CN104755490B

CN104755490B - 弱酸性pH响应性肽和含有其的脂质体

Info

Publication number: CN104755490B
Application number: CN201380055158.2A
Authority: CN
Inventors: 小暮健太朗; 滨进
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2013-10-21
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2033-10-21
Also published as: JP5931212B2; US20150250893A1; ES2627056T3; WO2014065245A1; US9526791B2; EP2910564A1; KR101678327B1; JPWO2014065245A1; EP2910564A4; CN104755490A; KR20150070378A; EP2910564B1

Abstract

本发明解决的问题是提供一种用于制备能够在弱酸性pH环境中释放目标物质的药物输送载体的肽化合物。本发明提供由亲水氨基酸嵌段和疏水氨基酸嵌段构建的肽化合物，其中，(1)该肽化合物由总计24至36个氨基酸组成；(2)该亲水氨基酸嵌段由总计4至10个氨基酸组成并具有‑3.0至‑1.0的平均亲水指数；并且(3)该疏水氨基酸嵌段由总计20至32个氨基酸组成，其中包含一个或多个His残基，并具有1.0至2.5的平均亲水指数。

Description

弱酸性pH响应性肽和含有其的脂质体

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年10月22日提交的日本专利申请第2012-233011号的优先权，其公开内容全部引入本文以供参考。

本发明涉及弱酸性pH响应性肽和含有该肽的脂质体。

背景技术

在癌症化疗中，已进行了开发DDS以改善特异性的尝试；然而，这些尝试中几乎均没有关注肿瘤环境。具体而言，肿瘤组织处于具有低于生理条件(pH在7.4左右)的pH(pH在6.5左右)的特殊环境中。但是，尚未开发出以肿瘤组织特异性方式起作用以响应于该较小pH改变的药物输送载体。直到现在，预料到EPR效应(增强的渗透和保留效应)，作为亲水大分子的聚乙二醇(PEG)已被用于修饰脂质体的表面等，并且修饰后的脂质体已被用作例如抗癌药物(例如专利文献(PTL)1)的载体。然而，在输送至肿瘤组织后药物从该PEG修饰的载体中的释放是速度受限的，并且药物不能被有效地释放至肿瘤组织中。由于在N-末端区域存在碱性氨基酸(赖氨酸或精氨酸)，PTL 2中公开的肽-脂质体复合物保留了正电荷，并且电荷不根据pH发生改变；因此不能期望足够的血液循环性质。

非专利文献(NPL)1使用His片断作为pH响应性区域。根据NPL1中公开的技术，外部环境的pH从7.4到5.0的剧烈降低导致中性His带正电荷，且由此增加的静电排斥引起胶束的破裂。但是，在弱酸性的pH 6.5时His不会单独地被充分地质子化；因此，引起电荷反转是困难的。为此，不能期望在pH为6.5时与胶束破裂相关的药物释放。

NPL 2公开了pH响应性胶束，当化学键合到嵌段聚合物末端的赖氨酸片断的二甲基马来酸由于pH的降低而解离时，该胶束的表面电荷由负变为正。在NPL 2中公开的肽中，二甲基马来酸的解离导致了带正电荷的赖氨酸残基的暴露；即使pH升高，这样的状态也不回到原始状态。

引用列表

专利文献

PTL 1：JP2004-10481A

PTL 2：JP2004-523531A

非专利文献

NPL 1：AIChE Journal,Vol.56,No.7,2010,pp.1922-1931

NPL 2:International Journal of Pharmaceutics,376,2009,pp.134-140

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种用于制造能够使目标物质在弱酸性pH环境如癌症组织中释放的药物输送载体的肽化合物。

问题的解决方案

本发明提供如下(1)至(10)项，其涉及肽化合物，包括该肽化合物的脂质体，或者使用该脂质体的物质引入剂。

(1)一种包括亲水氨基酸嵌段和疏水氨基酸嵌段的肽化合物；

[1]所述肽化合物由总计24至36个氨基酸组成；

[2]所述亲水氨基酸嵌段由总计4至10个氨基酸组成并且有具-3.0至-1.0的平均亲水指数；并且

[3]所述疏水氨基酸嵌段由总计20至32个氨基酸组成，其中包含一个或多个His残基，并具有1.0至2.5的平均亲水指数。

(2)根据(1)所述的肽化合物，其中所述亲水氨基酸嵌段具有-2.0至-1.5的平均亲水指数；并且

所述疏水氨基酸嵌段具有1.5至2.0的平均亲水指数。

(3)根据(1)或(2)所述的肽化合物，其中亲水氨基酸嵌段包括具有-3.0或更低亲水指数的氨基酸以及具有0至-1.0亲水指数的氨基酸；并且

所述疏水氨基酸嵌段包括His和具有高于0的亲水指数的氨基酸。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的肽化合物，其中构成所述亲水氨基酸嵌段的氨基酸是His或Glu、和Gly；并且

构成所述疏水氨基酸嵌段的氨基酸是His和至少一种选自由Leu、Ala、Met、Cys、Phe、Val和Ile所组成之群中的氨基酸。

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的肽化合物，其中所述亲水氨基酸嵌段具有包含0-5个His残基的肽序列；并且

所述疏水氨基酸嵌段具有包含1-8个His残基的肽序列。

(6)根据(1)至(5)中任一项所述的肽化合物，其中所述亲水氨基酸嵌段由下式(I)表示：

(AA₁)(AA₂)(AA₃)(AA₄) (I)

其中AA₁、AA₂、AA₃和AA₄中的任意两个为His或Glu，且另外两个是Gly；并且

所述疏水氨基酸嵌段含有5-8个由下式(II)表示的单元：

(AA₅)(AA₆)(AA₇)(AA₈) (II)

其中AA₅、AA₆、AA₇和AA₈相同或不同，且各自表示His、Leu或Ala，条件是至少一个式(II)的单元包含一或两个His残基；每个单元可以具有相同或不同的氨基酸序列。

(7)一种脂质体，包括根据(1)至(6)中任一项所述的肽化合物，以及脂类。

(8)根据(7)所述的脂质体，其中所述脂质体基于脂质体中脂类的总量包括1-10mol％的根据(1)至(6)中任一项所述的肽化合物。

(9)根据(8)所述的脂质体，其中所述脂质体是阳离子脂质体。

(10)根据(7)至(9)中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体包封有目标物质。

(11)一种药物组合物，包括根据(7)至(10)中任一项所述的脂质体。

(12)一种抗肿瘤剂，包括根据(7)至(10)中任一项所述的脂质体。

(13)一种用于预防和治疗癌症的方法，包括以能够有效预防或治疗癌症的量对哺乳动物施用根据(7)至(10)中任一项所述的脂质体。

(14)根据(7)至(10)中任一项所述的脂质体在制备癌症预防剂或癌症治疗试剂中的用途。

(15)根据(7)至(10)中任一项所述的脂质体，其被用于预防或治疗癌症。

发明的有利效果

本发明可以提供能够在弱酸性细胞环境(pH约6.5)中释放被包封的低分子目标物质，而在生理条件(pH约7.4)下不释放目标物质的脂质体。

本发明的脂质体可以在上述弱酸性区域中释放目标物质以使物质在其中起作用，并且因此可以提供优异的药物输送体系。

本发明的脂质体可以在生理条件如pH 7.4下保持被包封的目标物质，并且可以对甚至弱酸性的pH 6.5响应敏锐。为此，在由于EPR效应而到达肿瘤后，在肿瘤周边环境的弱酸性条件下，亲水嵌段的静电排斥和/或疏水嵌段的疏水相互作用的降低被引发；本发明的脂质体因此释放被包封的目标物质。如此，本发明的脂质体是高度有用的。

附图说明

图1A显示实施例1中得到的肽化合物1(SEQ ID NO:1)的HPLC结果。

图1B显示实施例1中得到的肽化合物1(SEQ ID NO:1)的MALDI-TOF-MS结果。

图2A显示实施例2中得到的肽化合物2(SEQ ID NO:2)的HPLC结果。

图2B显示实施例2中得到的肽化合物2(SEQ ID NO:2)的MALDI-TOF-MS结果。

图3A显示实施例3中得到的肽化合物3(SEQ ID NO:3)的HPLC结果。

图3B显示实施例3中得到的肽化合物3(SEQ ID NO:3)的MALDI-TOF-MS结果。

图4A显示比较例1中得到的比较化合物1(SEQ ID NO:4)的HPLC结果。

图4B显示比较例1中得到的比较化合物1(SEQ ID NO:4)的MALDI-TOF-MS结果。

图5A显示比较例2中得到的比较化合物2(SEQ ID NO:5)的HPLC结果。

图5B显示比较例2中得到的比较化合物2(SEQ ID NO:5)的MALDI-TOF-MS结果。

图6A显示比较例3中得到的比较化合物3(SEQ ID NO:6)的HPLC结果。

图6B显示比较例3中得到的比较化合物3(SEQ ID NO:6)的MALDI-TOF-MS结果。

图7显示在不同pH条件下包封钙黄绿素的脂质体1的包封药物渗漏率的测量结果。

图8显示在不同pH条件下包封Texas红标记的右旋糖酐的脂质体1的包封药物渗漏率的测量结果。

图9显示在不同pH条件下包封钙黄绿素和Texas红标记的右旋糖酐的脂质体1的包封药物渗漏率的测量结果。

图10显示单独的肽化合物1的CD光谱，以及引入肽的脂质体的CD光谱。

图11显示在测试例5中单独的阿霉素(Dox)的抗肿瘤作用以及包封Dox的脂质体的抗肿瘤作用。

具体实施方式

本发明的脂质体包括肽化合物和脂质体形成组分。

本发明的肽化合物包括亲水氨基酸嵌段和疏水氨基酸嵌段，且由总计24-36个，优选24-32个，且更优选24-28个氨基酸组成。该亲水氨基酸嵌段由总计4-10个，且优选4-8个氨基酸组成。该疏水氨基酸嵌段由总计20-32个，且优选20-24个氨基酸组成。

本发明的肽化合物包括通过肽键结合的一个亲水氨基酸嵌段和一个疏水氨基酸嵌段。任一氨基酸嵌段可以位于N-末端侧；然而，优选亲水氨基酸嵌段位于N-末端侧。

此外，本发明的肽化合物的疏水氨基酸嵌段具有一个或多个His残基；然而，在对弱酸性的响应性方面，重要的是具有-3.0或更低亲水指数的氨基酸，包括His，彼此不相邻。另外，肽化合物的序列优选具有1-13个His残基。

构成本发明的肽化合物的亲水氨基酸嵌段和疏水氨基酸嵌段具有特定的平均亲水指数。用于本发明的氨基酸的亲水指数在例如J.Mol.Biol.,(1982)157,pp.105-132中记载，并表明构成有机体的每种氨基酸特定的疏水性程度(参见表1)。平均亲水指数在例如Molecular Medicine,4:240-257,1998中记载，并且通过将下面每个嵌段中的氨基酸的亲水指数之和除以氨基酸的数目来获得。

表1

氨基酸(缩写)	亲水指数	氨基酸	亲水指数
				异亮氨酸(Ile，I)	4.5	丝氨酸(Ser，S)	-0.8
缬氨酸(Val，V)	4.2	酪氨酸(Tyr，Y)	-1.3
				亮氨酸(Leu，L)	3.8	脯氨酸(Pro，P)	-1.6
苯丙氨酸(Phe，F)	2.8	组氨酸(His，H)	-3.2
				半胱氨酸(Cys，C)	2.5	谷氨酸(Glu，E)	-3.5
甲硫氨酸(Met，M)	1.9	谷氨酰胺(Gln，Q)	-3.5
				丙氨酸(Ala，A)	1.8	天冬氨酸(Asp，D)	-3.5
甘氨酸(Gly，G)	-0.4	天冬酰胺(Asn，N)	-3.5
				苏氨酸(Thr，T)	-0.7	赖氨酸(Lys，K)	-3.9
色氨酸(Trp，W)	-0.9	精氨酸(Arg，R)	-4.5

在本发明的优选实施方式中，亲水氨基酸嵌段包括具有0或更低亲水指数的氨基酸，并且疏水氨基酸嵌段包括His和具有高于0的亲水指数的氨基酸。因此，亲水氨基酸嵌段与疏水氨基酸嵌段之间的边界通过除His之外的氨基酸的亲水指数来确定。位于边界上的His包含在亲水氨基酸嵌段中。

构成本发明的肽化合物的亲水氨基酸嵌段可以具有平均亲水指数为-3.0至-1.0且优选-2.0至-1.5的氨基酸的任何组合。优选的是具有-3.0或更低亲水指数的氨基酸和具有0至-1.0亲水指数的氨基酸的组合；更优选的是His或Glu、与Gly的组合；并且更优选的是His和Gly的组合。而且，亲水氨基酸嵌段的肽序列优选具有0-5个His残基。更具体地，特别优选由下式(I)表示的亲水氨基酸嵌段：

(AA₁)(AA₂)(AA₃)(AA₄) (I)

其中AA₁、AA₂、AA₃和AA₄中的任意两个为His或Glu，并且另外两个是Gly(特别优选地，任意两个是His，并且另外两个是Gly)。

构成本发明的肽化合物的疏水氨基酸嵌段可以具有平均亲水指数为1.0至2.5且优选1.5至2.0的氨基酸的任何组合。优选的是His和具有高于0的亲水指数的氨基酸的组合；更优选是His和选自Leu、Ala、Met、Cys、Phe、Val和Ile的任何氨基酸的组合；并且特别优选His和Leu或者Ala的组合，Leu和Ala是可能具有α-螺旋结构的氨基酸。而且，疏水氨基酸嵌段的肽序列优选具有1-8个His残基。更具体地，特别优选的是含有5-8个由下式(II)表示的单元的疏水氨基酸嵌段：

(AA₅)(AA₆)(AA₇)(AA₈) (II)

其中AA₅、AA₆、AA₇和AA₈相同或不同，且各自表示His、Leu或Ala，条件是单元之间或每个单元中的两个His残基彼此不相邻；每个单元可以具有相同或不同的氨基酸序列。

本发明的肽化合物的特别优选的实例包括以下：

His-Gly-His-Gly-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-His-Ala-Leu-Leu-Ala-His-Ala-Ala-Leu-Ala-His-Ala-Ala-Leu-Ala(SEQ ID NO:1)；

Gly-His-His-Gly-Leu-Ala-Leu-Leu-His-Ala-Leu-His-Leu-Ala-Ala-Ala-Ala-Leu-His-Ala-Ala-Ala-Leu-Ala(SEQ ID NO:2)；和

Glu-Gly-Glu-Gly-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-His-Ala-Leu-Leu-Ala-His-Ala-Ala-Leu-Ala-His-Ala-Ala-Leu-Ala(SEQ ID NO:3)。

本发明的肽化合物须包括上述亲水氨基酸嵌段和疏水氨基酸嵌段。仅包括疏水氨基酸嵌段的肽化合物由于下面的原因被认为不能引起脂质体的结构改变。即，这样的肽化合物被脂质体的疏水区域吸收，且质子不能进入脂质体；因此，即使当周围环境被酸化时该肽化合物也不响应。相比较地，仅包括亲水氨基酸嵌段的肽化合物不能被并入脂质体中。

本发明的肽化合物可以在C-末端具有C-末端保护基团。C-末端保护基团包括与C-末端羧基的碳原子形成酰胺的基团，或者与羧基的氧原子形成酯的基团。形成酯的基团的例子包括烷基，特别是C₁-C₅线性或支链烷基(C₁-C₅烷基)，例如甲基、乙基和丙基。形成酰胺的基团的例子包括胺官能团，例如氨基；以及烷基氨基官能团，例如甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲基乙基氨基、和其他单或二C₁-C₅烷基氨基。优选形成酰胺的基团；更优选氨基。

本发明的肽化合物可以通过已知的肽合成法制备，具体地，液相合成法或固相合成法。还可以使用基因重组技术通过包括将编码本发明肽化合物的DNA引入到宿主细胞中以及表达该DNA的方法来合成本发明的肽化合物。例如，在固相合成中，本发明的肽化合物可以如下获得：将其中与C-末端相应的氨基酸的氨基用氨基甲酸酯(urethane)保护基团如9-芴甲氧基羰基(Fmoc)加以保护的N-保护的氨基酸的羧基键合到具有氨基的不溶性树脂上；然后除去氨基保护基团以成功地将被保护的氨基酸在N-末端的方向上缩合；并且去除不溶性树脂和氨基酸的保护基团，从而得到本发明的肽化合物。上述具有氨基的不溶性树脂没有特别的限制，但是优选Fmoc-NH-SAL树脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基乙基)苯氧基连接树脂)；目标物质可以通过树脂的分裂直接加入其中。用于合成本发明肽化合物的被保护氨基酸可以通过使用已知方法用已知保护基团保护官能团而得到。还可以使用市售的被保护氨基酸。作为保护基团，可以使用已知的保护基团。其例子包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、9-芴甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基等。为制备被保护氨基酸，例如，可以使用已知的方法，例如DIPCDI-HOBt(二异丙基碳二亚胺-1-羟基苯并三唑)法。该缩合反应可以在已知溶剂中实施，例如，有机溶剂如二甲基甲酰胺。用于氨基保护基团的脱保护试剂不受限制，并且可以使用已知的试剂例如哌啶/二甲基甲酰胺来切裂保护基团如Fmoc。氨基甲酸酯保护基团的脱保护可以通过，例如催化还原或使用三氟乙酸来实施。其他保护基团的脱保护也可以通过已知方法实施。在每个合成步骤中缩合反应的进展程度可以通过已知方法，如茚三酮反应法确认。如此，可以得到具有所需氨基酸序列的被保护肽。使用Fmoc-NH-SAL树脂作为不溶性树脂通过用TMSBr(三甲基溴化硅烷)、TFA(三氟乙酸)等进行处理可以同时去除树脂和保护基团。根据使用的树脂的类型，可以获得C-末端是COOH或CONH₂的肽化合物。

由此获得的本发明的肽化合物可以通过已知方式分离并纯化，例如萃取、重结晶、各种色谱法(凝胶过滤、离子交换、分配、以及吸附)、电泳、以及逆流分布。优选反相高压液相色谱法。

只要本发明的脂质体是具有脂双层结构的闭合泡囊，其可以是多层脂质体(MLV)，或者单层脂质体，例如SUV(小单层泡囊)、LUV(大单层泡囊)或者GUV(巨大单层泡囊)。

本发明的脂质体中形成脂双层的脂的类型的具体例子包括，但不限于，磷脂酰胆碱(例如二油酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰卵磷脂)、磷脂酰甘油(例如二油酰基磷脂酰甘油、二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG))、磷脂酰乙醇胺(例如二油酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂及类似磷脂或其氢加成物；以及鞘磷脂、神经节苷脂及类似的糖脂。这些可以单独使用或两种或更多种组合使用。磷脂可以是合成的脂类，半合成的脂类，或者源自蛋黄、大豆或其他动物或植物(例如蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂)的天然脂类。这些脂类可以单独使用或两种或更多种组合使用。

为达到脂双层的物理或化学稳定并调整膜流动性，脂双层可以包括一种或多种例如选自以下的物质：胆固醇、胆固醇琥珀酸、羊毛甾醇、二氢羊毛甾醇、链甾醇、二氢胆固醇、以及类似的源自动物的甾醇；豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、以及类似的源自植物的甾醇(植物甾醇)；酵母甾醇、麦角固醇、以及类似的源自微生物的甾醇；甘油、蔗糖、以及类似的糖类；以及三油精、三辛酸甘油酯、以及类似的甘油脂肪酸酯。其量并无特别限定，但基于构成双层的脂类的总量优选5-40％(摩尔比)，且更优选10-30％(摩尔比)。

脂双层可以包括生育酚、没食子酸丙酯、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基甲苯以及类似的抗氧剂；硬脂酰胺、油胺以及类似的提供正电荷的带电材料；磷酸双十六酯以及类似的提供负电荷的带电材料；以及膜外源蛋白质、膜固有蛋白质、以及类似的膜蛋白质。其量可以被适当地调整。

更优选本发明的脂质体含有阳离子脂类(阳离子脂质体)。阳离子脂类的实例包括DODAC(双十八烷基二甲基氯化铵)、DOTMA(N-(2,3-二油氧基)丙基-N,N,N-三甲基铵)、DDAB(双十二烷基溴化铵)、DOTAP(1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷)、DC-Chol(3β-N-(N’,N’-二甲基-氨基乙烷)-氨基甲酰胆固醇)、DMRIE(1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羟基乙基铵)、DOSPA(2,3-二油氧基-N-[2(精胺甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐)、DSTAP(1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(二油酰基-3-二甲基铵丙烷)等等。优选的阳离子脂类是DOTMA、DSTAP或DODAP；并且特别优选的阳离子脂类是DOTAP。阳离子脂类可以单独使用或以两种或更多种的混合物使用。

在阳离子脂类中，DOTMA和DSTAP具有季胺并且总是具有正电荷，而DODAP具有叔胺并且在生理pH下不具有电荷。因此通过改变阳离子脂类的类型和量，阳离子脂类可以具有多种结构和特性。

本发明的脂质体优选包括辅助脂类(帮助脂类)。辅助脂类的实例包括EPC(鸡蛋磷脂酰胆碱)、DLPC(二亚油酰磷脂酰胆碱)、DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)、DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)、POPC(棕榈酰油酰磷脂酰胆碱)、DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)、DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、SOPE(硬脂酰油酰磷脂酰胆碱)等等。在这些中，优选EPC、DOPC、DOPE和SOPE。

本发明的脂质体具有本发明的肽化合物作为构成组分。当使用本发明的肽化合物时，优选将其基于100mol％构成脂质体的脂类以约1-10mol％的量加入。

本发明的脂质体可以用亲水聚合物修饰。

亲水聚合物的实例包括聚亚烷基二醇(聚亚烷基二醇共聚物例如聚丙二醇和聚乙二醇的嵌段共聚物、聚丙二醇、聚丁二醇、或聚乙二醇)、右旋糖酐、普鲁兰多糖、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐交替共聚物、直链淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶、角叉菜胶等；优选聚亚烷基二醇(聚亚烷基二醇共聚物例如聚丙二醇和聚乙二醇的嵌段共聚物、聚丙二醇、聚丁二醇或聚乙二醇)；并且特别优选聚乙二醇(PEG)。优选用这样的亲水聚合物修饰脂质体。PEG的实例包括DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)-PEG2000、DMPE(二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺)-PEG2000、DSG(二硬脂酸甘油)-PEG2000、DMG(二肉豆蔻酰甘油)-PEG2000、胆固醇PEG2000、硬脂酰PEG2000、C8神经酰胺PEG2000、C16神经酰胺PEG2000等等。其中，优选硬脂酰PEG2000或C8神经酰胺PEG2000。PEG的长度可以在约500-10000的分子量范围内适当选择。本领域技术人员也可以以相同的方式适当地选择其他亲水聚合物的分子量。

例如，当脂质体经PEG修饰时，优选使用硬脂酰化的PEG(STR-PEG)、C8神经酰胺PEG或胆固醇-PEG，以便对脂质体赋予优异的贮存稳定性，不损害目标物质(例如核酸药物，例如siRNA)的功能表达。还优选使用DSPE-PEG、DSG-PEG、C16神经酰胺-PEG或类似物，以便改善血液稳定性。当用亲水聚合物修饰脂质体时，优选基于100mol％构成脂质体的脂类使用约1-15mol％量的亲水聚合物修饰脂质体。

本发明的脂质体可以通过使用已知方法制备，例如水合法、超声法、乙醇注射法、醚注射法、反相蒸发法、冻融法等。

以下描述使用水合法的脂质体的制备例。

将作为脂双层构成组分的脂类以及本发明的肽化合物溶解在有机溶剂中，接着通过蒸发除去有机溶剂，从而得到脂膜。本文使用的有机溶剂的实例包括烃，例如戊烷、己烷、庚烷和环己烷；卤代烃，例如二氯甲烷和氯仿；芳香烃，例如苯和甲苯；低级醇，例如甲醇和乙醇；酯，例如乙酸甲酯和乙酸乙酯；酮，例如丙酮等等。这些可以单独使用或两种或更多种组合使用。随后，使脂膜水合，然后搅拌或超声，从而制备具有本发明肽化合物的脂质体。

另外，以下描述另一使用水合法的脂质体制备例。

将作为脂双层构成组分的脂类溶解在有机溶剂中，接着通过蒸发除去有机溶剂，从而得到脂膜。使该脂膜水合，并搅拌或者超声以制备脂质体。随后，将本发明的肽化合物加入到脂质体的外部液体中。从而可以将本发明的肽化合物引入到脂质体中。

例如，使用季胺作为阳离子脂类的脂质体制备可以通过与之后记载的实施例4中相同的方法、相似的方法、或者所述方法的组合以及标准方法来实施。而且，使用叔胺作为阳离子脂类的脂质体制备可以通过与之后记载的实施例4中相同的方法、相似的方法、或者所述方法的组合以及标准方法来实施。

在脂质体的制备过程中，辅助脂类(EtOH溶液)/阳离子脂类(EtOH溶液)的比率可以被适当地改变。

本发明的脂质体的优选实例包括具有EPC/DOTAP/本发明肽化合物、EPC/本发明肽化合物、或者EPC/DSPG/本发明肽化合物组成的脂质体；并且更优选具有EPC/DOTAP/本发明肽化合物组成的脂质体。

本发明的脂质体在约中性的pH(例如pH 7或7.4)具有约-50至+50mV的zeta电位，优选约-40至+40mV，且更优选约-30至+30mV。Zeta电位可以通过使用Zetasizer测定。

本发明的脂质体的平均粒径为，例如，30-1000nm，优选50-500nm，且更优选60-200nm，但是其不限于此。平均粒径可以通过例如动态光散射法、静态光散射法、电镜观察、原子力显微镜观察等测定。

待被输送到细胞中的目标物质可以包封在本发明的脂质体中。

当目标物质是水溶性的时，其被加入至当在制备脂质体期间使脂膜水合时使用的含水溶剂中。因此目标物质可以包封在脂质体的水相中。当为脂溶性的时，目标物质被加入到在制备脂质体期间使用的有机溶剂中；目标物质因此可以包封在脂质体的脂双层中。本通知书所使用的术语“包封”表示目标物质被包括到中空颗粒例如脂质体内的情况。

待被输送目标物质的有机体种类没有限制，只要它们是脊椎动物即可。优选哺乳动物。哺乳动物的实例包括人、猿、牛、绵羊、山羊、马、猪、兔子、狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠等等。

本发明的脂质体可以以分散状态使用。作为分散溶剂，可以使用缓冲溶液例如生理盐水溶液、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、或者乙酸缓冲溶液。添加剂，例如糖类、多元醇、水溶性聚合物、非离子表面活性剂、抗氧剂、pH调节剂以及水合促进剂，可以被加入至分散体中。

本发明的脂质体还可以以干燥的分散体状态(例如，冻干或喷雾干燥)使用。干燥的脂质体可以被加入到缓冲溶液中，例如生理盐水溶液、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、或者乙酸缓冲溶液，以制备分散体。

本发明的脂质体在体外或体内均可使用。当本发明的脂质体被用作药物组合物时，给药途径可以是，例如静脉注射、静脉滴注等。剂量和给药频率可以根据包封到本发明脂质体中的目标物质的种类和量进行适当调整。

当被用作药物组合物时，如果必要，本发明的脂质体可以包含药物载体。根据目的例如诊断或治疗，可以使用多种剂型。例如，可以使用注射剂作为剂型。多种剂型可以通过本领域技术人员常用的已知制备方法制备。

当制备注射剂时，可以将pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂等加入目标物质。皮下、肌内和静脉注射剂可以通过标准方法制备。

pH调节剂和缓冲剂的实例包括柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠等等。稳定剂的实例包括焦亚硫酸钠、EDTA、巯基乙酸、硫代乳酸等等。等渗剂的实例包括氯化钠、葡萄糖、D-甘露醇、甘油等等。

本发明的脂质体既不引起体重减轻也不引起肝病，因此可以安全施用。

本发明的物质引入剂可以在体外或在体内使用，以将目标物质输送至弱酸性pH部位。弱酸性pH部位的实例包括炎症部位、肿瘤部位、感染部位等等。具体地，优选肿瘤部位。

待被包封的目标物质的实例包括，但不特别限定为，一种或多种选自由以下所组成之群中的物质：药物、核酸、肽(例如催产素、缓激肽、促甲状腺素释放因子、脑啡肽、以及类似的生物活性肽和肽激素)、蛋白质(例如酶、白细胞介素和多种类似的细胞因此、细胞转移因子、细胞生长因子和抗体)、糖、以及其复合物。这些可以根据目的，例如诊断或治疗来选择。核酸包括DNA和RNA以及DNA和RNA的类似物和衍生物(例如siRNA、肽核酸(PNA)、和硫代磷酸酯DNA)。核酸可以是单链或者双链的，并且可以是线形或环状的核酸。

而且，本发明的脂质体可以设计成在不同部位释放包封在相同脂质体中具有不同分子量的数种类型的目标物质。例如，本发明的脂质体可以设计成以弱酸性pH特定的方式释放具有700或更低分子量的低分子物质，而在弱酸性pH环境中不释放具有700或更高分子量的高分子物质，但是在脂质体被摄取进入到肿瘤细胞中之后释放具有700或更高分子量的高分子物质。

基于100重量份构成脂质体的所有肽和脂类，目标物质的含量为0.1-60重量份，且优选1-40重量份。

当目标物质是药物时，可以使用任何用在弱酸性环境(pH在6.5左右)中的组织中的药物。例如，可以使用抗癌药物。抗癌药物的具体实例包括替加氟、阿霉素、道诺霉素、顺铂、奥沙利铂、卡铂、紫杉醇、依立替康、SN-38、放线菌素D、长春新碱、长春碱、甲氨喋呤、硫唑嘌呤、氟尿嘧啶、丝裂霉素C、多西紫杉醇、环磷酰胺、卡培他滨、表阿霉素、吉西他滨、米托葱醌、甲酰四氢叶酸、长春瑞滨、曲妥单抗、依托泊苷、雌氮芥、泼尼松、干扰素α、白细胞介素-2、博来霉素、异环磷酰胺、巯乙磺酸钠、六甲蜜胺、托泊替康、阿糖胞苷、甲强龙、地塞米松、巯嘌呤、硫代鸟嘌呤、氟达拉滨、吉姆单抗、去甲氧基柔红霉素、米托蒽醌、维甲酸、阿仑单抗、苯丁酸氮芥、克拉屈滨、伊马替尼、表阿霉素、氮烯唑胺、甲基苄肼、二氯甲基二乙胺、利妥昔单抗、地尼白介素、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑、别嘌呤醇、亚硝脲氮芥、他莫昔芬、非格司亭、替莫唑胺、美法仑、长春瑞滨、阿扎胞苷、沙利度胺、丝裂霉素等等。另外，也可以使用抗炎剂作为目标物质，因为炎症部位也是弱酸性区域。抗炎剂的实例包括非甾类抗炎剂(例如布洛芬、酮洛芬、萘普生、吲哚美辛、阿司匹林、双氯芬酸、吡罗昔康、对乙酰氨基酚、塞来昔布和罗非考昔)以及甾类抗炎剂(例如氢化可的松、氢化泼尼松、地塞米松和倍他米松)。

用作目标物质的核酸的优选实例包括选自由部分双链(meroduplex)RNA(mdRNA)、切口dsRNA(ndsRNA)、缺口dsRNA(gdsRNA)、短干扰核酸(siNA)、siRNA、小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰取代的寡核苷酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的dsRNA、和转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)所组成之群中的任何双链RNA(dsRNA)。目标物质可以单独使用或两种或更多种组合使用。例如，两种或更多种类型的siRNA可以组合使用。

在涉及取代和修饰(包括化学修饰)的一个实施方式中，双链RNA可以在双链RNA的一或两个3’末端处包括一至四个核苷酸的悬突，如包括一个脱氧核糖核苷酸或两个脱氧核糖核苷酸(例如胸苷、腺嘌呤)的悬突。双链RNA可以在双链RNA的一或两个末端具有平端。在一个实施方式中，第一或第二链的5’末端是磷酸化的。在双链RNA的任何实施方式中，悬突于3’末端的核苷酸可以包括在核酸糖、碱或骨架处被化学修饰的核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸。在双链RNA的任何实施方式中，悬突于3’末端的核苷酸可以包括一个或多个普遍碱核糖核苷酸。在双链RNA的任何实施方式中，悬突于3’末端的核苷酸可以包括一个或多个非环核苷酸。在双链RNA的任何实施方式中，dsRNA还可以包括终端磷酸酯基团，例如5’-磷酸酯(参见Martinez等人,Cell,110:563-574,2002；和Schwarz等人,Molec.Cell,10:537-568,2002)或者5’,3’-二磷酸酯。

双链RNA还可以包括2’-糖取代，例如2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-2-甲氧基乙基、卤素、2’-氟、或2’-O-烯丙基、或其组合。在另外的实施方式中，双链RNA还包括在第一链或者一或多个第二链的一或两个末端上的末端端帽取代基，例如烷基、脱碱基、脱氧脱碱基、甘油基、二核苷酸、非环核苷酸、反向脱氧核苷酸部分、或其组合。

在另外的实施方式中，双链RNA还可以包括至少一个修饰的核苷酸间连接，例如独立地硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphotriester)、氨基烷基磷酸三酯、膦酸甲酯、膦酸烷基酯、3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酸酯、亚膦酸酯、氨基膦酸酯(phosphoramidate)、3’-氨基氨基膦酸酯、氨基烷基氨基膦酸酯、硫羰氨基膦酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯、溴代磷酸酯连接、或其组合。

双链RNA可以被取代或修饰(包括化学修饰)，通过使用5-甲基胞嘧啶；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基、2-丙基或其他烷基衍生物；8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤(例如，8-氮杂、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基)；7-甲基、7-脱氮和3-脱氮腺嘌呤和鸟嘌呤；2-硫尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶；2-巯基胞嘧啶；5-甲基、5-丙炔基、5-卤代(例如5-溴或5-氟)、5-三氟甲基、或者其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；以及核苷酸类似物，如6-偶氮尿嘧啶。

RNA，如双链RNA(dsRNA)，可以被化学修饰。该化学修饰的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯核苷酸间连接、2’-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸、“非环”核苷酸、5’-C-甲基核苷酸、和末端甘油基和/或反相脱氧脱碱基残基引入。这些化学修饰可以保持RNAi在细胞中的活性。

本发明提供一种包括上述脂质体的药物组合物。将要通过本发明的药物组合物预防或治疗的目标疾病可以根据目标物质的类型加以筢，并且没有特别限定。本发明的药物组合物的实例包括抗肿瘤药物等等。

在该实施方式中，目标癌症没有特别限定。其实例包括头部和颈部癌症、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊和胆管癌、胆道癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸瘤、骨骼和软组织肉瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、脑瘤、间皮瘤、黑色素瘤等等。

实施例

在下面参考实施例和测试例更详细地记载本发明。然而，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1：合成HGHGLALLAHALLAHAALAHAALA(SEQ ID NO:1，肽化合物1)

使用Fmoc-Ala-HMP树脂作为起始原料，以0.1mM的量级，SEQ ID NO:1的肽使用氨基酸、缩合剂(HBTU/HOBt)以及反应促进剂(DIEA)(各自相对于树脂4当量)通过Fmoc固相合成来合成。(HBTU：M.W.379.2，HOBt，无水：M.W.135.1，DIEA：M.W.129.2)。将TFA(三氟乙酸)混合物溶液(TFA：125mL；H₂O：0.25mL；苯酚：0.375g；乙二硫醇：0.125mL；以及苯甲硫醚：0.25mL)加入合成树脂中并在冰冷却下反应15分钟，且在室温下2小时。肽从树脂中切裂出，并在乙醚中沉淀得到粗肽。通过HPLC进行纯化，接着冻干。通过HPLC和MAL-TOF-MS测定纯度。在以下HPLC条件下进行分析，并且目标肽化合物1(SEQ ID NO:1)作为单一峰获得。平均亲水指数在表3中示出，之后提供。

A缓冲液：0.1％TFA/H₂O；B缓冲液：0.1％TFA/乙腈；柱：SunFire C18柱，5μm，4.6×150mm；流速：1mL/min；波长：220nm。

将Applied Biosystems Voyager System用于MALDI-TOF-MS。计算分子量：2320.7；检测到：2321.40。

图1示出HPLC和MALDI-TOF-MS的结果。

合成规模：0.1mM量级(分子量：2020.7)；

使用的树脂：Fmoc-Ala-HMP树脂；

树脂的使用量：208.0mg(引入的树脂量：0.48mmol/g)；

通过使用该树脂得到的肽的理论值：232.3mg；

实际得到的粗量：228.6mg(收率：98.4％)。

实施例2：合成GHHGLALLHALHLAAAALHAAALA(肽化合物2)

如实施例1进行合成以得到肽化合物2(SEQ ID NO:2)。计算分子量：2320.7；检测到：2320.04。图2显示HPLC和MALDI-TOF-MS的结果。平均亲水指数在表3中示出，之后提供。

合成规模：0.1-mM量级(分子量：2320.7)；

使用的树脂：Fmoc-Ala-HMP树脂；

树脂的使用量：140.1mg(引入的树脂量：0.72mmol/g)；

通过使用该树脂得到的肽的理论值：234.0mg；

实际得到的粗量：95.5mg(收率：40.8％)。

实施例3：合成EGEGLALLAHALLAHAALAHAALA(肽化合物3)

如实施例1进行合成以得到肽化合物3(SEQ ID NO:3)。计算分子量：2304.6；检测到：2305.14。图3显示HPLC和MALDI-TOF-MS的结果。平均亲水指数在表3中示出，之后提供。

合成规模：0.1-mM量级(分子量：2304.6)；

使用的树脂：Fmoc-Ala-HMP树脂；

树脂的使用量：175.6mg(引入的树脂量：0.60mmol/g)；

通过使用该树脂得到的肽的理论值：242.7mg；

实际得到的粗量：240.1mg(收率：98.9％)。

比较例1：合成HHGGLLLLHHHAAAAALLLAAAAA(比较化合物1)

如实施例1进行合成以得到比较化合物1(SEQ ID NO:4)。计算分子量：2320.7；检测到：2320.65。图4显示HPLC和MALDI-TOF-MS的结果。平均亲水指数在表3中示出，之后提供。

合成规模：0.1-mM量级(分子量：2320.7)；

使用的树脂：Fmoc-Ala-HMP树脂；

树脂的使用量：179.8mg(引入的树脂量：0.58mmol/g)；

通过使用该树脂得到的肽的理论值：242.0mg；

实际得到的粗量：233.4mg(收率：96.4％)。

比较例2：合成HGHGGGGGGGGGAHALLAHAALAH(比较化合物2)

如实施例1进行合成以得到比较化合物2(SEQ ID NO:5)。计算分子量：2040.1；检测到：2040.49。图5显示HPLC和MALDI-TOF-MS的结果。平均亲水指数在表3中示出，之后提供。

合成规模：0.1-mM量级(分子量：2040.1)；

使用的树脂：H-His(Trt)-Trt(2-C1)树脂；

树脂的使用量：217.6mg(引入的树脂量：0.50mmol/g)；

通过使用该树脂得到的肽的理论值：222.0mg；

实际得到的粗量：182.9mg(收率：82.4％)。

比较例3：合成HGHGLALLAHALLAHAAAAL(比较化合物3)

如实施例1进行合成以得到比较化合物3(SEQ ID NO:6)。计算分子量：1928.2；检测到：1929.58。图6显示HPLC和MALDI-TOF-MS的结果。平均亲水指数在表3中示出，之后提供。

合成规模：0.1-mM量级(分子量：1928.2)；

使用的树脂：Fmoc-Leu-HMP树脂；

树脂的使用量：208.2mg(引入的树脂量：0.50mmol/g)；

通过使用该树脂得到的肽的理论值：200.7mg；

实际得到的粗量：111.8mg(收率：55.7％)。

实施例4：阳离子脂质体的制备，和pH响应性。

(1)脂质体如下制备。具体地，把由蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)和二油酰基四铵丙烷(DOTAP)以1:1摩尔比的混合物制备的脂类乙醇溶液分配至试管中。将实施例1中得到的肽化合物1的乙醇溶液以总脂类含量5mol％的量加入，并且将等量的氯仿与之混合，接着在氮气流下蒸发至干燥得到薄的脂膜。将pH为7.4的缓冲液加入其中，且使混合物在室温下充分地水合10分钟。水合完成后，使用水槽式超声装置对试管进行超声，以制备包括EPC、DOTAP和肽化合物1的脂质体1(脂类浓度：10mM)。

(2)稀释并混悬于具有不同pH的缓冲液中的脂质体1的粒径(尺寸)和表面电位(ζ电位)通过Malvern Instruments Ltd.制造的Zetasizer Nano测定。另外，也以相同的方式测定没有引入肽化合物的参照脂质体(EPC/DOTAP＝1/1，摩尔比)的粒径和表面电位。表2显示结果。

表2

结果显示没有引入本发明的肽化合物的参照脂质体在粒径和表面电位方面对pH的响应性极少地改变。相反地，引入有本发明的肽化合物的脂质体的粒径在pH为7.4时为约100nm。当pH为6.5时，粒径增长至当pH为7.4时的约两倍。而且，当pH为7.4时表面电位为-2.0mV；然而，当pH为6.5时表面电位改变至+9.8mV。这些结果表明因较小的pH变化引起的肽中包含的组氨酸的质子化导致粒径和表面电位的变化。当pH从7.4降低至6.5时粒径增加的原因被认为如下。即，组氨酸的质子化引起疏水区域之间疏水相互作用的降低，且导致亲水区域之间的静电排斥，由此脂质体结构松动。

测试例1：

测定在不同pH条件下被包封药物的渗漏。

(1)在如实施例4制备含有肽的脂膜之后，加入钙黄绿素(Mw：622.55)的30-mM溶液，且如实施例4制备包封钙黄绿素的脂质体1。未被包封的钙黄绿素通过凝胶过滤(Sephadex G50)被除去。

为测定被包封的钙黄绿素从脂质体中的渗漏，将脂质体稀释并混悬于具有不同pH的缓冲液中，且然后在37℃孵育10分钟。渗漏的钙黄绿素的荧光(λex：488nm，λem：517nm)通过读板仪(Infinite M200，Tecan制造)测定。当脂质体与1％的Triton-X100混合时渗漏的钙黄绿素的荧光被认为是完全渗漏。渗漏率通过下式计算。图7示出结果。

渗漏率(％)＝(F_样品-F_pH7.4)/(F_triton-F_pH7.4)×100

F_样品：每个pH值下从脂质体中渗漏出的钙黄绿素的荧光

F_pH7.4：pH 7.4下从脂质体中渗漏出的钙黄绿素的荧光

F_triton：当脂质体与1％的Triton-X100混合时钙黄绿素的荧光。

结果显示，在pH 7.4下没有观察到渗漏，而在pH 6.5下观察到约100％的钙黄绿素的渗漏。这表明由于较小的pH改变，嵌入脂膜中的肽化合物的亲水嵌段和疏水嵌段的His被质子化，这引起肽与脂类分子间的排斥，从而允许被包封的钙黄绿素的渗漏。

(2)在如实施例4制备含有肽的脂膜后，加入Texas红标记的右旋糖酐(Mw 3,000)的2-mg/ml溶液，并且如实施例4制备包封右旋糖酐的脂质体1。为了增加Texas红标记的右旋糖酐到脂质体中的包封率，进行液氮冷冻，接着在37℃融化。该冻融过程被重复5次。未被包封的Texas红标记的右旋糖酐通过凝胶过滤(Sepharose CL-6B)被除去。以与上述相同的方式测定被包封的Texas红标记的右旋糖酐从脂质体中的渗漏。图8显示结果。

结果显示，在pH 7.4下没有观察到渗漏，并且即使在pH 6.5或更低也没有观察到右旋糖酐从脂质体中的渗漏。这表明该脂质体可以根据较小的pH变化选择性地渗漏低分子量化合物，而不渗漏高分子量化合物。

(3)在如实施例4制备含有肽的脂膜后，加入钙黄绿素(Mw622.55)的15-mM溶液和Texas红标记的右旋糖酐(Mw 3,000)的1-mg/ml溶液，且如实施例4制备包封双组分的脂质体1。未被包封的钙黄绿素和右旋糖酐通过用透析膜(分子截流：14,000)透析除去。以与上述相同的方式测定被包封的Texas红标记的右旋糖酐和钙黄绿素从脂质体中的渗漏。图9显示结果。

结果显示，当钙黄绿素和右旋糖酐共同包封在脂质体中时，钙黄绿素在pH 6.5下的渗漏为约60％，且在pH 6或更低为约80％。另一方面，在所有pH下没有观察到右旋糖酐的渗漏。这证实了该脂质体可以根据较小的pH改变选择性渗漏低分子量化合物，如上所述。

本发明的脂质体可以以pH-依赖的方式渗漏低分子量化合物。当具有不同分子量的化合物被包封在本发明的脂质体中时，化合物可以根据其分子量逐步地渗漏。

测试例2：

单独的肽或引入有肽的脂质体在不同pH条件下的CD光谱(表示pH响应性和膜结构基底的必要性)

将单独的实施例1中得到的肽化合物1以及根据实施例4得到的引入有肽的脂质体(各自具有20μM的肽浓度)混悬于具有不同pH的PBS(-)中，并且在J-720WI分光偏振计(JASCO Corporation制造)上记录CD(圆二向色性)光谱。图10显示结果。

“α-螺旋”表示α-螺旋结构，并且“无规卷曲结构”表示其中不形成清楚的二级结构的状态。

结果显示，单独的肽化合物1在pH 7.4的结构为α-螺旋(正峰在196nm左右，并且负峰在207和222nm左右)；然而，随着pH的降低，其相继地转化为无规卷曲结构(负峰在196nm左右)。相比之下，引入有肽的脂质体在pH 7.4的结构是类似α-螺旋；然而，在pH 6.5下其几乎全部地转化为无规卷曲结构。因此，伴随着pH的变化，单独的肽和引入有肽的脂质体经历了不同的结构转变。这些结果表明膜结构基底对于肽的pH响应性是必要的。

实施例5：制备具有不同脂类组成的脂质体

(1)如实施例4制备中性脂质体2(EPC/肽化合物1＝1/5mol％)。

(2)如实施例4制备阴离子脂质体3(EPC/DSPG/肽化合物＝1/1/5mol％)。

测试例3：测定包封在多种脂质体中的药物的渗漏

将钙黄绿素包封在实施例4中得到的脂质体1，以及实施例5中得到的脂质体2和3中，并且如测试例1检定pH响应性。结果显示，在pH 7.4下没有观察到钙黄绿素从任何脂质体中的渗漏；然而，在pH 6.5下，阳离子脂质体1显示了最高的渗漏。该渗漏以阳离子脂质体3、中性脂质体2的顺序降低。这表明最优选将肽化合物引入到阳离子脂质体中，使得脂质体在稍酸性pH下呈现响应性。

实施例6

引入有实施例2中得到的肽化合物2的脂质体2根据实施例4所述的方法制备，并且包封钙黄绿素的脂质体2通过与测试例1相同的制备方法制备。

实施例7

引入有实施例3中得到的肽化合物3的脂质体3根据实施例4所述的方法制备，并且包封钙黄绿素的脂质体3通过与测试例1相同的制备方法制备。

比较例4

引入有比较例1中得到的比较化合物1的比较脂质体1根据实施例4所述的方法制备，并且包封钙黄绿素的比较脂质体1通过与测试例1相同的制备方法制备。

比较例5

引入有比较例2中得到的比较化合物2的比较脂质体2根据实施例4所述的方法制备，并且包封钙黄绿素的比较脂质体2通过与测试例1相同的制备方法制备。

比较例6

引入有比较例3中得到的比较化合物3的比较脂质体3根据实施例4所述的方法制备，并且包封钙黄绿素的比较脂质体3通过与测试例1相同的制备方法制备。

测试例4：引入有肽的脂质体的平均亲水指数，以及被包封药物的渗漏率

实施例4、6和7以及比较例4-6中得到的包封钙黄绿素的脂质体在pH 7.4和pH 6.5下的钙黄绿素渗漏率如测试例1进行计算。表3显示结果。

表3

结果显示，在引入有本发明的肽化合物的脂质体中，在pH 7.4的生理条件下没有观察到渗漏；然而，在弱酸性pH 6.5下观察到被包封药物的高渗漏(60％或更高)。特别地，在亲水氨基酸嵌段和疏水氨基酸嵌段中具有His的肽化合物中观察到显著高的渗漏。相反地，即使具有相同的氨基酸组成，在肽的疏水嵌段中具有相邻组氨酸残基的比较化合物1被引入的脂质体中，以及在平均亲水指数通过将肽化合物亲水嵌段和疏水嵌段中的氨基酸数目的比例改变为1:1而改变的比较化合物2被引入的脂质体中，被包封的药物的渗漏显著地降低，即使当pH从7.4改变至6.5时。因此，pH响应性不充分。另外，制备引入有比肽化合物1少四个残基的比较化合物3的脂质体；然而，在pH 6.5或更低其显著地聚集。而且，进行了将钙黄绿素包封到脂质体中的尝试；然而，在pH为7.4下观察到与当实施Triton处理相同水平的荧光强度。这表明包含少四个残基的序列的肽的脂质体是不稳定的，且药物不能被包封在其中。

测试例5：包封阿霉素(Dox)的脂质体4的抗肿瘤作用

包封Dox的脂质体4如下制备。具体地，把由蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)和二油酰基四铵丙烷(DOTAP)以1:1摩尔比的混合物制备的脂类乙醇溶液分配至试管中。将实施例1中得到的肽化合物1的乙醇溶液以总脂类含量5mol％的量加入，并且将等量的氯仿与之进一步混合，接着在氮气流下蒸发至干燥得到薄的脂膜。随后，将250mM的硫酸铵(pH 8.5)加入其中，且使混合物在室温下充分地水合10分钟。水合完成后，使用水槽式超声装置对试管进行超声，以制备包括EPC、DOTAP、PEG-DSPE和肽化合物1的脂质体4(脂类浓度：10mM)。使用以10％蔗糖(pH 8.5)平衡的Sephadex G-50柱对制备的脂质体4实施凝胶过滤。收集部分中的脂类浓度使用Phospholipid Test Wako进行定量。将Dox溶液(2mg/ml)加入至脂质体4中，且将混合物在65℃孵育1小时。然后，未被包封的Dox通过使用Sephadex G-50柱的凝胶过滤除去。包封在脂质体4中的Dox的量通过用Triton-X处理使脂质体溶解，然后使用读板仪(Infinite M200，Tecan制造)在490nm测定吸收度来进行定量。

为评价包封Dox的脂质体4的抗肿瘤作用，对荷瘤无毛小鼠施用Dox溶液或包封Dox的脂质体4，其中由皮下植入的B16-F1细胞形成的肿瘤生长至100mm³的尺寸，通过在植入后5、8、12或15天以每注射剂Dox浓度为0.5mg/kg尾静脉注射。肿瘤体积根据肿瘤长度和宽度使用下式计算：

(肿瘤体积)＝0.5×(长度)×(宽度)²

另外，相对肿瘤体积通过下式计算：

(相对肿瘤体积)＝(植入后8、12、15或19天的肿瘤体积)/(植入后5天的肿瘤体积)

图11显示结果。如图11所示，当施用低剂量的Dox时，包封Dox的脂质体4显示出比Dox溶液更高的肿瘤生长抑制作用。

Claims

1.一种肽化合物，其由一个亲水氨基酸嵌段和一个疏水氨基酸嵌段组成；

[1]所述肽化合物由总计24至36个氨基酸组成；

[2]所述亲水氨基酸嵌段由总计4个氨基酸组成并具有-3.0至-1.0的平均亲水指数；并且

[3]所述疏水氨基酸嵌段由总计20至32个氨基酸组成，其中包含一个或多个His残基，并且具有1.0至2.5的平均亲水指数；

其中所述亲水氨基酸嵌段由具有0或更低亲水指数的氨基酸组成且所述疏水氨基酸嵌段由一个或多个His残基和具有高于0的亲水指数的氨基酸组成，并且

其中当所述疏水氨基酸嵌段包括两个或更多个具有-3.0或更低亲水指数的氨基酸时，具有-3.0或更低亲水指数的氨基酸在所述疏水氨基酸嵌段中彼此不相邻，

其中所述亲水氨基酸嵌段由下式(I)表示：

(AA₁)(AA₂)(AA₃)(AA₄) (I)

其中AA₁、AA₂、AA₃和AA₄中的任意两个是His或Glu，且另外两个是Gly；并且

所述疏水氨基酸嵌段包含5-8个由下式(II)表示的单元：

(AA₅)(AA₆)(AA₇)(AA₈) (II)

2.根据权利要求1所述的肽化合物，其中所述亲水氨基酸嵌段具有-2.0至-1.5的平均亲水指数；并且

所述疏水氨基酸嵌段具有1.5至2.0的平均亲水指数。

3.根据权利要求1所述的肽化合物，其中所述亲水氨基酸嵌段包括具有-3.0或更低亲水指数的氨基酸以及具有0至-1.0亲水指数的氨基酸；并且

4.根据权利要求1所述的肽化合物，其中所述亲水氨基酸嵌段具有包含0至4个His残基的肽序列；并且

所述疏水氨基酸嵌段具有包含1至8个His残基的肽序列。

5.一种肽化合物，其由一个亲水氨基酸嵌段和一个疏水氨基酸嵌段组成；

[1]所述肽化合物由总计24至36个氨基酸组成；

[2]所述亲水氨基酸嵌段由总计4至10个氨基酸组成并具有-3.0至-1.0的平均亲水指数；并且

[3]所述疏水氨基酸嵌段由总计20至32个氨基酸组成，其中包含一个或多个His残基，并且具有1.0至2.5的平均亲水指数，

其中所述疏水氨基酸嵌段包含5-8个由下式(II)表示的单元：

(AA₅)(AA₆)(AA₇)(AA₈) (II)

其中AA₅、AA₆、AA₇和AA₈相同或不同，且各自表示His、Leu或Ala，条件是当所述疏水氨基酸嵌段包含两个或更多个His残基时，所述单元之间的两个His残基或各个单元中的两个His残基彼此不相邻；并且各个单元可具有相同或不同的氨基酸序列，

其中所述亲水氨基酸嵌段由具有0或更低亲水指数的氨基酸组成且所述疏水氨基酸嵌段由一个或多个His残基和具有高于0的亲水指数的氨基酸组成。

6.一种脂质体，包括根据权利要求1-5中任一项所述的肽化合物，以及脂类。

7.根据权利要求6所述的脂质体，其中所述脂质体基于所述脂质体中脂类的总量包括1-10mol％根据权利要求1-5中任一项所述的肽化合物。

8.根据权利要求7所述的脂质体，其中所述脂质体是阳离子脂质体。

9.根据权利要求6所述的脂质体，其中所述脂质体包封有目标物质。

10.一种药物组合物，包括根据权利要求6-9中任一项所述的脂质体。

11.一种抗肿瘤剂，包括根据权利要求6-9中任一项所述的脂质体。

12.根据权利要求6-9中任一项所述的脂质体在制备癌症预防剂或癌症治疗剂中的用途。

13.根据权利要求6-9中任一项所述的脂质体，其被用于预防或治疗癌症。