CN101970687A - 用于体内基因输送的自组装胶束样纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含核酸并适合用作体内核酸输送剂的纳米颗粒。本发明纳米颗粒使用如聚乙烯和磷脂等聚阳离子共价缀合物。最终的包含DNA的纳米颗粒具有泡状结构，复合物核心被混合的脂质/PEI-脂质单层包裹，其制备简单，承载能力高，在体内稳定。本发明纳米颗粒有良好的体内稳定性和延长的血液循环时间，能够有效地将基因输送到生物靶位处，如肿瘤。

Description

用于体内基因输送的自组装胶束样纳米颗粒
相关申请的交叉引用
本发明要求2007年11月9日提交的，名为基因输送纳米颗粒的美国临时申请No.61/002,626号的优先权，该申请整体纳入本文作为参考。
关于联邦政府资助研究或开发的声明
本发明的研究是使用国立卫生研究院No.R01HL55519号拨款，在美国政府支持下进行的。因此，美国政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
体内基因治疗依赖于基于DNA的药物的输送，形式可以是将寡核苷酸(反义寡聚脱氧核苷酸(ODN)SiRNA)或者整个基因(质粒DNA)输送进入其在细胞内起作用的位置。除了少数可以局部施药的例外情况，基因治疗的广泛临床应用还需要发展非侵入性的输送方法。非病毒系统是一种理想的DNA载体，因为其操作安全、简单，而且费用低于病毒系统。
在非病毒基因输送系统中，已经研究了基于聚合物的复合物和基于脂质的系统，脂质体复合物或包载DNA脂质体，但其在临床应用中显示出局限性。这主要是由于其缺乏体内稳定性以致不能在治疗水平上输送基因治疗剂到达靶位置。结合了基于聚合物的系统和基于脂质的系统的三级脂质体系统也已经被研究。其中，包封了PEI/DNA复合物的脂质体纳米颗粒，如bioPSL或pSPLP，已经被计划和测试在体内应用，得到结果是有希望的。然而，尽管在体内稳定而且达到靶位置的循环时间长，组合系统包括复杂耗时的制备步骤而且承载能力低。
阳离子聚合物聚乙烯亚胺(聚乙烯亚胺，PEI)及其衍生物已经被广泛的研究应用于基因输送[1-5]。PEI具有独特的优势，其在合成的聚阳离子中有最高的正电荷密度，使其可以在静电作用下与DNA有效凝聚。PEI还有一种内在机制，通过所谓的“质子海绵”机制[1，2]和核定位[6]调节“内体逃逸”，这使其具有高转染效率。在分子量从约1到800kDa的宽范围内，线性或分支状形式的，低分子量PEI已经被证明有良好的耐受性和低毒性[7]。
然而，由于在循环过程中的快速清除和RES(网状内皮系统)中的积累，PEI/DNA复合物形式的PEI在体内没有显示出显著的疗效。这主要归因于复合物整体的正电荷。尽管复合物的正电荷与细胞膜带负电的成分相互作用促进了复合物的吸收，它们也会与血液成分发生相互作用和调理作用，使复合物在血液循环中被快速清除。结果是，已有的PEI/DNA复合物几分钟内就会被从血液循环中清除，主要积累在RES器官中，例如肝和脾[8]。当注入身体时，这些PEI/DNA复合物在生理环境中还会发生DNA解离和聚合，这些因素限制了已知的PEI/DNA复合物的体内应用。
曾经尝试过几种方法以改进PEI/DNA复合物的体内稳定性[3，5，9]。如在其他纳米颗粒系统[10]中一样，已经使用聚(乙二醇)(PEG)来提高此类复合物的体内稳定性并延长其循环时间。为此目的，已经将PEG共价连接到制备好的PEI/DNA复合物上[11]，或使用连接了PEG的PEI与DNA形成复合物[12]。制备好的PEI/DNA复合物也可以使用阴离子肽和PEG的共聚物包被上PEG[13]。在结合PEI和脂质体的技术中，连接了脂质的PEI如软质酸酯PEI[14]和胆固醇PEI[15]已经被用于制备装载DNA的聚阳离子脂质体(PCL)。也已将制备好的PEI/DNA复合物包封在PEG稳定化的脂质体中，制成所谓的“预浓缩稳定质粒脂质颗粒”(pSPLP)[16]。然而，很明显还需要其他的方式提高体内基因治疗的成功率。
在非病毒基因输送系统中，已经研究了基于聚合物的复合物和基于脂质的系统，脂质体复合物或包载DNA脂质体，但其在临床应用中显示出局限性。这主要是由于其缺乏体内稳定性以致不能在治疗水平上输送基因治疗剂到达靶位置。结合了基于聚合物的系统和基于脂质的系统的三级脂质体复合物也已经被研究。其中，包封了PEI/DNA复合物的脂质体纳米颗粒，如bioPSL或pSPLP，已经被计划和测试在体内应用，得到结果是有希望的。然而，尽管在体内稳定而且达到靶位置的循环时间长，组合系统包括复杂耗时的制备步骤而且承载能力低。
发明简述
为满足这样的需求，开发了一种装载了核酸，如质粒DNA或siRNA的新型胶束状纳米颗粒(MNP)，以及一种构建输送基因的纳米颗粒的新方法。首先将阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)，结合到磷脂烷基或酰基链的末端，产生磷脂-聚乙烯亚胺(PLPEI)缀合物。随后将PLPEI与核酸，如质粒DNA、寡核苷酸(如反义寡核苷酸)、RNA或核酶混合，以形成大小在纳米尺度上并具有PEI/核酸(PEI/NA)复合物核心和磷脂单层(即单分子层)外膜结构的复合物。PLPEI的带阳离子的PEI基团和带阴离子的核酸之间的静电相互作用提供了形成纳米颗粒的驱动力。PLPEI缀合物的磷脂基团在疏水相互作用下排列成单分子层。将非修饰的(即非缀合的)磷脂如POPC，胆固醇添加到PLPEI/核酸复合物中以补充环绕PEI/核酸核心的脂质单分子层。还加入了PEG-PE以提供纳米颗粒立构稳化。非修饰的脂质和PEG-PE通过疏水相互作用被纳入单分子层中。最终的结构是空间稳定的胶束样纳米颗粒，。
在优选的实施方案中，本发明的纳米颗粒基于磷脂和聚乙烯亚胺(PLPEI)之间的共价缀合物，PEG-PE以及脂质的组合。磷脂-聚乙烯亚胺缀合物在质粒DNA、非修饰的脂质和PEG-PE存在的情况下会自组装成由脂质单层包裹硬核的胶束样纳米颗粒，所得到纳米颗粒的结构、性质适于体内应用。
本发明的纳米颗粒，一种新的基因输送结构，是无毒，可长期循环的，并且能够在体内有效的向RES位置和其他器官转染治疗核酸。本发明结合了基于聚合物的基因输送系统和基于脂质的基因输送系统，得到了一种磷脂和聚合物的化学缀合物的新用法。将聚乙烯亚胺(PEI)缀合在磷脂烷基链的末端()产生了一种新的化学物质，磷脂-聚乙烯亚胺(PLPEI)缀合物。PLPEI的两个功能区域，i)DNA结合区和ii)膜形成区，分别由PEI和PL基团形成。在DNA存在的情况下，PLPEI通过聚阳离子PEI和聚阴离子DNA间的静电相互作用自组装成纳米颗粒。脂质基团间的疏水相互作用也促进了自组装过程。自组装的纳米颗粒具有独特的结构，其中PEI/NA复合物核心和脂质单层外膜由化学键连接。本发明纳米颗粒不同于脂质体纳米颗粒等，脂质体纳米颗粒中，脂质形成双分子层而非单分子层。本发明纳米颗粒也不同于胶束，胶束完全由疏水相互作用组装而成，并有“临界胶态粒子浓度”的限制。
本发明的优点在于提供了简单的、可重复的一步制备方法以及相对于其他包封PEI/DNA复合物的脂质体纳米颗粒如bioPSL和pSPLP，更高的承载能力。本发明的纳米颗粒还提供了约25％(w/w)的高DNA承载能力，大约是文献已经报道的其他系统值的10倍。此处使用的“DNA承载能力”或“核酸承载能力”是指能包含入本发明的纳米颗粒的DNA或其他核酸的量。
附图简述
本发明的其他特征和优点在下文结合附图的优选实施方案以及权利要求中展示。
图1显示PEI/DNA核心为磷脂单层所包围的胶束样纳米颗粒(MNP)自组装过程的示意图。通过DNA和磷脂-聚乙烯亚胺缀合物(PLPEI)形成复合物，随后用脂质单层包封该复合物，MNP在水介质中自发形成。PLPEI的PEI基团与DNA致密结合，得到一个疏水核心，而PLPEI的磷脂基团与非修饰的脂以及PEG-PE形成环绕PEI/DNA核心的脂质单层。结合了PEG-PE的脂质单层也提供了体内稳定性。
图2a-2b显示对MNP形成的分析。(图2a)不同N/P比率下，PLPEI/DNA复合物对比PEI/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳。没有DNA迁移到胶中说明复合物形成。在N/P≥6时，DNA完全与PLPEI结合。PLPEI显示出的结合能力与非修饰PEI相当。(图2b)MNP的冷冻断裂电子显微镜(ffTEM)分析。MNP显示为平均直径50nm、大小分散范围窄、成型良好的球形颗粒。所有颗粒都显示出结构背后的阴影，证实了胶束样“核”和“单分子层”的构造。比例尺表示50nm。
图3a-3b显示了MNP的稳定性分析。(图3a)MNP对抗盐诱导的聚集的胶体稳定性。监测了加入盐(0.15M NaCl)前后的流体力学直径(hydrodynamic diameter)。加盐后，MNP保持稳定而PEI/DNA迅速聚集。数据以平均±s.e.m表示(n＝3)。(图3b)对MNP中所携带DNA的抗酶解保护。携带DNA的MNP和PEI/DNA复合物在经DNAase I处理后，在0.8％的预制琼脂糖凝胶上进行分析，MNP中的DNA完全被保护而未被酶解。泳道1，DNA；泳道2，DNA，DNase；泳道3，PEI/DNA；泳道4，PEI/DNA，DNase；泳道5，MNP；泳道6，MNP，DNase；泳道7，100碱基对的标记物。
图4显示了MNP对NIH/3T3细胞的毒性。成纤维细胞NIH/3T3用不同PEI浓度的携带了DNA的MNP或PEI/DNA复合物处理。相对细胞存活率表示为相对于以培养基处理的对照细胞的百分比。相比PEI/DNA复合物，4小时的处理后再经24小时温育，MNP没有显示出毒性。
图5a-5b显示了装载了DNA的MNP和PEI/DNA复合物在小鼠中的体内表现：静脉(i.v.)注射携有111In-标记的DNA的药剂后，(a)血液浓度-时间曲线(注意对数尺度)，和(b)DNA在器官中的积累情况。注射后不同的时间采集血样，在最后一次采血后采集主要器官。血液和器官样品的放射性使用伽玛计量器来测量，并表示为相对于每毫升血液或每克器官注射剂量的百分比表示(％ID/ml或％ID/g)。相比PEI/DNA复合物，MNP显示出更长的血液循环时间和更低的RES吸收。p值是先用双向方差分析(ANOVA)然后用Bonferroni post-hoc检验测定的。
图6a-6b显示了携带pGFP的MNP在鼠异种移植物模型中的体内转染结果。患LLC肿瘤的鼠静脉注射携带pGFP的MNP。注射后48小时，检测GFP在肿瘤中的表达。图中显示了体内生长的LLC肿瘤冷冻切片的荧光显微镜图像。(a)未经处理的动物的肿瘤切片(背景图案)；(b)注射了携带pGFP的MNP的动物的肿瘤切片。静脉注射携带pGFP的MNP使末端的肿瘤出现明亮的荧光。由于注射相同DNA含量的PEI/DNA复合物后动物很快死亡，没有检测接受PEI/DNA复合物注射的动物的肿瘤组织中的GFP表达。
发明详述
发明人开发了一种适合体内应用的新型基因输送载体。该载体可通过在烷基链末端化学缀合磷脂和聚阳离子，如聚乙烯亚胺(PLPEI)来构建。受聚阳离子PEI基团和DNA间的静电相互作用力驱动形成了致密的PEI/DNA复合物核心，同时，两亲性的磷脂基团与选择性加入的非修饰游离磷脂和连接了PEG的磷脂(如PEG-PE)一起形成环绕复合物核心的脂质单层外膜，由此形成携带有DNA的胶束样纳米颗粒，该纳米颗粒具有PEG链的空间位阻和脂质单层外膜的膜样屏障提供的稳定性。
与取得了巨大成功的空间稳化(steric stabilization)脂质体不同[20]，聚乙二醇(PEG)赋予复合物的立构稳化没能提供足够的循环时间和体内稳定性[8]。而本发明通过交联聚合物/DNA复合物(polyplexes)的表面[9]将空间稳定与“侧向稳定(lateral stabilization)”相结合，取得了重大的改进。这表明立构稳化对聚合物/DNA复合物的体内稳定作用有限，需要其他稳定机制来加强复合物的体内稳定性。
其他稳化作用可以通过用脂质屏障包封聚合物/DNA复合物来实现，因为盐不能透过脂质屏障，从而保护了复合物不会因受到盐的影响而不稳定。在血液循环中，由于复合物核心与生物环境相隔离，此类系统的体内表现主要取决于脂质屏障。脂质屏障的立构稳化作用延长了有载复合物的循环时间，并使复合物能够通过EPR机制被输送RES之外的其他靶器官。此外，被细胞吸收后，PEI仍将发挥其良好的功能，例如渗透活性和抗胞质核酸酶保护，从而改进DNA分子的细胞内药代动力学特性。
此外，胶束样纳米颗粒还受到来自脂质单层外膜的稳定化作用，该脂质单层受到PLPEI以及自由脂质和PEG-脂质中脂质基团之间疏水相互作用的驱动自动组装而成。MNP对盐引起的聚集和酶消化的强抵抗力证实了这样的脂质单分子层屏障的存在。生理环境的高盐是引起PEI/DNA复合物在体内不稳定的机制之一[8]。这些复合物通过聚阳离子PEI和聚阴离子DNA之间的强静电相互作用形成，并且由颗粒间的静电斥力稳定在胶态。然而，在生理环境中，升高的盐浓度会引起复合物颗粒聚集，原因在于聚合物/DNA复合物颗粒间的静电斥力被破坏，同时，由于聚阳离子和聚阴离子DNA之间的静电相互吸引被破坏，复合物颗粒发生解离[21]。尽管PEG链的立构稳化作用降低了PEG接枝PEI/DNA复合物对盐引发的聚集的敏感度，复合物稳定性一般表明单纯的立构稳化作用有限，还需要其他稳定机制来防止复合物聚集[12，22-24]。不能盐不透性脂质屏障的存在提高了高盐环境中MNP的稳定性。脂质单层屏障，与脂质体一样，阻止了外环境中的盐进到复合物核心，由此提供了抗盐引起的聚集的保护，否则，聚合物/DNA复合物将是不稳定的。没有游离脂质的中间产物PLPEI/DNA复合物发生的中等程度聚集表明：仅靠PLPEI缀合物的磷脂基团提供的脂质屏障似乎不及补充了非缀合脂质的辍合磷脂所提供的那样完全。
选择PEG-脂质如PEG-PE的合适的量以促进游离脂质进入已制备好的复合物并提供对最终构造物的立构稳化作用。考虑到随着混合物中PEG-PE含量增加(胶束形成始于约5mol％)，PEG-PE与磷脂的混合物从胶束相转变为层状相[25，26]，游离脂质混合物水悬浮液的PEG-PE浓度为10mol％有利于胶束相转变为层状相。与已制备好的PLPEI/DNA复合物共同温育后，包括游离脂质和缀合脂质在内总脂质中的PEG-PE含量下降至4.3mol％，在此浓度倾向于形成层状相。本发明还发现，胶束相中的PEG-PE分子会通过所谓的“胶束转移”[27]自发进入已制备好的磷脂囊泡表面。可以认为，游离脂质会与PLPEI/DNA复合物的疏水脂质区相互作用，解离成单体后自发进入已制备好的复合物的脂质层，从而与PLPEI缀合物提供的磷脂基团一起形成环绕复合物核心的脂质单层外膜。最终结构是一种具有PEI/DNA复合物核心和脂质单层外膜的，经立构稳化的胶束样硬核颗粒。
Pluronic P123-接枝的PEI/DNA复合物系统被认为具有类似的基于疏水相互作用的稳定机制[28，29]，在该复合物系统中，Pluronic P123-接枝PEI的两亲Pluronic P123链形成环绕聚合物/DNA复合物核心的胶束样结构，非修饰的Pluronic P123则通过与Pluronic P123-接枝PEI缀合物的疏水相互作用填充到复合物中，从而优化胶束样结构的稳定性。
胶束样纳米颗粒，在一定意义上，类似于将聚赖氨酸/DNA包封在靶向叶酸的阴离子脂质体中的所谓的“脂质体包封的聚阳离子凝缩DNA颗粒”(LDP II)[30]，或将PEI/DNA复合物包封在已制备好的阴离子脂质体中的“人造病毒样颗粒”[31-33]，或将PEI/DNA复合物包封在由外部PEG层稳定的脂质双层(即双分子层)中构成的“预凝缩稳定质粒脂质颗粒”(pSPLP)[16]。特别是，pSPLP表现出了将聚合物/DNA复合物包封在稳定化脂质体中的优点，即由于循环时间延长得以实现PEI/DNA复合物向肿瘤全身性的有效输送，以及PEI溶内体(endosomolytic)活性带来的转染效力提高。然而，pSPLP的制备包括将已制备好的聚合物/DNA复合物与脂质在乙醇(有机溶剂)中进行温育，这一步具有潜在的破坏性，因而需要多个步骤的浓缩和透析。
胶束样纳米颗粒的优点在于将脂质体和经立构稳化的脂质膜结合，尽管此处的脂质膜为单层膜。PLPEI缀合物促成了由同时发生的DNA凝缩和脂质膜形成共同完成的携带DNA的MNP的自组装过程。与脂质体包封的DNA-PEI复合物相比，MNP提供了效率100％的更方便的一步法DNA加载，还提供了高于各种将DNA包封入脂质体之类其他方法[34]的承载能力(高达530μgDNA/μmol总脂，或总颗粒质量的30％为核酸)。
本发明的胶束样纳米颗粒10包括一个包封在脂质单层中的核心复合物(见图1)。核心复合物20含有一个或多个核酸分子30，核酸分子与一个或多个阳离子聚合物分子40如PEI静电结合。阳离子聚合物与脂质单层外膜上的脂分子50共价缀合。一方面，阳离子聚合物结合和包裹核酸从而形成纳米颗粒的核心复合物。另一方面，阳离子聚合物与脂质分子—优选磷脂—的疏水区域的共价连接60使得复合物核心被脂质单分子层70所包封，提高了稳定性以及与细胞膜融合的能力。
胶束样纳米颗粒的平均直径可以从约10nm至约1000nm，优选约10nm至约500nm，更优选约10nm至约200nm，再优选约40nm至约100nm或从约50nm至约70nm。MNP的大小适于其进入细胞并将其所带的核酸成分转移到细胞质中。
阳离子聚合物可以是任何人造的或者天然的聚合物，每分子具有至少两个正电荷，并有足够的电荷密度和分子大小从而能够在生理条件下(即，体内或细胞内可能遇到的pH和盐环境)与核酸结合。适合的阳离子聚合物包括，例如，聚乙烯亚胺、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚烯丙胺和氨基葡聚糖。阳离子聚合物可以是直链或分支的，可以是均聚物或共聚物，包含的氨基酸可以是L或D型，也可以是这些特征的任意组合。优选的，阳离子聚合物分子足够柔韧使其可以与一个或多个核酸分子形成紧密的复合物。
与阳离子聚合物缀合的脂质分子在此处被称为“第一脂质”、“第一磷脂”、“缀合的脂质”或“缀合的磷脂”。适合的脂质包括任何如下所述天然的或合成的双亲(amphipathic)脂(也被称为两亲(amphiphilic)脂)：能够与其他双亲脂一起稳定的形成或进入质脂单层或双层。脂质的疏水基团与脂质单层或双层的疏水区域相接触，其极性头部指向外部的水相，脂质单层或双层的极性表面，并且，在此情况下，朝向纳米颗粒的外表面。双亲脂的亲水性源于极性或带电基团的存在，如碳水化合物、磷酸基、羧基、硫酸根、氨基、巯基，硝基，羟基之类。两亲脂的疏水部分可以来自其包含的非极性基团，包括长链饱和或不饱和脂族烃基以及被一个或多个芳烃、脂族环或杂环基取代的此类基团。两亲脂的例子包括但不限于，天然或合成的磷脂、糖脂、氨基脂、鞘脂、长链脂肪酸和甾醇。磷脂的代表性的例子包括，但不仅限于，卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷酸肌醇、磷脂酸、软质酰油酰、卵磷脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酸磷酯酰胆碱、二硬脂酰卵磷脂和二亚油酰磷脂酰胆碱。缺乏磷的其他化合物，如鞘脂、糖鞘脂、甘油二酯和β-酰基含氧酸也可以用作两亲脂。
在某些实施方案中，本发明的纳米颗粒包含未与阳离子聚合物缀合的其他脂质(“非缀合的脂质”或“法缀合的磷脂”)。这些非缀合的其他脂质具有稳定和完善脂质单层外膜的作用，并看作为稳定基团(如PEG)或靶向基团的连接位点。非缀合的脂可以是上面记载的两亲脂，如磷脂，也可以包含如甘油三酯和甾醇等其他脂(如胆固醇)。纳米颗粒中缀合的和非缀合的脂质中至少一种是形成脂质双层的脂质，如磷脂。在优选的实施方案中，纳米颗粒的脂质单层包含缀合脂质作为第一部分，非缀合脂质作为第二部分和胆固醇作为第三部分。每部分的相对含量可以不同，但优选每种缀合脂质和非缀合脂质占单层脂质的摩尔分数约为10到70％，胆固醇占单层脂质的摩尔分数约为1到30％或5％-20％。例如，在一个实施方案中，脂质单层包含缀合的脂、非缀合的脂和胆固醇，比例为4∶3∶3。
MNP的脂质单层还可以包含多种其他分子组分，用于例如稳定或标记颗粒或使其具有靶向功能。这些组分包括肽、蛋白质、去垢剂、脂质衍生物，特别是PEG-脂质衍生物，如连接了二烷基氧丙基、甘油二酯、磷脂酰乙醇胺和神经酰胺结合的PEG(见，如美国专利No.5,885,613，通过引用将其纳入本文)。在某些实施方案中，纳米颗粒基本上不含去垢剂。脂质单层加有PEG-脂时，PEG-脂的量优选占脂质单层重量的约0.5到20％，更优约1到10％，再优选约2到5％。在一个优选的实施例中，纳米颗粒的脂质单层包含缀合的脂、非缀合的脂、胆固醇和PEG-PE，摩尔比为4∶3∶3∶0.3。
可用于将肽或蛋白质连接到纳米颗粒上的一种脂质衍生物为对硝基苯羰基PEG-PE(pNP-PEG-PE)。游离氨基，如抗体或其它蛋白质分子上的游离氨基，可以与pNP基团反应，从而将靶向基团共价结合到纳米颗粒上。见，例如Liposomes：A Practical Approach，V.P.Torchelin and V.Weissig，Oxford University Press，2003，通过引用将其纳入本文。
纳米颗粒中央的核心复合物除阳离子聚合物，还包括一个或多个核酸分子。这些核酸分子用于转移入活细胞或组织内并在其中发挥其生物学作用。术语“核酸”指脱氧核苷酸或核苷酸以及它们单链或双链形式的聚合物(DNA或RNA)。该术语的核酸包括含有已知核苷酸类似物、修饰骨架残基或修饰连接的核酸，可以是合成的或天然存在的。类似物的例子包括但不限于：硫代磷酸酯、磷酰胺、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯，2-O-甲基核苷酸和肽-核酸(PNAs)。DNA可以是反义DNA、质粒DNA、部分质粒DNA、预凝缩DNA、聚合酶链式反应(PCR)产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA、或这些物质的衍生物。术语核酸可以与术语基因、cDNA、基因编码的mRNA和干扰RNA分子交换使用。术语“基因”指包括生产多肽或多肽前体所需的部分或全长编码序列的核酸(如DNA或RNA)序列。
术语“RNAi”指能够减少或抑制靶基因表达的双链RNA，当干扰RNA与靶基因处于同一细胞中时，干扰RNA会引起与干扰RNA序列互补的mRNA的降解。因此RNAi指由两条互补链或一条自我互补的单链形成的双链RNA。RNAi与靶基因通常基本上或完全一致。干扰RNA的序列可以对应靶基因的全长序列或其子序列。RNAi包括小干扰RNA或“siRNA”。siRNA长度约15-60、15-50、15-50、或15-40个碱基对，更常见的约15-30、15-25或19-25个碱基对，优选长约20-24或约21-22或21-23个碱基对。siRNA双链体可能具有约1到4个核苷酸的3’端突出，优选约2到3个核苷酸，还可能具有5’磷酸末端。siRNA可以是化学合成的或质粒编码的。siRNA也可以由较长的dsDNA剪切而来。优选的，dsDNA长度至少约100、200、300、400或500个核苷酸。dsDNA可能长达1000、1500、2000、5000个核苷酸或更长。dsDNA可以编码整个基因转录产物或部分基因转录产物。
应调整组装本发明纳米颗粒的阳离子聚合物与核酸的比率以确保所有的核酸都形成复合物。下面的实施例中描述了使用凝胶电泳的方法实现这一目标。一般来说，胺和磷的比率(N/P)以约1到20为宜。优选约10的比率。单个MNP的核酸装载量范围较宽。组装完成后MNP的核酸含量以重量计可以高达40％，这大大高于此前的含核酸纳米颗粒所能携带的量。对于某些技术，可能仅需要非常少量的核酸，甚至不需要核酸(如，对照颗粒)，在这样的情况下，一部分阳离子聚合物可以与阴离子聚合物(如，羟甲基纤维素)复合形成稳定的核心。阳离子聚合物中带电基团和核酸的比例根据两者共处所在溶液的pH值而不同。可以设计聚合物以使预定比例的可离子化基团带电以与核酸结合。例如，在某些实施方案中，至少约10％的基团带电，而在优选的实施方案中，在形成过程中以及在完成后的核心复合物中，聚合物约50到100％的基团带电。
通常，本发明的MNPs用于下调或消除目的基因产物的表达。或者，可以将治疗基因输送到特定细胞内替换有缺陷的基因，增加基因产物的表达，或调节其他基因的表达。许多适合本发明MNPs的靶基因产物是本领域技术人员公知的。这些产物包括但不限于：与病毒感染和恢复相关的基因、与代谢疾病和紊乱相关的基因、与肿瘤的发生和细胞转化相关的基因、血管新生基因、免疫调节基因如那些与炎症和自身免疫反应相关的基因、配体受体基因、以及与神经退行性疾病相关的基因。可由使用者来选择适合的目标，使用者可以按照常规选择适合的RNAi或治疗基因。
本发明还提供了一种包括上述纳米颗粒的非病毒载体。该载体具有含核酸-阳离子聚合复合物的核心复合物以及含有第一磷脂且该第一磷脂在末端(疏水性)与阳离子聚合物缀合的脂质单层外膜，并且，该载体适合将核酸从核心复合物中转送到细胞内。这可以通过多种机制实现，例如，在脂质单层中加入促进膜融合的脂或蛋白，或加入能够结合靶细胞表面受体的一种或多种靶向物质，如配体或抗体。并且，本发明载体可以包括设计用于促进或调节该载体内其他核酸序列的表达或进入基因组的核酸序列。
为将本发明纳米颗粒和非病毒载体送至靶细胞并将其所含核酸转移给靶细胞，可以在其形成过程中，向纳米颗粒表面加入靶向物质或靶向基团。这很容易做到，可以利用靶向基团的脂衍生物将靶向物质包含在非缀合脂质中来完成。例如，许多靶向物质是肽或蛋白，它们可以通过化学侧链与脂质缀合(如，靶向物质上的氨基与pNP-PEG-PE反应)。适合的靶向物质是本领域公知的，包括但不限于自然存在或工程设计的抗体或其抗原结合片段、域抗体或单链抗体、细胞表面受体的配体、生物素等。
本发明的另一项内容是一种制备胶束样纳米颗粒的方法，所述胶束样纳米颗粒包含被脂质单层包被的核心复合物。一个或多个核酸分子在适合形成纳米颗粒核心复合物的条件下与前文所述的阳离子聚合物-脂缀合物相接触。带负电荷的核酸与缀合物的阳离子聚合物部分静电结合，形成稳定的核心复合物。然后向所得核心复合物供给一种或多种非缀合脂质以形成包裹该核心复合物的脂质单层。
本发明还包括一种用胶束装纳米颗粒转染细胞的方法。在适合载体内核酸分子向细胞内转移的条件下，使细胞与前文所述的非病毒载体相接触。
本发明的纳米颗粒和非病毒载体可以单独使用，也可以与药用载体配制成药物组合物来使用，所述药物载体可按照给药途径和医药界标准实践来选择，例如生理盐水或磷酸缓冲液。药用载体通常在颗粒形成后加入。药物制剂中颗粒的浓度范围很宽，按重量计，可以小于约0.05％或约2.5％，也可以高达10％至30％。
本发明的药物组合物可采用传统的、公知的消毒技术消毒。可将水溶液包装以供使用，或将水溶液在无菌条件下过滤后冻干，临用前将冻干制剂与无菌水混合。组合物可以包含接近生理条件所需的药学上可接受的辅料，例如pH调节剂和缓冲剂、张度tonicity调节剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾和氯化钙。此外，颗粒悬液可以包含在储存期间保护脂质免受自由基损害和脂质过氧化损害的脂质保护剂。例如，可以使用亲脂性自由基淬灭剂，如α-生育酚。
本发明的纳米颗粒和非病毒载体可以用于将核酸导入细胞，例如用于治疗或预防与靶基因表达相关的疾病或紊乱。因此，本发明还提供将核酸(如RNAi或治疗基因)导入细胞的方法。在治疗有疾病或医学症状的对象或预防对象的疾病或医学症状的方法中，本发明的非病毒载体在体内或体外与一个或多个细胞相接触。这些细胞可以是对象的细胞，也可以是捐赠者的细胞。将细胞与载体接触的结果是，载体携带的一个或多个核酸被转移到对象的细胞中，从而治疗或预防疾病或医学症状。在某些实施方案中，细胞与载体在体外接触，随后将细胞作为治疗剂或预防剂的一部分给予对象。如前文所述形成适合的胶束样颗粒。然后将颗粒与适当的靶细胞接触一段时间，接触时间需足以发生核酸转移。本发明的纳米颗粒可吸附到与之混合或接触的几乎所有类型的细胞上。一旦吸附，颗粒可以通过细胞内吞作用进入细胞，与细胞表面膜上的脂质交换，或者与靶细胞融合，从而使得颗粒内的核酸转移或进入到细胞内。核酸细胞内输送最常见的靶细胞类型中之一是赘生neoplastic细胞(肿瘤细胞)。其他还有造血前体细胞或干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、肝细胞、内皮细胞、骨骼和平滑肌细胞、成骨细胞、神经元、静态淋巴细胞、末端分化细胞、淋巴细胞，上皮细胞、骨细胞等等。
对于体外应用，本发明纳米颗粒的核酸输送可以输送到任何源于植物或动物的、脊椎动物或无脊椎动物的、来自任何组织的在培养基中生长的细胞中。细胞和纳米颗粒的体外接触在生物相容的介质中进行。纳米颗粒的浓度可以依据特定的应用而变化。使用纳米颗粒的体外细胞治疗通常在生理温度下进行(约37℃)，时间约1到48小时，优选约2到4小时。
本发明提供了抑制细胞内基因表达的方法。该方法包括使细胞与胶束样纳米颗粒接触，所述纳米颗粒的核心复合物含有siRNA或RNAi或者在靶细胞内产生RNAi或siRNA的核酸。通过已知的方法针对靶基因专门设计siRNA或RNAi，将其转入细胞能抑制靶基因的表达。
在某些实施方案中，纳米颗粒可以用于在体内向动物，如犬类动物、猫类动物、马类动物、牛类动物、绵羊类动物、山羊类动物、鼠类或灵长类动物，包括人类输送核酸，如siRNA或治疗基因。体内输送可以是局部的，即直接输送到靶位置，或全身的。已经用核酸-脂质颗粒系统实现了以体内基因治疗为目的全身性输送，即通过如血液循环等身体系统将治疗核酸输送到较远的靶细胞，这可以参照以下文献完成：PCT申请WO96/40964，美国专利Nos.5,705,385、5,976,567、5,981,501和6,410,328，通过引用将这些文献纳入本文。
本发明还提供了试剂盒形式的胶束样颗粒。试剂盒通常包括容器以及一种或多种本发明的组合物，附带它们的使用和给药说明。在某些实施方案中，纳米颗粒具有已经附着在其表面的靶向基团，而在其他实施方案中，试剂盒包括能够与使用者选择的靶向基团反应的纳米颗粒。使靶向基团(如抗体、蛋白质)附着到外膜单层的脂质上的方法是本领域技术人员所公知的，试剂盒可以提供这些方法的说明。
本发明的还包括一种化学缀合物，其包含共价结合于脂质酰基链或烷基链末端的阳离子聚合物。这样的缀合物被用于制备MNP以及其他用途，例如制备用在药品、化妆品、食品、诊断工具、医疗设备及其外包物、以及生物传感器等商品上的含胶束样、单层或双层结构。化学缀合物包括一个或多个前文所述的阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺，所述阳离子聚合物化学缀合到两亲脂质分子的疏水性末端部分。所述的化学缀合是共价键，在某些实施例中，这样的键在一定条件下，如酸性pH或酶作用下，可以被切断。例如，缀合物可以通过1-棕榈酰-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱与聚乙烯亚胺反应制得。化学缀合物可以与一个或多个核酸分子结合以形成核酸-聚阳离子-脂质复合物。
以下实施例是为了展示本发明的优点并帮助普通技术人员制造和使用本发明。这些实施例未计划以任何其他方式限制公开的范围。
材料和方法
材料
除另有说明外，所有材料均购自Sigma-Aldrich。编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA(pDNA)终浓度1μg/μl，从Elim Biopharmaceuticals(Hayward，CA)购买。罗丹明标记的pGFP(pGeneGrip罗丹明/GFP)从Genlantis(San Diego，CA)购买。如有必要，根据已知方法[17]，用111In(PerkinElmer Life and Analytical Sciences，MA)放射性标记DNA至0.1μCi/μgDNA。使用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检验浓度和纯度。1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-PE)、胆固醇和氧化的磷脂、1-棕榈酰-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(AzPC Ester)从Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)购买。分子量1.8kDa的分支PEI(bPEI)从Polysciences，Inc.(Warrington，PA)购买并溶于水中至终浓度1.0μg/μl。
磷脂-聚乙烯亚胺缀合物(PLPEI)的合成
将12毫克分支PEI(7μmol)溶解于0.5ml氯仿，并与溶解在1ml氯仿中的5毫克氧化PC(AzPC Ester 7μmol)混合。推定bPEI的伯∶仲∶叔胺的比率为1∶2∶1，反应混合物的酸与伯氨之摩尔比为1∶10，即包含过量反应胺。向上述溶液中加入半毫克N，N-羰基二咪唑(CDI，3μmol)以通过形成咪唑衍生物来活化酸。反应混合物同10μLTEA(三乙胺)一起在室温下搅拌温育24小时。随后用氮气流清除氯仿，剩余物质悬浮在2ml蒸馏水中。用蒸馏水透析纯化(MWCO2,000)纯化产物，冻干后通过1H-NMR(CDCl3，300MHz)确认结构。从NMR谱(δ0.9：2.7H，δ1.3：17.6H，δ1.6：5.4H，δ2.4-2.8：96.0H，δ3.3：12.8H，δ3.6：1.58H，δ4.0-4.6：5.43H)上PEI主链的亚乙基(-CH2CH2-)信号(2.4-2.8ppm)与磷脂头部的甲基(-CH3)信号(3.4ppm)之比确定，缀合程度为：PEI对脂质摩尔比，1∶1()。PLPEI缀合物以1.5μg/μl的浓度溶于水中(PEI为1.0μg/μl)。
质粒DNA与PLPEI的结合
固定量的质粒DNA(100μg)与不同量的PLPEI分别溶解在HBG中(10mMHEPES，5％d-葡萄糖，pH 7.4)至终体积250μL。PLPEI溶液随后在漩涡搅拌中被快速加入到DNA溶液中。得到的聚合物/DNA复合物在E-凝胶电泳系统(Invitrogen Life Technologies)中使用琼脂糖凝胶电泳分析。预制的0.8％的E-凝胶板在60V，500mA下预电泳2分钟，随后加入1μg的pDNA。推定PEI每个含有一个氨基的重复单元为43.1g/mol，DNA每个含有一个磷酸的重复单元为330g/mol，计算所需氨基/磷酸比(N/P)。
包被DNA的胶束样纳米颗粒(MNP)的制备
使用PLPEI∶POPC∶胆固醇∶PEG-PE(4∶3∶3∶0.3，mol/mol)和pDNA构建MNP。首先，N/P比为10的PLPEI(PEI 130μg)和质粒DNA(100μg)分别溶解在HBG中至终体积250μL。PLPEI溶液随后在漩涡搅拌中被快速加入到DNA溶液中。另外由POPC，胆固醇和PEG-PE(42μg，21μg，15μg 3∶3∶0.3mol/mol)的混合物制备干燥的脂质膜，然后用500μLHBG水合。所得脂质悬液与制备好的PLPEI/DNA复合物在室温下温育24小时。也可将PLPEI/DNA复合物直接加入脂膜中。得到的MNP悬液4℃保存备用。
大小和zeta电位
将MNP溶解在HBG中至最佳的散射强度。流体力学直径和zeta电位使用Zeta Plus Particle Analyzer(Brookhaven Instruments Corp，Santa Barbara，CA)通过准电光散射法测定。散射光在23℃下以90度角测定。数据分析采用0.933mPa的粘度值和1.333的折射率。该仪器用乳胶微球悬浮液(0.09μm，0.26μm；Duke Scientific Corp，Palo Alto，CA，USA)进行常规校准。
冷冻断裂电子显微镜
MNP使用三明治技术和液氮冷却的丙烷冷激断裂。冷却速度为10,000K/sec，以避免冰晶形成和其他冷冻固定过程中的人工假象artifacts)。断裂过程在JEOL JED-9000冷冻蚀刻机上进行，暴露的断裂面以25-35度角喷镀铂30秒，喷镀碳35秒[2kV，60-70mA，1x10-5torr(1torr＝133Pa)]。复膜(replicas)用发烟硝酸清洗24-36小时，然后与新鲜的氯仿/甲醇[1∶1(vol/vol)]重复搅拌至少5次，使用JEOL 100CX电子显微镜观察。
抗盐诱导的聚集的稳定性
通过测定MNP的大小(流体动力学直径)来研究MNP颗粒对抗盐诱导的聚集的胶体稳定性。按前文所述方法测定大小，向MNP的HBG溶液中加入NaCl(5M)至终浓度0.15M。
核酸酶耐受性
通过在37℃下使用50单位的DnaseI(Promega Corp.，Madison，WI)处理样品30分钟测定MNP颗粒中DNA分子的核酸酶耐受性。使用终浓度5mM的EGTA和EDTA来终止反应。使用肝素(50单位/μgDNA)37℃下解离DNA，30分钟，产物在0.8％的预制琼脂糖凝胶上进行分析。
毒性检测
成纤维细胞NIH/3T3在96孔板中用添加了10％胎牛血清的DMEM培养。通过换之以不含血清的、包含直至最高100μg.ml PEI的梯度稀释培养基替(100μl)来处理细胞。温育4小时后，使用PBS清洗细胞两次并将细胞再置于完全培养基中(100μl)。温育24小时后，向每个孔中加入20μl CellTiter 96 Aqueous One solution溶液(Promega，Madison，WI)，并将平板再温育2小时。使用96孔板读取器(Multiscan MCC/340，Fisher Scientific Co)读取490nm处每个孔的光吸收。将只用培养基处理的细胞作为对照计算相对细胞存活率。
药代动力学特征和生物学分布
根据东北大学(Northeastern University)的教研用动物护理和使用管理委员会(the Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案，雄性balb/c小鼠(20-30g)使用氯胺酮/二甲苯胺噻嗪(1mg/0.2mg/每只动物)保持麻醉状态，用PE-10通过右侧颈动脉逆行插管。通过尾静脉注入携带111In-DNA(～2μCi111In，20μgDNA)的MNP。通过颈总动脉插管，在静脉推注后1、2、5、10、30、60分钟采集血液样品(30μl)。根据取样量给动物回补同体积的含肝素的PBS(10U/ml)。在第60分钟的最后一次采血后，采用颈椎脱位法处死动物并进行器官(肺、肝、脾、肾、肌肉、皮肤)取样。使用γ-计数器测量血液和器官样品的放射性。用相对于注射剂量的百分数来表示放射性(器官％ID/g，血液％ID/ml)。根据对应器官的血流量修正器官分布值。将血液“浓度对时间”数据拟合入双指数等式(c(t)＝A*e-αt+B*e-βt)测定药代动力学参数。
体内基因表达
根据东北大学教研用动物护理和使用管理委员会批准的方案，实验前14天，雄性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories)在左肋下皮下接种1×106LLC肿瘤细胞。通过尾静脉注射200μl含40μg的pGFP的MNP。将有同样大小肿瘤的未接受注射的小鼠作为阴性对照。被麻醉的小鼠在48小时后颈椎脱位处死，切下的肿瘤马上冷冻在Tissue-Tek OCT 4583 compound(Sakura Finetek，CA)中，不固定，用恒冷切片机制成8μm厚的切片。使用荧光显微镜(Olympus BX51)观察GFP荧光。
实施例1
胶束样纳米颗粒(MNP)的制备
制备胶束样纳米颗粒(MNP)：将质粒DNA和PLPEI形成复合物，而后用包含PEG-磷脂酰胆碱缀合物(PEG-PE)的脂质单层包裹以上已制备好的复合物(图1)。对于形成复合物的过程，由于复合物的形成将阻止DNA的迁移，将其保留在孔中，PLPEI与DNA的最佳比率根据完全抑制DNA在琼脂糖凝胶上迁移所需的胺量来确定。一定量的质粒DNA与不同胺/磷比(N/P)的PLPEI混合，并以琼脂糖凝胶电泳进行检测。被结合DNA的比率随着N/P比的升高而上升，N/P比高于6时，绝大多数DNA被结合。对比PLPEI的复合情况和非修饰PEI的可见，与脂缀合没有降低PEI结合DNA的能力(图2a)。选择所有DNA都与复合物结合的N/P比10用于下面的步骤。
包被PLPEI/DNA复合物时，包括POPC、胆固醇、PEG-PE(3∶3∶0.3mol/mol)的游离脂质混合物单独制备成水悬液。该脂质悬液随后与制备好的PLPEI/DNA复合物一起温浴，在PLPEI脂质基团和游离脂质间的疏水相互作用的驱动下自发形成外膜，通常是单分子层。游离脂质的最佳量根据能为制备好的PLPEI/DNA复合物提供完整脂质单层外膜所需脂分子数量来估算。推定直径约50nm的双层脂质体包含约25,000个脂分子[18，19]，PLPEI/DNA核心的质量/体积比为1g/ml，计算出约需要总量0.2μmol的脂质来覆盖直径50nm、总质量230μg的核心颗粒的整个表面，即需要总量1μmol的脂质来覆盖总质量1毫克的核心颗粒的整个表面。因此，除非另外说明，100μgDNA与对应于131μg(0.08μmol)PEI和49μg(0.08μmol)PL的180μgPLPEI形成复合物，随后与42μg(0.055μmol)POPC，21μg(0.055μmol)胆固醇和15μg(0.005μmol)PEG-PE一起温浴。
在荧光显微镜下，荧光标记的DNA(Rh-DNA)和荧光标记的游离脂质(CF-PEG-PE)同址定位证实游离脂质与PLPEI/DNA复合物相互作用并进入其中(未显示)。冷冻断裂透射电子显微镜(ffTEM)清楚地确认了特征性的硬核带单分子层外膜结构()。ffTEM显示平均直径50nm的良好的球形颗粒(图2b)。所有颗粒显示出含“硬核”颗粒胶束典型的结构后方阴影。这种表现与双分子层结构如脂质体的断裂表现不同，双分子层结构显示出凹凸断裂面(阴影分别在结构前方和后方)。
实施例2
MNP的理化特征
传统的PEI/DNA复合物在高盐生理条件下倾向于快速聚集[8]。为展示脂质外膜对抗盐导致的聚集的稳定效果，向复合物制剂中加入NaCl至终浓度0.15M，监测流体力学直径。一如所料，加入NaCl后PEI/DNA复合物迅速聚集，24小时内流体力学直径持续增加至近20倍。不含游离脂质和PEG-PE的PLPEI/DNA复合物中间体在加入NaCl后，直径迅速增加2倍，而后在24小时内保持相对恒定。与之相比，加入盐后，MNP保持稳定，24小时内没有明显的聚集(图3a)。
Zeta电位测量显示，MNP有一个-2.1±0.86mV(平均±s.e.m.，n＝5)的有利的中性表面电荷()，而PEI/DNA复合物有一个20.2±1.38mV(平均±s.e.m.，n＝5)的更有毒性的正表面电荷()。MNP的中性表面电荷也表明了脂质层的存在，该脂质层为无该脂质层时呈正电的PEI/DNA核心提供了电荷屏蔽保护。
所带DNA被完全保护而未受酶降解的作用进一步表明了脂质层的存在。游离DNA完全被酶处理降解，而PEI/DNA或MNP中的DNA保持完整。可能是由于酶的干扰，酶处理后，完整DNA的迁移被轻度阻滞。完整DNA的定量分析(Image，NIH)显示，从MNP回收了93％的所带DNA，相比之下，从PEI/DNA中仅可以回收70％，证明DNA被完全包封在脂质膜内(图3b)。
我们还评估了MNP对NIH/3T3细胞的毒性。PEI浓度100μg/ml时，处理4小时后温育24小时，MNP表现为无毒，与之对比鲜明的是，在PEI浓度15μg/ml时，PEI/DNA复合物就表现为高毒性(图4)。由于数据显示了相比PEI/DNA复合物表面的强正电荷，MNP带中性表面电荷，这个结果看起来相当容易理解。
实施例3
体内生物分布和基因表达
为显示MNP在血液中延长的循环时间以及由此带来的将其输送到靶器官如肿瘤的更高的可行性，在小鼠中用携带111In-DNA的MNP进行了药代动力学和生物分布的研究。静脉推注携带111In-DNA的MNP后，测量了主要器官的放射性并与对照PEI/111In-DNA进行对比。10分钟后，多达30％ID/ml的MNP仍在血液中，相比之下，PEI/DNA约10％ID/ml。注射后1小时，约20％ID/ml的MNP仍在血液中，而在循环中仅能检测到约5％ID/ml的PEI/DNA(图5A)。
相对于PEI/DNA，MNP包裹DNA较慢的清除以及由此带来的循环时间延长还得到了药代动力学参数的确认。通过将收集至60分钟的血液浓度数据导入二室模型计算半衰期(t1/2β)，发现半衰期约为239分钟，PEI/DNA复合物则为33分钟。从“浓度对时间”曲线得到的曲线下面积(AUC)也说明了相比PEI/DNA复合物，MNP包裹质粒DNA的全身性利用率增加(1404％ID·min/ml对530％ID·min/ml)。循环时间延长的原因是RES吸收导致的清除减少。对照复合物中DNA主要积累在RES器官中(肝40％ID/g和脾30％ID/g)，MNP中的DNA绕过了RES器官，在其中的积累明显减少(肝和脾少于5％ID/g)(图5b)。两者合计，长循环时间和RES位置的低积累使MNP适合体内应用。
用LLC肿瘤小鼠表明了增强的基因输送以及转染体内目标(如肿瘤)的能力，这是长循环药物纳米载体由通透性和保留增强(EPR)介导的被动积累的适宜特征。静脉注射携带编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA的MNP后，观察肿瘤组织中的基因表达。注射后48小时，使用MNP处理过的动物的肿瘤中观察到明亮的荧光，而对照小鼠的肿瘤中没有观察到荧光(图6)。由于动物存活时间短，没有观察注射PEI/DNA复合物的动物的肿瘤组织中的基因表达。静脉注射可比剂量的PEI/DNA复合物后，动物在30分钟内由于呼吸衰竭死亡，进一步确认了MNP明显降低的毒性。
综合来看，血液循环时间延长和RES位置的低积累使得MNP在肿瘤部位显著积累，引起报告基因的强表达。MNP的这些特性使其适用于体内基因治疗。
实施例4
携带siRNA的MNP的制备
制备携带siRNA的MNP像制备含DNA的MNP一样，与DNA相同，siRNA首先以相同的N/P比10与PLPEI结合。选定量的siRNA与N/P比达10所需量的PLPEI混合。注意，可以用等量的反义寡核苷酸替代siRNA以制备携带反义核酸的MNP。由此形成的siRNA/PLPEI复合物被用于以下步骤。
包括POPC、胆固醇、PEG2000-DSPE(3∶3∶0.3mol/mol)的游离脂质混合物被单独制备成水悬液。游离脂悬液随后与制备好的PLPEI/DNA复合物一起温浴。推定siRNA/PEI复合物核心的质量/体积比为1g/ml，约需要总量0.2μmol的脂质以覆盖直径50nm、总质量230μg的核心颗粒的整个表面，即需要总量1μmol的脂质以覆盖总质量1毫克的核心颗粒的整个表面。
选择PEG-PE的量，即，10mol％游离脂质和4.3mol％磷脂，以促进游离脂质进入制备好的复合物并为最终结构提供立构稳化作用。与制备好的PLPEI/DNA复合物共同温浴时，包括游离脂和缀合脂的总脂中PEG-PE含量降至4.3mol％，此时以层状相为主。最终的结构是空间稳定的胶束样硬核颗粒，具有一个siRNA/PEI复合物核心和脂质单层外膜。
使用荧光显微镜，根据荧光标记游离脂(CF-PEG2000-DSPE)和荧光标记的siRNA(Cy5-siRNA)的同址定位确认游离脂与siRNA/PLPEI复合物相互作用并进入其中。通过冷冻断裂透射电子显微镜(ffTEM)确认了特征性的带脂质单层包被的硬核结构。
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尽管已经结合优选实施方案描述了本发明，本领域普通技术人员在阅读前面的说明后，能够对本文提出的组分和方法做出不同的改变、等同形式的替代以及其他变化。因此，此后专利证书许可的保护仅由附带的权利要求书和其等同形式来限定。

Claims (43)

1.一种纳米颗粒，包含为脂质单层所包裹的核心复合物，所述核心复合物包含与一个或多个阳离子聚合物分子静电结合的一个或多个核酸分子，所述阳离子聚合物与脂质单层内的第一脂质共价缀合。
2.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的阳离子聚合物包含直链或分支聚乙烯亚胺、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚丙烯胺、氨基葡聚糖、或它们的任意组合。
3.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的第一脂质选自由天然的或合成的磷脂、糖脂、氨基脂、鞘脂、长链脂肪酸和甾醇组成的组。
4.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的脂质单层还包含一种或多种非缀合的脂。
5.如权利要求4所述的纳米颗粒，所述一种或多种非缀合磷脂分子选自由天然的或合成的磷脂、糖脂、氨基脂、鞘脂、长链脂肪酸和甾醇组成的组。
6.如权利要求4所述的纳米颗粒，其中，一部分非缀合磷脂分子是PEG化的。
7.如权利要求6所述的纳米颗粒，其中的脂质单层包含PEG-磷脂酰乙醇胺或pNP-PEG-PE。
8.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的脂质单层还包含胆固醇。
9.如权利要求8所述的纳米颗粒，其中脂质单层包含摩尔比率为4∶3∶3的缀合的第一脂质、非缀合的脂和胆固醇。
10.如权利要求8所述的纳米颗粒，还包含PEG-磷脂酰乙醇胺，其中脂质单层包含摩尔比为4∶3∶3∶0.3的缀合的第一脂质、非缀合的脂、胆固醇和磷脂酰乙醇胺。
11.如权利要求1所述的纳米颗粒，所述一个或多个核酸分子包括寡核苷酸、DNA分子、RNA分子或它们的任意组合。
12.如权利要求11所述的纳米颗粒，所述一个或多个核酸分子包括质粒DNA、RNAi、siRNA、反义寡核苷酸或核酶。
13.如权利要求11所述的纳米颗粒，其中的一个或多个核酸分子包括治疗性基因。
14.如权利要求13所述的纳米颗粒，其中的治疗性基因是细胞毒性基因或自杀基因。
15.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的一个或多个核酸分子占所述颗粒重量的最多40％。
16.如权利要求15所述的纳米颗粒，其中的一个或多个核酸分子约占所述颗粒重量的25％。
17.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的阳离子聚合物共价连接到所述第一脂质的烷基链或酰基链的末端
18.如权利要求1所述的纳米颗粒，所述颗粒直径约50nm。
19.包含权利要求1所述颗粒的非病毒载体。
20.如权利要求19所述的载体，还包含靶向剂。
21.如权利要求20所述的载体，其中的靶向剂选自抗体或其抗原结合片段、单链抗体、域抗体、细胞表面受体的配体、和生物素组成的组。
22.如权利要求21所述的载体，其中的靶向剂通过可断裂的键与所述载体相连。
23.如权利要求22所述的载体，其中可断裂的键在低pH下断裂。
24.如权利要求23所述的载体，其中可断裂的键是腙键。
25.如权利要求22所述的载体，其中可断裂的键是连接阳离子聚合物和第一脂质分子的键。
26.制备权利要求1所述纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包含为脂质单层所包裹的核心复合物，该方法包括：
(a)提供核酸、阳离子聚合物-脂质共价缀合物和一种或多种非缀合脂质；
(b)在适合形成核心复合物的条件下使核酸分子与阳离子聚合物-脂缀合物相接触，所述核心复合物包含与缀合物的阳离子聚合物部分静电结合的核酸；和
(c)使核心复合物与非缀合脂质接触以形成脂质单分子层。
27.如权利要求26所述的方法，在步骤(b)中，核酸和阳离子聚合物-脂缀合物在溶液中相接触以形成核心复合物。
28.如权利要求26所述的方法，其中，提供的非缀合脂质呈干燥膜的形式，在步骤(c)前该干燥膜水合。
29.如权利要求27所述的方法，其中，提供的非缀合脂质呈干燥膜的形式，在步骤(c)中用步骤(b)得到的水悬液使该干燥膜水合。
30.如权利要求26所述的方法，还包括在步骤(c)前向非缀合脂质中加入一种选自由中性脂质、糖脂、PEG化脂质、生物素化脂质、酰化蛋白质或糖蛋白、与脂质缀合的蛋白或糖蛋白、抗体或其抗原结合片段、单链抗体、域抗体、以及细胞表面受体的配体组成的组的成分。
31.如权利要求30所述的方法，其中，加入了中性脂质，该中性脂质为胆固醇。
32.如权利要求30所述的方法，其中，加入了PEG化的脂质，PEG化的脂质是PEG-磷酸乙醇胺或pNP-PEG-PE。
33.如权利要求32所述的方法，其中加入了中性脂质，所述中性脂质为胆固醇，聚合物-脂质缀合物、非缀合脂质、胆固醇和PEG-磷酸乙醇胺的摩尔比为4∶3∶3∶0.3。
34.转染细胞的方法，该方法包括将细胞与权利要求19所述的非病毒载体相接触，载体的核酸分子被转入细胞。
35.抑制细胞中基因表达的方法，该方法包括使细胞与权利要求1所述的纳米颗粒相接触，所述纳米颗粒中包含siRNA或RNAi，所述siRNA或RNAi被转入细胞并抑制基因表达。
36.治疗有疾病或症状的对象的方法，该方法包括给予对象权利要求19所述的非病毒载体，其中的核酸被转入对象的细胞，以此治疗疾病或症状。
37.如权利要求36所述的方法，其中的疾病是癌症。
38.如权利要求37所述的方法，其中的载体被靶向肿瘤。
39.一种化学缀合物，包含与脂质的酰基链或烷基链末端共价结合的阳离子聚合物。
40.如权利要求39所述的化学缀合物，包含聚乙烯亚胺。
41.如权利要求40所述的化学缀合物，其由1-棕榈酰-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱与分支聚乙烯亚胺反应形成。
42.权利要求39所述化学缀合物与核酸的复合物。
43.一种胶束、脂质单层或脂质双层结构，包含权利要求39所述的缀合物。
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