KR102035696B1

KR102035696B1 - 사이티딘 5-삼인산 또는 이의 고분자를 유효성분으로 포함하는 핵 내로의 약물 전달용 조성물 및 면역 증강제

Info

Publication number: KR102035696B1
Application number: KR1020170153724A
Authority: KR
Inventors: 강한창; 조하나
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2017-11-17
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2019-10-23
Also published as: KR20190056606A

Abstract

본 발명은 사이티딘 5-삼인산(Cytidine 5-triphosphate; CTP) 및 이의 고분자를 유효성분으로 포함하는, 핵 내 약물 전달용 조성물 또는 면역 증진제에 관한 것으로, CTP 또는 이의 고분자를 포함하는 조성물은 여러 약물을 생체 내로 전달하여 생체 이용률을 최대화할 수 있는 약물 전달용 조성물 및 T 림프구의 증식이 억제된 조건에서 이를 회복할 수 있는 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

사이티딘 5-삼인산 또는 이의 고분자를 유효성분으로 포함하는 핵 내로의 약물 전달용 조성물 및 면역 증강제{Composition for Drug Delivery into Nucleus Comprising Cytidine 5-triphosphate or Polymer thereof, and Immunostimulating Agents Comprising the Same}

본 발명은 사이티딘 5-삼인산 또는 이의 고분자를 유효성분으로 포함하는 핵 내로의 약물 전달용 조성물 및 면역 증강제에 관한 것이다.

특정 장기, 조직, 세포, 세포질, 미토콘드리아, 핵 주위 부분(perinuclear regions) 및 세포핵 부위로 다양한 치료제(예를 들면, 저분자량의 화학적 약물 및 조영제뿐만 아니라 고분자량의 펩타이드, 단백질 및 유전물질)를 전달하기 위한 효과적인 시스템 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 전통적인 제형과 다르게, 위치-특이적 나노치료제는 표적 부위에 전달된 치료제의 생체이용률(bioavailability)이 최대화되도록 고안되었고, 낮은 부작용으로 질병을 치료하면서 치료 효과를 높일 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 약물전달 기술은 고부가가치 기술로서 전체 약물 개발 과정에서 갈수록 중요한 부문을 차지하고 있고, 환자들의 약물 순응도와 복용의 편리성을 제고시키는 방법으로 그 활용도가 증가하고 있다.

세포 내로 전달된 화학적 및 생물학적 제제의 엔도솜 격리(Endosomal sequestration)와 핵막에 의한 핵 내 전달(nuclear delivery) 제한은 약물의 효능 개선의 중요한 장애물이다. 엔도솜 격리는 아민, 설폰아마이드, 카르복실산, 또는 인산기를 가진 저분자나 고분자에 의해 유도되는 엔도솜-막 불안정화 또는 파괴를 통해 극복될 수 있다. 이러한 저분자/고분자는 비바이러스성 유전자 전달 및 화학 약물의 세포질 전달에서 개선된 결과를 가져온다. 또한, 엔도솜 pH에 있어서, 수소이온 완충화(proton buffering) 및 구조 전이(conformational transition) 특성은 지질막 불안정화 또는 엔도솜 파괴(endosomolysis)를 유도하는 것으로 알려져 있다. 또한, 핵 내 약물전달능은 리신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)이 많이 포함된 펩티드인 핵 국재화 신호(nuclear localization signal; NLS), 핵공을 넓혀주는 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 저분자 리간드 물질 또는, 활성화되면 핵으로 이동할 수 있는 수용체에 결합하는 리간드 또는 펩티드를 포함한 저분자/고분자를 사용함으로써 극복할 수 있다. 이러한 방법들을 통해 비바이러스성 유전자 전달 및 화학 약물의 핵 내 전달에 있어서 개선된 효과를 가져온다.

한편, 디옥시리보핵산(DNA)으로부터 단백질이 발현되는 일련의 과정은 첫째, 디옥시리보핵산으로부터 이의 상보적인 서열을 갖는 리보핵산(RNA)인 전령 리보핵산(mRNA)을 생성하는 과정인 전사(transcription), 둘째, 전령 리보핵산(mRNA)을 아미노산 서열에 맞춰 변환하여 단백질을 만드는 과정인 번역(translation), 셋째, 번역된 단백질에 탄수화물과 같은 물질이 첨가되어 단백질 고유 기능을 완성하는 단백질 번역 후 변형(post-translational modification) 과정을 통해서 최종적으로 단백질로 발현된다. 이 중, 전사과정은 단백질 발현량을 조절하는 매우 중요한 단계이다. 세포 내 변화에 따라 전사 인자(transcription factors)는 RNA 중합효소와 프로모터에 결합하거나 떨어져 전사과정을 촉진 또는 억제하여 단백질의 발현을 조절하고 세포 내 항상성을 유지한다. 예를 들어, NF-κB는 세포 내 스트레스(예; 활성산소종, 자외선 노출, 박테리아 및 바이러스 노출)에 반응하여 세포내 면역 반응에 관여하는 단백질의 발현을 조절하며, 저산소증 유도 인자(Hypoxia inducible factor; HIF)는 저산소 조건에서 세포 생존과 관련된 단백질 발현을 촉진하여 세포 생존율을 증진한다.

또한, 생체 내 면역체계(immune system)에는 다양한 장기, 조직, 세포, 생리활성 물질 등이 포함되고, 이들의 상호작용은 생체 면역체계(immune system)가 생체 내의 미생물 또는 병원균 등을 포함하는 외부에서 유래한 물질, 내부에서 질병을 유발할 수 있는 물질, 비정상적인 증식을 하는 세포 등을 제거한다. 이러한 면역체계는 감염과 질병으로부터 우리 몸을 방어하고 생체 내 항상성을 유지하는 역할을 하고, 반대로 면역체계의 이상이 생기면 잘못된 면역반응을 일으키고, 질병을 유발한다. 따라서, 면역에 관여하는 세포의 이상은 질병으로 연결되는데, 특히 T 림프구(T lymphocyte)는 백혈구의 분화와 활성을 조절하고, 직접적으로 세포 독성 물질을 분비하여 비정상적인 세포 또는 바이러스 등을 제거하는 기능을 가지고 있다. 정상 면역반응에서는 T 림프구의 증식이 정상적으로 일어나지만, T 림프구의 이상이 발생되면 적절한 면역반응이 제한된다. 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus), 수두 대상포진 바이러스(Varicella zoster virus), 피낭성 세균(encapsulated bacteria) 등에 의한 감염은 T 림프구의 증식을 억제하고, 면역반응이 정상적으로 수행 할 수 없게 되어 결과적으로 질병이 유발된다.

사이티딘 5-삼인산(Cytidine 5-triphosphate; CTP)은 DNA/RNA 합성, 인지질(phospholipid) 합성, 그리고 단백질 시알산화(sialylation) 등에 관여하여 세포 증식 및 세포크기 확장에 관여한다고 알려져 있다. 이러한 CTP는 생체 내의 다른 뉴클레오타이드(nucleotide) 중에서 가장 낮은 농도로 존재하기 때문에 그 양이 매우 세밀하게 그 양이 조절되는 바, 이를 직접 전달하는 경우에는 높은 혈중 CTP 농도는 생체 내 이상반응을 유발하고, 혈중 CTP는 쉽게 가수분해될 수 있어 T 림프구 증식에 이상이 발생될 수 있다. 따라서 CTP의 직접 전달보다는 약물전달체를 활용한 세포 내 전달이 필요하다.

한편, 한국등록특허 제10-1577274에서는 뉴클레오타이드를 이용하여 엔도솜 분해능을 개선함으로써 약물전달의 효율을 증진시키고 있으나, 본 발명에 기재된 사이티딘 5-삼인산 및 폴리(사이티딘 5-삼인산)의 핵 내 약물전달능, 유전자 전사촉진능, T 림프구 증식 억제 조건에서 세포생존율 증진능에 대해서는 언급하고 있지 않다.

한국등록특허 제10-1577274호(2015.12.08 등록).

본 발명의 목적은 효율적으로 약물을 핵 내로 전달할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 T 림프구의 증식 억제 조건에서 T 림프구의 세포 생존율을 증가시킴으로써 면역을 활성화시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이티딘 5-삼인산(Cytidine 5-triphosphate; CTP) 또는 이의 고분자[poly(Cytidine 5-triphosphate); pCTP]를 유효성분으로 포함하는 핵 내로의 약물 전달용 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 사이티딘 5-삼인산(Cytidine 5-triphosphate; CTP) 또는 이의 고분자[poly(Cytidine 5-triphosphate); pCTP]를 유효성분으로 포함하는 면역 증강제(adjuvant)를 제공한다.

본 발명은 핵 내 약물 전달능, 유전자의 전사 촉진능 및 T 림프구의 증식 억제 조건에서 T 림프구의 생존율을 증진시키는 기능을 갖는 사이티딘 5-삼인산과 이의 고분자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 사이티딘 5-삼인산과 이의 고분자가 핵 내로 약물을 전달할 수 있고, 상기 약물이 유전자일 경우 이의 전사를 촉진하여 발현을 증가시키며, T 림프구의 생존율을 증진하는 기능을 나타내는 바, 상기 사이티딘 5-삼인산 또는 이의 고분자는 핵 내 약물 전달용 조성물 내지 면역 증강제로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 및 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체의 입자크기 및 제타전위를 나타낸 것이다.
도 2는 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션시킨 Jurkat 세포의 루시퍼라아제(luciferase) 유전자 발현효율을 나타낸 것이다.
도 3은 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션시킨 DPSCs 세포의 루시퍼라아제(luciferase) 유전자 발현효율을 나타낸 것이다.
도 4는 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션시킨 ADSCs 세포의 루시퍼라아제(luciferase) 유전자 발현효율을 나타낸 것이다.
도 5는 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션시킨 Jurkat 세포에서 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체에 의해 전달된 유전자 약물의 세포 및 핵 내 유입량을 나타낸 것이다.
도 6은 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션시킨 Jurkat 세포에서 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체에 의해 전달된 유전자 약물의 세포 내 유입량 대비 핵 내 유입량을 나타낸 것이다.
도 7은 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션시킨 Jurkat 세포에서 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체에 의해 전달된 유전자 약물의 핵 내 분포를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 자유 CTP와 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 동시에 면역세포인 Jurkat 세포에 처리했을 때, bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체에 의해 전달된 유전자 약물의 세포 내 유입량 또는 핵 내 유입량의 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션시킨 면역세포인 Jurkat 세포의 mRNA의 발현량을 나타낸 것이다.
도 10은 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, 프로타민(Protamine)/CTP 복합체 또는 프로타민/CTP 복합체의 입자크기 및 제타전위를 나타낸 것이다.
도 11은 디아자우리딘(Deazauridine)이 전처리된 Jurkat 세포 증식 억제 조건에서 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, 프로타민/CTP 복합체 또는 프로타민/pCTP 복합체에 의한 Jurkat 세포의 생존율 변화를 나타낸 것이다.
도 12는 디아자우리딘(Deazauridine)이 전처리된 Jurkat 세포 증식 억제 조건에서 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, 프로타민/CTP 복합체 또는 프로타민/pCTP 복합체에 의한 Jurkat 세포의 세포자멸사 변화를 나타낸 것이다.
도 13은 디아자우리딘(Deazauridine)이 전처리된 Jurkat 세포 증식 억제 조건에서 bPEI25kDa/CTP 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP 복합체에 의한 Jurkat 세포의 세포 주기 변화를 나타낸 것이다.
도 14는 디아자우리딘(Deazauridine)과 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, 프로타민/CTP 복합체 또는 프로타민/pCTP 복합체를 동시에 Jurkat 세포에 처리했을 때의 Jurkat 세포의 생존율 변화를 나타낸 것이다.
도 15는 디아자우리딘(Deazauridine)과 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, 프로타민/CTP 복합체 또는 프로타민/pCTP 복합체를 동시에 Jurkat 세포에 처리했을 때의 Jurkat 세포의 세포자멸사 변화를 나타낸 것이다.
도 16은 디아자우리딘(Deazauridine)과 bPEI25kDa/CTP 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP 복합체를 동시에 Jurkat 세포에 처리했을 때의 Jurkat 세포의 세포 주기 변화를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 발명자들은 사이티딘 5-삼인산 및 이의 고분자가 핵 내 약물 전달능 및 유전자 약물 전사 촉진능을 가짐으로써 세포 내로 전달된 약물을 효과적으로 핵 내로 전달하고 유전자 약물의 단백질 발현을 증진시킬 수 있는 생기능성(biofunctional)이 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

또한, T 림프구의 증식 억제 조건에서 사이티딘 5-삼인산 및 이의 고분자가 T 림프구의 생존율을 증진시키는 기능을 가짐으로써 T 림프구의 증식능 이상을 극복할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 사이티딘 5-삼인산(Cytidine 5-triphosphate; CTP) 또는 이의 고분자[poly(Cytidine 5-triphosphate); pCTP]를 유효성분으로 포함하는 핵 내로의 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "CTP"는 사이티딘 5-삼인산(cytidine 5-triphosphate)의 약어이며 "pCTP"는 사이티딘 5-삼인산의 고분자인 폴리(사이티딘 5-삼인산)[poly(Cytidine 5-triphosphate)]의 약어이다.

상기 CTP 및 pCTP는 세포의 핵 내로 약물을 전달할 수 있으므로, 특히 단백질, 유전자와 같은 거대분자 약물의 핵막 및 핵공에 의한 핵 내 유입 저감 현상을 해결할 수 있으며, 특히 비바이러스성 유전자와 같이 세포의 핵 내로 전달되어야 하는 약물의 생체 이용률을 현저히 향상시킬 수 있다.

이때, 상기 pCTP는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 5 내지 10,000 사이의 정수이다.

본 발명에서 사용되는 상기 "약물"은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에 대한 예방효과를 가지고, 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 할 수 있다.

바람직하게는, 상기 약물은 친수성 및 소수성 화학 약물, 펩타이드 약물, 유전자 약물 및 진단용 약물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 CTP 또는 pCTP를 포함하는 조성물은 유전자의 전사 촉진능을 나타내는 바, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물이 유전자 약물인 경우, 상기 유전자 약물은 조성물에 봉입되어 핵 내로 전달되고, 조성물에 포함된 CTP 또는 pCTP에 의해 그 발현이 증가할 수 있으며, 이때, 상기 유전자 약물은 CTP 또는 pCTP에 의해 유전자 전사가 촉진됨으로써 발현이 증가할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 약물 전달용 고분자를 더 포함하여 약물 전달 복합체를 형성할 수 있다.

이때, 약물 전달용 고분자는 폴리에틸렌이민(bPEI), 폴리리신(PLL), 폴리(아르기닌)[poly(arginine)], 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리(아미도아민)[poly(amido amine)], 폴리(베타 아미노 에스테르)[poly(beta amino ester)], 키토산(chitosan), 프로타민(protamine), 히스톤(histone), 폴리(3차 아민 메타크릴레이트)[poly(tertiary amine methacrylate)], 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트[poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)], 폴리(N-[N-(2-아미노에틸)-2-아미노에틸]아스팔트아미드(poly(N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide), 지질, 인지질, 고분자유래 나노구조체, 금속유래 나노구조체, 탄소유래 나노구조체, 칼슘포스페이트 나노구조체, 다공성 실리카 나노구조체 및 이들의 복합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 CTP 또는 pCTP를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 유효한 양"이란 약물이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다.

상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 이외에도 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

더불어, 본 발명은 사이티딘 5-삼인산(Cytidine 5-triphosphate; CTP) 또는 이의 고분자[poly(Cytidine 5-triphosphate); pCTP]를 유효성분으로 포함하는 면역 증강제(adjuvant)를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 디아자우리딘(Deazauridine)을 이용한 T 림프구의 증식 억제 조건에서 상기 CTP 또는 pCTP가 포함된 조성물이 T 림프구의 세포 생존율을 개선시키는 것을 확인하였다.

즉, 상기 CTP 또는 pCTP는 T 림프구의 세포 자멸을 억제함으로써 생존율을 증가시킬 수 있고, 또한, 상기 CTP 또는 pCTP는 T 림프구에서 DNA의 합성을 증진시킴으로써 생존율을 증가시킬 수 있는 바, 면역 증강제로서 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 pCTP는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 5 내지 10,000 사이의 정수이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<준비예 1> pCTP의 합성

단량체인 CTP를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC), N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), 트리에틸아민(triethylamine; TEA) 존재 하에 수용액 상에서 교반 반응하였다. 합성된 고분자와 부산물을 투석을 이용해 분리정제한 후, 동결건조하여 pCTP를 얻었다.

본 발명에서 반응 시 단량체 및 반응물의 몰비는 CTP : EDC : NHS = 1 : 1 : 1였고, CTP 200 mg을 물 5 mL에 녹여 사용하였다. 이때, 사용된 TEA는 100 μL였고, 교반 반응은 48시간 동안 상온에서 진행하였다. 합성된 고분자 수용액을 MWCO(molecular weight cut-off)가 3500 달톤인 투석막 안에 넣고, 밖의 물을 48시간 동안 최소 10번 이상 갈아주어 부산물과 저분자량 뉴클레오타이드를 제거하였으며, 분리정제 작업은 상온에서 진행했다. 투석막 안에 남은 수용액을 동결건조하여 pCTP 화합물을 얻었다.

<실시예 1> CTP 또는 pCTP가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체의 유전자 발현 효율 평가

CTP 또는 pCTP를 잘 알려진 고분자/유전자 복합체 내에 봉입시키기 위해, 양전하성 고분자인 폴리에틸렌이민(bPEI25kDa, 분자량 25 kDa) 용액과, 플라스미드 DNA(pDNA)와 CTP 또는 상기 준비예 1에서 제조한 pCTP를 함유한 음전하 용액을 각각 준비한 후, 두 용액을 섞어 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체를 만들었다. N/P 비율은 5가 되도록 준비하는데, 이때 CTP 또는 pCTP의 포스페이트(phosphate)는 고려하지 않았고, bPEI25kDa의 아민(amine)과 pDNA의 포스페이트(phosphate)로만 계산했다.

상기 복합체들의 입자크기 및 제타전위를 측정한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 내에 pDNA의 1 마이크로그램 당 CTP 농도가 각각 1, 2, 4 nmol 일 때, 이 복합체의 평균 입자크기는 각각 550 nm, 620 nm, 675 nm 정도였고, 평균 제타전위는 각각 +16 mV, -22 mV, -27 mV였다. 또한 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체 내에 pDNA의 1 마이크로그램 당 pCTP 농도가 각각 1, 2, 4 nmol 일 때, 이 복합체의 평균 입자크기는 각각 445 nm, 354 nm, 210 nm 정도였고, 평균 제타전위는 각각 +8.2 mV, -5 mV, -8.5 mV였다.

루시퍼라아제(luciferase)를 발현하는 플라스미드DNA(pDNA)를 이용하여 준비된 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체를 CTP가 포함되지 않은 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체와 비교하여 봉입된 CTP 또는 pCTP에 의한 유전자 발현 효율의 증진을 평가하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트의 한 웰 당 2×10⁵ 개의 인간 급성백혈병세포인 Jurkat 세포 또는 12 웰 플레이트 한 웰 당 1×10⁵ 개의 치수 유래 줄기세포인 DPSCs(Dental pulp stem cells) 또는 지방유래 줄기세포인 ADSCs(Adipose tissue-derived stem cells)를 넣은 후 24시간 동안 배양하였다. 준비된 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체 용액을 배양된 세포에 트랜스펙션하고, 48시간 후에 트랜스펙션된 세포의 유전자 발현효율을 루시퍼라아제의 발현량을 이용하여 평가하였다. 봉입된 CTP 또는 pCTP의 농도가 0일 때 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체를 형성하고, 이 복합체의 유전자 발현효율과 상대적으로 비교하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 Jurkat 세포에 CTP 농도가 2 nmol/μg pDNA, 4 nmol/μg pDNA인 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션하면 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 유전자 발현효율에 비해 각각 약 11배, 약 20배 증가하였고, CTP 농도가 2 nmol/μg pDNA, 4 nmol/μg pDNA인 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션하면 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 유전자 발현효율에 비해 각각 약 16배, 약 42배 증가하였다.

또한, 도 3에서 나타난 바와 같이 DPSCs 세포에 CTP 농도가 1 nmol/μg pDNA, 2 nmol/μg pDNA, 4 nmol/μg pDNA인 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션하면 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 유전자 발현효율에 비해 각각 약 5배, 약 5배, 약 14배 증가하였고, CTP 농도가 1 nmol/μg pDNA, 2 nmol/μg pDNA, 4 nmol/μg pDNA인 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션하면 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 유전자 발현효율에 비해 각각 약 5배, 약 6배, 약 14배 증가하였다.

더욱이, 도 4에서 나타난 바와 같이 ADSCs 세포에 CTP 농도가 1 nmol/μg pDNA, 2 nmol/μg pDNA, 4 nmol/μg pDNA인 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션하면 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 유전자 발현효율에 비해 각각 약 24배, 약 680배, 약 427배 증가하였고, CTP 농도가 1 nmol/μg pDNA, 2 nmol/μg pDNA, 4 nmol/μg pDNA인 bPEI25kDa/pCTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션하면 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 유전자 발현효율에 비해 각각 약 370배, 약 380배, 약 1215배 증가하였다.

즉, 도 2, 도 3 및 도 4는 CTP 및 pCTP를 포함한 비바이러스성 유전자 약물전달체 조성물을 세포에 처리하면 CTP와 pCTP에 의해 유전자 발현 효율이 증진되는 것을 확인시켜 준다.

< 실시예 2> CTP가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체 내 유전자 약물의 세포 및 핵 내 유입

CTP 및 pCTP가 유전자 약물전달체의 세포 및 핵 내 유입량에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 모델 약물 CTP를 이용하여 평가하였다. 구체적으로, 플라스미드 DNA(pDNA)에 YOYO-1과 같은 형광 물질을 10 : 1(pDNA : YOYO-1)의 비율로 삽입시킨 뒤에, 양전하성 고분자인 폴리에틸렌이민(bPEI25kDa, 분자량 25kDa) 용액과 pDNA-YOYO-1 및 CTP를 함유한 음전하 용액을 각각 준비한 후, 두 용액을 섞어 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 만들었다.

6 웰 플레이트의 한 웰 당 2×10⁵ 개의 Jurkat 세포를 넣어 24시간 동안 배양한 후, 준비된 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 용액을 세포에 트랜스펙션하였다. 4시간동안 트랜스펙션한 세포에서 유전자 약물의 세포 내 유입량 평가를 위해 원심분리를 통해 세포를 모았다. 유전자 약물의 핵 내 유입량 평가를 위해서는 원심분리를 통해 모아진 세포로부터 핵 분리 키트(Nuclei isolation kit)를 이용해 핵을 분리하였다. 분리한 세포 및 핵 내에 존재하는 YOYO-1 형광물질의 형광값을 유세포 분석기로 평가하여 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체에 의해 전달된 pDNA의 세포 내 유입량 및 핵 내 유입량을 분석하였다. 비교를 위해 CTP가 포함되지 않은 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체를 사용하였고, 이의 Jurkat 세포 내의 유입량 및 핵 내 유입량을 각각 1로 정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Jurkat 세포에 CTP 농도가 1 nmol/μg pDNA, 2 nmol/μg pDNA인 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션하면 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 세포 내 pDNA 유입량에 비해 각각 약 2배 증가하였고, bPEI25kDa/pDNA 복합체의 핵 내 pDNA 유입량에 비해 각각 약 9배, 약 4배 증가하였다.

또한, 도 6에서 보는 바와 같이, bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체을 이용해 전달된 pDNA의 세포 내 유입량 대비 핵 내 유입량(다시 말하면, 세포 대비 핵 선호도)을 계산하면, CTP 농도가 1 nmol/μg pDNA, 2 nmol/μg pDNA인 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션하면 bPEI25kDa/pDNA 복합체에 비해 각각 약 5배, 약 2배 더 핵을 선호한다. 더욱이, 도 7에서 보는 바와 같이, bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체가 bPEI25kDa/pDNA 복합체에 비해 더 많은 양의 pDNA를 Jurkat 세포의 핵 내로 전달하는 것을 공초점 현미경을 이용해 확인하였다.

< 실시예 3> 자유 CTP 존재 시, CTP가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체 내 유전자 약물의 세포 및 핵 내 유입

세포는 세포 외부의 물질을 세포 내로 유입시키고, 세포 내 소기관으로 이동시키기 위해서 세포막, 세포질, 또는 핵막에 다양한 수용체를 가지고 있다. 특정 수용체에 결합하는 리간드인지를 확인하기 위해 자유(free) 리간드를 추가적으로 도입하여 리간드의 세포 내 또는 세포 내 소기관 내 유입량 변화를 관찰한다. 본 발명에서는 CTP 또는 pCTP가 세포막, 세포질 또는 핵막에 존재하는 수용체에 결합하여 세포 내 및 핵 내로의 유전자 약물의 유입량을 증가시킨다고 가정하고, 이를 확인하기 위해서 모델 CTP가 포함된 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체와 자유 CTP(free CTP)를 Jurkat 세포에 동시에 처리하여 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체의 세포 및 핵 내 유입량의 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, bPEI25kDa/pDNA 복합체를 처리한 Jurkat 세포보다 bPEI25kDa/pDNA 복합체와 자유 CTP를 동시에 처리한 Jurkat 세포는 복합체에 의해 전달된 pDNA의 세포 내 유입량은 약 1.4배, 핵 내 유입량은 약 3배 감소하였다. 이와 달리, bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 처리한 Jurkat 세포보다 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체와 자유 CTP를 동시에 처리한 Jurkat 세포는 복합체에 의해 전달된 pDNA의 세포 내 유입량은 약 2.7배, 핵 내 유입량은 약 23.5배 감소하였다.

이러한 결과는 CTP가 세포막, 세포질, 또는 핵막에 존재하는 특정 수용체와 결합하여, 세포 내 및 핵 내로 유전자 약물 등을 효율적으로 전달할 수 있음을 보여준다.

< 실시예 4> CTP가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체가 트랜스펙션된 세포에서의 mRNA의 발현 평가

플라스미드DNA의 유전자 약물이 단백질로 발현되기 전 단계인 전령 리보핵산을 생성하는 전사과정에 CTP가 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 CTP를 포함하는 고분자 유전자 약물전달체를 Jurkat 세포에 트랜스펙션하여 mRNA 발현량을 평가하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트의 한 웰 당 2×10⁵ 개의 Jurkat 세포를 넣어 24시간 동안 배양하고, 준비된 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/pDNA 복합체 용액을 배양된 세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 3시간에 떼어낸 세포를 원심분리하여 모은 뒤, 세포로부터 mRNA를 분리하였다. 분리된 mRNA로부터 상보적인 cDNA를 합성한 뒤에, 하기 <표 1>에 개시된 바와 같이, 루시퍼라아제와 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄 반응을 통해(Real-time PCR) 세포 내 mRNA의 발현량을 평가하였다.

	프라이머 서열	서열번호
정방향	5'-CTGGGCCAGAAAGAAGCAGG-3'	1
역방향	5'-GTTTGGTGGGCTGATGAGGG-3'	2

그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이, Jurkat 세포에 CTP 농도가 2 nmol/μg pDNA, 4 nmol/μg pDNA인 bPEI25kDa/CTP-pDNA 복합체를 트랜스펙션하면 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 세포 내 루시퍼라아제의 mRNA 발현량에 비해 각각 약 25배, 약 54배 증가하였다. 이 결과는 핵 내 유입된 pDNA 양에 비해 mRNA 발현량이 각각 약 6배, 약 54배 증가하는 것으로 CTP의 전사촉진능을 확인시켜준다.

<실시예 5> CTP 와 pCTP가 포함된 고분자 약물 전달체 형성

CTP와 pCTP를 비바이러스성 약물 전달체에 봉입하여 세포 내로 전달하기 위해서 양전하성 고분자인 폴리에틸렌이민(bPEI25kDa, 분자량 25 kDa) 또는 프로타민 황산염(Protamine sulfate; PS)을 사용하여 나노크기의 입자를 형성하였다. 먼저, bPEI25kDa 또는 PS가 포함된 양전하 용액과, CTP 또는 pCTP를 함유한 음전하 용액을 각각 준비한 후, 두 용액을 섞어 bPEI25kDa/CTP, bPEI25kDa/pCTP, PS/CTP, 및 PS/pCTP 복합체를 형성하였다. 복합체를 형성할 때 양전하성 고분자와 CTP 또는 pCTP의 중량비율(weight ratio[WR])을 이용하였다.

도 10에 상기 복합체의 입자크기 및 제타전위의 측정 결과를 나타내었다. 도 10을 참조하면, bPEI25kDa/CTP 복합체는 WR 0.5, WR 1.0에서 각각 약 500 nm, 약 100 nm인 평균 입자크기를 가졌고, bPEI25kDa/pCTP 복합체 또한 WR 0.5, WR 1.0에서 각각 약 500 nm, 약 100 nm인 평균 입자크기를 가졌다. 제타전위는 bPEI25kDa의 양이 증가할수록 증가하는 것으로 나타났으며, 구체적으로 bPEI25kDa/CTP 복합체가 WR 0.5, WR 1.0에서 각각 약 +3.5 mV, 약 +5.8 mV인 평균 제타전위를 보였고, bPEI25kDa/pCTP 복합체는 WR 0.5, WR 1.0에서 각각 약 +13.5 mV, 약 +40 mV인 평균 제타전위를 나타냈다.

또한, PS/CTP 복합체와 PS/pCTP 복합체는 WR 0.5 및 WR 1.0에서 모두 약 100 nm인 평균 입자크기를 나타내었다. 제타전위는 PS의 양이 증가할수록 증가하였으며, 구체적으로 PS/CTP 복합체가 WR 0.5, WR 1.0에서 각각 약 +0.5 mV, 약 +6.6 mV인 평균 제타전위를 보였고, PS/pCTP 복합체는 WR 0.5, WR 1.0에서 각각 약 1.7 mV, 약 +1.6 mV인 평균 제타전위를 나타냈다.

< 실시예 6> 디아자우리딘이 전처리된 T 림프구의 증식 억제 조건에서 CTP 또는 pCTP가 포함된 고분자 약물 전달체의 세포 생존율 증진, 세포자멸사 억제 및 세포주기 개선

T 림프구가 특정 바이러스에 감염되면, T 림프구의 증식이 억제된다. 억제된 T 림프구 증식은 면역반응 감소시키고, 결과적으로 질병이 발생한다. 본 발명에서는 T 림프구의 세포 증식 억제 조건에서 CTP 또는 pCTP가 포함된 고분자 약물 전달체가 T 림프구의 세포 생존율을 증진시킬 수 있는지 평가하였다. 또한, CTP 또는 pCTP이 처리되는 시점이 T 림프구의 세포 증식 억제가 유발되기 전 또는 후인지에 따라 질병의 예방제 또는 치료제로서의 역할을 <실시예 6>과 하기 <실시예 7>에서 각각 평가하였다.

먼저, CTP 또는 pCTP의 치료제 역할 평가를 위해, 다음과 같은 실험과정을 거쳤다. 구체적으로, 96 웰 플레이트의 한 웰 당 1×10⁴ 개의 Jurkat 세포를 넣고, 우리딘(uridine) 유도체인 디아자우리딘(deazauridine; DA) 10 μM을 세포에 처리하여 CTP 생성을 저해하고 결과적으로 T 림프구의 증식을 억제시켰다. DA를 처리 후, 24시간이 지난 뒤에 CTP 또는 pCTP가 포함된 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 Jurkat 세포에 처리하였다. 48 시간동안 더 배양하고 Ez-Cytox를 사용하여 세포 생존율을 평가하였고, CTP 및 pCTP의 치료제 역할을 예측 및 비교하기 위해 DA 및 CTP 또는 pCTP가 포함된 고분자 약물전달체가 처리되지 않은 세포의 생존율을 100%로 정한 후 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 및 PS/pCTP 복합체의 세포 생존율을 영향을 비교하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, DA만 처리한 Jurkat 세포의 생존율은 30% 수준으로 떨어졌으나, [CTP]=0.4 μM로 준비된 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 추가적으로 처리한 Jurkat 세포는 생존율이 각각 36%, 43%, 51%, 66%로 각각 약 1.2배, 약 1.4배, 약 1.7배, 약 2.2배 증진되는 것을 확인하였다. 특히, [CTP]=5 μM 이상을 포함하는 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체는 65%~80%의 세포생존율을 보여 CTP를 처리하지 않을 때에 비해 약 2.2배~2.7배의 세포생존율 증진효과를 보였다.

전술한 결과에 따르면, CTP와 pCTP가 포함된 고분자 약물전달체를 DA에 의해 억제된 T 림프구에 처리하면 세포 생존율이 개선되었다. 이러한 세포 생존율 개선효과가 세포 자멸사와 관계되었는지 확인하기 위해 DA가 전처리된 T 림프구에 CTP 또는 pCTP가 포함된 고분자 약물 전달체를 처리 또는 미처리하여 세포 자멸사의 변화를 비교하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트의 한 웰 당 2×10⁵ 개의 Jurkat 세포를 넣고, 우리딘 유도체인 디아자우리딘(DA) 10 μM을 세포에 처리하여 CTP 생성을 저해하고 결과적으로 T 림프구의 증식을 억제시켰다. DA를 처리 후, 24시간이 지난 뒤에 CTP 또는 pCTP가 포함된 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 Jurkat 세포에 처리하였다. 48 시간동안 더 배양하고 아넥신 V-PI 염색(Annexin V-PI staining)을 통해서 세포 자멸사를 평가하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, DA가 처리되지 않은 Jurkat 세포는 세포자멸사(apoptosis) 상태의 세포가 약 6% 이하인데, DA를 처리하면 세포의 약 70%가 세포자멸사 상태가 되었다. DA가 전처리된 Jurkat 세포에 [CTP]=5 μM을 포함하는 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 처리하면, 세포자멸사 상태의 세포가 각각 약 18%, 약 14%, 약 10%, 약 10%로 감소하여 DA가 처리되지 않은 Jurkat 세포의 세포자멸사 비율에 근접해졌다.

다음으로, DA가 전처리된 Jurkat 세포에서 CTP 또는 pCTP에 의한 세포 생존율 증진 및 세포자멸사 감소가 세포주기(cell cycle)에 영향을 미치는지, 특히 DNA 합성에 영향을 주는지 확인하기 위해 세포 주기 변화를 평가하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트의 한 웰 당 2×10⁵ 개의 Jurkat 세포를 넣고, 우리딘 유도체인 디아자우리딘(DA) 10 μM을 세포에 처리하여 CTP 생성을 저해하고 결과적으로 T 림프구의 증식을 억제시켰다. DA를 처리 후, 24시간이 지난 뒤에 CTP 또는 pCTP가 포함된 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 Jurkat 세포에 처리하였다. 48 시간동안 더 배양하고 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI) 염색을 통해서 세포주기의 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 DA가 처리되지 않은 Jurkat 세포는 세포 자멸을 의미하는 서브 G1-기와 DNA를 합성하는 단계인 S-기의 세포 비율이 각각 약 8%와 약 19%이었으나, DA를 처리하면 서브 G1-기의 세포 비율은 크게 증가하여 약 40%가 되었으나, S-기의 세포비율은 약 21%로 큰 차이가 없었다. 그러나, DA가 전처리된 Jurkat 세포에 [CTP]=5 μM을 포함하는 bPEI25kDa/CTP 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP 복합체를 처리하면, 서브 G1-기는 각각 약 16% 수준으로 떨어지고, S-기는 각각 약 34%, 약 33% 수준으로 증가하였다. CTP 처리로 서브 G1-기의 세포비율은 완전한 회복은 되지 않았으나 상당히 감소하였고, 특이하게도 DNA를 합성하는 S-기가 약 1.7배 증진되는 효과를 보였다.

상기 도 11, 도 12 및 도 13의 결과를 통해, CTP 생성을 저해함으로써 세포 생존율 감소를 유발하는 DA 등의 물질이 처리된 Jurkat 세포 등의 T 림프구의 세포 생존율 감소 상태에서, CTP 또는 pCTP를 포함하는 약물전달체를 처리하면, DNA 합성 증진과 세포자멸사 감소를 통해 세포생존율을 증진하는 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 따라서, CTP 또는 pCTP 약물전달체는 T 림프구 생존율 이상을 치유할 수 있는 치료제로서 역할을 할 것으로 기대된다.

< 실시예 7> DA가 동시 처리된 T 림프구의 증식 억제 조건에서 CTP 또는 pCTP가 포함된 고분자 약물 전달체의 세포 생존율 증진, 세포자멸사 억제 및 세포주기 개선

상기 실시예 6에서 전술한 것처럼, CTP 또는 pCTP가 처리되는 시점이 T 림프구의 세포 증식 억제가 유발되기 전일 때, 질병의 예방제 역할을 하는지를 평가하였다.

CTP 또는 pCTP의 예방제 역할 평가를 위해, 다음과 같은 실험과정을 거쳤다. 구체적으로 96 웰 플레이트의 한 웰 당 1×10⁴ 개의 Jurkat 세포를 넣고, 우리딘 유도체인 DA 10 μM과 CTP 또는 pCTP가 포함된 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 동시에 Jurkat 세포에 처리하였다. 48 시간동안 더 배양하고 Ez-Cytox를 사용하여 세포 생존율을 평가하였고, CTP 및 pCTP의 예방제 역할을 예측 및 비교를 위해 DA 및 CTP 또는 pCTP가 포함된 고분자 약물전달체가 처리되지 않은 세포의 생존율을 100%로 정한 후 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 및 PS/pCTP 복합체의 세포 생존율을 영향을 비교하였다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, DA만 처리한 Jurkat 세포의 생존율은 40% 수준으로 떨어졌으나, [CTP]=0.4 μM로 준비된 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 추가적으로 처리한 Jurkat 세포는 생존율이 각각 52%, 53%, 58%, 57%로 각각 약 1.3배, 약 1.3배, 약 1.5배, 약 1.4배 증진되는 것을 확인하였다. 특히, [CTP]=5 μM 이상을 포함하는 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체는 85%~110%의 세포생존율을 보여 CTP를 처리하지 않을 때에 비해 약 2.1배~2.8배의 세포생존율 증진효과를 보였다. 특히, [CTP]=100 μM 의 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체의 처리는 DA에 의한 Jurkat 세포의 세포생존율 감소를 100% 억제할 수 있어 CTP 또는 pCTP가 예방제로 역할을 할 수 있음을 보여준다.

상기에서 CTP 또는 pCTP가 포함된 고분자 약물전달체를 DA와 동시에 처리하여, DA에 의한 Jurkat 세포의 세포생존율 감소를 억제 또는 개선함을 확인하였다. 이러한 세포 생존율 감소의 억제효과가 세포 자멸사와 관계되었는지를 확인하기 위해, DA와 CTP 또는 pCTP가 포함된 고분자 약물 전달체를 동시에 T 림프구에 처리 또는 미처리하여 세포 자멸사의 변화를 비교하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트의 한 웰 당 2×10⁵ 개의 Jurkat 세포를 넣고, 우리딘 유도체인 DA 10 μM과 CTP 또는 pCTP가 포함된 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 동시에 Jurkat 세포에 처리하였다. 48 시간동안 더 배양하고 아넥신 V-PI 염색을 통해서 세포 자멸사 비율을 평가하였다.

그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, DA가 처리되지 않은 Jurkat 세포는 세포자멸사(apoptosis) 상태의 세포가 약 8% 이하인데, DA를 처리하면 세포의 약 66%가 세포자멸사 상태가 되었다. DA와 [CTP]=5 μM을 포함하는 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 Jurkat 세포에 동시에 처리하면, 세포자멸사 상태의 세포가 각각 약 7%, 약 4%, 약 12%, 약 12%로 감소하여 DA가 처리되지 않은 Jurkat 세포의 세포자멸 비율에 비슷하거나 더 낮아졌다.

다음으로, DA와 CTP 또는 pCTP를 포함한 약물전달체가 동시에 처리된 Jurkat 세포에서, CTP 또는 pCTP에 의한 세포 생존율 증진 및 세포자멸사 감소가 세포주기(cell cycle)에 영향을 미치는지, 특히 DNA 합성에 영향을 주는지를 확인하기 위해 세포 주기 변화를 평가하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트의 한 웰 당 2×10⁵ 개의 Jurkat 세포를 넣고, 우리딘 유도체인 DA 10 μM 와 CTP 또는 pCTP가 포함된 bPEI25kDa/CTP 복합체, bPEI25kDa/pCTP 복합체, PS/CTP 복합체 또는 PS/pCTP 복합체를 Jurkat 세포에 동시에 처리하였다. 48 시간동안 더 배양하고 PI 염색을 통해서 세포주기의 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, DA가 처리되지 않은 Jurkat 세포는 세포 자멸을 의미하는 서브 G1-기와 DNA를 합성하는 단계인 S-기의 세포 비율이 각각 약 11%와 약 22%이었으나, DA를 처리하면 서브 G1-기의 세포 비율은 크게 증가하여 약 30%가 되고 S-기의 세포비율은 약 24%로 큰 차이가 없었다. 그러나 DA와 [CTP]=5 μM을 포함하는 bPEI25kDa/CTP 복합체 또는 bPEI25kDa/pCTP 복합체를 동시에 Jurkat 세포에 처리하면, 서브 G1-기는 각각 약 13%, 약 12% 수준으로 떨어지고, S-기는 각각 약 34%, 약 36% 수준으로 증가하였다. CTP 및 pCTP의 처리로 서브 G1-기의 세포비율은 거의 DA를 처리하지 않은 세포와 유사하게 나타남을 확인하였고, 더욱이 DNA를 합성하는 S-기가 약 1.4배 증진되는 효과를 보였다.

상기 도 14, 도 15 및 도 16의 결과를 통해, CTP 생성을 저해함으로서 세포 생존율 감소를 유발하는 DA 등의 물질과 CTP 또는 pCTP를 포함하는 약물전달체를 동시에 Jurkat 세포 등의 T 림프구에 처리하는 경우, DNA 합성 증진과 세포자멸사 감소를 통해 세포생존율 감소를 억제하는 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 CTP 또는 pCTP 약물전달체는 T 림프구 생존율 이상을 예방할 수 있는 예방제로서 역할을 할 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for Drug Delivery into Nucleus Comprising Cytidine 5-triphosphate or Polymer thereof, and Immunostimulating Agents Comprising the Same <130> ADP-2017-0418 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ctgggccaga aagaagcagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gtttggtggg ctgatgaggg 20

Claims

사이티딘 5-삼인산(Cytidine 5-triphosphate; CTP) 또는 이의 고분자[poly(Cytidine 5-triphosphate); pCTP]를 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
상기 조성물은 유전자 약물을 봉입하여 핵 내로 전달하며,
상기 유전자 약물은 조성물에 포함된 CTP 또는 pCTP에 의해 유전자 전사가 촉진됨으로써 그 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는, 핵 내로의 유전자 전달용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 pCTP는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵 내로의 유전자 전달용 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 5 내지 10,000 사이의 정수임.
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 유전자 전달용 고분자로서 폴리에틸렌이민(bPEI)을 더 포함하여 약물 전달 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 핵 내로의 유전자 전달용 조성물.
삭제
사이티딘 5-삼인산(Cytidine 5-triphospahte; CTP) 또는 이의 고분자[poly(Cytidine 5-triphosphate); pCTP]를 유효성분으로 포함하는 면역 증강제(adjuvant).
제 8 항에 있어서, 상기 CTP 또는 pCTP는 T 림프구의 세포 자멸을 억제함으로써 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강제(adjuvant).
제 8 항에 있어서, 상기 CTP 또는 pCTP는 T 림프구에서 DNA의 합성을 증진시킴으로써 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강제(adjuvant).