JP2019514902A - 経口投与用遺伝子伝達のためのナノ粒子およびこれを含む薬学組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、摂取された食事を感知し、生物学的システム内の血糖数値とインスリン分泌を調節できる新たな経口遺伝子伝達システムで経口投与用遺伝子伝達のためのナノ粒子に関し、より詳細には、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子を含む遺伝子伝達用ナノ粒子およびこれを含む薬学組成物に関する。【選択図】図1
Description
本発明は、効率的な経口投与用遺伝子伝達のための標的型ナノ粒子に関し、より詳細には、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子を含む遺伝子伝達用ナノ粒子およびこれを含む薬学組成物に関する。また、本発明は、標的にしようとする小腸細胞に遺伝子や治療タンパク質を伝達して副作用を最小化し、現在の治療技術の効率性を提供するための遺伝子伝達用ナノ粒子およびこれを含む薬学組成物に関する。
治療遺伝子を体内の所望する臓器に伝達して細胞内で新しいタンパク質を発現させることで疾病を治療する遺伝子治療(gene therapy)は、疾病の症状を治療するのではなく、疾病の原因を除去して治療する方式である。遺伝子治療は、一般的な薬物による治療に比べて優れた選択的治療効果を有し、他の治療法では調節しにくい疾病の治療率および治療速度を改善して長期間適用することができる。
遺伝子治療は、多様な疾病治療のために記載されている次世代治療技術であるが、巨大分子であるDNA、RNAなどを水溶液状態で細胞内に伝達する場合、生体内の特定酵素によって急速に分解され細胞伝達率が低くて、遺伝子治療を効果的にするためには、治療遺伝子を所望する標的細胞に安全に伝達して高い発現効率が得られるようにする遺伝子伝達体(gene carrier)を開発することが必須である。
遺伝子伝達体は、毒性が低かったりなければならず、遺伝子を選択的で効果的に所望する細胞に伝達できなければならない。このような遺伝子伝達体は、大きく、ウイルス性と非ウイルス性とに分けられる。
ウイルス性ベクター(viral vector)は、レトロウイルス(RV;Retro Virus)、アデノウイルス(AV;Adeno Virus)、アデノ随伴ウイルス(AAV;Adeno Associated Virus)などを遺伝子伝達体として用いたものであって、非ウイルス性ベクター(non−viral vector)に比べて遺伝子伝達効率が高いのに対し、体内適用時、ベクター自体が誘発する免疫反応や癌誘発などが問題となり、ベクターに挿入可能な遺伝子の大きさにも制限がある。
高分子やナノ粒子などの非ウイルス性ベクターは、ウイルス性ベクターによる生物学的危険性が低く、非免疫原性であり、変形および大量生産が可能であり、伝達可能な遺伝子の大きさにも比較的制限がないという利点のため、最近多くの研究が行われている。特に、陽イオン性高分子などの非ウイルス性ベクターを用いる方法が、製造方法の簡便性や相対的に低い危険性のため、多く研究されている。具体的なメカニズムは、負電荷を帯びている遺伝子と静電的相互作用によって複合体を形成して遺伝子を安定化させ、複合体表面の正電荷と細胞表面の負電荷が電気的相互作用によって複合体が細胞表面に結合した後、エンドソーム(endosome)から細胞質に遺伝子が放出される過程を経る。
このような陽イオン性高分子の具体例としては、プロタミン、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリアミドアミン(polyamidoamine)、ポリ−L−リシン(PLL)、ポリアミノエステル、ポリプロピレンイミンのような陽イオン性単一重合体、およびポリエチレングリコール(PEG)−ブロック−ポリL−リシンおよびPEG−PEIのような陽イオン性ブロック共重合体などが挙げられ、これらは、DNAなどの遺伝子を圧縮してナノ粒子を形成することにより酵素分解から遺伝子を保護し、速やかに細胞内に侵入してエンドソーム(endosome)から抜けられるように助ける。
大部分の非ウイルス性ベクターは、ウイルス性ベクターに比べて生分解性、低い毒性、非免疫原性、使用上の簡便さなどの利点を有するが、ウイルス性ベクターに比べて相対的に低い形質導入効率、制限的な粒子サイズなどの問題点がある。
現在、非ウイルス性ベクターとして最も広範囲に研究されているポリエチレンイミン(PEI)も、生体内の形質導入効率が著しく低下し、高い細胞毒性および低い血液適合性による遺伝子の低い発現効果などの問題点がある。
一方、韓国公開特許第10−2010−0122405号は、親水性高分子と疎水性高分子が結合した複合体である両親性高分子ナノ粒子にsiRNAを結合させたsiRNA伝達体で、親水性高分子としてキトサンとポリエチレンイミドそれぞれを、胆汁酸の5−β−コール酸(5−β−cholanic acid)と結合させて複合体を生成した後、それぞれの複合体を混合して製造されたナノ粒子形態の両親性高分子ナノ粒子を開示している。特に、前記文献は、胆汁酸の疎水性基とキトサン、ポリエチレンイミン(PEI)の親水性基による両親性によって水系で球形の自己集合体を形成し、これによって、キトサン−胆汁酸/ポリエチレンイミン(PEI)−胆汁酸の複合体ナノ粒子は、表面には強い両親性を帯びるポリエチレンイミンとキトサンが、内部(core)には疎水性の胆汁酸が位置していることを開示している。しかし、PEIの毒性の深刻性のため、臨床実験にはたどり着けずにいる。
したがって、安全で効率的な遺伝子伝達のために、既存の非ウイルス性ベクターの利点はそのまま維持しつつ、形質導入(transfection)効率を増強させた遺伝子伝達体の開発が切実に求められている。
一方、糖尿病(diabetes mellitus)は、インスリンの分泌量が不足したり正常な機能が行われず、血中ブドウ糖の濃度が高くなる代謝疾患で、インスリンがうまく分泌しなかったり、分泌したインスリンが体内でうまく作用せず体内の血糖が調節できずに上昇する場合を、第2型糖尿病といい、膵臓でインスリンを分泌せずに血糖が上昇する場合を第1型糖尿病という。第1型糖尿病の場合には、必ずインスリン投与治療が必要である。第2型糖尿病の場合には、生活習慣の見直しを基本とし、追加的に経口用血糖降下剤の投与が必要になりうる。飲み薬の場合、1日1〜3回服用し、薬の作用時間に応じて、飲む時間や副作用などが少しずつ異なる。
現在、糖尿病の治療法としては、食事療法、運動療法、スルホニルウレア剤、ビグアナイド(biguanide)系薬物、α−グルコシダーゼ抑制剤、インスリンなどが用いられており、新たな薬物の開発に対する多くの研究を通して多様なインスリンなどが開発されて臨床に適用されている。
一方、インスリン分泌ペプチドの一種であるグルカゴン様ペプチド−1(Glucagon like peptide1、GLP−1)は、回腸と大腸のL−細胞から分泌するインクレチン(incretin)ホルモンである。グルカゴン様ペプチド−1の主な作用は、インスリン分泌を増加させ、ブドウ糖の濃度に応じたインスリン分泌(Glucose dependent secretion)が行われて低血糖が発生しない。この特徴から第2型糖尿病の治療方法に適用されるが、血中半減期が2分前後と非常に短いため、薬剤としての開発に大きな制約がある。これによって、開発されて市販されるグルカゴン様ペプチド−1(Glucagon like peptide−1)作用剤(アゴニスト)としては、アメリカドクトカゲ(glia monster)の唾液腺から精製されたグルカゴン様ペプチド−1類似体であるエキセンディン(Exendin)−4がある。これは、DPP−IV(Dipeptidyl peptidase−4)に対する抵抗性とともに、グルカゴン様ペプチド−1より高い生理活性を有し、よって、体内半減期が2〜4時間とグルカゴン様ペプチド−1に比べて長くなった体内半減期を有する(US5,424,286)。しかし、DPP−IVの抵抗性を増加させる方法だけでは十分な生理活性の持続期間を期待することができないが、例えば、現在市販のエキセンディン−4(エキセナチド、exenatide)の場合、患者に1日2回注射により投与されなければならず、投与による嘔吐誘発およびムカムカ現象が患者に大きな負担として作用するというデメリットが依然として残っている。
しかし、これらの治療剤は、薬効が低かったり、肝機能障害、低血糖、乳酸血症などといった多くの副作用を起こす問題点がある。したがって、既存の糖尿病治療剤の副作用を低減し、代謝異常症状などを改善させ、長期服用時にも安全性に優れた糖尿病治療剤へのニーズがある。
そして、このような問題を解決するために、ウイルス伝達体を用いた技術が浮上したが、この技術は非特異的免疫反応などの危険性にさらされており、生産工程が複雑で商用化に多くの問題点がある。したがって、最近の研究方向は、非ウイルス性伝達体、すなわち、陽イオン性脂質や高分子を用いた伝達体を用いる方向へ進んでいる。このような非ウイルス性伝達体の効率はウイルス性伝達体に及ばないものの、生体内の安定性と生産工程が容易で価格が安いという利点がある。しかし、高分子と遺伝子を用いて混合物を作ろうとする際に、遺伝子特有の硬い性質と弱陰イオン性によって混合物の形成に大きな困難を覚える。
そこで、本発明者らは、上記の問題点を解決するために研究努力した結果、胆汁酸または胆汁酸誘導体が表面修飾されたイオン性高分子および遺伝子を含みかつ、遺伝子伝達用ナノ粒子のコアにイオン性高分子と遺伝子のイオン複合体を含み、ナノ粒子の表面に親水性のイオン性基を有する胆汁酸または胆汁酸誘導体が位置することにより、体内での安定性を向上させることができ、生体内での毒性を最小化して上記の副作用を減少させることができ、経口投与に関連する障害を克服できることを見出して、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、細胞内で目的の位置に治療遺伝子を効果的に伝達可能な遺伝子伝達用ナノ粒子であって、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した1種以上のイオン性高分子;および遺伝子を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記遺伝子伝達用ナノ粒子を有効成分として含む糖尿病治療用薬学組成物を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明は、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した1種以上のイオン性高分子および遺伝子を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を提供する。
本発明の一実施形態において、前記イオン性高分子は、陽イオン性高分子であってもよい。
本発明の一実施形態において、前記陽イオン性高分子は、キトサン、プロタミン、ポリ−L−リシン(PLL:poly−L−lysine)およびポリアミドアミン(PAMAM:polyamidoamine)からなる群より選択される。
本発明の一実施形態において、前記イオン性高分子は、陰イオン性高分子であってもよいし、この場合、陽イオン性高分子をさらに含む。
本発明の一実施形態において、前記陰イオン性高分子は、ヘパリン(heparin)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)およびコンドロイチン硫酸(chondroitin sulfate)から選択され、前記陽イオン性高分子は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリ−L−リシン(PLL:poly−L−lysine)およびポリアミドアミン(PAMAM:polyamidoamine)からなる群より選択される。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子は、二硫化結合により共有結合したものであってもよい。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸またはその誘導体は、デオキシコール酸(deoxycholic acid)、タウロデオキシコール酸(taurodeoxycholic acid)、タウロコール酸(TCA:taurocholic acid)、グリココール酸(glycocholic acid)およびグリコケノデオキシコール酸(glycochenodeoxycholic acid)からなる群より選択され、より好ましくは、タウロコール酸(TCA:taurocholic acid)である。
本発明の一実施形態において、前記遺伝子は、単鎖または二重鎖DNA(deoxyribonucleic acid)、単鎖または二重鎖RNA(ribonucleic acid)、プラスミド形DNA(plasmid DNA;pDNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、リボザイム、触媒的RNAおよびヌクレオチドの中から選択された1つ以上であってもよい。好ましくは、前記遺伝子は、プラスミド形DNA(pDNA)およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの中から選択された1つ以上であってもよい。さらに好ましくは、前記遺伝子は、グルカゴン様ペプチド−1遺伝子(GLP−1、Glucagon like peptide−1 gene)、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)であってもよい。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸またはその誘導体は、イオン性高分子の官能基数に応じて共有結合する程度が異なるが、好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体とイオン性高分子は、1:1〜1:300のモル比で共有結合してもよい。
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子は、粒子サイズに関係なく吸収可能であるが、好ましくは、500nm以下の粒子サイズを有することができる。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子は、1:1〜1:200のモル比で結合してもよい。
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子のN/P比(胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子の窒素原子の個数/遺伝子のリン酸塩原子の個数)は、1〜200であってもよい。
また、本発明は、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した1種以上のイオン性高分子およびグルカゴン様ペプチド−1(GLP−1、Glucagon like peptide−1)、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を有効成分として含む糖尿病治療用薬学組成物を提供する。
本発明の一実施形態において、前記組成物は、経口投与用であってもよい。
本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、摂取された食事を感知し、生物学的システム内の血糖数値とインスリン分泌を調節できる新たな経口遺伝子伝達システムであって、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子を含む。
本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、負電荷の遺伝子と陽イオン性高分子の静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に負電荷の遺伝子が封入されたイオン複合体がナノ粒子のコア部分に存在し、前記陽イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性の陰イオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸またはその誘導体が表面修飾された形態のナノ粒子である。
また、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、負電荷の遺伝子と陽イオン性高分子の静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に負電荷の遺伝子が封入されたイオン複合体がナノ粒子のコア部分に存在し、前記イオン複合体の陽イオン性高分子と、親水性の陰イオン性基を有する胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陰イオン性高分子が静電的相互作用で結合して前記陰イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性のイオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸またはその誘導体が表面修飾された形態のナノ粒子である。
したがって、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、陽イオン性高分子と遺伝子を直接的な物理的な結合により胃酸から防御をし、安全に小腸細胞に伝達することができ、また、小腸細胞内にGLP−1遺伝子を発現するL−Cellでのみ発現させる標的型ナノ粒子として用いることができる。
治療遺伝子を標的細胞に伝達するために、本発明の胆汁酸またはその誘導体が表面修飾されたナノ粒子を用いる場合、腸粘膜を通して遺伝子をよく伝達すると同時に、ナノ粒子のコアに存在するイオン複合体によって胃腸管で非常に安定している。これから、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、経口投与用に非常に好適であることが分かる。
本発明に係るナノ粒子の表面に修飾された胆汁酸によってナノ粒子のGI分解を抑制し、小腸の回腸部分で腸細胞膜の胆汁酸受容体であるASBT(apical sodium bile acid transporter)受容体を吸収して細胞内に治療遺伝子を伝達可能で、向上した遺伝子発現を示すことができる。
特に、治療遺伝子として、GLP−1、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)を用いた場合、腸細胞内の酵素であるグルタチオンおよびpHによって、本発明に係るナノ粒子の表面に修飾された胆汁酸と陽イオン性高分子が分離されてportal veinに入り、分離された治療遺伝子は腸細胞の核にのみ伝達されて、多量のGLP−1、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)が発現して糖尿病治療効能を効率的に示す。したがって、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、糖尿病マウスモデルへの経口投与時、成功したGLP−1、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)を発現させると同時に、インスリンを分泌させて血糖降下効果を示し、糖尿病、特に第2型糖尿病を効果的に予防または治療することができる。
以下、本発明についてより具体的に説明する。この時、使われる技術用語および科学用語において別の定義がなければ、この発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が通常理解している意味を有し、下記の説明において本発明の要旨を不必要にあいまいにしうる公知の機能および構成に関する説明は省略する。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、新たな経口遺伝子伝達システムであって、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した1種以上のイオン性高分子;および遺伝子;を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を提供する。
遺伝子は、陰イオンに帯電した巨大な高分子鎖形態で、遺伝子単独で存在する場合、比較的体積の大きいランダムコイルの形態を帯びていて遺伝子を細胞内に伝達しにくいことから、このような遺伝子との静電的相互作用によってナノサイズのイオン複合体を形成できる陽イオン性高分子を使用する。
本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、遺伝子とイオン性高分子のイオン複合体を含み、陰イオン性の遺伝子とイオン複合体を形成するイオン性高分子は、必ず陽イオン性高分子であり、前記陽イオン性高分子は、胆汁酸と共有結合した形態であってもよい。
本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陽イオン性高分子および遺伝子の間の静電的相互作用で形成されたり、胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陰イオン性高分子、陽イオン性高分子および遺伝子の間の静電的相互作用で形成されたもので、より安全に遺伝子の細胞内在化を誘導することができる。
すなわち、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、陽イオン性高分子と遺伝子のイオン複合体がナノ粒子のコアに存在し、親水性のイオン性基を有する胆汁酸がナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸が表面修飾された形態のナノ粒子である。
治療遺伝子を標的細胞に伝達するために、本発明の胆汁酸が表面修飾されたナノ粒子を用いる場合、腸粘膜を通して遺伝子をよく伝達すると同時に、ナノ粒子のコアに存在するイオン複合体によって胃腸管で非常に安定している。これから、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、経口投与用に非常に好適であることが分かる。
本発明の一実施形態において、前記イオン性高分子は、陽イオン性高分子であってもよい。前記イオン性高分子が陽イオン性高分子の場合、負電荷の遺伝子は、陽イオン性高分子と静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に封入されたイオン複合体を形成し、形成されたイオン複合体は、ナノ粒子のコア部分に位置し、陽イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性のイオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する。
本発明の一実施形態において、前記陽イオン性高分子は、毒性がない重量平均分子量100〜100,000の高分子で、例えば、キトサン(chitosan;CS)、グリコールキトサン、プロタミン(protamine;Prot)、ポリ−L−リシン(PLL:poly−L−lysine)およびポリアミドアミン(PAMAM:polyamidoamine)からなる群より選択され、好ましくは、キトサン(CS)、プロタミン(Prot)、ポリ−L−リシン(PLL)またはポリアミドアミン(PAMAM)であってもよい。
キトサン(chitosan)は、(1−>4)2−amino−2−deoxy−β−D−glucanの構造を有する天然に存在する非常に安全な陽イオン性多糖類である。キトサンは、天然の甲殻類などから得られるキチン(chitin)をN−脱アセチル化して製造される塩基性多糖類であって、生分解性、生体適合性および低い細胞毒性を示すことが知られている。本発明では、好ましくは、生分解性、生体適合性に優れた天然高分子である水溶性キトサンまたはグリコール基が導入されて水溶性がさらに増大したグリコールキトサンを使用することができる。
プロタミン(protamine)は、アルギニンが豊富な天然の陽イオン性タンパク質であって、動物の精巣のうち、特にサケを含んだ魚類の精子核に多く存在し、ヒストンのようにDNAと会合または解離により遺伝情報の発現に関与するタンパク質として知られている。通常、魚類の精子核から抽出されるプロタミンの分子量は約4,000〜10,000であり、構成アミノ酸の70%以上がアルギニンで存在するが、発明がこれに制限されるものではない。本発明のプロタミンは、プロタミン自体およびその薬剤学的に許容可能な塩をすべて含む。具体的には、本発明のプロタミンの塩は、塩酸塩または硫酸塩を含む酸性物質による塩形態を包括する。プロタミンは、塩形成なくても水に溶解可能であり、塩形態も水に溶解可能なため、いかなる形態でも使用可能である。
ポリ−L−リシン(PLL:poly−L−lysine)は、生分解性のペプチド結合で連結されていて遺伝子とイオン複合体を形成して細胞内に伝達できるが、やや毒性を示すので、単独で高い伝達効率を示すには限界があり、エンドソーム破壊物質やエンドソーム融合ペプチドなどを付着させて使用することができる。
本発明の一実施形態において、前記イオン性高分子は、陰イオン性高分子であってもよいし、この場合、遺伝子とのイオン複合体を形成するために、必ず陽イオン性高分子をさらに含む。すなわち、負電荷の遺伝子は、陽イオン性高分子と静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に封入されたイオン複合体を形成し、形成されたイオン複合体は、ナノ粒子のコア部分に位置する。前記陰イオン性高分子は、イオン複合体の陽イオン性高分子と静電的相互作用で結合しており、前記陰イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性のイオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する。
本発明の一実施形態において、前記陰イオン性高分子は、ヘパリン(heparin)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)およびコンドロイチン硫酸(chondroitin sulfate)から選択され、前記陽イオン性高分子は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリ−L−リシン(PLL:poly−L−lysine)およびポリアミドアミン(PAMAM:polyamidoamine)からなる群より選択される。
ヘパリンは、ヒドロキシ基、カルボキシル基およびアミノ基を含む構造で、非分画ヘパリン、高分子量ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリン断片、組換えヘパリン、ヘパリン類似体、ヘパランスルフェート、ヘパリン活性を有するスルホン化された多糖類などを使用することができる。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸またはその誘導体は、前記イオン性高分子と共有結合可能な官能基のほか、親水性の陰イオン性基を有するもので、デオキシコール酸(DCA:deoxycholic acid)、タウロデオキシコール酸(taurodeoxycholic acid)、タウロコール酸(TCA:taurocholic acid)、グリココール酸(glycocholic acid)およびグリコケノデオキシコール酸(glycochenodeoxycholic acid)からなる群より選択され、より好ましくは、親水性の陰イオン性基が4つ以上存在するタウロコール酸(TCA)であってもよい。
前記胆汁酸は、小腸の回腸部分を通して95%以上の高い効率で吸収されて肝に吸収されるが、これを「腸肝循環(enterohepatic circulation)」といい、このような腸肝循環で脂質移動に重要な役割を果たす生物学的界面活性剤で、末端の腸部分に存在するASBT(apical sodium−dependent bile acid transporter)によって特異的に認識されるため、経口伝達において標的リガンドとして作用できる。
すなわち、回腸部分を通して吸収が行われる胆汁酸は、前記遺伝子伝達用ナノ粒子の表面に位置することにより、ASBTを通して既存の経口投与方式の最大の問題点である腸内壁を通した前記遺伝子伝達用ナノ粒子のターゲット細胞内の吸収を増大させる役割を果たす[図1]。これによって、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、胆汁酸を吸収する回腸部分を通して吸収が容易であるので、経口用に使用可能であり、これによって、薬物の生体内利用率を増大させることができる。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子は、二硫化結合により共有結合したものであってもよい。
二硫化結合(S−S)は、腸細胞から多く分泌するグルタチオン(glutathione)に敏感に反応し分離されやすい傾向をもっていて、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子が腸細胞に接近した時、大部分が分離され細胞内に遺伝子のみがL−CELLの核内に入る。このように入った遺伝子は発現してGLP−1ペプチドを発現して損傷した機能を回復させる機能を行い、他の臓器や細胞への無分別な伝達を最小化するための役割を果たしたりする。
本発明の一実施形態において、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子に結合可能な遺伝子の種類は特に限定されず、本発明の目的に応じて所望する標的に伝達されて所望する治療効果を発揮できるいかなる遺伝子も本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明の遺伝子としては、疾病に関連する治療遺伝子の正常遺伝子、標的タンパク質の発現抑制遺伝子、アンチセンスポリヌクレオシドを含む大小のポリヌクレオシド、リボザイムやsiRNAを含む任意のRNA形態の遺伝子が含まれる。具体的には、単鎖または二重鎖DNA(deoxyribonucleic acid)、単鎖または二重鎖RNA(ribonucleic acid)、プラスミド形DNA(plasmid DNA;pDNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、リボザイム、触媒的RNAおよびヌクレオチドの中から選択された1つ以上であってもよい。好ましくは、前記遺伝子は、プラスミド形DNA(pDNA)およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの中から選択された1つ以上であってもよい。前記遺伝子は、遺伝子薬物であってもよいし、ここで、遺伝子薬物は、1つ以上の疾病治療または予防を薬効として示す遺伝子を意味する。
前記遺伝子は、インスリン分泌性ペプチドで、GLP−1をコーディングする遺伝子であってもよいし、好ましくは、グルカゴン様ペプチド−1遺伝子(GLP−1、Glucagon like peptide−1 gene)、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)であってもよい。
本発明において、「GLP−1遺伝子」、「GLP−1変異体」の用語は、当該遺伝子をコーディングする前記核酸(DNA)分子を称するものとして使われる。その他、GLP−作用剤、リラグルチドまたはエキセンディン−4なども遺伝子の並びを意味する場合には、当該ペプチドまたはタンパク質をコーディングする核酸(DNA)分子を称するものとして使われる。
前記GLP−1遺伝子、GLP−1変異体またはGLP−1誘導体は、環状(circular)または線状(linear)プラスミドにすべて含まれて発現できる。前記GLP−1変異体は、GLP−1(7−34)、GLP−1(7−35)、GLP−1(7−36)、Val8−GLP−1(7−37)、Gln8−GLP−1(7−37)、D−Gln9−GLP−1(7−37)、Thr18−Lys18−GLP−1(7−37)、Lys18−GLP−1(7−37)、His7−GLP−1(7−37)、Ser8−GLP−1(7−37)またはTyr8−GLP−1(7−37)として例示され、これらの配列リストは、US2013−0210717A1に公知である。前記GLP−1遺伝子、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)を用いて遺伝子伝達用ナノ粒子として複合化して生体内投与時に優れた血糖低下効果を得ることができ、これによって、糖尿病、特に第2型糖尿病を効果的に治療または予防することができる。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸またはその誘導体は、イオン性高分子の官能基数に応じて共有結合する程度が異なる。好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体およびイオン性高分子は、1:1〜1:300のモル比で共有結合してもよい。
好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体および陽イオン性高分子の場合、1:1〜1:100のモル比で共有結合してもよい。
好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体およびヘパリンの場合、1:1〜1:30のモル比で共有結合してもよい。
好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体およびヒアルロン酸の場合には、1:1〜1:200のモル比で共有結合してもよい。
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子は、粒子サイズに関係なく吸収可能であるが、好ましくは、500nm以下であってもよいし、さらに好ましくは、100〜300nmである。
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子のゼータ電位は、ナノ粒子の表面に用いられたイオン性高分子の種類に応じて異なり、具体的には、胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陽イオン性高分子および遺伝子の間の静電的相互作用で形成された遺伝子伝達用ナノ粒子は、10〜30mVの範囲のゼータ電位を示すことができる。また、胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陰イオン性高分子、陽イオン性高分子および遺伝子の間の静電的相互作用で形成された遺伝子伝達用ナノ粒子は、−10〜−30mVの範囲のゼータ電位を示すことができる。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子は、1:1〜1:200のモル比、好ましくは、1:1〜1:100のモル比で結合してもよい。前記結合比率は、遺伝子の発現率および細胞内に伝達される遺伝子伝達用ナノ粒子による細胞毒性による細胞成長に対する副作用がない範囲である。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した陽イオン性高分子および遺伝子は、1:1〜1:200の重量比/モル比、好ましくは、1:3〜1:30の重量比/モル比で混合できる。陽イオン性高分子が結合しうる限界があり、最適な強い結合能力を有しうる範囲でのみ伝達可能なため、前記範囲内で陽イオン性高分子と遺伝子の静電的相互作用によるイオン複合体の形成がよくなる。
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した陰イオン性高分子、陽イオン性高分子および遺伝子は、3:1:1〜10:1:200の重量比/モル比、好ましくは、3:1:1〜10:1:30の重量比/モル比で混合できる。前記範囲は、電荷対電荷(charge to charge)を利用して結合力を維持できる最適な範囲で、その範囲を超えると、剤形が設けられず安定性を失ってしまう。
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子のN/P比(胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子、特に陽イオン性高分子の窒素原子の個数/遺伝子のリン酸塩原子の個数)は、1〜200である。前記N/P比が前記範囲内に含まれると、陽イオン性高分子による遺伝子の安定化がよくなって、細胞吸収率が高くなり安定した遺伝子伝達用ナノ粒子を形成することができる。
また、本発明は、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した1種以上のイオン性高分子およびグルカゴン様ペプチド−1(GLP−1、Glucagon like peptide−1)、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を有効成分として含む糖尿病治療用薬学組成物を提供する。
前記遺伝子伝達用ナノ粒子は、インスリン分泌ペプチドの一種であるグルカゴン様ペプチド−1(Glucagon like peptide1、GLP−1)遺伝子、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)を治療遺伝子として含んでいて、ターゲット細胞に吸収されてインスリン分泌を増加させ、血中ブドウ糖の濃度に応じたインスリン分泌(Glucose dependent secretion)を起こして低血糖が発生しないようにする。したがって、糖尿病、特に第2型糖尿病の治療に有用に使用可能である。
本発明において、用語「有効成分」とは、前記組成物が個体に投与される場合、そうでない場合に比べて糖尿病の予防または治療する活性を有するものを含む。前記個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタおよびヤギからなる群より選択された1つ以上であってもよい。用語「予防」とは、前記組成物が投与されないものに比べて、血中ブドウ糖の濃度が高くなるのを防止することを含む。用語「治療」とは、前記組成物が投与されないものに比べて、血中ブドウ糖の濃度を低下させることを含む。
また、本発明の薬学組成物は、前記遺伝子伝達用ナノ粒子を単独で含んだり、1つ以上の薬学的に許容される担体、補強剤または賦形剤などをさらに含んでもよい。
さらに、本発明の薬学組成物は、薬学分野における通常の製剤、例えば、錠剤、丸剤、硬質・軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤(elixirs)などの経口投与用製剤、または静脈内、皮下、舌下、筋肉内投与用滅菌性水性またはオイル状溶剤の非経口投与用製剤に製剤化することができる。
本発明の薬学組成物に使用できる薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよび/またはミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の薬学組成物に使用できる賦形剤としては、甘味剤、結合剤、溶解剤、溶解補助剤、湿潤剤、乳化剤、等張化剤、吸着剤、崩壊剤、酸化防止剤、防腐剤、滑沢剤、充填剤、芳香剤などがあり、このような賦形剤の比率および性質は、選択された錠剤の溶解度および化学的特性、選択された投与経路および標準薬剤実務によって決定可能である。賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシン、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステリン、マグネシウムステアリン酸塩、マグネシウムアルミニウムケイ酸塩、デンプン、ゼラチン、トラガカントガム、アルギニン酸、ソジウムアルギン酸塩、メチルセルロース、ソジウムカルボキシルメチルセルロース、アガー、水、エタノール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、オレンジエッセンス、イチゴエッセンス、バニラフレーバーなどが挙げられる。
また、本発明の薬学組成物は、非経口投与形態に剤形化されてもよいが、この場合、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局所投与などを利用することができるが、これらに制限されない。この時、前記非経口投与用剤形に製剤化するために、前記薬学組成物は、有効成分、すなわち、前記遺伝子伝達用ナノ粒子が安定剤または緩衝剤とともに水で混合されて溶液または懸濁液に製造され、このような溶液または懸濁液がアンプルまたはバイアルの単位投与型で製造される。
本発明に係る薬学組成物は、より好ましくは、経口投与剤形であってもよい。
また、本発明の薬学組成物は、滅菌されたり、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、滲透圧調節のための塩および/または緩衝剤などの補助剤をさらに含んでもよく、その他治療的に有用な物質をさらに含んでもよいし、混合、顆粒化またはコーティングの通常の方法によって製剤化される。
また、本発明に係る薬学組成物において、有効成分である前記遺伝子伝達用ナノ粒子は、ヒトを含む哺乳類に対する投与用量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾病の程度に応じて異なり、1日1回または2回以上分割されて経口または非経口的経路を通して投与される。
以下、具体的な実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
この時、使われる技術用語および科学用語において別の定義がなければ、この発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が一般的に理解する意味を有する。また、従来と同一の技術的構成および作用に関する繰り返しの説明は省略する。
物質:
低−分子量のヘパリン(Hep、average MW5000Da)はメディプレックス(Mediplex Co.,Ltd、韓国)から購入し、ヒアルロン酸ナトリウム(MW:83kDa)はバイオランド(Bioland Co.,Ltd.、韓国)から購入し、TCA(PluronicTaurocholic acid sodium salt)、DMF(dimethyl formamide)、プロタミン(Prot)、キトサン(CS)、アセトン、4−NPC(4−methyl morpholin、4−nitrophenyl chloroformate)、TEA(trimethylamine)、NHS(N−hydroxysuccinimide)、EDC(N−(3−Dimethylaminopropyl)−N’−ethylcarbodiimide hydrochloride)、EDA(ethylene diamine)およびシスタミン二塩酸塩はsigma chemical.co(St.Louis、MO)から購入した。CaCo2細胞、MDCK−ASBTおよびMDCK細胞株は韓国細胞株銀行から購入した。pDNA遺伝子はEscherichia coli RR1に由来するPlasmid DNA(sigma−aldrich社、Product Codes D4154 and D3404)を使用した。
低−分子量のヘパリン(Hep、average MW5000Da)はメディプレックス(Mediplex Co.,Ltd、韓国)から購入し、ヒアルロン酸ナトリウム(MW:83kDa)はバイオランド(Bioland Co.,Ltd.、韓国)から購入し、TCA(PluronicTaurocholic acid sodium salt)、DMF(dimethyl formamide)、プロタミン(Prot)、キトサン(CS)、アセトン、4−NPC(4−methyl morpholin、4−nitrophenyl chloroformate)、TEA(trimethylamine)、NHS(N−hydroxysuccinimide)、EDC(N−(3−Dimethylaminopropyl)−N’−ethylcarbodiimide hydrochloride)、EDA(ethylene diamine)およびシスタミン二塩酸塩はsigma chemical.co(St.Louis、MO)から購入した。CaCo2細胞、MDCK−ASBTおよびMDCK細胞株は韓国細胞株銀行から購入した。pDNA遺伝子はEscherichia coli RR1に由来するPlasmid DNA(sigma−aldrich社、Product Codes D4154 and D3404)を使用した。
胆汁酸が共有結合した陽イオン性高分子の製造
実施例1:タウロコール酸が共有結合したプロタミン(Protamine−Taurocholic acid conjugate、以下、「Prot−TCA」という)の製造
透明な溶液になるまで、0℃でTCA(taurocholic acid)(1mmol)をDMSO(dimethyl sulfoxide)(5mL)に溶解させた。その後、TEA(triethylamine)(3mmol)および4−NPC(4−nitrophenyl chloroformate)(2.5mmol)を順に加えて、0℃で30分、常温で30分間反応させた。Prot(Protamine)(0.1mmol)を2次蒸留水(double distilled water)(10mL)に溶解させた後、前記反応溶液に加えて、常温で24時間反応させた。反応液を透析膜(MWCO:1000Da)を用いて毎6時間ごとに媒質を変えながら、3日間2次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してProt−TCAを得た(収得率78±2%、図2)。
実施例1:タウロコール酸が共有結合したプロタミン(Protamine−Taurocholic acid conjugate、以下、「Prot−TCA」という)の製造
透明な溶液になるまで、0℃でTCA(taurocholic acid)(1mmol)をDMSO(dimethyl sulfoxide)(5mL)に溶解させた。その後、TEA(triethylamine)(3mmol)および4−NPC(4−nitrophenyl chloroformate)(2.5mmol)を順に加えて、0℃で30分、常温で30分間反応させた。Prot(Protamine)(0.1mmol)を2次蒸留水(double distilled water)(10mL)に溶解させた後、前記反応溶液に加えて、常温で24時間反応させた。反応液を透析膜(MWCO:1000Da)を用いて毎6時間ごとに媒質を変えながら、3日間2次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してProt−TCAを得た(収得率78±2%、図2)。
1H NMRおよびTNBSA分析により、プロタミンにタウロコール酸が共有結合したことを確認した(図3)。
実施例2:タウロコール酸が共有結合したキトサン(Chitosan−Taurocholic acid conjugate、以下、「CS−TCA」という)の製造
透明な溶液になるまで、0℃でTCA(1mmol)をDMSO(5mL)に溶解させた。その後、TEA(3mmol)および4−NPC(2.5mmol)を順に加えて、0℃で30分、常温で30分間反応させた。CS(Chitosan)(0.01mmol)を2次蒸留水(20mL)に溶解させた後、前記反応溶液に加えて、常温で24時間反応させた。反応液を透析膜(MWCO:1000Da)を用いて毎6時間ごとに媒質を変えながら、3日間2次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してCS−TCAを得た(収得率92±2%、図4)。
透明な溶液になるまで、0℃でTCA(1mmol)をDMSO(5mL)に溶解させた。その後、TEA(3mmol)および4−NPC(2.5mmol)を順に加えて、0℃で30分、常温で30分間反応させた。CS(Chitosan)(0.01mmol)を2次蒸留水(20mL)に溶解させた後、前記反応溶液に加えて、常温で24時間反応させた。反応液を透析膜(MWCO:1000Da)を用いて毎6時間ごとに媒質を変えながら、3日間2次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してCS−TCAを得た(収得率92±2%、図4)。
1H NMRおよびTNBSA分析により、キトサンにタウロコール酸が共有結合したことを確認した(図5)。
(構造の確認)
前記Prot−TCAおよびCS−TCAはそれぞれProtおよびCSのアミン基がTCAのヒドロキシル基に共有結合して製造された。これを確認するために、D2OにProt−TCAおよびCS−TCAをそれぞれ10mg/mLに溶解させた後、1H NMR分析を実施した。その結果を図3および図5に示し、これから、TCAとProtとの間のアミド結合コンジュゲーションおよびTCAとCSとの間のアミド結合コンジュゲーションに対するピークがδ8ppmで検出された。
前記Prot−TCAおよびCS−TCAはそれぞれProtおよびCSのアミン基がTCAのヒドロキシル基に共有結合して製造された。これを確認するために、D2OにProt−TCAおよびCS−TCAをそれぞれ10mg/mLに溶解させた後、1H NMR分析を実施した。その結果を図3および図5に示し、これから、TCAとProtとの間のアミド結合コンジュゲーションおよびTCAとCSとの間のアミド結合コンジュゲーションに対するピークがδ8ppmで検出された。
また、前記Prot−TCAおよびCS−TCAのアミン基の含有量を調べるために、TNBSA(trinitro benzene sulphonate)分析により、ProtとCSそれぞれにTCAが共有結合した後、アミノ化の程度を定量化した。その結果、Prot−TCAはProtへのTCA共有結合前に比べて53%と、TCAの共有結合後にアミン基の含有量が減少したことを確認した。
実施例3:タウロコール酸が共有結合したポリアミドアミン(polyamidoamine−Taurocholic acid conjugate、以下、「PAMAM−TCA」という)の製造
Prot(Protamine)の代わりにポリアミドアミンを用いることを除けば、前記実施例1と同様の方法でPAMAM−TCAを製造し、FT−IRとFT−NMRにより構造を確認した(収得率50%、図6)。
Prot(Protamine)の代わりにポリアミドアミンを用いることを除けば、前記実施例1と同様の方法でPAMAM−TCAを製造し、FT−IRとFT−NMRにより構造を確認した(収得率50%、図6)。
実施例4:タウロコール酸が共有結合したポリ−L−リシン(poly−L−lysine−Taurocholic acid conjugate、以下、「PLL−TCA」という)の製造
Prot(Protamine)の代わりにポリ−L−リシンを用いることを除けば、前記実施例1と同様の方法でPLL−TCAを製造し、FT−IRとFT−NMRにより構造を確認した(収得率55%、図7)。
Prot(Protamine)の代わりにポリ−L−リシンを用いることを除けば、前記実施例1と同様の方法でPLL−TCAを製造し、FT−IRとFT−NMRにより構造を確認した(収得率55%、図7)。
胆汁酸が共有結合した陽イオン性高分子および遺伝子を含むナノ粒子の製造
実施例5:タウロコール酸が共有結合したプロタミンおよびGLP−1をコーディングする遺伝子を含むナノ粒子(以下、「Prot−TCA/GLP−1」という)の製造
10mM HEPESバッファー(pH7.4)に溶解したProt−TCA(1mg/mL)をストック溶液(stock solution)として使用した。GLP−1(Glucagon like peptide−1)をコーディングする遺伝子(7.780mg)を10mM HEPESバッファー(pH7.4)(1.922mL)に溶解させてGLP−1遺伝子溶液を製造した。gentle vortex下、GLP−1遺伝子溶液(10mL)をストックProt−TCA溶液(10mL)に滴加した。その後、反応物を常温で1時間放置し、2日間凍結乾燥してProt−TCA/GLP−1を得た[図8]。
実施例5:タウロコール酸が共有結合したプロタミンおよびGLP−1をコーディングする遺伝子を含むナノ粒子(以下、「Prot−TCA/GLP−1」という)の製造
10mM HEPESバッファー(pH7.4)に溶解したProt−TCA(1mg/mL)をストック溶液(stock solution)として使用した。GLP−1(Glucagon like peptide−1)をコーディングする遺伝子(7.780mg)を10mM HEPESバッファー(pH7.4)(1.922mL)に溶解させてGLP−1遺伝子溶液を製造した。gentle vortex下、GLP−1遺伝子溶液(10mL)をストックProt−TCA溶液(10mL)に滴加した。その後、反応物を常温で1時間放置し、2日間凍結乾燥してProt−TCA/GLP−1を得た[図8]。
実施例6:タウロコール酸が共有結合したキトサンおよびGLP−1をコーディングする遺伝子を含むナノ粒子(以下、「CS−TCA/GLP−1」という)の製造
前記実施例5のProt−TCAの代わりにCS−TCAを用いたことを除けば、前記実施例5と同様の方法でCS−TCA/GLP−1を得た。
前記実施例5のProt−TCAの代わりにCS−TCAを用いたことを除けば、前記実施例5と同様の方法でCS−TCA/GLP−1を得た。
粒子サイズおよびゼータ電位を分析するために、D2OにProt−TCA/GLP−1(実施例5)およびCS−TCA/GLP−1(実施例6)をそれぞれ1mg/mLに溶解させた。
(ナノ粒子の形態学的分析)
TEM(Transmission electron microscopy)および光散乱粒子分析器(Dynamic Light scattering particle size analyzer)を用いてProt−TCA/GLP−1(実施例5)の形態および粒子サイズ分布を観察した。
TEM(Transmission electron microscopy)および光散乱粒子分析器(Dynamic Light scattering particle size analyzer)を用いてProt−TCA/GLP−1(実施例5)の形態および粒子サイズ分布を観察した。
前記ナノ粒子のサイズは平均150nm程度であり、相対的に均一なサイズ分布を示した。
(ナノ粒子の表面電荷)
ゼータ電位分析器(Zeta analyzer)を用いて前記実施例5で製造されたナノ粒子のゼータ電位を測定した結果、正のゼータ電位を示した。このように表面電荷が正電荷を帯びるというのは、負電荷を帯びるGLP−1をコーディングする遺伝子が遺伝子伝達複合体の内部に完全に取り囲まれていることを意味し、正の表面電荷は遺伝子伝達ナノ粒子の細胞内への流入を容易にする。また、粒子の間に静電的反発力を起こして粒子同士の凝集現象を減少させる。
ゼータ電位分析器(Zeta analyzer)を用いて前記実施例5で製造されたナノ粒子のゼータ電位を測定した結果、正のゼータ電位を示した。このように表面電荷が正電荷を帯びるというのは、負電荷を帯びるGLP−1をコーディングする遺伝子が遺伝子伝達複合体の内部に完全に取り囲まれていることを意味し、正の表面電荷は遺伝子伝達ナノ粒子の細胞内への流入を容易にする。また、粒子の間に静電的反発力を起こして粒子同士の凝集現象を減少させる。
(ナノ粒子の安定性)
前記実施例5および6で製造されたナノ粒子の安定性を確認するために、ゲルリタデーション(Gel retardation)分析を実施した。
前記実施例5および6で製造されたナノ粒子の安定性を確認するために、ゲルリタデーション(Gel retardation)分析を実施した。
ゲルリタデーション実験は1%agarosゲルと1×TBE buffer溶液を用いて行われた。本発明のナノ粒子に封入された遺伝子GLP−1は0.5μg/mL EtBr(ethidium bromide)で染色されてゲル上に現れた。前記実験は100Vで30分間進行した。
その結果、Prot−TCAにGLP−1の複合化およびCS−TCAに対するGLP−1をコーディングする遺伝子の複合化は1:10以上のモル比で行われることを確認した。特に、実施例5のProt−TCAとGLP−1の複合化が1:150のモル比、実施例6のCS−TCAとGLP−1をコーディングする遺伝子の複合化が1:10のモル比で行われた場合、GLP−1をコーディングする遺伝子の凝縮による遅延現象がもたらされてGLP−1をコーディングする遺伝子の移動性が完全に遅延された。これから、前記Prot−TCAおよびCS−TCAそれぞれはGLP−1をコーディングする遺伝子を効果的に凝縮させて遺伝子伝達複合体Prot−TCA/GLP−1およびCS−TCA/GLP−1が形成されたことが分かった。したがって、本発明に係るナノ粒子は、遺伝子と複合体を形成することにより、遺伝子を伝達する遺伝子伝達体として有用に使用可能である。
(血清内安定性)
前記実施例5および6で製造されたナノ粒子の血清内安定性を確認するために、下記のような実験を実施した。
前記実施例5および6で製造されたナノ粒子の血清内安定性を確認するために、下記のような実験を実施した。
Prot−TCA/GLP−1(実施例5)およびCS−TCA/GLP−1(実施例6)をそれぞれ、20%血清下、37℃の条件で48時間保管した後、0.5MのEDTAを処理した。その後、Prot−TCA/GLP−1(実施例5)およびCS−TCA/GLP−1(実施例6)それぞれからGLP−1をコーディングする遺伝子を分離するために1%SDSを添加した。
その結果、free遺伝子GLP−1と比較して、Prot−TCA/GLP−1(実施例5)およびCS−TCA/GLP−1(実施例6)それぞれに封入されたGLP−1をコーディングする遺伝子は48時間血清から分解されず、血清内で非常に安定していることを確認した。
(pH条件に対する粒子の安定性)
多様なpH条件で本発明のナノ粒子の安定性を確認した。
多様なpH条件で本発明のナノ粒子の安定性を確認した。
すなわち、胃腸管(GI tract)の胃、十二指腸および回腸(ileum)断片でのpH条件と類似のpH3、pH5およびpH7.4の3つのpH溶液にProt−TCA/GLP−1(実施例5)およびCS−TCA/GLP−1(実施例6)それぞれを入れて、粒子サイズを観察した。その結果、Prot−TCA/GLP−1(実施例5)およびCS−TCA/GLP−1(実施例6)ともpH3で24時間まで安定していることを確認した。
実験例1:試験管内(in vitro)の遺伝子発現およびトランスウェル(transwell)研究
ASBT(Apical Sodium−dependent Bile Salt Transporter)−過発現MDCK細胞およびCaco−2細胞株を用いて緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein、GFP)の発現を観察した。
ASBT(Apical Sodium−dependent Bile Salt Transporter)−過発現MDCK細胞およびCaco−2細胞株を用いて緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein、GFP)の発現を観察した。
実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子にeGFP遺伝子4μgをそれぞれローディングした後、前記細胞株から成功した発現および緑色蛍光を観察した。
次に、二重層細胞培養技術で遺伝子複合体の伝達を研究するために、トランスウェルプレートの頂端部位でCaco−2単層を培養し、基底部位でMDCK−ASBT細胞株を培養した。その結果、前記ナノ粒子の成功した伝達が観察され、これから、TCA分子はこれら遺伝子複合体の吸収と伝達を助ける役割を果たすことが分かった。
培地で糖数値に反応して試験管内のGLP−1の発現を数値化するGLP−1 ELISAキットを用いており、その結果、GLP−1をコーディングする遺伝子の向上した発現が現れた。
実験例2:複合体の生体内(in vivo)生体分布(bio distribution)
eGFPローディングされた実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子の生体内生体分布を調べるために、下記の実験を行った。
eGFPローディングされた実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子の生体内生体分布を調べるために、下記の実験を行った。
Balb/cマウスを木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。治療遺伝子複合体の経口投与前の12時間、前記動物を絶食させた。絶食12時間後、eGFP遺伝子100μgを含有する実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子それぞれを経口胃管栄養法(oral gavage)で投与した。投与24時間後に動物を犠牲にし、共焦点顕微鏡(confocal microscope)で生体内遺伝子発現および試料の生体内分布を定量化した。
その結果、本発明の遺伝子伝達ナノ粒子によって回腸と肝断片での向上したeGFP遺伝子の発現を確認した。また、プロタミンとキトサンそれぞれに共有結合したTCAは、GI(gastrointestinal)分解を防止し、eGFPの吸収と発現を助けることが分かった。
実験例3:生体内(in vivo)GLP−1をコーディングする遺伝子の発現および血糖数値の調節
5週齢のZDFR(Zucker diabetic fatty rats)を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子の経口投与前の12時間、前記動物を絶食させた。絶食12時間後、実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子100μgをそれぞれ経口投与させた。投与24時間後に所定の時間間隔で尾静脈から血液を採取して血糖数値を測定した。驚くべきことに、血糖数値が正常血糖数値に調節されたことを確認した。5日後、実験動物を犠牲にし、ELISAキットで回腸と肝断片でのGLP−1およびインスリンの発現を分析した。その結果、対照群と比較して、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子の経口投与後、GLP−1ペプチドとインスリンタンパク質の向上した発現が現れた。
5週齢のZDFR(Zucker diabetic fatty rats)を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子の経口投与前の12時間、前記動物を絶食させた。絶食12時間後、実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子100μgをそれぞれ経口投与させた。投与24時間後に所定の時間間隔で尾静脈から血液を採取して血糖数値を測定した。驚くべきことに、血糖数値が正常血糖数値に調節されたことを確認した。5日後、実験動物を犠牲にし、ELISAキットで回腸と肝断片でのGLP−1およびインスリンの発現を分析した。その結果、対照群と比較して、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子の経口投与後、GLP−1ペプチドとインスリンタンパク質の向上した発現が現れた。
実験例4:GLP−1遺伝子伝達用複合体の生体内(in vivo)毒性
4週齢のSDラット(Sprague Dowley rats)を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子100μgをそれぞれ経口および静脈投与した。所定の時間間隔で24時間実験動物の血液を採取して一般の血液内容物(complete blood content)を分析し、肝および腎臓の活性を決定する生物学的マーカーの発現を評価した。その結果、本発明の遺伝子伝達複合体を非常に高い濃度で投与したとしても毒性がほとんど現れなかった。
4週齢のSDラット(Sprague Dowley rats)を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。実施例5および6の遺伝子伝達用ナノ粒子100μgをそれぞれ経口および静脈投与した。所定の時間間隔で24時間実験動物の血液を採取して一般の血液内容物(complete blood content)を分析し、肝および腎臓の活性を決定する生物学的マーカーの発現を評価した。その結果、本発明の遺伝子伝達複合体を非常に高い濃度で投与したとしても毒性がほとんど現れなかった。
投与7日後に動物を犠牲にし、回腸と肝断片の免疫組織検査を実施した。その結果、組織内でいかなる炎症も観察されておらず、毒性もほとんど現れなかった。
したがって、本発明の遺伝子伝達複合体は、安全で、無毒性であり、糖尿病の治療に使用可能であることが分かった。
実施例7:タウロコール酸が共有結合したプロタミンおよびpDNAを含むナノ粒子(以下、「pDNA/Prot−TCA」という)の製造
タウロコール酸とプロタミンの共有結合は、タウロコール酸のヒドロキシルグループとプロタミンのアミングループをTriethylamine(以下、TEA)と4−nitrophynyl chloroformate(以下、4−NPC)を用いて製造した。
タウロコール酸とプロタミンの共有結合は、タウロコール酸のヒドロキシルグループとプロタミンのアミングループをTriethylamine(以下、TEA)と4−nitrophynyl chloroformate(以下、4−NPC)を用いて製造した。
Prot−TCAの製造
タウロコール酸50mmolを溶かした10mlの蒸留水に4−NPC70mmolをDMF溶液3mlに完全に溶かして追加し、TEA溶液をタウロコール酸溶液が完全に黄色に変わるまで追加(100μl)した。この後、5mmolのプロタミンを追加した後、24時間撹拌して常温で反応を進行させた。反応が終わった後、透析により未反応物を除去するが、1kDaサイズのメンブレンフィルタ容器を用い、24時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により収得物Prot−TCAを得た。
タウロコール酸50mmolを溶かした10mlの蒸留水に4−NPC70mmolをDMF溶液3mlに完全に溶かして追加し、TEA溶液をタウロコール酸溶液が完全に黄色に変わるまで追加(100μl)した。この後、5mmolのプロタミンを追加した後、24時間撹拌して常温で反応を進行させた。反応が終わった後、透析により未反応物を除去するが、1kDaサイズのメンブレンフィルタ容器を用い、24時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により収得物Prot−TCAを得た。
pDNA/Prot−TCAの製造
前記実験方法で製造されたProt−TCA(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備する。この後、製造されたProt−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加する。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/Prot−TCAを得た(図8)。
前記実験方法で製造されたProt−TCA(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備する。この後、製造されたProt−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加する。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/Prot−TCAを得た(図8)。
(pDNA/Prot−TCAのpHに対する安定性試験)
前記製造されたpDNA/Prot−TCAの安定性を確認するために、蒸留水、pH5.2、1.8、7.4のHEPESバッファー溶液の条件で試験をした。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してpDNA/Prot−TCAとpDNA/Protの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、6、12、24時間にpDNA/Prot−TCA溶液を取って分析する。
前記製造されたpDNA/Prot−TCAの安定性を確認するために、蒸留水、pH5.2、1.8、7.4のHEPESバッファー溶液の条件で試験をした。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してpDNA/Prot−TCAとpDNA/Protの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、6、12、24時間にpDNA/Prot−TCA溶液を取って分析する。
その結果、pDNA/Prot−TCAは、前記提示された条件で優れた安定性を示すことを確認し、これは、胆汁酸の一種であるタウロコール酸の結合でpHに対する安定性が増加したと説明することができる。対照群としては、タウロコール酸が結合しないpDNA/Protを用い、pH5.2、7.4、そして蒸留水の条件では時間に応じて大きさが増加する傾向を、pH1.8では時間に応じて大きさが減少する傾向を示すことを確認した。特に、pH1.8で大きさが減少する傾向を示すのは、プロタミンが酸性の条件に弱くて分解が起こり、pDNAとの物理的結合が壊れる現象のためである。
(pDNA/Prot−TCAのSEMイメージを用いた合成の確認)
製造されたpDNA/Prot−TCAをsilicon waferに載せた後、自然乾燥をして分析するサンプルを準備する。分析はScanning Electron Microscopyを用い、10.0kV、×2,000倍率の条件で撮影された。
製造されたpDNA/Prot−TCAをsilicon waferに載せた後、自然乾燥をして分析するサンプルを準備する。分析はScanning Electron Microscopyを用い、10.0kV、×2,000倍率の条件で撮影された。
結果的に、製造されたpDNA/Prot−TCAは、粒子の100nmのサイズを有する粒子形状を有することを確認することができ、観察されたすべての粒子も同一のサイズを有する傾向を確認した。
(HCT116細胞を用いたpDNA/Prot−TCAの毒性試験)
製造されたpDNA/Prot−TCAの毒性を確認するためにHCT116細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
製造されたpDNA/Prot−TCAの毒性を確認するためにHCT116細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
理論的に知られているように、プロタミンは85%以上の生存率を示し、タウロコール酸が共有結合したプロタミンも80%以上の高い生存率を示すことを確認することができた。
(Confocal microscopyを用いた細胞吸収能確認試験)
製造されたpDNA/Protの細胞吸収能を確認するためにHCT116細胞を用いた。実験方法はHCT116細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ProtとpDNA/Prot−TCAを注入する。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察する。
製造されたpDNA/Protの細胞吸収能を確認するためにHCT116細胞を用いた。実験方法はHCT116細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ProtとpDNA/Prot−TCAを注入する。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察する。
その結果、pDNA/Prot−TCAは、対照群のpDNA/Protより優れた細胞吸収能を有することを確認することができ、その数値は約4倍以上であると確認した。
(Caco−2単層を用いたpDNA/Prot−TCAの細胞透過能検査)
pDNA/Prot−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
pDNA/Prot−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
その結果、pDNA/Prot−TCAは、対照群のpDNA/Protより優れた細胞透過能を有することを確認することができ、これは、後の動物実験において小腸を通したpDNA/Prot−TCAの吸収が可能であることを示唆する。
(経口投与によるpDNA/Prot−TCAの生体内分布度確認実験)
経口投与によるpDNA/Prot−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したプロタミンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与し、0.2、0.5、2、6、12、24時間での生体内分布を蛍光イメージと蛍光数値を通して確認した。
経口投与によるpDNA/Prot−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したプロタミンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与し、0.2、0.5、2、6、12、24時間での生体内分布を蛍光イメージと蛍光数値を通して確認した。
その結果、pDNA/Prot−TCAは小腸を通して吸収され、30分内の短い時間内に小腸で吸収が進み、2〜6時間にかけて肝に吸収された後、徐々に除去される現象を確認した。これは、既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路にそのまま沿うものであり、製造されたpDNA/Prot−TCAもタウロコール酸の生体内吸収効果を妨げたり阻害せず、本来の循環経路を維持することを検証した。
実施例8:タウロコール酸が共有結合したキトサンおよびpDNAを含むナノ粒子(以下、「pDNA/CS−TCA」という)の製造
TCA−NPCの製造
キトサンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した。
TCA−NPCの製造
キトサンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した。
CS−TCAの製造
キトサン(100mg)を蒸留水に溶解させ、製造されたTCA−NPC(20mg)を追加して24時間撹拌させた。この後、透析により未反応物を除去し、透析は1kDaのメンブレンフィルタ容器を用い、24時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により最終収得物CS−TCAを得た。
キトサン(100mg)を蒸留水に溶解させ、製造されたTCA−NPC(20mg)を追加して24時間撹拌させた。この後、透析により未反応物を除去し、透析は1kDaのメンブレンフィルタ容器を用い、24時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により最終収得物CS−TCAを得た。
pDNA/CS−TCAの製造
前記実験方法で製造されたCS−TCA(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたCS−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/CS−TCAを得た。
前記実験方法で製造されたCS−TCA(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたCS−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/CS−TCAを得た。
(電気泳動方法と大きさの分析によるpDNA/CS−TCAの安定性確認)
pDNA/CS−TCAの安定性を確認するために電気泳動方法とその大きさを測定して確認し、背景条件は蒸留水を用いた。
pDNA/CS−TCAの安定性を確認するために電気泳動方法とその大きさを測定して確認し、背景条件は蒸留水を用いた。
その結果、製造されたpDNA/CS−TCAは非常に安定した状態を最小24時間維持することを確認した。
(表面電荷の測定によるpDNA/CS−TCAの製造検証)
pDNA/CS−TCAの製造検証のためにZeta potential分析機器を用い、表面電荷(mV)を測定して製造の有無を確認した。
pDNA/CS−TCAの製造検証のためにZeta potential分析機器を用い、表面電荷(mV)を測定して製造の有無を確認した。
既存のpDNAは−2.96mVを有し、キトサンは36.12mVを有する。この後、pDNA/CS−TCAを製造すると、19.55〜25.68mVを有するが、これは、陽イオンのキトサンが陰イオンのpDNAの表面を完全に包んで製造されたpDNA/CS−TCAが陽イオンの表面電荷を有するのである。これによりpDNA/CS−TCAの完全な製造を確認した。
(pDNA/CS−TCAのpHに対する安定性試験)
前記製造されたpDNA/CS−TCAの安定性を確認するために、pH5.2、1.8、7.4のPBSバッファー溶液の条件で試験をした。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してpDNA/CS−TCAの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、6、12、18、24時間にpDNA/CS−TCA溶液を取って分析した。
前記製造されたpDNA/CS−TCAの安定性を確認するために、pH5.2、1.8、7.4のPBSバッファー溶液の条件で試験をした。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してpDNA/CS−TCAの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、6、12、18、24時間にpDNA/CS−TCA溶液を取って分析した。
その結果、pDNA/CS−TCAは、前記提示された条件で優れた安定性を示すことを確認し、これは、胆汁酸の一種であるタウロコール酸の結合でpHに対する安定性が増加することが分かった。
(MDCK−ASBT細胞を用いたpDNA/CS−TCAの毒性試験)
製造されたpDNA/CS−TCAの毒性を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
製造されたpDNA/CS−TCAの毒性を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
結果的に、pDNA/CS−TCAは80%以上の高い生存率を示すことを確認した。
(Confocal microscopyを用いた細胞吸収能の確認試験)
製造されたpDNA/CS−TCAの細胞吸収能を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用いた。実験方法は、MDCK−ASBT細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ChitosanとpDNA/CS−TCAを注入した。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察した。
製造されたpDNA/CS−TCAの細胞吸収能を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用いた。実験方法は、MDCK−ASBT細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ChitosanとpDNA/CS−TCAを注入した。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察した。
その結果、pDNA/CS−TCAは、対照群のpDNA/Chitosanより優れた細胞吸収能を有することを確認することができ、その数値は約2倍以上であると確認した。
(Caco−2単層を用いたpDNA/CS−TCAの細胞透過能検査)
pDNA/CS−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
pDNA/CS−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
その結果、pDNA/CS−TCAは、対照群のpDNA/Chitosanより優れた細胞透過能を有することを確認することができ、これは、後の動物実験において小腸を通したpDNA/CS−TCAの吸収が可能であることが分かった。
(pDNA/CS−TCAの遺伝子発現による遺伝子伝達能検証)
pDNA/CS−TCAの遺伝子発現効果検証のためにLuciferase方法を利用した。対照群としては、pDNA、pDNA/Chitosan、そしてbPEIを用いた。
pDNA/CS−TCAの遺伝子発現効果検証のためにLuciferase方法を利用した。対照群としては、pDNA、pDNA/Chitosan、そしてbPEIを用いた。
その結果、pDNA/CS−TCAは、陰性対照群であるpDNA、pDNA/Chitosanより最小2倍最大50倍以上の効果を有することを確認し、陽性対照群であるbPEIよりも優れた遺伝子伝達効果を有することを確認した。
(経口投与によるpDNA/CS−TCAの生体内分布度確認実験)
経口投与によるpDNA/CS−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したキトサンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与し、12時間での生体内分布を蛍光イメージを通して確認した。
経口投与によるpDNA/CS−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したキトサンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与し、12時間での生体内分布を蛍光イメージを通して確認した。
その結果、pDNA/CS−TCAは小腸、特に回腸を通して吸収され、肝にも吸収が進むことを確認した。これは、既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路にそのまま沿うものであり、製造されたpDNA/Chitosan−TCAもタウロコール酸の生体内吸収効果を妨げたり阻害せず、本来の循環経路を維持することを検証した。
実施例9:タウロコール酸が共有結合したポリアミドアミンおよびpDNAを含むナノ粒子(以下、「pDNA/PAMAM−TCA」という)の製造
TCA−NPCの製造
キトサンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した。
TCA−NPCの製造
キトサンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した。
PAMAM−TCAの製造
ポリアミドアミン(100mg)をHEPESバッファー溶液に溶解させ、製造されたTCA−NPC(20mg)を追加して24時間撹拌させた。この後、透析により未反応物を除去し、透析は1kDaのメンブレンフィルタ容器を用い、24時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により最終収得物PAMAM−TCAを得た。
ポリアミドアミン(100mg)をHEPESバッファー溶液に溶解させ、製造されたTCA−NPC(20mg)を追加して24時間撹拌させた。この後、透析により未反応物を除去し、透析は1kDaのメンブレンフィルタ容器を用い、24時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により最終収得物PAMAM−TCAを得た。
pDNA/PAMAM−TCAの製造
前記実験方法で製造されたPAMAM−TCA(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたMAM−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/PAMAM−TCAを得た。
前記実験方法で製造されたPAMAM−TCA(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたMAM−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/PAMAM−TCAを得た。
実施例10:タウロコール酸が共有結合したポリ−L−リシンおよびpDNAを含むナノ粒子(以下、「pDNA/PLL−TCA」という)の製造
TCA−NPCの製造
キトサンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した。
TCA−NPCの製造
キトサンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した。
PLL−TCAの製造
ポリ−L−リシン(50mg)をHEPESバッファー溶液に溶解させ、製造されたTCA−NPC(20mg)を追加して24時間撹拌させた。この後、透析により未反応物を除去し、透析は1kDaのメンブレンフィルタ容器を用い、24時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により最終収得物PLL−TCAを得た。
ポリ−L−リシン(50mg)をHEPESバッファー溶液に溶解させ、製造されたTCA−NPC(20mg)を追加して24時間撹拌させた。この後、透析により未反応物を除去し、透析は1kDaのメンブレンフィルタ容器を用い、24時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により最終収得物PLL−TCAを得た。
pDNA/PLL−TCAの製造
前記実験方法で製造されたPLL−TCA(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたPLL−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/PLL−TCAを得た。
前記実験方法で製造されたPLL−TCA(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたPLL−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/PLL−TCAを得た。
実施例11:TCAが二硫化結合で共有結合したヘパリン(以下、「Hep−S−S−TCA」という)の製造
Hep−S−S−TCAの合成はヘパリンとシスタミンのコンジュゲートから始まった。すなわち、ヘパリンのカルボキシル基は、EDC(1−ethyl−3−(−3−dimethylaminopropyl)carbodiimide)/NHS(N−bromosuccinimide)chemistryによりシスタミンのアミン基と共有結合した。
Hep−S−S−TCAの合成はヘパリンとシスタミンのコンジュゲートから始まった。すなわち、ヘパリンのカルボキシル基は、EDC(1−ethyl−3−(−3−dimethylaminopropyl)carbodiimide)/NHS(N−bromosuccinimide)chemistryによりシスタミンのアミン基と共有結合した。
Hep−S−S−NH2の製造
ヘパリン(100mg)を10mLのMESバッファー(50mmol、pH6)に溶解させ、溶液が透明になるまで冷浴で撹拌させた。過剰のEDC(ヘパリンに対して2.4当量)を加えて10分間撹拌させた後、常温で過剰のNHS(EDCに対して2.5倍当量)を加えて10分間撹拌させた。EDCとNHSによるカルボキシル基の活性後、シスタミン(100μg)を加えて、pH7で24時間反応させた。反応が終わると、2次蒸留水で24時間透析し、凍結乾燥してHep−S−S−NH2を得た(図9)。
ヘパリン(100mg)を10mLのMESバッファー(50mmol、pH6)に溶解させ、溶液が透明になるまで冷浴で撹拌させた。過剰のEDC(ヘパリンに対して2.4当量)を加えて10分間撹拌させた後、常温で過剰のNHS(EDCに対して2.5倍当量)を加えて10分間撹拌させた。EDCとNHSによるカルボキシル基の活性後、シスタミン(100μg)を加えて、pH7で24時間反応させた。反応が終わると、2次蒸留水で24時間透析し、凍結乾燥してHep−S−S−NH2を得た(図9)。
TCA−NPCの製造
活性化されたヘパリンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した(図10)。
活性化されたヘパリンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した(図10)。
Hep−S−S−TCAの製造
その後、DMSO(10mL)に溶解した活性化されたヘパリン(100μg)を加えて、常温で24時間反応させた。反応液を透析膜(MWCO:1000Da)を用いて毎3時間ごとに媒質を変えながら、48時間2次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してHep−S−S−TCAを得た(収得率80±5%、図11、図12)。
その後、DMSO(10mL)に溶解した活性化されたヘパリン(100μg)を加えて、常温で24時間反応させた。反応液を透析膜(MWCO:1000Da)を用いて毎3時間ごとに媒質を変えながら、48時間2次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してHep−S−S−TCAを得た(収得率80±5%、図11、図12)。
Hep−S−S−TCAは細胞内のグルタチオン(glutathione)濃度に反応して治療遺伝子を局所的に放出するように合成され、図9〜図11にHep−S−S−TCAを製造するための反応式を例示した。
ヘパリンにシスタミンのコンジュゲーションは1H NMRおよびTNBS分析によりそれぞれ定性的および定量的に決定され[図12]、これから、それぞれのヘパリン分子は5つの二硫化結合で結合したTCA分子が付着していることが分かった。
実施例12:TCAが二硫化(Disulfide)結合で共有結合したヘパリン、pDNAおよびプロタミンを含むナノ粒子(以下、「pDNA/Prot/Hep−S−S−TCA」という)の製造
Hep−S−S−TCAの製造において前記実施例11の方法を利用した。
Hep−S−S−TCAの製造において前記実施例11の方法を利用した。
pDNA/Protの製造
プロタミン(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備する。この後、プロタミン溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、20分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/Protを得た。
プロタミン(150nmol〜50nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備する。この後、プロタミン溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、20分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/Protを得た。
pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの製造
Hep−S−S−TCA(20mg)とpDNA/ProtをそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、Hep−S−S−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNA/Protの入ったHEPESバッファー溶液を1mlずつ追加した。定められた量のpDNA/Protをすべて追加した後、30分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAを得た。
Hep−S−S−TCA(20mg)とpDNA/ProtをそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、Hep−S−S−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNA/Protの入ったHEPESバッファー溶液を1mlずつ追加した。定められた量のpDNA/Protをすべて追加した後、30分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAを得た。
(電気泳動方法によるpDNA/Protの製造確認)
pDNA/Protの製造を確認するために電気泳動方法を利用して確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:0.5、1、2、3、4、6の比を比較して最適な条件を確認した。
pDNA/Protの製造を確認するために電気泳動方法を利用して確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:0.5、1、2、3、4、6の比を比較して最適な条件を確認した。
その結果、製造されたpDNA/Protは非常に安定して製造され、最小1:2の重量比を用いて製造した時、完全に製造されることを確認した。
(粒子のサイズおよび表面電荷の分析によるpDNA/Protの製造確認)
pDNA/Protの製造を確認するために粒子のサイズおよび表面電荷の分析を利用して確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:0.5、1、2、3、4、6の比を比較して最適な条件を確認した。
pDNA/Protの製造を確認するために粒子のサイズおよび表面電荷の分析を利用して確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:0.5、1、2、3、4、6の比を比較して最適な条件を確認した。
その結果、製造されたpDNA/Protは非常に安定して製造され、結果的に、1:3の重量比を用いて製造した時、最適な条件で製造されることを確認した。
(電気泳動方法と粒子サイズの分析によるpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの製造確認)
pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの製造を確認するために電気泳動方法と粒子サイズの分析により確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:3、4.5の比を比較して最適な条件を確認した。
pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの製造を確認するために電気泳動方法と粒子サイズの分析により確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:3、4.5の比を比較して最適な条件を確認した。
その結果、製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAは非常に安定して製造され、最小1:3の重量比を用いて製造した時、完全に製造されることを確認した。
(pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAのTEMイメージを用いた合成確認)
製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAをsilicon waferに載せた後、自然乾燥をして分析するサンプルを準備した後、Transmission Electron Microscopyを用いて分析した。
製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAをsilicon waferに載せた後、自然乾燥をして分析するサンプルを準備した後、Transmission Electron Microscopyを用いて分析した。
その結果、製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAは、粒子の100nmのサイズを有する粒子形状を有することを確認することができ、表面のHep−S−S−TCAのコーティング層を観測することにより、pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAが完全に製造されることを確認した。また、観察されたすべての粒子も同一のサイズを有する傾向を確認した。
(pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの遺伝子封入率の測定)
pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの遺伝子封入率測定のために電気泳動の方法を利用し、電気泳動により分離されたDNAの量を測定することにより、封入率を測定した。
pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの遺伝子封入率測定のために電気泳動の方法を利用し、電気泳動により分離されたDNAの量を測定することにより、封入率を測定した。
その結果、重量比1:6において70%の封入率で最大の封入効果を有することを確認し、1:3では約15%の封入効果を有することを確認した。1:6において最大の封入効果を有するが、前記電気泳動方法と粒子サイズの分析によるpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの製造確認実験で言及したように、遺伝子伝達のために最適化された重量比は1:3に固定した。
(電気泳動方法によるpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの安定性確認)
pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの安定性を確認するために電気泳動方法を利用して確認し、背景条件はpDNA分解要素のDNAseが含まれたHEPESバッファー溶液を用いた。
pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの安定性を確認するために電気泳動方法を利用して確認し、背景条件はpDNA分解要素のDNAseが含まれたHEPESバッファー溶液を用いた。
その結果、製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAは、pDNA分解要素のDNAseからpDNAを効果的に保護し、非常に安定した状態を維持することを確認した。
(Confocal microscopyを用いた細胞吸収能確認試験)
製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの細胞吸収能を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用いた。実験方法は、MDCK−ASBT細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ProtとpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAを注入した。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察した。
製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの細胞吸収能を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用いた。実験方法は、MDCK−ASBT細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ProtとpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAを注入した。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察した。
その結果、対照群として用いられたpDNA/Protも陽イオンの表面電荷をもっていて若干の吸収能は有することを示したが、結果的に、製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAが対照群のpDNA/Protより優れた細胞吸収能を有することを確認した。
(Confocal microscopyを用いた細胞発現確認試験)
製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの細胞発現効果を確認するためにHepG2細胞を用いた。実験方法は、HepG2細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルeGFPが追加されたpDNA/ProtとpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAを注入した。24時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察した。
製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの細胞発現効果を確認するためにHepG2細胞を用いた。実験方法は、HepG2細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルeGFPが追加されたpDNA/ProtとpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAを注入した。24時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察した。
その結果、製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAがeGFP遺伝子を伝達するのに成功して緑色蛍光を有することを確認し、その程度が対照群のpDNA/Protよりはるかに高いことを確認した。
(MDCK−ASBT細胞を用いたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの毒性試験)
製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの毒性を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
製造されたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの毒性を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
結果的に、Hep−S−S−TCAは90%以上、pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAも90%以上の高い生存率を示すことを確認した。
(Caco−2単層を用いたpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの細胞透過能検査)
pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
その結果、pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAは、対照群のpDNA/Prot/CSA−TCAより低い細胞透過能を有することを確認することができ、その数値はpDNA/Protと類似すると確認した。これは、二硫化結合(−S−S−)によってタウロコール酸がCaco−2細胞内で分離されてタウロコール酸のみが透過をし、pDNA/Prot/Hepは細胞内に蓄積されることを意味する。
(経口投与によるpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの生体内分布度確認実験)
経口投与によるpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したプロタミンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与あるいは静脈投与し、6時間での生体内分布を組織、そして細胞単位の蛍光イメージを通して確認した。
経口投与によるpDNA/Prot/Hep−S−S−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したプロタミンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与あるいは静脈投与し、6時間での生体内分布を組織、そして細胞単位の蛍光イメージを通して確認した。
その結果、pDNA/Prot/Hep−S−S−TCAは小腸、特に回腸を通して吸収され、肝にも若干の吸収が進むことを確認した。これは、小腸までは既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路にそのまま沿うものであり、小腸で二硫化結合(−S−S−)が分離されて製造されたpDNA/Prot/Hepがタウロコール酸の循環経路を外れて小腸に蓄積されることを意味する。
実施例13:TCAが二硫化結合で共有結合したキトサン(以下、「CS−S−S−TCA」という)の製造
Chitosan−S−S−COOHの製造
キトサン(100mg)を10mLのMESバッファー(50mmol、pH6)に溶解させ、溶液が透明になるまで冷浴で撹拌させる。過剰のEDC(キトサンに対して5当量)を加えて10分間撹拌させた後、常温で過剰のNHS(EDCに対して2.5倍当量)を加えて10分間撹拌させた。EDCとNHSによるカルボキシル基の活性後、システイン(500μg)を加えて、pH7で24時間反応させた。反応が終わると、2次蒸留水で24時間透析し、凍結乾燥してChitosan−S−S−COOHを得た。
Chitosan−S−S−COOHの製造
キトサン(100mg)を10mLのMESバッファー(50mmol、pH6)に溶解させ、溶液が透明になるまで冷浴で撹拌させる。過剰のEDC(キトサンに対して5当量)を加えて10分間撹拌させた後、常温で過剰のNHS(EDCに対して2.5倍当量)を加えて10分間撹拌させた。EDCとNHSによるカルボキシル基の活性後、システイン(500μg)を加えて、pH7で24時間反応させた。反応が終わると、2次蒸留水で24時間透析し、凍結乾燥してChitosan−S−S−COOHを得た。
TCA−NH2の製造
活性化されたキトサンChitosan−S−S−COOHにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した。
活性化されたキトサンChitosan−S−S−COOHにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて、常温で1時間反応させてTCA−NPCを製造した。
この後、製造されたTCA−NPC(100mg)をDMFに完全に溶解し、4−MMPを30μl追加して4時間反応する。この後、エチレンジアミンを1ml追加して16時間反応させてTCA−NH2を製造した。
CS−S−S−TCAの製造
その後、DMSO(10mL)に溶解した活性化されたキトサンChitosan−S−S−COOH(100μg)を加えて、常温で24時間反応させた。反応液を透析膜(MWCO:1000Da)を用いて毎3時間ごとに媒質を変えながら、24時間pH7の条件である2次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してCS−S−S−TCAを得た。(収得率50%、図13、図14)。
その後、DMSO(10mL)に溶解した活性化されたキトサンChitosan−S−S−COOH(100μg)を加えて、常温で24時間反応させた。反応液を透析膜(MWCO:1000Da)を用いて毎3時間ごとに媒質を変えながら、24時間pH7の条件である2次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してCS−S−S−TCAを得た。(収得率50%、図13、図14)。
実施例14:TCAが二硫化(Disulfide)結合で共有結合したキトサンおよびpDNAを含むナノ粒子(以下、「pDNA/CS−S−S−TCA」という)の製造
CS−S−S−TCA(20nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたCS−S−S−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/CS−S−S−TCAを得た。
CS−S−S−TCA(20nmol)とpDNA(1nmol)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたCS−S−S−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/CS−S−S−TCAを得た。
(電気泳動方法と粒子サイズの分析によるpDNA/CS−S−S−TCAの製造確認)
pDNA/CS−S−S−TCAの製造を確認するために電気泳動方法と粒子サイズの分析により確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:3、4.5の比を比較して最適な条件を確認した。
pDNA/CS−S−S−TCAの製造を確認するために電気泳動方法と粒子サイズの分析により確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:3、4.5の比を比較して最適な条件を確認した。
電気泳動方法により確認した結果、製造されたpDNA/CS−S−S−TCAは非常に安定して製造され、最小1:5の重量比を用いて製造した時、完全に製造されることを確認した。そして、粒子サイズの変化を適用して最適な重量比は1:50に設定した。
(pDNA/CS−S−S−TCAのpHに対する安定性試験)
前記製造されたpDNA/CS−S−S−TCAの安定性を確認するために、pH5.2、1.8、7.4のPBSバッファー溶液の条件で試験をする。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してpDNA/CS−S−S−TCAの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、6、12、18、24時間にpDNA/CS−S−S−TCA溶液を取って分析する。
前記製造されたpDNA/CS−S−S−TCAの安定性を確認するために、pH5.2、1.8、7.4のPBSバッファー溶液の条件で試験をする。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してpDNA/CS−S−S−TCAの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、6、12、18、24時間にpDNA/CS−S−S−TCA溶液を取って分析する。
その結果、pDNA/CS−S−S−TCAは、前記提示された条件で優れた安定性を示すことを確認し、これは、胆汁酸の一種であるタウロコール酸の結合でpHに対する安定性が増加したと説明することができる。
(MDCK−ASBT細胞を用いたpDNA/CS−S−S−TCAの毒性試験)
製造されたpDNA/CS−S−S−TCAの毒性を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
製造されたpDNA/CS−S−S−TCAの毒性を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
結果的に、pDNA/CS−S−S−TCAは90%以上の高い生存率を示すことを確認した。
(Confocal microscopyを用いた細胞吸収能確認試験)
製造されたpDNA/CS−S−S−TCAの細胞吸収能を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用いた。実験方法は、MDCK−ASBT細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ChitosanとpDNA/CS−S−S−TCAを注入する。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察する。
製造されたpDNA/CS−S−S−TCAの細胞吸収能を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用いた。実験方法は、MDCK−ASBT細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ChitosanとpDNA/CS−S−S−TCAを注入する。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察する。
その結果、対照群として用いられたpDNA/Chitosanも陽イオンの表面電荷をもっていて若干の吸収能は有することを示したが、結果的に、製造されたpDNA/CS−S−S−TCAが対照群のpDNA/Chitosanより優れた細胞吸収能を有することを確認した。
(Caco−2単層を用いたpDNA/CS−S−S−TCAの細胞透過能検査)
pDNA/CS−S−S−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
pDNA/CS−S−S−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
その結果、pDNA/CS−S−S−TCAは、対照群のpDNA/CS−TCAより低い細胞透過能を有することを確認することができ、その数値はpDNA/Chitosanと類似すると確認した。これは、二硫化結合(−S−S−)によってタウロコール酸がCaco−2細胞内で分離されてタウロコール酸のみが透過をし、pDNA/CSはCaco−2細胞内に蓄積されることを示す。
(経口投与によるpDNA/CS−S−S−TCAの生体内分布度確認実験)
経口投与によるpDNA/CS−S−S−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したキトサンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与し、6時間での生体内分布を蛍光イメージを通して確認した。
経口投与によるpDNA/CS−S−S−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したキトサンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与し、6時間での生体内分布を蛍光イメージを通して確認した。
その結果、pDNA/CS−S−S−TCAは小腸、特に回腸を通して吸収され、肝にも若干の吸収が進むことを確認した。これは、小腸までは既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路にそのまま沿うものであり、小腸で二硫化結合(−S−S−)が分離されて製造されたpDNA/Chitosanがタウロコール酸の循環経路を外れて小腸内に蓄積されることを示す。
実施例15:TCAが二硫化結合で共有結合したプロタミン(以下、「Prot−S−S−TCA」という)の製造
Prot−S−S−NH2の製造
システイン(10mmol)を10mLのMESバッファー(50mmol、pH6)に溶解させ、溶液が透明になるまで冷浴で撹拌させた。過剰のEDC(システインに対して2.4当量)を加えて10分間撹拌させた後、常温で過剰のNHS(EDCに対して2.5倍当量)を加えて10分間撹拌させた。EDCとNHSによるカルボキシル基の活性後、プロタミン(150mmol)を加えて、pH7で24時間反応させた。反応が終わると、2次蒸留水で24時間透析し、凍結乾燥してProt−S−S−NH2を得た。
Prot−S−S−NH2の製造
システイン(10mmol)を10mLのMESバッファー(50mmol、pH6)に溶解させ、溶液が透明になるまで冷浴で撹拌させた。過剰のEDC(システインに対して2.4当量)を加えて10分間撹拌させた後、常温で過剰のNHS(EDCに対して2.5倍当量)を加えて10分間撹拌させた。EDCとNHSによるカルボキシル基の活性後、プロタミン(150mmol)を加えて、pH7で24時間反応させた。反応が終わると、2次蒸留水で24時間透析し、凍結乾燥してProt−S−S−NH2を得た。
Prot−S−S−TCAの製造
活性化されたプロタミンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて活性化されたプロタミン(100nmol)を追加する。この後、常温で1時間反応させてProt−S−S−TCAを製造した(図15)。
活性化されたプロタミンにTCAをコンジュゲーションさせるために、TCA(50mmol)をDMSO(10mL)に溶解させた後、4−NPC(200mg)およびTEA(100μg)を加えて活性化されたプロタミン(100nmol)を追加する。この後、常温で1時間反応させてProt−S−S−TCAを製造した(図15)。
実施例16:TCAが二硫化(Disulfide)結合で共有結合したプロタミンおよびpDNAを含むナノ粒子(以下、「pDNA/Prot−S−S−TCA」という)の製造
Prot−S−S−TCA(200μg)とpDNA(1μg)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたProt−S−S−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/Prot−S−S−TCAを得た。(収得率:80%、図16)。
Prot−S−S−TCA(200μg)とpDNA(1μg)をそれぞれHEPESバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたProt−S−S−TCA溶液を撹拌し、同時にpDNAの入ったHEPESバッファー溶液を10μlずつ追加した。定められた量のpDNAをすべて追加した後、10分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物pDNA/Prot−S−S−TCAを得た。(収得率:80%、図16)。
(TNBSA方法および表面電荷の測定を利用したProt−S−S−TCAの合成検証)
Prot−S−S−TCAの合成を検証するためにTNBSA方法を利用し、より正確には、プロタミンのアミングループを数量化して消耗したアミングループ、すなわち、TCAが結合した比率を測定した。また、Zeta potential分析機器を用いて表面電荷を測定した。
Prot−S−S−TCAの合成を検証するためにTNBSA方法を利用し、より正確には、プロタミンのアミングループを数量化して消耗したアミングループ、すなわち、TCAが結合した比率を測定した。また、Zeta potential分析機器を用いて表面電荷を測定した。
その結果、プロタミンに対してタウロコール酸の供給比が増加すれば増加するほどプロタミンのアミングループが減少することを確認し、これによって表面電荷も減少することを確認した。このような変化は供給比1:15まで行われ、供給比1:15の後には大きな変化を見せなかった。これにより、タウロコール酸が効果的にプロタミンに結合し、最適な供給比は1:15であることを確認した。
(電気泳動方法と粒子サイズ、表面電荷の分析によるpDNA/Prot−S−S−TCAの製造確認)
pDNA/Prot−S−S−TCAの製造を確認するために電気泳動方法と粒子サイズ、表面電荷を測定して確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:5、25、50、100、150、200の比を比較して最適な条件を確認した。
pDNA/Prot−S−S−TCAの製造を確認するために電気泳動方法と粒子サイズ、表面電荷を測定して確認し、背景条件はHEPESバッファー溶液を用い、重量比を1:5、25、50、100、150、200の比を比較して最適な条件を確認した。
電気泳動方法により確認した結果、製造されたpDNA/Prot−S−S−TCAは非常に安定して製造され、最小1:5の重量比を用いて製造した時、完全に製造されることを確認した。そして、粒子サイズの変化および表面電荷値を適用して最適な重量比は1:200に設定した。
(pDNA/Prot−S−S−TCAのpHに対する安定性試験)
前記製造されたpDNA/Prot−S−S−TCAの安定性を確認するために、pH5.2、1.8、7.4のPBSバッファー溶液の条件で試験をした。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してpDNA/Prot−S−S−TCAの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、6、12、24時間にpDNA/Prot−S−S−TCA溶液を取って分析した。
前記製造されたpDNA/Prot−S−S−TCAの安定性を確認するために、pH5.2、1.8、7.4のPBSバッファー溶液の条件で試験をした。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してpDNA/Prot−S−S−TCAの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、6、12、24時間にpDNA/Prot−S−S−TCA溶液を取って分析した。
その結果、pDNA/Prot−S−S−TCAは、前記提示された条件で優れた安定性を示すことを確認し、これは、胆汁酸の一種であるタウロコール酸の結合でpHに対する安定性が増加したと説明することができる。
(MDCK−ASBT細胞を用いたpDNA/Prot−S−S−TCAの毒性試験)
製造されたpDNA/Prot−S−S−TCAの毒性を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
製造されたpDNA/Prot−S−S−TCAの毒性を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用い、毒性の検証方法としてはMTT実験方法を利用した。
結果的に、pDNA/Prot−S−S−TCAは90%以上の高い生存率を示すことを確認した。
(Confocal microscopyを用いた細胞吸収能確認試験)
製造されたpDNA/Prot−S−S−TCAの細胞吸収能を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用いた。実験方法は、MDCK−ASBT細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ProtとpDNA/Prot−S−S−TCAを注入した。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察した。
製造されたpDNA/Prot−S−S−TCAの細胞吸収能を確認するためにMDCK−ASBT細胞を用いた。実験方法は、MDCK−ASBT細胞を105cell/wellの濃度で8well plateに分譲させて準備した後、サンプルRhdamine−Bが結合したpDNA/ProtとpDNA/Prot−S−S−TCAを注入した。2時間の培養後、PBSを用いて3回の洗浄過程を経てconfocal microscopyを用いて観察した。
その結果、対照群として用いられたpDNA/Protも陽イオンの表面電荷をもっていて若干の吸収能は有することを示したが、結果的に、製造されたpDNA/Prot−S−S−TCAが対照群のpDNA/Protより優れた細胞吸収能を有することを確認した。
(Caco−2単層を用いたpDNA/Prot−S−S−TCAの細胞透過能検査)
pDNA/Prot−S−S−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、試験直後、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
pDNA/Prot−S−S−TCAの細胞透過能を検証するためにCaco−2細胞を単層培養して試験をした。試験は計6時間進行し、試験直後、10分、30分、1、2、4、6時間にサンプルを採取して検査した。
その結果、pDNA/Prot−S−S−TCAは、対照群のpDNA/Prot−TCAより低い細胞透過能を有することを確認することができ、その数値はpDNA/Protと類似すると確認した。これは、二硫化結合(−S−S−)によってタウロコール酸がCaco−2細胞内で分離されてタウロコール酸のみが透過をし、pDNA/Prot、より正確にはpDNA/Prot−SHはCaco−2細胞内に蓄積されることを意味する。
(製造されたpDNA/Prot−S−S−TCAの遺伝子発現による遺伝子伝達能検証)
pDNA/Prot−S−S−TCAの遺伝子発現効果検証のためにLuciferase方法を利用した。対照群としては、pDNA、Prot、Prot−TCA、そしてbPEIを用いた。
pDNA/Prot−S−S−TCAの遺伝子発現効果検証のためにLuciferase方法を利用した。対照群としては、pDNA、Prot、Prot−TCA、そしてbPEIを用いた。
その結果、pDNA/Prot−S−S−TCAは、陰性対照群であるpDNA、Prot、Prot−TCAより最小2倍最大10倍以上の効果を有することを確認し、陽性対照群であるbPEIと類似の遺伝子伝達効果を有することを確認した。
(経口投与によるpDNA/Prot−S−S−TCAの生体内分布度確認実験)
経口投与によるpDNA/Prot−S−S−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したプロタミンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与し、6時間での生体内分布を蛍光イメージを通して確認した。
経口投与によるpDNA/Prot−S−S−TCAの生体内分布度確認実験のためにRhodamine Bが結合したプロタミンを用い、マウスはBalb/c7週齢を用い、6時間の絶食後に薬物を経口投与し、6時間での生体内分布を蛍光イメージを通して確認した。
その結果、pDNA/Prot−S−S−TCAは回腸を通して吸収され、肝には全く吸収されないことを確認した。これは、小腸までは既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路をそのまま沿うものであり、小腸で二硫化結合(−S−S−)が分離されて製造されたpDNA/Protがタウロコール酸の循環経路を外れて小腸内に蓄積されることを意味する。証拠資料として、Prot−TCAは、小腸を経て肝においても高い量の吸収率を示したことを確認することができる。
実施例17:TCAが共有結合したヒアルロン酸(HA−TCA)の製造
TCAはHAとコンジュゲーションを誘導するために初期アミノ化された。アミノ化されたTCAの合成は次の通りである。
TCAはHAとコンジュゲーションを誘導するために初期アミノ化された。アミノ化されたTCAの合成は次の通りである。
TCA−NH2の製造
0℃でTCA(1mmol)をDMF(dimethylformamide)(5mL)に溶解させ、溶液が透明になるまで撹拌した。TEA(6mmol)および4−NPC(5mmol)を順に加えて、0℃で1時間反応させた後、常温で6時間さらに撹拌した。その後、5000rpmで遠心分離した後、ペレットをエチルアセテート(20mL)に分散させ、分別漏斗に移し、同量の2次蒸留水を加えて抽出した。水層を集めて回転蒸発器で残っている有機溶媒を除去した後、48時間凍結乾燥させてTCA−NPCを得た。
0℃でTCA(1mmol)をDMF(dimethylformamide)(5mL)に溶解させ、溶液が透明になるまで撹拌した。TEA(6mmol)および4−NPC(5mmol)を順に加えて、0℃で1時間反応させた後、常温で6時間さらに撹拌した。その後、5000rpmで遠心分離した後、ペレットをエチルアセテート(20mL)に分散させ、分別漏斗に移し、同量の2次蒸留水を加えて抽出した。水層を集めて回転蒸発器で残っている有機溶媒を除去した後、48時間凍結乾燥させてTCA−NPCを得た。
形成されたTCA−NPC(1mmol)をDMF(5mL)に溶解させた後、4−MMP(4−mercapto−4−methylpentan−2−one)(2mmol)を加えて、50℃で60分間撹拌させた。その後、エチレンジアミン(100mmol)を滴加し、常温で16時間反応させた。過剰のアセトンを加えて生成された沈殿物を濾過した後、48時間凍結乾燥させてTCA−NH2を得た(図17)。
HA−TCAの製造
TCAとHA(hyaluronic acid)のコンジュゲーションはEDC/NHS chemistryにより行われた。HAのカルボキシル基は、初期pH4、4℃でEDC(200mg)で15分間処理された。その後、NHS(100μg)を加えて10分間撹拌した。TCA−NH2(100μg)を加えて、pH7、常温で7時間反応させた。反応が終わると、2次蒸留水で24時間透析膜(MWCO:1000Da)を用いて透析した後、48時間凍結乾燥してHA−TCAを得た[収得率10%、図18]。
TCAとHA(hyaluronic acid)のコンジュゲーションはEDC/NHS chemistryにより行われた。HAのカルボキシル基は、初期pH4、4℃でEDC(200mg)で15分間処理された。その後、NHS(100μg)を加えて10分間撹拌した。TCA−NH2(100μg)を加えて、pH7、常温で7時間反応させた。反応が終わると、2次蒸留水で24時間透析膜(MWCO:1000Da)を用いて透析した後、48時間凍結乾燥してHA−TCAを得た[収得率10%、図18]。
実施例18:TCAが共有結合したヘパリン(Hep−TCA)の製造
HAの代わりにHepを用いたことを除けば、実施例17と同様の方法でHep−TCAを得た。
HAの代わりにHepを用いたことを除けば、実施例17と同様の方法でHep−TCAを得た。
TCAのアミノ化はTCAとHAまたはHepとの間の安定したアミド結合を形成するのに役立った。図18に示された1H NMR分析の結果、δ8ppmでTCAとHAとの間のアミド結合コンジュゲーションピークが検出された。
TNBS分析により、TCAの成功したアミノ化を確認した。このような結果からそれぞれのTCA分子はそのバックボーン内に1つのアミン基を有することが分かった。TCAとしてHepまたはHAのコンジュゲーションは1H NMR分析により確認された[図18]。1.0〜1.5ppm付近のピークからTCAモイエティの存在および3.5〜3.9ppm付近のピークからHAモイエティの存在が確認され、8ppmの新しいピークからTCAとHAとの間の安定したアミド結合が形成されたことが確認された。
HepまたはHAに結合したTCA分子の数を定量化するために硫酸分析を実施した。この後、実験はHepまたはHAとTCAが1:5のコンジュゲーション比率を有するHA−TCAまたはHep−TCAで行った。しかも、これらのゼータ電位は負電荷を示した。
実施例19:Prot/GLP−1/HA−TCAの製造
10mM HEPESバッファー(pH7.4)に溶解したProt(1mg/mL)をストック溶液として用いた。GLP−1をコーディングする遺伝子(7.780mg)を10mM HEPESバッファー(pH7.4)(1.922mL)に溶解させてGLP−1遺伝子溶液を製造した。gentle vortex下、GLP−1遺伝子溶液をストックProt溶液に滴加してProt/GLP−1イオン複合体溶液を製造した。Prot/GLP−1イオン複合体のProt:GLP−1が1:20のモル比の場合、正のゼータ電位および強い相互作用が現れた。
10mM HEPESバッファー(pH7.4)に溶解したProt(1mg/mL)をストック溶液として用いた。GLP−1をコーディングする遺伝子(7.780mg)を10mM HEPESバッファー(pH7.4)(1.922mL)に溶解させてGLP−1遺伝子溶液を製造した。gentle vortex下、GLP−1遺伝子溶液をストックProt溶液に滴加してProt/GLP−1イオン複合体溶液を製造した。Prot/GLP−1イオン複合体のProt:GLP−1が1:20のモル比の場合、正のゼータ電位および強い相互作用が現れた。
gentle vortex下、前記Prot/GLP−1イオン複合体をHA−TCA水溶液に1:1(v/v)で加えて、常温で30分間培養させた後、凍結乾燥してprot/GLP−1/HA−TCAを得た(収得率20%)。
実施例20:prot/GLP−1/Hep−TCAの製造
HAの代わりにHepを用いたことを除けば、実施例19と同様の方法でprot/GLP−1/Hep−TCAを得た。
HAの代わりにHepを用いたことを除けば、実施例19と同様の方法でprot/GLP−1/Hep−TCAを得た。
GLP−1およびProtの間の異なるモル比率を有するProt/GLP−1イオン複合体を製造し、ゲルリタデーション実験により、Protに対してGLP−1をコーディングする遺伝子が1:20のモル比率で複合化されていることが確認された。
prot/GLP−1イオン複合体は血清内で安定しており、Hep−TCAまたはHA−TCAでProt/GLP−1イオン複合体をコーティングしてもProt/GLP−1イオン複合体の構造的完全性を失うことなく依然として血清内安定していることを確認した。また、TEM分析により、Hep−TCAまたはHA−TCAでProt/GLP−1イオン複合体をコーティングする場合、185nmから235nmに粒子サイズが増加することを確認し、また、Hep−TCAまたはHA−TCAでProt/GLP−1遺伝子複合体をコーティングした後、TEM顕微鏡写真から透明なコーティングシェルが観察された。
多様なpH条件で粒子の安定性を確認した。すなわち、胃腸管(GI tract)の胃、十二指腸および回腸(ileum)断片でのpH条件と類似のpH3、pH5およびpH7.4の3つのpH溶液に入れて、粒子サイズを観察した。その結果、prot/GLP−1イオン複合体はpH3で不安定であったが、Hep−TCAまたはHA−TCAのような多糖類−TCA高分子でコーティングされたprot/GLP−1遺伝子複合体は、Hep−TCAまたはHA−TCAのような多糖類−TCA高分子のコーティングによって粒子の安定性が改善され、pH3で24時間まで安定していることを確認した。したがって、多糖類−TCA高分子でコーティングされた後、粒子は安定していることを確認した。
実験例7:試験管内(in vitro)遺伝子発現およびトランスウェル(transwell)研究
ASBT(Apical Sodium−dependent Bile Salt Transporter)−過発現MDCK細胞およびCaco−2細胞株を用いて緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein、GFP)の発現を観察した。
ASBT(Apical Sodium−dependent Bile Salt Transporter)−過発現MDCK細胞およびCaco−2細胞株を用いて緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein、GFP)の発現を観察した。
実施例19および20の遺伝子伝達用ナノ粒子にeGFP遺伝子4μgをローディングした後、前記細胞株から成功した発現および緑色蛍光を観察した。
次に、二重層細胞培養技術で遺伝子複合体の伝達を研究するために、トランスウェルプレートの頂端部位でCaco−2単層を培養し、基底部位でMDCK−ASBT細胞株を培養した。Hep−TCAおよびHA−TCAそれぞれがコーティングされたProt/GLP−1/HA−TCA(実施例19)およびProt/GLP−1/Hep−TCA(実施例20)の伝達を分析した。Caco−2単層でProt/GLP−1/HA−TCA(実施例19)およびProt/GLP−1/Hep−TCA(実施例20)からeGFPの最小限の発現が観察された。これから、シェルは標的遺伝子の放出において重要な役割を果たしていることが分かった。
培地で糖数値に反応して試験管内のGLP−1の発現を数値化するGLP−1 ELISAキットを用いた結果、GLP−1をコーディングする遺伝子の向上した発現が現れた。
実験例8:Prot/eGFP/多糖類−TCA遺伝子複合体の生体内(in vivo)生体分布(bio distribution)
eGFPローディングされたProt/GLP−1/HA−TCA(実施例19)およびProt/GLP−1/Hep−TCA(実施例20)の生体内生体分布を調べるために、下記の実験を行った。
eGFPローディングされたProt/GLP−1/HA−TCA(実施例19)およびProt/GLP−1/Hep−TCA(実施例20)の生体内生体分布を調べるために、下記の実験を行った。
Balb/cマウスを木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。治療遺伝子複合体の経口投与前の12時間、前記動物を絶食させた。絶食12時間後、eGFP遺伝子100μgを含有する試料を経口胃管栄養法(oral gavage)で投与した。投与24時間後に動物を犠牲にし、共焦点顕微鏡(confocal microscope)で生体内遺伝子発現および試料の生体内分布を定量化した。
その結果、本発明の遺伝子伝達複合体は、HA−TCAまたはHep−TCAによって回腸および肝断片での向上したeGFP遺伝子の発現を確認した。
実験例9:生体内(in vivo)GLP−1をコーディングする遺伝子の発現および血糖数値の調節
5週齢のZDFR(Zucker diabetic fatty rats)を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。治療遺伝子複合体の経口投与前の12時間、前記動物を絶食させた。絶食12時間後、Prot/GLP−1/HA−TCA(実施例19)およびProt/GLP−1/Hep−TCA(実施例20)100μgをそれぞれ経口投与させた。投与24時間後、所定の時間間隔で尾静脈から血液を採取して血糖数値を測定した。驚くべきことに、血糖数値が正常血糖数値に調節されたことを確認した。5日後、実験動物を犠牲にし、ELISAキットで異なる組織でのGLP−1およびインスリンの発現を分析した。その結果、対照群と比較して、GLP−1 loaded polysaccharide−TCA gene complexesの経口投与後、GLP−1ペプチドとインスリンタンパク質の向上した発現が現れた。
5週齢のZDFR(Zucker diabetic fatty rats)を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。治療遺伝子複合体の経口投与前の12時間、前記動物を絶食させた。絶食12時間後、Prot/GLP−1/HA−TCA(実施例19)およびProt/GLP−1/Hep−TCA(実施例20)100μgをそれぞれ経口投与させた。投与24時間後、所定の時間間隔で尾静脈から血液を採取して血糖数値を測定した。驚くべきことに、血糖数値が正常血糖数値に調節されたことを確認した。5日後、実験動物を犠牲にし、ELISAキットで異なる組織でのGLP−1およびインスリンの発現を分析した。その結果、対照群と比較して、GLP−1 loaded polysaccharide−TCA gene complexesの経口投与後、GLP−1ペプチドとインスリンタンパク質の向上した発現が現れた。
実験例10:bile acid mediated non−viral vectorsの生体内(in vivo)毒性
4週齢のSDラット(Sprague Dowley rats)を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子、すなわち、prot/GLP−1/HA−TCA(実施例19)およびprot/GLP−1/Hep−TCA(実施例20)をそれぞれ異なる濃度で経口および静脈投与した。所定の時間間隔で実験動物の血液を採取して一般の血液内容物(complete blood content)を分析し、肝および腎臓の活性を決定する生物学的マーカーの発現を評価した。その結果、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子を非常に高い濃度で投与したしても毒性がほとんど現れなかった。
4週齢のSDラット(Sprague Dowley rats)を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子、すなわち、prot/GLP−1/HA−TCA(実施例19)およびprot/GLP−1/Hep−TCA(実施例20)をそれぞれ異なる濃度で経口および静脈投与した。所定の時間間隔で実験動物の血液を採取して一般の血液内容物(complete blood content)を分析し、肝および腎臓の活性を決定する生物学的マーカーの発現を評価した。その結果、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子を非常に高い濃度で投与したしても毒性がほとんど現れなかった。
投与7日後に動物を犠牲にし、他の臓器の免疫組織検査を実施した。その結果、組織内でいかなる炎症も観察されておらず、毒性もほとんど現れなかった。
したがって、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、安全で、無毒性であり、糖尿病の治療に使用可能であることが分かった。
以上、本発明の実施例について詳細に記述されたが、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、添付した請求の範囲に定義された本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明を多様に変形して実施できる。したがって、本発明のこれからの実施例の変更は、本発明の技術を逸脱することがない。
本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、摂取された食事を感知し、生物学的システム内の血糖数値とインスリン分泌を調節できる新たな経口遺伝子伝達システムであって、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子を含む。
本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、負電荷の遺伝子と陽イオン性高分子の静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に負電荷の遺伝子が封入されたイオン複合体がナノ粒子のコア部分に存在し、前記陽イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性の陰イオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸またはその誘導体が表面修飾された形態のナノ粒子である。
また、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、負電荷の遺伝子と陽イオン性高分子の静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に負電荷の遺伝子が封入されたイオン複合体がナノ粒子のコア部分に存在し、前記イオン複合体の陽イオン性高分子と、親水性の陰イオン性基を有する胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陰イオン性高分子が静電的相互作用で結合して前記陰イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性のイオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸またはその誘導体が表面修飾された形態のナノ粒子である。
したがって、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、陽イオン性高分子と遺伝子を直接的な物理的な結合により胃酸から防御をし、安全に小腸細胞に伝達することができ、また、小腸細胞内にGLP−1遺伝子を発現するL−Cellでのみ発現させる標的型ナノ粒子として用いることができる。
治療遺伝子を標的細胞に伝達するために、本発明の胆汁酸またはその誘導体が表面修飾されたナノ粒子を用いる場合、腸粘膜を通して遺伝子をよく伝達すると同時に、ナノ粒子のコアに存在するイオン複合体によって胃腸管で非常に安定している。これから、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、経口投与用に非常に好適であることが分かる。
本発明に係るナノ粒子の表面に修飾された胆汁酸によってナノ粒子のGI分解を抑制し、小腸の回腸部分で腸細胞膜の胆汁酸受容体であるASBT(apical sodium bile acid transporter)受容体を吸収して細胞内に治療遺伝子を伝達可能で、向上した遺伝子発現を示すことができる。
特に、治療遺伝子として、GLP−1、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)を用いた場合、腸細胞内の酵素であるグルタチオンおよびpHによって、本発明に係るナノ粒子の表面に修飾された胆汁酸と陽イオン性高分子が分離されてportal veinに入り、分離された治療遺伝子は腸細胞の核にのみ伝達されて、多量のGLP−1、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)が発現して糖尿病治療効能を効率的に示す。したがって、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、糖尿病マウスモデルへの経口投与時、成功したGLP−1、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)を発現させると同時に、インスリンを分泌させて血糖降下効果を示し、糖尿病、特に第2型糖尿病を効果的に予防または治療することができる。
(配列リストFree Text)
配列リスト1:GLP−1コーディング配列(DNA Sequence)
配列リスト1:GLP−1コーディング配列(DNA Sequence)
Claims (18)
- 胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した1種以上のイオン性高分子;および
遺伝子;を含み、
前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子。 - 前記イオン性高分子は、陽イオン性高分子である、請求項1に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記陽イオン性高分子は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリ−L−リシン(PLL:poly−L−lysine)およびポリアミドアミン(PAMAM:polyamidoamine)からなる群より選択されるものである、請求項2に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記イオン性高分子は、陰イオン性高分子である、請求項1に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記陰イオン性高分子は、ヘパリン(heparin)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)およびコンドロイチン硫酸(chondroitin sulfate)から選択されるものである、請求項4に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 陽イオン性高分子をさらに含むものである、請求項4に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記陽イオン性高分子は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリ−L−リシン(PLL:poly−L−lysine)およびポリアミドアミン(PAMAM:polyamidoamine)からなる群より選択されるものである、請求項6に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子は、二硫化結合により共有結合したものである、請求項1に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記胆汁酸またはその誘導体は、デオキシコール酸(deoxycholic acid)、タウロデオキシコール酸(taurodeoxycholic acid)、タウロコール酸(TCA:taurocholic acid)、グリココール酸(glycocholic acid)およびグリコケノデオキシコール酸(glycochenodeoxycholic acid)からなる群より選択されるものである、請求項1に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記胆汁酸またはその誘導体は、タウロコール酸(TCA:taurocholic acid)である、請求項9に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記遺伝子は、単鎖または二重鎖DNA(deoxyribonucleic acid)、単鎖または二重鎖RNA(ribonucleic acid)、プラスミド形DNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、リボザイム、触媒的RNAおよびヌクレオチドの中から選択された1つ以上である、請求項1に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記遺伝子は、GLP−1遺伝子(GLP−1 gene)、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)およびエキセンディン−4(exendin−4)からなる群より選択される1つ以上である、請求項11に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記胆汁酸またはその誘導体とイオン性高分子は、1:1〜1:300のモル比で共有結合するものである、請求項1に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記ナノ粒子のサイズは、500nm以下である、請求項1に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子は、1:1〜1:200のモル比で結合するものである、請求項1に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 前記ナノ粒子のN/P比(胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子の窒素原子の個数/遺伝子のリン酸塩原子の個数)は、1〜200である、請求項1に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
- 胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した1種以上のイオン性高分子およびグルカゴン様ペプチド−1(GLP−1、Glucagon like peptide−1)、GLP−1ペプチド(GLP−1 peptide)、GLP−1変異体、GLP−1誘導体、GLP−1作用剤(GLP−1 agonist)、リラグルチド(Liraglutide)またはエキセンディン−4(exendin−4)を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を有効成分として含む糖尿病治療用薬学組成物。
- 前記薬学組成物は、経口投与用である、請求項17に記載の薬学組成物。
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