KR102004034B1 - 엔도솜 분해능과 핵 내 전달능을 갖는 폴리(피리독살 5-인산)[poly(pyridoxal 5-phosphate)] 고분자, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

엔도솜 분해능과 핵 내 전달능을 갖는 폴리(피리독살 5-인산)[poly(pyridoxal 5-phosphate)] 고분자, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피리독살 5-인산(Pyridoxal 5-phosphate; P5P)의 고분자인 폴리(피리독살 5-인산)[Poly(Pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 유효성분으로 포함하는, 엔도솜 분해능을 갖는 조성물, 비바이러스성 약물 전달용 조성물 또는 폴리(피리독살 5-인산) 고분자 화합물의 제조방법에 관한 것으로, 상기 pP5P가 엔도솜을 분해하는 능력뿐만 아니라 약물을 핵 내로 전달하는 기능, 항산화 활성 및 중성 pH에서 가용화 되는 특성을 나타내므로, 이를 포함하는 조성물은 비바이러스성 약물을 생체 내로 전달하여 생체 이용률을 최대화할 수 있는 약물 전달용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

엔도솜 분해능과 핵 내 전달능을 갖는 폴리(피리독살 5-인산)[poly(pyridoxal 5-phosphate)] 고분자, 이의 제조방법 및 용도{Poly(Pyridoxal 5-phosphate) which has endosomolytic activity and nuclear delivery activity, Its synthesis, and Use thereof}
본 발명은 엔도솜 분해능과 핵 내 전달능을 갖는 폴리(피리독살 5-인산) 고분자 및 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
특정 장기, 조직, 세포, 세포질, 미토콘드리아, 핵 주위 부분(perinuclear regions) 및 세포핵 부위로 다양한 치료제(예를 들면, 저분자량의 화학적 약물 및 조영제 뿐만 아니라 고분자량의 펩타이드, 단백질 및 유전물질)를 전달하기 위한 효과적인 시스템 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 전통적인 제형과 다르게, 위치-특이적 나노치료제는 표적 부위에 전달된 치료제의 생체이용률(bioavailability)이 최대화되도록 고안되었고, 낮은 부작용으로 질병을 치료하면서 치료 효과를 높일 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 약물전달 기술은 고부가가치 기술로서 전체 약물 개발 과정에서 갈수록 중요한 부문을 차지하고 있고, 환자들의 약물 순응도와 복용의 편리성을 제고시키는 방법으로 그 활용도가 증가하고 있다.
세포 내로 전달된 화학적 및 생물학적 제제의 엔도솜 격리(Endosomal sequestration)와 핵막에 의한 핵 내 전달(nuclear delivery) 제한은 약물의 효능 개선의 중요한 장애물이다. 엔도솜 격리는 아민, 설폰아마이드, 카르복실산, 또는 인산기를 가진 저분자나 고분자에 의해 유도되는 엔도솜-막 불안정화 또는 파괴를 통해 극복될 수 있다. 이러한 저분자/고분자는 비바이러스성 유전자 전달 및 화학 약물의 세포질 전달에서 개선된 결과를 가져온다. 또한, 엔도솜 pH에 있어서, 수소이온 완충화(proton buffering) 및 구조 전이(conformational transition) 특성은 지질막 불안정화 또는 엔도솜 파괴(endosomolysis)를 유도하는 것으로 알려져 있다. 또한 핵 내 전달능은 리신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)이 많이 포함된 펩티드인 핵국재화신호(nuclear localization signal; NLS), 핵공을 넓혀주는 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 저분자 리간드 물질 또는, 활성화되면 핵으로 이동할 수 있는 수용체에 결합하는 리간드 또는 펩티드를 포함한 저분자/고분자를 사용함으로써 극복할 수 있다. 이러한 방법들을 통해 비바이러스성 유전자 전달 및 화학 약물의 핵 내 전달에 있어서 개선된 효과를 가져온다.
더욱이 항산화제(anti-oxidant) 및 생체 내 반응의 조효소(coenzyme)로 사용되는 비타민 B6(vitamin B6, 피리독살 5-인산)는 산화 스트레스(oxidative stress)인 활성산소가 발생하는 다양한 질병 환경을 감소시키기 위한 보조제로 사용된다. 그러나 비타민 B6는 생체 내 pH(pH 7.4)에서 용해도(5 g/L)가 낮기 때문에 물에 용해시키기 위해서는 추가적으로 NaOH를 넣어서 염기성 용액으로 만들어 주어야 하므로 그 응용에 한계가 있다.
한편, 한국등록특허 제10-1547635호, 제10-1547636호 및 제10-1577274에서는 뉴클레오타이드, 환원성 또는 비환원성 뉴클레오타이드 고분자를 이용하여 엔도솜 분해능을 개선함으로써 약물 전달의 효율을 증진시키고 있으나, 본 발명에 기재된 피리독살 5-인산 고분자의 엔도솜 분해능 또는 핵 내 전달능에 대해서는 언급하고 있지 않다.
1. 한국등록특허 제10-1547635호(2015.08.20 등록). 2. 한국등록특허 제10-1547636호(2015.08.20 등록). 3. 한국등록특허 제10-1577274호(2015.12.08 등록).
본 발명의 목적은 엔도솜 막 불안정화 또는 파괴 작용을 통해 엔도솜 분해능을 가지는 신규한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엔도솜 분해능 및 핵 내 전달능을 가져 약물의 전달률을 향상시킬 수 있는 비바이러스성 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물에 포함된 폴리(피리독살 5-인산) 고분자 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 폴리(피리독살 5-인산)[poly(pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 유효성분으로 포함하는, 엔도솜 분해능을 갖는 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 폴리(피리독살 5-인산)[poly(pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 유효성분으로 포함하는 비바이러스성 약물 전달용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피리독살 5-인산(pyridoxal 5-phosphate; P5P), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)를 혼합 및 교반하여 중합반응시키는 단계; 및 중합반응이 완료된 혼합물을 투석하여 폴리(피리독살 5-인산)[poly(Pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 분리 정제하는 단계; 를 포함하는 폴리(피리독살 5-인산) 고분자 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017039973957-pat00001
상기 화학식 1에서, n은 4 내지 200의 정수 중 하나이다.
본 발명은 엔도솜 분해능 및 핵 내 전달능 증진 기능을 나타내는 폴리(피리독살 5-인산) 고분자, 이의 합성 및 용도에 관한 것으로서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 수소이온 완충 기능과 핵 내 전달능이 있어, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자를 포함하는 비바이러스성 약물 전달체에서 전달된 약물을 엔도솜에서 세포질로 탈출시키고, 세포질에 존재하는 약물 전달체의 핵 내 전달 효율을 높이며, 폴리(피리독살 5-인산) 고분자가 항산화 기능을 통해 활성산소가 유발된 상태에서 세포 생존율을 증진시킬 수 있으며, 상기 고분자는 난용성인 단량체와 달리 수용해성을 나타내므로, 약물을 생체 내로 효과적으로 전달하는 신규한 약물 전달 시스템으로 활용될 수 있다.
도 1은 겔 투과 크로마토그래피(Gel permeation chromatography)를 활용해 합성된 폴리(피리독살 5-인산)(pP5P)의 분자량을 측정한 결과이다.
도 2는 pP5P의 수소이온 완충능력(proton buffering capacity)을 평가한 결과이다.
도 3은 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체의 입자 크기 및 표면 전하를 나타낸 것이다.
도 4는 여러 세포에서 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체의 루시퍼라아제(luciferase) 유전자 발현효율을 나타낸 것으로, 보다 구체적으로, HEK293 세포(4a), DPSCs(dental pulp stem cells; 4b) 및 ADSCs(adipose tissue-derived stem cells, 지방유래 줄기세포; 4c)에서 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체의 루시퍼라아제(luciferase) 유전자 발현효율을 나타낸 것이다.
도 5는 HEK293 세포에서 클로로퀸(Chloroquine) 또는 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1) 존재 시, bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체의 루시퍼라아제(luciferase) 유전자 발현효율을 나타낸 것이다.
도 6은 HEK293 세포에서 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체 내의 유전자 약물의 세포 및 핵 내 유입량을 나타낸 것이다.
도 7은 여러 세포에서 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 형질주입(transfection)했을 때, 우혈청(fetal bovine serum; FBS) 존재 유무에 따른 세포 생존율 변화를 확인한 결과로, 보다 구체적으로 HEK293 세포(7a), DPSCs(7b) 및 ADSCs(7c)에서 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 형질 주입했을 때 우혈청 존재 유무에 따른 세포 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 과산화수소(H2O2)에 의한 활성산소 유발 조건에서 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 처리한 DPSCs의 세포생존율 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자들은 피리독살 5-인산 고분자가 수소이온 완충능력을 가짐으로써 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴하여, 세포 내로 전달된 약물을 엔도솜에서 세포 내 다른 소기관으로 탈출시킬 수 있는 생기능성(biofunctional)이 있다는 것을 확인하였다. 더욱이 엔도솜을 탈출한 폴리(피리독살 5-인산)을 포함한 약물전달체는 핵 내로 약물을 효과적으로 전달하는 기능을 가지고 있음을 확인하였고, 이를 이용한 약물전달체를 개발하였다.
또한, 폴리(피리독살 5-인산)이 피리독살 5-인산처럼 항산화 기능을 가졌음을 산화스트레스 환경에서 세포생존율 증진을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 폴리(피리독살 5-인산)[poly(pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 유효성분으로 포함하는, 엔도솜 분해능을 갖는 조성물을 제공한다;
[화학식 1]
Figure 112017039973957-pat00002
상기 화학식 1에서, n은 4 내지 200의 정수 중 하나이다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 용어, "P5P"는 피리독살 5-인산(Pyridoxal 5-phosphate), "pP5P"는 합성된 폴리(피리독살 5-인산)[poly(Pyridoxal 5-phosphate)] 고분자의 약어이다.
상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 음전하성인 것을 그 특징으로 한다.
상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 수소이온 완충화(proton buffering) 활성을 가지고 있어서, 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴하여 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도함으로써 엔도솜 분해능을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 세포의 핵 내로 약물을 전달할 수 있는 바, 특히 단백질, 유전자와 같은 거대분자 약물의 핵막 및 핵공에 의한 핵 내 유입 저감 현상을 해결할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자가 포함된 조성물이 과산화수소를 이용한 산화스트레스(oxidative stress)인 활성 산소 유발 조건에서 상기 세포 생존율을 개선시키는 것을 확인하였다. 즉, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 항산화 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 중성 pH에서 가용화될 수 있는 바, 즉, 단량체인 피리독살 5-인산과 달리 pH에 상관없이 물에 쉽게 가용화되므로, 단량체인 피리독살 5-인산이 생체 내 pH(pH 7.4)에서 낮은 용해도를 보여 가용화시키기 위해 염기성 용액을 함께 사용해야 한다는 단점을 해결할 수 있다.
더욱이, 본 발명은, 하기 화학식 1로 표시되는 폴리(피리독살 5-인산)[poly(pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 유효성분으로 포함하는 비바이러스성 약물 전달용 조성물을 제공한다;
[화학식 1]
Figure 112017039973957-pat00003
상기 화학식 1에서, n은 4 내지 200의 정수 중 하나이다.
본 발명에서 사용되는 상기 약물은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에 대한 예방효과를 가지고, 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 할 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 비바이러스성 약물은 친수성 화학 약물, 소수성 화학 약물, 진단용 약물, 펩타이드 및 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 상세하게는 유전자일 수 있으나, 비바이러스성이면서 약물 또는 생리활성 물질로 작용할 수 있는 것이면 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 약물 전달용 고분자를 더 포함하여 약물 전달 복합체를 형성할 수 있다.
이때, 상기 약물 전달용 고분자는 폴리에틸렌이민(bPEI), 폴리리신(PLL), 폴리(아르기닌)[poly(arginine)], 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리(아미도아민)[poly(amido amine)], 폴리(베타 아미노 에스테르)[poly(beta amino ester)], 키토산(chitosan), 프로타민(protamine), 히스톤(histone), 폴리(3차 아민 메타크릴레이트)[poly(tertiary amine methacrylate)], 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트[poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)], 폴리(N-[N-(2-아미노에틸)-2-아미노에틸]아스팔트아미드(poly(N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide), 지질, 인지질, 고분자유래 나노구조체, 금속유래 나노구조체, 탄소유래 나노구조체, 칼슘포스페이트 나노구조체, 다공성 실리카 나노구조체 및 이들의 복합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌이민(bPEI)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 수소이온 완충화(proton buffering) 활성을 가지고 있어서, 엔도솜 분해(endosomolysis)를 통한 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도할 수 있는 바, 따라서 약물 전달용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 세포의 핵 내로 약물을 전달할 수 있고, 특히 비바이러스성 유전자와 같이 세포의 핵 내로 전달되어야 하는 약물의 생체 이용률을 현저히 향상시킬 수 있다.
더욱이, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자가 포함된 약물 조성물이 과산화수소를 이용한 산화스트레스(oxidative stress)인 활성 산소 유발 조건에서 상기 세포 생존율을 개선시키는 것을 확인한 바, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 항산화 효과를 나타낼 수 있으므로, 약물 전달용 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 중성 pH에서 가용화될 수 있는 바, 즉, 단량체인 피리독살 5-인산과 달리 pH에 상관없이 물에 쉽게 가용화되므로, 단량체인 피리독살 5-인산이 생체 내 pH(pH 7.4)에서 낮은 용해도를 보여 가용화시키기 위해 염기성 용액을 함께 사용해야 한다는 단점이 해결된 약물 전달용 조성물로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자가 포함된 약물 전달용 조성물이 우혈청이 포함되어 있지 않은 배지에서는 세포의 생존율 감소를 현저히 억제하고, 우혈청이 있는 배지에서는 유전자 발현 효율의 감소량을 현저히 저감하였는 바, 특히 줄기세포의 생존율 및 유전자 발현 효율을 동시에 유지함으로써 줄기세포에 원하는 유전자의 발현을 유도하는 데에 유용하게 활용될 수 있다. 즉, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자가 포함된 약물 전달용 조성물은 줄기세포 배양 시 이용되어 줄기세포의 분화를 조절하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 약물 전달용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 약물, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자 및 약물 전달용 고분자 외에 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "약학적으로 유효한 양"은 약물이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 의미하며 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 "약학적으로 허용되는"은 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다.
상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 이외에도 상기 약물 전달용 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여될 수 있다.
더불어 본 발명은, 피리독살 5-인산(pyridoxal 5-phosphate; P5P), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)를 혼합 및 교반하여 중합반응시키는 단계; 및 중합반응이 완료된 혼합물을 투석하여 폴리(피리독살 5-인산)[poly(Pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 분리 정제하는 단계; 를 포함하는 폴리(피리독살 5-인산) 고분자 화합물의 제조방법을 제공한다.
상기와 같은 pP5P 고분자의 합성 및 분리 정제 과정은 모두 빛이 차단된 조건에서 진행하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 혼합 및 교반된 혼합물은 P5P : EDC : NHS가 1:2:1의 몰 비로 혼합된 것일 수 있고, 상기 중합반응은 5℃ 내지 50℃에서 0.5 내지 50 시간 동안 수행될 수 있다.
이때, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다;
[화학식 1]
Figure 112017039973957-pat00004
상기 화학식 1에서, n은 4 내지 200의 정수 중 하나이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 피리독살 5-인산(P5P)의 고분자(pP5P) 합성
단량체 피리독살 5-인산(P5P), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC), N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), 트리에틸아민(triethylamine; TEA) 존재 하에 수용액 상에서 교반 반응을 진행하여 단량체를 고분자 중합하였다. 반응 완료 후 합성된 고분자와 부산물을 투석을 이용해 분리정제하고 동결건조하여 폴리(피리독살 5-인산)을 얻었다. 위의 과정은 빛을 차단한 상태에서 수행되었다.
보다 구체적으로, 상기 과정에서 단량체 및 반응물의 반응 시 몰 비는 단량체 : EDC : NHS = 1 : 2 : 1 이었고, 단량체 200 mg을 물 5 mL에 녹여 사용하였다. 이때, 사용된 TEA의 양은 100 μL였고, 교반 반응은 48시간 동안 상온에서 진행하였다. 합성된 고분자 수용액을 MWCO(molecular weight cut-off)가 1000 달톤인 투석막 안에 넣고, 밖의 물을 48시간 동안 최소 10번 이상 갈아주어 부산물과 저분자량 피리독살 5-인산을 제거하였고, 이 분리정제 작업은 상온에서 진행되었다. 이후, 투석막 안에 남은 수용액을 동결건조하여 폴리(피리독살 5-인산)[poly(Pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 얻었다.
[반응식 1]
Figure 112017039973957-pat00005
<실시예 2> 합성된 pP5P의 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography) 분석
수용성 용매용 칼럼이 장착된 HPLC에 1 mg/mL의 유속으로 고분자 수용액(0.5 mg/mL)을 통과시킨 후 GPC 분석 모드로 고분자의 분자량을 계산하여, 합성된 pP5P의 GPC 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, pP5P의 수평균 분자량은 7.2×105 달톤이고, 중량평균 분자량은 9.4×105 달톤이며, 이의 다분산도는 1.3이었다.
<실시예 3> pP5P의 수소이온 완충능력(proton buffering capacity) 평가
pP5P을 150 mM 염화나트륨 수용액에 녹여 농도를 1 mg/mL로 만든 후, 1 M 수산화나트륨 수용액을 소량 추가해 pH 11 정도가 되도록 했다. 이 pP5P 수용액에 0.1 M 염화수소를 넣으면서 수용액의 pH 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 엔도솜의 pH 영역인 pH 5~7에서 염화나트륨 수용액은 수소이온 완충능력이 없으나, pP5P는 수소이온 완충능력을 갖고 있는 것을 확인할 수 있었고, 이들의 수소이온 완충능력은 3.2 μmol/mg pP5P이었다.
따라서, 이들의 엔도솜 내 pH 환경에서 수소이온 완충능력으로 인해, 수소이온 스폰지 효과(proton sponge effect)처럼 삼투압 차이에 의한 충격으로 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴시킬 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 4> pP5P가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체의 유전자 발현 효율 평가
pP5P를 잘 알려진 고분자/유전자 복합체 내에 봉입시키기 위해, 양전하성 고분자인 폴리에틸렌이민(bPEI25kDa, 분자량 25 kDa) 용액과, 플라스미드DNA(pDNA)와 pP5P를 함유한 음전하 용액을 각각 준비한 후, 두 용액을 섞어 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 만들었다. N/P ratio는 5가 되도록 준비하는데, 이때 pP5P의 포스페이트(phosphate)는 고려하지 않았고, bPEI25kDa의 아민(amine)과 pDNA의 포스페이트(phosphate)로만 계산했다.
상기 복합체들의 입자크기 및 전하를 측정한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체의 입자크기는 pDNA의 1 마이크로그램당 pP5P가 1 또는 3 nmol 일 때 100 nm, 2 nmol 일 때 300 nm 정도의 크기를 보였고, 제타전위는 pP5P가 1 nmol까지는 양전하를, 2 nmol 이상에서는 음전하를 띠었다.
또한, 준비된 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 pP5P가 포함되지 않은 bPEI25kDa/pDNA 복합체와 비교하여 봉입된 pP5P의 유전자 발현 효율의 향상능력을 평가했다. 구체적으로, 6 웰 플레이트의 한 웰 당 1×105 개의 HEK293 세포, 12 웰 플레이트의 한 웰 당 1×105 개의 DPSCs 또는 ADSCs 세포를 넣은 후 24시간 동안 배양하였고, 트랜스펙션 1시간 전에 우혈청이 포함되지 않은 트랜스팩션용 배지 또는 우혈청이 포함된 배양용 배지로 교체해 준 뒤에 준비된 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체 용액을 이렇게 배양된 세포에 트랜스펙션하였다. 4시간 동안 배양 후, 배양용 배지로 갈아준 뒤 44시간 동안 더 배양하였다. 이렇게 트랜스펙션 48시간 후에 이 세포의 유전자 발현효율을 pDNA의 루시퍼라아제의 발현량을 이용하여 평가하였는데, 봉입된 pP5P의 농도가 0일 때 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체를 형성하고, 이 복합체의 유전자 발현효율과 상대적으로 비교하였다.
그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이 우혈청이 포함된 배양용 배지에서 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 HEK293 세포에 트랜스펙션한 경우 pP5P 농도가 3 nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 약 88배 증가하였다. 또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 우혈청이 포함되지 않은 트랜스펙션용 배지에서 배양한 DPSCs 세포에 트랜스펙션한 경우, pP5P 농도가 2 nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 대조복합체인 bPEI25kDa/pDNA를 트랜스펙션한 경우보다 약 2배 증가하였고, 우혈청이 포함된 배양용 배지에서 배양한 DPSCs 세포에 트랜스펙션한 경우, pP5P의 농도가 3nmol/μg pDNA일 때, 대조복합체인 bPEI25kDa/pDNA를 트랜스펙션한 경우보다 약 18배 증가하였다. 더욱이, 도 4c에 나타난 바와 같이, bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 우혈청이 포함되지 않은 트랜스펙션용 배지에서 배양한 ADSCs 세포에 트랜스펙션한 경우, pP5P 농도가 3 nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 대조복합체인 bPEI25kDa/pDNA를 트랜스펙션한 경우보다 약 65배 증가하였고, 우혈청이 포함된 배양용 배지에서 배양한 ADSCs 세포에 트랜스펙션한 경우, pP5P의 농도가 3 nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 대조복합체인 bPEI25kDa/pDNA를 사용한 경우보다 약 21배 증가하였다.
< 실시예 5> 바필로마이신 A1( Bafilomycin A1) 또는 클로로퀸(Chloroquine)이 존재 시 pP5P가 포함된 고분자 약물 전달체의 유전자 발현 효율 평가
일반적으로 고분자 유전자 약물전달체가 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포로 들어가는 경우에는 약물전달체의 엔도솜 탈출이 유전자 발현 효율을 결정하는데 중요한 영향을 미친다. 이에, 본 발명의 고분자 유전자 약물전달체가 엔도사이토시스(endocytosis)를 이용해 세포로 유입되는지 평가하기 위해 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체의 트랜스펙션 시 엔도솜을 파괴하는 시약인 클로로퀸(chloroquine; 20μM) 또는 엔도솜의 pH 감소를 방지하는 시약인 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1; 50nM)을 배지에 같이 넣어준 뒤에 상기 실시예 4에서 수행한 방법대로 유전자 발현 효율을 평가하였다.
이론적으로, 고분자 유전자 약물전달체가 엔도사이토시스를 경유하여 세포로 유입되면, 클로로퀸과 바필로마이신 A1을 둘 다 넣지 않은 대조군(control) 실험의 고분자 유전자 전달체와 비교하여, 클로로퀸을 넣으면 고분자 약물전달체가 빨리 엔도솜으로부터 탈출되므로 유전자 발현효율이 높아지고, 바필로마이신 A1을 넣으면 고분자 약물전달체의 엔도솜 탈출이 어렵기 때문에, 유전자 발현효율이 낮아지거나 영향이 없다.
이와 관련하여, 실제 실험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, HEK293 세포에 bPEI25kDa/pDNA 복합체를 트랜스펙션한 경우에는 클로로퀸이 존재할 때 유전자 발현 효율이 34배 증가하였고, 바필로마이신 A1이 존재할 때에는 유전자 발현 효율이 3.3배 감소하였다. 반면에, pP5P가 포함된 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 트랜스펙션한 경우, 클로로퀸이 존재할 때 3.8배 증가한 유전자 발현 효율을 보였고, 바필로마이신 A1이 존재할 때에는 10배 감소한 유전자 발현 효율을 나타냈다.
즉, 이러한 결과로부터 pP5P를 포함하는 고분자 유전자 복합체가 엔도사이토시스를 통해 세포 안에 들어가고, pP5P의 수소이온 완충에 의해 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체가 엔도솜을 탈출했음을 알 수 있었다.
< 실시예 6> pP5P가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체 내 유전자 약물의 세포 및 핵 내 유입량 측정
pP5P가 유전자 약물전달체의 세포 및 핵 내 유입량에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 플라스미드DNA(pDNA)에 YOYO-1과 같은 형광 물질을 10 : 1(pDNA : YOYO-1)의 비율로 삽입시킨 뒤에, 양전하성 고분자인 폴리에틸렌이민(bPEI25kDa, 분자량 25kDa) 용액과 pDNA-YOYO-1 및 pP5P를 함유한 음전하 용액을 각각 준비한 후, 두 용액을 섞어 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 만들었다.
이후, 준비된 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 pP5P가 포함되지 않은 bPEI25kDa/pDNA 복합체와 비교하여 봉입된 pP5P에 의한 세포핵 내 유전자 약물의 유입량을 평가하였다. 6 웰 플레이트의 한 웰 당 1×105 개의 HEK293 세포를 넣은 후, 24시간 동안 배양하고, 준비된 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/pDNA 복합체 용액을 세포에 트랜스펙션하였다. 4시간 배양 후, 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 사용하여 세포를 웰 플레이트로부터 떼어내어 핵을 분리하였다. 마지막으로 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체가 트랜스펙션 된 세포 및 핵이 나타내는 형광값을 유세포 분석기를 통해서 확인함으로써, 세포 및 핵 내 유전자 약물의 유입량을 평가하였다.
이때, 봉입된 pP5P의 농도가 0일 때, 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체를 형성하고, HEK293 세포에서 이 복합체 내 유전자 약물의 세포 및 핵 내 유입량을 상대적으로 비교하기 위해 각각 1로 정했다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체의 유전자 약물의 경우, pP5P의 농도가 2 nmol/μg pDNA 일 때, 세포 내 유입량이 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 유전자 약물보다 2배 감소하였고, pP5P의 농도가 1 nmol/μg pDNA 또는 3 nmol/μg pDNA 일 때, 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체와 유사한 결과를 나타내었다. 반면, bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체의 유전자 약물의 핵 내 유입량의 경우 pP5P의 농도가 증가할수록 유전자 약물의 핵 내 유입량은 증가하였고, pP5P의 농도가 3 nmol/μg pDNA 일 때, 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체의 유전자 약물보다 핵 내 유입량이 약 1.8배 증가 하였다. 더욱이 pP5P의 농도가 2 nmol/μg pDNA 일 때, 대조복합체인 bPEI25kDa/pDNA와 동일한 양의 유전자 약물이 세포 내로 유입되었을 경우, bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체에 포함된 유전자약물의 핵 내 유입량은 약 2.7배 더 높았다.
< 실시예 7> pP5P가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체의 트랜스펙션 방법에 따른 세포 생존율 변화 확인
일반적으로 고분자 유전자 약물 전달체로 양이온성 고분자를 사용하는 경우, 우혈청(FBS)에 존재하는 음이온성 혈청 단백질과 응집할 수 있기 때문에 트랜스펙션하는 4시간 동안 우혈청이 없는 배지를 사용하게 된다. 그러나 세포를 우혈청이 없는 배지에 노출하게 되면 세포 생존율이 감소하는 문제점이 생기므로 우혈청이 포함된 배양용 배지에서 유전자 발현 효율을 높이는 것이 중요하다.
이에, 본 발명에서 사용한 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체의 경우에는 우혈청이 포함된 배양용 배지에서 유전자 발현 효율에 어떤 변화가 일어나는지를 확인하였다. 실제로 트랜스펙션 과정 중에 우혈청이 포함된 배양용 배지를 사용 경우, 세포 생존율에 도움이 되는지 확인하기 위해서 트랜스펙션 과정 중 우혈청이 포함되지 않은 트랜스펙션용 배지와 우혈청이 포함된 배양용 배지에 세포를 노출한 후에 세포 생존율을 평가하였다.
구체적으로, 24 웰 플레이트의 한 웰 당 5×104 개의 HEK293, DPSCs 및 ADCSCs 세포를 넣은 후 24시간 동안 배양하고, 준비된 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체와 pP5P가 포함되지 않은 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체 용액을 세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 1시간 전에 우혈청이 포함되지 않은 트랜스팩션용 배지 또는 우혈청이 포함된 배양용 배지로 교체한 뒤에 트랜스펙션 4시간 후 배양용 배지로 교체하고 그 뒤에 44시간 동안 더 배양하였다. 트랜스펙션 후 48시간이 되었을 때 MTT 분석법을 이용하여 세포의 생존율을 평가하였다. 이때, 우혈청이 포함된 배양용 배지에 노출시키고 고분자 유전자 약물전달체를 처리하지 않은 세포의 생존율이 100% 일 때 bPEI25kDa/pDNA 복합체와 pP5P가 포함된 고분자 유전자 약물전달체를 트랜스펙션 하였을 때 우혈청의 포함 여부에 따른 세포 생존율을 상대적으로 비교하였다.
그 결과, 도 7a 내지 7c에 나타난 바와 같이, HEK293(도 7a), DPSCs(도 7b), ADSCs(도 7c) 세포에서 우혈청이 포함된 배지에서 트랜스펙션을 수행한 경우 bPEI25kDa/pDNA 복합체와 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체 모두 100%에 가까운 세포 생존율을 나타낸 반면에, 우혈청이 포함되지 않은 배지에서 트랜스펙션을 수행한 경우, 복합체의 종류와 상관없이 세포 생존율이 20% 정도까지 감소한 것을 확인하였다. 따라서, pP5P에 유발되는 독성은 없으며, 우혈청이 포함된 배지에서 세포 배양 시에도 pP5P를 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 8> pP5P가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체의 활성산소에 의한 세포사멸 억제 효과 확인
실시예 4와 동일한 방법으로 준비된 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 pP5P가 포함되지 않은 bPEI25kDa/pDNA 복합체와 비교하여 봉입된 pP5P의 항산화능을 평가하였다.
구체적으로, 96 웰 플레이트의 한 웰 당 5 x 103개의 DPSCs 세포를 24시간 동안 배양하고, 준비된 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체 및 bPEI25kDa/pDNA 복합체 용액을 상기 배양 세포에 처리하였다. 이후, 20시간 동안 배양 후에 활성산소를 생성하기 위해서 과산화수소(H2O2)를 200 μM로 처리하고, 다시 4시간 동안 더 배양한 후에 상기 실시예 7에서 수행한 방법대로 세포 생존율을 평가하였다.
그 결과, 도 8에서 보는 것처럼 H2O2를 처리하지 않은 경우에는 12.5 μg/mL의 pDNA가 포함된 bPEI25kDa/pDNA 대조 복합체를 처리했을 때 세포 생존율이 30% 감소하였고, 25 μg/mL의 pDNA가 포함된 bPEI25kDa/pDNA 복합체를 처리했을 때에는 세포 생존율이 90% 감소하였다. 반면에 12.5 μg/mL과 25 μg/mL의 pDNA가 포함된 bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 처리했을 때에는 각각 20%와 40% 감소한 세포 생존율을 나타냈다. 또한, 200 μM의 H2O2를 사용하여 활성산소를 유발했을 때에는 bPEI25kDa/pDNA 대조 복합체를 처리한 세포의 세포 생존율은 60-90% 감소하였지만, bPEI25kDa/pP5P-pDNA 복합체를 처리한 세포의 세포 생존율은 40-60% 감소한 것으로 나타났다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 폴리(피리독살 5-인산)[poly(pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 유효성분으로 포함하는, 엔도솜 분해능을 갖는 조성물;
    [화학식 1]
    Figure 112017039973957-pat00006

    상기 화학식 1에서, n은 4 내지 200의 정수 중 하나이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 수소이온 완충화(proton buffering) 활성을 가지고 있어서, 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴하여 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도함으로써 엔도솜 분해능을 나타내는 것을 특징으로 하는 엔도솜 분해능을 갖는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 세포의 핵 내로 약물을 전달하는 것을 특징으로 하는 엔도솜 분해능을 갖는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 항산화 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 엔도솜 분해능을 갖는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 중성 pH에서 가용화 되는 것을 특징으로 하는 엔도솜 분해능을 갖는 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 폴리(피리독살 5-인산)[poly(pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 유효성분으로 포함하는 유전자 전달용 조성물;
    [화학식 1]
    Figure 112019034330243-pat00007

    상기 화학식 1에서, n은 4 내지 200의 정수 중 하나이다.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 약물 전달용 고분자로서 폴리에틸렌이민(bPEI)를 더 포함하여 약물 전달 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 조성물.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 수소이온 완충화(proton buffering) 활성을 가지고 있어서, 엔도솜 분해(endosomolysis)를 통한 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 조성물.
  11. 제 6 항에 있어서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 세포의 핵 내로 약물을 전달하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 조성물.
  12. 제 6 항에 있어서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 항산화 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 조성물.
  13. 제 6 항에 있어서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 중성 pH에서 가용화 되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 조성물.
  14. 피리독살 5-인산(pyridoxal 5-phosphate; P5P), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)를 혼합 및 교반하여 중합반응시키는 단계; 및 중합반응이 완료된 혼합물을 투석하여 폴리(피리독살 5-인산)[poly(Pyridoxal 5-phosphate); pP5P] 고분자를 분리 정제하는 단계; 를 포함하는 폴리(피리독살 5-인산) 고분자 화합물의 제조방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 폴리(피리독살 5-인산) 고분자는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리(피리독살 5-인산) 고분자 화합물의 제조방법;
    [화학식 1]
    Figure 112017039973957-pat00008

    상기 화학식 1에서, n은 4 내지 200의 정수 중 하나이다.
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