CN103561725B - 用于肺递送的载体、导入剂及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明通过使用包含GALA或Chol‑GALA的脂质体提供了能给予优异且无先例的肺迁移水平的脂质体。本发明通过使用该脂质体进一步提供了肺部递送运载体，该运载体与现有的运载体相比提供了更强的siRNA敲减。

Description

用于肺递送的载体、导入剂及用途
技术领域
本发明涉及用于肺递送的导入剂和载体及其用途。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年3月14日提交的第2011-55765号日本专利申请的优先权(该申请的全部内容并入本文作为参考)。
背景技术
近年来，对具有在脂质体膜的外表面上引入的功能性分子的脂质体积极地进行了研发，该脂质体用作用于向靶点递送目标物质的载体，所述目标物质例如低分子量药物、核酸药物、抗体药物、肽、蛋白、糖等。在生物医学领域，积极地进行了对核酸药物的研究，核酸药物是步抗体药物和蛋白药物后尘的下一代生物药物。核酸药物的实例包括反义核酸、核酶、核酸适配体、诱骗性寡核苷酸和siRNA。尽管核酸药物的临床应用仍处于其早期阶段，但siRNA已经特别受到关注，西方国家的制药公司和企业已经进行了siRNA的临床试验。然而，大多数这样的临床试验限于局部给药。尽管使用递送系统进行了用于全身给药的临床试验，但那些试验仅限于预期表现出被动累积的一些器官，例如肝脏。因此，为了扩展由siRNA代表的核酸药物的应用范围，亟需建立能主动靶向的递送系统。
已经开发的这样的递送系统的实例包括具有在脂质体膜的外表面上引入的亲水性聚合物(例如，聚亚烷基二醇，如聚乙二醇)的脂质体(参阅专利文献1和专利文献2)。关于这种脂质体，由于改善了脂质体的血液中滞留性，因此脂质体对肿瘤细胞的向性得到改善。此外，已经提出了多功能性包封型纳米装置(MEND)(在下文可以缩写为“MEND”)，并且该装置能用作将基因或肽选择性递送至特定细胞内的药物递送系统。
此外，已经开发了通过使用与GALA结合的胆固醇而在脂质体膜的外表面上引入GALA所获得的脂质体(参阅非专利文献1)。当脂质体经历胞吞作用时，脂质体被包括在核内体之内，并且当核内体与溶酶体融合时，核内体之内的脂质体被降解。然而，关于上述脂质体，包封在脂质体内的物质能从核内体中逃逸并能在细胞质中释放。
GALA是基本由谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸和丙氨酸(EALA)的重复序列的30个氨基酸残基形成的寡肽。由Szoka等人的研究小组合成了GALA(参阅非专利文献2)，并且迄今为止已对其进行了各种研究。已知虽然GALA在中性pH条件下由于谷氨酸的电排斥而采取无规卷曲结构，但在酸性条件下通过电排斥的消解，GALA采取与脂质膜具有高亲和性的α螺旋结构(参阅非专利文献2)。
此外，由于当用胆固醇(Chol)-结合的GALA(Chol-GALA)修饰MEND的表面时，核内体膜和MEND脂质膜在核内体内在酸性条件下经历膜融合，导致包封的物质释放入细胞质中，因此GALA已用作用于改善MEND活性的pH应答性的核内体-逃逸促进要素(参阅专利文献3)。
如上所述，尽管GALA已用作用于改善细胞内动力学的功能性要素，但其作为肺部迁移性要素是未知的。
此外，尽管肺部被提及为某些类型的用核内体可溶性肽修饰的脂质体的靶器官(参阅专利文献4)，但是所述肽的构型与本申请的基本由谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸和丙氨酸(EALA)的重复序列形成的GALA肽的构型在很大程度上是不同的。此外，尚未有关于用特异性迁移至肺部的肽修饰的脂质体的记载或建议。
引用目录
专利文献
PTL1:JP1-249717A
PTL2:JP2004-10481A
PTL3:JP2006-28030A
PTL4:JP10-506001A
非专利文献
NPL1:T.Kakudo等人,Biochemistry,2004;43:5618-5623
NPL2:N.K.Subbarao等人,Biochemistry,1987;26:2964-2972
发明概述
技术问题
本发明的目的为提供了将目的物质特异性递送至肺部的技术。
本发明的目的还为提供载体，所述载体具有优异的贮存稳定性和/或在贮存一定时段之后不聚集或大部分不聚集。
解决问题的方案
本发明人已经对具有使诸如药物的目的物质以高效率迁移至肺部的功能的载体进行了研究。由此，他们发现GALA肽表现出高的肺部迁移性并完成了本发明。
此外，他们还发现甚至当用PEG修饰包括GALA肽的载体(例如，用GALA肽-脂质修饰的脂质体)时，肺部特异性迁移性不消失，并完成了本发明。
此外，他们发现向用GALA肽或GALA肽-脂质修饰的脂质体添加辅助脂质(helperlipid)使得该脂质体具有下述物理性质：优异的贮存稳定性和/或在贮存一定时段之后不聚集或大部分不聚集；并完成了本发明。
因此，本发明提供了下列用途、物质导入剂和载体。
项1.由SEQ ID NO:1表示的GALA肽作为用于向肺部递送目的物质的载体的肺部迁移性要素的用途。
项2.如项1所述的用途，其中所述GALA肽与载体的组分结合。
项3.如项1或2所述的用途，其中所述载体包括脂质和/或胆固醇，并且所述GALA肽与阳离子脂质和/或胆固醇结合。
项4.如项1或2所述的用途，其中所述载体包括阳离子脂质和/或胆固醇，并且所述GALA肽与阳离子脂质和/或胆固醇结合。
项5.靶标为肺部的物质导入剂，所述导入剂具有包封在载体内的目的物质，并且所述载体包括由SEQ ID NO:1表示的GALA肽。
项6.如项5所述的物质导入剂，其中所述GALA肽与载体的组分结合。
项7.如项5或6所述的物质导入剂，其中所述载体包括脂质和/或胆固醇，并且所述GALA肽与阳离子脂质和/或胆固醇结合。
项8.如项5或6所述的物质导入剂，其中所述载体包括阳离子脂质和/或胆固醇，并且所述GALA肽与阳离子脂质和/或胆固醇结合。
项9.如项5至8中任一项所述的物质导入剂，其中所述载体用亲水性聚合物修饰，所述亲水性聚合物选自聚亚烷基二醇、葡聚糖、普鲁兰多糖、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯醚-马来酸酐交替共聚物、直链淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶和角叉菜胶。
项10.如项5至9中任一项所述的物质导入剂，其中所述目的物质为作用于肺部的生物活性物质。
项11.如项5至10中任一项所述的物质导入剂，其中所述目的物质选自药物、核酸、肽、蛋白、糖及其复合物。
项12.如项5至11中任一项所述的物质导入剂，所述目的物质为双链RNA(dsRNA)，其选自meroduplex RNA(部分双链RNA)(mdRNA)、带切口的dsRNA(ndsRNA)、有缺口的dsRNA(gdsRNA)、短干扰核酸(siNA)、siRNA、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、取代的短干扰寡核苷酸、修饰的短干扰寡核苷酸、化学修饰的dsRNA以及转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)。
项13.如项11或12所述的物质导入剂，其中所述目的物质为核酸，并且所述物质导入剂除所述核酸之外还包括聚乙烯亚胺(PEI)。
项14.用于向肺部递送目的物质的载体，所述载体包含由SEQ ID NO:1表示的作为将物质选择性递送至肺部的要素的GALA肽。
项15.如项14所述的载体，其中所述载体包括脂质和/或胆固醇，并且所述GALA肽与阳离子脂质和/或胆固醇结合。
项16.如项14所述的载体，其中所述载体包括阳离子脂质和/或胆固醇，并且所述GALA肽与阳离子脂质和/或胆固醇结合。
项17.如项15或16所述的载体，其中所述载体包括阳离子脂质，并且所述阳离子脂质包括选自DOTMA、DSTAP和DODAP的至少一种类型。
项18.如项14至17中任一项所述的载体，其中所述载体用亲水性聚合物修饰，所述亲水性聚合物选自聚亚烷基二醇、葡聚糖、普鲁兰多糖、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯醚-马来酸酐交替共聚物、直链淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶和角叉菜胶。
项19.如项18所述的载体，其中聚亚烷基二醇为PEG(优选分子量为2000的PEG)。
项20.如项14至19中任一项所述的载体，其还包含辅助脂质(helper lipid)。
项21.如项20所述的载体，其中所述辅助脂质(helper lipid)为EPC、DOPC、DOPE或SOPE。
项22.如项14所述的载体，其中所述载体为脂质体，并且所述脂质体的组成为阳离子脂质/Chol/辅助脂质(helper lipid)/STR-PEG/Chol-GALA或者辅助脂质(helperlipid)/Chol/STR-PEG/Chol-GALA(更优选为选自DOTMA、DODAP或DSTAP的阳离子脂质/Chol/选自EPC、DOPE或SOPE的辅助脂质(helper lipid)/STR-PEG/Chol-GALA，或者EPC/Chol/STR-PEG/Chol-GALA；以及进一步优选为DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG/Chol-GALA、DODAP/Chol/EPC/STR-PEG/Chol-GALA、DSTAP/Chol/EPC/STR-PEG/Chol-GALA、DOTMA/Chol/DOPE/STR-PEG/Chol-GALA、DOTMA/Chol/SOPE/STR-PEG/Chol-GALA或者EPC/Chol/STR-PEG/Chol-GALA)。
项23.如项14所述的载体，其中：
所述载体为脂质体，其包括作为脂质膜的组分的DOTMA、Chol和EPC；
关于DOTMA/Chol/EPC的脂质体的脂质组成(摩尔比)为10至50/20至50/20至70；以及
相对于DOTMA/Chol/EPC的总脂质量，脂质体还包括1mol%至15mol%的STR-PEG2000以及0.1mol%至5mol%的Chol-GALA。
项24.用于将目的物质导入肺部的方法，所述方法包括向哺乳动物给予载体，所述载体具有包封于其内的目的物质并且具有与其结合的由SEQ ID NO:1表示的GALA肽。
项25.用于治疗肺癌的治疗方法，所述方法包括向患有肺癌的哺乳动物给予载体，所述载体具有包封于其内的抗癌剂并且具有与其结合的由SEQ ID NO:1表示的GALA肽。
项26.如项24所述的治疗方法，其中所述肺癌为转移至肺部的癌。
项27.肺癌治疗剂，其包含载体，所述载体具有包封于其内的抗癌剂并具有与其结合的由SEQ ID NO:1表示的GALA肽。
项28.如项27所述的肺癌治疗剂，其中所述肺癌为转移至肺部的癌。
项29.如项3所述的用途、项7所述的物质导入剂或者项15所述的载体，其中所述GALA肽与相对于总脂质量的1mol%至4mol%的脂质组分结合。
本发明的有利效果
关于本发明，提供了用于将目的物质特异性地递送至肺部的载体或物质导入剂，特别是脂质体。此外，本发明的载体或物质导入剂、特别是脂质体能迁移至肺部并且还抑制了其向肝脏的迁移，所述肝脏为主要的积聚器官。此外，本发明的载体或物质导入剂、特别是脂质体尤其在肺部中已表现出超越现有的siRNA递送运载体的敲减作用，并且已经证实了具有非常优异的目的物质的导入效果。
因为本发明所用的包含GALA肽的载体和物质导入剂不具有聚集问题，所以它们不堵塞血管。
附图简述
图1-A示出GALA-修饰的脂质体随时间的肺部迁移的评价结果。
图1-B为其中按比例放大图1-A中纵轴的图表。
图2示出GALA-修饰的脂质体随时间的肝脏迁移的评价结果。
图3示出在各种比例下混合血液和GALA-修饰的MEND的结果，从而评价其与血细胞组分的相互作用。
图4示出GALA-修饰的MEND的尾静脉静脉内给药的结果，其中用[32P]标记siRNA且用[3H]标记脂质膜，并且在给药后1小时测量在肺部中的[32P]和[3H]，从而评价GALA-修饰的MEND向肺部的迁移。
图5示出包封荧光标记的siRNA的GALA-修饰的MEND的尾静脉静脉内给药的结果，并且使用激光共聚焦扫描显微镜评价了在给药后1小时的肺部内GALA-修饰的MEND的定位。
图6示出GALA-修饰的MEND和GALA-未修饰的MEND的尾静脉静脉内给药的结果，并且使用qRT-PCR评价在给药后24小时的肺部中的GALA-修饰的MEND和GALA-未修饰的MEND各自的敲减作用。
图7示出GALA-修饰的MEND的尾静脉静脉内给药的结果，并且使用qRT-PCR评价了在给药后24小时的肺部中的GALA-修饰的MEND的敲减作用。
图8示出GALA-修饰的MEND的尾静脉静脉内给药的结果，并且使用qRT-PCR评价了在给药后24小时的肝脏内的GALA-修饰的MEND的敲减作用。
图9示出GALA-修饰的MEND的尾静脉静脉内给药的结果，并且使用qRT-PCR评价了在给药后24小时的脾脏内的GALA-修饰的MEND的敲减作用。
图10示出当DOTMA、DSTAP和DODAP用作阳离子脂质时，MEND的敲减作用。
图11示出当EPC、DOPE和SOPE用作辅助脂质(helper lipid)时，各MEND的敲减作用。
图12示出当GALA-修饰的MEND连续给药4天时的重量变化。
图13示出当MEND连续给药4天时的AST和ALT的测量结果。
图14示出PEG-修饰的MEND的药代动力学评价结果。
图15示出PEG-修饰的MEND的敲减作用。
图16示出MEND的保存品的敲减作用。
图17示出在室温下贮存1个月之后GALA-修饰的MEND的贮存稳定性的结果。
图18示出具有不同的GALA修饰水平的MEND的尾静脉静脉内给药的结果，并且使用qRT-PCR评价了在给药后24小时的肺部内的GALA-修饰的MEND的敲减作用。
图19示出在肺转移模型中给予GALA-修饰的MEND的肺转移抑制作用。
图20示出在肺转移模型中给予GALA-修饰的MEND的敲减作用。
实施方案描述
将在下文详述本发明。
本发明的载体能通过包含GALA肽而实现向肺部的选择性迁移。
“由SEQ ID NO:1表示的GALA肽”是下述的30个氨基酸的肽。
Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu His Glu AlaLeu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Glu Trp(SEQ ID NO:1)
由SEQ ID NO:1表示的肽在其序列中具有谷氨酸(E)-丙氨酸(A)-亮氨酸(L)-丙氨酸(A)的部分结构的4个单元。由SEQ ID NO:1表示的肽可以在除该部分结构之外的其它部分中具有氨基酸的删除、取代或添加，尽管优选保持部分结构的3个单元或4个单元，更优选保持4个单元。这些修饰的GALA肽也被包括在本发明的“由SEQ ID NO:1表示的GALA肽”中。
关于向由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列进行的氨基酸的删除、取代或添加的数量和位置，氨基酸的数量为1个以上，优选为1个或多个。其具体范围包括：对于删除而言，通常为1至4个，优选为1至3个，进一步优选为1或2个；对于取代而言，通常为1至6个，优选为1至4个，进一步优选为1或2个；以及对于添加而言，通常为1至12个，优选为1至6个，进一步优选为1至4个。氨基酸的取代优选为在类似氨基酸内进行的取代，例如疏水性氨基酸(Leu、Val、Ile、Ala)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)、碱性氨基酸(Arg、Lys、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、中性氨基酸(Gly、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Pro)。应注意的是，在本说明书中，GALA肽有时被简称为“GALA”。
优选在GALA肽与形成所述载体的组分之间形成键。形成所述载体的组分的实例包括脂质、蛋白或肽、糖链、水溶性或水混溶性聚合物(中性、阳离子或阴离子的)、表面活性剂等。尽管键的实例包括任何键，诸如共价键、离子键、氢键和配位键，但共价键或配位键是优选的，并且共价键是最优选的。
GALA肽被包括在能够将物质导入细胞的运载体(载体)中。能够将物质导入细胞的运载体(载体)的实例包括基于脂质的转染试剂、病毒衍生的颗粒、脂质体、核酸聚合复合物(polyplexes)、胶束等；并且在优选实施方案中被脂质体修饰或与脂质体结合。当载体为脂质体时，可将GALA肽与脂质体的任何组分结合，例如磷脂、胆固醇、脂质(优选阳离子脂质)和辅助脂质(helper lipid)。与胆固醇(胆固醇基-OH)结合的SEQ ID NO:1的GALA肽例如具有下列结构(下文有时缩写为“Chol-GALA”)：(胆固醇基)-O(C=O)-(WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA)-NH2
在上述描述中，“-O(C=O)-”与GALA肽的N-末端处的氨基结合，并且“-NH2”意味着GALA肽的C-末端处的羧基被氨基保护。在胆固醇和GALA肽之间形成的键可以为上述的氨基甲酸酯键，或可以为酯键或醚键。胆固醇基可以在N-末端或C-末端与GALA肽结合，或可以与GALA肽的任何氨基酸的侧链结合。此外，胆固醇基可以通过诸如亚烷基、肽或聚醚的任何衔接物而与GALA肽结合。此外，尽管C-末端是上述的酰胺，但C-末端可以为其它基团，例如羧酸(COOH)、酯或羧酸的盐。
当GALA肽与诸如胆固醇和磷脂的脂质组分结合并且被包括在载体或物质导入剂中时，所包括的GALA的肽的量相对于总脂质量为约0.1mol%至5mol%，优选0.3mol%至4mol%，更优选0.5mol%至4mol%，进一步优选1mol%至4mol%，特别优选1.5mol%至2mol%。应注意的是，本说明书中描述的“总脂质量”不包括与脂质体的修饰组分结合的脂质组分的量。即，不包括与GALA肽结合的脂质组分的量。同样地，当用PEG修饰载体时，不包括与PEG结合的脂质组分的量。
例如，当未与GALA肽结合的脂质组分(总脂质量)为100mol且与GALA肽结合的脂质组分为5mol时，GALA修饰水平(与GALA肽结合的脂质相对于总脂质量的比)为5mol%。
当由除脂质之外的组分形成载体时，GALA肽的量相对于载体的总重量为约0.01wt%至10wt%，优选0.1wt%至5wt%，更优选0.5wt%至4wt%，并且特别优选1wt%至2.5wt%。
尽管上面描述了其中GALA肽与胆固醇结合的实施方案，但GALA肽可以与除胆固醇之外的载体的其它组分结合，并且其方式对于本领域技术人员而言是显而易见的。
在pH接近中性(例如，pH7或7.4)时，本发明的载体和物质导入剂的ζ电位为约-100mV至100mV，优选为约-50mV至50mV，并且更优选为约-30mV至30mV。能使用ζ电位仪(zetasizer)来测量ζ电位。
本发明的载体和物质导入剂的平均粒径不受特别限定，并且例如，粒径为30nm至1000nm，优选50nm至300nm，更优选50nm至200nm，并且特别优选50nm至150nm。能通过例如动态光散射法、静态光散射法、电子显微镜、原子力显微镜等来测量平均粒径。
本发明的导入剂包括载体和旨在细胞内递送的目的物质。目的物质可以具有与载体形成的共价键，可以与载体形成复合物，并且当载体为中空颗粒时，目的物质可以被包封或包囊在载体内。本发明的目的物质特别为当被引入肺细胞中时发挥作用的生物活性物质。
本发明的物质导入剂可以体外和体内用于将目的物质在肺细胞内递送。
目的物质的类型不受特别限制，并且其实例包括：药物、核酸、肽(肽激素、生物活性肽等，例如催产素、缓激肽、促甲状腺激素释放因子和脑啡肽)、蛋白(酶、各种细胞因子，例如白介素、细胞转移因子、细胞生长因子等)、糖或那些物质的复合物。目的物质的类型可以根据治疗目的、诊断、肺病类型等而适当选择。应注意的是，“核酸”除了DNA或RNA之外还包括其类似物或其衍生物(例如，siRNA、肽核酸(PNA)、硫代磷酸DNA等)。此外，核酸可以为单链或双链的，并且可以为线性或圆形的。
当目的物质为药物时，其实例包括抗癌剂、血管扩张药物、肺血管炎治疗剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、支气管扩张剂、镇咳剂、肺纤维化抑制剂、抗结核药物等。抗癌剂的具体实例包括阿霉素、柔红霉素、顺铂、奥沙利铂、卡铂、紫杉醇、伊立替康、SN-38、放线菌素D、长春新碱、长春碱、氨甲喋呤、咪唑硫嘌呤、氟尿嘧啶、丝裂霉素C、多西他赛、环磷酰胺、卡培他滨、表柔比星、吉西他滨、米托蒽醌、亚叶酸、长春瑞滨、曲妥珠单抗、依托泊苷、雌莫司汀、强的松、干扰素-α、白介素-2、博来霉素、异环磷酰胺、美司钠、六甲蜜胺、拓扑替康、阿糖胞苷、甲基强的松龙、地塞米松、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、吉妥珠单抗、伊达比星、米托蒽醌、维甲酸、阿伦单抗、苯丁酸氮芥、克拉屈滨、伊马替尼、表阿霉素、达卡巴嗪、丙卡巴肼、氮芥、利妥昔单抗、地尼白介素-白喉毒素连接物(denileukin diftitox)、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异噁唑、别嘌呤醇、卡莫司汀、他莫昔芬、非格司亭、替莫唑胺、美法仑、长春瑞滨、氮杂胞苷、沙利度胺、丝裂霉素等。血管扩张药物的具体实例包括波生坦、安倍生坦、贝前列素钠、西地那非、依前列醇等。肺血管炎治疗剂的具体实例包括肾上腺皮质类固醇、环磷酰胺、咪唑硫嘌呤、氨甲喋呤、阿司匹林等。抗菌剂的具体实例包括两性霉素B等。抗病毒剂的具体实例包括阿糖腺苷、阿昔洛韦、三氟胸苷等。抗炎剂的具体实例包括苯基丁氮酮、对乙酰氨基酚、布洛芬、吲哚美辛、舒林酸、吡罗昔康、双氯芬酸、强的松、倍氯米松、地塞米松等。
当目的物质为核酸时，其优选的实例包括选自下述的双链RNA(dsRNA)：部分双链RNA(mdRNA)、带切口的dsRNA(ndsRNA)、有缺口的dsRNA(gdsRNA)、短干扰核酸(siNA)、siRNA、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、取代的短干扰寡核苷酸、修饰的短干扰寡核苷酸、化学修饰的dsRNA以及转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)。目的物质可以单独使用，或者可以使用两种以上类型的目的物质的混合物。例如，可以使用两种以上类型的siRNA的组合。当物质导入剂包括诸如siRNA的核酸作为目的物质时，还优选同时也包括诸如聚乙烯亚胺(PEI)的阳离子。
在使用取代和修饰(包括化学修饰)的一个实施方案中，双链RNA可以包括含脱氧核糖核苷酸或两个脱氧核糖核苷酸(例如，胸苷、腺嘌呤)的突出部分(overhang)，或者可以包括在双链RNA的一个或两个3’端处的1至4个核苷酸的突出部分。双链RNA可以包括在一端或两端处的钝端。在一些实施方案中，磷酸化第一链和第二链的5’端。在所有使用双链RNA的实施方案中，在3’端处的核苷酸突出部分可以包括在核酸的骨架、碱基或糖上具有化学修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在所有使用双链RNA的实施方案中，在3’-端的核苷酸突出部分可以包括一个以上的普遍的碱基核糖核苷酸。在所有使用双链RNA的实施方案中，在3’-端的核苷酸突出部分可以包括一个以上的非环状核苷酸。在使用双链RNA的所有实施方案中，dsRNA还可以包括末端磷酸酯基团，例如5’,3’-二磷酸酯或5’-磷酸酯(参阅Martinez等人,Cell.110:563-574,2002;以及Schwarz等人,Molec.Cell.10:537-568,2002)。
双链RNA还可以包括2’-糖取代，例如2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-2-甲氧基乙基、卤素以及2’-氟、2’-O-烯丙基，或其任意组合。在其它实施方案中，双链RNA还可在第一链的一端或两端或者在第二链的一端或多个端处包括端帽(terminal cap)取代基，例如烷基、脱碱基、脱氧脱碱基、甘油基、二核苷酸、非环状核苷酸、反转脱氧核苷酸部分或其任意组合。
此外，在另一实施方案中，双链RNA可以包括至少一个修饰的核苷酸间键，例如独立为硫代磷酸酯键、手性硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、氨基烷基磷酸三酯键、甲基膦酸酯键、烷基膦酸酯键、3’-亚烷基膦酸酯键、5’-亚烷基膦酸酯键、手性膦酸酯键、膦酰基乙酸酯键、硫代膦酰基乙酸酯键、亚膦酸酯键、氨基磷酸酯键、3’-氨基氨基磷酸酯键、氨基烷基氨基磷酸酯键、硫羰基氨基磷酸酯键、硫羰基烷基磷酸酯键、硫羰基烷基磷酸三酯键、硒代磷酸酯键或硼烷膦酸酯键，或者其任意组合。
双链RNA可以通过使用核酸类似物而被取代或修饰(包括化学修饰)，所述核酸类似物包括：5-甲基胞嘧啶；5-羟基甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；6-甲基；2-丙基或其他烷基衍生物，例如腺嘌呤和鸟嘌呤；8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤(8-氮杂-、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基等)；7-甲基、7-脱氮杂和3-脱氮杂-腺嘌呤和鸟嘌呤；2-硫尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶；2-硫代胞嘧啶；5-甲基、5-丙炔基、5-卤代(5-溴、5-氟等)、5-三氟甲基或其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；以及6-偶氮尿嘧啶。
诸如双链RNA(dsRNA)的RNA可以被化学修饰。这样的化学修饰的非限制性实例包括在核苷酸之间引入硫代磷酸酯键、引入2’-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸、“非环状”核苷酸、5’-C-甲基核苷酸和向末端引入甘油基和/或反转的脱氧脱碱基残基。这些化学修饰能保持在细胞内的RNAi活性。
只要脂质体是具有脂质双层结构的封闭的囊泡，脂质体可以为多层脂质体(MLV)或单层脂质体如SUV(小单层囊泡)、LUV(大单层囊泡)和GUV(巨单层囊泡)。
本发明的载体(运载体)可以用亲水性聚合物修饰。
亲水性聚合物的实例包括聚亚烷基二醇(聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇，或者聚亚烷基二醇的共聚物，例如聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物)、葡聚糖、普鲁兰多糖、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯醚-马来酸酐交替共聚物、直链淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶、角叉菜胶等。亲水性聚合物优选为聚亚烷基二醇(聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇，或者聚亚烷基二醇的共聚物，例如聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物)，并且特别优选为聚乙二醇(PEG)；并且载体(运载体)优选用这些亲水性聚合物修饰。PEG的长度可以适当地选自约500至10000的分子量范围，并且优选的分子量为1000至5000，并且更优选的分子量为2000。用PEG修饰的脂质的实例包括DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)-PEG2000、DMPE(二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺)-PEG2000、DSG(二硬脂酰甘油)-PEG2000、DMG(二肉豆蔻酰甘油)-PEG2000、胆固醇化的PEG2000、STR(十八烷基)-PEG2000或C8神经酰胺-PEG2000、C16神经酰胺-PEG2000等。其中，STR-PEG2000或C8神经酰胺-PEG2000是优选的。其它亲水性聚合物的分子量可以由本领域技术人员同样适当地进行选择。
例如，当脂质体要被PEG-修饰时，为了获得具有优异的贮存稳定性且不损害肺部迁移性和目的物质(例如，核酸药物，如siRNA)的功能表现的载体(例如，脂质体制剂)，优选使用硬脂化的PEG(STR-PEG)、C8神经酰胺-PEG或者胆固醇化的PEG(Chol-PEG)。此外，为了改善血液中稳定性，优选使用DSPE-PEG、DSG-PEG、C16神经酰胺-PEG等。
当亲水性聚合物要用于修饰脂质体时，当形成脂质体的脂质为100mol%时，优选将亲水性聚合物以约1mol%至15mol%的比用于修饰。
在下文中，尽管使用脂质体作为实例来描述用于将目的物质体外或体内递送至肺部的载体(运载体)，但本发明不限于脂质体，并且任何能将GALA肽导入细胞内的载体(运载体)均包括在本发明中。
在本发明的脂质体中，形成脂质双层的脂质类型不受特别限制，并且其具体实例包括：磷脂，如磷脂酰胆碱(例如，二油酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱等)、磷脂酰甘油(例如，二油酰基磷脂酰甘油、二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油以及二硬脂酰基磷脂酰甘油)、磷脂酰乙醇胺(例如，二油酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺以及二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂等；其氢化产物；以及糖脂，例如鞘磷脂和神经节苷脂。关于脂质，可以单独使用单一脂质，或可以使用两种以上的脂质的组合。磷脂可以为源自蛋黄、大豆的天然脂质，或来自动物和植物的其它脂质(例如，蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等)；合成脂质；或半合成脂质。关于脂质，可以单独使用单一脂质，或可以使用两种以上的脂质的组合。
为了物理地或化学地稳定脂质双层或调节膜的流动性，脂质双层可以包含例如下列中的一种或多种：源自动物的固醇，例如胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、羊毛固醇、二氢羊毛固醇、链甾醇和二氢胆固醇；源自植物的固醇(植物固醇)，例如豆甾醇、谷甾醇、菜油固醇和菜籽甾醇；源自微生物的固醇，例如酵母甾醇和麦角固醇；糖，例如甘油和蔗糖；以及甘油脂肪酸酯，例如的三油酸甘油酯和三辛酸甘油酯。尽管其含有量不受特别限制，但相对于形成脂质双层的脂质的总量，所述含有量优选为5%至40%(摩尔比)，并且进一步优选为10%至30%(摩尔比)。
脂质双层可以包括：抗氧化剂，例如生育酚、没食子酸丙酯、棕榈酸抗坏血酸酯和丁基化苯甲醇；给予正电荷的带电物质，例如硬脂胺和油胺；给予负电荷的带电物质，例如磷酸双十六烷酯；以及膜蛋白，例如表面膜蛋白和内在膜蛋白。其含有量可以得到适当地控制。
本发明的脂质体在其表面上具有由30个氨基酸形成的GALA肽。应注意的是，在单层脂质体中的脂质体表面为脂质双层的外表面，以及在多层脂质体中的脂质体表面为在最外层的脂质双层的外表面。此外，本发明的脂质体还可以在除表面之外的其它部分(例如，脂质双层的内表面)处包含肽。
本发明的载体优选包含阳离子脂质。阳离子脂质的实例包括DODAC(双十八烷基二甲基氯化铵)、DOTMA(N-(2,3-二油酰氧基)丙基-N,N,N-三甲基铵)、DDAB(双十二烷基溴化铵)、DOTAP(1,2-二油酰氧基-3-三甲基胺丙烷)、DC-Chol(3-β-N-(N’,N’,-二甲基-氨基乙烷)-氨基甲酰胆固醇)、DMRIE(1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羟乙基铵)、DOSPA(2,3-二油烯氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵)、DSTAP(1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(二油酰基-3-二甲基胺丙烷)等。阳离子脂质优选为DOTMA、DSTAP或DODAP，并且特别优选为DOTMA。关于阳离子脂质，可以单独使用单一阳离子脂质，或可以使用两种以上的阳离子脂质的组合。
在阳离子脂质中，DOTMA和DSTAP具有季铵并且一致地具有正电荷，而DODAP具有叔胺且在生理pH中不具有电荷。因此，通过改变阳离子脂质的类型和配合量，可以拓宽阳离子脂质的结构和特性。
本发明的载体优选包含辅助脂质(helper lipid)。辅助脂质的实例包括EPC(蛋磷脂酰胆碱)、DLPC(二亚油酰基磷脂酰胆碱)、DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)、DPPC(二棕榈酰基磷脂酰胆碱)、DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱)、DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)、DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)以及SOPE(硬脂酰基油酰基磷脂酰胆碱)。其中，EPC、DOPC、DOPE和SOPE是优选的。
例如，因为包含DOPC作为辅助脂质(helper lipid)的MEND在室温下贮存1个月之后根本不聚集，所以DOPC在贮存稳定性方面也是优异的。
作为本发明的脂质体的优选方式，能例示下述脂质体，其中用疏水性基团或疏水性化合物修饰GALA肽，并且将疏水性基团或疏水性化合物插入脂质双层中，但是该肽从脂质双层被暴露出。应理解的是，在本方式中，“该肽从脂质双层被暴露出”包括肽从脂质双层的外表面或内表面被暴露出的情况，以及其中肽从两个表面被暴露出的情况。
疏水性基团或疏水性化合物不受特别限制，只要其能插入脂质双层中。疏水性基团的实例包括：饱和或不饱和脂肪酸基团，例如十八烷基、棕榈基、油基、棕榈油酸醇基(palmitoleyl)、亚麻基、亚油基等；脂肪醇、脂肪胺或包括碳数为10个以上的烃基在内的其它基团(例如，固醇衍生的基团，例如胆固醇基(Chol))；及它们的衍生物。其中，碳数为10至20的脂肪酸基团(例如，棕榈酰基、油基、十八烷基、花生四烯酰基等)是特别优选的。此外，疏水性化合物的实例包括上述的磷脂、糖脂或固醇、长链脂肪醇(例如，磷脂酰乙醇胺、胆固醇等)、聚氧丙烯基烷基、甘油脂肪酸酯等。
可以使用本领域已知的方法来产生本发明的脂质体，所述方法包括例如水合法、超声处理、乙醇注射法、醚注射法、反相蒸发法和冷冻-解冻法。
下面将示出使用水合法生产脂质体的方法。
将为脂质双层的组分的脂质以及用疏水性基团或疏水性化合物修饰的肽溶解在有机溶剂中，然后通过蒸发除去有机溶剂以获得脂质膜。在该情况中，有机溶剂的实例包括：烃，例如戊烷、己烷、庚烷和环己烷；卤代烃，例如二氯甲烷和氯仿；芳香烃，例如苯和甲苯；低级醇，例如甲醇和乙醇；酯，例如乙酸甲酯和乙酸乙酯；以及酮，例如丙酮。关于这些有机溶剂，可以单独使用单个有机溶剂，或可以使用两种以上的有机溶剂的组合。接下来，通过水合脂质膜并搅拌或超声处理溶液，能产生在脂质体表面上具有肽的脂质体。
此外，下面将示出使用水合法的其它制备实例。
将为脂质双层的组分的脂质溶解在有机溶剂中，然后通过蒸发除去有机溶剂以获得脂质膜。将该脂质膜水合，并且将溶液搅拌或超声处理以产生脂质体。接下来，通过向脂质体的外部溶液添加用疏水性基团或疏水性化合物修饰的肽，能将肽引入至该脂质体的表面。或者，通过向具有已溶解于其中的脂质的有机溶剂中添加用疏水性基团或疏水性化合物修饰的肽，能将肽引入至脂质体的表面。
例如，当将季胺用作阳离子脂质时，能使用类似于稍后描述的实施例3-1中的方法、基于该实施例的方法、或那些方法与本领域中常用方法的组合来生产脂质体；并且当叔胺用作阳离子脂质时，能使用类似于稍后描述的实施例3-2中的方法、基于该实施例的方法、或那些方法与本领域中常用方法的组合来生产脂质体。
当制备阳离子脂质体时，能酌情改变阳离子脂质/Chol/辅助脂质(helper lipid)的比。组成比(摩尔比)优选为10至50/20至50/20至70，更优选为20至40/30至50/20至40，并且特别优选为30/40/30。阳离子脂质/Chol/辅助脂质(helper lipid)的优选组合为：选自DOTMA、DODAP或DSTAP的阳离子脂质/Chol/选自EPC、DOPE或SOPE的辅助脂质(helperlipid)，并且更优选为DOTMA/Chol/EPC、DODAP/Chol/EPC、DSTAP/Chol/EPC、DOTMA/Chol/DOPE或者DOTMA/Chol/SOPE。当用Chol-GALA修饰脂质体时，可以酌情改变Chol-GALA的添加比，并且相对于总脂质量，(阳离子脂质/Chol/辅助脂质(helper lipid)的脂质总量)其实例包括0.1mol%至5mol%，优选0.3mol%至4mol%，更优选0.5mol%至4mol%，进一步优选1mol%至4mol%，并且特别优选1.5mol%至2mol%。此外，可以酌情地用PEG修饰脂质体，并且当进行PEG修饰时，能酌情改变PEG的添加比，并且相对于总脂质量(阳离子脂质/Chol/辅助脂质(helper lipid)的脂质总量)，添加比的实例包括0.1mol%至15mol%，并且优选为1mol%至5mol%。应注意的是，所添加的PEG优选为与脂质结合的PEG，更优选为STR-PEG或C8神经酰胺-PEG，并且特别优选为STR-PEG2000或C8神经酰胺-PEG2000。
此外，通过使用上述辅助脂质(helper lipid)，能制备脂质体组成为辅助脂质(helper lipid)/Chol的中性脂质体，尽管可以酌情改变其组成比(摩尔比)，但组成比优选为40至90/10至60，更优选为60至80/20至40，并且特别优选为70/30。辅助脂质(helperlipid)/Chol的组合优选为EPC/Chol、DLPC/Chol、DMPC/Chol、DPPC/Chol、DSPC/Chol、POPC/Chol、DOPC/Chol、DOPE/Chol或SOPE/Chol，更优选为EPC/Chol、DOPC/Chol、DOPE/Chol或SOPE/Chol，并且特别优选为EPC/Chol。当用Chol-GALA修饰脂质体时，可以酌情改变Chol-GALA的添加比，并且相对于总脂质量(辅助脂质(helper lipid)/Chol的脂质总量)，其实例包括0.1mol%至5mol%，优选0.3mol%至4mol%，更优选0.5mol%至4mol%，进一步优选1mol%至4mol%，并且特别优选1.5mol%至2mol%。此外，可以酌情用PEG修饰脂质体，并且当进行PEG修饰时，能酌情改变PEG的添加比，并且相对于总脂质量(辅助脂质(helper lipid)/Chol的脂质总量)，添加比的实例包括0.1mol%至15mol%，并且优选为1mol%至5mol%。应注意的是，所添加的PEG优选为被修饰至脂质上的PEG，更优选为STR-PEG或C8神经酰胺-PEG，并且特别优选为STR-PEG2000或C8神经酰胺-PEG2000。
本发明的脂质体组成优选为阳离子脂质/Chol/辅助脂质(helper lipid)/STR-PEG/Chol-GALA或者辅助脂质(helper lipid)/Chol/STR-PEG/Chol-GALA，更优选为选自DOTMA、DODAP或DSTAP的阳离子脂质/Chol/选自EPC、DOPE或SOPE的辅助脂质(helperlipid)/STR-PEG/Chol-GALA，或者EPC/Chol/STR-PEG/Chol-GALA；以及进一步优选为DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG/Chol-GALA、DODAP/Chol/EPC/STR-PEG/Chol-GALA、DSTAP/Chol/EPC/STR-PEG/Chol-GALA、DOTMA/Chol/DOPE/STR-PEG/Chol-GALA、DOTMA/Chol/SOPE/STR-PEG/Chol-GALA或者EPC/Chol/STR-PEG/Chol-GALA。应注意的是，作为STR-PEG，其PEG具有分子量2000的STR-PEG2000是特别优选的。
本发明的最优选脂质体具有DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA的组成，其中：
优选地，其中的DOTMA/Chol/EPC的组成比(摩尔比)为10至50/20至50/20至70，并且相对于DOTMA/Chol/EPC的总脂质量，以1mol%至15mol%来包含STR-PEG2000，并且以0.1mol%至5mol%来包含Chol-GALA；
更优选地，其中的DOTMA/Chol/EPC的组成比(摩尔比)为20至40/30至50/20至40，并且相对于DOTMA/Chol/EPC的总脂质量，以1mol%至5mol%来包含STR-PEG2000，并且以1mol%至4mol%来包含Chol-GALA；以及
最优选地，其中的DOTMA/Chol/EPC的组成比(摩尔比)为30/40/30，并且相对于DOTMA/Chol/EPC的总脂质量，以1mol%至5mol%来包含STR-PEG2000，并且以1.5mol%至2mol%来包含Chol-GALA。因为STR-PEG2000和Chol-GALA为脂质体的修饰组分，所以其添加量以相对于100mol%(即，由DOTMA/Chol/EPC的三种组分形成的脂质体的总脂质量)的比的形式来表示。
待向肺细胞递送的目的物质能被包封在本发明的脂质体内。
包封在本发明的物质导入剂(尤其是脂质体)中的目的物质的实例根据肺部疾病的类型包括上述药物(抗癌剂、血管扩张药物、抗菌剂等)、核酸(DNA,RNA及其类似物或衍生物(例如，siRNA、肽核酸(PNA)、硫代磷酸DNA等))，以及肽(肽激素和生物活性肽，例如催产素、缓激肽、促甲状腺激素释放因子以及脑啡肽)。根据肺部疾病的类型，通过包封合适的目的物质，可以治疗或预防该肺部疾病。在本说明书中，“肺部疾病”包括但不限于肺癌、肺的炎性疾病、肺纤维化、肺栓塞、肺动脉高压、肺血管炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、石棉肺/积尘病、哮喘、支气管扩张、支气管肺发育不良(BPD)、慢性支气管炎、慢性咳嗽、慢性阻塞性肺病(COPD)、感冒、囊性纤维化、肺气肿、汉坦病毒、组织胞浆菌病、流感、军团病、肺淋巴管肌瘤病、百日咳、胸膜炎、气胸、原发性肺泡换气低下综合征、肺泡蛋白沉积症、呼吸窘迫综合征、RS病毒、结节病、严重急性呼吸综合征(SARS)、结核病等。优选用作治疗或预防的靶标的肺病为涉及肺部血管的肺病，并且其实例包括肺癌、肺动脉高压、肺血管炎等；并且肺癌(包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌)是特别优选的。肺癌不仅包括原发性肺癌，而且还包括从肺之外的其它器官转移的转移性肺癌。此外，本发明的物质导入剂还可用于抑制其原发病灶为肺部的癌症向其它器官(例如，肾上腺、肝脏、脑部、骨等)的转移。要包封在本发明的物质导入剂中以用于治疗肺癌及用于抑制癌症从肺部转移的目的物质为：优选地，上述抗癌剂(例如，盐酸氨柔比星、吉非替尼、顺铂、长春花碱、丝裂霉素C、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、卡铂、伊立替康、替加氟、依托泊苷、长春新碱、环磷酰胺、阿霉素、异环磷酰胺、长春地辛等)，或靶标为涉及血管生成的因子例如，CD31、ESAM、VEGF、VEGFR、EGF、EGFR、Dll、SFRP、CD151、bFGF、TGFβ1、PDGF、HGF等)的siRNA；更优选地，靶标为CD31、ESAM、CD151、VEGF或EGF的siRNA；并且特别优选地，抗CD31siRNA。根据用途，这些药剂可以单独使用或以两种以上的混合物形式使用。
包封在本发明的物质导入剂中以用于肺动脉高压的目的物质优选为上述血管扩张剂(例如，波生坦、安倍生坦、贝前列素钠、西地那非、依前列醇等)，或者涉及血管舒张的因子(例如，内皮素受体(ETA,ETB)、PDE5等)的抗siRNA。
包封在本发明的物质导入剂中以用于肺血管炎的目的物质优选为肾上腺皮质类固醇、环磷酰胺、咪唑硫嘌呤、氨甲喋呤、阿司匹林等。
本发明的物质导入剂可以单独使用，或可以与用于肺部疾病的其它治疗一起使用。
当目的物质为水溶性时，能通过将目的物质添加至当水合脂质膜以制备脂质体时所用的水性溶剂中，从而将目的物质包封在脂质体内的水相中。当目的物质为亲脂性时，能通过将目的物质添加至用于制备脂质体的有机溶剂中，从而将目的物质包封在脂质体的脂质双层中。在本说明书中，“包封”包括下述两种情况，即，其中目的物质被包括在诸如脂质体的中空颗粒内的情况，以及其中目的物质被保留在诸如脂质双层膜的形成所述载体的表面部分处的情况。
目的物质所要递送至的生物物种不受特别限制，只要该物种是具有肺的脊椎动物，并优选为哺乳动物。这样的哺乳动物的实例包括人、猴、牛、绵羊、山羊、马、猪、兔、狗、毛、大鼠、小鼠、豚鼠等。
本发明的脂质体可以例如处于分散液体的状态下使用。作为分散溶剂，例如，可以使用缓冲液，乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或盐水溶液。可以向分散液体中添加例如添加剂，例如糖、多元醇、水溶性聚合物、非离子表面活性剂、抗氧化剂、pH调节剂、水合促进剂等。
本发明的脂质体可以以通过干燥所述分散液体(例如，冻干、喷雾干燥等)而获得的形式来使用。可以将干燥的脂质体添加到诸如乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或盐水溶液的缓冲液中，从而获得分散液体。
各脂质体均能体外和体内使用。当各脂质体体内使用时，给药途径的实例包括静脉内注射、静脉内滴注等；并且给药剂量和给药频率可以根据被包封在本发明脂质体中的目的物质的量和类型等而适当调节。
本发明的脂质体未表现出导致体重降低或肝脏损伤，并且能安全地给药。
实施例
在下文中，尽管基于实施例更详细地描述了本发明，但毋庸置疑地，本发明不限于实施例。
在下面示出各实施例中使用的试剂、材料、动物等。
EPC购自NOF Corp.,(Tokyo,JAPAN)。DOTAP、DSTAP、DODAP、胆固醇、DOPE、SOPE、DOPC和C8神经酰胺-PEG2000购自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL,USA)。DOTMA购自Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(Tokyo,JAPAN)。STR-PEG2000购自Wako PureChemical Industries,Ltd.。
使用专利文献3所述的方法、基于该专利文献3的方法或者那些方法与本领域常用方法的组合，合成Chol-GALA(胆固醇基-O(C=O)-WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA-NH2;Mw3444.0;>71%的纯度)。
PEI(支链型，平均分子量10,000)购自Wako Pure Chemical Industries,Ltd.。
转氨酶CII-Test Wako购自Wako Pure Chemical Industries,Ltd.。
RNAlater购自Ambion。High Capacity RNA-to-cDNA Kit(高容量RNA-to-cDNA试剂盒)和Gene Expression Master Mix(TaqMan基因表达预混液)购自AppliedBiosystems。siRNA和Cy5标记的siRNA的合成委托给Hokkaido System Science Co.Ltd.。根据本领域常用的方法进行引物和探针的合成。所用的siRNA、引物和探针的序列在下面示出。
siRNA
CD31-1有义:GCACAGUGAUGCUGAACAATT(SEQ ID NO:2)
CD31-1反义:UUGUUCAGCAUCACUGUGCTT(SEQ ID NO:3)
CD31-2有义:GUGCAUAGUUCAAGUGACATT(SEQ ID NO:4)
CD31-2反义:UGUCACUUGAACUAUGCACTT(SEQ ID NO:5)
CD31-3有义:GCAAGAAGCAGGAAGGACATT(SEQ ID NO:6)
CD31-3反义:UGUCCUUCCUGCUUCUUGCTT(SEQ ID NO:7)
荧光素酶有义:GCGCUGCUGGUGCCAACCCTT(SEQ ID NO:8)
荧光素酶反义:GGGUUGGCACCAGCAGCGCTT(SEQ ID NO:9)
作为CD31siRNA，上述3种类型等量混合使用。
引物，探针
CD31正向:CAGAGCGGATAATTGCCATTCC(SEQ ID NO:10)
CD31反向:ACAGGATGGAAATCACAACTTCATC(SEQ ID NO:11)
CD31探针:[FAM]ACCCTCAGGATCTCGCTGAACACCGC[TAMRA](SEQ ID NO:12)
CD34正向:TCTGCCTGGAACTAAGTGAAGC(SEQ ID NO:13)
CD34反向:CCTCAGACTGGGCTAGAAGCA(SEQ ID NO:14)
CD34探针:[FAM]ACCAGCATCAGCCTCAGCCTCCTCC[TAMRA](SEQ ID NO:15)
5周龄的ICR雄性小鼠和6周龄的C57BL/6雄性小鼠购自Japan SLC,Inc.。
对于其他而言，除非另外提及，则使用特级或一级商购产品，或者与其类似的产品。
此外，在下面示出各实施例中使用的仪器等。
为了制备脂质膜，使用泵DIVAC1.2和捕获器EVALA UNI TRAP UT-1000(二者均来自Tokyo Rikakikai Co.,Ltd.)。
浴槽型超声波破碎仪AU-25C(AIWA MEDICAL INDUSTRY Co.,Ltd.)用于超声处理。ZETA SIZER Nano-ZS(Malvern Instruments Ltd.)利用动态光散射(DLS)来测量ζ电位和颗粒直径。
ABI7500实时系统(Applied Biosystems)用于实时PCR。
液体闪烁计数器TRI-CABB1600TR(PACKARD)用于测量β射线。
作为共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)，使用A1(Nikon)、物镜Plan Apo VC20×和60×以及Ar激光和He/Ne激光的激光器。
PCR热循环仪TP3000(Takara Bio,Inc.)用于反转录。
Docu-pH计(Sartorius)用于测量pH。
通过用适量EtOH进行稀释，以所需浓度(1mM至10mM)制备所用的脂质。
通过使用COSMOSIL5C4-AR-300(尺寸:10×250mm)的反相HPLC纯化Chol-GALA。将H2O/0.1%TFA用作缓冲液A，并且将CH3CN/0.1%TFA用作缓冲液B。注射溶解在DMF中的Chol-GALA(纯度:>71%)(4mg/mL，粗制物形式)，并且在25℃、以2.0mL/min流速应用梯度，并且50%B=>95%B(20min)(下面描述详情)。通过在215nm检测吸光度来收集Chol-GALA，并且冻干。使用HPLC检查纯化的Chol-GALA的纯度，然后，将纯化的Chol-GALA分散为1mM EtOH溶液，并在-80℃贮存。
<条件>
注射量：250μL(4mg/mL在DMF中)
流速：2mL/min
柱温度：25℃
方案：
表1
时间(min) 缓冲液B(%)
0 50
20 95
40 95
40.5 100
40.5 100
46 50
60 50
使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments,UK)测量脂质体和MEND的颗粒直径和ζ电位。
除非另外提及，则以三次以上的实验值的平均值±标准偏差的形式来描述实验数据。为了检验显著性，进行单因素方差分析检验(one-way ANOVA test)，并且使用Dunnett法来进行多重比较，并且P<0.05的值被认为是显著的。
实施例1：脂质体制备
1)脂质膜制备
在玻璃试管中，以70/30的摩尔比(脂质体a)配制EPC(EtOH溶液)和Chol(EtOH溶液)，向其添加STR-PEG2000(EtOH溶液)以便相对于脂质体a的总脂质量为5mol%，向其添加适量的EtOH，然后在干燥器中减压干燥试管以蒸馏出溶剂，从而制备脂质组成为EPC/Chol/STR-PEG2000的脂质膜(在图1中缩写为“脂质体”)。此外，当用Chol-GALA修饰EPC/Chol/STR-PEG2000时，将相对于脂质体a的总脂质量其量为2mol%的Chol-GALA添加到脂质溶液中，从而制备脂质组成为EPC/Chol/STR-PEG2000/Chol-GALA的脂质膜(在图1中，缩写为“GALA-脂质体”)。此外，当制备图1中公开为“阳离子-脂质体”的脂质膜时，以30/40/30的摩尔比添加DOTMA(EtOH溶液)、Chol和EPC，并且进行与上述相类似的操作，从而制备脂质组成为DOTMA/Chol/EPC的脂质膜(脂质体b)。
2)脂质体制备
向上述1)中制备的脂质膜添加具有5%Glucose(葡萄糖)(HBG)的10mM HEPES缓冲液(体内实验)或10mM HEPES缓冲液(HB)(体外实验)，以获得2.64mM(体内实验)或0.55mM(体外实验)的脂质浓度，并且在室温下进行水合15分钟以上。然后，通过在浴槽型超声波破碎仪中进行约1分钟的超声处理，从而制备脂质体。
实施例2脂质体的药代动力学评价
1)脂质体给药、器官收集及[3H]测量
用[3H]标记在上述2)中制备的脂质体的脂质膜，从而获得给药样品。
在10μL脂质体/g小鼠的条件下向小鼠(ICR，5周龄，雄性)的尾静脉进行给药。在给药后1分钟、5分钟和15分钟以及1小时和6小时，用醚麻醉小鼠，对其实施剖腹手术，从下腔静脉采集它们的血液，并摘除它们的肺和肝脏。用生理盐水彻底清洗每一器官，称重(对于肝脏，将肝脏切碎，彻底混合，并使用0.2g的肝脏)，放置在塑料小瓶中，并且向其添加2mL的Soluene-350，将该溶液在50℃下孵育过夜，从而溶解该组织。溶液具有向其添加的10mL的Hionic fluor，彻底混合，在4℃下静置过夜，并且使用液体闪烁计数器来测量其[3H]计数。此外，为了评价[3H]的给药剂量，将10mL的Hionic fluor添加至10μL的给药的脂质体样品中，并且将混合物彻底混合。将混合物在4℃下静置过夜，类似地测量[3H]计数。
2)器官迁移量的评价
将每一器官样品的[3H]计数(测量值)除以供测量的器官的重量，从而计算每1g的每一器官所包含的[3H]，然后将其除以在给药的脂质体中包含的[3H]，从而以相对于给药剂量的比的形式计算器官迁移量。
在图1-A、图1-B和图2中示出GALA-修饰的脂质体(GALA-脂质体)随时间的肺和肝脏迁移的评价结果。
如图1-A、图1-B和图2所示，观察到用GALA修饰的脂质体向肺部迁移。此外，确认的是，由于改善了用GALA修饰的脂质体的肺部迁移，因而降低了向肝脏的迁移。
实施例3-1MEND1制备
1)脂质膜制备
与实施例1中的方法类似，在玻璃试管中，以30/40/30的摩尔比添加DOTMA(EtOH溶液)、Chol(EtOH溶液)和EPC(EtOH溶液)，向其添加适量的EtOH，并且在干燥器中将试管减压干燥以蒸馏出溶剂，从而制备脂质组成为DOTMA/Chol/EPC的脂质膜(脂质体b)。当用STR-PEG2000(EtOH溶液)进行修饰时，相对于脂质体b的总脂质量其量为5mol%的STR-PEG2000被添加到脂质溶液中，从而制备脂质组成为DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000的脂质膜(下文有时缩写为“MEND1”)。当用Chol-GALA进行修饰时，相对于脂质体b的总脂质量其量为2mol%的Chol-GALA被添加到脂质溶液中，从而制备脂质组成为DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA的脂质膜(下文有时缩写为“GALA-MEND1”)。
2)siRNA复合物(siRNA核颗粒)的制备
制备PEI/siRNA复合物以获得电荷比(+/-)=1.8。相对于0.333mg/mL的siRNA溶液，通过滴注0.125mg/mL的PEI溶液(siRNA溶液：PEI溶液的体积比=6:4))来进行制备，同时将溶液放置在涡流中，并在室温下孵育溶液15分钟以上。作为siRNA溶液和PEI溶液，可以使用HBG稀释的siRNA溶液和PEI溶液。
3)MEND的制备
将siRNA核颗粒溶液添加至试管中，其中制备上述1)中获得的脂质膜，以使脂质浓度为2.64mM，并且在室温下进行水合15分钟以上。然后，在浴槽型超声波破碎仪中对其进行超声处理约1分钟，从而制备MEND，并且产生包封siRNA核颗粒的GALA-MEND1和MEND1。
实施例3-2MEND2的制备
1)脂质膜的制备
基于实施例1所述的制备方法，在玻璃试管中，以30/40/30的摩尔比来添加DODAP(EtOH溶液)、Chol(EtOH溶液)和EPC(EtOH溶液)，从而制备组分为DODAP/Chol/EPC的脂质溶液(脂质体c)。为了获得脂质溶液，相对于脂质体c的总脂质量，添加5mol%的STR-PEG2000(EtOH溶液)，以制备脂质组成为DODAP/Chol/EPC/STR-PEG2000的脂质膜(下文有时缩写为“MEND2”)当使用Chol-GALA进行修饰时，相对于脂质体c的总脂质量，向MEND2的脂质溶液添加2mol%的Chol-GALA，向其添加适量的EtOH，并且在干燥器中减压干燥试管以蒸馏出溶剂，从而制备脂质组成为DODAP/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA的脂质膜(在下文有时缩写为“GALA-MEND2”)。
2)siRNA复合物(siRNA核颗粒)的制备
制备PEI/siRNA复合物以获得电荷比(+/-)=1.8。相对于0.333mg/mL的siRNA溶液，通过滴注0.125mg/mL的PEI溶液(siRNA溶液：PEI溶液的体积比=6:4)来进行制备，同时将溶液放置在涡流中，并在室温下孵育溶液15分钟以上。作为siRNA溶液和PEI溶液，将用HBG(pH未调节的(pH5.0))稀释的siRNA溶液和PEI溶液用于制备酸性溶液核颗粒。
3)MEND的制备
将siRNA核颗粒溶液添加至试管中，其中制备上述1)中获得的脂质膜，以使脂质浓度为2.64mM，并且在室温下进行水合15分钟以上。然后，在浴槽型超声波破碎仪中对其进行超声处理约1分钟，并且通过等量的siRNA核颗粒溶液来添加HBG(pH8.1)，使得制备的溶液变成中性，从而制备MEND，并且产生包封siRNA核颗粒的GALA-MEND2和MEND2。
实施例4与血细胞的相互作用
以1:1的体积比来混合小鼠血液(包含20个单位/mL的肝素)和GALA-MEND1溶液，并且使用振荡器在37℃下混合该混合物5分钟(样品1)。将血液以10:1的体积比进一步添加到该混合物中，并且使用相同条件来混合该混合物(样品2)。将各自10μL的样品1和2添加到载玻片上，在其上放置盖玻片，并且使用显微镜观察样品。
图3示出在各种比例下混合血液和所获得的GALA-MEND1的结果，从而评价其与血细胞组分的相互作用。
如图3所示，观察到GALA-修饰的MEND和血液的聚集是可逆的。
实施例5MEND的药代动力学评价
用[3H]标记MEND的脂质膜，并且用[32P]标记siRNA，以获得给药样品。
向小鼠(ICR，5周龄，雄性)的尾静脉给予MEND1或GALA-MEND1溶液(2mg siRNA/kg小鼠)。在给药后1小时用醚麻醉小鼠，对其实施剖腹手术，从下腔静脉采集它们的血液，并且摘除它们的肺。将肺称重，将约0.1mg的肺放置在塑料小瓶中，并且向其添加2mL的Soluene-350，并且将溶液在50℃下孵育过夜，从而溶解组织。
向该溶液中添加200μL(100μL×2)的H2O2以脱色，向其添加10mL的Hionic fluor，并且彻底混合该混合物。将混合物在4℃下静置过夜，并且使用液体闪烁计数器来测量[3H]和[32P]的计数。此外，通过向从未给药小鼠中摘除的肺添加已知量的MEND1溶液并实施相似的操作来产生标准曲线，并且计算向每一器官的[3H]和[32P]的迁移量。
图4示出GALA-MEND1或MEND1的尾静脉静脉内给药的结果，其中siRNA用[32P]标记并且脂质膜用[3H]标记，并且测量在给药后1小时的肺中的[32P]和[3H]以评价GALA-修饰的MEND向肺的迁移。
如图4所示，MEND1向肺的迁移已经通过GALA修饰而显著地改善。
实施例6使用CLSM的MEND的肺内定位
将使用Cy5标记的siRNA而制备的MEND1和GALA-MEND1用作给药样品。
向小鼠(ICR，5周龄，雄性)的尾静脉给予在实施例3-1中获得的MEND1或GALA-MEND1溶液(2mg siRNA/kg小鼠)。在尾静脉静脉内给药之后1小时麻醉小鼠，并且摘除它们的肺以产生约数毫米程度的肺组织片。将产生的肺组织片放置在GSL I-B4Isolectin FITC轭合物(由Funakoshi Corp.制造)溶液(使用生理盐水溶液稀释至20μg/mL)中30分钟，从而使溶液浸透过该肺组织片，并且用CLSM进行观察。
图5示出包封荧光标记的siRNA的MEND1或GALA-MEND1的尾静脉静脉内给药的结果，并且使用共聚焦激光扫描显微镜评价了在给药后1小时的肺中的GALA-修饰的MEND的定位。
如图5所示，观察到GALA-修饰的MEND在肺中高度积聚并与血管内皮细胞共定位。
实施例7-1取决于存在或不存在GALA修饰的体内敲减作用
通过使用GALA-修饰的MEND和GALA-未修饰的MEND来研究GALA修饰的敲减作用。
1)MEND溶液的制备
使用与实施例3-1相类似的方法，制备GALA-MEND1溶液和GALA-未修饰的MEND1溶液。更具体地，相对于脂质体的总脂质量，通过使用5mol%的STR-PEG2000来修饰所制备的脂质组成为DOTMA/Chol/EPC=30/40/30的脂质体，从而获得MEND1；以及相对于总脂质量，通过使用2mol%的Chol-GALA进一步修饰MEND1来获得GALA-MEND1。
2)体内转染
向小鼠(C57BL/6,6周,雄性)的尾静脉给予上述1)中获得的MEND溶液(0.5-4mgsiRNA/kg小鼠)。在尾静脉静脉内给药之后24小时用醚麻醉小鼠，对其实施剖腹手术，并且摘除它们各个器官(肺、肝脏和脾脏)。将摘除的器官浸入RNAlater，在4℃下保持过夜，并且在-20℃贮存。
3)mRNA提取
将在-20℃下贮存的器官样品恢复至室温，将它们的重量调节至20mg至30mg，并且使用RNA微型试剂盒和QIA工作站(QIA cube)(由Qiagen制造)根据所附方案进行RNA提取。
4)反转录
根据所附的方案，使用High Capacity RNA-to-cDNA试剂盒，由1μg的总RNA制备cDNA。使用热循环仪通过变性条件(65℃,5min=>4℃保持)和反转录条件(42℃,60min=>95℃,5min=>4℃,保持)来进行变性和反转录。
5)使用实时PCR的mRNA定量
使用基于TaqMan法的相对定量法(Δ-ΔCt法)来进行mRNA(CD31)的定量。对于5μL的稀释至预期浓度的cDNA，添加0.25μL的100μM上游引物、0.25μL的100μM下游引物、0.0625μL的100μM探针、6.9375μL的过滤的DDW和12.5μL的2x TaqMan M.M.。然后，在95℃下进行初始变性10分钟，在95℃进行PCR变性反应15秒，并且进行40次PCR循环，其中在60℃下进行退火/延伸反应1分钟作为单次循环。通过使用CD34作为内部标准基因，使用Δ-ΔCt法，由相对定量来计算CD31的mRNA水平。
图6示出GALA-MEND1和MEND1的尾静脉静脉内给药的结果以及使用qRT-PCR在给药后24小时的肺中的GALA-MEND1和MEND1各自的敲减作用的评价。应注意的是，在图6中，GALA(+)表示GALA-MEND1的结果，而GALA(-)表示MEND1的结果。
如图6所示，通过用GALA修饰MEND，显著改善了肺内的敲减作用。
实施例7-2体内敲减评价
1)通过使用与实施例7-1中的体内转染、mRNA提取、反转录和使用实时PCR的mRNA定量相似的方法，通过尾静脉来静脉内给予用与实施例3-1相似的方法制备的GALA-修饰的MEND(其脂质组成以摩尔比计为DOTMA/Chol/EPC=30/40/30，并且其GALA修饰水平相对于总脂质量为2mol%)，并且用qRT-PCR评价在给药后24小时的肺、肝脏和脾脏中的GALA-修饰的MEND的敲减作用。
图7示出GALA-修饰的MEND的尾静脉静脉内给药的结果以及使用qRT-PCR的在给药后24小时的肺中的GALA-修饰的MEND的敲减作用的评价。
图8示出GALA-修饰的MEND的尾静脉静脉内给药的结果以及使用qRT-PCR的在给药后24小时的肝脏内的GALA-修饰的MEND的敲减作用的评价。
图9示出GALA-修饰的MEND的尾静脉静脉内给药的结果以及使用qRT-PCR的在给药后24小时的脾脏内的GALA-修饰的MEND的敲减作用的评价。
如图7所示，当与现有运载体AtuPLEX相比较时，GALA-修饰的MEND在肺中表现出显著更强的敲减作用。
如图8所示，当与现有运载体的AtuPLEX相比较时，尽管当与图7相比时，GALA-修饰的MEND当其以1.0-4.0mg/kg给药时在肝脏中表现出敲减作用，但在肺部中的敲减作用远强于在肝脏中的敲减作用。
此外，如图9所示，GALA-修饰的MEND在脾脏中未表现出任何显著的敲减作用。
实施例7-3具有不同阳离子脂质的MEND的敲减作用
制备具有不同阳离子脂质的GALA-MEND，并且比较每一GALA-MEND的敲减作用。
1)MEND的制备
通过与实施例3-1类似的方法进行将DOTMA用作阳离子脂质的GALA-MEND1(其脂质组成为DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA)的制备。除了将DOTMA换为DSTAP，基于实施例3-1所述的制备方法进行将DSTAP用作阳离子脂质的GALA-MEND3(其脂质组成为DSTAP/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA)的制备。此外，通过与实施例3-2类似的方法进行将DODAP用作阳离子脂质的GALA-MEND2(其脂质组成为DODAP/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA)的制备。
2)体内敲减评价
评价在上述1)中获得的具有不同阳离子脂质的每一GALA-MEND的敲减作用。通过与实施例7-1类似的方法进行评价。
图10示出当DOTMA、DODAP和DSTAP用作阳离子脂质时，GALA-MEND1至GALA-MEND3的敲减作用。应注意的是，给药剂量为0.5mg siRNA/kg。
如图10所示，无论阳离子脂质是叔胺还是季胺，均显示出本发明的MEND具有高敲减作用。其中，表明的是，具有DOTMA作为阳离子脂质的MEND具有最高敲减作用。
实施例7-4具有不同辅助脂质(helper lipid)的MEND的敲减作用
制备具有不同辅助脂质的MEND，并且比较每一MEND的敲减作用。
1)MEND的制备
用与实施例3-1相似的方法进行包含辅助脂质(helper lipid)的MEND的制备。更具体地，制备具有摩尔比为30/40/30的DOTMA/Chol/辅助脂质(helper lipid)的脂质体，然后相对于每一脂质体的总脂质量，用5mol%的STR-PEG2000和2mol%的Chol-GALA修饰脂质体，从而制备GALA-修饰的MEND。
2)体内敲减评价
评价具有不同辅助脂质(helper lipid)的每一GALA-修饰的MEND的敲减作用。通过与实施例7-1类似的方法进行评价。
图11示出当EPC、DOPE和SOPE用作辅助脂质(helper lipid)时，每一GALA-修饰的MEND的敲减作用。应注意的是，在图11中，“EPC”、“DOPE”和“SOPE”各自表示脂质组成为DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA、DOTMA/Chol/DOPE/STR-PEG2000/Chol-GALA和DOTMA/Chol/SOPE/STR-PEG2000/Chol-GALA的GALA-修饰的MEND。此外，给药剂量为0.5mgsiRNA/kg。
如图11所示，不管辅助脂质(helper lipid)的类型如何，均显示出本发明的包含辅助脂质(helper lipid)的GALA-修饰的MEND具有高敲减作用。
实施例8-1MEND的4天连续给药所产生的体重变化
1)MEND溶液的制备
根据实施例3-1的方法制备GALA-修饰的MEND溶液。更具体地，脂质组成设定为DOTMA/Chol/EPC=30/40/30(摩尔比)，并且相对于总脂质量，GALA修饰水平设定为2mol%。
在小鼠(C57BL/6,6周,雄性)的尾静脉中连续4天给予(使用27G的皮下注射器针头)在上述1)中产生的GALA-修饰的MEND溶液。从给药起始当天至最后给药后一天，每天测量每一小鼠的体重，并且计算其由于连续给药而产生的体重变化。应注意的是，给药剂量为1mgsiRNA/kg/天或2mg siRNA/kg/天。
图12示出当GALA-修饰的MEND被连续给药4天时的体重变化。
如图12所示，当1mg/kg或2mg/kg的本发明的GALA-修饰的MEND连续给药4天时，没有观察到体重降低。
实施例8-2MEND的4天连续给药之后的AST和ALT
通过小鼠的尾静脉连续4天向小鼠静脉内给予在实施例8-1使用的GALA-修饰的MEND，在最后给药后24小时，对其用醚麻醉并实施剖腹手术，使用23G皮下注射器针头和1mL注射器从后腔静脉采取它们的血液。将血液在4℃下静置4小时，并且离心(4℃,12000rpm,2min)以收集血清形式的上清液。使用5μL该血清和AST和ALT测量试剂盒(转氨酶CII-TestWako)根据其中所附的方法测量血清中的AST和ALT。结果在表13中示出。
如图13所示，因为未观察到AST和ALT的变化，所以本发明的GALA-修饰的MEND被认为在4天连续给药之后不导致肝脏损伤。
实施例9PEG-修饰的MEND的药代动力学评价
使用PEG-未修饰的/GALA-修饰的MEND以及PEG-修饰的/GALA-修饰的MEND，比较在存在或不存在PEG修饰时的GALA-修饰的MEND的药代动力学。
使用通过实施例3-1的方法产生的MEND。相对于总脂质量，PEG修饰水平设定为1mol%或5mol%。
根据实施例5进行MEND的药代动力学评价。应注意的是，对于PEG-未修饰的END(脂质组成:DOTMA/Chol/EPC)、1%STR-PEG2000-修饰的MEND(脂质组成:DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000)以及1%C8神经酰胺-PEG2000-修饰的MEND(脂质组成:DOTMA/Chol/EPC/C8神经酰胺-PEG2000)由N=2进行药代动力学评价。
图14示出PEG-未修饰的/GALA-修饰的MEND(脂质组成:DOTMA/Chol/EPC/Chol-GALA)以及PEG-修饰的/GALA-修饰的MEND(脂质组成:DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA和DOTMA/Chol/EPC/C8神经酰胺-PEG2000/Chol-GALA)的肺部迁移速率的比较。
如图14所示的，甚至当用STR-PEG和C8神经酰胺-PEG修饰GALA-修饰的MEND时，观察到高水平的肺部迁移。
实施例10PEG-修饰的MEND的敲减作用
使用PEG-未修饰的/GALA-修饰的MEND以及PEG-修饰的/GALA-修饰的MEND，比较在存在或不存在PEG修饰时的GALA-修饰的MEND的敲减作用。
作为MEND，使用在实施例9中使用的PEG-未修饰的/GALA-修饰的MEND和PEG-修饰的/GALA-修饰的MEND。更优选地，将STR-PEG2000和C8神经酰胺-PEG2000用作PEG，并且相对于总脂质量，PEG修饰水平为1mol%和5mol%。将与实施例7-1类似的方法用于MEND的敲减评价。应注意的是，给药剂量为1mg siRNA/kg。图15示出PEG-未修饰的/GALA-修饰的MEND以及PEG-修饰的/GALA-修饰的MEND的敲减作用的比较。
如图15所示，甚至当用STR-PEG2000和C8神经酰胺-PEG2000修饰GALA-修饰的MEND时，获得高敲减作用；并且可以通过PEG修饰来抑制GALA-修饰的MEND的聚集。
实施例11PEG-修饰的MEND在贮存某一时段之后的敲减作用
接下来，在贮存某一时段之后，比较PEG-未修饰的/GALA-修饰的MEND以及PEG-修饰的/GALA-修饰的MEND的敲减作用。
作为GALA-修饰的MEND，使用在实施例9中使用的PEG-未修饰的/GALA-修饰的MEND和PEG-修饰的/GALA-修饰的MEND。应注意的是，STR-PEG2000用作PEG，并且相对于总脂质量，PEG修饰为5mol%。将MEND在室温下在HBG溶液(pH7.4)中贮存16天。将与实施例7-1类似的方法用于MEND的敲减评价。应注意的是，给药剂量为1mg siRNA/kg。贮存16天的MEND的敲减作用通过N=2进行。图16示出在室温下贮存16天的PEG-未修饰的/GALA-修饰的MEND以及PEG-修饰的/GALA-修饰的MEND的敲减作用。
如图16所示，显示出STR-PEG2000-修饰的/GALA-修饰的MEND甚至在室温下贮存16天之后在肺部内仍具有高敲除作用。
实施例12GALA-修饰的MEND的贮存稳定性
接下来，利用在室温下保持1个月之后存在或不存在GALA-修饰的MEND的聚集来检验改变辅助脂质(helper lipid)对GALA-修饰的MEND的物理性质的影响。
通过实施例3-1的方法、基于实施例3-1的方法或者那些方法与本领域常用方法的组合来产生所用的GALA-修饰的MEND。将MEND在室温下在HBG溶液中贮存1个月。图17示出在室温下保持1个月之后的MEND的特性。应注意的是，在图17中，“EPC”、“DLPC”、“DMPC”、“DPPC”、“DSPC”、“POPC”、“DOPC”以及“DOPE”各自表示脂质组成为DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA、DOTMA/Chol/DLPC/STR-PEG2000/Chol-GALA、DOTMA/Chol/DMPC/STR-PEG2000/Chol-GALA、DOTMA/Chol/DPPC/STR-PEG2000/Chol-GALA、DOTMA/Chol/DSPC/STR-PEG2000/Chol-GALA、DOTMA/Chol/POPC/STR-PEG2000/Chol-GALA、DOTMA/Chol/DOPC/STR-PEG2000/Chol-GALA和DOTMA/Chol/DOPE/STR-PEG2000/Chol-GALA的脂质体。
如图17所示，当EPC、DLPC、POPC或DOPC用作辅助脂质(helper lipid)时，在室温下保持1个月之后未观察到GALA-修饰的MEND的聚集；以及当DOPE用作辅助脂质(helperlipid)时，在室温下保持1个月之后，仅观察到GALA-修饰的MEND的轻微聚集。
实施例13GALA修饰水平对体内敲减的影响
通过使用具有不同GALA修饰水平的MEND，评价GALA修饰水平对敲减作用的影响。更具体地，通过使用与实施例7-1的体内转染、mRNA提取、反转录和使用实时PCR的mRNA定量相似的方法；通过尾静脉静脉内给予用与实施例3-1相似的方法产生的GALA-修饰的MEND(其脂质组成以摩尔比计为DOTMA/Chol/EPC=30/40/30，并且相对于脂质体的总脂质量，其STR-PEG2000修饰水平为5mol%且其GALA修饰水平为1mol%至4mol%)，并且用qRT-PCR评价给药后24小时的肺部内的GALA-修饰的MEND的敲减作用。
图18示出具有不同GALA修饰水平的MEND的尾静脉静脉内给药的结果，并且使用qRT-PCR评价在给药后24小时的肺部内的每一具有不同GALA修饰水平的MEND的敲减作用。
如图18所示，通过1mol%至4mol%的GALA修饰，改善了肺部中的敲减作用，并且特别地，通过1.5mol%至2mol%的GALA修饰，肺部内的敲减作用具有最高改善。
实施例14在黑色素瘤肺转移癌模型中MEND给药的抗肿瘤作用
1)MEND溶液的制备
使用与实施例3-1类似的方法，制备GALA修饰的-MEND溶液和GALA-未修饰的MEND溶液。其脂质组成以摩尔比计为DOTMA/Chol/EPC=30/40/30，并且相对于脂质体的总脂质量，STR-PEG2000修饰水平为5mol%并且GALA修饰水平为2mol%。
2)创建用于黑色素瘤肺转移癌的模型
在含10%FBS的RPMI-1640培养基中培养荧光素酶(GL4)稳定表达B16-F10小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10-luc2:Caliper Life Sciences,MA,USA)48小时。通过小鼠尾静脉向小鼠(C57BL/6,6周,雄性)给予B16-F10-luc2细胞(2×105个细胞/100μL)以创建黑色素瘤肺转移癌模型(第0天)。
3)向黑色素瘤肺转移癌模型的MEND给药
从移植B16-F10-luc2细胞之后第二天开始，每隔三天向模型小鼠给予(1mgsiRNA/KG小鼠)包封对照siRNA(抗-Luc(GL3))或抗-CD31siRNA的GALA-修饰的MEND。在移植肿瘤之后17天，对小鼠进行剖腹手术，并且摘除它们的肺。将摘除的肺部各自分为两份，一份用于肿瘤肺转移评价，而另一份用于评价CD31mRNA表达水平。应注意的是，在MEND给药期间监测小鼠的体重。
4)肿瘤肺转移的定量评价
将摘除的肺样品放置在辅助管中，向其添加1mL的体内细胞裂解缓冲液，并且使用POLYTRON均质器(由KINEMATICA AG制造)进行均化。在样品管中回收匀浆，并离心(4℃,13,000rpm,10分钟)。将50μL荧光素酶分析底物与20μL上清液混合，并且使用光度计(Luminescencer-PSN，由ATTO Corp.制造)测量荧光素酶活性。以相对于整个肺部的相对光单位(RLU)形式来计算荧光素酶活性(RLU/肺)。结果在图19中示出。
5)CD31mRNA表达水平评价
通过使用与实施例7-1类似的方法，计算在摘除的肺中CD31mRNA水平。结果在图20中示出。
如图19所示，当与未治疗组和对照siRNA给药组相比时，通过给予包封抗-CD31siRNA的GALA-修饰的MEND，显著抑制了肺转移的进程。此外，如图20所示，当与未治疗组和对照siRNA给药组相比时，通过给予包封抗-CD31siRNA的GALA-修饰的MEND，显著抑制了CD31mRNA表达水平。
迄今，已经报道了敲除CD31或给予抗CD31抗体抑制了肿瘤组织中的血管生成，导致黑色素瘤肺转移的进展的抑制(Proc Natl Acad Sci U S A.2010年10月26日;107(43):18616-21)。通过给予本文所获得的GALA-修饰的MEND而获得的肺转移进展抑制作用被认为是归因于由于CD31mRNA的敲减而产生的肺转移肿瘤组织中血管生成的抑制。
应注意的是，因为没有观察到由向用于肺转移的模型小鼠给予GALA-修饰的MEND而导致的体重降低，所以表明的是，GALA-修饰的MEND能用于治疗肺转移且没有表现出毒性。
基于这些结果，观察到的是，GALA-修饰的脂质体特异性地迁移向肺部。
此外，观察到的是，包封siRNA的GALA-修饰的脂质体在肺部中具有有效的敲减作用。
此外，因为甚至在本发明的GALA-修饰的MEND给药时没有观察到体重下降和肝脏损伤，所以确认的是，给药能安全地进行。
基于上述结果，变得明确的是，本发明的用GALA肽修饰的载体可用作将目的物质特异性递送至肺部的运载体，并且用作用于优选地将药物、更优选将诸如siRNA的核酸药物特异性递送至肺部的运载体。
实施例中获得的作为物质导入剂的脂质体(MEND)的平均尺寸为约90nm至170nm，并且ζ电位为-50mV至50mV。
在表2和表3中分别示出实施例1和3中制备的脂质体的尺寸和ζ电位。
表2实施例1中制备的脂质体的尺寸和ζ电位
表3实施例3中制备的MEND的尺寸和ζ电位
本说明书中公开的文献以其整体形式并入本文作为参考。

Claims (11)

1.由SEQ ID NO:1表示的GALA肽在制备用于向肺部递送目的物质的载体的肺部迁移性要素中的用途，
其中所述载体为脂质体，
所述脂质体包含阳离子脂质、胆固醇和选自以下的至少一种辅助脂质：EPC、DOPE、SOPE、DLPC、DMPC、POPC和DOPC，并且关于阳离子脂质/胆固醇/辅助脂质的所述脂质体的脂质组成摩尔比为10-50/20-50/20-70，
所述脂质体在其表面上具有GALA肽，所述GALA肽与所述脂质体的组分结合，并且
所述阳离子脂质由选自DOTMA、DSTAP和DODAP的至少一种类型组成。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述GALA肽与阳离子脂质和/或胆固醇结合。
3.由SEQ ID NO:1表示的GALA肽在制备靶标为肺部的物质导入剂中的用途，所述导入剂具有包封在载体内的目的物质，并且所述载体包括所述GALA肽，
其中所述载体为脂质体，
所述脂质体包含阳离子脂质、胆固醇和选自以下的至少一种辅助脂质：EPC、DOPE、SOPE、DLPC、DMPC、POPC和DOPC，并且关于阳离子脂质/胆固醇/辅助脂质的所述脂质体的脂质组成摩尔比为10-50/20-50/20-70，
所述脂质体在其表面上具有GALA肽，所述GALA肽与所述脂质体的组分结合，并且
所述阳离子脂质由选自DOTMA、DSTAP和DODAP的至少一种类型组成。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述GALA肽与阳离子脂质和/或胆固醇结合。
5.如权利要求3所述的用途，其中所述目的物质选自药物、核酸、肽、蛋白、糖及其复合物。
6.由SEQ ID NO:1表示的GALA肽在制备用于向肺部递送目的物质的载体中的用途，所述载体包括作为向肺部选择性递送物质的要素的所述GALA肽，
其中所述载体为脂质体，
所述脂质体包含阳离子脂质、胆固醇和选自以下的至少一种辅助脂质：EPC、DOPE、SOPE、DLPC、DMPC、POPC和DOPC，并且关于阳离子脂质/胆固醇/辅助脂质的所述脂质体的脂质组成摩尔比为10-50/20-50/20-70，
所述脂质体在其表面上具有GALA肽，所述GALA肽与所述脂质体的组分结合，并且
所述阳离子脂质由选自DOTMA、DSTAP和DODAP的至少一种类型组成。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述GALA肽与阳离子脂质和/或胆固醇结合。
8.如权利要求6或7所述的用途，其中所述载体用聚乙二醇修饰。
9.如权利要求6或7所述的用途，其中所述辅助脂质为EPC、DOPE或SOPE。
10.如权利要求6所述的用途，其中：
所述载体为脂质体，其包括作为脂质膜的组分的DOTMA、胆固醇和EPC；
关于DOTMA/胆固醇/EPC的所述脂质体的脂质组成摩尔比为10-50/20-50/20-70；以及
相对于DOTMA/胆固醇/EPC的总脂质量，所述脂质体还包括1mol％至15mol％的STR-PEG2000以及0.1mol％至5mol％的胆固醇-GALA。
11.如权利要求1所述的用途，其中：
所述载体为脂质体，其包括作为脂质膜的组分的DOTMA、胆固醇和EPC；
关于DOTMA/胆固醇/EPC的所述脂质体的脂质组成摩尔比为10-50/20-50/20-70；以及
相对于DOTMA/胆固醇/EPC的总脂质量，所述脂质体还包括1mol％至15mol％的STR-PEG2000以及0.1mol％至5mol％的胆固醇-GALA。
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