmány egy jelentős előrelépést képvisel, mivel magasabb rendű eukarióta sejtek hatékony transzformációját nagyon kis mennyiségű DNS-sel teszi lehetővé.
Vírusok, víruskomponensek vagy nem virális endoszóma-litikus anyagok jelenléte endoszóma-litikus konjugátumok alkotórészeként DNS-komplexekben a következő előnyökkel jár:
1) A géntranszfer-technika szélesebb körű alkalmazhatósága nukleinsav-komplexekkel, mivel maga az endoszóma-litikus anyag - különösen abban az esetben ha egy vírust (komponenst) viszünk be - alkothatja az internalizáló Faktort, vagy akár kombinációban egy további internalizáló Faktorral (például transzferrinnel vagy aszialo-fetuinnal stb.) a DNS-hez kötve komplexbe vihető. Ezáltal válik lehetővé a vírusok kedvező hatásának kihasználása olyan sejteknél is, amelyek nem rendelkeznek a kérdéses vírushoz receptorral.
2) A géntranszfer hatásfokának javulása, mivel az endoszóma-litikus konjugátum DNS-hez történő kötődése által biztosítva van a sejtbe történő együttes felvételük. A vírusok és DNS-ek összehangolt felvétele és kiszabadulása révén lehetővé válik továbbá a hatásos géntranszferhez szükséges vírus és DNS mennyiség csökkentése, ami különösen in vivő alkalmazásnál lényeges jelentőségű.
A jelen találmányban „internalizáló Faktor” alatt olyan ligandumok vagy azok fragmentumai értendők, amelyek a sejthez való kötődést követően endocitózissal, előnyösen receptor-közvetítette endocitózissal internalizálódnak, vagy olyan Faktorok, amelyeknek kötődése/internalizálódása a sejtmembrán elemeivel történő fúzióval következik be.
A megfelelő internalizáló Faktorok közé tartoznak a transzferrin ligandumok [Klausner R. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2263-2266 (1983)], konalbumin [Sennett C. et al., Annu. Rév. Biochem., 50, 1053-1086 (1981)], aszialoglikoproteinek (mint aszialo-transzferrin, aszialo-rozomukoid vagy aszialo-fetuin) [Ashwell G. et al., Annu. Rév. Biochem., 51, 531— 554 (1982)], lektinek [Goldstein J. L. et al., Natúré 285, 66 (1980)] illetve olyan anyagok, amelyek galaktózt tartalmaznak, és az aszialo-glikoprotein-receptoron keresztül intemalizálődnak; mannóz tartalmú glikoproteinek [Stahl P. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1399-1403 (1978)], lizoszóma enzimek [Sly W. et al., J. Cell Biochem., 18, 67-85 (1982)], LDL [Goldstein J. L. et al„ Clin. Rés., 30, 417-426 (1982)], módosított LDL [Goldstein J. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 333-337 (1979)], olyan lipoproteinek, amelyeket a sejt a receptorokon keresztül vesz föl (apó B100/ /LDL); vírusfehérjék, mint a gp!20 HIV-fehérje; antitestek [Mellmann I. S. et al., J. Cell Bioi., 98, 1170-1177 (1984); Kuhn L. C. et al., Trends Biochem. Sci., 7,299-302 (1982); Abrahamson D. R. et al., J. Cell Bioi., 91, 270-280 (1982)], illetve azok sejtfelszíni antigének elleni fragmentumai, például anti-CD4, anti-CD7; citokinek, mint interleukin-1 [Mizel S. B. et al., J. Immunoi., 138, 2906-2512 (1987)], interleukin-2 [Smith K. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 864-867 (1985)], TNF [Imamura
K. et al. , J. Immunoi., 139, 2989-2992 (1987)], interferonok [Anderson P. et al., J. Bioi. Chem., 257, 11 301-11 304 (1982)]; CSF („Colony-stimulating Faktor” - kolóniastimuláló Faktor) [Walker F. et al., J. Cell Physiol., 130, 255-261 (1987)], Faktorok és növekedési Faktorok, mint inzulin [Marshall S., J. Bioi. Chem., 250, 4133-4144 (1985)], EGF („Epitermal Growth Faktor” - hám eredetű növekedési Faktor) [Carpenter G„ Cell, 37, 357-358 (1984)]; PDGF („Platelet-derived Growth Faktor” - vérlemezke eredetű növekedési Faktor) [Heldin C-H. et al., J. Bioi. Chem., 257, 4216-4221 (1982)], TGFp („Transforming Growth Faktor β’’-transzformáló β növekedési Faktor) [Massague J. et al., J. Cell Physiol., 128, 216-222 (1986)], idegnövekedési Faktor [Hosang M. et al., EM15
HU 211 925 A9
BO J. 6, 1197-1202 (1987)], inzulinhoz hasonló növekedési Faktor I („Insulin-like Growth Faktor”) [Schalch D. S. et al., Endocrinology, 118, 1590-1597 (1986)], LH, FSH [Ascoli M. et al., J. Bioi. Chem., 253, 7832-7838 (1978)], növekedési hormon [Hizuka N. et al., J. Bioi. Chem., 256, 4591-4597 (1981)], prolaktin [Posner Β. I. et al., J. Cell Bioi., 93, 560-567 (1982)], glukagon [Asada-Kubota M. et al., Exp. Pathol., 23, 95-101 (1983)], tiroid-hormonok [Cheng SY. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3425-3429 (1980)], α-2-makroglobulin-proteáz [Káplán J. et al., J. Bioi. Chem., 254, 7323-7328 (1979)], valamint a „hatástalanított toxinok. További példák az immunglobulinok vagy fragmentumaik, mint az Fcreceptor ligandumjai, vagy anti-immunglobulin antitestek, amelyek az SIg-khez („Surface Immunglobulins”= sejtfelszíni immunglobulinok) kötődnek. A ligandumok természetes vagy szintetikus eredetűek lehetnek [lásd Trends Pharmacol. Sci.. 10. 458—462 (1989) és az abban található hivatkozásokat].
Az ilyen, jelen találmány szerinti Faktorok alkalmassága szempontjából lényeges követelmények a következők,
a) hogy specifikus sejttípus által, amelyikbe a nukleinsavat be kell vinni, internalizálhatók legyenek, és internalizáló képességüket ne, vagv lényegesen ne befolyásolja ha kötőFaktorral konjugáljuk őket, és
b) hogy ezen tulajdonságuk keretein belül képesek arra. hogy a nukleinsavat az általuk használt útvonalon keresztül a sejtbe a „hátukon” („piggyback” ) bevigyék.
A jelen találmány szerint elvégzett kísérletekben megmutattuk a találmány széleskörű felhasználhatóságát. tekintettel az internalizáló Faktorra vagy a kombinációs komplexekben levő kiegészítő internalizáló Faktorra humán- és egér-transzferTÍnpolilizin(pL)-konjugátumok. aszialo-fetuin-pL-konjugátumok, galaktózpL-konjugátumok, búzacsíra-agglutinin-konjugátumok. a T-sejt-speciftkus gpl20-pL- és anti CD7-pLkonjugátum segítségével, valamint DNS-polilizinkomplexekkel, amelyek nem tartalmaztak internalizáló Faktort. Ezenkívül bemutattuk a találmány szerinti virális konjugátumokat DNS-ből és polilizinnel konjugált vírusból (vagy víruskomponensből) álló komplexek segítségével, amelyek nem tartalmaztak kiegészítő internalizáló Faktor/kötő Faktor-konjugátumot.
Specifikusan, előkísérletekben meghatározhatjuk, hogy ha az endoszóma-litikus anyag szabad vírus, egy internalizáló Faktor alkalmazása vagy - abban az esetben, ha az endoszóma-litikus anyag egy, az endoszóma-litikus konjugátum részét képező vírus vagy víruskomponens vagy egy nem virális peptid - egy „kiegészítő internalizáló Faktor lehetővé teszi-e vagy megjavítja-e a nukleinsav-komplexek felvételét. Az ilyen vizsgálatok párhuzamos transzfekciókat foglalnak magukban nukleinsav-komplexekkel, először internalizáló Faktor (kiegészítő) nélkül, például virális konjugátumok esetén, amelyek nukleinsavból és virális konjugátumból állnak, és másodszor olyan komplexekkel, amelyekben a nukleinsav komplexet képez egy további. internalizáló Faktort magában foglaló konjugátummal - amelyre a célsejtek receptorral rendelkeznek - és egy nukleinsav-affin anyaggal.
Internalizáló Faktor vagy egy kiegészítő internalizáló Faktor, azaz egy kombinációs komplex alkalmazása esetén, ezt mindenekelőtt a célsejtek által definiáljuk, például bizonyos sejtfelszíni antigének vagy receptorok által, amelyek egy sejttípusra nézve specifikusak, következésképp lehetővé teszik a nukleinsav irányított bevitelét ebbe a sejttípusba.
A jelen találmány keretei között megfelelő nukleinsavaffin anyagok például a homológ szerves polikationok, mint polilizin, poliarginin, poliomitin vagy heterológ, két vagy több különböző, pozitív töltésű aminosavat tartalmazó polikationok, amelyek különböző lánchosszúságúak lehetnek, továbbá nem peptid jellegű szintetikus polikationok, mint a poli-(etilén-imin). Alkalmas nukleinsav-affin anyagok továbbá a természetes, polikation karakterű DNS-kötő fehérjék, mint a hisztonok vagy protaminok, illetve ezek analógjai vagy fragmentumai úgy, mint a spermin vagy spermidin.
A polikation hossza nem döntő jelentőségű, amennyiben a komplexek - tekintettel az előnyben részesített kivitelezési formára - lényegében elektroneutrálisak. A polilizin lánchossz előnyben részesített tartománya körülbelül 20 és 1000 lizinmonomer között van. Egy előre megadott DNS hosszúsághoz azonban nem tartozik kritikus polikation lánchossz. Ha a DNS 6000 bázispárból áll, és 12 000 negatív töltése van, a polikation mennyisége DNS mólonként például mól polilizin 200 monomer, vagy mól polilizin 400 monomer, vagy
120 mól polilizin 100 monomer, stb. lehet.
Az átlag szakember egyszerű rutin kísérletek segítségével kiválaszthat más polikation hossz és moláris mennyiség kombinációkat.
A konjugátumok alkotórészét képező további megfelelő nukleinsav-affin anyagok közbenső vegyületek, mint az etidiumdimerek, akridin vagy közbenső peptidek, amelyek triptofánt és/vagy tirozint és/vagy fenilalanint tartalmaznak.
Tekintettel a nukleinsav-komplex minőségi összetételére, általában legelőször a sejtbe bejuttatandó nukleinsavat határozzuk meg. A nukleinsavat mindenekelőtt a sejtben elérendő biológiai hatás által definiáljuk, a génterápia keretei közötti felhasználás esetében a kifejezésre juttatandó gén, illetve géndarab - például egy hibás gén helyettesítése céljából - vagy egy gátolandó gén célszekvenciája által. A sejtbe szállítandó nukleinsavaknál DNS-ről vagy RNS-ról lehet szó, ahol a nukleotidszekvenciára nézve nem állnak fenn korlátozások.
Ha a találmányt daganalsejteknél alkalmazzuk, mint rákvakcina bevetését, a sejtbe bevezetendő DNS előnyösen egy immunmoduláló anyagot, például egy citokint - mint IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-α - kódol. Különösen hasznos lehet citokineket - például IL2-t és IFN-gammát - kódoló DNS-ek kombinációja. Egy további, a daganatsejtekbe történő génbevitelnél hasznos gén, a „Multi Drug Resistance Gene” (mdr).
A sejtbe két vagy több különböző nukleinsav-szek16
HU 211 925 A9 venciát is be lehet vinni, például két különböző fehérjét kódoló cDNS-t tartalmazó plazmidot megfelelő regulátor-szekvenciák kontrollja alatt, vagy két, különböző cDNS-eket tartalmazó plazmidszerkezetet.
A sejtbe specifikus génszekvenciák gátlása céljából bevezetett, terápiásán hatásos inhibiáló nukleinsavak közé tartoznak olyan génszerkezetek, amelyekből antiszenz RNS vagy ribozim íródik át. Továbbá oligonukleotidok, például antiszenzoligonukleotidok sejtbe történő bevitele is lehetséges. Antisense-oligonukleotidok előnyösen 15 vagy több nukleotidot tartalmaznak. Adott esetben az oligonukleotidok multimerek is lehetnek. Ribozimokat előnyösen egy olyan génszerkezet részeként vihetünk be a sejtbe, amely stabilizáló génelemeket, például tRNS-génelemeket tartalmaz. Ilyen típusú génszerkezeteket az EP-AO 387 775 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés ismertet.
A nukleinsav molekulákon kívül, amelyek géneket, például virális géneket komplementaritásuk alapján gátolnak, más gátló hatással rendelkező géneket is használhatunk. Erre példák az olyan gének, amelyek olyan virális fehérjéket kódolnak, melyek úgynevezett transzdomináns mutációt szenvedtek [Herskowitz I., Natúré 329, 219 (1987)]. A gének kifejeződése a sejtben olyan fehérjéket szolgáltat, amelyek a megfelelő vad típusú fehérjét elnyomják, és ily módon védik a sejtet, amely celluláris immunitást szerez, miközben a vírusreplikációt megakadályozzák.
Alkalmasak olyan transzdomináns mutáns vírusfehérjék, amelyek a replikációhoz és a kifejeződéshez szükségesek, - például Gag-, Tat- és Rev-mutánsox amelyekről kimutatták, hogy gátolják a HlV-replikációt [Trono D. et al., Cell 59, 113-120 (1989); Green M. et al., Cell 58, 215-223 (1989); Malim M. et al., Cell 55,205-214(1989)].
Az intracelluláris immunitás megszerzésének egy másik mechanizmusa magában foglalja olyan RNS molekulák kifejeződését, amelyek egy nélkülözhetetlen virális fehérje számára a kötő helyet tartalmazzák, például úgynevezett „TAR Decoys” [Sullenger B. A. et al., Cell 63,601-608 (1990)].
A szomatikus génterápia keretei között felhasználható génekre - amelyek a jelen találmány segítségével, mint génszerkezetek alkotórészei a sejtbe juttathatók példák a VEI. Faktor (hemofília A) [Wood W. I. et al., Natúré, 312, 330-337 (1984)], IX Faktor (hemofília B) [Kurachi K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6461-6464 (1982)], adenozin-dezamináz (SCID) [Valerio D. et al., Gene, 31, 147-153 (1984)], α-l antitripszin (tüdőemfizéma) [Ciliberto G. et al., Cell, 41, 531— 540 (1985)] vagy a cisztikus fibrózis (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gén) [Riordan J. R. et al., Science, 245, 1066-1073 (1989)]. Ezek a példák nem jelentenek semmiféle korlátozást.
A nukleinsavak nagyságára vonatkozóan a felhasználás igen széles területen lehetséges; a jelen találmány segítségével körülbelül 0,15 kb (egy ribozimot tartalmazó tRNS gén esetében) és 50 kb közötti nagyságrendben és efölött vihetők be nukleinsav molekulák a sejtbe; kisebb nukleinsav molekulákat oligonukleotidként alkalmazhatunk.
Nyilvánvaló, hogy éppen azon tény alapján, mely szerint a jelen találmány a génszekvenciákra nézve semmiféle korlátozást nem ír elő, és a találmány segítségével egészen nagy génszerkezetek is átvihetők, adottak a legszélesebb felhasználási lehetőségek.
A nukleinsavból kiindulva meghatározzuk a nukleinsav-affin anyagot, előnyösen egy szerves polikation vegyületet, amely biztosítja a nukleinsav komplexbe vitelét és a kapott komplexek előnyösen, lényegében véve elektroneutrálisak. Ha a komplexek az endoszóma-litikus konjugátum mellett egy intemalizáló Faktorból és egy nukleinsav-affin anyagból álló konjugátumot tartalmaznak, mindkét konjugátum kation részét az elektroneutralitásra való tekintettel vesszük figyelembe.
Korábbi találmányok során megállapítást nyert, hogy a nukleinsav sejtbe történő bevitelére egy optimum érhető el, amennyiben a konjugátum: nukleinsav arányt úgy választottuk meg, hogy az intemalizáló Faktor-polikation/nukleinsav komplexek lényegében elektroneutrálisak voltak. Megállapítást nyert, hogy a sejtbe felvett nukleinsav mennyiségét nem csökkenti, ha a transzferrin-polikation-konjugátum egy részét nem kovalensen kötött polikationon keresztül visszük be, sőt bizonyos esetekben a DNS felvétel jelentős megnövekedését érhetjük el [Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55,4255-4259 (1991)]. Emellett megfigyeltük, hogy a DNS a komplex belsejében toroidális szerkezetben található, 80-100 nm átmérőjű, tömörített formában. A polikation mennyiségét tehát a két paraméterre - elektroneutralitás és egy kompakt szerkezet elérésére - való tekintettel választjuk ki, ahol a polikation mennyisége, tekintettel a jelen találmány keretei között előnyben részesített, elektroneutrális komplexek elérésére, a nukleinsavak töltéséből adódik, és általában a DNS tömörítését is szavatolja.
Tehát, a jelen találmánynak egy további megvalósítási formájában a komplexek nukleinsav-kötő anyagokat is tartalmaznak nem kovalensen kötött formában, amelyek azonosak vagy különböznek a kötő Faktortól. Abban az esetben, amikor az endoszóma-litikus anyag szabad vírus, a komplexek nukleinsavat és internalizáló Faktor/konjugátumot foglalnak magukban. Abban az esetben, amikor egy endoszóma-litikus, például egy virális konjugátumot alkalmazunk, a nukleinsav ezzel a konjugátummal komplexben van, adott esetben egy kiegészítő intemalizáló Faktor konjugátumával együtt. A nem kovalensen kötött, „szabad” nukleinsav-affin anyagok fajta és mennyiség szerinti kiválasztását is a konjugátummal illetve konjugátumokkal határozzuk meg, különös tekintettel a konjugátumban található kötőFaktorra: amennyiben a kötőFaktor például egy olyan anyag, amely nem vagy csak csekély képességet mutat a DNS kondenzálására, a komplex hatékony internalizálása szempontjából általában célszerű, olyan DNS-affin anyagokat bevinni, amelyek ezzel a tulajdonsággal erősebben kifejezett mértékben rendelkeznek. Amennyiben maga a kötőFaktor egy nukleinsavat
I7
HU 211 925 A9 kondenzáló anyag és általa már elérjük a nukleinsavnak a hatékony intemalizálás szempontjából kielégítő tömörítését, célszerűen egy olyan nukleinsav-affin anyagot alkalmazunk, amely más mechanizmusok szerint fokozza a génkifejeződést.
Az alkalmazható „szabad”, jelen találmány szerinti, nukleinsav-affin anyagok közé tartoznak olyan vegyületek, amelyek képesek a nukleinsavak kondenzálására és/vagy ezek nemkívánatos sejten belüli lebomlásának kivédésére, különösen a már említett polikation karakterű anyagok. A megfelelő anyagok egy további csoportját képezik azok, amelyek a nukleinsavhoz való kötődésük révén annak átírásában/kifejeződésében javulást okoznak azáltal, hogy javítják a nukleinsav hozzáférését a sejt génkifejeződési gépezetéhez. Egy ilyen anyagra példa a kromoszomális nem-hiszton fehérje HMG1. amelyről megállapítottuk, hogy rendelkezik a DNS tömörítésének képességével és elősegíti a kifejeződést a sejtben.
A komplexekre való tekintettel az endoszóma-litikus anyag és/vagy internalizáló Faktor/nukleinsav-affin anyag/nukleinsav(ak) moláris arányainak a meghatározásánál figyelembe kell venni, hogy a nukleinsav(ak) komplexbe vitele történik, hogy a képződött komplex kötődni tud a sejthez és internalizálódik és hogy vagy magától vagy az endoszóma-litikus anyag segítségével kiszabadul az endoszómákból.
Az internalizáló Faktor/kötőFaktor/nukleinsav arány különösen a polikation molekula nagyságától, valamint a pozitív töltésű csoportok számától és eloszlásától függ, ezek azok a kritériumok, amelyeket összehangolunk a bejuttatandó nukleinsav(ak) nagyságával és szerkezetével. Az internalizáló Faktor:nukleinsavaffin anyag moláris aránya előnyösen körülbelül 10:1 és 1:10 között mozog.
A konjugátumok megszerkesztése és szintetizálása és a transzfekció hatékonysága szempontjából optimális konjugátum:DNS arány meghatározása után títrálás segítségével határozhatjuk meg az internalizáló Faktor/konjugátum-rész mennyiségét, amely adott esetben szabad nukleinsav-affin anyaggal pótolható. Ha polikationokat használunk, mind kötőFaktorként, mind szabad nukleinsav-affin anyagként azonosak vagy különbözőek lehetnek.
A találmánynak olyan megvalósítási formájában, amelynél virális konjugátumokat használunk, a komplexben található komponensek arányainak meghatározására szolgáló megfelelő módszer abból áll, hogy először a sejtekbe bejuttatandó génszerkezetet definiáljuk és amint azt már fent leírtuk, egy olyan vírust vagy víruskomponenst kell találnunk, amely alkalmas a speciális transzfekcióra. Ezután a vírust vagy víruskomponenst hozzákötjük egy polikationhoz és komplexbe visszük a génszerkezettel. Definiált mennyiségű virális konjugátumból kiindulva titrálásokat végezhetünk úgy, hogy a célsejteket ezzel a (konstans) konjugátum mennyiséggel és csökkenő DNS koncentrációval kezeljük vagy fordítva. Ezen a módon állapítjuk meg az optimális DNS:víruskonjugátum arányt. Kiegészítő internalizáló Faktor alkalmazásánál például úgy járunk el, hogy állandó DNS mennyiségből kiindulva titrálások segítségével határozzuk meg a víruskonjugátum és az internalizáló Faktor/konjugátum közötti optimális arányt.
A komplexeket előállíthatjuk a mindig hígított oldatok formájában rendelkezésre álló komponensek, i) nukleinsav, ii) virális konjugátum, iii) internalizáló Faktor/kötőFaktor-konjugátum és adott esetben iv) nem-kovalensen kötött nukleinsav-affin anyag összekeverésével. Polikationoknak kötőFaktorként és egyidejűleg „szabad” polikationokként történő alkalmazása esetén általában célszerű először a konjugátumokból és szabad polikationokból egy keveréket készíteni és ezt a keveréket egyesíteni a DNS-sel. A DNS-nek a konjugátum(ok)hoz és a polikationokhoz való optimális arányát titrálási kísérletekkel határozzuk meg, azaz állandó mennyiségű DNS-sel és növekvő mennyiségű konjugátum(ok)/polikation-keverékkel végzett transzfekciós kísérletek sorozatával. A konjugátum(ok):polikationok optimális arányát a keverékben megkaphatjuk rutin kísérletek segítségével, vagy a titrálási kísérletekben alkalmazott keverékek optimális arányainak összevetésével.
A DNS-komplexek előállítása fiziológiás sóoldatokban történhet. Egy további lehetőség töményebb sóoldatok (körülbelül 2M NaCl) alkalmazása és ehhez kapcsolódóan a fiziológiás körülmények beállítása fokozatos hígítással, illetve dialízissel.
A komponensek - nukleinsav, konjugátum(ok), adott esetben nem-kovalensen kötött szabad nukleinsav-affin anyag - összekeverésének mindenkori legalkalmasabb sorrendjét előkísérletekben határozzuk meg. Bizonyos esetekben célszerűnek bizonyulhat első lépésben a nukleinsavat a konjugátummal komplexbe vinni, és a „szabad” nukleinsav-affin anyagot csak ezután hozzáadni, például polikation, transzferrin/etídium-dimer-konjugátumok és polilizin esetében.
A találmánynak egy előnyben részesített megvalósítási formájában az internalizáló Faktor vagy a kiegészítő internalizáló Faktor transzferrin, és a kötőFaktor egy polikation. „Transzferrin” alatt kell érteni mind a természetes transzferrineket, mind azokat a transzferrin-módosulatokat, amelyeket a receptorok megkötnek és amelyek bejutnak a sejtbe.
A nukleinsav felvétele komplexek formájában történik, amelyekben internalizáló Faktor/polikation-konjugátumok vannak a nukleinsavval komplexben. Nemkovalensen kötött nukleinsav-affin anyag esetén ez előnyösen egy polikation. Ez a polikation azonos vagy különböző a konjugátumban található polikationnal.
„Kombinációs komplexek” esetén a nukleinsavat olyan komplexek formájában intemalizáljuk, amelyekben egyrészt az internalizáló Faktor/konjugátumok, másrészt az endoszóma-litikus anyagok vannak komplexben nukleinsavval.
A szabad vírussal vagy a virális konjugátumokkal kombinációs komplexekben felhasználásra kerülő internalizáló Faktor//polikation konjugátumokat előállíthatjuk kémiai úton, vagy abban az esetben, ha a polikation egy polipeptid, rekombináns úton. Az előállítási
HU 211 925 A9 módszereket illetően az EP 388 758 számú európai szabadalmi leírásra hivatkozunk.
A jelen találmány keretei között előnyösen olyan konjugátumokat használunk, amelyekben glikoproteint, például transzferrint és a kötőFaktort a glikoprotein egy vagy több szénhidrát-láncán keresztül összekötjük egymással.
Ellentétben a szokásos kapcsolási eljárásokkal előállított konjugátumokkal, az ilyen konjugátumok mentesek az alkalmazott linker-vegyületektől eredő módosításoktól. Ezek a konjugátumok olyan glikoproteinek esetén, amelyeknek a kapcsoláshoz csak egy, vagy kevés megfelelő szénhidrát-csoportjuk van, például transzferrin, azzal az előnnyel is rendelkeznek, hogy glikoprotein/kötóFaktor kötőhelyük szempontjából pontosan definiáltak.
Glikoprotein-polikation-konjugátumok előállítására egy megfelelő eljárást tettek közzé a P 4 115 038.4 számú német szabadalmi bejelentésben; újabban Wagner és munkatársai írták le [Wagner E. et al., Bioconjugate Chemistry 2, 226-231 (1991)].
A bevitt endoszóma-litikus anyag mennyisége, illetve koncentrációja az egyedileg elvégzendő transzfekcióhoz igazodik. Célszerű a vírusnak, illetve víruskomponensnek olyan legkisebb mennyiségét bevinni, amely a vírus és a nukleinsav-komplex internalizációjának és az endoszómákból való szabaddá válásának biztosításához szükséges. A vírus(konjugátum) menynyiségét a mindenkori sejttípusra határozzuk meg, ahol mindenekelőtt ennek a sejttípusnak a vírussal való fertőzhetőségét kell figyelembe venni. Egy további fontos tényező az intemalizáló Faktor/kötőFaktor-konjugátum, különös tekintettel az intemalizáló Faktorra, amelyre a célsejtek meghatározott számú receptorral rendelkeznek. A vírus(konjugátum) mennyisége ezenkívül igazodik a bejuttatandó DNS mennyiségéhez. Egy olyan stabil transzfekcióhoz, amelyhez csekély mennyiségű DNS szükséges, általában elegendő kis mennyiségű vírus, miközben a nagyobb mennyiségű DNS-t igénylő tranziens transzfekció nagyobb alkalmazott vírusmennyiséget igényel. Speciális felhasználáshoz előkísérletekben határozzuk meg az optimális víruskoncentrációt a transzfekcióra kiszemelt sejtekkel, esetleg kevert sejtpopulációval és a transzfekcióhoz kiválasztott vektorrendszerrel titrálás segítségével, ahol DNS-ként célszerűen olyan génszerkezetet viszünk be, amely nagyságára nézve a konkrét felhasználásra kiszemelttel messzemenően összehangolt, és a géntranszfer hatékonyságának egyszerűbb mérése céljából egy riportergént tartalmaz. A jelen találmány keretei között a luciferáz és a β-galaktozidáz gének ilyen típusú kísérletekhez riportergénként való alkalmasságát mutattuk meg.
A találmány tárgyát egy további vonatkozásban nukleinsavból nukleinsav-kötő anyagból és adott esetben intemalizáló Faktorból álló komplexek magasabb rendű eukarióta sejtekbe történő bevitelére szolgáló eljárás képezi. Az eljárás azzal jellemezhető, hogy a sejteket olyan anyaggal hozzuk kapcsolatba, amely per se vagy a nukleinsav-komplexek alkotórészeként, rendelkezik a sejtekbe történő felvétel és az endoszómák tartalmának - amelyekben a nukleinsav-komplexek a sejtbe lépés után lokalizálva vannak - a citoplazmába történő kiengedése képességével.
Általában előnyben részesítjük az endoszóma-litikus anyag és a nukleinsav-komplex egyidejű beadását, bár ez egymást követően is történhet. A külön történő alkalmazás esetében a sorrendiség nem döntő tényező - addig amíg a beadás gyors egymásutánban következik - hogy a sejtnek a komponensekkel lehetőség szerint egyidejű érintkezését szavatoljuk.
Szabad vírusnak egy elkülönített készítményben való alkalmazása esetén azáltal biztosíthatjuk a víruspreparátumnak a komplexekkel egyidejű beadását, hogy a víruspreparátum a nukleinsav-komplexet tartalmazó transzfekciós táptalaj alkotórészét képezi.
Szabad vírus egyidejű beadása esetén a nukleinsavkomplexeket és a víruskészítményt alkalmazás előtt összekeverjük.
Egy előnyben részesített megvalósítási formában az endoszóma-litikus anyag egy kombinációs komplex alkotórésze.
A génkifejeződés felerősítésére a találmány szerinti készítményeket ismételve is alkalmazhatjuk.
Egy előnyben részesített megvalósítási formában a sejtek primer daganatsejtek. Egy különösen előnyben részesített megvalósítási formában a nukleinsav egy DNS, amely egy vagy több olyan szekvenciát tartalmaz, amelyek egy immunszabályozó anyagot, előnyösen citokint kódolnak.
Egy további megvalósítási formában a sejtek mioblasztok, előnyösen primer mioblasztok.
Egy további megvalósítási formában a sejtek fíbroblasztok, előnyösen primer fibroblasztok.
Egy további megvalósítási formában a sejtek hepatociták, előnyösen primer hepatociták
Egy további megvalósítási formában a sejtek primer endotélsejtek.
Egy további megvalósítási formában a sejtek primer légúti hámsejtek.
Az 1. táblázat a jelen találmány segítségével végzett sikeres transzfekciókat mutat be különböző sejttípusok példáján.
A találmány szerinti készítményt kutya-hemofília B-fibroblasztok transzfekciójánál is megvizsgáltuk. Mind a luciferázt, mind a β-galaktozidázt sikeresen ki tudtuk fejezni ezekben az esetekben. Ezenkívül alkalmaztuk a rendszert az 1,4 kb IX kutyaFaktor cDNSnek ezekbe a fibroblasztokba történő bevitelére. Szendvics-ELISA segítségével ki tudtuk mutatni a IX Faktort 24 órával a transzfekció után.
Meghatározott esetekben célszerű az endoszóma-litikus anyaghoz kiegészítésként egy lizoszómatróp anyagot alkalmazni, például ha az endoszóma-litikus anyag egy peptidkonjugátum vagy egy retrovírus, amelyeknek az endoszóma-litikus aktivitása nem szigorúan savas pH-érték függő.
Ismert, hogy a lizoszómatróp anyagok gátolják a proteázok és nukleázok aktivitását és ezáltal gátolhatják nukleinsavak lebomlását [Luthmann H. és Magnus19
HU 211 925 A9 són G., Nucl. Acids Rés. 11, 1295-1308 (1983)]. Ezekhez az anyagokhoz tartoznak a klorokin, monenzin, nigericin és metilamin. Megmutattuk, hogy a monenzin a riportergén-kifejeződés emelkedését idézte elő Moloney retrovírus alkalmazásakor.
Klorokin jelenléte kimutathatóan a K562-sejtek gyakorlatilag 100%-ánál egy olyan riportergén-kifejeződéséhez vezetett, amelyet transzferrin közvetítette DNS-transzferrel vittünk be a sejtekbe. BNL.CL2 vagy HepG2-hepatociták nem reagáltak olyan jól a klorokinre, mint a K562-sejtek, mégis 5-10%-ban tudtunk transzfekciót elérni, amikor a hozzáadott replikáció-hibás vagy kémiailag inaktivált adenovírus endoszómalitikus tulajdonságait használtuk ki.
A jelen találmány segítségével felerősítjük a biológiai vektorok előnyeit. A receptorok eloszlása alapján mind az intemalizáló Faktorra, mind a vírusra nézve tropizmus áll fenn. E két komponensnek a mindenkori sejtpopulációra való összehangolása révén megnövelt szelektivitás érhető el, amely mindenekelőtt a jelen találmány terápiás felhasználásánál bír különös fontossággal.
A jelen találmány tárgyát egy további vonatkozásban olyan gyógyászati készítmények képezik, amelyek aktív alkotórészként egy terápiásán hatásos, előnyösen egy génszerkezet részét képező nukleinsav komplexét, valamint egy endoszóma-litikus anyagot (adott esetben konjugálva van), és adott esetben egy intemalizáló Faktor/konjugátumot tartalmaznak. Bármilyen inért, gyógyászatilag elfogadható hordozót alkalmazhatunk, például konyhasó-oldatot vagy foszfát-pufferrel készített konyhasóoldatot vagy bármi olyan hordozót, amelyben a DNS-komplexek megfelelően oldhatók ahhoz, hogy a jelen találmány szerinti eljárásnál felhasználhatók legyenek. A gyógyászati készítmény formulázási módszereit illetően a Remington’s Pharmaceutical Sciences 1980 (Mack Publ. Co., Easton, PA, Osol ed.) kiadványára hivatkozunk.
A jelen találmány a lehető legnagyobb rugalmasság előnyét nyújtja többek között gyógyászati készítményként történő felhasználásnál. A találmány szerinti öszszetétel liofilizátumként vagy megfelelő pufferben, mélyfagyasztott állapotban állhat rendelkezésre. Rendelkezésre bocsátható felhasználásra kész reagensként oldatban is, előnyösen hűtve szállítva. Adott esetben a transzfekcióhoz szükséges komponensek - azaz DNS, endoszóma-litikus anyag, adott esetben konjugálva vagy egy különálló konjugációs partnerrel konjugációra készen, DNS-kötő anyag, adott esetben egy intemalizáló Faktorral konjugálva, és adott esetben szabad polikation egy megfelelő pufferben külön vagy részben elkülönítve - egy transzfekciós kit alkotórészeként lehetnek jelen, amely szintén a jelen találmány tárgyát képezi.
Egy ilyen transzfekciós kit-ben különböző DNS-ek, például különböző antigéneket kódoló DNS-ek és/vagy különböző intemalizáló Faktor-konjugátumok lehetnek jelen, amelyek lehetővé teszik a transzfekciós kit modulrendszer szerinti alkalmazását. Az, hogy az alkotórészek felhasználásra kész készítményként vagy egymástól elválasztva - hogy közvetlenül felhasználás előtt keverjük össze - állnak rendelkezésre, a specifikus felhasználás mellett a komplexek stabilitásától függ, amelyet rutinszerű stabilitási teszttel vizsgálhatunk. Egy előnyben részesített kivitelezési formában transzglutaminázhoz kapcsolt adenovíruspolilizin-konjugátumot - amely tároláskor stabilnak bizonyult használunk egy kit alkotórészeként. Egy további előnyben részesített kivitelezési formában biotinezett adenovírust és sztreptavidin-polilizint keverünk össze felhasználás előtt. A találmány rugalmassága folytán az átlag szakember számtalan különböző transzfekciós kit-et fejleszthet ki.
Gyógyászati felhasználásra a készítmény beadása tervszerűen történhet egy gyógyászati készítmény részeként, előnyben részesítve az intravénás útvonalat. Ennek az alkalmazási formának a célszervei például a máj, lép, tüdő, csontvelő, valamint a daganatok.
Egy példa a helyi alkalmazásra a tüdőszövet (a találmány szerinti összetétel folyadékként történő alkalmazása becseppentéshez vagy aeroszolként belélegzésre).
A találmány szerinti gyógyászati készítmények továbbá beadhatók közvetlen injektálással a májba, az izomszövetbe vagy egy daganatba, vagy helyileg alkalmazhatók a gyomor- és bélrendszerben. Egy további módja a gyógyászati készítmény beadásának az epevezeték-rendszerben történő felhasználás. Ez a felhasználási mód megengedi a közvetlen hozzáférést az epecsatornácskákon található hepatocita-membránokhoz, miközben elkerüljük a kölcsönhatást a vér alkotórészeivel.
Nemrég adódott a lehetőség mioblasztok (éretlen izomsejtek) alkalmazására, géneknek egerek izomrostjaiba való bevitelére. Mivel a mioblasztokról kimutattuk, hogy a génterméket kiválasztják a véráramba, ez a módszer szélesebb alkalmazásra találhat az izomsejtek genetikai hibáinak a kezelésénél, mint például az izomdisztrófiával összefüggő hibánál. Tehát a génmanipulált mioblasztokat felhasználhatjuk olyan géntermékek szállítására, amelyek vagy a vérben hatnak vagy a vér szállítja azokat. A jelen találmány kísérletei azt mutatták, hogy mind mioblaszt-, mind miotube-kultúrák, sőt primerek magas hatásfokkal vethetők alá transzfekciónak. Azok a transzfekciós táptalajok, amelyek a legjobb eredményeket mutatták, biotinezett adenovírusból, transzferrin-polilizinből és sztreptavidinpolilizinből álló kombinációs komplexeket tartalmaztak. Luciferaz és β-galaktozidáz riporter gén-termékeken kívül a VIII. Faktort is kifejeztük izomsejtekben. Ezenkívül beépítettük a csirke adenovírust, CELO-t olyan kombinációs komplexekbe, amelyek kiegészítő intemalizáló Faktorként búzacsíra-agglutinint tartalmaztak.
A gyógyászati alkalmazás ex vivő is végbemehet, ahol a kezelt sejteket, például csontvelő-sejteket, hepatocitákat vagy mioblasztokat visszavezetjük a testbe [Ponder J. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1217-1221 (1991); Dhawan J. et al., Science 254, 1509-1512 (1991)]. A jelen találmánynak egy további
HU 211 925 A9 ex vivő alkalmazása az úgynevezett rákvakcinát érinti. Ennek a gyógyászati lehetőségnek az elve abban áll, hogy a betegből daganatsejteket izolálunk, és a sejtekbe egy citokint kódoló DNS-t viszünk be. A következő lépés a sejtek inaktiválását foglalja magában - például sugárzással - oly módon, hogy már nem szaporodnak, de a citokint még mindig kifejezik. Ezek után a genetikailag megváltoztatott sejteket vakcinaként beadjuk annak a betegnek, akiből a sejteket levettük. Az oltás helyének környezetében a kiválasztott citokinek aktiválják az immunrendszert, többek között azáltal, hogy a sejtölő T-sejteket aktiválják. Ezek az aktivált sejtek a test más részein is kifejthetik hatásukat, és nem kezelt daganatsejteket is megtámadhatnak. Ilyen módon lecsökken a daganatok kiújulásának és metasztázis kialakulásának a kockázata. A rákvakcinák génterápiában történő alkalmazására egy megfelelő előírást készítettek Rosenberg és munkatársai [Rosenberg St. A. et al., Humán Gene Therapy 3, 75-90 (1992)]. Az általuk ajánlott retrovirális vektorok helyett lehet a jelen találmány géntranszfer-rendszerét alkalmazni. A jelen találmány kísérletei során sikeresen vittünk be primer melanoma-sejtekbe egy riportergént, amelyet polilizinhez kapcsolt adenovírusból és transzferrin-polilizinből álló kombinációs komplexek tartalmaztak.
A jelen találmányt felhasználhatjuk a gazdaszervezet egy adott antigénre adott immunválaszának meghatározására ilyen elemzések antigént kifejező sejtek gén transzferén alapulnak.
Az antigén-specifikus sejtölő T-limfociták (CTLCytotoxic T-lymphocytes), amelyek megölik a fertőzött sejteket, fontos szerepet játszanak a gazdaszervezet vírusos fertőzésekkel vagy daganatokkal szembeni védekezésében. A T-sejtek és az antigént bemutató sejt (APC = Antigén Présén ting Cell) kölcsönhatása HLAkorlátozás alatt áll (HLA = Humán Lymphocytic Antigens = MHC = Major Histocompatibilty Complex). Antigént kifejező sejtek CTL-ek általi elpusztításának in vitro, „CTL Killing Assay”-ve, történő megállapításához az antigént a CTL-ek számára a megfelelő HLAkörnyezetben kell bemutatni, amely általában egy autológ célsejten történik.
Egy „CTL Killing Assay” a következőképpen végezhető el: az APC-ket egy olyan DNS-szerkezettel vetjük alá transzfekciónak, amely egy antigént kódoló szekvenciát tartalmaz. Az antigénepitópokat MHC I. osztályú molekulákhoz kötjük és a sejt felszínén egy specifikus CTL-válasz számára célként megjelenítjük. Egy betegből származó szérum próbával történt inkubálás után, specifikus CTL-ek előfordulásától függően, bekövetkezik az APC-ék lízise. A sejtek lízisét például, a szérum hozzáadása előtt az APC-ékbe beépített, radioaktív króm szabaddá válásának nyomonkövetésével mérjük. Megalapozott előírások [Walker R. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9514-9518 (1989)] B-limfoblasztoid sejtvonalakat (B-LCL = B-Lymphoblastoid Cell Lines) alkalmaznak, amelyekben rekombináns vakcínia vírusok transzfekciója révén antigén gének kifejeződését váltják ki. Az antigént körülbelül egy napon át hatékonyan kifejező sejtek azonban mégis elpusztulnak a vakcínia vírus litikus hatása következtében.
Ezeket a nehézségeket elkerülhetjük a „CTL Killing Assay”-k segítségével, amelyek a jelen találmány géntranszfer-rendszerét használják antigént kódoló DNS-nek a sejtbe történő bevezetésére, például HIVvagy daganat-antigéneket kódoló szerkezetek bevitelét fibroblasztokba, hogy ezeket az antigén kifejezésére késztessék.
Primer fibroblasztok könnyen nyerhetők biopsziával, könnyen tenyészthetők és a jelen találmány segítségével különösen hatékony (körülbelül 50-70%) transzfekcióra való hajlamot mutattak.
Az ilyen elemzések hasznosak vakcinák kifejlesztése szempontjából olyan epitópok azonosítására, amelyeket az ölősejtek felismernek. Ezenkívül előnyösen használhatók egy személy meghatározott antigénnel szembeni HLA-korlátozott immunválaszának meghatározására.
Az átvitt géneknek gyakorlatilag minden sejtben tapasztalt magas szinten történő kifejeződése miatt, a találmányt rekombináns fehérjék előállítására is felhasználhatjuk. Ebben az esetben sincs, vagy csak csekély korlátozás áll fenn a szállítandó DNS szekvenciájára és móltömegére vonatkozóan, továbbá a sejttípusok széles spektruma alkalmas a találmány szerinti DNS szerkezettel való transzfekcióra. Ennélfogva majdnem minden sejttípus felhasználható rekombináns fehérjék előállítására, amely biztosítja, hogy a rekombináns fehérje természetes és teljesen módosított poszttranszlációs fejlődési formában képződjön, amely szavatolja a tennék magas biológiai aktivitását.
A géntranszfert a sejtekben úgy érhetjük el, ahogyan a jelen példákban luciferáz és IFN-a segítségével megmutatjuk, gyakorlatilag minden egyes, egy kívánt fehérjetennék képződéséhez vezető génszerkezet szállítható. A kívánt fehérje termék a transzfekció után 24 órától 1 hétig terjedő időszakban vagy tovább kinyerhető a sejtkultúrából (a mindenkori fehérje termékre vonatkozó előírásnak megfelelően vagy a sejtek felülúszójából, vagy egy megfelelő sejt-homogenizátumból).
A géntranszfer-rendszer jelen találmány szerinti alkalmazása rekombináns fehérjék előállítására a következő előnyökkel jár:
1) A magas transzfekciós hatékonyság alapján (a transzfekción átesett sejtek több, mint 90%-a tudja a gént nagy mennyiségben kifejezni) nincs szükség a transzfekcióra kiszemelt sejtek előzetes szelekciójára; továbbá nem szükséges stabil sejtvonalakat hitelesíteni. Egy sejtkultúra kis mennyiségben elegendő lehet használható mennyiségű fehétje kinyeréséhez.
2) Bevihetők nagy génszerkezetek; 48 kb méretűt tudtunk eredményesen transzportálni.
3) A génkifejeződés olyan sejtekben mehet végbe, amelyek szavatolják, hogy a megfelelő poszt-transzlációs fejlődés és módosulás megtörténik, például K-vitamin függő alvadási Faktorok karboxilálása) [Armentano D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6141— 6145 (1990)] vagy sejttípus-specifikus glikozilálás.
HU 211 925 A9
4) A találmány szerinti rendszer révén a célsejteknek nagyobb választéka áll majd a génkifejeződés rendelkezésére.
A találmány általános leírása után ugyanez jobban érthetővé válik a következő példákra történő hivatkozáson keresztül, amelyeket szemléltetés céljából bocsájtunk közre, és nem jelentenek semmiféle korlátozást. Az itt hivatkozott szabadalmakat és publikációkat hivatkozásként teljes egészükben beépítettük.
A jelen találmányt szemléltető következő példákban ha nem adjuk meg másképp, a következő anyagokat és módszereket alkalmaztuk:
Transzferrin-polilizin/DNS-komplexek előállítása
a) Humántranszferrin-polilizin-konjugátumok A Wagner és munkatársai által leírt módszert [Wagner E. et al., Bioconjugate Chemistry 2, 226-231 (1991)] alkalmaztuk, amelynél a polilizin kapcsolása a transzferrin szénhidrátoldalláncain keresztül történik.
280 mg (3.5 pmől) humán transzferrin oldatot (vasmentes, Sigma) 6 ml 30 mM nátrium-acetát pufferben pH = 5,0 C-ra lehűtöttünk és 11 mg (51 pmól) nátrium-perjodátot tartalmazó, 750 pl 30 mM nátrium-acetát puffért pH = 5, adtunk hozzá. A keveréket 90 percig jégfürdőben, sötétben állni hagytuk. A kismolekulájú termékek eltávolítása céljából gélszűrést végeztünk (Sephadex G25, Pharmacia), amely körülbelül 250 mg oxidált transzferrint (mérése ninhidrines meghatározással) tartalmazó oldatot eredményezett. (Az aldehidet tartalmazó és ánizsaldehiddel színreakciót adó oxidált forma bizonyítására a próbákat szilikagél vékonyréteglemezre csepegtettük fel, megszárítottuk és a lemezeket p-ánizsaldehid/kénsav/etanol (1/1/18) elegybe merítettük, majd szárítottuk és hevítettük.) A módosított transzferrin oldatot gyorsan (10-15 percen belül) hozzáadtuk egy 1.5 pmól fluoreszcens jelölésű, átlagosan 190 lizinmonomer lánchosszúságú poli(L)-lizint - 4,5 ml 100 mM nátrium-acetátban, pH = 5 - tartalmazó oldathoz. Az oldat pH-ját 1 M nátrium-bikarbonát puffer hozzáadásával 7,5-re állítottuk be. A keverékhez hozzáadtunk szakaszosan, óránként 4 adagban, egyenként 28,5 mg (450 umól) nátrium-cianobórhidridet. 17 óra után 2 ml 5 M nátrium-kloridot adtunk hozzá, hogy az oldat összkoncentrációját körülbelül 0,75 M-ra állítsuk be. A reakciókeveréket kationcserélő oszlopra vittük fel (Pharmacia Mono S HR 10/10) és állandó mennyiségű 25 mM HEPES-t (pH = 7,3) tartalmazó, 0,75-2,5 M nátrium-klorid só-gradiens mellett frakcionáltuk. A magas sókoncentráció az oszlop töltésénél és a gradiens kezdeténél lényeges volt a polikation-konjugátumok kinyeréséhez. Valamennyi transzferrin (körülbelül 30%) eluált gyenge fluoreszcens aktivitással keresztáramban; a fluoreszcens jelölésű konjugátum zöme 1,35 M és 1,9 M közötti sókoncentrációnál eluált és 3 frakcióban gyűjtöttük össze. Ezek a frakciók (elúciójuk sorrendjében) 2 1 25 mM HEPES-sel (pH = 7,3) szemben dializálva egy 45 mg (0,56 pmól), 366 nmól polilizinnel módosított transzferrin tartalmú A frakciót (TfpL190A). egy 72 mg (0,90 umól), 557 nmól polilizinnel módosított transzferrin tartalmú B frakciót (TfpL190B) és egy 7 mg (85 nmól), 225 nmól polilizinnel módosított transzferrin tartalmú C frakciót (TfpL190C) eredményeztek. A transzferrin-konjugátumokat, amennyiben nem kerültek azonnal felhasználásra, hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, majd -20 C-on vasmentes állapotban tároltuk. A vas beépítése előtt próbákat (0,5-1 mg) állítottunk be nátrium-kloriddal fiziológiás sókoncentrációra (150 mM). A vas beépítését transzferrin mg-onként 4 pl 10 mM vas(III)-citrát puffer (amely 200 mM citrátot tartalmazott és a pH-ját nátrium-bikarbonáttal 7,8-ra állítottuk be) hozzáadásával végeztük el. A vastartalmú konjugátumokat DNS-komplex képzésére való felhasználásuk előtt kis részletekre osztottuk, hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben vagy szárazjég/etanólban és -20 C-on tároltuk. (Ez a művelet célszerűnek bizonyult, miután megmutatkozott, hogy többszöri felengedés és lefagyasztás a konjugátumok tönkremenéséhez vezet.)
b) Egértranszferrin-polilizin-konjugátumok
A humántranszferrinnél megadott módszerekhez hasonlóan jártunk el, midőn a szénhidrát-oldalláncokon keresztül tör'énő kapcsolást végeztük el. 4,1 mg (51 nmól) egértranszferrinből és 2,1 mg (34 nmól) pL290-ből kiindulva olyan konjugátumokat kaptunk, amelyek 15,5 nmól egértranszferrint és 13 nmól pL290-et tartalmaztak.
Plazmid-DNS
a) pRSVL-DNS
A pRSVL DNS-plazmid 6 pg-ját - (pRSVL a Photinus pyralis luciferáz génjét tartalmazza, a Rous Sarcoma Vírus LTR Enhancer/Promoters kontrollja alatt [Uchida Y. et al., J. Biochem. 82,1425-1433 (1977); De Wet J. et al., Mól. Cell. Bioi. 7, 725-737 (1987)], Triton-X Lyse Standard módszer szerint előállítva [Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 474 (1982)], amelyet CsCl/EtBr egyensúlyiréteg-gradiens centrifugálás, butanolos színtelenítés, és 10 mM Tris/HCl pH 7,5 + 1 mM EDTR-t tartalmazó 350 pl HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,3) oldatul szembeni dialízis követ - a sejtekhez történő hozzáadás előtt 30 perccel 12 pg transzferrinpolilizin-konjugátummal kevertük össze 150 pl HBS-ben.
b) pCMVL-DNS
A pCMVL plazmidot oly módon állítottuk elő, hogy a pSTCX556 plazmid BamHI-inszertjét [Seveme Y. et al., EMBO J. 7, 2503-2508 (1988)] eltávolítottuk, a plazmidot Klenow-fragmentummal kezeltük, és a Hindül/Sspl valamint a pRSVL plazmidból Klenowkezelt fragmentumot - amelyik a luciferázt illetve a β-galaktozidázt kódoló szekvenciákat tartalmazza [Macgregor G. és Casky C. T., Nucleic Acids Rés. 17, 2365 (1989)] - beültettük. A komplexképzés a pRSVL-hez hasonlóan történt.
Víruskészítmények előállítása
a) Adenovírus-készítmények
A dl312 adenovírus törzset [Jones N. és Shenk T.,
HU 211 925 A9
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3665-3669 (1979)] alkalmaztuk, amely az Ela-régióban egy törléssel rendelkezik. A vírus szaporítását az Ela-transz-komplementálandó 293-as sejtvonalban végeztük el, ahol nagy mennyiségben állítottuk elő a vírust, mint azt Davidson és Hassell [Davidson D. és Hassell J. A., J. Virol. 61, 1226-1239 (1987)] leírják. A tisztított vírust tároló pufferben (100 mM Tris, pH = 8,0, 100 mM NaCl, 0,1% BSA, 50% glicerin) vagy HBS/40% glicerinben vettük fel és részletekben, -70 ’C-on tároltuk. A virionkoncentráció meghatározását az extrahált genomiális vírus-DNS UV-spektrofotometriás analízisével végeztük el [egy optikai denzitás egység (OD, A260) megfelel ml-enként 1012 víruspartikulának; [Chardonnet Y. és Dales S„ Virology, 40, 462-477 (1970)).
b) Retrovírus-készítmények
Az N2 Moloney-egérleukémia-retrovírust egy ekotrópiás befoglaló-vonalban fogtuk meg [Keller G. et al., Natúré 318, 149-154 (1985); Armentano D. et al., J. Virol. 61, 1647-1650 (1987)]. A vírust kifejező túlélő sejtvonalakat összegyűjtöttük, hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben és -20 C-on tároltuk. A példákban alkalmazott túlélők titere körülbelül 106 cfu/ml (cfu = colonie farming unit = telepképző egység) volt, amelyet neomicin rezisztens kolóniaképzés segítségével, NIH3T3-sejtekkel mértünk meg. A túlélőket a vírus-koncentráló kísérletekhez nitrogén atmoszférában egy 300 Kb membránszűrőn (FILTRON) átszűrtük és egy AMICON keverőkoncentrátorba juttattuk. Ily módon tudtuk a normális körülmények közötti 10-3 ml túlélőt 10-szeresére koncentrálni.
Sejtek és táptalajok
HeLa-sejteket 5%, hővel inaktivált magzati borjúszérummal (FCS), 100 I. E. penicillin/100 gg/ml sztreptomicinnel és 2 mM glutaminnal kiegészített DMEM-táptalajban tenyésztettünk. WI-38, MRC-5 és KB-sejteket 10%, hővel inaktivált FCS-sel, a DMEMnél leírt antibiotikumokkal, 10 mM nem-eszenciális aminosavakkal és 2 mM glutaminnal kiegészített EMEM-táptalajban (Eagle’s Modified Essential Médium) tenyésztettük. CFTl-et, egy respirációs cisztikus fibrózis hámsejt-vonalat (Yankaskas módszere szerint előállítva [Yankaskas J. R. et al., Am. Rév. Respir. Dis. 143, A139 (1991)]; a CFT1-sejtvonal azzal jellemezhető, hogy a AF5O8-törlés CF-mutációra nézve homozigóta) F12-7X-táptalajon tenyésztettünk [Willumsen N. J. et al., Am. J. Physiol. 256, (Cell Physiol. 25,) 1033— 1044 (1989)]. A géntranszfer kísérletekhez a sejteket 6 cm-es sejtkultúra-lemezeken tenyésztettük addig, amíg körülbelül 50%-ban egybefolytak (5 x 105 sejt). A táptalajt eltávolítottuk és 1 ml DMEM- vagy EMEM/2% FCS-táptalajt adtunk hozzá. Ezekután adtuk hozzá a konjugátum-DNS-komplexeket, közvetlenül utána a dl313 adenovírust (0,05-3,2 x 104 partikula/sejt) vagy a vírus-tárolópufferből egy összevethető mennyiséget (1-80 μΐ). A lemezeket egy órára visszatettük a termosztátba (5% CO2, 37 ’C), utána 3 ml komplett táptalajt adtunk hozzájuk. További 24 órás inkubálás után kinyertük a sejteket a luciferáz gén kifejeződésének meghatározása céljából. CFT1-sejtek esetében a géntranszfer kísérletek előtt a sejteket 4 órán át F12-7Xtáptalajon, humántranszferrin nélkül tenyésztettük.
A következő sejtvonalakat az ATCC-től - hozzáférhető a megadott katalógus számok alatt - szereztük be: HeLa-sejtek: CCL2, K562-sejtek: CCL 243, Hep G2-sejtek: HB 8065, ΉΒ-73-sejtek: ΤΊΒ 73 (BNLCL.2), NIH3T3sejtek: CRL1658,293-sejtek: CRL1573, KB-sejtek: CCL 17, WI-38-sejtek: CCL 75, MRC-5-sejtek: CCL 171. A H9-sejteket az AIDS Research and Reference Reagent Program, U.S. Department of Health and Humán Services intézettől, 87. katalógus számon szereztük be.
Primer limfocitákat kaptunk úgy, hogy köldökzsinór-vérből egy 25 ml-es próbát EDTA-t tartalmazó próba-csövecskében vettünk fel. Kis részleteket 4,5 ml Ficoll-hypaque-val (Pharmacia) alárétegeztünk és 15 percig 2.500 rpm mellett centrifugáltuk. A felső plazmaréteg és a tiszta Ficoll-réteg közötti barnás réteget (körülbelül 10 ml) eltávolítottuk. 40 ml IMDM + 10% FCS keverékét adtuk hozzá, a próbát 15 percig 1200 rpm mellett centrifugáltuk és a sejt-pelletet 50 ml friss IMDM + 10% FCS keverékében vettük fel (a sejtsűrűség körülbelül 2 x 106 sejt/ml volt). Fito-hemagglutinin (PHA P, DIFCO) egy 250 μΙ-es részletét adtuk hozzá, a kultúrát 48 órán át 37 ’C-on és 5% CO2 mellett inkubáltuk, végül rekombináns IL-2-őt (BMB) adtunk hozzá (koncentráció: 20 egység/ml). Ezekután a sejteket IMDM/ /20% FCS, 2 egység/ml IL-2 segítségével 1:3 arányban megosztottuk. A sejtek egy részét FCS + 5% DMSO keverékében, folyékony nitrogénben mélyfagyasztottuk. Felhasználás előtt a sejteket IMDM + 20% FCS + 2 egység/ml IL-2 keverékében tenyésztettük.
A szekvenciális kötésvizsgálatokhoz a HeLa-sejteket 4 ’C-on, 2% FCS-sel kiegészített 1 ml DMEM-ben ekvilibráltuk. A konjugátum-DNS-komplexeket ugyanúgy adtuk hozzá, mint a többi kísérletnél és a lemezeket 2 órán át 4 ’C-on inkubáltuk. Ezekutá: a lemezeket alaposan mostuk jéghideg DMEM/2% FCS-sel, végül ennek a táptalajnak 2 ml-ét adtuk hozzá. Ezt követően tettük rá a d 1312 adenovírust illetve víruspuffert, a sejteket hagytuk lassan felmelegedni, mielőtt további 24 órára a termosztátba tettük azokat. Az inkubáció után kinyertük és luciferáz-gén kifejeződésre vizsgáltuk a sejteket.
Luciferáz meghatározás
A sejtkivonatok előállítását, a fehérjetartalom standardizálását valamint a luciferáz aktivitás meghatározását az alábbi hivatkozások szerint végeztük el [Zenke
M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659 (1990); Cotten M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USAS7, 4033-4037 (1990) illetve az EP 388 758 számú európai szabadalmi leírás].
/. példa
Adenovírus-kezelés transzferrin-polilizin-konjugátumokkal történő géntranszferre gyakorolt hatásának meghatározása
Mindenekelőtt emelkedő vírus-dózis hatását vizsgáltuk meghatározott mennyiségű konjugátum-DNS23
HU 211 925 A9 komplex géntranszfert eredményező képességére. A komplexképzéshez 6 pg pRSVL plazmidot 12 pg humánlranszferrin-polilizin-konjugátummal (hTfpL190B) kevertünk össze. A konjugátum-DNSkomplexet a dl312 adenovírus különböző mennyiségeivel (0,05-3,2 χ 104 víruspartikula/sejt) adtuk HeLasejtekhez. Ennek az analízisnek az eredményét az 1. ábrán mutatjuk meg. A luciferáz aktivitást fényegység/50 pg sejtfehérje mértékegységben fejeztük ki. Ezen analízis szerint a hozzáadott adenovírus emelkedő mennyiségei a géntranszferben megfelelő növekedést eredményeztek. Az ábrán 2-4 különálló kísérlet eredményeinek átlagértékeit mutatjuk meg; a vízszintes vonalak a standard szórást mutatják.
2. példa
Konjugátum-DNS-komplex dózishatása
Az 1. példában leírtak szerinti konjugátum-DNSkomplexek logaritmikus hígítmányait készítettük el, ezeket HeLa-sejtekhez adtuk dl312 adenovírus nélkül vagy állandó mennyiségű dl313 adenovírus (1 χ 104 víruspartikula/sejt) adagolása mellett. A luciferáz aktivitást úgy határoztuk meg, ahogyan azt az 1. példában megadtuk. Az eredmények a 2. ábrán láthatók.
3. példa
Transzferrin-polilizin általi, adenovírusok okozta receptorközvetítette endocitózissal történő géntranszfer felerősítése
a) Az adenovírus-kezelés hatása a komplexben levő DNS transzferére
A transzfekcióhoz a következő komponenseket raktuk össze: 6 pg pRSVL-DNS transzferrin-polilizin-konjugátum nélkül (DNS); 6 pg pRSVL-DNS + 6 pg nemkonjugált polilizin270 (DNS + pL); 6 pg pRSVL-DNS + 12 pg az előző példákban alkalmazott transzferrinpolilizin-konjugátum (DNS + hTfpL190B). Ezeket a transzfekciós anyagokat HeLa-sejtekhez adtuk dl312 adenovírus (dl312) nélkül vagy azzal együtt (1 χ 104 víruspartikula/sejt). A sejtkivonatok előállítását, az összfehérje standardizálását valamint a luciferáz aktivitás meghatározását az előző példákhoz hasonlóan végeztük el. Az elvégzett kísérletek eredménye a 3A. ábrán látható.
b) Az adenovírus-kezelés hatása a receptorhoz kötött DNS transzferére
Konjugátum-DNS-komplexeket (DNS + hTfpL190B) vagy polilizinDNS-komplexeket (DNS + pL) kötöttünk HeLa-sejtekhez anélkül, hogy intemalizáltuk volna azáltal, hogy 4 ’C-on inkubáltuk. A nem kötött komplexeket a d 1312 adenovírus (1 x 104 víruspartikula/sejt) vagy öszszevethető mennyiségű puffer hozzáadása előtt eltávolítottuk. Az ezt követő inkubációt 37 °C-on végeztük, hogy lehetővé tegyük a kötött DNS-komplexek és az adenovírusok intemalizációját. A luciferáz aktivitás meghatározása a már megadottak szerint történt (3B. ábra).
c) Az adenovírus-kezelés hatása a transzferrin-polilizin-konjugátumok általi géntranszferre pg pRSVL-DNS + 12 pg transzferrin-polilizinkonjugátum tartalmú (DNS + hTfpL190B) konjugátum-DNS-komplexeket adtunk 1 χ 104 adenovíruspartikula (dl312)/sejt vagy összevethető mennyiségű, hővel inaktivált dl312 adenovírus (dl312 h.i.) mellett HeLasejtekhez. A hőinaktiválást 45 ’C-on történő 30 perces inkubációval oldottuk meg [Defer C. et al., J. Virol. 64, 3661-3673 (1990)].
4. példa
Az adenovírus-kezelés hatása a transzferrin-polilizin-konjugátumok általi géntranszferre kiválasztott sejtvonalakban
Konjugátum-DNS-komplexeket (6 pg pRSVL + 12 pg hTfpL190B) adtunk a C1FT1-, KB-, HeLa-, WI-38- és MRC-5-sejtvonalak sejtjeihez dl312 adenovírussal együtt (1 χ 104 víruspartikula/sejt) vagy anélkül. A géntranszfer hatékonyságát a különböző sejtvonalakra az előző példákhoz hasonlóan luciferáz méréssel határoztuk meg (4. ábra).
5. példa
A luciferáz-gén kifejeződés felerősödése a géntranszporton alapul nem pedig transzaktiváláson Mindenekelőtt egy, a luciferázt konstitutíven (szerkezetéből adódóan) kifejező sejtvonalat - K56210/6 jelzéssel - állítottunk elő úgy, hogy a sejteket egy olyan plazmiddal fertőztük, amely egy RSV-luciferáz-génfragmentumot (a pRSVL-nek egy Apal/PvuI-fragmentuma [De Wet J. et al., Mól. Cell. Bioi. 7, 725-737 (1987)] klónozva a pUCu-Locus Clal-helyére [Collis P. et al., EMBO J. 9, 233-240 (1990)] tartalmazott. Ezt a plazmidot vittük komplexbe egy transzferrin-polilizin-konjugátummal és ezzel a komplexszel fertőztünk K562-sejteket, amelynek során az alábbi hivatkozásban található módszer szerint jártunk el [Cotten M. et al., Proc. Natl. Rcad. Sci. USA 87, 4033^4037 (1990)]. Mivel a pUCu-Locus plazmid egy neomicin-rezisztencia gént tartalmaz, a neomicin rezisztencia alapján ki tudtuk válogatni a luciferázt kifejező kiónokat. További vizsgálatokhoz a K562 10/6 jelű kiónt választottuk ki.
RK562 szülői sejtvonalának részleteit (200 pl RPMI 1640 + 2% FCS keverékében; 500 000 sejt/próba) vagy 12 pg TfpL + 6 pg pRSVL, vagy 4 pg pL90 + 6 pg pRSVL keverékével, mindegyiket 500 pl HBSben kezeltük. Adl312 adenovírus megadott mennyiségeit (5. ábra) 1,5 órán át 37 ’C-on hagytuk a sejtekre hatni, majd 2 ml RPMI + 10% FCS keverékét adtuk hozzá. Ezekután folytattuk az inkubálást 37 ’C-on további 24 óráig és végül a sejteket előkészítettük a luciferáz aktivitás méréséhez. Azt találtuk, hegy az adenovírussal történő inkubálás a luciferáz aktivitásban nyilvánvaló emelkedést okoz (5A. ábra). Ez érvényes mind a TfpL-komplexekre (2000 fényegység 25 000 fényegységgel szemben), mind a pL90-komplexekre (0 szemben 1,9 x 106 fényegységgel). Ebből adódik, hogy a K562-sejtvonal rendelkezik a pRSVL/polilizinkomplexek internalizálásának képességével és hogy ez a luciferáz kifejeződéssel mért internalizáció a vírus jelenléte folytán jelentősen emelkedik.
HU 211 925 A9
Hasonló kísérleteket végeztünk az RSVL-luciferázgént konstitutíven kifejező K562 10/6 sejtekkel, ahol hasonló mennyiségű dl312 adenovírust vittünk be. 500.000 sejt kis részleteit (200 μΐ RPMI + 2% FCS keverékében) az 5B. ábrán megadott mennyiségű dl312 adenovírussal 1,5 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Ezekután ugyanúgy, mint a szülői sejteknél, RPMI + 10% FCS keverékét adtuk hozzá, 24 órán át tovább inkubáltuk és meghatároztuk a luciferáz aktivitást. Ahogyan az az 5B. ábrából látható, ezeknél a sejteknél az adenovírussal való kezelés nem hatott észrevehetően a luciferáz aktivitásra; a kontroll értékek ugyanott találhatók, ahol a vírussal kezelt próbák értékei.
6. példa
Májsejtek transzfekciója aszialo-fetuin/polilizinkonjugátumokkal (AFpL) vagy tetra-galaktózpeptid/pL-konjugátumokkal (gal4pL) adenovírus jelenlétében
a) A laktozilált peptid előállítása
A Lys-(NE-Lys)Lys-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-GlyGly-Ser-Gly-Gly-Cys, elágazó peptid - Fmoc-módszer segítségével előállítva, egy Applied Biosystem 431A peptid-szintetizáló alkalmazásával, amely a Cys számára egy ditio-piridin csoportot tartalmazott - 3,5 mgját (1,92 umól) egy, 7,85 mg laktózt 40 μΐ 10 mM vizes nátriumacetátban (pH=5) tartalmazó oldattal kezeltük 37 °C-on. Az oldathoz 4 részletben 0,6 mg (10 pmól) nátrium-ciano-bórhidridet adtunk körülbelül 10 órás időközökben. Összesen 64 óra 37 C-on tartás után 0,5 ml HEPES-t (pH = 7,3) és 15 mg ditio-treitolt (DTT) adtunk hozzá. Az argon alatti gélszűréssel (Sephadex G-10, 12 x 130 mm, eluens: 20 mM NaCl) történt frakcionálás 3,6 ml laktozilált peptid oldatot eredményezett a szabad merkapto-formában (az Ellmanntesztnek megfelelően 1,73 μπιόΐ; 84% hozam). A módosított peptid próbák ánizs-aldehiddel adtak színreakciót, ninhidrinnel viszont nem; ez egyezik azzal a feltevéssel, hogy minden 4 N-terminális aminocsoport laktozilálva van. A tetragalaktózpeptid/polilizin-konjugátumot a 6. ábrán mutatjuk be.
b) A 3-ditio-piridin-propionáttal módosított polilizin előállítása
0,60 μπιόΐ, 290 lizinmonomer átlagos lánchosszúságú poli-(L)lizin (pL290, Hydrobromid, Sigma) gélszűrt oldatához 1,2 ml 100 mM HEPES-ben (pH = 7,9) intenzív keverés mellett SPDP 15 mM (6,0 umól) etanolos oldatának 400 μΐ-jét adtuk. 1 órával később hozzáadtunk 500 μΐ 1 M nátrium-acetátot (pH = 5); 100 mM nátriumacetáttal való gélszűrés (Sephadex G-25) után az oldat 0,56 pmól pL290-et tartalmazott
5,77 pmól ditio-piridin-linkerrel.
c) A peptid konjugációja polilizinnel
Konjugátumokat úgy állítottunk elő, hogy az a) pont szerint előállított laktozilált peptid 1,5 μιηόΐ-ját 3 ml 20 mM NaCl-ban a b) pont szerint kapott módosított pL2900,146 pmól-jával 620 μΐ 100 mM nátrium-acetát pufferben argon-atmoszférában összekevertük. 100 μΙ 2
M HEPES (pH - 7,9) hozzáadása után a reakciókeveréket 18 órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. NaCl hozzáadása révén megemeltük a sókoncentrációt 0,66 Mra és a konjugátumokat kationcserélő-kromatográfiával (Pharmacia Mono S oszlop HR 5/5; gradiens-elúció, A puffer: 50 mM HEPES pH = 7,3; B puffer: A puffer + 3 M NaCl) elválasztottuk. A körülbelül 1,2-1,8 M sókoncentrációnál eluált termékfrakciókat 2 konjugátumfrakcióba gyűjtöttük; a konjugátum-frakciókat (gal)4pLl és (gal)4pL2 jelöléssel láttuk el. 25 mM HEPES-sel (pH = 7,3) szembeni dialízis a következő konjugátum-frakciókat eredményezte, 24 nmól módosított pL290-et tartalmazó (gal)4pLl és 24,5 nmól módosított pL290-et tartalmazó (gal)4pL2.
d) Aszialo-fetuin/konjugátumok előállítása
A konjugátumokat ugyanazon elv alapján állítottuk elő, mint a transzferrin-konjugátumokat; egy hasonló eljárást aszialo-rozomukoid/polilizin-konjugátumok előállítására Wu és Wu [Wu G. Y. és Wu C. H„ J. Bioi. Chem. 263, 14 621-14 624 (1988)] írtak le.
Az aszialo-fetuin polilizinhez történő kötését a bifunkciós SPDP reagenssel való (Pharmacia) módosítás után diszulfid hidakon keresztül végeztük el. 100 mg (2,2 umól) aszialo-fetuint (Sigma) 2 ml 100 mM HEPES-ben (pH = 7,9) oldva, Sephadex G-25 oszlopon gélszűrésnek vetettük alá. Az így kapott 4 ml oldatot 330 μΐ (5,0 umól) SPDP 15 mM etanolos oldatához adtuk hozzá erőteljes keverés mellett. 1 órás szobahőfokon tartás után további gélszűréssel (Sephadex G-25) tisztítottuk; így adódott 5 ml, 2,5 μιηόΐ ditio-piridinlinkerrel módosított 1,4 μπιόΐ aszialo-fetuin oldat.
Konjugátumokat állítottunk elő azáltal, hogy 5 ml 100 mM HEPES-ben (pH = 7,9) oldott 1,4 μιηόΐ módosított aszialo-fetuint 6,5 ml 200 mM HEPES-ben (pH = 7,6) oldott 0,33 pmól módosított pL 190-nel (amely 1,07 umól merkapto-propionát csoportot tartalmazott; ennél ugyanúgy jártunk el, mint a transzferrin-konjugátumok előállításánál) kevertünk össze argon-atmoszférában. A reakciókeveréket 24 órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. A konjugátumokat a reakciókeverékből kation-cserélő kromatográfiával (Pharmacia Mono S oszlop HR10/10; gradienselúció, A puffer: 50 mM HEPES pH = 7,9; B puffer: A puffer + 3 M NaCl) választottuk el és az oszlophoz a feltöltést megelőzően 0,6 M végső koncentráció eléréséig nátrium-kloridot adtunk. A termékfrakció körülbelül 1,5 M sókoncentrációnál eluált. A HBS-sel szembeni dialízis olyan konjugátumokat eredményezett, amelyek 0,24 pmól pL190nel módosított 0,52 pmól aszialo-fetuint tartalmaztak.
e) HepG2-sejtek transzfekciója pRSVL-DNS-komplexekkel
A HepG2-sejteket 10% FCS + 100 I. E./ml penicillin, 100 pg/ml sztreptomicin + 2 mM glutamin tartalmú DMEM-táptalajban, T25-palackokban tenyésztettük. A transzfekciókat 400 000 sejt/palack sejtsűrűségnél végeztük. A transzfekció előtt a sejteket 4 ml, 10% FCS tartalmú friss táptalajjal mostuk. Közvetlenül a transzfekció előtt klorokint (Sigma) adtunk hozzá úgy,
HU 211 925 A9 hogy a sejtszuszpenzióban (+ DNS-oldat) a végső koncentráció 100 μΜ-t tett ki.
330 pl HBS-ben oldott 10 μg pRSVL-DNS-t a 7. ábrán megadott mennyiségű, 170 μΐ HBS-ben oldott TfpL190B-konjugátummal (TfpL), aszialo-fetuinpL90-konjugátummal (AfpL), polilizin290-nel (pL) vagy tetra-galaktóz-peptid-polilizin-konjugátummal ((gal)4pL) kevertünk össze. A kompetíciós kísérletekben 30 perc után 240 μg aszialo-fetuint ((ga!)4pL + Af) vagy 30 pg laktozilált peptidet ((gal)4pL + (gal)4) adtunk hozzá. A keveréket hozzáadtuk a sejtekhez; a sejteket 4 órán át 37 C-on inkubáltuk, utána a transzfekciós táptalajt kiegészítettük 4 ml, 10% FCS tartalmú friss táptalajjal. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferáz meghatározáshoz. A 7. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek ossz luciferáz aktivitását mutatják. Ahogyan az az ábrából látható, pL és TfpL csekély luciferáz aktivitást mutatnak; a (gal)4pL hasonlóan magas értékeket mutat, mint az AfpL; (gal)4 vagy Af hozzáadásakor ezek versengenek az aszialoglikoprotein receptorért és mint ahogyan az várható, csökkentik az értékeket.
f) Hep G2-sejtek transzfekciója pCMVL-DNSkomplexekkel
Hep G2-sejteket tenyésztettünk 6 cm-es lemezeken 300 000 sejt/lemez sejtsűrűség eléréséig, az e) pontban leírtak szerint. A transzfekció előtt a sejteket 1 ml, 2% FCS tartalmú friss táptalajjal mostuk.
HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t a 8. ábrán megadott mennyiségű, 170 pl HBS-ben oldott TfpL190B-konjugátummal (TfpL), aszialo-fetuin/pLkonjugátummal (AFpL), polilizin290-nel (pLys290), (gal)4pLl-gyel vagy (gal)4pL2-vel kevertünk össze. 30 perc múlva minden DNS-konjugátum-komplexhez 1 ml. 2% FCS és 50 pl adenovírus-törzsoldat dl312 C tartalmú DMEM-et adtunk. A kompetíciós kísérletekben. ahogyan megadtuk, 30 pg laktozilált peptidet (gal) 4pL [(gal) 4pLl + (gal) 4, illetve (gal) 4pL2 + (gal) 4] adtunk hozzá. A keveréket hozzáadtuk a sejtekhez; a sejteket 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk, utána 1,5 ml, 10% FCS tartalmú táptalajt adtunk hozzá. 2 órával később a transzfekciós táptalajt 4 ml friss DMEM-táptalajjal + 10% FCS-sel pótoltuk. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferáz aktivitás meghatározásához; a 8. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek ossz luciferáz aktivitását mutatják. Hatást mutat a pLys290, a (gal)4pL egy erősebb hatást mutat; (gal)4 hozzáadása, amely verseng az aszialo-glikoprotein receptorért, az értékeket lecsökkenti a polilizinnel kapott értékre.
g) TIB73-sejtek transzfekciója pCMVL-DNS-komplexekkel
Az embrionális egér-májsejtvonal ATCC TIB73 [BNL CL.2; Patek P. Q. el al., Natúré 276, 510-511 (1978)] sejtjeit 37 °C-on 5% CO2 atmoszférában 10% FCS + 100 1. E./ml penicillin, 100 pg/ml sztreptomicin + 2 mM glutamin tartalmú „magas glükóz” DMEMben (0,4%- glükóz) tenyésztettük 6 cm-es lemezeken.
A transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sejtsűrűségnél végeztük. A transzfekció előtt a sejteket 1 ml friss táptalaj + 2% FCS keverékével mostuk.
300 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t, 170 pl HBS-ben oldott, megadott mennyiségű egértranszferrin-polilizin290-konjugátummal (mTfpL), aszialo-fetuin/pL-konjugátumokkal (AFpL), polilizin290-nel (pLys290), (gal)4pLl-gyel vagy (gal)4pL2vel kevertünk össze. 30 perc elteltével minden DNSkonjugátumkomplexhez 1 ml, 2% FCS + 50 pl dl312C adenovírus törzsoldat tartalmú DMEM-et adtunk. A keveréket hozzáadtuk a sejtekhez, a sejteket 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk, utána 1,5 ml, 10% FCS tartalmú táptalajt adtunk hozzá. 2 órával később a transzfekciós táptalajt 4 ml friss táptalajjal pótoltuk. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferáz aktivitás meghatározásához; a 9B. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek ossz luciferáz aktivitását mutatják.
Összehasonlításképpen adenovírus nélkül, klorokin jelenlétében hajtottunk végre transzfekciót: A transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sejtsűrűségnél végeztük el. A transzfekció előtt a sejteket 1 ml, 2% FCS tartalmú friss táptalajjal mostuk. Közvetlenül a transzfekció előtt klorokint (Sigma) adtunk hozzá úgy, hogy a sejtszuszpenzióban (+ DNS-oldat) a végső koncentráció 100 pM lett. 330 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVLDNS-t, 170 pl HBS-ben oldott, megadott mennyiségű mTfpL-lel, A FpL-lel, pLys290-nel, (gal)4pLl-gyel vagy (gal)4pL2-vel kevertük össze. 30 perc múlva a DNS-komplexeket hozzáadtuk a sejtekhez. A sejteket 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk, utána 1,5 ml, 10% FCS + 100 pM klorokin tartalmú táptalajt adtunk hozzá. 2 órával később a transzfekciós táptalajt 4 ml friss táptalajjal pótoltuk. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferáz aktivitás meghatározásához. A luciferáz aktivitásra kapott értékeket a 9A. ábrán mutatjuk meg.
7. példa
DNS bevitele T-sejtekbe
a) Anti CD7-polilizinl90-konjugátumok előállítása mM HEPES-ben (pH = 7,9) oldott 1,3 mg anti CD7-antitestet (Immunotech) elegyítettünk 49 pl 1 mM SPDP (Pharmacia) etanolos oldatával. 1 órás szobahőfokon tartás után Sephadex G-25 gélt tartalmazó oszlopon szűrtük át (az eluens 50 mM HEPES-puffer pH = 7,9 volt), ahol 1,19 mg (7,5 nmól), 33 nmól piridil-ditiopropionát maradékokkal módosított anti CD7-et kaptunk. FITC-vel fluoreszcens jelölésű polilizinl90-et az SPDP-hez hasonlóan módosítottunk és ditio-treitollal való kezelés és azt követő gélszűrés révén szabad merkapto-csoportokat tartalmazó, módosított formába hoztuk. 35 nmól merkapto-csoporttal módosított 11 nmól polilizin!90 0,2 ml 30 mM nátriumacetát pufferben készült oldatát oxigén kizárása mellett módosított anti CD7-tel (0,5 ml 300 mM HEPES-ben, pH = 7,9) kevertük össze és egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. A reakciókeveréket 5 M NaCl hozzáadásával körülbelül 0,6 M-ra állítottuk be. A konjugátumok elválasztása ioncserélő-kromatográfiával (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES, pH = 7,3,
HU 211 925 A9 sógradiens 0,6-3 M NaCl) történt; a megfelelő, 6,2 nmól polilizin 190-nel módosított, 0,51 mg (3,2 nmól) anti CD7-antitestből álló konjugátumokat 10 mM HEPES-sel (pH = 7,3) szemben végzett dialízissel nyertük.
b) gpl20-polilizin 190-konjugátumok előállítása
A kapcsolás az irodalomból ismert módszerekhez hasonlóan, 6-maleimido-kapronsav-N-hidroxiszukcinimid-észterrel (EMCS, Sigma) való módosítást követően tioéter-kötéssel történt [Fujiwara et al., J. Immunoi. Meth. 45, 195 (1981)].
Tioéterrel kapcsolt gpl20-polilizin 190-konjugátumok: 0,45 ml 100 mM HEPES-ben (pH = 7,9) oldott 2 mg rekombináns gpl20-at 10 mM EMCS oldat 17 μΙével dimetil-formamidban elegyítettünk. 1 óra szobahőfokon tartás után Sephadex G-25 gélt tartalmazó oszlopon szűrtük át (az eluens 100 mM HEPES-puffer pH = 7,9 volt). A termékoldatot (1,2 ml) azon nyomban oxigén kizárásával fluoreszcens jelölésű, 30 nmól merkapto-csoporttal módosított 9,3 nmól polilizin 190 oldatába (90 μΐ 30 mM nátriumacetátban pH = 5,0) helyeztük át és egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. A reakciókeveréket 5 M NaCl hozzáadásával körülbelül 0,6 M-ra állítottuk be. A konjugátumok elválasztása ioncserélő-kromatográfíával (Mono S, Pharmacia, 50 mM HEPES, pH = 7,3, sógradiens 0,6-3 M NaCl) történt; a frakcionálás és 25 mM HEPES-sel (pH = 7,3) szemben végzett dialízis után három, A, B és C konjugátum-frakciót kaptunk, amelyek rendre 1,9 nmól polilizin 190-nel módosított 0,40 mg rgpl20 (A frakció), 2,5 nmól polilizin 190-nel módosított 0,25 mg rgpl20 (B frakció) illetve 1,6 nmól polilizin 190-nel módosított 0,1 mg rgpl20 (C frakció) voltak.
pCMVL-DNS-t (6 μg/próba) vittünk komplexbe megadott menynyiségű polilizin90-nel vagy polilizin-konjugátumokkal 500 μΐ HBS-ben. Közben H9sejtek (106 sejt 5 ml, 2% FCS tartalmú RPMI-ben) vagy primer humán limfociták (3 x 106 sejt Iscove’s módosított Dulbecco’s táptalajban (IMDM) + 2% FCS) kis mennyiségét állítottuk elő. Apolilizin-DNSkomplexeket minden sejtpróbához hozzáadtuk. 5 perccel később hozzáadtuk a megadott mennyiségű dl312 adenovírust. Ezekután a sejteket 37 ’C-on 1,5 órát inkubáltuk, majd 15 ml RPMI-t (H9-sejtek esetében) vagy IMDM-et (primer limfociták esetében) + 2% FCS-t adtunk minden próbához. A sejteket 37 ’Con 24 órán keresztül tenyésztettük, kinyertük és a többi kísérlethez hasonlóan kezeltük a luciferáz aktivitás meghatározása céljából. Az elvégzett kísérletek eredményeit a 10A. (H9-sejtek) illetve 10B. (primer limfociták) ábrákon mutatjuk be: H9-sejteknél az anti CD7-konjugátum (10 A. ábra, 7-9. hasábok) és a gpl20-konjugátum (10-12. hasábok) mutatta a legjobb eredményeket az adenovírussal elért géntranszfert illetően, amelynél a gpl20-konjugátum már adenovírus nélkül is nyilvánvaló luciferáz-génkifejeződést eredményezett. Figyelemre méltó, hogy az elvégzett kísérletekben csak a gpl20-konjugátum volt képes a DNS-t primer limfocitákba bevinni és ezt is csak a hibás adenovírus jelenlétében (10B. ábra, 7. és
8. hasábok).
8. példa
Adenovírusok inaktiválása
a) Inaktiválás UV-besugárzással
Egy dl312 adenovírus-készítményt, amelynek az előállítását és tárolását a példák előtti bevezetőben írtuk le, egy jégre, és két UV-lámpától (Philips TUV1 S(G15 T8)-lámpák) 8 cm távolságban elhelyezett sejtkultúra-lemez 2 cm-es mélyedéseibe (300 μΙ/mélyedés) adagoltuk. A vírust a 11 A. ábrán megadott időtartamú UV-besugárzásoknak vetettük alá és minden készítményből megvizsgáltunk egy kis mennyiséget a vírustiter meghatározására, valamint arra, hogy képes-e és milyen mértékben a polilizin-transzferrin-konjugátumokkal történő géntranszfert HeLa-sejtekbe felerősíteni.
A sejtek tenyésztése és a transzfekció lényegében úgy történt, ahogyan azt fent a „Sejtek és táptalajok” címszó alatt megadtuk; a transzfekcióhoz felhasznált komponensek a 11 A. ábrán láthatók. A pCMVLDNS-ből és 12 μg TfpL-ből álló komplexeket 500 μΐ HBS-ben állítottuk elő és 3 x 105 HeLa-sejthez (1 ml DMEM + 2% FCS-ben) adtuk hozzá. Körülbelül 5 perc múlva minden kultúrához minden víruspreparátumból 54 μΙ-t adtunk és a kultúrákat 37 ‘C-on 1,5-2 órán át inkubáltuk. Ezekután 5 ml DMEM + 10% FCS részleteket adtunk minden kultúrához, folytattuk az inkubálást 37 ’C-on 24 órán keresztül, majd kinyertük a kultúrákat és luciferáz aktivitásra vizsgáltuk azokat. A be nem sugárzott vírus 54 μΙ-es menynyisége nincs a telítési zónában, azaz a teszt legalább
3-szoros vírusmennyiségre érzékeny. A luciferáz kifejeződésre kapott értékeket a 11 B. ábrán mutatjuk be (satírozott négyszögek). Minden készítmény vírustiterét az El A komplementáló 293-sejtvonal felhasználásával határoztuk meg. Először hígítási sorozatokat készítettünk a besugárzott és be nem sugárzott víruspróbákból DMEM + 2% FCS-ben. Ezzel párhuzamosan 5 x 104 293-sejtet tartalmazó próbákat készítettünk (2 cm-es bemélyedésbe) és 200 μΐ DMEM + 2% FCS-hez adtuk hozzá. Minden hígítmánynak egy 5 μΙ-es részletét mértük be összehasonlítás céljából egy-egy második bemélyedésbe. A vírus sejtekhez való kötődésének létrehozására 1,5 óráig 37 ’C-on termosztáltuk, azután minden bemélyedésbe 2 ml DMEM + 10% FCS-t mértünk be. 48 órával később megszámoltuk a kultúrákat a citopátiás hatás megállapítása céljából. Az a vírus-hígítmány, amely fölött a kultúrában 48 óra után a sejteknek kevesebb, mint 50%-a mutat nyilvánvaló citopátiás hatást, minden víruskészítményben a fertőzőképes vírusok relatív mennyiségét mutatja. A kapott értékeket a 1 IB. ábrán (üres négyszögek) mutatjuk be. Az ebben a példában elvégzett kísérletek eredménye azt mutatja, hogy a vírustiternek UV-besugárzás következtében tíz 4. hatványával való visszaesése a luciferázgén transzferében csak 20-szoros csökkenést okoz. Ez azt mutatja, hogy azok a mechanizmusok, amelyek a vírus fertőzőképességéért felelősek tönkretehetők anélkül, hogy
HU 211 925 A9 a vírusnak a géntranszfert felerősítő képességét korlátoznák. Megfigyeltük, hogy alacsony vírusdózisoknál a géntranszfer vírus általi felerősítése csekély mértékben esett vissza (11 A. ábra, 3-6. hasábok), és hogy ez a hatás magasabb dózisoknál erőteljesebben lépett föl.
b) Adenovírusok inaktiválása formaldehiddel ml adenovírus-készítményt előekvilibráltunk egy 10 ml-es G-25 oszlopon (Pharmacia PD 10 G, 25 M) 150 mM NaCl, 25 mM HEPES (pH = 7,9), 10% glicerin keverékével áthajtva és 2,5 ml térfogatban felfogva. A gélszűrt víruskészítmény kis részleteit 20 órán át jégen formaldehid nélkül (0), 0,01%, 0,1% vagy 1% formaldehiddel inkubáltuk. Ezt követően 100 mM koncentrációban Tris pH = 7,4 puffért adtunk hozzájuk, majd a próbákat először 2 órán át 1 1 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH = 7,4 és 50% glicerin elegyével végül egy éjszakán át 2 x 1 1 150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH =
7,9 és 50% glicerin elegyével szemben dializáltuk.
A vírus részleteket ezt követően 293-sejtekre vittük titerük meghatározása céljából (CPE-végpont-meghatározással vagy tarfolt módszerrel) [Precious B. és Russell W. C., Virology, ed. Mahy, B. W. J„ IRL Press, Oxford. Washington, DC, 193-205 (1985)]. Ezután az előző példákhoz hasonlóan - a luciferáz aktivitás mérésével - meghatároztuk a formaldehiddel kezelt vírusok hatását a géntranszferre HeLa-sejtekben (300 000). A víruskészílmény 90 μΙ-e eredményezett géntranszfert. amely több mint 108 fényegységnek felelt meg. A vírus 0,01% vagy 0,1% formaldehides kezelése a géntranszfer aktivitás csekély mértékű csökkenését eredményezte (körülbelül 10-szeres csökkenés 0,1%-nál). Jóllehet az 1% formaldehides kezelés a géntranszfer aktivitás feltűnő veszteségét okozza, a vírus 90 μΙ-e még így is IO4 fényegységnek megfelelő génkifejeződést eredményezett. A 0,1% formaldehides kezelésnél a vírustiter 105 PFU-ra (plaque forming unit = tarfolt egység) esett vissza a luciferáz aktivitás mindössze 10%-os csökkenésével párosulva. Az elvégzett kísérletek eredményét a 12 A. ábrán mutatjuk be.
c) Az adenovírus inaktiválása hosszúhullámú
UV/8-metóxi-psoralennel
A tisztított víruspreparátum kis részleteit 0,33 μ g/ml 8-metoxi-psoralen (33 pg/ml 8-metoxi-psoralen törzskoncentráciő DMSO-ban oldva) koncentrációra állítottuk be és egy 365 nm UV-fényforrásnak (UVP Modell TL-33) tettük ki jégre helyezve, 4 cm távolságra a lámpa szűrőjétől. A megvilágítás időtartama 15-30 perc volt, mint az a 12B. ábrából látható. A víruspróbákat ezután egy Sephadex G-25 oszlopon (Pharmacia, PD-10) ekvilibráltuk HBS + 40% glicerinnel áthajtva és -70 °C-on tároltuk.
A víruskészítményeket egyrészt a pCMVL/hTfpLkomplexek segítségével HeLa-sejtekbe történő géntranszfert felerősítő képességükre (fényegységekben bemutatva, jobboldali tengely a 12 B. ábrán), másrészt 293-sejtekben való replikálódási képességükre (vírustiter, baloldali tengely a 12B. ábrán) vizsgáltuk.
A következő példákban, amelyek a transzferrin-polilizin-DNS-komplexek internalizációjának retrovírusok segítségével történő felerősítését mutatják be, hacsak másképpen nem adtuk meg, a következő anyagokat és módszereket használtuk:
Transzferrin-polilizin 190-konjugátumokat és konjugátum-DNS-komplexeket az előző példákhoz hasonlóan állítottuk elő. A NIH3T3-sejteket 10% FCS + 100
I. E./ml penicillin, 100 pg/ml sztreptomicin + 2 mM glutamin tartalmú DMEM-táptalajban tenyésztettük. A transzfekciókhoz T25-palackonként 5-7 x 105 sejtet szélesztettünk ki a transzfekciót megelőzően 18-24 órával. Közvetlenül a transzfekció előtt friss táptalajba tettük a sejteket és a különböző, a transzfekcióhoz felhasznált komponenseket a következő sorrendben adtuk hozzá:
klorokin (100 μΜ, ahol megadtuk), polilizintranszferrin-DNS-komplex és retrovírus-készítmény. A sejteket ezt követően 4 óra hosszat 37 °C-on inkubáltuk, majd kicseréltük a táptalajt és a sejteket 24 órával később kinyertük. Kivonatokat állítottunk elő úgy, hogy három fagyasztás/felengedés ciklust alkalmaztunk; a kivonatok kis, fehérjetartalmukra standardizált részleteit luciferáz aktivitásra vizsgáltuk, mint ahogyan az előző példákban megadtuk.
9. példa
NIH3T3-sejtek transzfekciója Moloney vírussal
A megadott körülmények között 106 NIH3T3-sejt transzfekcióját végeztük el TfpL-DNS-komplexekkel 100 μΜ klorokin jelenlétében vagy klorokin nélkül, ahogyan azt a 13. ábrán megadtuk. Megállapítottuk, hogy klorokin nélkül a luciferáz aktivitás értékei csak a háttér nívót érték el (1. hasáb), miközben klorokin jelenlétében a pRSVL-riportergén magas kifejeződését tudtuk mérni (2. hasáb). A Moloney leukémia vírus emelkedő mennyiségei (az ábrán RVS-ként jelölve), amelyeket a DNS-komplexekkel egyidejűleg adtunk a sejtekhez, egyre emelkedő luciferáz-gén kifejeződést tudtak előidézni.
10. példa
Annak vizsgálata, hogy a géntranszfer erősödése
NÍH3T3-sejtek transzferrin-polilizin-DNS-komplexekkel történő transzfekciójánál vajon a Moloney vírusra vezethető-e vissza
A 9. példában alkalmazott víruskészítmény retrovírust kifejező sejtek nyers, nem frakcionált maradéka volt. Ahhoz, hogy bizonyítékot kapjunk arra nézve, hogy az ezzel a preparátummal elért DNS-bevitel fokozódás ténylegesen a vírusra vezethető vissza, a maradékot a fent leírt dialízis/koncentrálástisztításnak vetettük alá, ahol a retrovírus maradékot (az ábrán RSV-ként megadva) 10szeresére koncentráltuk. Abban az esetben, ha a retrovírus felelős az erősödésért, a membrán-maradékban talált aktivitás - eltekintve a rendkívül labilis retrovírusnak a koncentrálási lépések alatt bekövetkező esetleges inaktiválódásától - az eredeti maradékban mértnek körülbelül 10-szerese kell legyen. Ugyanúgy, mint az előző példában, 106 NIH3T3-sejtet vetettünk alá transzfekciónak a
HU 211 925 A9
14. ábrán megadott körülmények között. A 14. ábrából látható, hogy a géntranszfert felerősítő hatás a membránmaradékban fordul elő (20-600 μΙ-t alkalmaztunk, 3-6. nyomvonalak; azonkívül megmutatkozott, hogy a 10szeresen koncentrált preparátumok 200 és 600 μΐ-es mennyiségei körülbelül fele olyan aktívak, mint 2 vagy 6 ml az eredeti, nem koncentrált retrovírus preparátumból (7. és 8. nyomvonalak). Ezzel párhuzamosan humán K562-sejtekkel végeztünk kísérleteket, amelyek nem rendelkeznek receptorral az ekotróp egér retrovírusra. Mint vártuk, nem értük el a génkifejeződés felerősödését.
11. példa
A Moloney vírus géntranszferre gyakorolt hatásánál a transzferrin és receptora közötti kölcsönhatások játszanak szerepet
Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy a TfpL/pRSVL-komplexek transzferé a sejtekbe a polilizinnek a retrovírushoz való nem specifikus kötődésére vezethető vissza, és a belépési mechanizmus további tisztázására, megvizsgáltuk a retrovírusnak a csak polilizinnel komplexben levő plazmid-DNS-t sejtbe szállító képességét. Az alkalmazott polilizin mennyiség megfelel a korábban közölt optimumnak, amely a plazmid-DNS teljes mértékű kondenzációját eredményezi és hasonló ahhoz a polilizin mennyiséghez, amely a polilizin-transzferrin-konjugátumnál kerül felhasználásra [Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259 (1991)]. Azok a kísérletek, amelyeknek az eredményét a 15. ábrán mutatjuk meg azt eredményezték, hogy a riportergén klorokin hiányában sem TfpLpRSVL-komplexek, sem pL-pRSVL-komplexek formájában nem fejeződik ki (1. és 2. hasábok).Ezzel szemben retrovírus jelenlétében a TfpL-komplexként elkészített riporter-DNS kifejeződik, viszont pL-DNSkomplex formájában nem (vesd össze a 3. és 4. hasábokat az 5. és 6-tal). Az elvégzett kísérletek továbbá azt eredményezték, hogy feleslegben levő szabad transzferrin jelenléte a retrovírus által megkönnyített DNSbevitelben csökkenést okozott (7. és 8. hasáb). Ezek az eredmények is alátámasztják azt a feltételezést, hogy a transzferrin és receptora közötti kölcsönhatások a DNS-felvétel retrovírus által okozott felerősítésében lényeges szerepet játszanak.
12. példa
A pH érték befolyása a retrovírusok géntranszferre gyakorolt hatására
E példa keretei között elvégzett kísérletek célja az volt, hogy megvizsgáljuk a pH érték befolyását a retrovírusok géntranszfert felerősítő képességére. A transzfekciós kísérleteket az előző példákban leírtakkal azonos módon végeztük el. Annak megállapítására, hogy vajon egy alacsonyabb pH érték a géntranszfer hatás számára lényeges-e, felhasználtuk mindkét jólismert endoszómális pH-érték-csökkenést gátló szert, a monenzint és ammónium-kloridot. A kísérleti eredményeket a 16. ábrán mutatjuk be. Mindkét anyag hatását megvizsgáltuk a TfpL-DNS-transzferre és azt találtuk, hogy a két anyag egyike sem helyettesítheti a klorokint funkcionálisan. Bár a luciferáz-gén kifejeződésének csekély emelkedését állapítottuk meg magasabb ammónium-klorid koncentrációknál (1-5. hasábok). A retrovírus önmagában mutat az előző példákban már megfigyelt enyhe felerősödést a DNS-transzportban (6. nyomvonal). Egy erős emelkedést figyeltünk meg, ha a retrovírust 1 μΜ monenzin jelenlétében alkalmaztuk (7. nyomvonal). Kevésbé erős hatást figyeltünk meg magasabb monenzin koncentrációnál (8. nyomvonal) valamint ammónium-klorid jelenlétében (9. és 10. nyomvonalak).
13. példa
Transzferrin-konjugátumokkal elért géntranszfer felerősítése az influenza-hemagglutinin HA2 N-terminális endoszóma-litikus peptidje révén
a) A peptid szintézise
A peptidet, amely az 1. számú szekvenciavázlat szerint a következő: Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-GlyPhe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-AspGly-Gly-Gly-Cys, Fmoc(fluorenilmetoxi-karbonil)módszer segítségével [Atherton E. et al., Bioorg. Chem. 8, 351 (1979)] szintetizáltuk, ahol egy Applied Biosystems 431A peptidszintetizálót alkalmaztunk. Az oldalláncok védőcsoportjai t-butil a Cys számára, Glu és Asp és tritil az Asn számára. A kapcsolási reakció után ninhidrin tesztet végeztünk, amely minden lépésre 98%-nál nagyobb kapcsolási fokot mutatott. Α-19-cel kezdődően kétszeres kapcsolásokat végeztünk. Az N-terminális Fmoc-csoportot NMP-ben (N-metil-pirrolidon) oldott 20% piperidinnel távolítottuk el a peptidgyanta egy részéből. Ezekután az Fmoc-védett és nem védett frakciókat DCM-mel (diklór-metán) mostuk és vákuum alatt szárítottuk. A hozam 294 mg Fmoc-mentes peptidgyanta illetve 367 mg Fmoc-védett peptidgyanta. Az Fmocmentes peptidgyanta 111 mg-ját 1,5 órán keresztül trifluor-ecetsavas hasításnak vetettük alá, ahol 10 ml TFA, 0,75 g fenol, 300 μΐ EDT (etán-ditiol), 250 μΐ Et-S-Me (etil-metil-szulfid) és 500 μΐ víz keverékét használtuk fel. A peptidet a gyantától egy üvegnuccson szűrtük át. A gyantát DCM-mel mostuk és hozzáadtuk a szűrlethez. A szűrletet körülbelül 2 ml-re pároltuk be és azután cseppenként, rázás közben 40 ml éterhez adtuk hozzá. A peptid-csapadékot lecentrifugáltuk és az étermaradékot kidobtuk. A csapadékot 3-szor mostuk 40 ml éterrel és magas vákuumban szárítottuk. A kapott 58 mg nyersterméket 300 μΐ 25% NHyl tartalmú, 3,5 ml 20 mM NHjHCOs-ban oldottuk. Az oldatot ugyanazon puffer alkalmazásával egy előkészített Sephadex G-25 oszlopon (Pharmacia, PD-10) gélszűrtük. Az egész anyagot felvittük egy Mono Q-oszlopra (Pharmacia 100 x 14 mm). (Gradiens: 0-10 perc 100% A, 10-100 perc 0-100% B. A: 20 mM NHjHCOj + 300 μΐ NH3/I. B: A + 3 M NaCl. Mérés 280 mM, Trp-fluoreszcencia kimutatásnál 354 nm-en. Folyadékáram 1 ml/perc). A termék 1 M NaCldal eluál. A Mono Q-oszlop fő frakcióját reverz fázisú HPLC-vel, egy BIORAD-Hi-Pore RP-304-oszlop (250 x 10 ml) alkalmazásával tovább tisztítottuk (Gradiens: 12,5 perc 50-100% A puffer, 12,5-25 perc 100% B. A: 20 mM NH4HCO3 + 300 μΐ NH3/1. B: A puffer 98%
HU 211 925 A9 metanolban. Folyadékáram 3 ml/perc. Mérés 237 nmen). A tennék 100% B-nél eluál. A termékfrakciót egy Speedvac készülékben bepároltuk, majd A pufferben újra feloldottuk, végül liofilizáltuk. Aciszteinnel (Cys) védett formában levő, HPLC-vel tisztított tennék hozama 8,4 mg (a peptidet „P16” jelöléssel illettük). Ahhoz, hogy a peptidet a szabad merkapto-formában kapjuk meg, a tbutil-védett anyagot tioanizol/etán-ditiol/trifluor-ecetsav/ /trifluor-metán-szulfonsav (2/1/40/3) keverékével (a trifluor-metán-szulfonsavat a megadott arányban a többi komponens után adtuk az elegyhez) 30 percen keresztül kezeltük szobahőmérsékleten. A peptidet éteres kicsapással és azt követően a fent megadott A pufferrel gélszűrve (Sephadex G-25) argon-atmoszférában választottuk el.
b) Az influenzapeptid összekapcsolása polilizinnel bl) Közvetlen kötés SPDP-n (szukcinimidil-piridilditio-propionát) keresztül
19,8 mg polilizin(pL)300-hidrobromidot (Sigma) Sephadex G-25 oszlopon (Pharmacia PD-10) nátriumacetátban (pH = 5) gélszűrtünk a kismolekulájú frakciók eltávolítása végett. A ninhidrin teszt alapján a pLkoncentráció a gélszűrés után 3,16 mg/ml lett. Az oldat pH értékét 1 M NaOH-val 7-8-ra állítottuk be. ApL-oldat 2,5 ml-éhez (7,9 mg pL = 0,13 umól) 0,64 pmól SPDP-t (Pharmacia; 40 mM oldat abszolút etanolban) adtunk. Ez az SPDP:pL 5:1 moláris arányának felel meg. A keveréket egy éjszakán át reagáltattuk és 20 mM NH4HCO3-ban (pH = 8,2) G-25 oszlopon gélszűrtük. A szűrlet egy kis részletének DTT-vel (ditio-treitol) történő redukciója után a tiopiridon mérése azt mutatta, hogy a reakció teljesen lejátszódott. 2,2 ml 0,3 pmól pL-SPDP-t (pmól SPDP-re vonatkoztatva) 0.35 pmól. tiol-formában levő peptiddel hagytunk reagálni. A peptid és a pL összekeverésekor megjelent fehér csapadékot feloldottuk azáltal, hogy az oldatot 2 M guanidin-hidrokloridra állítottuk be, ahol a reakció az éjszaka folyamán lejátszódott. A tiopiridon fotometriás mérése a reakciókeverékben újból megerősítette a reakció befejezettségét. Ezekután a keveréket 2 1 20 mM HEPES/0.5 M guanidin-hidroklorid elegyével szemben kétszer dializáltuk. A kapott oldatot egy Mono S-oszlopra (0,7 x 6 cm, Pharmacia) vittük föl (Gradiens: 0-20 perc 100% A, 20-140 perc 0-100% B. A: 20 mM HEPES pH = 7,3/0,5 M guanidin-hidroklorid, B: 20 mM HEPES pH = 7,3/3 M guanidin-hidroklorid, 0,3 ml/perc. Kimutatás 280 nm-nél és fluoreszcenciakimutatás 354 nm-nél, gerjesztés 280 nm-nél). A termékfrakciót, amely 1,5 M guanidin-hidrokloriddal eluált, 2x21 HBS-sel szemben dializáltuk. ApL-koncentráció ehhez kapcsolódó meghatározása ninhidrin teszttel körülbelül 1,14 mg/ /ml koncentrációt mutatott. A konjugátum oldatában levő peptidmennyiséget 280 nm-nél mért abszorpciójából számoltuk; ez a peptid:pL 4:1 moláris arányt adta.
b2) Kötés polietilén-glikol linkeren keresztül
14,6 mg pL300-hidrobromidot (Sigma) gélszűrtünk a bl)-ben megadottak szerint. A ninhidrin teszt alapján a pL-koncentráció a gélszűrés után 4,93 mg/ml lett. Az oldat pH értékét 1 M NaOH-val 7-8-ra állítottuk be. A pLoldat 2,7 ml-éhez (13,3 mg pL0,22 pmól) 4,33 pmól SPDP-t (Pharmacia: 30 mM oldat abszolút etanolban) adtunk. Ez az SPDP:pL 20; 1 moláris arányának felel meg. 1,5 óra után a reakciókeveréket Sephadex G-25 oszlopon 0,1 M nátrium-acetát/3 M guanidin-hidroklorid keverékében gélszűrtük. A szűrlet egy kis részletének DTT-vel történő redukciója után tiopiridont határoztunk meg, amely a termékfrakcióban 3,62 umól SPDP-t mutatott. Az SPDP-vel módosított pL-t redukáltuk 79 mg DTT-nek az oldathoz történő hozzáadása révén. 2 órás redukció után az oldatot újból G-25 oszlopon, a megadott körülmények között gélszűrtük. A tiol-meghatározás Ellmann-teszt segítségével 2,224 ml-ben 3,15 pmól tiolkoncentrációt mutatott.
17,6 mg = 5 pmól POE-t (polioxi-etilén-bisz (6amino-hexil), Sigma) oldottunk fel 500 pl 20 mM Na HCO3/3 M guanidinhidroklorid (pH 7-8) keverékében és 300 pl DMF-ben (dimetilformamid) oldott 13,8 mg EMCS-sel (ε-maleimido-kapronsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter) (Sigma) (= 44,7 pmól) reagáltattuk. 30 perc után az oldatot G-25 oszlopon gélszűrtük (20 mM Na HCO3/3 M guanidin-hidroklorid). A maleimidocsoport fotometriás meghatározása 300 nm-nél 6,36 umól reagált EMCS-t mutatott 2 ml oldatban.
Ennek az oldatnak 1,05 ml-éhez (megfelel
3,34 pmól EMCS-nek) 1,39 umól tiol-formában (2,5 ml 20 mM NaHCO3/3 M guanidin-hidroklorid keverékben) levő peptidet adtunk cseppenként, Vortex segítségével intenzív átkeverés mellett, argonáramban. 15 perc múlva az Ellmann-teszttel már nem volt kimutatható szabad tiolcsoport.
A redukált, SPDP-vel módosított pL oldatát 1 M NaOH hozzáadásával 7-8 pH értékre állítottuk be. Ennek az oldatnak 1,37 ml-ét Vortex segítségével intenzív átkeverés mellett a fenti reakciókeverékhez adtuk. Ez a peptidSH:POE-EMCS:pL-SH 1:2,4:1.4 (EMCS-re illetve SHra vonatkoztatva) moláris arányát eredményezte. 2,5 órás reakció után az Ellmann-teszttel már nem voltak kimutatható szabad tiol-csoportok. Az anyagot egy éjszakán keresztül 2 1 20 mM HEPES pH = 7,3/0,6 M NaCl keverékével szemben dializáltuk és azt követően egy Mono Soszlopra vittük föl (Gradiens: 0-20 perc 22% A, 20-150 perc 22-100% B. A: 20 mM HEPES pH = 7,3, B: A + 3 M NaCl. Folyadékáram 0,3 ml/perc. A mérést 280 nmnél, a fluoreszcencia mérést 354 nm-nél végeztük). A terméket, amely 1,5-1,6 M NaCl-dal eluált, 21 HBS-sel szemben dializáltuk. A ninhidrin teszt segítségével végzett pLkoncentráció meghatározás és a peptidkoncentráció fotometriás meghatározása 280 nm-nél egy számított peptid:pL 12:1 arányt adott 0,49 mg/ml pL-koncén (rációnál, 4,5 ml össztérfogatban.
c) Liposzóma-készítmény
A liposzómákat REV-módszerrel („reverse-phase evaporation” = reverz fázisú bepárlás) [Szoka F. és Papahadjopoulos D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4194-4198 (1978); Straubinger R. M. és Papahadjopoulos D., Meth. Enzymol. 101, 512-527 (1983)] állítottuk elő; A vizes fázis 10 mM HEPES (pH = 7,3), 100
HU 211 925 A9 mM kalcein 150 mM NaCl; szerves fázis: 300 pmól L-a-lecitint (tojássárgájából, főleg palmitoil-oleoilfoszfatidil-kolin; Avanti Polar Lipids) 260 pl kloroformban rotációs bepárló segítségével bepároltuk. Ezt követően az anyagot magas vákuumban szárítottuk és azután újraoldottuk 3 ml dietil-éterben. A vizes fázis 1 ml-ét az éterfázissal alaposan összekevertük Vortex segítségével és 5 percig 0 ”C-on Sonicator-ban (Badtyp) ultrahanggal kezeltük. 30 perces jégen tartás után az anyagot még egyszer kezeltük ultrahanggal 10 percig. Az eredményül kapott stabil emulziót lassan bepároltuk rotációs bepárlóban. A dietil-éter eltávolítása után 100 mbar-nál a vizes fázis 0,75 ml-ét adtuk hozzá. A maradék éternyomokat további bepárlással távolítottuk el 50 mbar-nál 30 perc alatt. A kapott emulziót (1,7 ml) 500 rpm mellett centrifugáltuk és ezt követően egy nukleopórusos polikation membránon (0,1 pm) keresztül extrudáltuk, amely 0,7 ml végtérfogatú liposzómaoldatot eredményezett. A liposzómákat a be nem épült anyagoktól gélszűréssel (Sephadex G50 médium, Pharmacia; 23 ml géltérfogat, 10 mM HEPES pH = 7,3/150 mM NaCl) választottuk el. 500 pl térfogatban hat frakciót gyűjtöttünk. 2 mM mennyiséggel lipidfoszfort határoztunk meg Bartlett módszere szerint [Bartlett G. R., J. Bioi. Chem. 234, 466(1959)].
d) A liposzómák áteresztő-képességének meghatározása (Liposomes Leakage Assay)
A liposzómák tartalmának szabaddá válását („leakage”) a bezárt kalcein kilépése alapján és az ebből következő hígulásból, amely a fluoreszcencia kikapcsolódásának felfüggesztését okozza [Bondeson J. et al., Biochim. Biophys. Acta 777, 21-27 (1984)], mértük meg. A kalcein fluoreszcenciát egy Kontron SMF 25 spektrálfluoriméterrel (gerjesztés 490 nm-nél, emisszió 515 nm-nél) mértük. E célra a fenti liposzóma-oldat 100 μΙ-es részleteit 0,1 M nátrium-acetát vagy 10 mM HEPES/150 mM NaCl pufferrel - a megfelelő pH értékkel (4,3, 4,5, 5,0, 6,0, 7,3)100-szorosára hígítottuk 1 ml térfogat eléréséhez. Ezekhez az oldatokhoz 2,5 pg peptidet (t-butil-védett formában; 1 pg/μΙ oldat HBS-ben) adtunk küvettákban, gyenge argonárammal (végső koncentráció 400 nM peptid) való keverés közben. A kalcein fluoreszcenciát különböző időpontokban a peptid hozzáadása után mértük. A 100%-os felszakításra jellemző értékeket 2 pl Triton XI00 (Fluka) hozzáadása révén határoztuk meg.
Ugyanezt az eljárást alkalmaztuk a kalcein fluoreszcencia mérésére a liposzóma-oldathoz adott peptid-pL-konjugátumok esetében. A konjugátum 2,5 pgját (1 pg/μΙ koncentráció egyedül a pL mennyiségre vonatkoztatva) adtuk 1 ml liposzóma-oldathoz (végső koncentráció 20 η M módosított peptid). Ehhez hasonlóan vetettünk alá 2,5 pg peptid-polilizin-konjugátumot 5 pg DNS-sel történő 15 perces inkubálás után a liposzóma áteresztőképesség meghatározásnak.
Azt találtuk, hogy a peptid csak savas közegben okozza a liposzómák tartalmának szabaddá tételét (17. ábra). A peptidkonjugátum lényegesen alacsonyabb pH értéknél volt aktív, ennél semleges pH értéknél is erős aktivitást tapasztaltunk, amely a pH érték csökkenésével még felerősödik. A konjugátum komplexbe vitele DNSsel eltüntette az aktivitást semleges pH értéknél, miközben savas pH értéknél nyilvánvaló aktivitás mutatkozott.
e) K562-sejtek transzfekciója
K562-sejteket szuszpenzióban tenyésztettünk RPMI 1640 táptalaj (Gibco BRL + 2 g nátrium-bikarbonát/1) + 10% FCS, 100 egység/ml penicillin, 100 μΐ/μΐ sztreptomicin és 2 mM glutamin keverékében 500 000 sejt/ml sejtsűrűségig. 12-20 órával a transzfekció előtt a sejteket friss táptalajba tettük, amely 50 μΜ desz-ferri-oxamint tartalmazott (erre azért volt szükség, hogy a transzferrin receptorok számában növekedést érjünk el). A transzfekció reggelén a sejteket összegyűjtöttük, friss táptalajban, amely 10% FCS + 50 μΜ desz-fenri-oxamint tartalmazott szuszpendáltuk (250 000 sejt/ml) és 2-2 ml-t adagoltunk 24 bemélyedést tartalmazó lemezre.
160 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t a 18. ábrán megadott mennyiségű, 160 pl HBS-ben oldott TfpL-konjugátummal vagy pL300-zal kevertük össze, 15 perc múlva hozzáadtuk az influenzapeptid-pL-konjugátum („P16pL”) megadott mennyiségeit, további 15 perc elteltével a keveréket K562-sejtekhez adtuk hozzá. A sejteket 37 ’C-on 24 óráig inkubáltuk és utána kinyertük a luciferáz aktivitáshoz. A luciferáz aktivitást úgy határoztuk meg, ahogyan azt az előző példákban megadtuk. A 18. ábrán megadott értékek a transzfekción átesett sejtek ossz luciferáz aktivitását mutatják.
f) HeLa-sejtek transzfekciója
HeLa-sejteket 6 cm-es szaporító csészékben tenyésztettünk úgy, ahogyan azt a „Sejtek és táptalajok” fejezetben megadtuk. A transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sűrűségnél végeztük el. A transzfekció előtt a sejteket I ml, 2% FCS tartalmú friss táptalajban inkubáltuk.
160 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t a 19. ábrán megadott mennyiségű, 160 pl HBS-ben oldott TfpLkonjugátummal vagy pL300-zal vagy a kettő keverékével kevertük össze. 15 perc múlva hozzáadtuk az influenza-peptid-pL-konjugátum („P16pL”) megadott mennyiségeit és további 15 perc elteltével a keveréket hozzáadtuk a sejtekhez. A sejteket 37 ’C-on 2 óráig inkubáltuk, utána 2,5 ml, 10% FCS-sel kiegészített friss táptalajt adtunk hozzájuk. A sejteket 37 ’C-on 24 óráig inkubáltuk és azután kinyertük a luciferáz aktivitáshoz. A luciferáz aktivitást úgy határoztuk meg, ahogyan azt az előző példákban megadtuk. A 19. ábrán megadott értékek a transzfekción átesett sejtek ossz luciferáz aktivitását mutatják.
14. példa
A transzferrin-konjugátumok okozta géntranszfer felerősítése egy további N-terminális endoszómalitikus influenzahemagglutinin-HA2-peptid segítségével
a) Peptid-polilizin-konjugátumok előállítása
A P41 jelölésű, a 2. számú szekvenciavázlat szerint: Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-AsnGly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys pep31
HU 211 925 A9 tidet a 13. példa a) pontja szerinti peptidhez hasonlóan szintetizáltuk. A peptid kapcsolását polilizinhez (pL300) a 13. példa bl) pontja szerint SPDP-n keresztüli kötéssel végeztük el. Ily módon olyan konjugátumokat kaptunk, amelyekben a peptid:polilizin mólaránya 4:1.
b) HeLa-sejtek transzfekciója influenzapeptidkonjugátumokkal
HeLa-sejteket 6 cm-es csészékben tenyésztettünk, mint ahogyan megadtuk, a transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sűrűségnél végeztük el. A transzfekció előtt a sejteket 1,5 ml, 2% FCS tartalmú friss táptalajjal inkubáltuk. 160 μΐ HBS-ben (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH = 7,3) oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 160 pl HBS-ben oldott 6 pg TfpL190B konjugátummal kevertük össze, 15 perc után 10 pg P41pL influenzapeptid-polilizin-konjugátumot vagy összehasonlítás céljából 18 pg P16pL influenzapeptid-polilizin-konjugátumot (lásd a 13. példában) adtunk hozzá (20. ábra); a megadott mennyiségeket mindkét peptidkonjugátum esetében teszteltük arra nézve. hogy a géntranszfer felerősítésére az optimális mennyiséget képviseljék. További 15 perc elteltével a keveréket hozzáadtuk a sejtekhez. A sejteket 37 °C-on 4 órát inkubáltuk. utána 2 ml, 18% FCS tartalmú táptalajt adtunk hozzá. 24 óra múlva a sejteket kinyertük a luciferáz teszthez. A 20A. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek ossz luciferáz aktivitását mutatják.
A két peptidkonjugátummal végzett kísérletek öszszehasonlítása a géntranszfernek több mint 3,5-szeresen magasabb felerősítését mutatja a P41pL peptidkonjugátummal.
c) BNL CL. 2 sejtek transzfekciója influenzapeptidkonjugátumokkal
A BNL CL.2 sejteket a 6. példában leírtak szerint tenyésztettük. A P41 influenzapeptidet polilizin300-zal a peptid: poli lizin 1:1.3:1 és 8:1 moláris arányokkal konjugáltuk. 6 pg pCMVL-DNS és 20 pg konjugátum komplexét adtuk a sejtekhez. Összehasonlítás céljából 20 pg pL300-at vagy 20 pg P16-polilizin-konjugátumot, a 13. példában leírtak szerint előállítva, alkalmaztunk. A sejteket 37 °C-on 4 óráig inkubáltuk, utána hozzáadtunk 2 ml, 18% FCS tartalmú táptalajt. 24 óra elteltével a sejteket kinyertük a luciferáz teszthez, amelynek eredményeit a 20B. ábrán mutatjuk be. A konjugátumok peptidtartalma összhangban volt a génkifejeződés felerősödésével. Aliposzóma áteresztő-képesség meghatározásában (Liposomes Leakage Assay) (20C. ábra), amelyet úgy végeztünk el, mint a 13. példában, a konjugátumok (2,5 pg polilizinnek megfelelő, pH = 5) aktivitása peptid tartalmukkal együtt nőtt (az ábrán a P41 „influ2”-ként van jelölve).
75. példa
HeLa-sejtek transzfekciója egy $-galaktozidáz riportergénszerkezettel és a fi-galaktozidá; kifejeződés in situ kimutatása
a) A sejtek tenyésztése és transzfekciója
A transzfekcióhoz a HeLa-sejteket 5% FCS, penicillin, sztreptomicin és glutamin tartalmú DMEM táptalajban tenyésztettük az előző példákban megadottak szerint, 3 cm-es kultúrlemezen, fedőüvegeken (3 x 104 sejt/lemez).
A transzfekcióhoz a β-galaktozidáz riportergénszerkezet (pCMV-P-gal) 160 pl HBS-ben oldott 6 pgját 160 pl HBS-ben 12 pg TfpL190B-vel komplexbe vittük és 30 percig szobahőfokon inkubáltuk.
Egy másik kísérletben 160 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMV^-gal-t 80 pl HBS-ben 6 pg TfpL190B-vel 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltunk. Ezután a 13. példában előállított influenzapeptid-konjugátum (P16pL) 80 pl HBS-ben oldott 12 pg-ját adtuk hozzá és a keveréket további 15 percig inkubáltuk. Ezt a DNS-polikation-komplexet azután 1 ml DMEM + 2% FCS, antibiotikum és glutamin keverékével vegyítettük a fent megadottak szerint. Abból a célból, hogy a klorokinnak és az adenovírusnak a transzfekció teljesítő képességére kifejtett hatását megmutassuk, további kísérletekben a DNS-polikation-komplexeket tartalmazó táptalajhoz kiegészítésként 100 pM végkoncentrációban klorokint vagy 50 pl dl312 adenovírus törzsoldatot adtunk.
A transzfekcióhoz az eredeti szaporító táptalajt eltávolítottuk a sejtekről és 1 ml, a DNS-komplexeket klorokinnal vagy anélkül, illetve vírussal vagy anélkül tartalmazó táptalajt adtunk hozzájuk. 37 °C-on történő 2 órás inkubálás után 1 ml, 10% FCS, antibiotikum és glutamin tartalmú táptalajt adtunk a sejtekhez és folytattuk az inkubálást még 2 óráig. Ezután az egész táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket 3 ml friss DMEM + 10% FCS, antibiotikum és glutamin táptalajban tenyésztettük.
b) fi-galaktozidáz meghatározás
A transzfekció után 48 órával eltávolítottuk a táptalajt, a sejteket 1-szer mostuk foszfát-pufferben készített konyhasó oldattal (PBS) és PBS-ben oldott 0,5% glutáraldehiddel 5 percig fixáltuk szobahőfokon. Ezután a fixálószert eltávolítottuk és a sejteket 1-szer PBS-sel mostuk. Ezt követően a színezőoldattal (10 mM foszfát-puffer pH = 7,0,150 mM NaCl, 1 mM MgCl2,3,3 mM K4Fe(CN)6 3H2O, 3,3 mM K3Fe(CN)6 és 0,2% 5-bróm-4-klór-3-indol-p-galaktopiranozid) 37 °C-on 20 perctől 3 óráig inkubáltuk [Lim K. és Chae C. B., Bio Techniques 7, 576579 (1989)]. Ezután a fedőüvegeket PBS-ben, vízben és alkoholban leöblítettük, megszárítottuk és a tárgyasztalon Mowiol-ban befedtük. Az analízishez egy Zeiss Axiophot mikroszkópot használtunk.
A 21. ábra a mikroszkopikus nagyítások (112x) képeit mutatja. A: HeLa-sejtek, transzfekció 6 pg pCMV-^-gal-lal, komplexben 12 pg TfpL190B-vel. A β-galaktozidázt kimutató színreakció 3 óra alatt készült el. Az ábra azt mutatja, hogy nagyon kevés sejt (55 sejt; a megfestődött sejtek csoportját nyíllal jelöltük) fejezi ki a β-galaktozidáz gént. B: HeLa-sejtek, transzfekció 6 pg pCMV^-gal-lal, komplexben 6 pg TfpL190B-vel és 12 pg P16pL-lel. Színreakció: 3 óra. Kevés sejt (250 sejt) fejezi ki a β-galaktozidáz gént. A sejtek reakciója azonban erősebb, mint az A esetben. C: HeLa-sejtek, transzfekció 6 pg pCMV^-gal-lal, kom32
HU 211 925 A9 plexben 6 gg TfpL190B-vel és 12 gg P16pL-lel 100 gM klorokin jelenlétében. Színreakció: 3 óra. A sejtek számos csoportja mutat erős pozitív reakciót (több, mint 1000 sejt). D: HeLa-sejtek, transzfekció 6 gg pCMV-p-gal-lal, komplexben 12 gg TfpL190Bvel dl312 adenovírus jelenlétében. Színreakció 20 perc. Majdnem minden sejt (több, mint 90%) mutat pozitív reakciót. E: nem fertőzött HeLa-sejtek (kontroll a β-galaktozidáz reakció specificitásához). Színreakció: 3 óra.
16. példa
HeLa-sejtek transzfekciója egy 48 kb kozmiddal szabad adenovírus jelenlétében
a) Egy a luciferázt kódoló szekvenciát tartalmazó kozmid előállítása
Az egyetlen - a P. pyralis luciferázt kódoló - szekvenciát az RSV promoter kontrollja alatt tartalmazó 3,0 kb Sall-fragmentumot a p22RSVLuca plazmidból a Cl-7al kozmidklón egyetlenSall-helyére ligáltuk, konkatamerek képzése céljából. (A Cl-7al egy olyan, nyilvánvaló gént nem kódoló 37 kb humán genomiális DNS Sau3A-fragmentet (részleges emésztés) tartalmaz, amely a pW15 kozmidvektor BamHI-helyére van klónozva (stratagén)]. A ligációs reakció termékét ezután in vitro becsomagoltuk és a kapott fágpartikula egy részével E. coli MN544 törzset fertőztünk és LB amp lemezekre szélesztettük. A rekombinánsokat kolóniahibridizációval a 3,0 kb Sall-fragmentum (véletlenszerű feltöltéssel 32-P-jelölésű), mint hibridizációs szonda felhasználásával screeneltük és a pozitivek egy részét restrikciós térképezés segítségével analizáltuk. A Sall-inszertum egyetlen másolatát tartalmazó kozmid szerkezetet (CosLuc) tenyésztettük és céziumgradiensen tisztítottuk (teljes nagyság: 48 kb).
Előállítottunk egy kicsi, pWELuc (12 kb) kontrollkozmidot a CosLuc NotI-vei való emésztésével, religálással, baktériumok transzformálásával és a megfelelő plazmid izolálásával. Ez egy olyan 12 kb molekulát eredményezett, amelyből hiányzott a humánDNS-inszertum egy része és a CosLuc polilinkerének egy része. A pSPNeoLuc (8 kb) az 5. példában leírt plazmid, amely egy RSV-luciferáz-gén fragmentum (a pRSVL-nek egy Apal/Pvul-ffagmentuma, amely a pUCp-Locus Clal-helyére van klónozva).
b) A kozmid bevitele HeLa-sejtekbe ml DMEM + 2% FCS-sel befedett HeLa-sejteket (3 x 104 sejt/6 cm-es lemez) TfpL/DNS-komplexekkel - amelyeket a példák előtti bevezetőben leírtak szerint állítottunk elő és a megadott mennyiségű hTfpL-t, szabad polilizint és DNS-t tartalmazták - inkubáltunk. Az inkubációs keverékek kiegészítésként vagy 100 μΜ klorokint (1. és 2. hasábok) vagy 10 μΐ, 5 x 10” partikula/ml koncentrációjú dl312 adenovírust (3-12. hasábok) tartalmaztak. 2 órás, 37 “C-on történő inkubáció után minden lemezhez 4 ml DMEM + 10% FCS-t adtunk. 24 órával később a sejteket kinyertük és megmértük a luciferáz aktivitást. Az eredményeket a 22A. ábrán mutatjuk meg.
c) A kozmid bevitele neuroblasztóma sejtekbe ml DMEM + 2% FCS-sel befedett, GI-ME-N jelölésű neuroblasztóma sejtvonal sejtjeit [Dönti E. et al., Cancer Gént. Cytogenet. 30, 225-231 (1988)] (1 x 106 sejt/6 cm-es lemez) TfpL/DNSkomplexekkel - amelyeket a leírtak szerint állítottunk elő és a megadott mennyiségű hTfpL-t, szabad polilizint és DNS-t tartalmazták - inkubáltunk. Az inkubációs keverékek kiegészítésként vagy 100 μΜ klorokint (3. és 4. hasábok) vagy 10 μΐ, 5 x 1011 partikula/ml koncentrációjú dl312 adenovírust (5. és
6. hasábok) tartalmaztak. 2 órás, 37 °C-on történő inkubáció után minden lemezhez 4 ml DMEM + 10% FCS-t adtunk. 24 órával később a sejteket kinyertük és megmértük a luciferáz aktivitást. Az eredményeket a 22B. ábrán mutatjuk meg.
17. példa
Géntranszfer kémiailag kapcsolt adenovírus-polilizin-konjugátumokkal
a) Adenovírus-polilizin-konjugátumok előállítása kémiai kapcsolással
150 mM NaCl/25 mM HEPES (pH = 7,9)/10% glicerin keverékben levő dl312 adenovírus gélszűrt (Sephadex G-25 PD-10, Pharmacia) oldatának 2,35 ml-ét (körülbelül 10 partikula) 1 mM SPDP(Pharmacia)oldat 10 μΙ-ével (10 nmól) elegyítettük. 3,5 óra múlva szobahőmérsékleten a módosított vírust gélszűréssel (mint fent) elválasztottuk a reagens fölöslegtől. Az oldatot (2,5 ml) átmostuk argonnal és oxigén kizárása mellett, argon alatt, FITC-jelölésű, 2,3 nmól merkapto-propionát csoportokkal módosított polilizin (1 nmól) (az EP 388 758 európai szabadalmi leírás szerint előállítva) oldatának 42 μΙ-ével reagáltattuk. 18 órás szobahőfokon tartás után az oldat felét centrifugacsőbe töltöttük, 1 ml cézium-klorid oldattal (sűrűség 1,33 g/ml) óvatosan alárétegeztünk és 2 órán keresztül 35 000 rpm (5W60 rotor) mellett szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A vírus-szegélyt 200 μΐ cézium-klorid frakcióként gyűjtöttük össze és HBS/50% glicerin oldatával 1 ml-re hígítottuk. Egy DNS-kötés meghatározást végeztünk a módosított vírus 300 μΙ-ével: a vírus oldatot 1 ml HBSsel meghígítottuk és 35-S-jelzésű DNS (15 ng pRSVL, Nick-transzlációval előállítva) 100 μΐ oldatával elegyítettük. Kontrollként párhuzamos kísérletet végeztünk ugyanolyan mennyiségű, nem módosított dl312 vírussal. 30 perc után a próbákat centrifugacsö vekbe töltöttük, 1 ml cézium-klorid oldattal (sűrűség 1,33 g/ml) óvatosan alárétegeztünk és 2 órán keresztül 35 000 rpm (5W60 rotor) mellett szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A gradienst egyenként 5 frakcióba osztottuk; 1. frakció, 1 ml; 2. frakció, 0,6 ml;
3-5. frakció egyenként 200 μΐ. Megmértük a 200 μΙ-es frakciók radioaktivitását és a 23. ábrán mutatjuk be. A vírustartalmú (3-5.) frakciókban, főleg a 3. frakcióban nyilvánvalóan magasabb a radioaktivitás, mint a kontroll kísérletben. Ez a polilizin/módosított adenovírus és a jelzett DNS specifikus összekapcsolódására vezethető vissza, cézium-klorid jelenléte valószínűleg a komplexek részleges disszociációját okozza.
HU 211 925 A9
b) K562-sejtek transzfekciója
K562-sejteket (ATCC CCL 243) szuszpenzióban tenyésztettünk RPMI 1640 táptalaj (Gibco BRL + 2 g nátrium-bikarbonát/1) + 10% FCS, 100 egység/ml penicillin, 100 μΐ/μΐ sztreptomicin és 2 mM glutamin keverékében 500 000 sejt/ml sejtsűrűségig. 12-20 órával a transzfekció előtt a sejteket friss táptalajba tettük, amely 50 μΜ desz-ferri-oxamint tartalmazott (erre azért volt szükség, hogy a transzferrin receptorok számában növekedést érjünk el). A transzfekció reggelén a sejteket összegyűjtöttük, friss táptalajban, amely 10% FCS + 50 μΜ desz-ferri-oxamint tartalmazott szuszpendáltuk (250 000 sejt/ml) és 2-2 ml-t adagoltunk 24 bemélyedést tartalmazó lemezre. A pCMVL-DNS megadott mennyiségeit (6, 0,6, 0,06 pg) 100 μΐ HBSben 50 μΐ polilizin-adenovírus (pL Adeno) illetve a kontroll dl312 adenovírus megfelelő mennyiségével (35 pl) kevertük össze. 20 perc múlva mindig a megfelelő mennyiségű (12, 1,2, 0,12 pg) TfpL190B-konjugátumct 150 pl HBS-hez adtuk hozzá. További 20 perc elteltével a keveréket K562-sejtekhez adtuk. A sejteket 37 °C-on 24 óráig inkubáltuk és utána kinyertük azokat a luciferáz meghatározáshoz. A luciferáz aktivitás az előző példákban megadottak szerint történt. A 24. ábrán szereplő értékek a transzfekción átesett sejtek ossz luciferáz aktivitását mutatják.
c) HeLa-sejtek transzfekciója
Egy polilizin-víruskonjugátum aktivitásának ellenőrzésére egy módszer a konjugátum azon képességének felülvizsgálata, hogy nagyon kis DNS-mennyiségeket (kevesebb, mint 0,1 pg) tud-e szállítani. Megnövekedett DNS-transzfer kapacitást vártunk, amikor az adenovírus közvetlenül a polilizin által kondenzált DNS-hez van kötve, mivel az intemalizáló Faktorok (transzferrin és adenovírus (fehérje)] közvetlenül a szállítandó DNS-hez vannak kapcsolva. Ennek a feltevésnek a helyességét vizsgálandó konstans mennyiségű polilizin-adenovírus-konjugátumot (2,5 pl, körülbelül 5 x 107 víruspartikula) a riporterplazmid különböző mennyiségeivel (3-0,0003 pg) 475 pl HBS-ben komplexbe vittük. 15 perc szobahőfokon történő inkubálás után a DNS tömegének megfelelő mennyiségű transzferrin-polilizint adtunk minden próbához (ezt a menynyiséget TfpL-re választottuk meg, mivel ez a plazmidDNS 50%-ának teljes mértékű elektroneutralitását garantálja és egyidejűleg a vírus-polilizin-konjugátum számára kötési szabad teret biztosít). TfpL hozzáadása után a keverékeket 15 percig inkubáltuk, majd minden keveréket egy-egy 6 cm-es szaporító csészéhez adtunk, amelyek 300 000 HeLa-sejtet tartalmaztak 1 ml DMEM/2% FCS-ben. Ezután a sejteket 1,5 óráig 37 ’C-on inkubáltuk, majd 4 ml DMEM/10% FCS-t adtunk hozzájuk. Ezzel párhuzamosan ekvivalens mennyiségű DNS-t 2-szeres fölöslegben levő TfpLlel (a teljes mértékű DNS kondenzációhoz szükséges mennyiség) vittünk komplexbe és HeLa-sejtek géntranszferére használtuk fel (egyszer önmagában, egyszer 25 pl, polilizinhez nem kapcsolt dl 312 adenovírus készítmény jelenlétében). 24 óra után kinyertük a sejteket, kivonatokat készítettünk és részleteit luciferáz aktivitásra vizsgáltuk. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 25. ábrán mutatjuk be: adenovírus hiányában 0,3 pg DNS mennyiség alatt nem mutatható ki luciferáz aktivitás. Mind a polilizinhez kötött, mind a nem kötött adenovírus jól működött nagy DNS mennyiségeknél (3 pg és 0,3 pg). A nem kötött adenovírussal azonban 0,03 pg-nál egy csaknem 100-szoros aktivitás csökkenést és ez alatt a DNS mennyiség alatt elhanyagolható aktivitást figyeltünk meg. Ezzel ellentétben a polilizinhez kapcsolt vírus megtartja géntranszfer kapacitását mind 0,003, mind 0,0003 pg DNS mennyiségnél. Ez a DNS mennyiség megfelel körülbelül 150 DNS molekula/sejt és körülbelül 1 víruspartikula/sejt molekula koncentrációknak.
18. példa
Géntranszfer a polilizinhez enzimesen kapcsolt adenovírusokkal
a) Enzimreakció ml adenovírus készítményt (dl 312 törzs; 5 x 1010 PFU/ml) vittünk föl egy Sephadex G-25 gélszűrő oszlopra (Pharmacia), amelyet előzőleg 25 ml reakciós pufferrel (0,1 M Tris-HCl; pH = 8,0,2 mM DTT, 30% glicerin) ekvilibráltunk. Az elúció 3,5 ml reakciós pufferrel történt. A reakciós kiindulási elegy az enzimes kapcsoláshoz 1150 pl vírus-elúciós frakcióból, 0,5 nmól tengerimalac máj glutaminázból (TG) (Sigma), 2 nmól illetve 20 nmól polilizin290-ből, 10 mM CaCL-bóI és 1500 pl végtérfogatú reakciós pufferből áll. A reakciót 37 ’C-on 1 óráig végeztük, majd 30 pl 0,5 M EDTA hozzáadásával leállítottuk. A kapcsolás specificitásának kontrolljaként transzglutamináz nélküli reakciós összeállításokat is készítettünk. A be nem épült polilizint a vírusoktól centrifugálással választottuk el, CaCl-gradiens segítségével (sűrűség 1,33 g/ml; 170 000 g, 2 óra). A vírusokat tartalmazó frakciót leválasztottuk, azonos térfogatú glicerinnel elegyítettük, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és -70 ’C-ra állítottuk be.
b) A polilizin adenovírusokhoz való kötésének bemutatása
A reakciót olyan polilizinnel végeztük a fent leírtak szerint, amelyet előzőleg Bolton-Hunter Reagens (Amersham) segítségével 125J-vel jelöltünk. A CsCl-gradiens centrifugálás után a vírusfrakciót leválasztottuk és egy további CsCl-gradienssel szétválasztottuk. Ezután a gradienst frakcionáltuk és szcintillációs számláló segítségével minden frakcióban meghatároztuk a radioaktivitást. Mint ahogyan a 26. ábrán látható megmutatkozott, hogy a TG-t tartalmazó reakció-összetételnél (dl312/TG-pL) a radioaktív polilizin feldúsult a vírusfrakcióban (vírus). A kontroll összetételnél TG nélkül (d 1312/pL) nem dúsult fel a radioaktív polilizin a vírusfrakcióban.
c) Polilizinnel módosított adenovírus frakciók tesztelése a transzfekciós hatékonyságra gyakorolt hatásukat illetően
i) Sejtek és táptalajok
A transzfekcióhoz 5 x 105 sejtet (egér hepatociták;
HU 211 925 A9
ATCC No.: ΤΊΒ73) tenyésztettünk 10% hővel inaktivált magzati borjúszérum (FCS), 2 mM glutamin, 100
I. E./ml penicillin és 100 pg/ml sztreptomicin tartalmú DMEM táptalajban, 6 cm-es szaporító csészékben.
ii) Vírus-DNS-transzferrin-komplexek képzése
A mindenkori polilizinnel módosított vírusfrakció 50 μΙ-ét 10 pl HBS-ben oldott 6 μg pCMVL DNSplazmiddal kevertük össze és 20 percig szobahőfokon inkubáltuk. Ezután a keverékhez 8 pg egértranszferrinpolilizin290 B-t (mTfpL) adtunk és további 20 percig folytattuk az inkubálást.
iii) Egér hepatociták transzfekciója
A vírus-DNS-transzferrin-komplexeket 1,5 ml táptalajjal (DMEM + 2% FCS, 2 mM glutamin és antibiotikumok) kevertük össze és miután eltávolítottuk a régi táptalajt, a sejtekhez adtuk. 2 órás 37 'C-on történő inkubálás után a sejtekhez 2 ml, 10% FCS, glutamin és antibiotikum tartalmú DMEM-et adtunk. További 2 órás tenyésztés után az egész táptalajt eltávolítottuk és a sejtekhez 4 ml, 10% FCS, glutamin és antibiotikum tartalmú DMEM-et adtuk.
iv) A luciferáz kifejeződés meghatározása órával a transzfekció után kinyertük a sejteket és a fent leírtak szerint elvégeztük a luciferáz meghatározást. Amint az a 27. ábrából látható, a legerősebb kifejeződést (153 540 000 fényegység) az a víruskészítmény adta, amelynél az adenovírusokat TG-vel és 20 nmól polilizinnel kezeltük (dl312/TG-20 nmól pL). A TG-vel és 2 nmól polilizinnel kezelt (dl312/TG-2 nmól pL) víruskészítmény valamivel kevésbé volt aktív (57 880 000 fényegység). A kontroll frakció, amelynél az adenovírusokat 20 nmól polilizinnel kezeltük, de TG nélkül, csaknem 500-szor kevésbé volt hatásos. Összehasonlítás céljából további komplexeket használtunk transzfekcióhoz adenovírusokból kiindulva, amelyek sem TG-vel sem polilizinnel nem voltak kezelve (dl312). Ez a készítmény 4 403 000 fényegységet eredményezett.
d) A transzfekciós hatékonyság emelése polilizinnel módosított adenovírusok révén, összevetve nem módosított adenovírusokkal, különösen alacsony DNS mennyiségeknél
A transzfekciót a c) példában leírtak szerint végeztük el, ahol a komplexképzéshez 50 μΐ dl312/TG20 nmól pL adenovírus frakciót és 6 pg pCMVLuc(=pCMVL)/8 pg mTfpL, 0,6 pg pCMVLuc/0,8 pg mTfpL vagy 0,06 pg pCMV-Luc/0,08 pg mTfpL komplexeket alkalmaztunk. Összehasonlítás céljából 6 pg, 0,6 pg, 0,06 pg pCMVL/mTfpL-komplexekkel és nem módosított adenovírusokkal (dl312) is végeztünk transzfekciókat. Azt találtuk, hogy a polilizinnel módosított adenovírusok komplexei alacsony DNS mennyiségeknél is még magas kifejeződési értékeket adtak, ugyanakkor a nem módosított adenovírusoknál a kifejeződés erősen csökkent volt (28.ábra).
19. példa
Géntranszfer olyan konjugátumokkal, amelyekben az adenovírus és a polilizin között egy biotinsztreptavidin hídon keresztül történik a kötés
a) A dl312 adenovírus biotinilálása
150 mM NaCl/5 mM HEPES (pH = 7,9)/10% glicerin keverékben levő dl312 adenovírus gélszűrt (Sephadex G-25 PD-10, Pharmacia) oldatának 2,4 ml-ét (körülbelül 10*1 partikula) 1 mM NHS-LC-Biotin (Pierce 21335) oldatának 10 pl-ével (10 nmól) elegyítettük. 3 órás szobahőfokon tartás után a biotinnal módosított vírust a fölöslegben levő reagenstől gélszűréssel (mint fenn) választottuk el. Az oldatot glicerin hozzáadásával 40% glicerin koncentrációra állítottuk be (össztérfogat 3,2 ml) és - 25 °C-on tároltuk. A vírus biotineződését a különböző hígítások cellulóz-nitrát membránra történő csepegtetésével, kvalitatíven tudtuk kimutatni: 80 °C-on 2 óráig vákuum szárítószekrényben történő szántás után BSA-val blokkolás, inkubálás sztreptavidinnel konjugált alkalikus foszfatázzal (BRL), mosás és 1 órás inkubálás az NBT/X-foszfáttal (nitroblau-tetrazólium só/5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát, toluidin-só; Boehringer Mannheim) pozitív színreakciót eredményezett.
b) Sztreptavidin-polilizin-konjugátumok előállítása
A sztreptavidin polilizinnel történő kapcsolását
Wagner és munkatársai [Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)] és az EP-A1 388 758 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés által leírt módszer szerint végeztük el. 1 ml, 200 mM HEPES (pH = 7,9) és 300 mM NaCl keverékében oldott 79 nmól (4,7 mg) sztreptavidint SPDP 15 mM etanolos oldatával (236 nmól) kezeltünk.
1,5 óra szobahőmérsékleten tartás után a módosított fehérjét egy Sephadex G-25 oszlopon gélszűrtük, ahol 196 nmól ditio-piridin-linkerrel módosított 75 nmól sztreptavidin kaptunk. A módosított fehérjét 2,6 ml, 100 mM HEPES (pH = 7,9) és 150 mM NaCl keverékében oldott, 3-merkapto-propionáttal módosított polilizinnel (75 nmól, átlagos Iánchosszúság 290 lizinmonomer, 190 nmól merkapto-propionát-linkerrel módosítva) argonatmoszférában reagáltattuk. A konjugátumokat kationcserélő-kromatográfiával választottuk el egy Mono S-HR5-oszlopon (Pharmacia). (Gradiens: 20-100% puffer. A puffer: 50 mM HEPES pH = 7,9; B puffer: A + 3 M NaCl. A termékfrakció 1,2 M és 1,7 M sókoncentráció között eluált. A HBS-sel (20 mM HEPES pH = 7,3, 150 mM NaCl) szemben végrehajtott dialízis egy 45 nmól sztreptavidinből és 53 nmól polilizinből álló konjugátumot eredményezett.
c) HeLa-sejtek transzfekciója
HeLa-sejteket tenyésztettünk 6 cm-es szaporító csészékben, amint azt az 13. példában megadtuk. A transzfekciókat 300 000 sejt/lemez sűrűségnél végeztük. A transzfekció előtt a sejteket 1 ml, 2% FCS tartalmú friss táptalajjal inkubáltuk.
100 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 170 pl HBS-ben oldott 0,8 pg sztreptavidin-polilizinnel ke35
HU 211 925 A9 vertük össze. 20 perc után 170 μ] HBS-ben oldott 3 μ! polilizin pL300-at kevertünk hozzá. További 20 perc elteltével 65 μΐ biotinezett adenovírust, vagy kontrollként dl312 adenovírus megfelelő mennyiségét (30 pl kiindulási vírus a módosításhoz) adtunk hozzá. A komplex-keverékeket („biotinAdV/komplex A” illetve „kontroll AdV” lásd 29. ábra) további 20 percig állni hagytuk.
Egy alternatív komplexképzést végeztünk úgy, hogy 65 pl biotinezett adenovírust először 50 pl HBSben levő 0,8 pg sztreptavidin-polilizinnel kevertünk össze, 20 perc után 170 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t adtunk hozzá és további 20 perc elteltével 200 pl HBS-ben oldott 3 pl polilizin pL300-at kevertünk hozzá („biotin AdV/komplex B” komplexkeverék).
pl HBS-ben oldott 0,6 pg pCMVL-DNS-t 33 pl HBS-ben oldott 0,3 pg sztreptavidin-polilizinnel kevertük össze. 20 perc elteltével 65 pl biotinezett adenovírust, vagy kontrollként dl312 adenovírus megfelelő mennyiségét (30 pl kiindulási vírus a módosításhoz) adtunk hozzá. A komplex-keverékeket („biotinAdV/komplex A” illetve „kontroll AdV” lásd 29. ábra) további 20 percig állni hagytuk és azután HBS-sel 500 pl-re hígítottuk. Elvégeztük az alternatív komplexképzést úgy. hogy 65 pl biotinezett adenovírust először 50 pl HBS-ben levő 0.3 pg sztreptavidin-polilizinnel kevertünk össze, 20 perc után 50 pl HBS-ben oldott 0,6 pg pCMVL-DNS-t adtunk hozzá. A komplexkeveréket („biotin AdV/komplex B”) további 20 percig állni hagytuk és azután HBSsel 500 pl-re hígítottuk.
A keverékeket hozzáadtuk a sejtekhez. A sejteket 2 órán keresztül 37 'C-on inkubáltuk, majd 2,5 ml, 10% FCS-sel kiegészített friss táptalajt adtunk hozzájuk. A sejteket 24 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk és kinyertük a luciferáz meghatározáshoz. A luciferáz aktivitást úgy határoztuk meg. ahogyan azt az előző példákban megadtuk. A 29. ábrán megadott értékek a transzfekción átesett sejtek össz luciferáz aktivitását szemléltetik.
Ezzel párhuzamosan HeLa-sejtek olyan transzfekcióit végeztük el, ahol a konjugátum víruskomponenseként egy olyan biotinezett vírust használtunk fel, amelyet előzőleg psoralen/UV-kezeléssel inaktiváltunk. Az inaktiválás a következőképpen történt: Egy 1,6 cm-es szövetkultúra lemez két bemélyedésébe 200-200 pl biotinezett vírüskészítményt adtunk. Minden próbához 2 pl (33 mg/ml) 8-metoxi-psoralent (DMSO-ban) adtunk, a csészét jégre helyeztük és 10 percig UV-lámpával (365 nm; UVPTL-33 lámpa) sugároztuk be, ahol a próba távolsága a szűrőtől 4 cm-re volt. A besugárzás után egyesítettük a két próbát és gélszűrésnek vetettük alá (G50, Nick-oszlop, Pharmacia), ahol az oszlopot előzőleg 40% glicerin tartalmú HBS-sel ekvilibráltuk. 75 pl-es részleteket komplexbe vittünk 0,8 pg sztreptavidin-polilizinnel és HeLa-sejtek transzfekciójához használtuk fel a fent leírtak szerint.
Citopátiás végpont meghatározással megállapítottuk, hogy az inaktiválás következtében több, mint 104nel csökkent a vírustiter, mialatt a transzfekciós kapacitás magas koncentrációknál kevesebb, mint 50%-kal, és alacsonyabb koncentrációknál 5-szörösen csökkent.
d) K562-sejtek transzfekciója
K562-sejteket szuszpenzióban tenyésztettünk RPMI 1640 táptalaj (Gibco BRL + 2 g nátrium-bikarbonát/1) + 10% FCS, 100 egység/ml penicillin, 100pg/ml sztreptomicin és 2 mM glutamin keverékében 500 000 sejt/ml sejtsűrűségig. A transzfekció előtt 16 órával a sejteket 50 pM desz-ferrí-oxamin (Sigma) tartalmú, friss táptalajhoz adtuk. A transzfekció reggelén a sejteket 250 000 sejt/ml koncentrációig felvettük friss táptalajban, amely 10% FCS + 50 pM desz-ferrioxamint tartalmazott, és bemélyedésenként 2-2 ml-t adagoltunk 24 bemélyedést tartalmazó lemezre.
Három különböző típusú DNS-komplexet állítottunk elő: a) 160 pl HBS-ben (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH = 7,3) oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 160 pl HBS-ben oldott 12 pg TfpL190B konjugátummal kevertünk össze, 30 perc múlva 20 pl dl312 adenovíruskészítményt adtunk hozzá és a keveréket a sejtekhez adtuk.
b) 160 pl HBS-ben oldott 800 pg sztreptavidin-polilizint 20 pl biotinezett adenovírussal hoztunk össze mint a)-ban, kevertük, 30 perc után 160 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t adtunk hozzá és további 30 perc elteltével az oldatot összekevertük 160 pl HBSben oldott 10 pg TfpL190B konjugátummal. 30 perc múlva a sejtekhez adtuk a keveréket.
c) A DNS-komplexeket b) szerint állítottuk elő azzal a különbséggel, hogy TfpL190B helyett poli(L)-lizin p(Lys)290 3,5 pg oldatát adtuk hozzá.A sejteket 24 óráig 37 C-on inkubáltuk. majd kinyertük a luciferáz meghatározáshoz. A 30. ábrán bemutatott értékek a transzfekción átesett sejtek össz luciferáz aktivitását szemléltetik.
20. példa
Gén transzfer primer csontv elő-sejtekbe
a) Csontv elő-sejtek izolálása
Primer csontvelő-sejteket nyertünk ki egerekből azáltal, hogy szaporító táptalajt (10% FCS-t, 5 x 10 5 M merkapto-etanolt, 1% IL3-mal kondicionált táptalajt és antibiotikumokat tartalmazó IMDM) 1 ml-es ampullával összekötött injekciós tűvel (0,4 mm vagy 0,5 mm átmérőjű) izolált felső combcsonton és sípcsonton húztunk keresztül. A sejteket 100 xg mellett 8 percig tartó centrifugálással mostuk 1-szer a szaporító táptalajban. Ezután a sejteket 107 sejt/ml koncentrációnál reszuszpendáltuk és T25-szaporító palackokba kiszélesztettük. 4 óra elteltével a meg nem tapadt sejteket egy új T25-szaporító palackba tettük át és egy éjszakán keresztül 50 pM desz-ferri-oxamin jelenlétében tenyésztettük.
b) Adenovírus-transzferrin-polilizin/DNS-komplexek képzése
A komplexképzéshez 50 pl biotinezett adenovírust 400 pg, 20 pl HBS-ben oldott sztreptavidinnel módosított polilizinnel inkubáltunk 20 percig. Ezután 6 pg
HU 211 925 A9 pCMVL-t tartalmazó 20 μΐ HBSt adtunk hozzá. 20 perces inkubációs idő után 160 pl HBS-ben oldott 7 pg egértranszferrin-polilizi n-konj ugátumot (mTfpL) adtunk hozzá és az egész keveréket további 20 percig inkubáltuk.
c) Transzfekció
A csontvelő-sejteket a transzfekcióhoz 100 xg mellett 8 percig tartó centrifugálással elválasztottuk a táptalajtól. A sejtüledéket 3 ml, 2% FCS tartalmú és az adenovírus-transzfen-inpolilizin/DNS-komplexek 250 pl-ét tartalmazó szaporító táptalajban vettük fel és egy új T25-palackban 37 ’C-on tenyésztettük 3 órán keresztül. Ezután 3 ml, és további 2 óra elteltével 6 ml szaporító táptalajt adtunk hozzá, amely 10% FCS-t tartalmazott.
d) A luciferáz kifejeződés meghatározása
A transzfekció után 48 órával kinyertük a sejteket és mint a többi példában, luciferáz aktivitásra vizsgáltuk azokat. A transzfekció 310 χ 103 fényegység/100 pg összsejt-fehérjének megfelelő luciferáz aktivitáshoz vezetett.
27. példa
Neuroblasztóma sejtek transzfekciója egy 48 kb kozmiddal adenovírus jelenlétében
a) A luciferázt kódoló szekvenciát tartalmazó kozmid elkészítése
Egy P. pyralis luciferázt kódoló szekvenciát az RSV promoter [De Wet J. et al., Mól. Cell. Bioi. 7, 725-737 (1987)] kontrollja alatt tartalmazó 3,0 kb Sall-fragmentumot a Cl-7aAl kozmid klón egyetlen Sall-helyére ligáltuk konkatamerek képzése céljából. (A Cl-7aAl egy olyan, nyilvánvaló géneket nem kódoló 37 kb humán genomiális DNS Sau 3A fragmentumot (részleges emésztés) tartalmaz, amely a pW15 kozmid vektor stratagén BamHIhelyére van klónozva). A ligációs reakció termékét ezután in vitro becsomagoltuk és a kapott fágpartikula egy részével E. coli MN544 törzset fertőztünk és LB amp lemezekre szélesztettük. A rekombinánsokat kolónia-hibridizációval a 3,0 kb Sallfragmentum (véletlenszerű feltöltéssel 32-P-jelölésfí), mint hibridizációs próba felhasználásával screeneltük és a pozitivek egy részét restrikciós térképezés segítségével analizáltuk. A Sall-inszertum egyetlen másolatát tartalmazó kozmid szerkezetet (CosLuc) tenyésztettük és cézium-gradienssel tisztítottuk (teljes nagyság: 48 kb). Előállítottunk egy kicsi, pWELuc (12 kb) kontroll kozmidot a CosLuc Notl-vel való emésztésével, religálással, baktériumok transzformálásával és a megfelelő plazmid izolálásával. Ez egy olyan 12 kb molekulát eredményezett, amelyből hiányzott a humán-DNS inszertum és a CosLuc polilinkerének egy része.
b) A kozmid bevitele neuroblasztóma sejtekbe
A neuroblasztóma sejtvonal GI-ME-N jelölésű [Dönti E. et al., Cancer Génét. Cytogenet. 30, 225-231 (1988)] sejtjeit (6 cm-es csészénként 1 x 106 sejt) I ml DMEM + 2% FCS-sel fedtük be, és az anyagok és módszerek leírása szerint elkészített, a jelzett mennyiségű hTfpL-t, szabad pL-t és DNS-t tartalmazó TfpL/DNS komlexekkel inkubáltuk. Ahogyan jelezzük, a sejtek inkubációs keverékei kiegészítésként vagy 100 pM klorokint (3. és 4. hasáb) vagy 10 pl, 5 x 1011 partikula/ml d 1312 adenovírust (5. és 6. hasábok) tartalmaztak. Az utolsó két próba (StpL/biotin) 30 percig sztreptavidin-polilizinnel (0,8 pg, a 19. példa szerint előállítva) 150 pl HBS-ben inkubált 15 pl biotinezett dl312 adenovírust (1 x 10*1 partikula) tartalmazott. A próbához ezután 150 pl HBS-ben 6 pg DNS-t adtunk, 30 percig szobahőfokon állni hagytuk, amelyhez azután 150 pl HBS-ben 6 pg hTfpL + 1 pg szabad pL keverékét adtuk. További 30 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után a keveréket a sejtekhez adtuk. 2 órás 37 ’C-on történő inkubálás után minden csészéhez 4 ml DMEM + 10% FCS-t adtunk. 24 órával később kinyertük a sejteket és megmértük a luciferáz aktivitást. Az eredményeket a 31. ábra mutatja.
22. példa
Géntranszfer primer légúti hámsejtekbe molekuláris konjugátum vektorok alkalmazásával A cisztikus fibrózis genetikai javítására irányuló, a találmány szerinti molekuláris konjugátum vektorokat felhasználó kezdeti kísérletek alkalmazhatóságának értékelése azt mutatta, hogy a légúti hámból származtatott, el nem pusztuló sejtvonalak e géntranszfer módszerre érzékenynek bizonyultak. Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy ez a jelenség a légúti hám változásaira vezethető vissza, amelyeket a halhatatlanság vált ki, a transzferrin-polilizin molekuláris konjugátumokkal végzett kísérleteket primer légúti hámsejtekben (1 ΆΕ) is elvégeztük.
’AE-sejteket orrpolip próbákból nyertünk ki [Yankaskas J. R. et al., Genetics and Epithelial Cell Dysfunction in Cystic Fibrosis, Alán R. Liss, Inc., 139-149 (1987)]. A szövetet steril konyhasó oldatban mostuk, utána antibiotikumokkal kiegészített (penicillin 50 E/ml, sztreptomicin 50 pg/ml, gentamicin 40 pg/ml) Joklik’s féle MÉM táptalajban (Minimum Essential Médium = minimális létfenntartó táptalaj) 4 ’C-on a laboratóriumba-szállítottuk. A porc- és fölöslegben levő szubmukózus szövetet eltávolítottuk és az epiteliális rétegeket proteáz oldatban (Sigma, Typ 14, 0,1 mg/dl) MEM-ben 4 ’C-on 16-48 órát inkubáltuk. A proteáz semlegesítésére 10% FBS-t (borjúmagzat-szérum) adtunk hozzá és a sejteket enyhe mozgatással feloldottuk. A kapott szuszpenziót 10 pm-es nylonrácson szűrtük keresztül a sejttörmelék eltávolítása céljából, centrifugáltuk (150 xg, 5 perc) és F12 + 10% FBS keverékében mostuk.
Az 1’ AE sejteket ezután a luciferáz kódolásáért felelős plazmidot (pRSVL) riportergénként tartalmazó (fényegység) transzferrin-polilizin-konjugátumokkal (hTfpL) kezeltük. Ennél a vizsgálatnál a primer sejtek ezekre a komplexekre nem mutatták azt a fogékonyságot, mint a megfelelő halhatatlan sejtvonalak (1° AE: alapérték = 429 ± 41 fényegység; +hTfpL = 543 ± fényegység), amely azt bizonyítja, hogy az 1 ’AE sej37
HU 211 925 A9 tek viszonylag kevés transzferrin receptorral rendelkeznek.
Az 1 °AE sejtek felületén egy alternatív célreceptor kihasználására olyan konjugátumokat állítottunk össze, amelyekbe beépítettünk egy replikációra képtelen adenovírust a ligandum részeként (bAdpL; lásd 19a) és 19b) példákat) biotinezett adenovírus és sztreptavidinpolilizin konjugátumok előállítására; a luciferázt kódoló plazmidot riporter génként alkalmaztuk). Ezzel a konjugátummal kezelt humán 1 AE sejtek az alapértéknél szignifikánsan erősebb kifejeződést mutattak (+bAdpL - 2 585 753 ± 453 585 fényegység). Ezenkívül más fajok 1 AE sejtjei is nagyfokú érzékenységet mutattak az ezzel a módszerrel végzett géntranszferre (egér = 3 230 244 ± 343 153; majom = 53 498 880 ± 869 481 fényegység). Tehát az 1 °AE sejtekbe irányuló géntranszfer végrehajthatósága megalapozza ennek a megközelítésnek a használhatóságát a közvetlen in vivő géntranszfer elérésére.
23. példa
Géntranszfer hepatocitákba molekuláris konjugátum vektorokkal
a) Szövettenyészet sejtjeinek transzfekciója
Az egérembrió hepatocita BNL CL.2 sejtvonal sejtjeit (ATCC TIB 73) úgy tenyésztettük, ahogyan azt a 6. példában leírtuk. A HeLa-sejteket és a hepatocitákat 6 cm-es Petri-csészékben tenyésztettük. A transzfekciót körülbelül 3 x 105 sejt/csésze sejtsűrűségnél végeztük. A transzfekció előtt a standard táptalajt 1 ml, 2% FCS tartalmú friss táptalajjal pótoltuk.
b) Kettős komplexek képzése
Biotinezett adenovírusokat reagáltattunk (körülbelül 109 PFU. lásd a 19.a) és 19.b) példát) 50 μΐ HBSben 800 ng sztreptavidinnel módosított polilizinnel. 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 170 μ] HBS-ben oldott 6 μg pCMVL-DNS-t adtunk hozzá, 30 percig inkubáltuk és azután 200 μΐ HBS-ben oldott 3 pg pL300- at adtunk hozzá és további 30 perc elteltével az oldatot felhasználtuk transzfekciós kísérletekhez.
c) Hármas komplexek képzése
Adenovírust és transzferrint tartalmazó hármas komplexeket a következők szerint képeztünk: biotinezett adenovírusokat reagáltattunk (körülbelül 109 PFU) 800 pg sztreptavidinnel módosított polilizinnel. 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 170 pl HBS-ben oldott 6 pg plazmid DNS-sel kevertük öszsze, 30 percig inkubáltuk és azután 200 pl HBS-ben oldott 10 pg transzferrin-polilizint TfpL190B-t [Wagner E. et al., Bioconjugate Chemistry 2, 226-231 (1991)] adtunk hozzá és további 30 perc elteltével az oldatot felhasználtuk transzfekciós kísérletekhez.
d) $-galaktozidáz meghatározás
BNL CL.2-sejteket fedőlemezekre szélesztettünk ki és 24 óra múlva a sejteket a pCMV-p-gal riporter génnel [Lim K. és Chae C. B., BioTechniques 7, 576579 (1989)] transzfekciónak vetettük alá. 48 órával később elvégeztük a Lim és Chae szerinti β-galaktozidáz tesztet.
Kettős transzport komplexek. Biotinezett adenovírust kombináltunk sztreptavidinnel módosított polilizinnel. Egy másik módon adenovírust kötöttünk polilizinhez kovalensen, transzglutamináz segítségével. Az adenovírus-polilizin konjugátumot DNS-hez adtuk, hogy a DNS és polilizin között komplex képződjön, semlegesítve a DNS negatív töltéseinek egy ismert (körülbelül 1/4) részét. Ezután számított mennyiségű polilizint adtunk hozzá a maradék töltések semlegesítésére. Az így létrejött, a DNS-t az adenovírus-polilizin konjugátumhoz és polilizinhez kötve tartalmazó komplexeket kettős transzport komplexeknek nevezzük.
Lényegében kétféle lehetőség van kettős transzfer komplexek összeállítására. A DNS-t köthetjük a sztreptavidinnel módosított polilizinhez és utána kapcsoljuk a biotinezett adenovírushoz, vagy az adenovírust kötjük először a polilizinnel és utána visszük komplexbe a DNS-sel. Az utóbbi eljárás egyértelműen jobb eredményeket hozott, különösen alacsony DNS bevitelnél, ezért ezt az eljárást részesítjük előnyben mind kettős, mind hármas komplexek összeállításánál.
Transzferrint tartalmazó hármas transzport komplexek. Az adenovírus-polilizin konjugátumokat DNS-hez adtuk, hogy a DNS és polilizin között komplex képződjön, semlegesítve a DNS negatív töltéseinek egy ismert (körülbelül 1/4) részét. Ezután számított menynyiségű transzferrin-polilizin konjugátumot adtunk hozzá a maradék töltések semlegesítésére. A DNS-t, adenovírus-polilizint és transzferrin-polilizint tartalmazó komplexeket hármas komplexeknek nevezzük. Elvileg egy ilyen hármas komplexnek rendelkeznie kell az endocitózis képességével a sejtfelületi adenovírusvagy transzferrin-receptorokhoz való kötődés révén.
A DNS-kondenzátumok és az adenovírus összekötése nagymértékben felerősíti a luciferáz-riportergén kifejeződést. A dl312 adenovírus törzs és a polilizin közötti fizikai kapcsolódást létrehozhatjuk vagy a két komponens transzglutaminázzal való inkubálásával, vagy az adenovírus biotinezésével és a polilizin sztreptavidinnel történő módosításával. Az így létrejött kötésnek a transzfekciós hatékonyságra kifejtett hatását a
32. ábrán mutatjuk be, ahol hepatocitákat inkubáltunk transzferrin-polilizin-DNS komplexekkel (TfpL) klorokin jelenlétében vagy adenovírus jelenlétében (Adeno V + TfpL). A transzferrinfekció (ez a kifejezés transzferrin közvetítette transzfekciót jelent) szabad adenovírus jelenlétében emelkedett, a transzferrin-polilizin-DNS komplexek sejtbe történő kiengedésének tipikus fokozódását mutatva. A pLAdenoV/TfpL hasábok az adenovírussal végzett transzfekciók eredményeit mutatják, amelyeket először transzglutamináz segítségével polilizinnel konjugáltunk, majd DNS-sel reagáltattunk a DNS negatív töltéseinek egy részét semlegesítve. Később transzferrin-polilizint adtunk hozzá, amely a maradék negatív töltéseket semlegesítette. Ily módon egy hármas komplex, adenovírus-polilizin/transzferrin-polilizin/ /DNS képződött. Mint az az ábrából világosan látható, kivételesen magas értéket,
HU 211 925 A9
1,5 x 109 fényegységet értünk el (ez körülbelül 5000 fényegységnek felel meg sejtenként). Az AdenoV+ +pL+TfpL hasáb szemléltette kísérletekhez az adenovírust és a polilizint úgy kevertük össze, mint a transzglutaminázzal való kezeléshez. Az enzimet azonban elhagytuk, hogy kimutassuk a polilizin adenovírushoz való kötődésének transzglutamináz okozta specificitását. A víruskészítményt ugyanazzal a DNS és TfpL mennyiséggel vittük komplexbe, mint a pLAdenoV/TfpL-nél. Ebben az esetben ugyanolyan mérsékelt transzfekciót értünk el, mint AdenoV + TfpL esetében, mivel mindkét kísérletnél sztochasztikus folyamat az adenovírus és a DNS/transzferrin-polilizin-komplex együttes lokalizációja, ellentétben a pLAdenoV/TfpL hasáb mutatta kísérlettel, ahol a vírusnak és a DNS-nek a hármas komplexen keresztül való fizikai kötődése révén létrejött együttes lokalizáció a transzferrinfekció nagy mértékéhez vezetett.
K562-sejtek transzfekciója mutatja az adenovírus endoszóma-litikus tulajdonságait. A humán eritro-leukémia K562-sejtvonal sejtjei körülbelül 150 000 transzferrin receptorral rendelkeznek [Klausner R. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 2263-2266 (1983)]. Ezekben a sejtekben klorokin jelenlétében még adenovírus nélkül is nagymértékű transzferrinfekciót lehet elérni TfpL/riporter-DNS-komplexekkel (33. ábra, TfjpL), mint ahogyan erről már Cotten és munkatársai [Cotten M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033-4037 (1990)] is hírt adtak. Ugyanezek a komplexek szabad vírus hozzáadásával (AdenoV/ /TfpL), de klorokin nélkül viszonylag gyenge riportergén kifejeződést adnak vélhetően azért, mert a K562-sejtek más vérsejtekhez hasonlóan kevés számú adenovírus receptorral rendelkeznek [Silver L. et al., Virology 165, 377-387 (1988); Horváth J. et al., J. Virol. 62, 341-345 (1988)]. Ha az adenovírust egy biotin-sztreptavidin hídon keresztül polilizinhez kötjük és a riporter-DNS-t több polilizin hozzáadásával teljesen kondenzáljuk, hogy a kettős komplexet teljessé tegyük (pLAdeno V/pL), az adenovírussal támogatott transzfekció közepes értékeket ér el. Vélhetően azért, mivel hatásosan használjuk ki a K562 sejteken levő kevés számú adenovírus receptort. Ha azonban az adenovírus-polilizinnel komplexbe vitt DNS-t teljesen kondenzáljuk és transzferrinpolilizin hozzáadásával egy hármas komplex (pLAdenoV/TfpL) keletkezése közben semlegesítjük, és a számtalan sejtfelületi transzferrin receptor játékteret kap, a transzfekciós hatékonyság - mind a hatékony transzferem kötődésnek, mind a vírus endoszóma-litikus aktivitásának köszönhetően - legalább két további nagyságrenddel emelkedik (33. ábra).
Hármas DNS-komplexek a hepatociták közel 100%-ánál riportergén kifejeződéshez vezetnek. Az új DNS transzport-komplexek hatékonyságát egér hepatocitákban (BNL CL.2) teszteltük, meghatározva a sejteknek azt a %-át, amely különböző transzfekciós eljárásainkkal elérhető. A sejteket CMV promoter irányította β-galaktozidáz riportergénnel fertőztük. A sejtek fixálása után meghatároztuk a β-galaktozidáz aktivitást [Lim K. és Chae C. B., Bio Techniques 7, 576-579 (1989)]. A 34. ábra mutatja a β-galaktozidáz meghatározását egér hepatocitákban a) transzfereinfekciónál klorokin jelenlétében, b) transzfereinfekciónál szabad dl312 adenovírus jelenlétében és c) adenovírus (dl312)polilizin-transzferein-DNS hármas komplexekkel végzett transzfekciónál. Adenovírus hiányában a riporter DNS standard transzferrinfekcióját követően csak kevés sejt fejezi ki a riportergént. A transzfekció százalékos aránya kevesebb, mint 0,1%. Ha klorokint használunk, a százalékos arány körülbelül 0,2%-ra nő. (34A. ábra). Szabad adenovírus jelenlétében a sejteknek körülbelül 5-10%-a fejezi ki a riportergént (34B. ábra), mialatt a hármas komplexek transzglutaminázzal módosított vírussal a legtöbb, ha nem az összes sejtnél génkifejeződéshez vezetnek (34C. ábra). Mivel a hármas komplexeket nagy hígításokban alkalmazhatjuk, általában nem következik be a szabad (inaktivált) adenovírus nagy adagjainál megfigyelt toxikus hatás. Azt azonban figyelembe kell venni, hogy a hármas komplexeknek - a szövetkultúra sejtek 100%-ának elérése céljából - nagy koncentrációban történő alkalmazásánál egy hasonló toxikus hatás észlelhető. A toxikus hatások oka a maradék virális génaktivitásban vagy a hozzáadott vírus endoszóma-litikus tulajdonságaiban rejtőzhet, vagy lehet egyszerűen a bevitt gén magas kifejeződésének következménye.
Egy transzfekcióval bevitt riportergén hatása átmeneti, de nem szaporodó hepatocitákban hetekig eltartó. Hármas komplexeket (pLAdenoV/TfpL) állítottunk elő polilizin-adenovfrussal és olyan módosított adenovírussal, amely még psoralennel is inaktiválva volt. Egy 2/3 részben egybefüggő hepatocita-sejtkultúrát a 34B. ábrán bemutatott kísérlethez hasonlóan, a pCMVL luciferáz riporter-plazmiddal transzfekciónak vetettünk alá és különböző időpontokban mértük a luciferáz aktivitást. Amint az a 35. ábrából látható, a luciferáz aktivitás 3 nap után - amikor a hepatocita-sejtkultúra egybefüggő lett és a sejtek abbahagyták a szaporodást - lett a legmagasabb. A riportergén kifejeződés fennmaradt a nem szaporodó sejtkultúrában anélkül hogy a gén hordozására nézve szelekciót végeztünk volna, és legalább 6 hétig eltartott, különösen abban az esetben, amikor a hármas komplexben psoralennel inaktivált adenovírust alkalmaztunk.
24. példa
Csirke adenovírus CELO alkalmazása a humán sejtekbe történőDNS-transzport felerősítésére Ebben a példában a CELO csirke adenovírust teszteltük az előző példákhoz hasonlóan, amelyekben a humán adenovírus 5 típust vizsgáltuk, hogy alkalmas-e humán HeLa-sejtekbe történő DNS-transzfer felerősítésére.
Csirke adenovírust, CELO-t (Phelps törzs, FAV-1,7 szerotípus, csirkevese-sejtpasszázs) használtunk. A vírust (2 ml) 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl (HBS) + 10% glicerin keverékével ekvilibrált, PD-10 gélszűrő oszlopon hajtottuk át, az eluátum 2 ml-ét 20 μΐ 1 mM NHS-LC-biotinnal (Pierce) szobahőmérsékleten 3 óráig reagáltattuk. A biotinezett vírust ez39
HU 211 925 A9 után 3 x 300 ml HBS + 40% glicerin keverékével szemben 4 C-on dializáltuk és részletekben -70 °C-on tároltuk.
HeLa-sejteket (5 x 105 sejt/6 cm-es csésze) 2 ml DMEM + 2% FCS keverékében a polilizin- (pLys) vagy transzferrin-polilizin(TfpL)-keverékekkel komplexbe vitt pCMVL plazmid 6 pg-jával 500 μΐ HBSben inkubáltunk (a komplexeket szobahőfokon 30 percig előinkubáltuk). A próbákat ezután 37 ’C-on, a 36. ábrán megadott vírusmennyiségek jelenlétében a sejtekhez adtuk. Azoknál a próbáknál, amelyek a biotinezett CELO vírust tartalmazták, a megadott vírusmenynyiséget a megadott mennyiségű sztreptavidinpolilizinnel (StrpL) 200 μΐ HBS-ben 30 percig szobzhőfokon előinkubáltuk, mielőtt a pCLuc plazmid 6 pg-ját 100 μΐ HBS-ben hozzáadtuk. 30 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után a TfpL-anyag megadott mennyiségét adtuk a sejtekhez 37 ’C-on. 2 órával később 5 ml DMEM + 10% FCS-t adtunk a sejtekhez, 24 óra múlva kinyertük a sejteket és előkészítettük a luciferáz meghatározáshoz. Az eredményeket a 36. ábrán mutatjuk be.
Mint ahogyan a 36. ábra mutatja, a CELO vírus szabad formában felerősítette a DNS-transzportot HeLa-sejtekbe (1-6. hasábok). Ha azonban a CELO vírust biotinnal módosítottuk és sztreptavidinnel komplexbe vittük, azt találtuk, hogy a vírus mind transzferrin-polilizin kiegészítéssel, mind anélkül a humán dl312 adenovírussal elérttel összehasonlítható mértékben erősíti fel a DNS-transzfert. HeLa-sejtek speciális sejtvonala magas kötési kapacitást mutat polilizin/DNS-komplexekkel transzferrin nélkül (vesd össze a 36. ábra 1. és
4. próbáinak luciferáz aktivitásait). Tehát a komplex felvételéhez elegendő a CELO vírus bezárása egy polilizin-DNS-komplexbe.
25. példa
Mioblasztok transzfekciója a) Mioblasztok és miotubok transzfekciója DNS/transzferrin-polilizin-komplexekkel szabad adenovírus és biotin-sztreptavidinen keresztül kapcsolt adenovírus jelenlétében
C2C12 mioblasztokal (ATCC Nr.: CRL 1772) [Blau H. et al., Science 230, 758-766 (1985)] és G8 mioblasztokal (ATCC Nr.: CRL 1456) „magas glükóz tartalmú DMEM” + 10% FCS táptalajban tenyésztettünk. A mioblaszt kultúrákat körülbelül 5 x 105 sejt/ /6 cm-es csésze összefüggő sejtrétegnél vetettük alá transzfekciónak. Miotubok tenyészetét állítottuk elő azáltal, hogy mioblasztokat 6 cm-es csészékbe kiszélesztettünk (körülbelül 5 x 105 sejt/csésze) és amikor a sejtek összefüggő réteget alkottak, a táptalajt „magas glükóz tartalmú DMEM' + 2% lószérum keverékével cseréltük ki [Barr E. és Leiden J„ Science 254, 1507— 1509 (1991); Dhawan J. et al., Science 254, 1509-1512 (1991)]. A miotubok transzfekcióját 5-7 nappal később végeztük el. A transzfekciós komplexeket úgy állítottuk elő, ahogyan azt a 19. példában leírtuk a TfpL, StrpL és biotinezett dl312 adenovírus megadott mennyiségeit alkalmazva. A sejteket a transzfekció után 20 órával kinyertük és megmértük a luciferáz aktivitást. A 37. ábrán megadott luciferáz aktivitás az összes sejtpróbára vonatkozik. Mind a mioblaszt- mind a miotubkultúráknál magas transzfekciós hatékonyságot tudtunk elérni. A miotubok differenciálódása révén a transzfekciós hatékonyság kevesebb, mint 1 lóg értékkel esett vissza (C2C12) vagy nem mutatott szignifikáns csökkenést (G8). A miotubok képződésében való részvétel a G8-sejtvonalnál kisebb gyakoriságnál következik be, amely részben felelős lehet a kimutatható teljesítő képesség csökkenés hiányáért a differenciált tenyészetben. A transzferrin és a transzferrin receptor közötti kölcsönhatás szerepe a DNS-transzportban ennél a sejttípusnál nem volt lényeges. Mind a négy sejtkészítménynél csak gyenge DNS-transzport ment végbe TfpL/DNS-komplexek szabad dl312 adenovírus jelenlétében történő alkalmazásakor (1., 4„ 7. és 10. hasábok). Kapcsolt vírusrendszer alkalmazásakor a transzfekció teljesítő képessége felerősödött (2., 3., 5., 6., 8„ 9„ 11. és 12. hasábok). Összehasonlítva a csak polilizin/StrpL-t és vírust tartalmazó, kombinációs komplexekkel elért géntranszfert olyan komplexek eredményeivel, amelyek a transzferrin-polilizint magukba zárják, a teljesítő képességnek kisebb, mint 1 lóg növekedése adódott (vesd össze például a 2. nyomvonalat, ahol transzferrin nélkül a 3.-kai, ahol transzferrin jelenlétében történt transzfekció). A csekély transzfekció szabad vírussal és az erős transzfekció kapcsolt vírus-komplexekkel mind transzferrin-polilizin jelenlétében, mind anélkül azt sejteti, hogy ezeknél a sejteknél az adenovírus ligandumként szolgál és kapcsolás nélkül a szabad vírus be tud hatolni a sejtekbe, a TfpL/DNS-komplex azonban nem lép be produktív mennyiségben (az ebben a példában alkalmazott pCMVL-DNS-t az ábrán pCLuc jelöléssel illetjük).
b) A transzfekciós gyakoriság hisztokémiai analízise miotubokban
C2C12 miotubkultúrákat állítottunk elő (5 x 105 mioblaszt sejtet 6 cm-es csészékbe kiszélesztettünk, miotubokra differenciáltuk), mint azt a)-ban leírtuk. A szabad vírussal végzett próbáknál pCMVP-gal DNS-t (6 pg) 8 pg TfpL-lel 500 pl HBS jelenlétében komplexbe vittünk és 2 ml DMEM/2% FCS-ben 18 pl dl 312 adenovírus (1 x 1012 víruspartikula/ml) jelenlétében a sejtekhez adtuk. A kapcsolt vírussal végzett próbáknál komplexbe vittünk pCMVLacz DNS-t (6 pg) 500 pl HBS-ben 7 pg TfpL + 800 ng StrpL + 18 pl biotinezett dl312 adenovírus (1 x 10’2 vírus/ml) keverékével, és 2 ml DMEM/2% FCS-ben a sejtekhez adtuk. 24 órás inkubáció után a sejteket, mint azt a 15. példában leírtuk, megfestettük a β-galaktozidáz aktivitás meghatározásához.
A β-galaktozidáz színminták egybeestek azoknak a transzfekcióknak az eredményeivel, amelyeknél riportergén termékként luciferázt [lásd a)] alkalmaztunk. A miotubkultúrákban nagyon alacsony génkifejeződést kaptunk szabad vírus alkalmazása esetén, miközben a vírus DNS-hez való kötése magas génkifejeződési nívót eredményez. A kékszínű, sokmagvú tubulusok je40
HU 211 925 A9 lenléte mutatta egy gén sikeres transzferét ezekbe a differenciálódott sejtekbe szabad adenovírus jelenlétében.
c) DNS-transzfer primer egérmioblaszt- és egérmiotubkultúrákba
Egy 4 hetes hím C57B1/6 egér két hátsólábának nagy vázizomzatát sterilen, PBS-ben izoláltuk és körülbelül 5 mm-es darabokra aprítottuk. A szövetet 20 ml PBS-ben szuszpendáltuk, körülbelül 2 percig hagytuk leülepedni és a maradékot leszívtuk. Ezt a mosási műveletet 3-szor ismételtük. A szövetet ezután 3,5 ml PBS + 0,5 ml tripszin/EDTA, 0,5 ml 1%-os (tömeg/térfogat) kollagenáz (IITyp, Sigma) és 0,5 ml 1%-os BSA (V frakció 4 mM CaCl2-ban) keverékével összekevertük és 37 °C-on 30 percig gyakori óvatos rázogatás mellett inkubáltuk. A 30 perces inkubálás végén a maradék szövetet hagytuk leülepedni, a maradékot eltávolítottuk és 5 ml DMEM + 20% FCS-sel kevertük össze. A proteázzal történő inkubálást 3-4-szer ismételtük, amíg a szövet teljesen diszpergált állapotú nem lett. A sejtszuszpenziót ezután egy sejt-szitán (Falcon) szűrtük át aggregátumok és szövetdarabkák eltávolítása céljából, és 500 xg mellett 15 percig centrifugáltuk. A sejtpelletet 10 ml DMEM + 20% FCS-ben reszuszpendáltuk és eltávolítottuk a fibroblasztokat úgy, hogy a sejteket 60 perc időtartamra egy 15 cm átmérőjű, fedetlen szaporító csészére szélesztettük ki. A meg nem tapadt sejteket azután óvatosan eltávolítottuk és öt, lamininnal rétegzett 10 cm-es szövettenyésztő csészére, csészénként 15 ml DMEM + 20% FCS keverékében szélesztettük. Az összefüggő sejtréteg elérése után (körülbelül 1 héttel később) a sejteket tripszinnel kezeltük és csészénként körülbelül 1 x 106 sejtet lamininnal rétegzett 6 cm-es csészére újraszélesztettünk. Miotubkultúrák képzése céljából körülbelül 5 nappal később (amikor a sejtek összefüggő réteget képeztek) a táptalajt DMEM + 2% lószérumra cseréltük ki, és egy héttel később transzfekciókat végeztünk. A mioblaszt kultúrák transzfekcióját 6 cm-es csészékben körülbelül 80%-os összefüggő sejtrétegnél végeztük el.
A lamininnal rétegzett sejtkultúra lemezeket a következőképpen állítottuk elő; sejtkultúra lemezeket steril vízben oldott 0,025 mg/ml polilizinnel (móltömeg: 30 000-70 000, Sigma) rétegeztünk szqbahőmérsékleten 30 percig. A lemezeket 3-szor mostuk steril vízzel és levegőn szárítottuk. Ezután a lemezeket 8 pg/ml laminin (EHS, Sigma) vizes oldatával egy éjszakán át rétegeztük. A lemezeket azután a sejtek szélesztése előtt 3-szor mostuk.
A transzfekcióhoz felhasznált DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy a psoralen/UV-inaktivált, biotinezett dl312 adenovírus (a 19. példa szerint előállítva) megadott mennyiségét 150 pl HBS-ben meghígítottuk, 150 μ HBS-ben oldott 1 pg StrpL-t adtunk hozzá és végül szobahőfokon 30 percig inkubáltuk. Ezután minden próbához 6 pg pCMVL-t (az ábrán pCLuc-ként jelölve) tartalmazó 100 pl HBS-t adtunk és további 30 percig szobahőfokon inkubáltuk. Lezárásként minden próbához 100 pl HBS-ben 7 pg Tfp L-t adtunk, 30 percig szobahőfokon inkubáltuk és azután a 6 cm-es csészékben, 2 ml DMEM + 20% FCS tartalmú mioblaszt- vagy miotubkultúrákhoz adtuk hozzá. 1 órás inkubálás után a táptalajt 5 ml DMEM + 20% FCS-sel (mioblasztok) vagy DMEM + 2% lószérummal (miotubok) pótoltuk, és a sejteket 48 órával később kinyertük a luciferáz analízishez. Az összes sejtpróba luciferáz aktivitás értékeit a 38. ábrán szemléltetjük.
26. példa
A mioblasztokba CELO vírussal történő transzfer javítása lektin-ligandum alkalmazásával
a) dl312 adenovírus és CELO vírus összehasonlító analízise HeLa-sejtekben és C2C12 mioblasztokban
HeLa-sejtek vagy C2C12 mioblasztok próbáit (5 x 105 sejt/ 6 cm-es csésze) fertőztük 6 pg pCMVL-lel (az ábrán pCLuc-ként jelölve), amelyet előzőleg 1 pg Strp L/7 pg TfpL + 5 pl biotinezett dl312 adenovírus (lásd a 19. példát, 1 x 10'2 víruspartikula/ml) vagy 18 pl biotinezett CELO vírus (lásd a 24. példát 0,3 X 1012 víruspartikula/ml) keverékével vittünk komplexbe. 20 órás inkubáció után kinyertük a sejteket és előkészítettük a luciferáz meghatározáshoz. A 39. ábra mutatja minden összesített sejtpróba luciferáz aktivitását.
HeLa-sejtek transzfekcióját összevethető hatékonysággal végeztük el humán dl312 adenovírus/Strp L/Tfp L/DNS-komplexek alkalmazásával, amelyek a sejtekbe vagy adenovírus receptoron vagy transzferrin receptoron keresztül léphetnek be, vagy CELO vírus/Strp L/Tfp L/DNS-komplexekkel, amelyek a transzferrin receptoron keresztül léphetnek be. Miközben azonban a DNS-transzfer C2C12 mioblasztokba d 1312 adenovíruskomplexekkel hatékonyan elvégezhető volt, a CELO vírus-komplexek ezekben a sejtekben rosszul működtek. Korábbi példák mutatták, hogy a transzferrin receptor a kombinációs komplexek transzportjánál ezekben a sejtekben csak csekély szerepet játszik; vélhetően az adenovírus receptor a fő belépési hely. A CELO vírus gyenge aktivitását mioblasztokban tehát mind a CELO vírusnak, mind a transzferrinnek a C2C12 mioblasztokon való gyenge kötődésére kellene visszavezetnünk.
b) C2C12 mioblasztok CELO vírussal történő transzfekciójának javítása búzacsíra-agglutinin ligandumként való felhasználásával
Az a) szerint kapott gyenge transzport alapján egy új ligandumot választottunk ki a transzferrin helyettesítésére.
A biotinezett búzacsíra-agglutinint (2-4 mól biotin/mól fehéije) Boehringer Mannheimtől szereztük be. Biotinezett CELO vírust állítottunk elő, mint ahogyan már leírtuk. 6 pg pCMVL + a megadott mennyiségű StrpL, TfpL, biotinezett búzacsfraagglutinin (biotinyliertes Weizenkeimagglutinin = WGA-B) és CELO vírus tartalmú komplexeket állítottunk elő a következők szerint.
A vírust és a búzacsíra-agglutinint (WGA) együtt hígítottuk meg 150 pl HBS-ben. Az StrpL-t ugyanígy 150 pl HBS-ben hígítottuk meg, a két oldatot összekevertük és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A
HU 211 925 A9
100 μ] HBS-ben hígított DNS-t hozzáadtuk a StrpL/vírus/WGA oldathoz, ezt követte egy további 30 perces inkubálás szobahőfokon. Végül a TfpL-t 100 μΐ HBSben hozzáadtuk a keverékhez és a próbát szobahőfokon újból 30 percig inkubáltuk. A komplexeket 2 ml DMEM + 2% FCS-ben levő C2C12 mioblasztokhoz (5 x 105 sejt/6 cm-es csésze) adtuk hozzá. Egy órával később 5 ml DMEM + 10% FCS-t adtunk a sejtekhez és 20 órával később előkészítettük a sejteket a luciferáz aktivitás méréséhez. Minden összesített sejtpróba luciferáz aktivitását (fényegységben) a 40. ábrán mutatjuk be (az ebben a kísérletben alkalmazott DNS pCMVL volt, amit az ábrán pCLuc-ként jelöltünk).
Vírus nélkül nagyon gyenge DNS-transzfert kaptunk mind búzacsíra-agglutininnel, mind nélküle (1. és 6. hasábok). Közepes transzportot értünk el kapcsolt CELO vírussal (2. hasáb), 16-szoros növekményt értünk el azonban amikor a komplex WGA-B-t tartalmazott. A WGA mennyiségének növelése a komplexben (1 pg-ról 5 pg-ra) egy gyenge csökkenést okozott a transzferben (vesd össze a 3. és 4. hasábokat), ugyanakkor a StrpL tartalom növelése a komplexben (1 pgról 2 pg-ra) a transzfert kissé erősítette vesd össze a 3. és 5. hasábokat). Ezek az eredmények világosan mutatják, hogy a WGA-B mint ligandum a CELO vírusokkal történő DNS-transzportot C2C12 mioblasztokban felerősíti.
d) Λ Vili. Faktor gén kifejeződése C2C12 mioblaszt- és miotubkultúrákban A mioblaszt- és miotubkultúrákat a fentiek szerint állítottuk elő, Transzfekciókat végeztünk egy plazmid 6 pg-jának felhasználásával, amely a teljes hosszúságú humán VIII. Faktor cDNS-ét tartalmazta [Wood W. I. et al.. Natúré 312. 330-337 (1984); Eaton D. L. et al., Biochemistry 25. 8343-8347 (1986)] és a szokásos komplexképzési előírás szerint vittük komplexbe 5 vagy 15 pl biotinezett adenovírussal (mint megadtuk) + 0,5 vagy 1 pg StrpL-lel és 7 vagy 6 pg TfpL-lel.
A DNS/vírus-komplexeket 2% FCS/DMEM-ben vittük fel a sejtekre. 4 órás 37 °C-on történő inkubálás után minden csészéhez 3 ml friss DMEM + 10% FCS-t adtunk. 18 órával később leszedtük a táptalajt a sejtekről és egy COATEST (KABI; Pharmacia) alkalmazásával. amely egy teszt-rendszer nemzetközi standarddal, mint referenciával a VIII. Faktor meglétét vizsgáltuk. A VIII. Faktor mennyiségeit 24 óra/1 x 106 sejtben képződött egységekben megadva vittük fel a 41. ábrára.
27. példa
Adenovírus-fehérje felhasználása a DNS-transzporthoz wt300 adenovírust (vad típus 300) szaporítottunk HeLa-sejtekben, tisztítottuk és mint a dl 312 adenovírusnál leírtuk, biotineztük. A vírus 1,2 ml-ét dializáltuk 3 x 300 ml, 5 mM MES (2-Nmorfolino-etán-szulfonsav) és 1 mM EDTA (pH - 6,25) keverékével 4 °C-on 18 órán keresztül. Az anyagot ezután 30 percig 27 K mellett 5W60 rotorban centrifugáltuk. A maradékot óvatosan eltávolítottuk, a pelletet HBS/40% glicerinben reszuszpendáltuk. A felülúszóhoz 20 mM HEPES-t (pH = 7,4) és 150 mM NaCl-ot adtunk és mind a pellet-frakciók (tartalmazzák a virális core-fehérjéket és a hexonkapszid fő mennyiségét; a 42. ábrán „core”), mind a felülúszó-frakciók (tartalmazzák a vertexet; a 42. ábrán „vertex”) DNS-transzport aktivitását megvizsgáltuk Movl3 egérfibroblasztokban [Strauss W. és Jaenisch R., EMBO J. 11,417-422 (1992)] vagy HeLasejtekben.
A komplexképzést a DNS-sel a következők szerint végeztük el. Minden frakció megadott mennyiségét - a felszakított vírust centrifugálás előtt vagy az intakt vírust (pg fehérjében kifejezve, ahogyan a Bradfordféle méréssel meghatároztuk - 300 pl HBS-ben meghígítottuk. Sztreptavidin-polilizint (3 pg 50 pl HBS-ben) adtunk hozzá, amelyet egy 30 perces inkubálás követett szobahőmérsékleten. 6 pg pCMVL-t (az ábrán pCLuc-ként jelölve) hígítottunk 100 pl HBS-ben és 30 perces inkubációra az első oldathoz adtuk. Végül 100 pl HBS-ben oldott 2 pg TfpL-t adtunk hozzá, amelyet további 30 perces inkubáció követett. Azokban a próbákban, amelyeket csak TfpL-lel állítottunk elő 170 pl HBS-ben oldott 8 pg TfpL-t 330 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-lel kevertünk össze 30 percig szobahőfokon. A megadott mennyiségű vírusfehérjét 300 pl HBS-ben hígítottuk és azután a TfpL/DNSkomplexekhez adtuk. Ezután minden próbát 1 óra hosszára 5 x 105 sejt/csésze, 2 ml DMEM/10% FCS tartalmú sejtkultúrákhoz (vagy HeLa-sejtekhez vagy Movl3 fibroblasztokhoz) adtuk. Ezután 5 ml, 10% FCS tartalmú friss táptalajt adtunk hozzá és 20 órával később a sejteket előkészítettük a luciferáz aktivitás méréshez. A kapott luciferáz aktivitást (fényegységben) mind HeLa-sejtekre (A tábla), mind Movl3 fibroblasztokra (B tábla) a 42. ábra szemlélteti.
Mindkét sejttípusnál a DNS-transzfer aktivitásnak egy dózisfiiggő növekedése következett be a vertexfrakcióval összeköttetésben (4-6. próbák mindkét táblán). Ha a TfpL/DNS-komplexek a biotinezett vírusfehérje ugyanazon mennyiségét tartalmazták sztreptavidin-polilizin nélkül, egy alapértékekhez közeli DNS-transzportot (3. próba mindkét táblán) figyelhettünk meg.
28. példa
Felerősített géntranszfer galaktóz-ligandum konjugátumot tartalmazó hármas DNS-komplexek alkalmazásával
a) Influenzapeptid-konjugátumot tartalmazó hármas komplexek
A polilizinnel konjugált peptidek jelenléte, amelyek az influenzavfrus-hemagglutinin ΗΑ-2-alegységének N-terminálisából levezetett szekvenciákat tartalmazták DNS/transzferrin-polilizin-komplexekben, a transzferrin-polilizin közvetítette géntranszfert lényegesen felerősítették (13. és 14. példák).
Hasonló, a négyfogú galaktóz-ligandum-polilizinkonjugátumot és a polilizinnel módosított influenzapeptidet, InflupL (a 6. vagy a 13. példa szerint előállítva) tartalmazó DNS-kombinációs komplexeket állítot42
HU 211 925 A9 tünk elő oly módon, hogy a ligandumpolilizin-konjugátumot a pCMVL DNS-plazmidhoz adtuk a DNS töltései felének semlegesítése céljából és a maradék töltéseket arra használtuk, hogy a komplexeket influenzapeptid-polilizinkonjugátummal töltsük fel. Ezeknek a DNS-komplexeknek a transzportja - amelyek a (gal)4 szintetikus ligandumot tartalmazzák - BNL CL.2 hepatocitákba (a transzfekciókat a 6. g) példában leírtak szerint végeztük el) olyan luciferáz-gén kifejeződést eredményezett (43. ábra), amely szignifikánsan magasabb volt, mint a transzferemnél, mint ligandummal kapott kifejeződés. A génkifejeződés több, mint 500-szor magasabb volt annál a kifejeződésnél, amelyet a kontroll kísérletekben influenzapeptid nélküli DNS-komplexekkel, de azonos mennyiségű polilizinnel (43. ábra) kaptunk. A DNS-kombinációs komplexekkel kapott aktivitás is körülbelül 30-szor magasabb volt, mint a DNS/(gal)4p L-komplexekkel, amelyekkel a sejteket klorokin jelenlétében inkubáltuk.
b) Adenovírus-konjugátumot tartalmazó hármas komplexek
A komplexeket a következők szerint állítottuk elő; 50 pl HBS-ben oldott biotinezett dl313 adenovírust (a 19. példa szerint előállítva; 2 pl, 6 pl vagy 18 pl; 1012 partikula/ml) 100 pl HBS-ben oldott sztreptavidin-polilizinnel (100 ng, 160 ng vagy 480 ng) kevertünk össze. 30 perces inkubálás után 200 pl HBS-ben oldott 6pg pCMVL-t és további 30 perc után 150 pl HBSben 3,8 pg (gal)4p L-t (a 6. példa szerint előállítva) vagy 150 pl HBSben 7 pg TfpL-t adtunk hozzá. A DNS-komplex oldatokat „magas glükóz tartalmú” DMEM + 2% FCS táptalajban szaporított, egyenként 300 000 sejt/6 cm-es csésze sűrűségű sejtkultúrákhoz (ATCC TIB73, ATCC TIB74, ATCC TIB7S, ATCC TIB76) adtuk. Az ezt követő sejtkultúra kezelési lépéseket és a luciferáz meghatározást úgy végeztük el, ahogyan azt az előző példákban leírtuk. A 44. ábrán látható génkifejeződési értékeket kaptuk (24 óra után).
29. példa
DNS-transzport transzferrin-polilizinnel szabad és konjugált rhinovírus jelenlétében
a) HRV-2 rhinovírus készítése
HRV-2 rhinovírust Skern és munkatársainak leírása alapján állítottunk elő és tisztítottuk [Skern T. et al., Virology 736, 125-132 (1984)].
Rhinovírus 400 pl-es oldatát (körülbelül 30 pg) HBS (150 mM NaCl/ 5 mM HEPES pH = 7,9) /10% glicerinben 10 nmól NHS-LC-biotinnal (Pierce 21335) kezeltük. 3 órás szobahőfokon történő inkubációt követően a vírust HBS/40% glicerinnel szemben végzett megnyújtott dialízissel 4 °C-on elválasztottuk a be nem épült biotintól.
Fényérzékeny rhinovírust, amelyet akridin-narancs jelenlétében tenyésztve állítottunk elő [Madshus I. H. et al., Virology /39, 346-357 (1984)], inaktiváltunk.
b) A DNS-komplexek előállítása és transzfekciók
i) Transzferein-polilizin/DNS-komplexeket állítottunk elő úgy, hogy 330 pl HBS-ben (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH = 7,3) oldott 6 pg pCMVL plazmidDNS-t 170 pl HBS-ben oldott 8 pg TfpL290-nel kevertünk össze.
A DNS-komplexeket 1,5 ml táptalajjal (DMEM + 2% FCS) és 0,14-3,5 pg HRV-2 rhinovírussal (vagy inaktivált HRV-2-vei) kevertük össze. A,keveréket NIH3T3-sejtekre vittük (300 000 sejt/6 cm-es csésze). 4 órával később a transzfekciós táptalajt 4 ml friss táptalajjal (DMEM + 10% FCS) egészítettük ki. A sejteket 24 óra múlva kinyertük és luciferáz aktivitásra vizsgáltuk azokat, mint ahogyan korábban már leírtuk (45A. ábra).
ii) Transzferein-polilizin- és rhinovírus-polilizinkonjugátumokat tartalmazó DNS-kombinációs-komplexeket állítottunk elő a következők szerint: Biotinezett HRV-2 rhinovírus (3,5 pg) 100 pl HBS-ben készített oldatát 100 pl HBS-ben oldott 1 pg StrpL-lel kevertük össze (más víruskoncentrációkat a megfelelő arányban kevertünk). 30 perces szobahőfokon tartás után az oldatot 150 pl HBS-ben oldott 6 pg plazmid-DNS-sel kevertük össze és további 30 percig szobahőfokon inkubáltuk és azután 150 pl HBS-ben oldott 6 pg TfpL290-nel kevertük.
A DNS-komplexeket 1,5 ml táptalajjal (DMEM + 2% FCS) kevertük össze és NIH3T3-sejtekhez (300 000 sejt/6 cm-es csésze) adtuk. A kultúrák további kezelését és a luciferáz meghatározást az i)ben leírtak szerint végeztük el (45B. ábra).
30. példa
HeLa-sejtek transzfekciója ionosán kötött adenovírust tartalmazó kombinációs komplexekkel Komplexképzés A): A DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 30 pl dl312 adenovírust (körülbelül 109 PFU) 1 pg polilizinnel (pLys450; átlagos lánchossz 450 lizinmonomer) 170 pl HBS-ben kevertünk össze és azután 30 perces szobahőfokon tartás után 170 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-sel elegyítettük.
További 30 perces inkubálás után a komplexeket 170 pl HBS-ben oldott 9 pg TfpL190-nel kevertük össze. A komplex keverék egy részletét (10% = 50 pl oldat, 600 ng DNS; vagy 1% = 5 pl oldat, 60 ng DNS)
1,5 ml DMEM + 2% FCS-sel meghígítottuk és 300 000 HeLa-sejthez adtuk. 4 óra elteltével 2 ml DMEM + 20% FCS-t adtunk hozzá. A 24 óra utáni sejtkinyerés és luciferáz meghatározás a szokásos módon történt. Az összkivonatnak megfelelő luciferáz aktivitás 29 115 000 fényegységet (600 ng DNS esetén) és 1 090 000 fényegységet tett ki (60 ng DNS esetén).
Komplexképzés B) (kontroll kísérlet): A DNSkomplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 170 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 170 pl HBS-ben oldott 1 pg polilizinnel (pLys450) és 30 perces szobahőmérsékleten tartás után végül 170 pl HBS-ben oldott 9 pg TfpL 190-nel kevertünk össze. További 30 perces inkubálás után a komplexeket 30 pl dl312 adenovírussal (körülbelül 109 PFU) elegyítettük. A komplex keverék egy részletét (10% = 50 pl oldat, 600 ng DNS; vagy 1 % = 5 pl oldat, 60 ng DNS) 1,5 ml DMEM + 2%
HU 211 925 A9
FCS-sel meghígítottuk és 300 000 HeLa-sejthez adtuk. 4 óra elteltével 2 ml DMEM + 20% FCS-t adtunk hozzá. A 24 óra utáni sejtkinyerés és luciferáz meghatározás a szokásos módon történt. Az összkivonatnak megfelelő luciferáz aktivitás 405 000 fényegységet (600 ng DNS esetén) és 200 fényegységet tett ki (60 ng DNS esetén).
37. példa
DNS/adenovírus/transzferrin-polilizin-komplexek helyi beadása patkányok májába
a) Közvetlen injektálás
A DNS-komplexeket a 19. példában leírtak szerint állítottuk elő. A komplexek 200 μΐ dl313 adenovírust,
6,4 pg sztreptavidinpolilizint, 48 pg pCMVL-t és 48 pg TfpL290-et tartalmaztak 2.000 pl össztérfogat HBS-ben. Egy hím Sprague-Dawley patkányt (testtömeg 240 g) avertinnel elaltattunk és egy 4 cm hosszú laparotómiát végeztünk. A komplex oldatot a baloldali májlebenybe injektáltuk. Ezután a sebet rétegenként összezártuk. A patkányt 48 órával a komplexek injektálása után leöltük és a máj különböző mintáiból luciferáz kifejeződést mértünk. Az injektálás területéből készült máj-homogenizátum 5615 fényegység/mg fehérjetartalom értéknek adódott; az ossz aktivitás 370 600 fényegységet tett ki.
b) A komplexek beadása a májba az epevezeték rendszeren keresztül
A komplexeket a következők szerint állítottuk elő: 200 pl HBS-sel hígított 200 pl biotinezett dl312 adenovírust 400 pl HBS-ben 6,4 pg sztreptavidinnel módosított polilizinnel 30 percig szobahőfokon inkubáltunk. Utána 800 pl HBS-ben 48 pg pCMVL-t adtunk hozzá. 30 perces inkubálás után 900 pl HBS-ben 48 pg TfpL-t adtunk hozzá. A komplexek felhasználásához egy hím Sprague-Dawley patkányt (testtömeg 250 g) avertinnel elaltattunk és a hasat egy mediánvágással megnyitottuk. A belet a test bal oldalára helyeztük és 1 ml-es fecskendővel és tömlővel ellátott 27 G tűt vezettünk be az epevezetékbe. A komplexek injektálása 4 percig tartott. Ezután a tűt kihúztuk az epevezetékből és az injektálás helyét egy fibrin-ragasztóval (Immuno) pecsételtük meg. A hasi sebet varrással és fémkapcsokkal zártuk le. 30 óra elteltével leöltük a patkányt és a különböző májlebenyekből vett mintákat luciferáz kifejeződésre vizsgáltuk. A luciferáz aktivitás csúcsértéke 19 000 fényegység/mg fehérje volt; a számított összkifejeződés a máj egészében 2,7 x 106 fényegység közelében volt.
32. példa
DNS/adenovírus/TfpL-komplexek beadása egerek felduzzasztott farokvénájába A komplexeket úgy készítettük el, ahogyan azt a
19. példában leírtuk. A komplexek 45 pl dl 312 adenovírust, 0,8 pg sztreptavidin-polilizint, 6 pg pCMVL-t és 24 pg TfpL290-et tartalmaztak 150 pl HBS össztérfogatban. A komplexeket egy avertinnel elaltatott hím C3H/He egér farokvénájába (kor: 2 hónap) injektáltuk.
Közvetlenül az injekció végén a farokvénát a proximális és disztális farokvégeken összenyomtuk úgy, hogy a komplex-oldatot a komprimálás alatt (20 perc) a beoltott farokrészben visszatartsuk és ne tudjon a vérrel kisodródni. 48 órával az oltás után az egeret a nyak kitekerésével leöltük és az injektált farokvénát kipreparáltuk. A luciferáz kifejeződést a farokrészlet homogenizátumában mértük. Ez 2600 fényegység/3 cm farokvéna luciferáz aktivitásnak adódott.
33. példa
Primer humán melanómasejtek transzfekciója Primer melanómasejteket izoláltunk egy beteg sebészetileg eltávolított melanómájából. A daganatot mechanikailag aprítottuk RPMI 1640 sejtkultúra táptalajban 5% FCS, 2 mM glutamin és antibiotikumok kiegészítésével, és a szövetdarabkákat egy acélszitán nyomtuk keresztül. Ezután többszöri centrifugálással és reszuszpendálással mostuk a daganatsejteket és T25 tenyésztő palackokba szélesztettük. A daganatsejtek izolálása után 24 órával következett a transzfekció hármas komplexekkel, amelyek a következőkből álltak: 3 pl, 9 pl vagy 27 pl biotinezett dl313 adenovírus (1 x 1012/ml), 0,5 pg sztreptavidin-polilizin, 6 pg pCMVL és 1 pg TfpL290 (27 pl adenovírus esetében: 1 pg sztreptavidin-polilizin és 6 pg TfpL290) 500 pl HBS össztérfogatban. A transzfekció után 36 órával kinyertük a sejteket és megmértük a luciferáz aktivitást. Az eredményeket a 46. ábrán mutatjuk be.
34. példa
Primer humán fibroblasztok transzfekciója Humán bőrbiopsziákat tettünk DMEM, 2 mM glutamin, 20% FCS és antibiotikumokat tartalmazó táptalajra 6 cm-es Petri-csészébe. Ezután a biopsziákat sebészkéssel alaposan felaprítottuk és 3 ml táptalaj jelenlétében 5 napig tenyésztettük. Ezután a sejteket friss DMEM táptalajjal mostuk, amely 2 mM glutamint, 10% FCS-t és antibiotikumokat tartalmazott és további 7 napig tenyésztettük. A tenyésztési idő lejárta után a sejteket tripszinnel kezeltük és új Petri-csészében elkülönítve tenyésztettük. Amint a sejtek majdnem összefüggő réteget alkottak, újból tripszinnel kezeltük és lefagyasztva tároltuk a transzfekcióig. A transzfekcióhoz a sejteket felengedtük, 6 cm-es Petri-csészékbe szélesztettük és 2 mM glutamint, 10% FCS-t és antibiotikumokat tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük. A konjugátumokat a transzfekcióhoz a következőképpen állítottuk elő: 3 pl, 10 pl, 20 pl és 30 pl biotinezett dl312 adenovírust 0,1 pg, 0,3 pg, 0,5 pg és 0,8 pg sztreptavidin-polilizinnel 150 pl HBS-ben 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk Ezután 170 pl HBSben oldott pCMVp-gal plazmid 6 pg-ját adtuk hozzá és a keveréket további 30 percig inkubáltuk. Utolsó lépésként a 3 pl d 1312 adenovírust tartalmazó konjugátumokhoz 7,8 pg TfpL-t, a 10 pl dl312-t tartalmazókhoz 7 pg TfpL-t, a 20 pl és 30 pl d 1312-t tartalmazó konjugátumokhoz pedig 6 pg TfpL-t adtunk 170 pl HBSben. 30 perces inkubációs idő után a konjugátumokat 2 ml, 2 mM glutamin, 2% FCS és antibiotikum tartalmú,
HU 211 925 A9
DMEM-ben fölvittük a sejtekre és 4 órát inkubáltuk 37 °C-on. Ezután eltávolítottuk a táptalajt és a szaporítást 37 “C-on 2 mM glutamint, 10% FCS-t és antibiotikumokat tartalmazó DMEM-ben folytattuk. 48 óra után meghatároztuk a β-galaktozidáz kifejeződést, mint ahogyan az előző példákban leírtuk.
A 3 μΐ dl312 tartalmú konjugátumokkal történő transzfekciónál a sejtek 14%-a mutatott β-galaktozidáz termelést, 10 μΐ d 1312- nél 32%, 20 μΐ d 1312-nél 39% és 30 μΐ d 1312-nél 64% pozitív sejtet kaptunk.
35. példa
Géntranszfer nem virális endoszóma-litikus anyag alkalmazásával
a) Membránt felszakító peptidek szintézise i) Peptidszintézis: A peptideket egy automatikus szintetizálón (ABI 431 A) rögzített fázisú eljárással palkoxi-benzil- alkohol-gyanta (0,97 mmól/g), mint rögzített fázis és Fmoc-védett aminosavak felhasználásával állítottuk elő. A karboxi-terminális aminosavat a szimmetrikus anhidriden keresztül kötöttük a gyantához. A következő aminosavakat az 1-hidroxibenzotriazoldiciklohexil-karbodiimid módszerrel kapcsoltuk. A következő oldallánc-védő csoportokat alkalmaztuk: (Trt)Asn, (Trt)Cys [EALA és GLF esetében (t-Bu) Cys], (t-Bu) Glu, (Trt) His, (T-Bu) Ser.
A peptidek szekvenciái a következők voltak:
EALA (5. számú szekvencia): Trp-Glu-Ala-AlaLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-HisLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-LeuAla-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
GLF (6. számú szekvencia): Gly-Leu-Phe-Gly-AlaLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-HisLeu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-LeuAla-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
GLF-II (7. számú szekvencia): Gly-Leu-Phe-GlyAla-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-GluAla-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
GLF-delta (8. számú szekvencia): Gly-Leu-PheGlu-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-GluAla-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
EALA-Inf (9. számú szekvencia): Gly-Leu-PheGly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-GluGly-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
EALA-P50 (10. számú szekvencia): Gly-Leu-PheGlu-Ala-Ile-Glu-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-GluGly-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
P50 (11. számú szekvencia): Gly-Leu-Phe-GluAla-Ile-Glu-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-GlyMet-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys
A peptideket elválasztottuk a gyantától és az oldallánc-védő csoportokat [a (t-Bu)Cys kivételével] a 100 mg pepiiddel feltöltött szilárd fázisnak 3 ml, fenol/etán-ditiol/tioanizol/víz/trifluor-ecetsav 0,75:0,25:0,5:0,5:10 keverékkel 1,5 óráig szobahőfokon történő kezelése révén távolítottuk el. A nyers peptideket éterben kicsapattuk és
2-szer mostuk. Az S-t-Buval védett EALA és GLF peptideket kis mennyiségű 1 M trietilammónium-bikarbonátban (TEAB) pH = 8, oldottuk 100 mM TEAB-ra meghígítottuk és a továbbiakban reverz fázisú HPLC-vel egy Nucleosil 500-5C4 oszlopon tisztítottuk (0,1% TFA/ /acetonitrilgradiens), mindkét peptid körülbelül 50% acetonitrilnél eluált. A peptidek szabad Cys-SH formáját úgy kaptuk meg, hogy a Trt-Cys-peptidekről ugyanúgy távolítottuk el a védőcsoportokat, mint ahogyan fent leírtuk. A nyers peptideket (5 mg) 1 μΐ β-merkaptoetanolt tartalmazó 100 μΐ, 100 mM TEAB (pH = 8) oldatában oldottuk és gélszűréssel (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, 0,5 mM EDTA), majd fagyasztva szárítással vagy ioncserélő-kromatográfiával (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH = 7,3, gradiens 0-3 M NaCl; a peptid 1,5 M NaClnál eluál) tisztítottuk.
ii) Módosítás N-(hidroxi-etil)-maleimiddel: A GLFdelta, GLFH, EALA-Inf, EALR-P50 és P50 peptidek C-terminális SH-csoportját a gélszűrés (Sephadex G25, 20 mM HEPES pH = 7,3, 0,5 mM EDTA) utáni szabad SH- formából N-(hidroxi-etil)-maleimid 1,3— 10-szeres moláris fölöslegével történő reakció révén (1 óra szobahőfokon) blokkoltuk. A fölösleges maleimidet gélszűréssel (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH = 8) távolítottuk el és a módosított peptideket (GLF-delta-mal, GLF-II-mal, EALA-Inf-mal, EALAP50-mal és P50-mal) fagyasztva szárítás után trietilammónium-sók formájában kaptuk meg.
iii) Módosítás 2,2’-ditio-bisz-piridinnel. A szabad SH-peptideket 10 ekvivalens 2,2’-ditio-bisz-piridinnel (20 mM HEPES, pH - 7,9, 0,5 mM EDTA) egy éjszakán át szobahőfokon reagáltattuk. A fölösleges reagenst gélszűréssel (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH = 8) vagy ioncserélő-kromatográfiával (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH = 7,3, gradiens 0-3 M NaCl; a peptid 1,5 M NaCl-nál eluál) távolítottuk el, hogy megkapjuk a (2-piridiltio-)Cys-peptideket (GLFdelta-SSPy, GLF-II-SSPy, EALA-Inf-SSPy, EALAP50-SSPy és P50-SSPy).
iv) A peptidek dimerizálása: A P50 homodimerjét (P50 dim) állítottuk elő azáltal, hogy a P50-Cys-(2-piridiltio) és P50-Cys-SH ekvimoláris mennyiségeit 20 mM HEPES-ben (pH = 7,3) 3 napig szobahőmérsékleten reagáltattuk. A reakciókeveréket egy Mono Q oszlopon választottuk el (HR-5/5 Pharmacia, 20 mM HEPES (pH = 7,3), gradiens 0,09-3 M NaCl; a P50-dimer
1,1 M NaCl-nál eluált). A GLF-SS-P50 heterodimert hasonlóan, a p50 peptid szabad merkapto formáját a GLF piridiltio-módosított peptiddel reagáltatva állítottuk elő.
b) A liposzómák áteresztő-képességének meghatározása (laposomés Leakage Assay)
A szintetikus peptideknek azon tulajdonságát, hogy képesek a liposzómák felszakítására, olyan fluoreszcens színanyagnak a liposzómából való kilépése segítségével mértük, amely kalceinnek önkioltó koncentrációjával van telítve. A liposzómákat REV-módszerrel (reverz fázisú bepárlás) [Szoka F. és Papahadjopoulos D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,4194-4198 (1978)] állítottuk elő 100
HU 211 925 A9 mM kalcein, 375 mM Na+, 50 mM NaCl, pH = 7,3 vizes fázist alkalmazva és egy 100 nm-es polikarbonát szűrőn [MacDonald R. C. et al., Biochim. Biophys. Acta 1061, 297-303 (1991)] keresztül extrudáltuk egységes nagyságeloszlás elérése céljából. A liposzómákat Sephadex G-25 oszlopon, izoozmotikus puffer (200 mM NaCl, 25 mM HEPES, pH = 7,3) segítségével gélszűréssel választottuk el a be nem épült anyagoktól. A áteresztő-képesség méréshez (leakage assay) a törzsoldatot (6 μΙ/ml) különböző pH értékeknél hígítottuk 2 x assaypufferben (400 mM NaCl, 40 mM Na-citrát). Egy 100 ples részletet adtunk a peptid egy vizes sorozathígítmányának 80 μΙ-éhez 96 bemélyedést tartalmazó mikrotiter-lemezen (a lipid végső koncentrációja: 25 μΜ) és 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után 600 nm-en (gerjesztés 490 nm-nél) vizsgáltuk a kalcein-fluoreszcenciát egy mikrotiterlemez-fluoreszcens fotométerrel. A 100%os felszakításnak megfelelő értéket 1 μΐ 10%-os Triton X-100 oldat hozzáadásával kaptuk meg. A „leakage” egységeket a peptidkoncentráció reciprokaként vettük számításba, amelynél 50%-os felszakítást vettünk figyelembe (azaz azt a térfogatot liposzómaoldat μΙ-ben, amely μg peptidre vontkoztatva 50%-ban lízist szenved). A 20 egység alatti értékeket extrapoláltuk. A liposzómák felszakítására irányuló meghatározások eredményeit a 47. ábrán mutatjuk be. A legmagasabb pH-specifikus aktivitást GLF és EALA peptidek mutatták.
c) Az eritrociták lízisének meghatározása (Erythrocytes Lyse Assay)
Friss humán eritrocitákat többször mostunk HBS-sel és megfelelő pH értékű 2 x assay-pufferben (300 mM NaCl. 30 mM Nacitrát) 6,6 x 107/ml koncentrációnál reszuszpendáltuk. Egy 75 μΐ-es részletet adtunk a peptid egy vizes sorozathígítmányának 75 μΙ-éhez 96 bemélyedést tartalmazó mikrotiterlemezen (Konus típus) és 1 órán keresztül 37' C-on állandó rázás közben inkubáltuk. A nem lizált eritrociták centrifugálással (1000 rcf, 5 perc) történő eltávolítása után a maradék 100 μΙ-ét egy új mikrotiterlemezre vittük át és 450 nm-en (alapvonal-kiigazítás 750 nm-en) meghatároztuk a hemoglobin-abszorpciót. 100%-os lízist 1 μΐ 10%-os Triton X-100 oldat centrifugálás előtti hozzáadásával határoztunk meg. A hemolitikus egységeket a peptidkoncentráció reciprokaként vettük számításba, amelynél 50%-os lízist vettünk figyelembe (azaz azt a térfogatot eritrocita-oldat μΙ-ben, amely μg peptidre vontkoztatva 50%-ban lízist szenved). A 3 hemolitikus egység alatti értékeket extrapoláltuk. Az értékeket a 48. ábrán szemléltetjük. Látható, hogy a P50 dim és az EALA-P50 peptidek rendelkeztek a legmagasabb pH-specifikus aktivitással a sejtek lízise és/vagy nagyobb molekulák, mint a hemoglobin kiengedése tekintetében. A P50-mal és P50-SSPy P50 monomerek aktivitása alacsonyabb volt. Melittin mutatta a legmagasabb aktivitást, ez azonban nem specifikus a savas pH értékre.
d) DNS-kombinációs-komplexek előállítása
DNS-komplexeket úgy állítottunk elő, hogy először
150 μΐ HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 150 pl HBS-ben oldott 4 pg TfpL290-nel kevertünk össze és végül 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 100 pl HBS-ben oldott 4-20 pg poli(L)-lizin290-nel elegyítettük. További 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után 0,3-30 pg, 100 pl HBS-ben oldott peptidet adtunk hozzá és további 30 percig inkubáltuk. Az endoszómalitikus anyag optimális mennyiségét előzetes titrálással állapítottuk meg, ahol megmértük a kapott géntranszfer teljesítő képességet (lásd a 3. táblázatot: Géntranszfer BNL CL.2-sejtekbe). A polilizin és az endoszóma-litikus anyag egyidejű hozzáadása ugyanúgy, mint nagyobb térfogatok alkalmazása a komplexek előállításához (1,5 ml végtérfogat), összehasonlítható (vagy jobb) transzfekciós hatékonyságot eredményezett. Ezekből a kísérletekből az is kiderült, hogy a nem peptid amfipátiás anyagok, mint a dezoxikolsav és olajsav a DNS transzferét felerősítik.
e) A sejtek transzfekciója
Adherens sejtvonalakat (BNL CL.2 hepatocitákat illetve NIH3T3-sejteket) tenyésztettünk a transzfekció előtt 1-2 napig 6 cm-es csészékben (DMEM táptalaj 10% FCS-sel; 300 000 sejt/csésze). A táptalajt eltávolítottuk és 1,5 ml DMEM + 2% FCS és 500 pl DNSkomplex keverékét adtuk a sejtekhez. Egy alternatíva 0,5 ml DMEM + 6% FCS és 1,5 ml DNS-komplex keverékének az alkalmazása. 4 órás inkubáció után 2 pl DMEM-et (18% FCS) adtunk hozzá. Egy másik lehetőség szerint 4 ml, 10% FCS-sel kiegészített DMEM-et adhatunk hozzá. A sejtkinyerés és a luciferáz meghatározások 24 órával a transzfekciót követően történtek, mint azt korábban leírtuk. A bemutatott fényegység értékek a transzfekción átesett sejtek ossz luciferáz aktivitását szemléltetik.
A BNL CL.2 hepatociták transzfekcióját a 49. ábrán mutatjuk be.
49A. ábra: A DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 250 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVLDNS-t 250 pl HBS-ben oldott 4 pg TfpL29O-nel kevertünk össze és végül 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 750 pl HBS-ben oldott 20 pg poli(L)-lizin290-nel elegyítettük. További 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után hozzáadtuk a megadott mennyiségű peptidet 250 pl HBS-ben oldva. További 30 perces inkubálás után a komplexeket 0,5 ml DMEM + 6% FCS-sel elegyítettük és 450 000 sejthez adtuk.
49B. ábra: A DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 500 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 250 pl HBS-ben oldott 4 pg TfpL290-nel kevertünk össze és 30 percig szobahőfokon állni hagytuk. 500 pl HBS-ben oldott 20 pg poli(L)-lizin290-et 250 pl HBSben oldott megadott mennyiségű peptiddel elegyítettünk és azonnal a TfpL/DNS-keverékhez adtuk. További szobahőfokon történő 30 perces inkubálás után a komplexeket 0,5 ml DMEM + 6% FCS keverékével elegyítettük és 450 000 sejthez adtuk. A sejtkinyerés és luciferáz meghatározások a leírtak szerint történtek.
Az 50. ábrán a NIH3T3-sejtekkel végzett kísérleteket mutatjuk meg. A komplexek A) és B) szerinti előállításai ugyanúgy történtek, mint a BNL CL.2 sejteknél.
A sejtkultúra kísérletekben a P50 dim és ERLA46
HU 211 925 A9
P50 peptidek mutatták a legmagasabb aktivitást, az EALA és GLF peptidek közepes aktivitásúak, miközben a P50 monomerek és a melittin alacsony aktivitásúak voltak.
36. példa
Géntranszfer egy, a C-terminálison oligolizin meghosszabbítással rendelkező, nem virális szintetikus peptid alkalmazásával
A következő szekvenciával (4. számú szekvencia) rendelkező peptidet állítottuk elő és tisztítottuk az előző példában leírt módszer szerint: Met-Ala-Gln-AspIle-Ile-Ser-Thr-Ile-Gly-Asp-Leu-Val-Lys-Trp-Ile-IleAsp-Thr-Val-Asn-Lys-Phe-Thr-Lys-Lys-Lys-Lys-LysLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys. Ez a Staphylococcus aureus δ-toxinjából (3. számú szekvencia): Met-AlaGln-Asp-Ile-Ile-Ser-Thr-Ile-Gly-Asp-Leu-Val-LysTrp-Ile-Ile-Asp-Thr-Val-Asn-Lys-Phe-Thr-Lys-Lys, levezetett peptid - amelyről ismert, hogy savas pH értéknél specificitással rendelkezik a membránok felszakításában [Thiaudiere E. et al., Eur. J. Biochem. 195, 203213 (1991); Alouf J. E. et al., Eur. J. Biochem. 183, 381-390 (1989)] 10 kiegészítő Lys egységgel történő meghosszabbítás következtében.
A DNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 170 μΐ HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 170 μΐ HBS-ben oldott 4 pg TfpL290-nel kevertünk össze és végül 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 170 pl HBS-ben oldott 3 pg peptiddel elegyítettük. További 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után a komplexeket 1,5 ml DMEM + 2% FCS-sel kevertük össze és 450 000 BNL CL.2 hepatocitához adtuk. 2 óra múlva 2 ml DMEM + 20% FCS-t adtunk hozzá. A transzfekció után 24 órával a sejtkinyerést és a luciferáz aktivitás méréseket az előző példákban leírtak szerint végeztük el. Az összkivonatnak megfelelő luciferáz aktivitás 481 000 fényegység volt.
37. példa
Hepatociták transzfekciója a C-terminálison oligolizin farokkal rendelkező melittin-peptidek jelenlétében
A következő szekvenciáknak megfelelő peptideket szintetizáltuk (N-től a C-terminális irányába) (12. számú szekvencia): Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-ValLeu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-IleLys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysLys-Lys-Lys-Lys (mell jelzéssel) és (13. számú szekvencia): Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Glu-Val-Leu-GluThr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-ArgLys-Arg-Gln-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysLys-Lys (savas mutáns mel2 jelzéssel) a 36. példában leírtak szerint.
ADNS-komplexeket úgy állítottuk elő, hogy először 170 pl HBS-ben oldott 6 pg pCMVL-DNS-t 170 pl HBS-ben oldott 4 pg TfpL290-nel kevertünk össze és végül 30 perces szobahőmérsékleten tartás után 170 pl HBS-ben oldott körülbelül 3 pg mell vagy 5 pg mel2 peptiddel elegyítettük. További 30 perces szobahőfokon történő inkubálás után a komplexeket 1,5 ml DMEM +
2% FCS-sel kevertük össze és 450 000 BNL CL.2 sejthez adtuk, amelyeket a 36. példában leírtak szerint tenyésztettünk. A transzfekció után 24 órával a sejtkinyerést és a luciferáz aktivitás méréseket az előző példákban leírtak szerint végeztük el. Az összkivonatnak megfelelő luciferáz aktivitás mell esetében 9200, mel2 esetében 9400 fényegység volt.
38. példa
Interferon-a. kifejeződése HeLa-sejtekben
HeLa-sejteket (5 x 105 sejt/6 cm-es csésze) fertőztünk pADCMVl-IFN plazmiddal, amely a humán alfa2c interferont kódolja a CMV enhancer/promoterszekvencia kontrollja alatt (A plazmidot a DE 4 021 917 A számú német szabadalmi leírás írja le. A pADCMVIIFN plazmidot úgy kaptuk meg, hogy a HindlII-XbaIIFN-a2c-inszertumot a pADCMVl-be újraklónoztuk.) 330 pl HBS-ben oldott 6 pg DNS mintákat elegyítettünk 330 pl HBS-ben oldott 8 pg TfpLlel és 30 percig állni hagytuk szobahőmérsékleten. A 610. minták csak 4 pg TfpL-t tartalmaztak és az első 30 perces inkubálást követően a 6. és 7. mintákhoz egyegy részlet 160 pl HBS-ben oldott Pl6pL-t (20 pg), és a 8., 9. és 10. próbákhoz egy-egy részlet pLys290-et (20 pg) adtunk. További 30 perces inkubálás után 160 pl HBS-ben oldott 10 pl (8. próba) vagy 50 pl (9. és 10. próba) szabad Pl 6 részleteket adtunk hozzájuk (a P16 és P16pL szintézisére lásd a 13. példát). További 30 perc elteltével a próbákat HeLa-sejtekre vittük fel 2 ml DMEM/2% FCS-ben, amely a következő kiegészítő komponenseket tartalmazta: a 2., 7. és 10. próbák 100 pM klorokint, a 3. és 4. próbák 5 pl és 15 pl d 1312 adenovírust (1 x 1012 partikula/ml) tartalmaztak, az 5. próba ugyanezen vírus psoralennel inaktivált formájának 15 pl-ét tartalmazta. (Az endogén interferon-termelés adenovírus révén történő stimulálására kontrollként a 11., 12. és 13. próbákat a vírus kis részleteivel kezeltük, mint a 3., 4. és 5. példákban.) A transzfekció után 2 órával 5 ml friss DMEM + 10% FCS táptalajt adtunk a sejtekhez. 48 órával a transzfekció után a táptalajt eltávolítottuk és 2 ml friss DMEM + 10% FCS-sel pótoltuk. Ebből a táptalajból 72 órával a transzfekció után kinyertük a sejteket és az IFN-a meghatározására elvégeztük az ELISA tesztet a DE 4 021 917 A számú német szabadalmi leírás szerint. Az IFN-α mennyiségeket (ng/ml-ben) az 51. ábrán mutatjuk meg.
A korábban luciferáz vagy β-galaktozidáz riportergénekkel tett megfigyelésekkel összhangban, a TfpL csak gyengén működött az IFN-gén transzferénél ezekben a sejtekben. Klorokin jelenléte kimutatható jelet eredményezett (körülbelül 7 ng/ml 2. próba) ezzel szemben a dl312 adenovírus dózisfüggő módon stimulálta a DNStranszfert (3. és 4. próbák). Ezeknek a sejteknek összehasonlítható mennyiségű vírussal való kezelése IFN-DNSkomplexek nélkül nem adott kimutatható IFN-jelet (11. és 12. próbák). Az influenzapeptidből levezetett szintetikus endoszóma-litikus Pl6 peptiddel (lásd 13. példa), mint konjugátummal (6. és 7. próbák) vagy a TfpL/DNSkomplexek felületéhez ionosán kötött peptiddel végzett
HU 211 925 A9 transzfekció (8., 9. és 10. próbák; a peptid kötéséhez lásd a 35. példát) kimutatható interferon termelést eredményezett, amelyet a peptidkonjugátum klorokin jelenlétében (7. próba) felerősített.
SZEKVENCIALISTA
/. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 23 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Glu Alá Ile Alá Gly Phe
1 5
Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile
10 15
Asp Gly Gly Gly Cys
2. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 23 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia; mindkettő
A molekula ti pusa: | peptid
Gly Leu Phe Gly Alá Ile Alá Gly Phe
1 5
Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile
10 15
Asp Gly Gly Gly Cys
3. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 26 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Met Alá Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile
1 5
Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp
10 15
Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys
20 25
4. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza; 36 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Met Alá Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile
1 5
Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp
10 15
Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys
20 25
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
30 35
5. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 34 aminosav A szekvencia típusa, aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Trp Glu Alá Alá Leu Alá Glu Alá Leu
1 5
Alá Glu Alá Leu Alá Glu His Leu Alá
10 15
Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu Glu Alá
20 25
Leu Alá Alá Gly Gly Ser Cys
30
6. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 35 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Gly Alá Leu Alá Glu Alá
1 5
Leu Alá Glu Alá Leu Alá Glu His Leu
10 15
Alá Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu Glu
20 25
Alá Leu Alá Alá Gly Gly Ser Cys
30 35
7. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 35 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Gly Alá Leu Alá Glu Alá
1 5
Leu Alá Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu
10 15
Alá Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu Glu
25
Alá Leu Alá Alá Gly Gly Ser Cys
30 35
8. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 34 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Glu Leu Alá Glu Alá Leu
1 5
Alá Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu Alá
10 15
Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu Glu Alá
20 25
Leu Alá Alá Gly Gly Ser Cys
30
HU 211 925 A9
9. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 34 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Gly Alá Ile Alá Gly Phe
1 5
Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Alá
10 15
Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu Glu Alá
20 25
Leu Alá Alá Gly Gly Ser Cys
30
10. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 34 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Glu Alá Ile Glu Gly Phe
1 5
Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Alá
10 15
Glu Alá Leu Alá Glu Alá Leu Glu Alá
20 25
Leu Alá Alá Gly Gly Ser Cys
30
ll. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 23 aminosav A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
Gly Leu Phe Glu Alá Ile Glu Gly Phe
1 5
Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile
10 15
Asp Gly Gly Gly Cys
20
72. számú szekvenciavázlat 10 A szekvencia hossza: 36 aminosav
A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
15 Gly Ile Gly Alá Val Leu Lys Val Leu Ser Lys
1 Thr Thr Gly Leu 5 Pro Lys
Alá Leu 15 Ile Gin
10 Trp Ile Lys Arg
Arg Gin
20 20 25
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
30 35
73. számú szekvenciavázlat 25 A szekvencia hossza: 36 aminosav
A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: mindkettő A molekula típusa: peptid
30 Gly 1 Ile Gly Alá Val 5 Leu Glu Val Leu
Glu 10 Thr Gly Leu Pro Alá 15 Leu Ile Ser
35 Trp Ile 20 Lys Rrg Lys Arg Gin 25 Gin Lys
Lys Lys Lys 30 Lys Lys Lys Lys Lys 35 Lys
7. táblázat (1 A.): Transzfekciós módszerek
SEJTTÍPUS Komplex: TfpL (A) TfpL + Klorokin (A) TfpL + szabad AdenoV (B) TfpL + kötött AdenoV (B) TfpL + InflupLys (F)
Hepatociták HepG2 - +/- +++
BNL.CL2 - +/-. ++++ +++++ +++
primer - - - +
Mioblasztok/Miotubok C2C12 +/- +/- +++++
G8 +/- +/- +++++
primer +++
Fibroblasztok 3T3 + + +++ +++++ +
Mov-13 +/- +/- +++++ +
Egér L-sejtek +/- + + +++++ +
primer ++++
Endotélsejtek Sertés aorta +/- + +++ +/-
Humán neuroblasztoma sejtvonal GI-ME-N +/- +/- +++ ++++
HeLa-sejtek + + +++++ +++++ +++
HU 211 925 A9
I. táblázat (folyt., JB.): Transzfekciós módszerek
SEJTTÍPUS Komplex: TfpL (A) TfpL + Klorokin (A) TfpL + szabad adenovírus (B) TfpL + kötött adenovírus (B) TfpL + InflupLys (F)
Egér ES sejtek CCE +/- + +
Bruce 4 +/- + +++
Eritroid sejtek K562 - ++++ + +++++ +
csirke HD3 + ++++ +++ +++++
Csontvelő Egér - - +
csirke +/- + +
EBV-transzformáli Humán B-sejtek - - - +++
Egér plazmasejtvonalak (MPC11.SP2/0) + + +++
+/- Luciferáz aktivitás 1000-10 000 fényegység/ΊΟ6 sejt + 10 000-1O6 fényegység ++ 1-5 x 106 fényegység +++ 5-50 x 106 fényegység ++++ 50-100 x IO6 fényegység +++++ >100 x IO6 fényegység
TfpL transzfemn-poliltzin
AdenoV replikádéra képtelen dl 312 adenovírus
Influ-pLys Influenza HA-2 N-terminális peptid-polilizin
2. táblázat (2AJ: Membránaktív fehérjék
Virális fúziós fehérjék N-terminális fúziós szekvencia
Burokkal rendelkező vírusok Influenzavírus Myxoviridae HA-2 pH 5 Wbite, 1990; Takahashi, 1990
VSV Rhabdoviridae G pH 5 Hoekstra, 1990
Vacciniavírus 14 kDa pH 5 Gong et al., 1990
Sendai vírus Parainfluenzav. FI pH 7 Hoekstra, 1990; Gething et al., 1978
Masernvírus Parainfluenzav. F pH 7 Takahashi, 1990
HÍV Retroviridae gp41 pH 7 Slepushkin et al., 1992
SIV Retroviridae gp41 pH 7 Ruysschaert u.
Vandenbranden 1991; Franchini, 1989
Burok nélküli vírusok Poliovírus Enterovíridae vpl pH 5 Fricks und Hogle, 1990
Coxackievírus Enteroviridae vpl pH 5 Gething et al., 1978
Rhinovírus vpl pH 5
Intemális fúziós szekvencia
Burokkal rendelkező vírusok Semliki Forest v. Togaviridae El pH 5 White, 1990
Sindbisvírus White, 1990
Burok nélküli vírusok Rhesus Rotavírus vp5 Mackow et al., 1988
HU 211 925 A9
A 2. táblázatban szereplő szerzők szerinti irodalmi hivatkozások részletezve megtalálhatók az irodalomjegyzékben
2. táblázat (folyt., 2B.): Membránaktív fehérjék
Mikroorganizmusokból származó toxinok
Sztreptolizin 0 Streptococcus szulfhidril-aktivált, koleszterinhez kötött 20-80 mer, 15 nm-es pórusok 69 kDA pH 7 Kehoe et al., 1987
Liszteriolizin O L monocytogenes szulfhidril-aktivált, koleszterinhez kötött C9-cel és sztreptolizin Oval rokon 60kDA pH 5 Geoffroy et al., 1987
α-toxin Straphylococcus amfipátiás felület β-lapszerkezet hexamer léziók, 2 nm-es pórusok 34 kDA pH 7
Hemolizin E. coli 8 amfipátiás hélix 416 kDA pH 7 Oropeza-Werkerle et al., 1992
Hemolizin Trypanosoma cruzi perforinekhez hasonló, C9-cel rokon 75kDA pH 5 Andrews et al., 1990
Gerincesek immunrendszere
Perforin Ca2+ függő membrán-inszerció Ojcius und Jung, 1991
Komplement C9 (MAC 056-8,9^) Hohler fehérje-henger 10 nm-es csatorna jól szabályozott aktivitás Bhakdi und TranumJensen, 1991; Esser, 1991
Spermium-tojás-fúziós fehérje
PH-30 a felületi fehérjék oc-alegysége internális fúziós szekvencia pH 7 Blobel et al., 1992
2. táblázat (folyt. 2C.): Membránaktív fehérjék
Védelmi toxinok
Melittin méhméreg 26AA amf. α-hélix csavarodott Blondelle u. Houghten, 1991; Dempsey et al., 1991; Ikura u. Inagaki, 1991
Bombolitin poszméh-méreg 17AA amf. a-hélix Argiolas u. Pisano, 1985
Mastoparan darázsméreg 14AA amf. a-hélix Arginolas u. Pisano, 1885
Crabrolin lódarázs-méreg 13AA amf. a-hélix Arginolas u. Pisano, 1985
Pardaxin „moses sole” hal 33AA amf. α-hélix csavarodott Shai et al.
Antibakteriális peptidek Sarcotoxin 1A „húslégy”
Cecropins rovarok (humorális immunrendszer, selyemmoly) 37AA amf. α-hélix csavarodott Esser, 1991
Maganin bőr Xenopus laevis 23AA amf. a-hélix Marion et al., 1988
Alameticin gomba (Trichoderma viride) 15-24AA amf. a-hélix a-amino-vajsav Esser, 1991
Baktériumok-toxinok δ-toxin Staphylococcus aureus 26AA amf. α-hélix savas közegben Thiaudiere et al., 1991; Alouf et al., 1989
Amoebapor Entamoeba histolytica 25AA amf. α-hélix savas közegben Leippe et al., 1991
Gerincesek immunrendszere Defenzin négymagvú neutrofil 29-34AA β-lapszerk. (SS-hfd) Lehrer et al., 1991
HU 211 925 A9
3. táblázat: BNL CL.2 sejtek transzfekciója (6 pg pCMV-L DNS, 4 pg TfpL290)
pLys ORg 0,3 pg 1 l^g 3 Pg 10 pg 20 pg 30 pg
Opg P50 óim 160 330 540 300
GLF 490 290 340
Melittin 0 0 0 70 425
4 Pg P50 dim 3100 200 430 180 410
GLF 670 600 170
EALA 3140 150 560
10 pg P50 dim 5700 760 1330 3 424 800
GLF 1950 16 600 217000 215 000 1980
EALA 2120 16 800 179 300 181 700 76 360
20 pg P50 dim 3200 23 300 185 100 7 054 800 9 344 000
GLF 418 400 320 600 294 200
EALAm 191 000 181 000 273 600
Melittin 6545
6730 34 700 16 000
12 200 11 900 1400
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (90)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Készítmény magasabb rendű eukarióta sejtek nukleinsavból és nukleinsav-affin anyagból - adott esetben nevezett sejtek számára internalizáló faktorral kapcsolva - álló komplexszel történő transzfekciójára, azzal jellemezve, hogy olyan anyagot tartalmaz, amely vagy per se vagy a nukleinsav-komplex alkotórészeként rendelkezik a sejtbe bekerülés és az endoszómák tartalmának - amelyekben a komplex a sejtbe való belépés után lokalizálva van - a citoplazmába történő kiengedése képességével.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag vírus vagy víruskomponens, amely a nevezett sejtek számára per se internalizáló faktor.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag egy nukleinsav-kötő doménnel rendelkezik vagy egy nukleinsavaffin anyaghoz kötődik, és rendelkezik a konjugátum/nukleinsav-komplex alkotórészeként a sejtbe történő felvétel képességével, nevezett komplex továbbá adott esetben a sejtek számára egy internalizáló faktort tartalmaz.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag kovalensen kötődik egy nukleinsavaffin anyaghoz.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag a nukleinsavaffin anyaghoz nem kovalensen kötődik.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a kötés egy biotin-sztreptavidin hídon keresztül történik.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a kötés ionosán történik.
  8. 8. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag a nukleinsavhoz közvetlenül egy nukleinsav-kötő doménen keresztül kötődik.
  9. 9. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag vírus vagy víruskomponens.
  10. 10. A 2. vagy 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag adenovírus.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus mutáns.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus replikációra képtelen mutáns.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus az ElA-régióban egy vagy több mutációt és/vagy kivágást szenvedett mutáns.
  14. 14. A 10. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus inaktiválva van.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus rövidhullámú UV-vel inaktivált.
  16. 16. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus UV/psoralennel inaktivált.
  17. 17. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus formaldehiddel inaktivált.
  18. 18. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a víruskomponens egy vagy több adenovírus-fehérjéből áll.
  19. 19. A 2. vagy 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a vírus picornavírus, előnyösen rhinovírus.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a rhinovírus inaktivált.
  21. 21. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag per se nem internalizáló faktor a sejtek számára és hogy a nukleinsav-komplex ezenkívül a nevezett sejtek számára a
    HU 211 925 A9 nukleinsav-affin anyaghoz kötött intemalizáló faktort tartalmaz.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag vírus vagy víruskomponens, amely humán sejt számára nem internalizáló faktor.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag olyan vírus, amely az embertől eltérő fajra fertőző.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a vírus egy adenovírus.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus egy madár adenovírus.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adenovírus a Chick Embryo Lethal Orphan (csirke embriót elölő) vírus.
  27. 27. A 21. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag egy tetszés szerint módosított, endoszóma-litikus virális peptid.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve. hogy az endoszóma-litikus peptid influenza-hemagglutinin HA2-peptid.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve. hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GluAla-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-GlyMet-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  30. 30. A 28. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-Phe-GlyAla-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-GlyMet-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  31. 31. A 21. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag nem virális, adott esetben módosított természetes vagy szintetikus peptid.
  32. 32. A 27. vagy 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid nukleinsav-kötő doménnel rendelkezik.
  33. 33. A 3. vagy 21. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor transzferrin.
  34. 34. A 3. vagy 21. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor egy ligandum hepatociták számára.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor egy ligandum az aszialo-glikoprotein receptor számára.
  36. 36. A 35. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az intemalizáló faktor tetragalaktóz-polilizin.
  37. 37. A 3-36. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkotórészeként felhasználható nukleinsav komplex, nevezett komplex egy vagy több a sejtben kifejezendő nukleinsavat, olyan endoszóma-litikus anyagot, amely eredetileg nukleinsav-kötő doménnel rendelkezik vagy egy nukleinsav-affin anyaghoz kötődik és ezenkívül adott esetben egy további, nukleinsavaffin anyaghoz kötődő intemalizáló faktort tartalmaz.
  38. 38. A 37. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy nevezett nukleinsav terápiásán aktív.
  39. 39. A 38. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy nevezett nukleinsav egy vagy több, a génterápiában hatásos DNS molekulát foglal magában.
  40. 40. A 39. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy nevezett DNS molekulák citokineket kódolnak.
  41. 41. A 38. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy nevezett nukleinsav olyan nukleotid-szekvenciát tartalmaz, amelyről sejtműködést specifikusan gátló RNS molekulák íródhatnak át.
  42. 42. A 37. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav-affin anyag szerves polikation.
  43. 43. A 42. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a polikation polilizin.
  44. 44. A 37. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag és az intemalizáló faktor ugyanahhoz a nukleinsav-affin anyaghoz kötődik.
  45. 45. A 44. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag és az intemalizáló faktor polilizinhez kötődik.
  46. 46. A 45. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy azonkívül nem kovalensen kötött polilizint tartalmaz.
  47. 47. A 37-46. igénypontok bármelyike szerinti komplex alkotórészeként felhasználható konjugátum, azzal jellemezve, hogy a nevezett konjugátum egy nukleinsav-affin anyaghoz kötött endoszóma-litikus anyagot tartalmaz.
  48. 48. A 47. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag a nukleinsav-affin anyaghoz kovalensen kötődik.
  49. 49. A 47. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag nem kovalensen kötődik a nukleinsavaffin anyaghoz.
  50. 50. A 49. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a kötés egy biotin-sztreptavidin hídon keresztül valósul meg.
  51. 51. A 49. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a kötés ionosán történik.
  52. 52. A 47. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag vírus vagy víruskomponens.
  53. 53. Az 52. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag adenovírus.
  54. 54. Az 53. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus mutáns.
  55. 55. Az 54. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus replikációra képtelen mutáns.
  56. 56. Az 55. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus az ElA-régióban egy vagy több mutációt és/vagy kivágást szenvedett mutáns.
  57. 57. Az 53. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus inaktivált.
  58. 58. Az 57. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus rövidhullámú UV-vel inaktivált.
  59. 59. Az 57. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus UV/psoralennel inaktivált.
  60. 60. Az 57. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus formaldehiddel inaktivált.
  61. 61. Az 52. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a víruskomponens adenovírus-fehérje.
  62. 62. Az 52. igénypont szerinti konjugátum, azzal
    HU 211 925 A9 jellemezve, hogy a vírus picomavírus, előnyösen rhinovírus.
  63. 63. A 62. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a rhinovírus inaktivált.
  64. 64. A 47. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag per se nem internalizáló faktor a transzfekcióra kiszemelt sejt számára.
  65. 65. A 64. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag vírus vagy víruskomponens, amely humán sejt számára nem internalizáló faktor.
  66. 66. A 64. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag olyan vírus, amely az embertől eltérő fajra fertőző.
  67. 67. A 66. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a vírus adenovírus.
  68. 68. A 67. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a vírus madár adenovírus.
  69. 69. A 68. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az adenovírus a Chick Embryo Lethal Orphan (csirke embriót elölő) vírus.
  70. 70. A 64. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag egy tetszés szerint módosított endoszóma-litikus virális peptid.
  71. 71. A 70. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve. hogy az endoszóma-litikus peptid influenzahemagglutinin HA2-peptid.
  72. 72. A 71. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve. hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-PheGlu-Ala-lle-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-GluGly-Met-Ile-Rsp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  73. 73. A 71. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a peptid szekvenciája: Gly-Leu-PheGly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-GluGly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  74. 74. A 47. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az endoszóma-litikus anyag nem virális, adott esetben módosított természetes vagy szintetikus peptid.
  75. 75. Endoszóma-litikus peptid, amely felhasználható a 32. igénypont szerinti készítmény alkotórészeként, azzal jellemezve, hogy endoszóma-litikus doménnel és nukleinsav-kötő doménnel rendelkezik.
  76. 76. A 75. igénypont szerinti endoszóma-litikus peptid, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav-kötő dómén egy oligolizin farok.
  77. 77. Eljárás a 48. igénypont szerinti konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vírust vagy egy (poli)peptid endoszóma-litikus anyagot és egy poliamint transzglutamináz jelenlétében enzimesen kapcsolunk össze.
  78. 78. Eljárás a 48. igénypont szerinti konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vírust vagy egy (poli)peptid endoszóma-litikus anyagot és egy políamint kémiailag kapcsolunk össze.
  79. 79. Eljárás a 49. igénypont szerinti konjugátum előállítására, amely magában foglalja
    a) egy vírus vagy víruskomponens biotinnal történő módosítását és
    b) az a) lépésben módosított vírus vagy víruskomponens sztreptavidinnel kapcsolt poliaminhoz való kötését.
  80. 80. Eljárás nukleinsavak bevitelére magasabb rendű eukarióta sejtekbe, azzal jellemezve, hogy a sejteket az 1-36. igénypontok szerinti készítménnyel kezeljük.
  81. 81. A 80. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek humán sejtek.
  82. 82. A 81. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek humán daganatsejtek.
  83. 83. A 81. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek humán mioblasztok.
  84. 84. A 81. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek humán fibroblasztok.
  85. 85. A 81. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek humán hepatociták.
  86. 86. A 81. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek humán endotél sejtek.
  87. 87. A 81. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek humán tüdő epitél sejtek.
  88. 88. A 81. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményben a nukleinsav génterápiásán hatásos.
  89. 89. A 82. és 88. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a daganatsejteket a készítménnyel ex vivő kezeljük és hogy nevezett DNS egy vagy több immunszabályozó anyagot, előnyösen citokint kódol.
  90. 90. Eljárás egy szóban forgó fehérje előállítására magasabb rendű eukarióta, sejtekben, azzal jellemezve, hogy a sejteket az 1. igénypont szerinti készítménnyel kezeljük, ahol a nukleinsav olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely a kívánt fehérjét kódolja, a sejteket a fehéqe kifejeződéséhez alkalmas körülmények között szaporítjuk és a fehérjét izoláljuk.
    96. Készítmény magasabb rendű eukarióta sejteknek nukleinsav komplexszel történő transzfekciójára, lényegében ahogy itt leírtuk hivatkozással a mellékelt példákra.
    97. Nukleinsav komplex, amely a 96. igénypont szerinti készítmény alkotórészeként alkalmazható, lényegében ahogy itt leírtuk hivatkozással a mellékelt példákra.
    98. Konjugátum, amely a 97. igénypont szerinti komplex alkotórészeként alkalmazható, lényegében ahogy itt leírtuk hivatkozással a mellékelt példákra.
    99. Endoszóma-litikus peptid, amely a 96. igénypont szerinti készítmény alkotórészeként alkalmazható, lényegében ahogy itt leírtuk hivatkozással a mellékelt példákra.
    100. Eljárás a 48. igénypont szerinti konjugátum előállítására, lényegében ahogy itt leírtuk hivatkozással a mellékelt példákra.
    101. A 77., 78., 79. vagy 100. igénypont szerinti eljárással készült konjugátum.
    102. Eljárás nukleinsavnak magasabb rendű eukarióta sejtekbe történő bevitelére, lényegében az itt leírtak és a referenciaként csatolt példák szerint.
    HU 211 925 A9
    103. Eljárás egy szóban forgó fehérje előállítására, lényegében az itt leírtak és a referenciaként csatolt példák szerint.
    104. A 90. vagy 103. igénypontok szerinti módszerrel előállított fehérje. 5
    105. Gyógyszerkészítmény, amely egy 96. igénypont szerinti kompozíciót tartalmaz, lényegében ahogy itt leírtuk hivatkozással a mellékelt példákra.
    106. Transzfekciós kit lényegében ahogy itt leírtuk hivatkozással a mellékelt példákra.
HU95P/P00694P 1991-09-30 1995-06-30 Composition for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells HU211925A9 (en)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76803991A 1991-09-30 1991-09-30
US76778891A 1991-09-30 1991-09-30
US82710392A 1992-01-30 1992-01-30
US82710292A 1992-01-30 1992-01-30
US86475992A 1992-04-07 1992-04-07
US93778892A 1992-09-02 1992-09-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211925A9 true HU211925A9 (en) 1996-01-29

Family

ID=27560281

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400898A HU218846B (hu) 1991-09-30 1992-09-28 Készítmények nukleinsavkomplexek magasabbrendű eukarióta sejtekbe való bevitelére és eljárás az előállításukra
HU95P/P00694P HU211925A9 (en) 1991-09-30 1995-06-30 Composition for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400898A HU218846B (hu) 1991-09-30 1992-09-28 Készítmények nukleinsavkomplexek magasabbrendű eukarióta sejtekbe való bevitelére és eljárás az előállításukra

Country Status (28)

Country Link
US (4) US5547932A (hu)
EP (2) EP0545016A1 (hu)
JP (1) JPH10506001A (hu)
CN (1) CN1059705C (hu)
AT (1) ATE215990T1 (hu)
AU (1) AU671084B2 (hu)
BG (1) BG62740B1 (hu)
BR (1) BR9206559A (hu)
CA (1) CA2118816C (hu)
CZ (1) CZ293141B6 (hu)
DE (1) DE59209951D1 (hu)
DK (1) DK0607206T3 (hu)
EE (1) EE03195B1 (hu)
ES (1) ES2173083T3 (hu)
FI (1) FI941474A0 (hu)
HK (1) HK1013104A1 (hu)
HU (2) HU218846B (hu)
IL (1) IL103171A (hu)
MX (1) MX9205543A (hu)
NO (1) NO316744B1 (hu)
NZ (1) NZ244306A (hu)
PL (1) PL180304B1 (hu)
PT (1) PT607206E (hu)
RO (1) RO117861B1 (hu)
SG (1) SG44680A1 (hu)
SI (1) SI9200236B (hu)
SK (1) SK281682B6 (hu)
WO (1) WO1993007283A1 (hu)

Families Citing this family (418)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5981273A (en) * 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
CA2131620A1 (en) * 1992-03-20 1993-09-30 Louis C. Smith A dna transporter system and method of use
ATE260679T1 (de) * 1992-04-03 2004-03-15 Univ California Selbstorganisierendes system zur verabreichung von polynukleotiden enthaltend ein amphiphatisches peptid
WO1994006923A1 (en) * 1992-09-24 1994-03-31 The University Of Connecticut Modification of a virus to redirect infectivity and enhance targeted delivery of polynucleotides to cells
EP0689604A1 (de) * 1993-03-19 1996-01-03 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Verfahren zur herstellung von krebsvakzinen
DE4311651A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
US5578475A (en) * 1993-07-12 1996-11-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
DE4335025A1 (de) * 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
EP0648493A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-19 Tadatsugu Prof. Dr. Taniguchi A method to reverse the phenotype of transformed cells by the transcription factor IRF-1
US5928944A (en) * 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
MX9603866A (es) * 1994-03-18 1997-03-29 Boehringer Ingelheim Int Procedimiento para el tratamiento de celulas eucarioticas.
WO1995026411A2 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 The Uab Research Foundation Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
US6284880B1 (en) 1994-05-30 2001-09-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Chicken embryo lethal orphan (CELO) virus GAM-1
DE4418965A1 (de) * 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
DE4426429A1 (de) * 1994-07-26 1996-02-01 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen
US6468981B1 (en) 1994-07-29 2002-10-22 Emory University Compositions and methods for targeting pharmaceutically active materials to cells containing androgen receptors
US5525606A (en) 1994-08-01 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Substituted 06-benzylguanines and 6(4)-benzyloxypyrimidines
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US6465253B1 (en) 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5965541A (en) * 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5846782A (en) * 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5962311A (en) * 1994-09-08 1999-10-05 Genvec, Inc. Short-shafted adenoviral fiber and its use
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US6010871A (en) * 1994-09-29 2000-01-04 Ajinomoto Co., Inc. Modification of peptide and protein
US6221959B1 (en) 1994-11-18 2001-04-24 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
US6359054B1 (en) 1994-11-18 2002-03-19 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions for intramuscular administration
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
DE69627644T2 (de) * 1995-03-09 2004-02-19 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Vektoren, die therapeutische gene fuer antimikrobielle peptide enthalten, zur verwendung in der gentherapie
WO1996029423A1 (en) * 1995-03-20 1996-09-26 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range
DE19510344C1 (de) * 1995-03-22 1996-11-07 Boehringer Ingelheim Int Verwendung einer Tumorvakzine
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
EP0832269A1 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
WO1996040961A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
ES2333425T5 (es) * 1995-06-15 2012-08-28 Crucell Holland B.V. Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante humano destinados a terapia génica
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
GB9515356D0 (en) * 1995-07-26 1995-09-20 Medical Res Council Improvements in or relating to delivery of nucleic acid
US5770720A (en) * 1995-08-30 1998-06-23 Barnes-Jewish Hospital Ubiquitin conjugating enzymes having transcriptional repressor activity
IL115199A (en) 1995-09-07 2005-05-17 Opperbas Holding Bv Composition comprising a polynucleic acid molecule in a liposome and method using said composition
CA2279675A1 (en) 1995-12-15 1997-06-16 Enzo Therapeutics, Inc. Property effecting and/or property exhibiting constructs for localizing a nucleic acid construct within a cell for therapeutic and diagnostic uses
WO1997028817A1 (en) * 1996-02-09 1997-08-14 Cheng Pi Wan Receptor ligand-facilitated delivery of biologically active molecules
DE19605548A1 (de) * 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
AU728146B2 (en) 1996-03-14 2001-01-04 Immune Response Corporation, The Targeted delivery of genes encoding interferon
DE19615803A1 (de) 1996-04-20 1997-10-23 Boehringer Ingelheim Int CELO-Virus
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
DE69725878T2 (de) 1996-08-13 2004-07-29 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Zusammensetzungen zur polynukleotidabgabe
DE19632532A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung von Säugetieren mit definierten genetischen Eigenschaften
US5948681A (en) * 1996-08-14 1999-09-07 Children's Hospital Of Philadelphia Non-viral vehicles for use in gene transfer
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US5965441A (en) * 1996-11-13 1999-10-12 The General Hospital Coporation HSV/AAV hybrid amplicon vectors
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
WO1998027209A1 (en) * 1996-12-18 1998-06-25 Emory University Polycationic oligomers
US6093392A (en) * 1997-03-14 2000-07-25 Childrens Hospital Of Phildelphia Methods and compositions for use in gene therapy for treatment of hemophilia
US20040009166A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-15 Filpula David R. Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation
JP4187277B2 (ja) * 1997-04-30 2008-11-26 エンゾン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6635623B1 (en) 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
US6172211B1 (en) 1997-07-11 2001-01-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Nucleic acid encoding tag7 polypeptide
WO1999002192A1 (en) * 1997-07-11 1999-01-21 Brandeis University Method of inducing apoptosis by reducing the level of thiamin
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
EP1007673B1 (en) 1997-07-30 2008-12-17 Emory University Novel bone mineralization proteins, dna, vectors, expression systems
WO1999007723A1 (en) * 1997-08-07 1999-02-18 University Of Maryland, Baltimore Nucleic acid uptake and release vehicle
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6197332B1 (en) * 1997-08-13 2001-03-06 Chiron Corporation Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US5998386A (en) 1997-09-19 1999-12-07 Feldman; Arthur M. Pharmaceutical compositions and method of using same for the treatment of failing myocardial tissue
US6555367B1 (en) * 1997-10-10 2003-04-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
CA2308606A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
US7294755B1 (en) 1997-11-14 2007-11-13 Cedars-Sinai Medical Center Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
ATE426036T1 (de) * 1997-11-14 2009-04-15 Cedars Sinai Medical Center Transfektion und transfer nicht humaner mannlicher keimzellen zur generierung transgener nicht humaner saugetiere
US6734338B1 (en) 1997-11-14 2004-05-11 Cedars-Sinai Medical Center Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
EP0945138A1 (en) * 1997-12-04 1999-09-29 Université Louis Pasteur de Strasbourg Transfection particles
EP2138191A1 (en) * 1998-01-05 2009-12-30 University Of Washington Enhanced transport using membrane disruptive agents
AU1979599A (en) 1998-01-14 1999-08-02 Chiron S.P.A. (neisseria meningitidis) antigens
WO1999055365A1 (en) 1998-04-30 1999-11-04 Cornell Research Foundation, Inc. Adenoviral vectors with tandem fiber proteins
BR9910089A (pt) 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
US7244714B1 (en) * 1998-06-12 2007-07-17 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US7091192B1 (en) 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US20040043489A1 (en) * 1998-07-08 2004-03-04 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
WO2000011019A1 (en) * 1998-08-21 2000-03-02 Felix Frey Conjugates of dna interacting groups with steroid hormones for use as nucleic acid transfection agent
AU767975B2 (en) 1998-09-11 2003-11-27 Genvec, Inc. Alternatively targeted adenovirus
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
EP1121437B1 (en) 1998-10-15 2008-02-20 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
WO2000027795A1 (en) 1998-11-12 2000-05-18 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US20050063950A1 (en) * 1998-11-19 2005-03-24 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
ATE483816T1 (de) 1998-11-19 2010-10-15 Univ Georgetown Systemisches virus/ligand genabgabemittel und gentherapie
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
ES2310055T3 (es) 1998-12-16 2008-12-16 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinasa humana dependiente de ciclina (hpnqalre).
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
GB9908195D0 (en) 1999-04-09 1999-06-02 Microbiological Res Authority Treatment of intracellular infection
DE19918446A1 (de) * 1999-04-23 2000-11-23 Univ Eberhard Karls Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
US6514762B1 (en) 1999-04-23 2003-02-04 New Mexico State University Technology Transfer Corporation Delivery of nucleotides by electrochemical release
RU2245366C2 (ru) 1999-04-30 2005-01-27 Чирон С.Р.Л. Антиген neisseria, кодирующая его нуклеиновая кислота, их использование
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) * 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US6696272B1 (en) 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
US20080281041A1 (en) 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US8541548B2 (en) * 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
DK1102785T3 (da) * 1999-06-07 2013-05-13 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til lægemiddeltilførsel ved anvendelse af pH-følsomme molekyler
US8137695B2 (en) * 2006-08-18 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
DE1221490T1 (de) * 1999-09-17 2003-05-28 Tgt Lab S A De C V Rekombinante, adenovirale vektoren und ihre verwendung zur behandlung von unterschiedlichen typen der leber-, nieren- und lungenfibrose und hypertrophischen narben
EP2275552B1 (en) 1999-10-29 2015-09-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Neisserial antigenic peptides
CA2395636A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Novartis Ag Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
US7737108B1 (en) 2000-01-07 2010-06-15 University Of Washington Enhanced transport using membrane disruptive agents
PT2289545T (pt) 2000-01-17 2016-09-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacina de omv suplementada contra meningococos
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
PT2270030E (pt) 2000-02-28 2012-07-24 Novartis Vaccines & Diagnostic Expressão heteróloga de proteínas de neisseria
US6680172B1 (en) 2000-05-16 2004-01-20 Regents Of The University Of Michigan Treatments and markers for cancers of the central nervous system
EP1157999A1 (en) * 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
EP1301612A2 (en) * 2000-05-31 2003-04-16 Genvec, Inc. Method and composition for targeting an adenoviral vector
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
EP1294908B1 (de) 2000-06-28 2006-03-08 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin Verfahren zur verbesserung der transfektionseffizienz
US20040058856A1 (en) * 2000-07-26 2004-03-25 Soo-Young Choi Oligolysine transducing domain, oligolysine-cargo molecule complex and uses thereof
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20040033605A1 (en) * 2000-09-20 2004-02-19 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells
DE60138403D1 (de) * 2000-09-26 2009-05-28 Crucell Holland Bv Adenovirale vektoren für die übertragung von genen in zellen der skelettmuskulatur oder myoblasten
EP1191104A1 (en) * 2000-09-26 2002-03-27 Introgene B.V. Gene delivery vehicles and use thereof in the preparation of a medicament and/or vaccine
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
JP2004521614A (ja) * 2000-10-27 2004-07-22 インヴィトロジェン コーポレーション アンチセンスオリゴヌクレオチドを真核細胞に導入する方法
MXPA03003690A (es) 2000-10-27 2004-05-05 Chiron Spa Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos.
US6892140B1 (en) 2000-11-27 2005-05-10 Enteron, Inc. Immunogenic cancer peptides and uses thereof
MXPA00011713A (es) * 2000-11-28 2002-05-31 Tgt Lab S A De C V Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
US6635466B2 (en) * 2001-01-09 2003-10-21 University Of Iowa Research Foundation Adenovirus serotype 30 (Ad30)
AU2002240201A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-19 Yale University Peptides for facilitating composite receptor expression and translocation of macromolecules
ATE398461T1 (de) 2001-02-13 2008-07-15 Us Gov Sec Army Impstoffe zur transkutanen immunisierung gegen reisediarrhö
AU2002258603A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-15 University Of Michigan Method of inhibiting cancerous cell proliferation using ras mutants of gdp-bound conformation
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
US20020193295A1 (en) * 2001-05-04 2002-12-19 Emanuel Calenoff Immunogenic peptides and uses thereof
CA2445947A1 (en) * 2001-04-30 2002-11-07 Targeted Genetics Corporation Lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
WO2002089586A1 (en) * 2001-05-10 2002-11-14 St. Jude Children's Research Hospital Lung epithelial cell line for propagating viruses
US20060159657A1 (en) * 2001-06-14 2006-07-20 Macromed, Incorporated Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US20030003074A1 (en) * 2001-06-14 2003-01-02 Macromed, Inc. Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
EP2000545B1 (en) 2001-06-20 2011-08-31 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of lung tumor
WO2003000707A2 (en) 2001-06-21 2003-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
GB0120022D0 (en) 2001-08-16 2001-10-10 Photobiotics Ltd Conjugate
KR101008758B1 (ko) 2001-09-18 2011-01-14 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 방법 및 이를 위한 조성물
US20060199778A1 (en) * 2001-09-19 2006-09-07 Rutledge Ellis-Behnke Methods and products related to non-viral transfection
AU2002334895B2 (en) 2001-10-09 2006-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
US7745418B2 (en) * 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
EP1448586A4 (en) * 2001-11-02 2006-03-01 Intradigm Corp THERAPEUTIC METHODS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY VEHICLES
EP2325193A3 (en) 2001-11-02 2012-05-02 Insert Therapeutics, Inc. Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
ES2312649T3 (es) 2001-12-12 2009-03-01 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunizacion frente a chlamydia trachomatis.
KR100623128B1 (ko) 2002-01-02 2006-09-14 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료 방법 및 이를 위한 조성물
US8138383B2 (en) * 2002-03-11 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Membrane active heteropolymers
US8008355B2 (en) * 2002-03-11 2011-08-30 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(vinyl ether) polymers
AU2003220161A1 (en) * 2002-03-12 2003-09-29 Nitto Denko Corporation Vector for transfection of eukaryotic cells
AU2003225791A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Department Of Veterans Affairs, Rehabilitation R And D Service Methods and compositions for directing cells to target organs
US20030180712A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biostratum Ab Inhibition of the beta3 subunit of L-type Ca2+ channels
MXPA04010092A (es) 2002-04-16 2004-12-13 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores.
SI1497438T1 (sl) * 2002-04-25 2010-03-31 Crucell Holland Bv Sredstva in postopki za pripravo adenovirusnih vektorjev
US20040142450A1 (en) * 2002-05-10 2004-07-22 Seo Sang Heui Lung epithelial cell line for propagating viruses
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20050233993A1 (en) * 2002-06-05 2005-10-20 Kadonaga James T Methods for promoting homologous recombination
SI1515752T1 (sl) 2002-06-19 2009-06-30 Univ Health Network Aktivacija ACE2 za zdravljenje srčne, pljučne in ledvične bolezni in hipertenzije
US20060003316A1 (en) * 2002-07-15 2006-01-05 John Simard Immunogenic compositions derived from poxviruses and methods of using same
EP2277551B1 (en) 2002-09-06 2013-05-08 Cerulean Pharma Inc. Cyclodextrin-based polymers for delivering the therapeutic agents covalently bound thereto
US20050260601A1 (en) * 2002-09-09 2005-11-24 Whitt Michael A Recombinant mutants of rhabdovirus and methods of use thereof
EP1537208A1 (en) 2002-09-13 2005-06-08 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
EP1549767A4 (en) 2002-09-26 2006-06-07 Amgen Inc MODULATION OF FORKHEAD BOX O1A GENE EXPRESSION
US20060171883A1 (en) * 2002-10-10 2006-08-03 Phillips Catherine A Detection, localization and staging of tumors using labeled activated lymphocytes directed to a tumor specific epitope
WO2004044136A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2’-modified nucleosides for use in gene modulation
EP1560839A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc CHIMERIC OLIGOMER COMPOUNDS AND THEIR USE IN GENE MODULATION
US20050026859A1 (en) * 2002-11-12 2005-02-03 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
US20080026077A1 (en) * 2002-11-12 2008-01-31 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
JP4986109B2 (ja) 2002-11-13 2012-07-25 ジェンザイム・コーポレーション アポリポタンパク質ｂ発現のアンチセンス調節
PT2336318E (pt) 2002-11-13 2013-06-12 Genzyme Corp Modulação anti-sentido da expressão de apolipoproteína b
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004072284A1 (en) 2003-02-11 2004-08-26 Antisense Therapeutics Ltd Modulation of insulin like growth factor i receptor expression
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7217566B2 (en) * 2003-03-24 2007-05-15 Invitrogen Corporation Attached cell lines
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
AU2004231740A1 (en) * 2003-04-17 2004-11-04 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Desmoglein 4 is a novel gene involved in hair growth
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040220085A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Compositions for nucleic acid delivery
US20040220084A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Methods for nucleic acid delivery
BRPI0410886A (pt) 2003-06-03 2006-07-04 Isis Pharmaceuticals Inc composto de filamento duplo, composição farmacêutica, sal farmaceuticamente aceitável, métodos de modificação do ácido nucleico que codifica a survivina humana, de inibição da expressão da suvivina em células ou tecidos, e de tratamento de uma condição associada com a expressão ou superexpressão da suvivina, e, oligonucleotìdeo de rnai de filamento único
WO2005002509A2 (en) * 2003-06-09 2005-01-13 Corixa Corporation Dna vectors
WO2005007819A2 (en) 2003-07-09 2005-01-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds
US7683036B2 (en) 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
EP1668130A2 (en) 2003-09-18 2006-06-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eif4e expression
US7662929B2 (en) 2003-10-10 2010-02-16 Alchemia Oncology Pty Limited Antibody that specifically binds hyaluronan synthase
EP2267154A1 (en) 2003-10-23 2010-12-29 Illumigen Biosciences, Inc. Oligoadenylate synthetase
WO2005056752A2 (en) 2003-10-24 2005-06-23 Gencia Corporation Methods and compositions for delivering polynucleotides
US20090208478A1 (en) * 2003-10-24 2009-08-20 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
SI2161283T1 (sl) 2003-11-17 2014-10-30 Genentech, Inc. Sestavki, ki obsegajo protitelesa proti CD79b, konjugirana na sredstvo, ki inhibira rast, ali na citotoksično sredstvo, in postopki za zdravljenje tumorja hematopoetskega izvora
EP1697534B1 (en) 2003-12-01 2010-06-02 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
US20050265956A1 (en) * 2004-01-12 2005-12-01 Ye Liu Polyalkyleneimine-graft-biodegradable polymers for delivery of bioactive agents
US20050164271A1 (en) 2004-01-20 2005-07-28 Sanjay Bhanot Modulation of glucocorticoid receptor expression
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
US20050227940A1 (en) * 2004-01-23 2005-10-13 City Of Hope Amplifying interfering RNA (RNAi) expression and effects
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050203047A1 (en) * 2004-03-10 2005-09-15 Ulrich Thomann Delivery vectors for short interfering RNA, micro-RNA and antisense RNA
US8790919B2 (en) 2004-03-15 2014-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of RNA by RNase H
EP1730280B1 (en) * 2004-03-26 2018-10-24 Curis, Inc. Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof
PT1736541E (pt) 2004-03-29 2013-01-31 Galpharma Co Ltd Nova proteína galectina 9 modificada e sua utilização
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
JP5101288B2 (ja) * 2004-10-05 2012-12-19 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー アプタマー調節される核酸及びその利用
JP2008515908A (ja) 2004-10-06 2008-05-15 ユニバーシティー オブ ロチェスター 組織因子経路を阻害する薬剤を使用する、肺高血圧症の治療
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
US8999944B2 (en) 2005-01-20 2015-04-07 University Of Rochester Thioredoxin interacting protein (TXNIP) as regulator of vascular function
AU2006213686A1 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Avi Bio Pharma, Inc. Antisense composition and method for treating muscle atrophy
WO2006091722A2 (en) * 2005-02-23 2006-08-31 Uab Research Foundation Alkyl-glycoside enhanced vaccination
CA2597325A1 (en) 2005-03-10 2006-09-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating vascular integrity
ES2381201T3 (es) 2005-03-31 2012-05-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos
US8734851B2 (en) * 2005-04-29 2014-05-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Localized delivery of nucleic acid by polyelectrolyte assemblies
UA95446C2 (ru) 2005-05-04 2011-08-10 Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. Мутаци в генах oas1
DE102005023993A1 (de) * 2005-05-20 2006-11-23 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Nicht virales Vektorsystem zum Transport von Nukleinsäure in die Lunge
US7807652B2 (en) 2005-11-21 2010-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
US20090317802A1 (en) * 2005-12-09 2009-12-24 Bhatia Sangeeta N Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells
US20090068158A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
US20090074733A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-19 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
WO2007089584A2 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to huntingtin
EP1984399A4 (en) * 2006-02-10 2010-03-03 Univ California TRANSDUCIBLABLE DELIVERY OF SIRANA BY MEANS OF DSRNA BINDEDOMADE FUSIONS TO PTD / CPPS
AU2007219615B2 (en) 2006-03-03 2013-11-28 Promis Neurosciences Inc. Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases
WO2007109584A1 (en) * 2006-03-16 2007-09-27 University Of Washington Temperature-and ph-responsive polymer compositions
EP2007428A2 (en) 2006-04-05 2008-12-31 Genentech, Inc. Method for using boc/cdo to modulate hedgehog signaling
EP2013344B1 (en) 2006-05-03 2012-08-29 Baltic Technology Development, Ltd. Antisense agents combining strongly bound base - modified oligonucleotide and artificial nuclease
US20110206692A1 (en) 2006-06-09 2011-08-25 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
CN101506368B (zh) * 2006-07-12 2017-02-08 加利福尼亚大学董事会 通过可逆的磷酸三酯电荷中和保护基转导运输核酸
US8198253B2 (en) 2006-07-19 2012-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to HBXIP
US8017109B2 (en) * 2006-08-18 2011-09-13 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(acrylate) polymers
AU2007292874B2 (en) 2006-09-08 2013-11-21 Rhode Island Hospital Treatment, prevention, and reversal of alcohol-induced liver disease
JP2010502719A (ja) 2006-09-08 2010-01-28 ロード アイランド ホスピタル アルコール誘発性脳疾患の治療、予防および回復
US8158595B2 (en) * 2006-11-09 2012-04-17 California Institute Of Technology Modular aptamer-regulated ribozymes
EP2099496A2 (en) * 2006-12-08 2009-09-16 Massachusetts Institute of Technology Delivery of nanoparticles and/or agents to cells
US8048998B2 (en) * 2007-01-19 2011-11-01 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of LNA oligonucleotides
US8834918B2 (en) * 2007-01-22 2014-09-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Modified multilayered film
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
WO2008103962A2 (en) 2007-02-22 2008-08-28 Genentech, Inc. Methods for detecting inflammatory bowel disease
US7981688B2 (en) 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
EP2139447A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
CA2584494A1 (en) * 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
EP3293266A1 (en) 2007-05-04 2018-03-14 University Health Network Il-12 immunotherapy for cancer
US20090082217A1 (en) * 2007-07-16 2009-03-26 California Institute Of Technology Selection of nucleic acid-based sensor domains within nucleic acid switch platform
US20120165387A1 (en) 2007-08-28 2012-06-28 Smolke Christina D General composition framework for ligand-controlled RNA regulatory systems
US8367815B2 (en) * 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US8865667B2 (en) * 2007-09-12 2014-10-21 California Institute Of Technology Higher-order cellular information processing devices
AU2008307482B2 (en) 2007-10-02 2012-07-12 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-RNA and precursors thereof
US20090105375A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-23 Lynn David M Ultrathin Multilayered Films for Controlled Release of Anionic Reagents
US9029524B2 (en) * 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
EP2077119A1 (de) * 2007-12-21 2009-07-08 Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. Behandlung von Fibrosen und Lebererkrankungen
US8344116B2 (en) * 2008-03-17 2013-01-01 Case Western Reserve University Polymers and complexes for delivery of nucleic acids to intracellular targets
WO2009114942A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
AU2009232355A1 (en) 2008-04-04 2009-10-08 Calando Pharmaceuticals, Inc. Compositions and use of EPAS1 inhibitors
GB2459436A (en) * 2008-04-08 2009-10-28 Henderson Morley Plc Vaccine adjuvant
US8324333B2 (en) 2008-06-05 2012-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Anionic charge-dynamic polymers for release of cationic agents
WO2010008582A2 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell drug delivery system
NZ591416A (en) 2008-08-25 2012-11-30 Excaliard Pharmaceuticals Inc Antisense oligonucleotides directed against connective tissue growth factor and uses thereof
EP2949752B1 (en) 2008-09-22 2017-12-20 RXi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering rnai compounds
WO2010065662A2 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Curna, Inc. Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirtuin 1
MX2011005918A (es) 2008-12-04 2011-06-17 Opko Curna Llc Tratamiento de enfermedades relacionadas con un gen supresor de tumor mediante inhibicion del transcrito antisentido natural para el gen.
ES2629630T3 (es) 2008-12-04 2017-08-11 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con eritropoyetina (EPO) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a EPO
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
CA2752237C (en) 2009-02-12 2020-03-24 Opko Curna, Llc Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
JP6066035B2 (ja) 2009-02-12 2017-01-25 クルナ・インコーポレーテッド グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）関連疾病の、ｇｄｎｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
ES2845644T3 (es) 2009-03-04 2021-07-27 Curna Inc Tratamiento de enfermedades relacionadas con sirtuina1 (SIRT1) mediante inhibición del transcrito del antisentido natural a sirtuina 1
CA2755409C (en) 2009-03-16 2019-04-30 Joseph Collard Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (nrf2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf2
CA2755404C (en) 2009-03-17 2020-03-24 Joseph Collard Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
WO2010107991A2 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of ixolaris, a tissue factor inhibitor, for the treatment and prevention of cancer
US9145555B2 (en) 2009-04-02 2015-09-29 California Institute Of Technology Integrated—ligand-responsive microRNAs
EP3248618A1 (en) 2009-04-22 2017-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
NO2424987T3 (hu) 2009-05-01 2018-04-14
CA2761142C (en) 2009-05-06 2021-06-08 Opko Curna, Llc Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
CN103223177B (zh) 2009-05-06 2016-08-10 库尔纳公司 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病
CN102575251B (zh) 2009-05-18 2018-12-04 库尔纳公司 通过抑制针对重编程因子的天然反义转录物来治疗重编程因子相关的疾病
US8895527B2 (en) 2009-05-22 2014-11-25 Curna, Inc. Treatment of transcription factor E3 (TFE3) and insulin receptor substrate 2(IRS2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TFE3
CA2764683A1 (en) 2009-05-28 2010-12-02 Joseph Collard Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene
CN106390107B (zh) 2009-06-10 2019-12-31 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向
US8426214B2 (en) * 2009-06-12 2013-04-23 University Of Washington System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers
JP6128846B2 (ja) 2009-06-16 2017-05-17 クルナ・インコーポレーテッド パラオキソナーゼ（ｐｏｎ１）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｐｏｎ１遺伝子関連疾患の治療
ES2620960T3 (es) 2009-06-16 2017-06-30 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con un gen de colágeno mediante la inhibición de un transcrito antisentido natural a un gen de colágeno
JP6073133B2 (ja) 2009-06-24 2017-02-01 クルナ・インコーポレーテッド 腫瘍壊死因子受容体２（ｔｎｆｒ２）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｔｎｆｒ２関連疾患の治療
WO2010151674A2 (en) 2009-06-26 2010-12-29 Curna, Inc. Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
KR101802536B1 (ko) 2009-08-05 2017-11-28 큐알엔에이, 인크. 인슐린 유전자 (ｉｎｓ)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 인슐린 유전자 (ｉｎｓ) 관련된 질환의 치료
JP5964232B2 (ja) 2009-08-25 2016-08-03 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド ‘ｉｑモチーフ含有ｇｔｐアーゼ活性化タンパク質’（ｉｑｇａｐ）に対する天然アンチセンス転写産物の阻害によるｉｑｇａｐ関連疾患の治療
DK2473522T3 (en) 2009-09-02 2016-11-28 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
EP4089169A1 (en) 2009-10-12 2022-11-16 Larry J. Smith Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
RU2539772C2 (ru) 2009-10-22 2015-01-27 Дженентек, Инк. Способы и композиции для модуляции гепсином стимулирующего макрофаги белка
WO2011052804A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Tokyo University Of Science Educational Foundation Administrative Organization Method of delivering agent into target cell
US20120244169A1 (en) 2009-11-06 2012-09-27 Fibrogen, Inc. Treatment for Radiation-Induced Disorders
US20110117668A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-19 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-powered smart diagnostic devices
US9080933B2 (en) 2009-11-09 2015-07-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates
CN102781237A (zh) * 2009-11-23 2012-11-14 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的基于环糊精的聚合物
MX2012006072A (es) 2009-11-30 2012-07-23 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de tumores.
EP2509953B1 (en) 2009-12-11 2016-03-30 Genecode AS Methods of facilitating neural cell survival using gdnf family ligand (gfl) mimetics or ret signaling pathway activators
DK2513310T3 (en) 2009-12-16 2018-02-05 Curna Inc TREATMENT OF DISEASES CONNECTED WITH MEMBRANE-BONDED TRANSCRIPTION FACTOR Peptidase, site 1 (MBTPS1), BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPTION TO MBTPS1
EP2515947B1 (en) 2009-12-23 2021-10-06 CuRNA, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
DK2516648T3 (en) 2009-12-23 2018-02-12 Curna Inc TREATMENT OF HEPATOCYTE GROWTH FACTOR (HGF) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST HGF
EP2519634B1 (en) 2009-12-29 2016-06-01 CuRNA, Inc. TREATMENT OF TUMOR PROTEIN 63 (p63) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO p63
JP5993744B2 (ja) 2009-12-29 2016-09-14 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 核呼吸因子１（ｎｒｆ１）に対する天然アンチセンス転写物の阻害による核呼吸因子１関連疾患の治療
EP2521784B1 (en) 2010-01-04 2017-12-06 CuRNA, Inc. Treatment of interferon regulatory factor 8 (irf8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irf8
EP2521785B1 (en) 2010-01-06 2022-03-09 CuRNA, Inc. Inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene for use in a treatment of pancreatic developmental gene related diseases
ES2664866T3 (es) 2010-01-11 2018-04-23 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la globulina fijadora de hormonas sexuales (shbg) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a shbg
WO2011090971A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
DK2529015T3 (en) 2010-01-25 2018-02-26 Curna Inc TREATMENT OF RNASE H1-RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO RNASE H1
CA2790506A1 (en) 2010-02-22 2011-08-25 Curna, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (pycr1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pycr1
AU2011221226A1 (en) 2010-02-23 2012-08-16 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
PL2539451T3 (pl) * 2010-02-24 2016-08-31 Arrowhead Res Corporation Kompozycje do ukierunkowanego dostarczania siRNA
TWI644675B (zh) 2010-04-09 2018-12-21 可娜公司 藉由抑制纖維母細胞生長因子２１（ｆｇｆ２１）之天然反義轉錄物以治療ｆｇｆ２１相關疾病
US8362207B2 (en) 2010-04-16 2013-01-29 Wake Forest University Health Sciences Multi-level specific targeting of cancer cells with IL-13
WO2011139917A1 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression
KR20130101442A (ko) 2010-05-03 2013-09-13 큐알엔에이, 인크. 시르투인 (sirt)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (sirt) 관련된 질환의 치료
CN107090045A (zh) 2010-05-03 2017-08-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
US9457079B2 (en) 2010-05-12 2016-10-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for producing enteroendocrine cells that make and secrete insulin
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
JP5973996B2 (ja) 2010-05-26 2016-08-23 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ａｔｏｈ１に対する天然アンチセンス転写物の阻害による無調ホモログ１（ａｔｏｈ１）関連疾患の治療
US9057067B2 (en) 2010-07-10 2015-06-16 Kinki University Method for transfecting nucleic acid to cell and nucleic acid complex
RU2611190C2 (ru) 2010-07-14 2017-02-21 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с геном dlg, путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена dlg
EP2625197B1 (en) 2010-10-05 2016-06-29 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
US8993533B2 (en) 2010-10-06 2015-03-31 Curna, Inc. Treatment of sialidase 4 (NEU4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NEU4
US9222088B2 (en) 2010-10-22 2015-12-29 Curna, Inc. Treatment of alpha-L-iduronidase (IDUA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IDUA
RU2611195C2 (ru) 2010-10-27 2017-02-21 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с интерферон- связанным регулятором развития 1 (ifrd1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к ifrd1
US20140134181A1 (en) 2010-11-05 2014-05-15 Kenneth E. Lipson Treatment Method For Lung Remodeling Diseases
WO2012065067A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Georgetown University Immortalization of epithelial cells and methods of use
KR102010598B1 (ko) 2010-11-23 2019-08-13 큐알엔에이, 인크. Nanog에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 nanog 관련된 질환의 치료
US20130344053A1 (en) 2010-12-28 2013-12-26 University Of Rochester Methods of Modifying Insulin Signaling Using Biliverdin Reductase (BVR) and BVR Derived Peptides
PL2670411T3 (pl) 2011-02-02 2019-09-30 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Związki antysensowne ukierunkowane na czynnik wzrostu tkanki łącznej (ctgf) do leczenia bliznowców lub blizn przerostowych
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
EP2687204B1 (en) 2011-03-14 2020-10-14 National University Corporation Hokkaido University Vector for pulmonary delivery, inducing agent, and uses
CN103547588B (zh) 2011-04-13 2016-06-29 Isis制药公司 Ptp1b表达的反义调节
CN103620036B (zh) 2011-06-09 2016-12-21 库尔纳公司 通过抑制共济蛋白(fxn)的天然反义转录物而治疗fxn 相关疾病
EP2721156B1 (en) 2011-06-16 2016-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
WO2013036875A1 (en) 2011-09-07 2013-03-14 Mount Sinai School Of Medicine Ceramidase and cell differentiation
AU2012312433B2 (en) 2011-09-20 2017-07-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of GCGR expression
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
BR112014009790A2 (pt) 2011-10-25 2018-05-15 Isis Pharmaceuticals Inc composto para modulação antisense da expressão de gccr, seu uso e composição
HUE040179T2 (hu) 2012-03-15 2019-02-28 Curna Inc Agyi eredetû neutrotróf faktorral (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) összefüggõ betegségek kezelése a BDNF-fel kapcsolatos természetes antiszensz transzkriptumok gátlása révén
EP2885313A4 (en) 2012-08-20 2016-03-09 Univ California POLYNUCLEOTIDES WITH BIOREVERSIBLE GROUPS
US20160136159A1 (en) 2012-09-17 2016-05-19 Chemedest Ltd. Method for Treating Peripheral Neuropathy
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
EP2908853B1 (en) 2012-10-21 2018-12-05 University Of Rochester Thy1 (cd90) as a therapy to control adipose tissue accumulation
WO2014078819A2 (en) 2012-11-16 2014-05-22 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
US10052364B2 (en) 2013-03-15 2018-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
US9822418B2 (en) 2013-04-22 2017-11-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Mutations in PDGFRB and NOTCH3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis
WO2014197938A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy
CN111235149B (zh) 2013-09-05 2024-04-16 萨罗塔治疗公司(美国) 酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入
US10036020B2 (en) 2013-09-19 2018-07-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Compositions and methods for inhibiting JC virus (JCV)
WO2015070210A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Wake Forest University Health Sciences Epha3 and multi-valent targeting of tumors
WO2015116902A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Genentech, Inc. G-protein coupled receptors in hedgehog signaling
AU2015214264B2 (en) 2014-02-04 2018-12-20 Curis, Inc. Mutant Smoothened and methods of using the same
WO2015171918A2 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and uses for treatment thereof
RU2771104C2 (ru) 2014-05-14 2022-04-26 Таргиммьюн Терапьютикс Аг Улучшенные полиэтилениминовые полиэтиленгликолевые векторы
US10729785B2 (en) * 2014-05-19 2020-08-04 BioNTech SE Particles comprising protamine and RNA in combination with endosome destabilizing agents
WO2015200901A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of serotonin expression in gut enteroendocrine cells results in conversion to insulin-positive cells
WO2016011203A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
JP7175608B2 (ja) 2014-11-19 2022-11-21 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 加齢に伴うフレイルのための治療としてのオステオカルシン
EP3234141A4 (en) 2014-12-18 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir tm compounds
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
MA50829A (fr) 2015-06-01 2018-04-11 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'exon induite pat technologie antisens dans le collagène de type vii
CA2989827A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
US10954300B2 (en) 2015-09-28 2021-03-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Use of pentoxifylline with immune checkpoint-blockade therapies for the treatment of melanoma
WO2017062835A2 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating duchenne muscular dystrophy and related disorders
EP3371211A4 (en) 2015-11-04 2019-08-21 Icahn School of Medicine at Mount Sinai METHOD FOR THE TREATMENT OF TUMORS AND CANCER AND IDENTIFICATION OF CANDIDATE PATIENTS FOR SUCH TREATMENT
CA3007424A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Children's Hospital Los Angeles "mobilizing leukemia cells"
SG11201805341RA (en) 2015-12-23 2018-07-30 Univ Queensland Technology Nucleic acid oligomers and uses therefor
AU2017213826A1 (en) 2016-02-04 2018-08-23 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EA201892366A1 (ru) 2016-04-18 2019-03-29 Сарепта Терапьютикс, Инк. Антисмысловые олигомеры и способы их применения для лечения заболеваний, связанных с геном кислой альфа-глюкозидазы
WO2017189730A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
EP3500581A4 (en) 2016-08-17 2021-10-06 Solstice Biologics, Ltd. POLYNUCLEOTIDE CONSTRUCTS
WO2018209288A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded rna complexes and uses related thereto
US11597744B2 (en) 2017-06-30 2023-03-07 Sirius Therapeutics, Inc. Chiral phosphoramidite auxiliaries and methods of their use
WO2019055460A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 The Children's Medical Center Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TRANSPOSON-ASSOCIATED DISEASES
EP3697910A4 (en) 2017-10-18 2021-07-14 Sarepta Therapeutics, Inc. ANTISENSE OLIGOMERIC COMPOUNDS
WO2019126578A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
AU2019247490A1 (en) 2018-04-06 2020-10-22 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
CA3214540A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Pasi A. Janne Compositions and methods for treating cancer

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN165717B (hu) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5428132A (en) * 1987-10-11 1995-06-27 United States Of America Conjugate and method for integration of foreign DNA into cells
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5149782A (en) * 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
JP3222461B2 (ja) * 1990-05-18 2001-10-29 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 新規タンパク質―ポリカチオン結合体
JPH07500961A (ja) * 1990-10-01 1995-02-02 ユニバーシティ オブ コネチカット 細胞による選択的内在化を目的としたウイルス及び細胞の標的設定
AU1922092A (en) * 1991-05-03 1992-12-21 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Targeted delivery of genes encoding cell surface receptors
AU668870B2 (en) * 1991-05-14 1996-05-23 Targetech, Inc Targeted delivery of genes encoding immunogenic proteins
AU2160992A (en) * 1991-06-05 1993-01-12 Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan, The Targeted delivery of genes encoding secretory proteins
KR100252547B1 (ko) * 1991-09-05 2000-09-01 프레드 마리얀스키 폴리-또는 올리고누클레오티드의 세포로의 표적화된 전달
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5981273A (en) 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5225182A (en) * 1991-10-31 1993-07-06 Sharma Yash P Vectored drug delivery system using a cephaloplastin linking agent and a methed of using the system
US5922859A (en) 1992-02-01 1999-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Complexes containing nucleic acid which can be taken-up by endocytosis into higher eukaryotic cells
US5583020A (en) * 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
WO1994017832A1 (en) 1993-02-09 1994-08-18 The Scripps Research Institute Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
DE4335025A1 (de) 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection

Also Published As

Publication number Publication date
HU9400898D0 (en) 1994-06-28
US5547932A (en) 1996-08-20
WO1993007283A1 (de) 1993-04-15
CN1059705C (zh) 2000-12-20
NO941154D0 (no) 1994-03-29
US6274322B1 (en) 2001-08-14
CZ293141B6 (cs) 2004-02-18
FI941474A (fi) 1994-03-30
DE59209951D1 (de) 2002-05-16
IL103171A0 (en) 1993-02-21
MX9205543A (es) 1993-05-01
SI9200236B (sl) 2002-10-31
SK36894A3 (en) 1994-08-10
US6077663A (en) 2000-06-20
ATE215990T1 (de) 2002-04-15
CA2118816A1 (en) 1993-03-31
EP0607206A1 (de) 1994-07-27
BG62740B1 (bg) 2000-06-30
CZ74694A3 (en) 1995-05-17
EE03195B1 (hu) 1999-06-15
FI941474A0 (fi) 1994-03-30
EP0545016A1 (de) 1993-06-09
US6022735A (en) 2000-02-08
CN1070946A (zh) 1993-04-14
BG98718A (bg) 1995-02-28
SI9200236A (en) 1993-03-31
HU218846B (hu) 2000-12-28
HK1013104A1 (en) 1999-08-13
BR9206559A (pt) 1994-11-08
CA2118816C (en) 2003-06-17
RO117861B1 (ro) 2002-08-30
JPH10506001A (ja) 1998-06-16
EP0607206B1 (de) 2002-04-10
HUT71312A (en) 1995-11-28
NZ244306A (en) 1995-07-26
PL180304B1 (pl) 2001-01-31
AU2652692A (en) 1993-05-03
NO316744B1 (no) 2004-04-26
AU671084B2 (en) 1996-08-15
DK0607206T3 (da) 2002-08-05
PT607206E (pt) 2002-07-31
NO941154L (no) 1994-03-29
SK281682B6 (sk) 2001-06-11
ES2173083T3 (es) 2002-10-16
IL103171A (en) 2003-04-10
SG44680A1 (en) 1997-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211925A9 (en) Composition for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5981273A (en) Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
JP3479298B2 (ja) 高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体
JP6039617B2 (ja) 長期持続性の医薬製剤
US20050215499A1 (en) Lipoproteins as nucleic acid vectors
WO1994017832A1 (en) Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
JP2002514892A (ja) 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
CA2222550A1 (en) Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
JP2000516098A (ja) 短シャフトアデノウイルスファイバーおよびその用途
JP2001503250A (ja) 束縛ペプチドモチーフを用いたターゲッティングアデノウイルス
WO1994021808A1 (de) Verfahren zur herstellung von krebsvakzinen
JP2001521381A (ja) ポリマー修飾ウイルス
EP1489093A1 (en) Peptides, medicinal compositions containing the peptide and medicinal compositions for treating cancer
KR100241685B1 (ko) 핵산 복합체를 고등 진핵세포내로 도입시키기 위한 조성물
RU2138553C1 (ru) Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции
HRP920602A2 (hr) Sastav za uvođenje kompleksa nukleinskih kiselina u više eukariotične stanice
WO1998035984A2 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
JPH06506826A (ja) タンパク性の脂質含有粒子