CN109069656A - 用于基因递送的口服纳米颗粒和包含其的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的用于基因递送的纳米颗粒是口服施用的纳米颗粒，用于基因递送，使用能够感知摄入的膳食并控制生物系统中的血糖水平和胰岛素分泌的新型口服基因递送系统。更具体地，本发明涉及：用于基因递送的纳米颗粒，包含与胆汁酸或胆汁酸衍生物共价键合的离子聚合物；和基因，以及包含其的药物组合物。

Description

用于基因递送的口服纳米颗粒和包含其的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于有效口服基因递送的靶向纳米颗粒，更具体地，涉及用于基因递送的纳米颗粒，其包含：与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和基因，以及涉及包含其的药物组合物。此外，本发明涉及用于基因递送的纳米颗粒，其用于将基因或治疗性蛋白质递送至靶向小肠细胞，以最小化副作用并提供当前治疗技术的效率，并且涉及包含其的药物组合物。
背景技术
基因疗法通过向靶器官递送治疗基因以在细胞中表达新蛋白质来治疗疾病。基因疗法不是治疗疾病的症状，而是通过消除疾病的原因来治疗疾病的方法。基因疗法比一般药物疗法具有更好的选择性治疗效果，并且可以通过提高其他疗法难以控制的疾病的治愈率来长期应用。
基因疗法是公开用于治疗各种疾病的下一代治疗技术，但是，当DNA、RNA等大分子以水溶液状态输送到细胞中时，它在体内被特定的酶迅速降解，并且其细胞内递送速率低。因此，为了使基因疗法有效，开发能够将治疗基因安全地传递给靶细胞以获得高表达效率的基因载体是必要的。
基因载体应该具有低毒性或无毒性，并且应该能够选择性地和有效地将基因递送至靶细胞。这些基因载体可大致分为病毒和非病毒基因载体。
病毒载体使用逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)等作为基因载体，并且具有比非病毒载体更高的基因递送效率。然而，当将这些病毒载体引入体内时，载体本身会引起诸如免疫应答或癌症诱导等问题。另外，对可插入载体的基因的大小有限制。
非病毒载体如聚合物或纳米颗粒具有优于病毒载体的优点，因为它们具有低生物风险，无免疫原性，可被修饰，并且可以大量生产，并且可以通过它们递送的基因的大小不太受限制。由于这些优点，最近进行了许多研究。特别是，由于生产方法简单或风险相对较低，因此对使用非病毒载体如阳离子聚合物的方法进行了大量研究。在一个特定的机制中，非病毒载体通过与基因的静电相互作用形成络合物来稳定带负电的基因，并且络合物通过复杂表面上的正电荷和细胞表面上的负电荷之间的电相互作用与细胞表面结合，之后基因从核内体释放到细胞质中。
这些阳离子聚合物的具体实例包括阳离子均聚物如鱼精蛋白、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺胺，聚-L-赖氨酸(PLL)、聚氨基酯、聚丙烯亚胺等，和阳离子嵌段共聚物如聚乙二醇(PEG)-嵌段-聚L-赖氨酸和PEG-PEI。这些阳离子聚合物通过将基因压缩成纳米颗粒来保护DNA等基因免受酶促降解，并帮助使基因迅速渗入细胞并使基因从内体中逃逸出来。
与病毒载体相比，大多数非病毒载体具有诸如生物降解性、低毒性、非免疫原性、易用性等优点。但是存在如与病毒载体相比，转染效率相对较低、粒径有限等问题。
目前作为非病毒载体进行最广泛研究的聚乙烯亚胺(PEI)也存在问题，例如由于血液相容性低的显著低的体内转染效率、高细胞毒性和低基因表达效率等。
同时，韩国专利申请公开号10-2010-0122405公开了纳米粒子型两亲性聚合物纳米粒子，其是通过将siRNA与两亲性聚合物纳米粒子结合而得到的siRNA载体，包含与疏水聚合物结合的亲水聚合物的络合物，其通过将壳聚糖和聚乙烯酰亚胺各自作为亲水聚合物与胆汁酸5-β-胆烷酸结合而制备，从而产生络合物，然后将络合物互相彼此混合。特别地，上述专利文献公开了由于胆汁酸的疏水基团和壳聚糖和聚乙烯亚胺(PEI)的亲水基团引起的两亲性，在水性体系中形成球形自聚集体，由于这个原因，强两亲性聚乙烯亚胺和壳聚糖位于壳聚糖-胆汁酸/聚乙烯亚胺(PEI)-胆汁酸络合物纳米颗粒的表面上，疏水性胆汁酸位于核心中。然而，由于PEI的严重毒性，不适用于临床试验。
因此，迫切需要开发用于安全有效的基因递送的基因载体，其具有增强的转染效率，同时保留了常规非病毒载体的优点。
同时，糖尿病是一种代谢疾病，其中由于胰岛素分泌不足或功能异常导致血糖浓度增加。2型糖尿病是指在不受控制的情况下体内血糖水平升高的情况，因为胰岛素分泌不当或分泌的胰岛素不能在体内正常发挥作用，1型糖尿病是指由于胰腺不能分泌胰岛素而血糖水平升高的情况。在1型糖尿病的情况下，胰岛素治疗是必要的。在2型糖尿病的情况下，改变生活方式是必要的，并且此外还可能需要口服降血糖药。每天进食给药一至三次，并且药物的给药时间或副作用根据药物的作用时间略有不同。
目前使用的糖尿病治疗包括饮食疗法、运动疗法、磺脲类、双胍类药物、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素等，通过许多关于新药开发的研究已经开发出各种胰岛素等，并已应用于临床实践。
同时，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种胰岛素分泌肽，是一种由回肠和大肠的L细胞分泌的肠促胰岛素激素。胰高血糖素样肽-1的主要作用是增加胰岛素分泌并通过葡萄糖依赖性胰岛素分泌来抑制低血糖症。由于这些特征，胰高血糖素样肽-1用于治疗2型糖尿病。然而，它的血液半衰期很短，约为2分钟，因此，使用胰高血糖素样肽-1的药物的开发受到很大限制。因此，开发的和市售的胰高血糖素样肽-1激动剂包括毒蜥外泌肽-4，一种从毒蜥的唾液腺分离的胰高血糖素样肽-1类似物。毒蜥外泌肽-4具有比胰高血糖素样肽-1更高的生理活性以及对DPP-IV(二肽基肽酶-4)的抗性，因此体内半衰期为2至4小时，比胰高血糖素样肽-1长(US 5,424,286)。然而，仅通过增加对DPP-IV的抗性的方法不可能期望足够的生理活动持续时间。例如，目前市售的毒蜥外泌肽-4(艾塞那肽)应每天两次通过注射施用给患者，并且还有一个缺点，即由于施用艾塞那肽引起的呕吐和恶心给患者带来了很大的负担。
然而，这些治疗剂具有低效率或引起许多副作用的问题，例如肝功能障碍、低血糖症、乳酸酸中毒等。
因此，需要一种糖尿病治疗剂，其能够减少常规糖尿病治疗剂的副作用，改善代谢异常，并且即使长期施用也是安全的。另外，为了解决这些问题，开发了采用病毒载体的技术。该技术面临非特异性免疫反应等风险，且生产过程复杂，导致商业化中的许多问题。因此，最近的研究已经针对非病毒载体的使用，即基于阳离子脂质或聚合物的载体。虽然这些非病毒载体的效率低于病毒载体的效率，这些非病毒载体的优点在于它们在体内稳定，通过简单易行的方法生产，并且价格低廉。然而，当使用聚合物和基因制备混合物时，由于基因的特征硬度和弱阴离子性质，混合物的形成遇到很大困难。
公开
技术问题
因此，本发明人进行了研究并努力解决上述问题，结果发现，当用于基因递送的纳米颗粒包含用胆汁酸或胆汁酸衍生物和基因进行表面修饰的离子聚合物时，当用于基因递送的纳米颗粒的核心包含离子聚合物和基因的离子络合物时，当具有亲水离子基团的胆汁酸或胆汁酸衍生物位于纳米颗粒表面时，可以改善纳米颗粒的体内稳定性，通过最小化纳米颗粒的体内毒性可以减少上述副作用，并且可以克服与口服纳米颗粒相关的病症，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于基因递送的纳米颗粒，其能够将治疗基因有效地递送至细胞内靶位点，包括：至少一种与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和基因，其中缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物具有离子基团。
本发明的另一个目的是提供用于治疗糖尿病的药物组合物，其包含用于基因递送的纳米颗粒作为活性成分。
技术方案
为达到上述目的，本发明提供一种用于基因递送的纳米颗粒，其包含：至少一种与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和基因，其中缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物具有离子基团。
在本发明的一个实施方案中，离子聚合物可以是阳离子聚合物。
在本发明的一个实施方案中，阳离子聚合物可选自下组：壳聚糖、鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸(PLL)和聚酰胺胺(PAMAM)。
在本发明的一个实施方案中，离子聚合物可以是阴离子聚合物，在这种情况下，离子聚合物还包含阳离子聚合物。
在本发明的一个实施方案中，阴离子聚合物可选自肝素、透明质酸和硫酸软骨素，阳离子聚合物可选自下组：壳聚糖、乙二醇壳聚糖、鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸(PLL)和聚酰胺胺(PAMAM)。
在本发明的一个实施方案中，与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物可以是通过二硫键缀合的离子聚合物。
在本发明的一个实施方案中，胆汁酸或其衍生物可选自下组：脱氧胆酸、牛磺酸脱氧胆酸、牛磺胆酸(TCA)、甘氨胆酸和甘氨鹅去氧胆酸。更优选地，其为牛磺胆酸(TCA)。
在本发明的一个实施方案中，基因可以是选自单链或双链DNA(脱氧核糖核酸)、单链或双链RNA(核糖核酸)、质粒DNA(pDNA)、反义寡核苷酸、核酶、催化RNA和核苷酸中的一种或多种。优选地，基因可以是选自质粒DNA(pDNA)和反义寡核苷酸中的一种或多种。更优选地，该基因可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)基因、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒晰外泌肽-4。
在本发明的一个实施方案中，胆汁酸或其衍生物的缀合度可以根据离子聚合物的官能团的数量而变化，但胆汁酸或其衍生物和离子聚合物可优选以1：1至1：300的摩尔比互相缀合。
在本发明的一个实施方案中，无论粒径如何，都可以吸收用于基因递送的纳米颗粒，但可优选具有500nm或更小的粒径。
在本发明的一个实施方案中，与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物和基因可以以1：1至1：200的摩尔比互相键合。
在本发明的一个实施方案中，用于基因递送的纳米颗粒的N/P比(与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物的氮原子数/基因的磷原子数)可以是1至200。
本发明还提供用于治疗糖尿病的药物组合物，其包含用于基因递送的纳米颗粒作为活性成分，其中所述纳米颗粒包含：至少一种与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)基因、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒晰外泌肽-4，其中缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物具有离子基团。
在本发明的一个实施方案中，组合物可以用于口服给药。
有益效果
本发明的用于基因递送的纳米颗粒是一种新型口服基因递送系统，其能够调节生物系统中的血糖水平和响应于摄入的膳食的胰岛素分泌，包含：与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和基因。
本发明的用于基因递送的纳米颗粒是用胆汁酸或其衍生物表面修饰的纳米颗粒，其中由于带负电荷的基因和阳离子聚合物之间的静电相互作用，包含包封在阳离子聚合物中的带负电荷的基因的离子络合物存在于纳米颗粒的核心中，其中与阳离子聚合物缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物位于纳米颗粒的表面上，同时具有亲水性阴离子基团。
此外，本发明的用于基因递送的纳米颗粒是用胆汁酸或其衍生物表面修饰的纳米颗粒，其中由于带负电荷的基因和阳离子聚合物之间的静电相互作用，包含包封在阳离子聚合物中的带负电荷的基因的离子络合物存在于纳米颗粒的核心中，其中离子络合物的阳离子聚合物和与具有亲水阴离子基团的胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的阴离子聚合物，通过静电相互作用相互缀合，因此，与阴离子聚合物缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物位于纳米颗粒的表面上，同时具有亲水性离子基团。
因此，本发明的用于基因递送的纳米颗粒通过阳离子聚合物和基因之间的直接物理结合来保护免受胃酸，可以安全地递送至小肠细胞，并且还可以用作靶向纳米颗粒，其使得GLP-1基因仅在小肠中的L-细胞中表达。
当用本发明的胆汁酸或其衍生物表面修饰的纳米颗粒用于将治疗基因递送至靶细胞时，它很容易通过肠粘膜传递基因，同时由于纳米颗粒核心中存在离子络合物，在胃肠道中非常稳定。这表明本发明的用于基因递送的纳米颗粒非常适合口服给药。
位于本发明的纳米颗粒表面上的胆汁酸可以抑制纳米颗粒的胃肠(GI)降解，并吸收小肠回肠中肠细胞膜的胆汁酸受体ASBT(顶侧钠胆汁酸转运蛋白)受体，从而将治疗基因递送到细胞中，因此纳米颗粒可以表现出基因表达增加。
特别地，当使用的治疗基因是GLP-1、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒蜥外泌肽-4时，位于本发明的纳米颗粒表面的胆汁酸和阳离子聚合物被肠细胞的谷胱甘肽酶和pH分离，并进入门静脉，分离的治疗基因仅被递送至肠细胞核并表达大量的GLP-1、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒蜥外泌肽-4，从而有效地表现出糖尿病治疗功效。
因此，当向糖尿病小鼠模型口服施用本发明的用于基因递送的纳米颗粒时，通过分泌胰岛素可以表现出降血糖作用，同时成功表达GLP-1、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒蜥外泌肽-4，从而有效地预防或治疗糖尿病，特别是2型糖尿病。
附图说明
图1是通过回肠ASBT吸收本发明的用于基因递送的纳米颗粒的过程的示意图。
图2是实施例1中的Prot-TCA的制备过程的反应流程图。
图3显示了实施例1中制备的Prot-TCA的1H NMR。
图4是实施例2中的CS-TCA的制备过程的反应流程图。
图5显示了实施例2中制备的CS-TCA的1H NMR。
图6显示了实施例3中PAMAM-TCA的制备过程的反应流程图。
图7显示了实施例4中PLL-TCA的制备过程的反应流程图。
图8显示了实施例7中pDNA/Prot-TCA的制备过程的反应流程图。
图9显示了实施例11中Hep-S-S-NH2的制备过程的反应流程图。
图10显示了实施例11中TCA-NPC的制备过程的反应流程图。
图11显示了实施例11中Hep-S-S-TCA的制备过程的反应流程图。
图12显示了实施例11中制备的Hep-S-S-NH 2和Hep-S-S-TCA的1H NMR。
图13是实施例13中的CS-S-S-TCA的制备过程的反应流程图。
图14显示了实施例13中制备的CS-S-S-TCA的1H NMR。
图15是实施例15中的Prot-S-S-TCA的制备过程的反应流程图。
图16是实施例16中的pDNA/Prot-S-S-TCA的制备过程的反应流程图。
图17显示了实施例17中制备的TCA-NPC和TCA-NH 2的1H NMR。
图18显示了实施例17中制备的HA-TCA的1H NMR。
发明形式
在下文中，将更详细地描述本发明。除非另外定义，否则本文使用的科学和技术术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。在以下描述中，当可能不必要地模糊本发明的主题时，将省略对已知功能和配置的详细描述。
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明提供一种用于基因递送的纳米颗粒，其是一种新型口服基因递送系统，包括：至少一种与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和基因，其中缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物具有离子基团。
该基因是带负电荷的大聚合物链的形式。当基因单独存在时，它具有体积相对较大的无规则卷曲形状，因此难以将基因递送到细胞中。因此，使用阳离子聚合物，其可通过静电相互作用与基因形成纳米尺寸的离子络合物。
本发明的用于基因递送的纳米颗粒包含基因与离子聚合物的离子络合物。与阴离子基因形成离子络合物的离子聚合物应基本上是阳离子聚合物，其中阳离子聚合物可以是与胆汁酸缀合的聚合物。
本发明的用于基因递送的纳米颗粒可以通过基因与与胆汁酸或其衍生物缀合的阳离子聚合物之间的静电相互作用形成，或者可以通过与胆汁酸或其衍生物，阳离子聚合物和基因缀合的阴离子聚合物之间的静电相互作用形成，并且可以更安全地诱导基因的细胞内化。
即，本发明的用于基因递送的纳米颗粒是用胆汁酸表面修饰的纳米颗粒，其中阳离子聚合物与基因的离子络合物存在于纳米颗粒的核中，具有亲水离子基团的胆汁酸位于纳米颗粒的表面上。
当将本发明的胆汁酸或其衍生物表面修饰的纳米颗粒用于将治疗基因递送至靶细胞时，其容易通过肠粘膜递送基因，同时，由于纳米颗粒核心中存在离子络合物，在胃肠道中非常稳定。这表明本发明的用于基因递送的纳米颗粒非常适合口服给药。
在本发明的一个实施方案中，离子聚合物可以是阳离子聚合物。当离子聚合物是阳离子聚合物时，由于与阳离子聚合物的静电相互作用，带负电的基因被包封在阳离子聚合物中，从而形成离子络合物。形成的离子络合物位于纳米颗粒的核中，与阳离子聚合物缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物位于纳米颗粒的表面上，同时具有亲水性离子基团。
在本发明的一个实施方案中，阳离子聚合物可以是重均分子量为100-100,000的无毒聚合物。例如，它可以选自下组：壳聚糖(CS)、乙二醇壳聚糖、鱼精蛋白(Prot)、聚L-赖氨酸(PLL)和聚酰胺胺(PAMAM)。优选地，它可以是壳多糖(CS)、鱼精蛋白(Prot)、聚-L-赖氨酸(PLL)或聚酰胺胺(PAMAM)。
壳多糖是天然存在的，非常安全的阳离子多糖，具有(1->4)2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖的结构。壳多糖是通过从天然甲壳类等获得的几丁质的N-脱乙酰化产生的碱性多糖，并且已知其显示出生物降解性、生物相容性和低细胞毒性。在本发明中，优选使用水溶性壳聚糖，其是具有优异生物降解性和生物相容性的天然聚合物，或者是由于引入其中的二醇基团而具有增加的水溶性的二醇壳聚糖。
鱼精蛋白是一种富含精氨酸的天然阳离子蛋白质，大量存在于动物睾丸中，尤其是鱼类的精子核，包括鲑鱼，并且已知通过与DNA结合或解离而参与遗传信息表达，如组蛋白。通常，从鱼的精子核中提取的鱼精蛋白的分子量为约4,000至10,000，并且鱼精蛋白的组成氨基酸的70％或更多是精氨酸，但是本发明的范围不限于此。本发明的鱼精蛋白包括所有鱼精蛋白本身及其药学上可接受的盐。具体地，本发明的鱼精蛋白盐包括由酸性物质形成的盐，包括盐酸盐或硫酸盐。鱼精蛋白可以以任何形式使用，因为它可溶于水而不形成盐，并且其盐也可溶于水。
聚L-赖氨酸(PLL)通过可生物降解的肽键连接，因此可以与基因形成离子络合物并且可以递送至细胞。然而，它有些毒性，因此当单独使用时，难以显示出高的递送效率。因此，可以在内体破坏性物质、内体融合肽等附着于其上的状态下使用。
在本发明的一个实施方案中，离子聚合物可以是阴离子聚合物，并且在这种情况下，它基本上还包含阳离子聚合物，以与该基因形成离子络合物。即，由于与阳离子聚合物的静电相互作用，带负电的基因被包封在阳离子聚合物中，从而形成离子络合物，并且形成的离子络合物位于纳米粒子的核中。阴离子聚合物通过静电相互作用与离子络合物的阳离子聚合物键合，并且与阴离子聚合物缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物位于纳米颗粒的表面上，同时具有亲水性离子基团。
在本发明的一个实施方案中，阴离子聚合物可选自肝素、透明质酸和硫酸软骨素，阳离子聚合物可选自下组：壳聚糖、乙二醇壳聚糖、鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸(PLL)和聚酰胺胺(PAMAM)。
肝素具有包含羟基、羧基和氨基的结构，使用的可以是非分馏肝素、高分子量肝素、低分子量肝素、肝素片段、重组肝素、肝素类似物、硫酸乙酰肝素、具有肝素活性的磺化多糖等。
在本发明的一个实施方案中，除了能够与离子聚合物缀合的官能团外，胆汁酸或其衍生物还具有亲水性阴离子基团，可以选自下组：脱氧胆酸(DCA)、牛磺酸脱氧胆酸、牛磺胆酸(TCA)、甘氨胆酸和甘氨鹅去氧胆酸。更优选地，它具有四个或更多个亲水阴离子基团的牛磺胆酸(TCA)。
胆汁酸通过小肠回肠被吸收到肝脏中，效率高达95％或更高，这种吸收被称为“肠肝循环”。胆汁酸是一种生物表面活性剂，通过这种肠肝循环在脂质迁移中起重要作用，并且可以在口服递送中充当靶向配体，因为它特异性地通过存在于远端肠部分中的ASBT(顶侧钠依赖性胆汁酸转运蛋白)识别。
即，通过回肠吸收的胆汁酸位于纳米颗粒的表面上，用于基因递送，因此，通过肠内壁增加纳米颗粒对基因输送到靶细胞的摄取的作用，这是通过ASBT进行的常规口服给药方法的最大问题(图1)。因此，本发明的用于基因递送的纳米颗粒可以容易地通过吸收胆汁酸的回肠吸收，因此它可以用于口服给药，从而提高药物的生物利用度。
在本发明的一个实施方案中，与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物可以是通过二硫键缀合的离子聚合物。
二硫键(S-S)具有容易与从肠细胞大量分泌的谷胱甘肽敏感反应并易于分离的倾向。因此，当本发明的用于基因递送的纳米颗粒接近肠细胞时，它大部分被分离，只有基因进入L细胞的细胞核。表达所输入的基因并通过表达GLP-1肽起到恢复受损功能的作用。此外，二硫键也在最大限度地减少向其他器官或细胞的非特异性递送中起着重要作用。
在本发明的一个实施方案中，可以与本发明的用于基因递送的纳米颗粒结合的基因种类没有特别限制，并且可以是任何基因，根据本发明的目的，其可以被递送到期望的目标并且可以表现出期望的治疗效果，属于本发明的范围内。例如，本发明的基因可包括用于疾病相关治疗基因的正常基因、用于抑制靶蛋白表达的基因、包括反义多核苷酸的大或小多核苷酸、核酶或包括siRNA的任何RNA型基因。具体地，该基因可以是选自单链或双链DNA(脱氧核糖核酸)、单链或双链RNA(核糖核酸)、质粒DNA(pDNA)、反义寡核苷酸、核酶、催化RNA和核苷酸的一种或多种。优选地，基因可以是选自质粒DNA(pDNA)和反义寡核苷酸中的一种或多种。该基因可以是基因药物，并且如本文所用，基因药物是指对预防或治疗一种或多种疾病具有药效的药物。
该基因可以是编码GLP-1的基因，其是胰岛素分泌肽。优选地，该基因可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)基因、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒晰外泌肽-4。
在本发明中，术语“GLP-1基因”和“GLP-1变体”用于表示编码各基因的核酸(DNA)分子。另外，术语“GLP-1激动剂”、“利拉鲁肽”或“毒蜥外泌肽-4”等在涉及基因列表时用于表示编码各肽或蛋白质的核酸(DNA)分子。
GLP-1基因、GLP-1变体或GLP-1衍生物可全部包括在用于表达的环状或线性质粒中。GLP-1变体可以是例如，GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Val8-GLP-1(7-37)、Gln8-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr18-Lys18-GLP-1(7-37)、Lys18-GLP-1(7-37)、His7-GLP-1(7-37)、Ser8-GLP-1(7-37)或Tyr8-GLP-1(7-37)，其序列在US2013-0210717A1中公开。用于基因递送的纳米颗粒，通过与上述GLP-1基因、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒晰外泌肽-4形成复合物而制备，在体内给药时，它可以表现出优异的降血糖作用，从而有效地预防或治疗糖尿病，特别是2型糖尿病。
在本发明的一个实施方案中，胆汁酸或其衍生物的缀合度可以根据离子聚合物的官能团的数量而变化。优选地，胆汁酸或其衍生物和离子聚合物可以以1：1至1：300的摩尔比相互缀合。
优选地，胆汁酸或其衍生物和阳离子聚合物可以以1：1至1：100的摩尔比相互缀合。
优选地，胆汁酸或其衍生物和肝素可以以1：1至1:30的摩尔比相互缀合。
优选地，胆汁酸或其衍生物和透明质酸可以以1：1至1：200的摩尔比相互缀合。
在本发明的一个实施方案中，尽管无论粒径如何都可以吸收用于基因递送的纳米颗粒，但其优选具有500nm或更小，更优选100-300nm的粒径。
在本发明的一个实施方案中，用于基因递送的纳米颗粒的ζ电位可以根据纳米颗粒表面上使用的离子聚合物的种类而变化。具体地，通过基因和与胆汁酸或其衍生物缀合的阳离子聚合物之间的静电相互作用形成的用于基因递送的纳米颗粒可以显示10至30mV的ζ电位。另外，通过基因，阳离子聚合物和与胆汁酸或其衍生物缀合的阴离子聚合物之间的静电相互作用形成的用于基因递送的纳米颗粒可显示出在-10至-30mV范围内的ζ电位。
在本发明的一个实施方案中，与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物和基因可以以1：1至1：200，优选1：1至1：100的摩尔比彼此结合。在结合比范围内，基因的表达水平不会受到不利影响，并且细胞生长不会受到纳米颗粒对传递到细胞中的基因递送的细胞毒性的不利影响。
在本发明的一个实施方案中，与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的阳离子聚合物和基因可以以1：1至1：200的重量比/摩尔比，优选1：3到1:30彼此混合。由于阳离子聚合物的结合能力有限，并且只能在阳离子聚合物具有最佳强结合能力的范围内进行递送，通过阳离子聚合物和基因之间的静电相互作用，在上述比例范围内容易形成离子络合物。
在本发明的一个实施方案中，与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的阴离子聚合物，阳离子聚合物和基因可以以3：1：1至10：1：200，优选3：1：1至10：1：30的重量比/摩尔比彼此混合。该比例范围是通过电荷-电荷相互作用可以保持结合能力的最佳范围。超出此范围，配方无法制出并失去稳定性。
在本发明的一个实施方案中，用于基因递送的纳米颗粒的N/P比(与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物(特别是阳离子聚合物)的氮原子数/基因的磷原子数)为1至200。当N/P比在该范围内时，可以促进阳离子聚合物对基因的稳定化，因此可以增加基因进入细胞的摄取，并且可以形成用于基因递送的稳定的纳米颗粒。
本发明还提供用于治疗糖尿病的药物组合物，其包含用于基因递送的纳米颗粒作为活性成分，其中所述纳米颗粒包含：至少一种与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)基因、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒蜥外泌肽-4，其中缀合胆汁酸或胆汁酸衍生物具有离子基团。
用于基因递送的纳米颗粒包含作为治疗基因的，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)基因、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒蜥外泌肽-4，这是一种绝缘分泌肽。因此，它通过摄取到靶细胞中来增加胰岛素分泌，并诱导葡萄糖依赖性胰岛素分泌，从而防止低血糖的发生。因此，它可以有助地用于治疗糖尿病，特别是2型糖尿病。
本发明中的术语“活性成分”包括与其他方面相比，当将组合物给予受试者时具有预防或治疗糖尿病的活性。受试者可以是选自哺乳动物中的至少一种，例如人、小鼠、仓鼠、狗、猫、马、牛、猪和山羊。术语“预防”包括与不施用组合物相比，防止血糖浓度增加。术语“治疗”包括与不施用组合物时相比降低血糖浓度。
此外，本发明的药物组合物可包含仅用于基因递送的纳米颗粒，或者可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
此外，本发明的药物组合物可以制备成制药领域中已知的常规制剂，例如，口服剂量制剂，例如片剂、丸剂、软/硬胶囊、液体、悬浮液、乳液、糖浆、颗粒、酏剂等，或肠胃外剂量制剂，例如用于静脉内、皮下、舌下或肌肉内给药的无菌水溶液或油基溶液。
可用于本发明药物组合物的药学上可接受的载体是通常用于制剂的那些，包括但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和/或矿物油等。
可用于本发明药物组合物的赋形剂包括甜味剂、粘合剂、溶解剂、助溶剂、润湿剂、乳化剂、等渗剂、吸附剂、崩解剂、抗氧化剂、防腐剂、润滑剂、填充剂、香料等。这些赋形剂的比例和性质可以通过所选片剂的溶解度和化学性质、选择的给药途径和标准药学实践来确定。赋形剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、甘氨酸、二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸、硬脂酸镁、铝硅酸镁、淀粉、明胶、黄蓍胶、海藻酸、海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、琼脂、水、乙醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、氯化钙、橙子精华、草莓精华、香草香精等。
此外，本发明的药物组合物还可以配制成肠胃外剂型。在这种情况下，可以使用静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、皮下给药、局部给药等，但不限于此。为了提供用于肠胃外给药的制剂，可以通过将活性成分(即，用于基因递送的纳米颗粒)与稳定剂或水中的缓冲液混合，将药物组合物制备成溶液或悬浮液，并且该溶液或悬浮液可以制备成安瓿或小瓶的单位剂型。
更优选地，本发明的药物组合物可以是口服剂量制剂。
此外，本发明的药物组合物可以是灭菌的，或者还可以包含药物赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、水合剂或乳化促进剂，用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它还可以包含其他治疗上有用的物质，并且可以根据常规方法配制，例如混合，制粒或包衣。
用于基因递送的纳米颗粒，其是本发明的药物组合物的活性成分，施用于包括人在内的哺乳动物的给药剂量可以根据患者的年龄、体重、性别、给药方式、健康状况和疾病的严重程度而变化。药物组合物可以通过口服或肠胃外途径每天施用一次或两次或更多次。
在下文中，将参考具体实施例更详细地描述本发明。以下实施例用于说明本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制。除非另外定义，否则本文使用的科学和技术术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。另外，将省略与现有技术中相同的技术配置和作用的重复描述。
材料：
低分子量肝素(Hep，平均分子量：5000Da)购自Mediplex有限公司(韩国)，透明质酸钠(分子量：83kDa)购自Bioland有限公司(韩国)。TCA(多元磺胆酸钠)、DMF(二甲基甲酰胺)、鱼精蛋白(Prot)、壳聚糖(CS)、丙酮、4-NPC(4-甲基吗啉，4-硝基苯基氯甲酸酯)、TEA(三甲胺)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐)、EDA(乙二胺)和胱胺二氯化物购自西格玛化工有限公司(密苏里州圣路易斯市)。Caco-2细胞、MDCK-ASBT和MDCK细胞系购自韩国细胞系库。作为pDNA基因，使用来源于大肠杆菌RR1的质粒DNA(西格玛-奥德里奇，产品代码D4154和D3404)。
制备与胆汁酸缀合的阳离子聚合物
实施例1：鱼精蛋白-牛磺胆酸结合物(以下称为“Prot-TCA”)的制备
在0℃下将TCA(牛磺胆酸)(1mmol)溶解在DMSO(二甲基亚砜)(5mL)中直至形成透明溶液。然后，依次加入TEA(三乙胺)(3mmol)和4-NPC(4-硝基苯基氯甲酸酯)(2.5mmol)，然后在0℃下反应30分钟并在室温下反应30分钟。将Prot(鱼精蛋白)(0.1mmol)溶解在双蒸水(10mL)中，然后加入到反应溶液中，然后在室温下反应24小时。将反应溶液用双蒸水透过透析膜(MWCO：1000Da)透析3天，同时每6小时更换培养基。透析后，将反应产物冷冻干燥，得到Prot-TCA(产率：78±2％；图2)。
1H NMR和TNBSA分析表明牛磺胆酸与鱼精蛋白缀合(图3)。
实施例2：壳聚糖-牛磺胆酸缀合物(以下称为“CS-TCA”)的制备
在0℃下将TCA(1mmol)溶解在DMSO(5mL)中直至形成透明溶液。然后，依次加入TEA(3mmol)和4-NPC(2.5mmol)，然后在0℃下反应30分钟并在室温下反应30分钟。将CS(壳聚糖)(0.01mmol)溶解在双蒸水(20mL)中，然后加入到反应溶液中，然后在室温下反应24小时。将反应溶液用双蒸水透过透析膜(MWCO：1000Da)透析3天，同时每6小时更换培养基。透析后，将反应产物冷冻干燥，得到CS-TCA(产率：92±2％；图4)。
1H NMR和TNBSA分析表明，牛磺胆酸与壳聚糖缀合(图5)。
(结构分析)
通过将Prot和CS各自的氨基与TCA的羟基缀合来制备Prot-TCA和CS-TCA。为了证实，将Prot-TCA和CS-TCA分别以10mg/mL溶解在D2O中，然后进行1H NMR分析。结果显示在图3和5中。从图3和图5中可以看出，在δ8ppm处检测到TCA和Prot之间的酰胺键缀合峰和TCA与CS之间的酰胺键缀合峰。
另外，为了检测Prot-TCA和CS-TCA的氨基含量，通过TNBSA(三硝基苯磺酸盐)分析定量TCA与Prot和CS各自结合后的胺化程度。结果证实，与TCA缀合至Prot之前相比，Prot-TCA的氨基含量为53％，表明在缀合TCA后氨基含量降低。
实施例3：聚酰胺胺-牛磺酸结合物(以下称为“PAMAM-TCA”)的制备
除了使用聚酰胺胺代替Prot(鱼精蛋白)之外，以与实施例1中所述相同的方式制备PAMAM-TCA。通过FT-IR和FT-NMR分析PAMAM-TCA的结构(产率：50％；图6)。
实施例4：聚-L-赖氨酸-牛磺酸结合物的制备(以下称为“PLL-TCA”)
除了使用聚-L-赖氨酸代替Prot(鱼精蛋白)之外，以与实施例1中所述相同的方式制备PLL-TCA。通过FT-IR和FT-NMR分析PLL-TCA的结构(产率：55％；图7)。
含有胆汁酸缀合阳离子聚合物和基因的纳米颗粒的制备
实施例5：含有鱼精蛋白-牛磺胆酸缀合物和GLP-1编码基因的纳米颗粒的制备(下文称为'Prot-TCA/GLP-1')
将溶解在10mM HEPES缓冲液(pH7.4)中的Prot-TCA(1mg/mL)用作储备溶液。将GLP-1(胰高血糖素样肽-1)编码基因(7.780mg)溶解于10mM HEPES缓冲液(pH7.4)(1.922mL)中，从而制备GLP-1基因溶液。在温和振荡下，将GLP-1基因溶液(10mL)滴加到原料Prot-TCA溶液(10mL)中。此后，将反应产物在室温下静置1小时并冷冻干燥2天以获得Prot-TCA/GLP-1(图8)。
实施例6：包含壳聚糖-牛磺酸结合物和GLP-1编码基因的纳米颗粒的制备(以下称为“CS-TCA/GLP-1”)
除了使用CS-TCA代替实施例5的Prot-TCA之外，以与实施例5中所述相同的方式获得CS-TCA/GLP-1。
为了分析粒径和ζ电位，将Prot-TCA/GLP-1(实施例5)和CS-TCA/GLP-1(实施例6)分别以1mg/mL溶解在D2O中。
(纳米颗粒子的形态分析)
用TEM(透射电子显微镜)和动态光散射粒度分析仪，观察Prot-TCA/GLP-1(实施例5)的形态和粒度分布。
纳米颗粒的平均尺寸约150nm并且显示出相对均匀的尺寸分布。
(纳米颗粒的表面电荷)
使用ζ电位分析仪，测量实施例5中制备的纳米颗粒的ζ电位。结果，纳米颗粒显示出正的ζ电位。这种正表面电荷意指带负电荷的GLP-1编码基因完全包封在基因递送复合物中。正表面电荷促进基因递送纳米颗粒的细胞内内化。另外，它在颗粒之间引起静电排斥，从而减少颗粒的聚集。
(纳米粒子的稳定性)
为了确认实施例5和6中制备的纳米颗粒的稳定性，进行凝胶阻滞分析。
使用1％琼脂糖凝胶和1×TBE缓冲溶液进行凝胶阻滞实验。将包封在本发明的纳米颗粒中的基因GLP-1在0.5μg/mL EtBr(溴化乙锭)上染色并在凝胶上成像。实验在100V下进行30分钟。
结果证实，GLP-1与Prot-TCA的缀合和GLP-1编码基因与CS-TCA的缀合以1:10或更高的摩尔比进行。特别地，当实施例5中Prot-TCA和GLP-1之间以1：150的摩尔比进行缀合，并且实施例6中CS-TCA和GLP-1编码基因之间以1:10的摩尔比进行缀合时，由于诱导GLP-1编码基因缩合引起的延滞现象，因此GLP-1编码基因的迁移被完全延迟。这表明Prot-TCA和CS-TCA中的每一个都有效地浓缩了编码GLP-1的基因，因此形成了基因递送复合物(Prot-TCA/GLP-1和CS-TCA/GLP-1)。因此，本发明的纳米颗粒可以与基因形成复合物，并且可以有助地用作递送基因的基因载体。
(血清中的稳定性)
为了确认实施例5和6中制备的纳米颗粒的血清稳定性，如下进行实验。
将Prot-TCA/GLP-1(实施例5)和CS-TCA/GLP-1(实施例6)分别在37℃下在20％血清中储存48小时，然后用0.5M EDTA处理。然后，加入1％SDS以从Prot-TCA/GLP-1(实施例5)和CS-TCA/GLP-1(实施例6)中分别分离GLP-1编码基因。
结果表明，与游离基因GLP-1相比，包封在Prot-TCA/GLP-1(实施例5)和CS-TCA/GLP-1(实施例6)各自中的GLP-1编码基因在48小时内未从血清中降解，并且在血清中非常稳定。
(针对pH条件的颗粒稳定性)
在各种pH条件下检查本发明的纳米颗粒的稳定性。
具体地，将Prot-TCA/GLP-1(实施例5)和CS-TCA/GLP-1(实施例6)中的每一种加入到不同pH(pH 3、pH 5和pH 7.4)的三种溶液中，pH类似于胃胃、胃肠道的十二指肠和回肠碎片，并观察其粒径。结果证实，Prot-TCA/GLP-1(实施例5)和CS-TCA/GLP-1(实施例6)在pH 3至24小时都是稳定的。
实验例1：体外基因表达和Transwell研究
使用ASBT(顶侧钠依赖性胆汁盐转运蛋白)-过表达MDCK和Caco-2细胞系，观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。
将4μg的eGFP基因上样到实施例5和6中分别制备的用于基因递送的纳米颗粒上，然后观察到在细胞系中成功表达并观察到绿色荧光。
此后，为了研究双层细胞培养技术中基因复合物的递送，在transwell板的顶端部分培养Caco-2单层，并在底部培养MDCK-ASBT细胞系。结果，观察到纳米颗粒成功递送，表明TCA分子的功能是协助这些基因复合物的摄取和递送。
使用GLP-1ELISA试剂盒，其量化GLP-1响应于培养基中葡萄糖水平的体外表达，结果，GLP-1编码基因的表达增加。
实验例2：复合物的体内生物分布
为了检验实施例5和6中制备的用于基因递送的负载eGFP的纳米颗粒的体内生物分布，进行了以下实验。
将Balb/c小鼠圈养在木笼中并定期提供食物和水。在口服施用治疗性基因复合物之前12小时，将动物禁食。禁食12小时后，通过口服灌喂给动物施用实施例5和6的每种基因递送纳米颗粒，其含有100μg的eGFP基因。在给药后24小时，处死动物，并使用共聚焦显微镜定量基因的体内表达和样品的体内生物分布。
结果，本发明的基因递送纳米颗粒显示eGFP基因在回肠和肝脏片段中的表达增加。此外，可以看出与每种鱼精蛋白和壳聚糖缀合的TCA阻止了基因的GI(胃肠)降解并有助于eGFP的摄取和表达。
实验例3：GLP-1编码基因的体内表达和血糖水平的调节
将5周龄的ZDFR(Zucker糖尿病性肥胖大鼠)圈养在木笼中，并定期提供食物和水。在口服施用实施例5和6的基因递送纳米颗粒之前12小时，将动物禁食。禁食12小时后，将100μg实施例5和6的每种基因递送纳米颗粒口服给予每只动物。在给药后24小时的预定时间间隔，从每只动物的尾静脉取血，并测量血液的葡萄糖水平。令人惊讶地证实，血糖水平被调节至正常血糖水平。5天后，处死实验动物，用ELISA试剂盒分析回肠和肝脏碎片中GLP-1和胰岛素的表达。结果证实，与对照组相比，在口服施用本发明的用于基因递送的纳米颗粒后，GLP-1肽和胰岛素蛋白的表达增加。
实验例4：复合物对GLP-1基因递送的体内毒性
将4周龄的斯泼累格·多雷(SD)大鼠圈养在木笼中，并定期提供食物和水。将100μg实施例5和6的每种基因递送纳米颗粒口服和静脉内施用于每只动物。以预定的时间间隔从实验动物取血24小时，分析血液中的全血含量，并评估确定肝脏和肾脏毒性的生物学标记物的表达。结果，即使以非常高的浓度给药，本发明的基因递送复合物也几乎没有毒性。
在给药后7天，处死动物，并进行回肠和肝脏碎片的免疫组织学检查。结果，在组织中未观察到炎症，并且也观察到毒性很小。
因此，可以看出本发明的基因递送复合物是安全和无毒的，并且可以用于治疗糖尿病。
实施例7：包含鱼精蛋白-牛磺胆酸缀合物和pDNA的纳米颗粒的制备(下文称为“pDNA/Prot-TCA”)
通过使用三乙胺(下文称为TEA)和4-硝基苯基氯甲酸酯(下文称为4-NPC)将牛磺胆酸的羟基与鱼精蛋白的氨基缀合，制备鱼精蛋白-牛磺胆酸缀合物。
制备Prot-TCA
将完全溶解在3ml DMF溶液中的4-NPC(70mmol)加入到10毫升蒸馏水中的牛磺胆酸(50mmol)的溶液中，加入100μlTEA溶液直至牛磺胆酸溶液变为完全黄色。然后，加入鱼精蛋白(5mmol)，然后在室温下反应，同时搅拌24小时。反应完成后，通过透析除去未反应的物质。用蒸馏水通过膜滤器(1kDa尺寸)进行透析24小时。接下来，进行冷冻干燥以获得Prot-TCA。
制备pDNA/Prot-TCA
将通过上述实验方法制备的每种Prot-TCA(150nmol至50nmol)和pDNA(1nmol)加入HEPES缓冲溶液中。接下来，搅拌制备的Prot-TCA溶液，同时每次加入10μl含有pDNA的HEPES缓冲溶液。在完全加入预定量的pDNA后，进行另外的搅拌10分钟，并完成反应，从而获得最终产物pDNA/Prot-TCA(图8)。
(pDNA/Prot-TCA的pH稳定性实验)
为了证实所制备的pDNA/Prot-TCA的稳定性，使用蒸馏水和pH 5.2、pH 1.8和pH7.4的HEPES缓冲溶液进行实验。在该实验中，通过测量时间依赖性大小来测量pDNA/Prot-TCA和pDNA/Prot的稳定性。具体地，在实验开始后即刻和实验开始后6,12和24小时，对pDNA/Prot-TCA溶液进行取样和分析。
结果证实，pDNA/Prot-TCA在上述条件下显示出优异的稳定性。这表明由于牛磺胆酸(一种胆汁酸)的结合，pH稳定性增加。作为对照，使用未与牛磺胆酸缀合的pDNA/Prot。对于对照，观察到在pH 5.2，pH 7.4和蒸馏水的条件下，尺寸显示出随时间增加的趋势，并且在pH 1.8下显示出随时间降低的趋势。特别是，尺寸在pH值为1.8时显示出降低的趋势的原因是因为鱼精蛋白在酸性条件下很弱并且降解，并且与pDNA的物理键断裂。
(使用SEM图像确认pDNA/Prot-TCA的合成)
将制备的pDNA/Prot-TCA置于硅片上，然后自然干燥，从而制备待分析的样品。使用扫描电子显微镜在10.0kV和2,000倍的放大率下进行分析。
结果，可以看出，所制备的pDNA/Prot-TCA具有100nm大小的颗粒形状，并且所有观察到的颗粒也具有均匀的尺寸。
(HCT 116细胞对pDNA/Prot-TCA毒性的研究实验)
HCT116细胞用于评估制备的pDNA/Prot-TCA的毒性，并且MTT试验用于毒性验证。
如理论上已知的，可以看出鱼精蛋白的存活率显示为85％或更高，并且鱼精蛋白-牛磺胆酸缀合物也显示出80％或更高的高存活率。
(使用共聚焦显微镜的细胞摄取实验)
HCT116细胞用于检查制备的pDNA/Prot的细胞摄取。在实验方法中，将HCT116细胞以105细胞/孔的浓度分配到8孔板中，然后注射罗丹明B-缀合的样品(pDNA/Prot和pDNA/Prot-TCA)。温育2小时后，用PBS洗涤细胞三次，并使用共聚焦显微镜观察。
结果，可以看出pDNA/Prot-TCA具有比对照pDNA/Prot更好的细胞摄取能力，并且细胞摄取能力高出约4倍。
(使用Caco-2单层分析pDNA/Prot-TCA的细胞通透性)
为了验证pDNA/Prot-TCA的细胞渗透性，通过将Caco-2细胞培养为单层进行实验。实验总共进行了6个小时，在10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和6小时收集样品并分析。
结果，可以看出pDNA/Prot-TCA具有比对照pDNA/Prot更好的细胞渗透性，表明在之后的动物实验中pDNA/Prot-TCA可以通过小肠吸收。
(口服给药后pDNA/Prot-TCA的体内生物分布分析实验)
对于口服给药后分析pDNA/Prot-TCA的体内生物分布的实验，使用罗丹明B-缀合的鱼精蛋白，并使用7周龄Balb/c小鼠。禁食6小时后，将药物口服给予小鼠，基于荧光图像和荧光水平确定药物在0.2、0.5、2、6、12和24小时的体内生物分布。
结果证实，pDNA/Prot-TCA通过小肠吸收，在不到30分钟的短时间内在小肠中吸收，在2-6小时内被吸收到肝脏中，然后缓慢消除。这表明pDNA/Prot-TCA遵循已知的牛磺胆酸体内循环途径，并且证实所制备的pDNA/Prot-TCA既不干扰也不损害牛磺胆酸的体内摄取并维持牛磺胆酸的原始循环途径。
实施例8：包含壳聚糖-牛磺胆酸缀合物和pDNA的纳米颗粒的制备(下文称为“pDNA/CS-TCA”)
制备TCA-NPC
为了将TCA与壳聚糖结合，将TCA(50mmol)溶解在DMSO(10mL)中，然后向其中加入4-NPC(200mg)和TEA(100μg)，然后在室温下反应1小时，从而制备TCA-NPC。
制备CS-TCA
将壳聚糖(100mg)溶解于蒸馏水中，加入制备的TCA-NPC(20mg)，搅拌24小时。然后，通过透析除去未反应的物质。用蒸馏水通过1-kDa膜滤器透析24小时。接下来，进行冷冻干燥，从而获得最终产物CS-TCA。
制备pDNA/CS-TCA
将通过上述实验方法制备的CS-TCA(150nmol至50nmol)和pDNA(1nmol)中的每一种添加至HEPES缓冲溶液中。然后，搅拌制备的CS-TCA溶液，同时每次加入10μl含有pDNA的HEPES缓冲溶液。在完全加入预定量的pDNA后，另外搅拌10分钟，结束反应，从而获得最终产物pDNA/CS-TCA。
(通过电泳测定和尺寸分析检查pDNA/CS-TCA的稳定性)
通过进行电泳并测量其大小来检查pDNA/CS-TCA的稳定性，并使用蒸馏水作为背景条件。
结果证实，将产生的pDNA/CS-TCA维持在非常稳定的状态至少24小时。
(通过表面电荷测量验证pDNA/CS-TCA的产生)
使用ζ电位分析仪来验证pDNA/CS-TCA的产生，并且通过测量表面电荷(mV)来检查是否将产生pDNA/CS-TCA。
常规pDNA的表面电荷为-2.96mV，壳聚糖的表面电荷为36.12mV。当产生pDNA/CS-TCA时，其表面电荷为19.55至25.68mV。这是因为阳离子壳聚糖完全包围了阴离子pDNA的表面，因此产生的pDNA/CS-TCA具有阳离子表面电荷。这表明成功产生了pDNA/CS-TCA。
(pDNA/CS-TCA的pH稳定性实验)
为了证实所产生的pDNA/CS-TCA的稳定性，使用pH 5.2、pH 1.8和pH 7.4的PBS缓冲溶液进行实验。在该实验中，通过测量时间依赖性大小来测量pDNA/CS-TCA的稳定性。具体地，在实验开始后和实验开始后6、12、18和24小时，对pDNA/CS-TCA溶液进行取样和分析。
结果证实，pDNA/CS-TCA在上述条件下显示出优异的稳定性。这表明由于牛磺胆酸(一种胆汁酸)的缀合，pH稳定性增加。
(使用MDCK-ASBT细胞对pDNA/CS-TCA毒性的实验)
MDCK-ASBT细胞用于评估产生的pDNA/CS-TCA的毒性，并且MTT测定用于毒性验证。
结果证实，pDNA/CS-TCA显示出80％或更高的高存活率。
(使用共聚焦显微镜的细胞摄取实验)
MDCK-ASBT细胞用于检查产生的pDNA/CS-TCA的细胞摄取。在实验方法中，将MDCK-ASBT细胞以105细胞/孔的浓度分配到8孔板中，然后注射罗丹明B-缀合的样品(pDNA/壳聚糖和pDNA/CS-TCA)。温育2小时后，用PBS洗涤细胞三次，并使用共聚焦显微镜观察。
结果，可以看出pDNA/CS-TCA具有比对照pDNA/壳聚糖更好的细胞摄取能力，并且细胞摄取能力高约2倍。
(使用Caco-2单层分析pDNA/CS-TCA的细胞通透性)
为了确认pDNA/CS-TCA的细胞渗透性，通过将Caco-2细胞培养为单层进行实验。实验总共进行6小时，并在10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和6小时收集样品并进行分析。
结果，可以看出pDNA/CS-TCA具有比对照pDNA/壳聚糖更好的细胞渗透性，表明在之后的动物实验中pDNA/CS-TCA可以通过小肠吸收。
(通过基因表达确认pDNA/CS-TCA的基因递送能力)
荧光素酶测定法用于验证pDNA/CS-TCA的基因表达效应。作为对照，使用pDNA、pDNA/壳聚糖和bPEI。
结果证实，pDNA/CS-TCA的效果比阴性对照(pDNA和pDNA/壳聚糖)高2至50倍，并且具有比阳性对照(bPEI)更好的基因递送效果。
(口服给药后pDNA/CS-TCA的体内生物分布分析的实验)
对于口服给药后分析pDNA/CS-TCA的体内生物分布的实验，使用罗丹明B-缀合的壳聚糖，并使用7周龄Balb/c小鼠。禁食6小时后，将药物口服给予小鼠，并在12小时时基于荧光图像确定药物的体内生物分布。
结果证实，pDNA/CS-TCA通过小肠，尤其是回肠吸收，并且还被吸收到肝脏中。这表明pDNA/CS-TCA遵循已知的牛磺胆酸体内循环途径，并且证实所产生的pDNA/壳聚糖-TCA既不干扰也不损害牛磺胆酸的体内摄取并维持牛磺胆酸的原始循环途径。
实施例9：包含聚酰胺胺-牛磺酸结合物和pDNA的纳米颗粒的制备(下文称为“pDNA/PAMAM-TCA”)
制备TCA-NPC
为了将TCA与壳聚糖结合，将TCA(50mmol)溶解在DMSO(10mL)中，然后向其中加入4-NPC(200mg)和TEA(100μg)，然后在室温下反应1小时，从而制备TCA-NPC。
制备PAMAM-TCA
将聚酰胺胺(100mg)溶解在HEPES缓冲液中，加入制备的TCA-NPC(20mg)，搅拌24小时。接下来，通过透析除去未反应的物质。用蒸馏水通过1-kDa膜滤器进行透析24小时。接下来进行冷冻干燥，从而获得最终产物PAMAM-TCA。
制备pDNA/PAMAM-TCA
将通过上述实验方法制备的PAMAM-TCA(150nmol至50nmol)和pDNA(1nmol)各自添加至HEPES缓冲液中。然后，搅拌制备的MAM-TCA溶液，同时每次加入10μl含有pDNA的HEPES缓冲液。在完全加入预定量的pDNA后，再搅拌10分钟，并完成反应，从而获得最终产物pDNA/PAMAM-TCA。
实施例10：包含聚-L-赖氨酸-牛磺酸结合物和pDNA的纳米颗粒的制备(下文称为“pDNA/PLL-TCA”)
制备TCA-NPC
为了将TCA与壳聚糖结合，将TCA(50mmol)溶解在DMSO(10mL)中，然后向其中加入4-NPC(200mg)和TEA(100μg)，然后在室温下反应1小时，从而制备TCA-NPC。
制备PLL-TCA
将聚L-赖氨酸(50mg)溶解于HEPES缓冲液中，加入制备的TCA-NPC(20mg)，搅拌24小时。然后，通过透析除去未反应的物质。用蒸馏水通过1-kDa膜滤器进行透析24小时。然后进行冷冻干燥，从而获得最终产物PLL-TCA。
制备pDNA/PLL-TCA
将通过上述实验方法制备的PLL-TCA(150nmol至50nmol)和pDNA(1nmol)分别添加至HEPES缓冲溶液中。接下来，搅拌制备的PLL-TCA溶液，同时每次加入10μl含有pDNA的HEPES缓冲溶液。在完全加入预定量的pDNA后，再搅拌10分钟，完成反应，从而获得最终产物pDNA/PLL-TCA。
实施例11：通过二硫键与TCA缀合的肝素的制备(下文称为'Hep-S-S-TCA')
Hep-S-S-TCA的合成从肝素与胱胺的缀合开始。即，肝素的羧基通过EDC(1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)/NHS(N-溴代琥珀酰亚胺)化学与胱胺的氨基结合。
制备Hep-S-S-NH2
将肝素(100mg)溶于10mL MES缓冲液(50mmol，pH6)中，并在冷浴中搅拌直至溶液变得透明。向其中加入过量的EDC(相对于肝素为2.4当量)，然后搅拌10分钟，之后在室温下加入过量的NHS(相对于EDC为2.5当量)，然后搅拌10分钟。在通过EDC和NHS活化羧基后，加入胱胺(100μg)，然后在pH 7下反应24小时。反应完成后，将反应溶液用双蒸水透析24小时并冷冻干燥，得到Hep-S-S-NH2(图9)。
制备TCA-NPC
为了将TCA与活化肝素结合，将TCA(50mmol)溶解在DMSO(10mL)中，然后向其中加入4-NPC(200mg)和TEA(100μg)，然后在室温下反应1小时，从而制备TCA-NPC(图10)。
制备Hep-S-S-TCA
然后，向其中加入溶解在DMSO(10mL)中的活化肝素(100μg)，在室温下反应24小时。将反应溶液用双蒸水透过透析膜(MWCO：1000Da)透析48小时，同时每3小时更换一次培养基。透析后，将反应产物冷冻干燥，得到Hep-S-S-TCA(产率：80±5％；图11和12)。
合成Hep-S-S-TCA以局部释放响应细胞内谷胱甘肽的治疗基因，图9至11说明了用于制备Hep-S-S-TCA的反应流程。通过1H NMR和TNBS分析定量和定性地测定胱胺与肝素的缀合(图12)。从该结果可以看出，TCA分子通过五个二硫键与每个肝素分子连接。
实施例12：通过二硫键、pDNA和鱼精蛋白制备包含与TCA缀合的肝素的纳米颗粒(以下称为pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA')
用实施例11的方法制备Hep-S-S-TCA。
制备pDNA/Prot
将鱼精蛋白(150nmol至50nmol)和pDNA(1nmol)分别加入HEPES缓冲溶液中。然后搅拌鱼精蛋白溶液，同时每次加入10μl含有pDNA的HEPES缓冲液。在完全加入预定量的pDNA后，再搅拌20分钟，完成反应，从而获得最终产物pDNA/Prot。
制备pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA
将Hep-S-S-TCA(20mg)和pDNA/Prot加入HEPES缓冲溶液中。然后，搅拌Hep-S-S-TCA溶液，同时每次加入1ml含有pDNA/Prot的HEPES缓冲溶液。在完全加入预定量的pDNA/Prot后，再搅拌30分钟，完成反应，从而获得最终产物pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA。
(通过电泳试验确认pDNA/Prot的产生)
电泳试验用于确认pDNA/Prot的产生，HEPES缓冲溶液用作背景条件。在1：0.5、1、2、3、4和6的重量比之间进行比较，从而确定最佳条件。
结果证实，制备的pDNA/Prot非常稳定，并且重量比为至少1：2是制备的最佳条件。
(通过粒度分析和表面电荷分析确认pDNA/Prot的产生)
粒度分析和表面电荷分析用于确认pDNA/Prot的产生，HEPES缓冲溶液用作背景条件。在1：0.5、1、2、3、4和6的重量比之间进行比较，从而确定最佳条件。
结果证实，制备的pDNA/Prot非常稳定，并且重量比为1：3是pDNA/Prot制备的最佳条件。
(通过电泳测定和粒度分析确认pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的产生)
电泳测定和粒度分析用于确认pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的产生，HEPES缓冲溶液用作背景条件。在1：3和4.5的重量比之间进行比较，从而确定最佳条件。
结果证实，制备的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA非常稳定，并且重量比为至少1：3是制备的最佳条件。
(使用TEM图像确认pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的合成)
将制备的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA置于硅片上，然后自然干燥，从而制备待分析的样品。使用透射电子显微镜分析样品。
结果，可以看出制备的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA是具有100nm大小的颗粒形状。此外，可以观察到表面上的Hep-S-S-TCA涂层，表明完全产生了pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA。此外，确认了所有观察到的颗粒也具有均匀的尺寸。
(pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA中基因的包封率的测定)
使用电泳测定法测定pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA中基因的包封率，并通过测定用于电泳的分离DNA的量来测定包封率。
结果证实，重量比为1：6显示的包封率为70％，这是最高的包封率，并且重量比为1：3显示的包封率为约15％。虽然1：6的重量比显示出的包封率最高，在确认通过电泳测定和粒度分析的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA产生的实验中，用于基因递送的优化的重量比设定为如上所述的1：3。
(通过电泳测定确认pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的稳定性)
电泳试验用于确认pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的稳定性，含有DNA酶(一种pDNA降解酶)的HEPES缓冲液用作背景条件。
结果证实，制备的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA有效地保护pDNA免受pDNA降解酶DNA酶的影响，并保持非常稳定的状态。
(使用共聚焦显微镜的细胞摄取实验)
MDCK-ASBT细胞用于检测所制备的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的细胞摄取。在实验方法中，将MDCK-ASBT细胞以105细胞/孔的浓度分配到8孔板中，然后注射罗丹明B-缀合的样品(pDNA/Prot和pDNA/Prot/Hep-SS-TCA)。温育2小时后，用PBS洗涤细胞三次，并使用共聚焦显微镜观察。
结果证实，尽管用作对照的pDNA/Prot由于其阳离子表面电荷也显示出轻微的摄取能力，但是产生的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA具有比对照pDNA/Prot更好的细胞摄取能力。
(使用共聚焦显微镜的细胞表达实验)
HepG2细胞用于评估制备的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA对细胞内表达的影响。在实验方法中，将HepG2细胞以105细胞/孔的浓度分配到8孔板中，然后注射eGFP缀合的样品(pDNA/Prot和pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA)。温育24小时后，用PBS洗涤细胞三次，并使用共聚焦显微镜观察。
结果证实，通过成功递送eGFP基因产生的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA具有绿色荧光，并且荧光强度显著高于对照pDNA/Prot的荧光强度。
(使用MDCK-ASBT细胞对pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA毒性的实验)
MDCK-ASBT细胞用于评估产生的pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的毒性，并且MTT测定用于毒性验证。
结果证实，Hep-S-S-TCA显示的存活率为90％或更高，并且pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA也显示出90％或更高的高存活率。
(使用Caco-2单层检查pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的细胞通透性)
为了确认pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的细胞渗透性，通过将Caco-2细胞培养为单层进行实验。实验总共进行6小时，并在10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和6小时收集样品并进行分析。
结果证实，pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA具有比对照pDNA/Prot/CSA-TCA更低的细胞渗透性，并且细胞渗透性与pDNA/Prot相似。这表明牛磺胆酸在Caco-2细胞中被二硫键(-S-S-)分离，并且只有牛磺胆酸渗透细胞，pDNA/Prot/Hep聚集在细胞内。
(口服给药后pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的体内生物分布的分析实验)
对于分析口服给药后pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA的体内生物分布的实验，使用罗丹明B-缀合的鱼精蛋白和7周龄Balb/c小鼠。禁食6小时后，将药物口服或静脉注射给小鼠，基于组织和细胞的荧光图像确定6小时时药物的体内生物分布。
结果证实，pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA通过小肠、尤其是回肠吸收，并且还被轻微吸收到肝脏中。这表明pDNA/Prot/Hep-S-S-TCA遵循已知的牛磺胆酸直至小肠的体内循环途径，并且二硫键(-S-S-)在小肠中分离，产生的pDNA/Prot/Hep在牛磺胆酸循环途径外的小肠中积累。
实施例13：通过二硫键与TCA缀合制备壳聚糖(下文称为'CS-S-S-TCA')
制备壳聚糖-S-S-COOH
将壳聚糖(100mg)溶解在10mL MES缓冲液(50mmol，pH6)中，并在冷浴中搅拌直至溶液变得透明。向其中加入过量的EDC(相对于壳聚糖为5当量)，然后搅拌10分钟，之后在室温下加入过量的NHS(相对于EDC为2.5当量)，然后搅拌10分钟。在通过EDC和NHS活化羧基后，加入半胱氨酸(500μg)，然后在pH 7下反应24小时。反应完成后，将反应溶液用双蒸水透析24小时并冷冻干燥，得到壳聚糖-S-S-COOH。
制备TCA-NH2
为了将TCA与活化的壳聚糖-S-S-COOH结合，将TCA(50mmol)溶解在DMSO(10mL)中，然后向其中加入4-NPC(200mg)和TEA(100μg)，然后在室温下反应1小时，从而制备TCA-NPC。
接下来，将制备的TCA-NPC(100mg)完全溶解在DMF中，并向其中加入30μl的4-MMP并反应4小时。然后，将1ml乙二胺加入到反应溶液中反应16小时，从而制备TCA-NH2。
制备CS-S-S-TCA
此后，加入溶解在DMSO(10mL)中的活化的壳聚糖-S-S-COOH(100μg)，然后在室温下反应24小时。将反应溶液用pH 7的双蒸水透过透析膜(MWCO：1000Da)透析24小时，同时每3小时更换一次培养基。透析后，将反应产物冷冻干燥，得到CS-S-S-TCA(产率：50％；图13和14)。
实施例14：包含通过二硫键与TCA缀合的壳聚糖和pDNA的纳米颗粒的制备(以下简称'pDNA/CS-S-S-TCA')
将CS-S-S-TCA(20nmol)和pDNA(1nmol)各自加入HEPES缓冲溶液中。然后，搅拌制备的CS-S-S-TCA溶液，同时每次加入10μl含有pDNA的HEPES缓冲溶液。在完全加入预定量的pDNA后，再搅拌10分钟，完成反应，从而获得最终产物pDNA/CS-S-S-TCA。
(通过电泳测定和粒度分析确认pDNA/CS-S-S-TCA的产生)
进行电泳测定和粒度分析以确认pDNA/CS-S-S-TCA的产生，并且使用HEPES缓冲溶液作为背景条件。在1：3和4.5的重量比之间进行比较，从而确定最佳条件。
电泳测定的结果表明制备的pDNA/CS-S-S-TCA非常稳定，并且使用至少1：5的重量比是制备的最佳条件。另外，基于粒径的变化，最佳重量比设定为1:50。
(pDNA/CS-S-S-TCA的pH稳定性实验)
为了证实所产生的pDNA/CS-S-S-TCA的稳定性，使用pH 5.2、pH 1.8和pH7.4的PBS缓冲溶液进行实验。在该实验中，通过测定时间依赖性大小来测定pDNA/CS-S-S-TCA的稳定性。具体地，在实验开始后即刻和实验开始后6、12、18和24小时，立即取样并分析pDNA/CS-S-S-TCA溶液。
结果证实，pDNA/CS-S-S-TCA在上述条件下显示出优异的稳定性。这表明由于牛磺胆酸(一种胆汁酸)的缀合，pH稳定性增加。
(使用MDCK-ASBT细胞对pDNA/CS-S-S-TCA的毒性试验)
MDCK-ASBT细胞用于评估产生的pDNA/CS-S-S-TCA的毒性，并且MTT测定用于毒性验证。
结果证实，pDNA/CS-S-S-TCA显示出90％或更高的高存活率。
(使用共聚焦显微镜的细胞摄取实验)
MDCK-ASBT细胞用于检查制备的pDNA/CS-S-S-TCA的细胞摄取。在实验方法中，将MDCK-ASBT细胞以105细胞/孔的浓度分配到8孔板中，然后注射罗丹明B-缀合的样品(pDNA/壳聚糖和pDNA/CS-S-S-TCA)。温育2小时后，用PBS洗涤细胞三次，并使用共聚焦显微镜观察。
结果证实，尽管用作对照的pDNA/壳聚糖由于其阳离子表面电荷也显示出轻微的摄取能力，但产生的pDNA/CS-S-S-TCA具有比对照pDNA/壳聚糖更好的细胞摄取能力。
(使用Caco-2单层检查pDNA/CS-S-S-TCA的细胞通透性)
为了确认pDNA/CS-S-S-TCA的细胞渗透性，通过将Caco-2细胞培养为单层进行实验。实验总共进行6小时，并在10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和6小时收集样品并进行分析。
结果证实，pDNA/CS-S-S-TCA具有比对照pDNA/CS-TCA更低的细胞渗透性，并且细胞渗透性与pDNA/壳聚糖相似。这表明牛磺胆酸在Caco-2细胞中被二硫键(-S-S-)分离，并且只有牛磺胆酸渗透细胞，pDNA/CS聚集在Caco-2细胞中。
(口服给药后pDNA/CS-S-S-TCA的体内生物分布分析的实验)
对于口服给药后分析pDNA/CS-S-S-TCA的体内生物分布的实验，使用罗丹明B-缀合的壳聚糖和7周龄Balb/c小鼠。禁食6小时后，将药物口服给予小鼠，并在6小时时基于荧光图像确定药物的体内生物分布。
结果证实，pDNA/CS-S-S-TCA通过小肠、特别是回肠吸收，还被轻微吸收到肝脏中。这表明pDNA/Prot/Hep-SS-TCA遵循已知的牛磺胆酸直至小肠的体内循环途径，并且二硫键(-S-S-)在小肠中分离，产生的pDNA/壳聚糖在牛磺胆酸循环途径外的小肠中积累。
实施例15：通过二硫键与TCA缀合制备鱼精蛋白(下文称为'Prot-S-S-TCA')
制备Prot-S-S-NH2
将半胱氨酸(10mmol)溶于10mL MES缓冲液(50mmol，pH6)中，并在冷浴中搅拌直至溶液变得透明。向其中加入过量的EDC(相对于半胱氨酸为2.4当量)，然后搅拌10分钟，之后在室温下加入过量的NHS(相对于EDC为2.5当量)，然后搅拌10分钟。通过EDC和NHS活化羧基后，加入鱼精蛋白(150mmol)，然后在pH7下反应24小时。反应完成后，将反应溶液用双蒸水透析24小时并冷冻干燥，得到Prot-S-S-NH2。
制备Prot-S-S-TCA
为了将TCA与活化的鱼精蛋白结合，将TCA(50mmol)溶解在DMSO(10mL)中，然后向其中加入4-NPC(200mg)和TEA(100μg)，然后加入活化的鱼精蛋白(100nmol)。接下来，使混合物在室温下反应1小时，从而产生Prot-S-S-TCA(图15)。
实施例16：包含通过二硫键与TCA缀合的鱼精蛋白和pDNA的纳米颗粒的制备(以下简称'pDNA/Prot-S-S-TCA')
将Prot-S-SCA(200μg)和pDNA(1μg)各自加入HEPES缓冲溶液中。然后搅拌制备的Prot-S-S-TCA溶液，同时每次加入10μl含有pDNA的HEPES缓冲溶液。在完全加入预定量的pDNA后，再搅拌10分钟，完成反应，从而获得最终产物pDNA/Prot-S-S-TCA(产率：80％；图16)。
(通过TNBSA试验和表面电荷测量确认Prot-S-S-TCA的合成)
TNBSA试验用于确定Prot-S-S-TCA的合成。更具体地，通过定量鱼精蛋白的氨基数来测量消耗的氨基数，即TCA的缀合速率。此外，使用ζ电位分析仪测量表面电荷。
结果证实，随着牛磺胆酸与鱼精蛋白的进料比增加，鱼精蛋白的氨基数减少，因此表面电荷也减少。这种变化出现在进料比例高达1:15的情况下，并且在进料比为1:15后没有出现显著变化。这表明牛磺胆酸与鱼精蛋白有效结合，最佳进料比为1:15。
(通过电泳测定、粒度分析和表面电荷分析确认pDNA/Prot-S-S-TCA的产生)
进行电泳测定、粒度分析和表面电荷测量以确认pDNA/Prot-S-S-TCA的产生，并且使用HEPES缓冲溶液作为背景条件。在1：5、25、50、100、150和200的重量比之间进行比较，从而确定最佳条件。
电泳测定的结果表明，产生的pDNA/Prot-S-S-TCA非常稳定，并且使用至少1：5的重量比是最佳制备条件。另外，基于粒径和表面电荷值的变化，将最佳重量比设定为1：200。
(pDNA/Prot-S-S-TCA的pH稳定性实验)
为了证实所产生的pDNA/Prot-S-S-TCA的稳定性，使用pH 5.2、pH 1.8和pH 7.4的PBS缓冲溶液进行实验。在该实验中，通过测定时间依赖性大小来测定pDNA/Prot-S-S-TCA的稳定性。具体地，在实验开始后即刻和实验开始后6、12和24小时，对pDNA/Prot-S-S-TCA溶液进行取样和分析。
结果证实，pDNA/Prot-S-S-TCA在上述条件下显示出优异的稳定性。这表明由于牛磺胆酸(一种胆汁酸)的缀合，pH稳定性增加。
(使用MDCK-ASBT细胞对pDNA/Prot-S-S-TCA毒性的实验)
MDCK-ASBT细胞用于评估产生的pDNA/Prot-S-S-TCA的毒性，并且MTT测定用于毒性验证。
结果证实，pDNA/Prot-S-S-TCA显示出90％或更高的高存活率。
(使用共聚焦显微镜的细胞摄取实验)
MDCK-ASBT细胞用于检查产生的pDNA/Prot-S-S-TCA的细胞摄取。在实验方法中，将MDCK-ASBT细胞以105细胞/孔的浓度分配到8孔板中，然后注射罗丹明B-缀合的样品(pDNA/Prot和pDNA/Prot-S-S-TCA)。温育2小时后，用PBS洗涤细胞三次，并使用共聚焦显微镜观察。
结果证实，尽管用作对照的pDNA/Prot由于其阳离子表面电荷也显示出轻微的摄取能力，但产生的pDNA/Prot-S-S-TCA具有比对照pDNA/Prot更好的细胞摄取能力。
(使用Caco-2单层检测pDNA/Prot-S-S-TCA的细胞通透性)
为了确认pDNA/Prot-S-S-TCA的细胞渗透性，通过将Caco-2细胞培养为单层进行实验。实验总共进行6小时，在实验开始后立即收集样品，并在10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和6小时收集样品并进行分析。
结果证实，pDNA/Prot-S-S-TCA具有比对照pDNA/Prot-TCA更低的细胞渗透性，并且细胞渗透性值与pDNA/Prot相似。这表明牛磺胆酸在Caco-2细胞中通过二硫键(-S-S-)分离，并且只有牛磺胆酸渗透细胞，pDNA/Prot-SH聚集在paco-2细胞中，与pDNA/Prot不同。
(确认通过基因表达产生的pDNA/Prot-S-S-TCA的基因递送能力)
荧光素酶测定用于验证pDNA/Prot-S-S-TCA的基因表达效应。使用pDNA、Prot、Prot-TCA和bPEI作为对照。
结果证实，pDNA/Prot-S-S-TCA比阴性对照(pDNA、Prot和Prot-TCA)有效2至10倍，并且具有与阳性对照bPEI类似的基因递送效果。
(口服给药后pDNA/Prot-S-S-TCA的体内生物分布分析的实验)
对于口服给药后分析pDNA/Prot-S-S-TCA的体内生物分布的实验，使用罗丹明B-缀合的鱼精蛋白和7周龄Balb/c小鼠。禁食6小时后，将药物口服给予小鼠，并在6小时时基于荧光图像确定药物的体内生物分布。
结果证实，pDNA/Prot-S-S-TCA通过回肠吸收，并未被吸收到肝脏中。这表明pDNA/Prot-S-S-TCA遵循已知的牛磺胆酸体内循环途径直至小肠，并且二硫键(-S-S-)在小肠中分离，产生的pDNA/Prot在牛磺胆酸循环途径外的小肠中聚集。作为证据，可以看出Prot-TCA在通过小肠后在肝脏中也显示出高的摄取率。
实施例17：透明质酸-TCA缀合物(HA-TCA)的制备
首先胺化TCA以诱导与HA的缀合。胺化TCA的合成如下。
制备TCA-NH2
在0℃下，将TCA(1mmol)溶解在DMF(二甲基甲酰胺)(5mL)中并搅拌直至溶液变得透明。依次加入TEA(6mmol)和4-NPC(5mmol)，在0℃下反应1小时，然后在室温下再搅拌反应溶液6小时。然后，将反应溶液以5000rpm离心，将颗粒分散在乙酸乙酯(20mL)中，转移到分液漏斗中，并用相同量的双蒸水萃取。收集水层，并使用旋转蒸发器除去剩余的有机溶剂。将残余物冷冻干燥48小时，从而获得TCA-NPC。
将形成的TCA-NPC(1mmol)溶解在DMF(5mL)中，然后向其中加入4-MMP(4-巯基-4-甲基戊烷-2-酮)(2mmol)，然后在50℃下搅拌60分钟。之后，将乙二胺(100mmol)滴加到该溶液中，然后在室温下反应16小时。向溶液中加入过量的丙酮，过滤生成的沉淀，然后冷冻干燥48小时，从而得到TCA-NH 2(图17)。
制备HA-TCA
通过EDC/NHS化学进行TCA与HA(透明质酸)的缀合。首先用EDC(200mg)在pH4和4℃下处理HA的羧基15分钟。然后，将NHS(100μg)加入到HA中并搅拌10分钟。接下来，添加TCA-NH 2(100μg)，然后在pH 7和室温下反应7小时。反应完成后，将反应溶液用双蒸水透过透析膜(MWCO：1000Da)透析24小时，然后冷冻干燥48小时，从而得到HA-TCA(产率：10％；图18)。
实施例18：肝素-TCA缀合物(Hep-TCA)的制备
除了使用Hep代替HA之外，以与实施例17中所述相同的方式制备Hep-TCA。
TCA的胺化有助于在TCA和HA或Hep之间形成稳定的酰胺键。如图18所示，1H NMR分析的结果表明，在δ8ppm处检测到TCA和HA之间的酰胺键缀合峰。
TNBS分析证实TCA成功胺化。这些结果表明每个TCA分子在其骨架中具有单个氨基。通过1H NMR分析证实Hep或HA与TCA的缀合(图18)。从约1.0至1.5ppm的峰确认了TCA部分的存在，并且从约3.5至3.9ppm的峰确认了HA部分的存在。另外，从8ppm的新峰开始，证实在TCA和HA之间形成稳定的酰胺键。
为了量化与Hep或HA缀合的TCA分子的数量，进行硫酸盐测定。用HA-TCA或Hep-TCA进行随后的实验，其中Hep或HA和TCA以1：5的比例缀合。另外，这些缀合物显示出负的ζ电位。
实施例19：Prot/GLP-1/HA-TCA的制备
将溶于10mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中的Prot(1mg/mL)用作储存溶液。通过将GLP-1编码基因(7.780mg)溶解在10mM HEPES缓冲液(pH7.4)(1.922mL)中来制备GLP-1基因溶液。在温和振荡下，将GLP-1基因溶液滴加到原液Prot溶液中，从而制备Prot/GLP-1离子复合物溶液。当Prot：GLP-1的摩尔比为1:20时，Prot/GLP-1离子复合物显示出正的ζ电位和强相互作用。
在温和振荡下，将Prot/GLP-1离子复合物以1：1(v/v)加入HA-TCA水溶液中，在室温下孵育30分钟，然后冷冻干燥得到prot/GLP-1/HA-TCA(产率：20％)。
实施例20：prot/GLP-1/Hep-TCA的制备
除了用Hep代替HA之外，以与实施例19中所述相同的方式获得prot/GLP-1/Hep-TCA。
制备在GLP-1和Prot之间具有不同摩尔比的Prot/GLP-1离子络合物。凝胶阻滞实验表明，编码GLP-1的基因以1:20的摩尔比与Prot缀合。
证实prot/GLP-1离子复合物在血清中是稳定的，即使Prot/GLP-1离子复合物涂有Hep-TCA或HA-TCA，Prot/GLP-1离子复合物在血清中仍然稳定而不失其结构稳定性。此外，TEM分析显示当用Hep-TCA或HA-TCA包被Prot/GLP-1离子复合物时，粒径从185nm增加到235nm。另外，在用Hep-TCA或HA-TCA包被Prot/GLP-1基因复合物后，在TEM显微照片中观察到透明包衣壳。
在各种pH条件下检测颗粒的稳定性。具体地，将颗粒添加到具有不同pH(pH 3，pH5和pH 7.4)的三种溶液中，类似于胃肠(GI)道的胃、十二指肠和回肠碎片的pH，并观察颗粒大小。结果证实，prot/GLP-1离子复合物在pH 3下不稳定，但由于包被多糖-TCA聚合物如Hep-TCA或HA-TCA，用多糖-TCA聚合物如Hep-TCA或HA-TCA包被的prot/GLP-1基因复合物显示出颗粒稳定性提高，在pH 3下稳定至24小时。这表明在用多糖-TCA聚合物包被后颗粒是稳定的。
实验例7：体外基因表达和Transwell研究
使用ASBT(顶侧钠依赖性胆汁盐转运蛋白)-过表达MDCK和Caco-2细胞系，观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。
将4μg的eGFP基因上样到实施例19和20的每一个中产生的基因递送纳米颗粒上，然后观察到细胞系的成功表达和绿色荧光。
此后，为了研究双层细胞培养技术中基因复合物的递送，在transwell板的顶端部分培养Caco-2单层，并在底部培养MDCK-ASBT细胞系。分析分别涂有HA-TCA和Hep-TCA的Prot/GLP-1/HA-TCA(实施例19)和Prot/GLP-1/Hep-TCA(实施例20)的递送。在Caco-2单层中，观察到来自Prot/GLP-1/HA-TCA(实施例19)和Prot/GLP-1/Hep-TCA(实施例20)的eGFP的最低表达。这表明壳在靶基因的释放中起重要作用。
用GLP-1 ELISA试剂盒量化响应于培养基中的葡萄糖水平的GLP-1的体外表达，结果，GLP-1编码基因的表达增加。
实验例8：Prot/eGFP/多糖-TCA基因复合物的体内生物分布
为了检测带有eGFP的Prot/GLP-1/HA-TCA(实施例19)和Prot/GLP-1/Hep-TCA(实施例20)的体内生物分布，进行以下实验。
将Balb/c小鼠圈养在木笼中并定期提供食物和水。在口服治疗性基因复合物之前12小时，将动物禁食。禁食12小时后，通过口服将含有100μgeGFP基因的每个样品给予动物。在给药后24小时，处死动物，并使用共聚焦显微镜定量基因的体内表达和样品的体内生物分布。
结果，由于HA-TCA或Hep-TCA，本发明的基因递送复合物显示eGFP基因在回肠和肝脏片段中的表达增加。
实验例9：GLP-1编码基因的体内表达和血糖水平的调节
将5周龄的ZDFR(Zucker糖尿病性肥胖大鼠)圈养在木笼中，并定期提供食物和水。在口服治疗性基因复合物之前12小时，将动物禁食。禁食12小时后，将100μgProt/GLP-1/HA-TCA(实施例19)和Prot/GLP-1/Hep-TCA(实施例20)各自口服给予动物。在给药后24小时的预定时间间隔，从每只动物的尾静脉取血，测量血液的葡萄糖水平。令人惊讶地证实，血糖水平被调节至正常血糖水平。5天后，处死实验动物，用ELISA试剂盒分析不同组织中GLP-1和胰岛素的表达。结果证实，与对照组相比，口服载有GLP-1的多糖-TCA基因复合物后，GLP-1肽和胰岛素蛋白的表达增加。
实验例10：胆汁酸介导的非病毒载体的体内毒性
将4周龄的斯泼累格·多雷(SD)大鼠圈养在木笼中，并定期提供食物和水。将100μg本发明的每种基因递送纳米颗粒，即prot/GLP-1/HA-TCA(实施例19)和prot/GLP-1/Hep-TCA(实施例20)以不同浓度口服和静脉内给予每只动物。以预定的时间间隔从实验动物取血，分析血液中的全血含量，并评估确定肝脏和肾脏毒性的生物学标记物的表达。结果，即使以非常高的浓度给药，本发明的基因递送纳米颗粒也几乎没有毒性。
在给药后7天，处死动物，进行回肠和肝脏碎片的免疫组织学检查。结果，在组织中没有观察到炎症，并且也观察到很小的毒性。
因此，可以看出本发明的基因递送纳米颗粒是安全和无毒的并且可以用于治疗糖尿病。
如上所述，尽管已经详细描述了本发明的实施例，本发明所属领域的技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以以各种形式修改本发明。因此，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对本发明的前述实施例进行修改。
工业适用性
本发明的用于基因递送的纳米颗粒是一种新型口服基因递送系统，其能够调节生物系统中的血糖水平和响应于摄入的膳食的胰岛素分泌，包含：与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和基因。
本发明的用于基因递送的纳米颗粒是用胆汁酸或其衍生物表面修饰的纳米颗粒，其中由于带负电荷的基因和阳离子聚合物之间的静电相互作用，包含包封在阳离子聚合物中的带负电荷的基因的离子络合物存在于纳米颗粒的核心中，其中与阳离子聚合物缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物位于纳米颗粒的表面上，同时具有亲水性阴离子基团。
此外，本发明的用于基因递送的纳米颗粒是用胆汁酸或其衍生物表面修饰的纳米颗粒，其中由于带负电的基因和阳离子聚合物之间的静电相互作用，包含在阳离子聚合物中包封的带负电的基因的离子络合物存在于纳米颗粒的核心中，并且其中离子络合物的阳离子聚合物和与具有亲水阴离子基团的胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的阴离子聚合物通过静电相互作用彼此缀合，因此，与阴离子聚合物缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物位于纳米颗粒的表面上，同时具有亲水性离子基团。
因此，本发明的用于基因递送的纳米颗粒通过阳离子聚合物和基因之间的直接物理结合来保护免受胃酸，可以安全地递送至小肠细胞，并且还可以用作靶向纳米颗粒，其使得GLP-1基因仅在小肠中的L-细胞中表达。
当用本发明的胆汁酸或其衍生物表面修饰的纳米颗粒用于将治疗基因递送至靶细胞时，其容易通过肠粘膜递送基因，同时，由于纳米颗粒核心中存在离子复合物，在胃肠道中非常稳定。这表明本发明的用于基因递送的纳米颗粒非常适合口服给药。
位于本发明的纳米颗粒表面上的胆汁酸可以抑制纳米颗粒的胃肠(GI)降解，并吸收小肠回肠中肠细胞膜的胆汁酸受体ASBT(顶侧钠胆汁酸转运蛋白)受体，从而将治疗基因递送到细胞中，因此纳米颗粒可以增加基因表达。
具体地，当使用的治疗基因是GLP-1、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒晰外泌肽-4时，位于本发明的纳米颗粒表面的胆汁酸和阳离子聚合物被肠细胞的谷胱甘肽酶和pH分离并进入门静脉，分离的治疗基因仅被递送至肠细胞核并表达大量的GLP-1、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒晰外泌肽-4，从而有效地表现出糖尿病治疗功效。因此，当向糖尿病小鼠模型口服给药时，本发明的用于基因递送的纳米颗粒通过分泌胰岛素，同时成功表达GLP-1、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒晰外泌肽-4，可以表现出降血糖作用，从而有效地预防或治疗糖尿病，特别是2型糖尿病。
序列表文本
SEQ ID NO 1：GLP-1编码序列(DNA序列)
<110> KB 生物医药株式会社
<120> 用于基因递送的口服纳米颗粒和包含其的药物组合物
<130> PCT2017-025
<150> KR 10-2016-0050955
<151> 2016-04-26
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 4755
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GLP-1 cDNA
<400> 1
ggtgggtttc atcgggtggg cccagcggga cagggccggg tgaaattagg gagggggctg 60
ggctggggcg caatggaggc cgagccaatc ccggactcct caatgccagc aaagcttctg 120
gcgccgccct gtctgaacct ggagcggctg ggaggatccc cctcccagga gaagccgagg 180
accccaggat gctgcagaat cagtgagagg tgcgtaaggc caaaccccat tccccggacc 240
ccgctagcac ttcaccacct ggctcagtga tcaaggggtc atgacctctc tttgctgggg 300
ttatcgagaa gtggcaattt tataatagtt actgaaactt acaaagaggt tctggtgccc 360
agagacactt ggggtcatct agggatcaga ggccatgcaa ttccatgtct ctggggctga 420
tgtaggcact ccccagggat catccagggg ttatggaggg caactcaata ataatgaaaa 480
tgataaaaat cgtaatcata ttatggcaag ccagcggcgt ggtggcgcgt gcctgtaagt 540
cccagctact cgggaggctg aggcggaagg atcggtcgag cccaggagtt ctaggctgca 600
ctgagtcctg atcacgcccc tgcactccag gcgggggtac agagtgaggc tcggtctcta 660
aaagaaacac aaagaaaaaa agtaaccttt ttctcgatcc tgcagccaga ggcttgatat 720
cctgcctcgg tcacctaggg cggtccctgc ctgggtgatc tacgggtgcc gtaaggggtt 780
gattgatgtg gagggctggg cgtgcctggg aggcccacag tgggcgaggt gagttgcaat 840
tactgcaact cttaaacctt ccacccagag ttagaaatga ctgaacctca ggtggggtgt 900
gtagcctgtc caagggtaca caaagagccg gcccaagttg gaaccccctg gccggctaaa 960
cccaggagtc acccaagaaa acgtgacccc actgcccttc tccccaggtc cctctggcct 1020
gcatgccagg agtcggtcac cgccctgtgc ttcctccaag agacagtgga gaggctgggt 1080
cagtcccctg cccaggacac cccggtcctg gggccttgct gggacccgat ggctctgggg 1140
actcagggcc gcctgctgct ggacagggat tccaaggaca cacagaccag gatcagccaa 1200
aagggccgcc gtctgcagcc cccggggact ccctcggccc caccccagag aaggccccgg 1260
aaacagctga acccctgccg gggcaccgag agagtggacc ctgggttcga gggggtgact 1320
ctgaagtttc agataaagcc ggactccagc ctgcagatca tccccacgta caggtagggg 1380
ccggctgggg ccaggccgcc ctttctccca gttacaacgc aaacaccagt gtgggaggta 1440
ggggtgctct ctggcgtcgg tgtggaccct cacctgtgct ctacgttaca cgtggcccag 1500
tctctggttg acaacttgag ctggtgccag atacagtcct gccgctcctg actcagtggc 1560
tccccactcc caatgtgaga cctggtctct ttaggaatca ggcctggcct tgcttaggct 1620
gcagctgcgg ctgcggtgat ttttcccaat aatgctaaca gctactattt gttggtagtg 1680
acaacaataa gaggttaaca ggcagtattt tatgtgtatg ggctcattca aaagcctggg 1740
gaggccgggc acagtggctc acgcctataa tcccatcact ttgggaggcc aaggcgagca 1800
gatcacctga agtcaggagt ttgagatcag cctggccaac atagtgaaac cccatgtcta 1860
ctaaaaatac aaaaaattag ctgggcgttg tagtgggtgc ctgtaatccc agctgctcag 1920
gaggctgagg caggagaatc gcttgaactc aggaggtgaa gtcttcagta agcagagata 1980
gcgccacctc actccagcct gagccacaga gtgggactca gtctcaaaaa aaaaaaaaaa 2040
actagctggg aatggtaatg ggcacctgta atcccagcta cttgggaggc tgaggcagga 2100
gaatcgcttg aacccaggag gtggaggttg cactgagcag agatggcacc actgcactcc 2160
agcctgggtg acagagcaag actccatccc cttaaaaaaa aaaaaaaaaa agctttggga 2220
agctgggcct ggtggctcac acctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa ggtgggagga 2280
ttgcatgagc ccaggagttc aagaccagcc tgggcaacat agtatgaccc ccagctctaa 2340
tttttaccta tttattgtta ttataaaaat tataattatg acttttttaa tcatgccgcc 2400
aaaacaatat tttttttttt ttttgagatg gagttgcact ctgtcgttca ggctggagtg 2460
caatgacaca atctcggctc actgcaacct ctgcctcccg gattcaaacg attctcctgc 2520
ctcagcctct ggagtagctg ggattacagg tgcctgctac cacgcctggc taatttttgt 2580
atttttagta gagatggggt tttgccatgt tggccgggat ggtctcgatc tcttgacctc 2640
aggtgatcca tctgccttgc cctcccaaag tgttgggatt acaggagtga gccgccacca 2700
tgcctggctg cttttttttg cttttgtttg tttgtttgtt tttgagacag ggtcttgctc 2760
tgtcacccag ggtggagtgc agtggcgcaa tcatggctca ctgcagcctg gacctcccag 2820
gcccaagcca tcctccctcc tcagcctccc aactagctgg gagtgcaggc ctgtaccacc 2880
actcctggct attttttttg tttgtagaga cggggtctcc ctatattgcc cagactccca 2940
tctcttttta aaaatcaata aatcaaattt tcaaagaaaa aaaaactgtt gtattgggaa 3000
gcccatttta cagatgagga aactgaggca cagagtagga gataatgtgt ccaggctcac 3060
acagcaagga catggagaac tgggattgga acctggcagg ctgtccctgt gcttactatt 3120
tttcaaataa taataataat aattaggtcg ggcacggtag ctcatgcctg taatccctgc 3180
actttgggag gccgaggtgg gtggatcact tgaggtcagg agttcgagac cagcctggcc 3240
aacatggtga aaccccgtct gtactaaaaa tacaaaaatt agctgggcgt ggtgtcgcgc 3300
gcctgtagtc ccagctgctt gggaggctga ggctcaagaa ttgcttgaac ccgggaggtg 3360
gaggttgtag tgagctgaga tgacaccact acactccagc ctgggcaaca gagcgagact 3420
ccatctgcaa aaataataat aataataata ataatattac taatgagagg caaagccagg 3480
ccattcagat attagttgcc tcctcggggg atggctgata ccttgatact aaatcttcat 3540
ttcggagggc tgttggggac aagctacaga tcccccccag tgctaatacc ttgtctgccc 3600
cacagcctgc cctgcagtag ccgttctcag gaatcccctg cagatgctgt tgggggccct 3660
gcagcccacc caggaggcac cgaggcccac tcagcaggca gcgaggccct gggtgagtcc 3720
tgaaaaccca agagctataa atattttggg ggccaatttc ctgtcttccc tgcctttctc 3780
cctgcccccc ccttctccat cttgcttccc catttagagc cctcagggag gagtcgcagc 3840
acccccctcc acttgggctg agtcaccccc acccccagct tcctcctctg cggaatgctg 3900
ccatctgtct cccttcctgg ctttgctgtg gcttagagct ggcaactccc agggctgatc 3960
cagagctagg tggggccttt actgagaccc ccacaaaatg cccgactccg cacaggcatc 4020
ccgagctcac atgcttggcc tctgacccct gccctttgac ctctgaccct tcagagcccc 4080
ggcgctgtgc ttcctgtcgg acccagagga ccccgctctg gagagacgct gaagatggga 4140
cccctctctg caacgcctgt gggatcaggt ccttagaatg gaggagggag ttggggcggg 4200
ggtccccaaa tcagtccacg tgtaaccagg atggcctgtg gggaaagcaa aaagcaaaac 4260
acctacctct tgggaaaagt ggtttccttg tggcggtttc cgggccccca ctgcatccta 4320
aatggcagtt tcttgtcccc caaccctagg tacaagaaat acggcactcg ctgctccagc 4380
tgctggctgg tgcccaggaa aaatgtccag cccaagaggc tatgtggcag atgtggagtg 4440
tccctggacc ccattcagga aggttaaacc cagcttcacc ctgctgagct gctgcttctg 4500
cctccgtttc accagtggga gaatgggcag aagcagctct cctaggagga ttggggaaag 4560
agccggcctg cctcctctct gccatctcca gattcaagga tcccggggga agacccaggc 4620
ctcaggtggc agagcctgct aggggtcacc agccccttct ccagtcagcc ttggccgagg 4680
ccccctcagg agacgctctc aggaaggatg agcattgtta cagcagggac aataaagtac 4740
agagatatgc cgaga 4755

Claims (18)

1.一种用于基因递送的纳米颗粒，其包含：至少一种与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和基因，其中所述缀合的胆汁酸或胆汁酸衍生物具有离子基团。
2.如权利要求1所述的基因递送的纳米颗粒，其中所述离子聚合物是阳离子聚合物。
3.如权利要求2所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中所述阳离子聚合物选自下组：壳聚糖、乙二醇壳聚糖、鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸(PLL)和聚酰胺胺(PAMAM)。
4.如权利要求1所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中所述离子聚合物是阴离子聚合物。
5.如权利要求4所述的基因递送的纳米颗粒，其中所述阴离子聚合物选自下组：肝素、透明质酸和硫酸软骨素。
6.如权利要求4所述的用于基因递送的纳米颗粒，还包含阳离子聚合物。
7.如权利要求6所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中所述阳离子聚合物选自下组：壳聚糖、乙二醇壳聚糖、鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸(PLL)和聚酰胺胺(PAMAM)。
8.如权利要求1所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物是通过二硫键缀合的离子聚合物。
9.如权利要求1所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中所述胆汁酸或胆汁酸衍生物选自下组：脱氧胆酸、牛磺酸脱氧胆酸、牛磺胆酸(TCA)、甘氨胆酸和甘氨鹅去氧胆酸。
10.如权利要求9所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中所述胆汁酸或胆汁酸衍生物是牛磺胆酸(TCA)。
11.如权利要求1所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中所述基因是选自下组的至少一种：单链或双链DNA(脱氧核糖核酸)、单链或双链RNA(核糖核酸)、质粒DNA(pDNA)、反义寡核苷酸、核酶、催化RNA和核苷酸。
12.如权利要求11所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中所述基因是选自下组的至少一种：胰高血糖素样肽-1(GLP-1)基因、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽和毒晰外泌肽-4。
13.如权利要求1所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中所述胆汁酸或胆汁酸衍生物和所述离子聚合物以1：1至1：300的摩尔比相互缀合。
14.如权利要求1所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的尺寸为500nm或更小。
15.如权利要求1所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物和基因以1：1至1：200的摩尔比相互键合。
16.如权利要求1所述的用于基因递送的纳米颗粒，其中纳米颗粒的N/P比(与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物的氮原子数/基因的磷原子数)为1至200。
17.一种用于治疗糖尿病的药物组合物，其包含用于基因递送的纳米颗粒作为活性成分，其中所述纳米颗粒包含：至少一种与胆汁酸或胆汁酸衍生物缀合的离子聚合物；和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)基因、GLP-1肽、GLP-1变体、GLP-1衍生物、GLP-1激动剂、利拉鲁肽或毒晰外泌肽-4，其中所述缀合胆汁酸或胆汁酸衍生物具有离子基团。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于口服给药。
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