KR101547635B1 - 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자를 포함하는 비바이러스성 약물전달용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약물 전달용 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 뉴클레오타이드를 이용하여 합성된 비환원성 고분자 및 이의 제조방법과, 이를 포함하는 약물 전달용 고분자 조성물을 제공한다. 뉴클레오타이드를 이용하여 비환원성 고분자를 합성하여 (-)전하 고분자를 얻은 후, 이를 (+)전하 단백질이나 펩타이드와 결합시켜 정전기적 인력에 의해 단백질이나 펩타이드를 표적 부위로 전달하는 약물 전달체로서, 신규 발명된 비환원성 고분자를 포함하는 비바이러스성 약물전달체에서 발명된 고분자가 수소이온 완충 활성으로 인해 전달된 약물을 엔도솜에서 세포 내 다른 소기관으로 탈출시킬 수 있는 효과적인 약물전달체에 대한 것이다.

Description

비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자를 포함하는 비바이러스성 약물전달용 조성물{Composition for non-viral drug delivery comprising non-reducible polynucleotide polymer}
본 발명은 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자를 포함하는 비바이러스성 약물전달용 조성물에 관한 것이다.
특정 장기, 조직, 세포, 세포질, 미토콘드리아, 핵 주위 부분(perinuclear regions) 및 세포핵 부위로 다양한 치료제(예를 들면, 저분자량의 화학적 약물 및 조영제 뿐만 아니라 고분자량의 펩타이드, 단백질 및 유전물질)를 전달하기 위한 효과적인 시스템 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 전통적인 제형과 다르게, 위치-특이적 나노치료제는 표적 부위에 전달된 치료제의 생물학적 이용가능성(bioavailability)이 최대화되도록 고안되었고, 낮은 부작용으로 질병을 치료하면서 치료 효과를 높일 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 약물전달 기술은 고부가가치 기술로서 전체 약물 개발 과정에서 갈수록 중요한 부문을 차지하고 있고, 환자들의 약물 순응도와 복용의 편리성을 제고시키는 방법으로 그 활용도가 증가하고 있다.
세포 내로 전달된 생물학적 제제의 엔도솜 격리(Endosomal sequestration)는 중요한 장애물인데, 이는 아민, 설폰아마이드 또는 카르복실산을 가진 고분자나 단량체에 의해 유도되는 엔도솜-막 불안정화 또는 파괴를 통해 극복될 수 있다. 이러한 고분자/단량체는 비바이러스성 유전자 전달 및 화학 약물의 세포질 전달에 있어서 개선된 결과를 가져온다. 엔도좀 pH에 있어서, 수소이온 완충화(proton buffering) 및 구조 전이(conformational transition) 특성은 지질막 불안정화 또는 엔도좀 파괴(endosomolysis)를 유도하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명자들은 뉴클레오타이드를 이용하여 비환원성 고분자를 합성하여 (-)전하 고분자를 얻은 후, 이를 (+)전하 단백질이나 펩타이드와 결합시켜 정전기적 인력에 의해 단백질이나 펩타이드를 표적 부위로 전달하는 약물 전달체로서, 수소이온 완충 활성으로 인해 전달된 약물을 엔도솜에서 세포 내 다른 소기관으로 탈출시킬 수 있는 생기능성(biofunctional)물질의 약물전달체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
한편, 한국등록특허 제10-1224004호에서는 수평균 분자량이 7,000 달톤 이하인 약물전달용 폴리락트산 유도체 화합물 및 그 제조방법, 및 이를 이용한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물 및 그 제조방법에 대해 개시하고 있으나, 본원 발명의 약물 전달용 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자와는 그 기술적 구성이 상이하다.
본 발명의 목적은 음전하를 띄는 신규한 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP 및 CTP로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드, 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)의 혼합 및 교반 반응을 통한 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 음전하를 띄는 신규한 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물이 양전하성 분자(예로, 단백질 또는 펩타이드)를 포함하는 약물 전달용 고분자 조성물에서 약물전달체로서 역할을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 음전하를 띄는 신규한 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물 및 다양한 특성의 약물을 포함하는 비바이러스성 약물전달체에서 약물의 효능 증진을 위해 신규한 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물이 엔도좀 막 불안정화 또는 파괴하는 역할을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물을 제공한다. 상세하게는, 상기 고분자 화합물은 음전하성인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112015070103089-pat00001
상기 화학식 1에서,
R은
Figure 112015070103089-pat00002
,
Figure 112015070103089-pat00003
또는
Figure 112015070103089-pat00004
중 어느 하나이고,
X는 0 내지 2의 정수이며, n은 4 내지 2000의 정수임.
상세하게는, X=0 이면, pAMP, pGMP 또는 pCMP이고, X=1 이면, pADP, pGDP 또는 pCDP이고, X=2 이면, pATP, pGTP 또는 pCTP이다.
또한, 본 발명은 AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP 및 CTP로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드, 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)를 혼합하는 교반 반응 단계; 및 상기 교반 반응된 혼합물을 투석하여 폴리뉴클레오타이드 고분자를 분리 정제하는 단계를 포함하는 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물 제조방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 교반 반응된 혼합물은 AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP 및 CTP로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 : EDC : NHS가 1:0.5:0.5 내지 1:3:3의 몰비로 혼합되어 있는 것을 특징으로 하고, 상기 교반 반응은 5 내지 50℃에서 0.5 내지 200시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "AMP"는 아데노신일인산(Adenosine monophosphate), "ADP"는 아데노신이인산(Adenosine diphosphate), "ATP"는 아데노신삼인산(Adenosine triphosphate), "GMP"는 구아노신일인산(Guanosine monophosphate), "GDP"는 구아노신이인산(Guanosine diphosphate), "GTP"는 구아노신삼인산(Guanosine triphosphate), "CMP"는 사이티딘일인산(Cytidine monophosphate), "CDP"는 사이티딘이인산(Cytidine diphosphate), "CTP"는 사이티딘삼인산(Cytidine triphosphate)의 약어이다.
또한, 본 발명은 상기 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물 및 양전하성 분자를 포함하는 약물 전달용 고분자 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 양전하성 분자는 양전하를 띄는 단백질 또는 펩타이드 약물인 것을 특징으로 한다.
상세하게는, 상기 조성물은 수소이온 완충화(proton buffering) 활성을 가지고 있어서 엔도좀 분해(endosomolysis)를 통한 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물 및 비바이러스성 약물전달체를 포함하는 비바이러스성 약물전달체 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 조성물은 수소이온 완충화(proton buffering) 활성을 가지고 있어, 엔도좀 분해(endosomolysis)를 통한 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도하는 것을 특징으로 한다.
상세하게는, 상기 비바이러스성 약물전달체는 친수성 및 소수성 화학 약물, 단백질 약물, 펩타이드 약물, 유전자 약물, 진단용 약물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 약물을 포함하고, 폴리에틸렌이민(bPEI), 폴리리신(PLL), 폴리(아르기닌)(poly(arginine)), 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리(아미도 아민)(poly(amido amine)), 폴리(베타 아미노 에스테르)(poly(beta amino ester)), 키토산(chitosan), 프로타민(protamine), 히스톤(histone), 폴리(3차 아민 메타크릴레이트(poly(tertiary amine methacrylate)), 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트(poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)), 폴리(N-[N-(2-아미노에틸)-2-아미노에틸]아스팔트아미드(poly(N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide), 지질, 인지질, 고분자유래 나노구조체, 금속유래 나노구조체, 탄소유래 나노구조체, 칼슘포스페이트 나노구조체, 다공성 실리카 나노구조체 및 이들의 복합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 전달체를 포함하는 것을 특징으로 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약물 전달용 고분자 조성물은 약학적으로 유효한 양의 약물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 약물이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달용 고분자 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 고분자 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 “약물”은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, (1) 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에 대한 예방효과를 가지고, (2) 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, (3) 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 할 수 있다.
본 발명은 약물 전달용 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 뉴클레오타이드를 이용하여 비환원성 고분자를 합성하여 (-)전하 고분자를 얻은 후, 이를 (+)전하 단백질이나 펩타이드와 결합시켜 정전기적 인력에 의해 단백질이나 펩타이드를 표적 부위로 전달하는 약물 전달체로서, 수소이온 완충 활성으로 인해 전달된 약물을 엔도솜에서 세포 내 다른 소기관으로 탈출시킬 수 있는 효과적인 약물전달체에 대한 것이다.
또한 본 발명은 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자를 포함한 비바이러스성 약물전달체에서 수소이온 완충 활성으로 인해 전달된 약물을 엔도솜에서 세포 내 다른 소기관으로 탈출시킬 수 있는 효과적인 생기능성 물질에 대한 것이다.
도 1은 합성된 폴리뉴클레오타이드의 젤 투과 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 폴리뉴클레오타이드의 수소이온 완충능력(proton buffering capacity) 평가 결과이다.
도 3은 형성된 pATP/리소자임(Lysozyme) 복합체의 입자크기와 표면전하를 나타낸다.
도 4는 PLL/폴리뉴클레오타이드-pDNA 복합체의 입자크기와 표면전하를 나타낸다.
도 5는 HepG2 세포에서 bPEI25kDa/pATP-pDNA 복합체 (N/P 5), bPEI25kDa/pGTP-pDNA 복합체 (N/P 5), PLL/pATP-pDNA 복합체 (N/P 5) 및 PLL/pGTP-pDNA 복합체 (N/P 5)의 유전자 발현효율을 나타낸다. ATP 및 GTP의 봉입된 농도가 0일 때, 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체 (N/P 5) 및 PLL/pDNA 복합체 (N/P 5)을 형성하고, 유전자 효율의 상대적 비교를 위해 이들의 유전자 효율을 각각 1로 표준화했다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 폴리뉴클레오타이드 ( Polynucleotide ) 합성
다양한 종류의 단량체(ATP, ADP, AMP, GTP, GDP, GMP, CTP, CDP, CMP)를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC), N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), 트리에틸아민(triethylamine; TEA) 존재 하에 수용액 상에서 교반 반응하였다. 합성된 고분자와 부산물을 투석을 이용해 분리정제한 후, 동결건조하여 폴리뉴클레오타이드를 얻었다.
본 발명에서 단량체 및 반응물의 몰비는 단량체 : EDC : NHS = 1 : 1 : 1로 반응하였고, 단량체 200mg을 물 5mL에 녹였다. 이때, 사용된 TEA는 100μL였고, 교반 반응은 48시간 동안 상온에서 진행하였다. 합성된 고분자 수용액을 MWCO(molecular weight cut-off)가 3500달톤인 투석막 안에 넣고, 밖의 물을 48시간 동안 최소 10번 이상 갈아주어 부산물과 저분자량 뉴클레오타이드를 제거하였고, 분리정제 작업은 상온에서 진행했다. 투석막 안에 남은 수용액을 동결건조하여 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자를 얻었다.
[반응식 1]
Figure 112015070103089-pat00005
< 실시예 2> 합성된 폴리뉴클레오타이드의 젤 투과 크로마토그래피( Gel Permeation Chromatography ) 분석
고분자 수용액을 0.5mg/mL로 희석한 후에 GPC용 vial에 0.2mL씩 옮겨 담았다. 그 후에 HPLC을 사용하여 하나의 샘플당 유속 1mg/mL로 15분간 흘려주었다. 분석 프로그램에서 GPC 모드로 전환 후 분자량 측정 범위 선택 후 calibration curve를 통하여 분자량을 계산하였다.
합성된 pATP와 pGTP의 GPC 결과를 도 1 나타내었다. pATP의 수평균 분자량은 1.28×105 달톤이고, 중량평균 분자량은 1.67×105 달톤이며, 이의 다분산도는 1.30이었다. pGTP의 수평균 분자량은 1.15×105 달톤이고, 중량평균 분자량은 1.83×105 달톤이며, 이의 다분산도는 1.5이었다.
< 실시예 3> 폴리뉴클레오타이드의 수소이온 완충능력( proton buffering capacity) 평가
단량체 및 합성된 폴리뉴클레오타이드 고분자를 1 mg/mL 농도로 150 mM 염화나트륨 수용액에 녹인 후, 소량의 NaOH를 넣어 약 pH 11의 수용액을 준비하였다. 이 수용액에 0.1 M 염화수소를 넣어주면서 pH 변화를 모니터링하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 엔도솜의 pH 영역인 pH 4-7에서 NaCl 용액은 수소이온 완충능력이 없는데, 폴리아데노신삼인산 (pATP)은 수소이온 완충능력을 갖고 있는 것을 확인할 수 있었고, 이는 ATP와 거의 같음을 알 수 있었다. 또한, 폴리구아노신삼인산 (pGTP)의 수소이온 완충능력도 GTP의 그 것과 거의 같았다. 이러한 폴리뉴클레오타이드의 엔도솜 내 pH 환경에서의 수소이온 완충능력은 잘 알려진 “수소이온 스폰지 효과(proton sponge effect)”처럼 삼투압 차이에 의한 충격으로 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴시킬 수 있다.
< 실시예 4> 폴리뉴클레오타이드의 양전하성 약물의 봉입 평가
음전하성 폴리뉴클레오타이드를 이용해 양전하성 단백질/펩타이드 약물의 봉입가능성을 리소자임(lysozyme)을 이용해 평가했다. 모델 폴리뉴클레오타이드로 pATP를 이용하여 리소자임과 중량비(Weight ratio)로 10 또는 20이 되도록 각각의 같은 부피의 용액을 준비하였다. 준비된 두 용액을 섞어 준 뒤에 약 15초간 강하게 교반해 주고, 30분 동안 상온에서 방치하였다. 형성된 pATP/리소자임(Lysozyme) 복합체의 입자크기는 수용액상에서는 zetasizer을 이용해 측정하였고, 건조된 입자는 주사전자현미경을 이용해 관찰했다. 또한 복합체 입자의 표면전하는 수용액상에서 zetasizer로 평가했다. 이 때 형성된 pATP/리소자임 복합체는 약 40 nm정도였으며, 표면전하는 약 -5mV 였다(도 3). 본 결과를 통해서 음전하성 폴리뉴클레오타이드가 양전하성 단백질/펩타이드를 봉입할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 5> 폴리뉴클레오타이드가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체의 유전자 발현 효율
폴리뉴클레오타이드를 잘 알려진 고분자/유전자 복합체 내에 봉입시키기 위해, 양전하성 고분자인 폴리에틸렌이민 (bPEI, 분자량 25kDa) 또는 폴리리신(PLL) 용액과 pDNA와 폴리뉴클레오타이드를 함유한 음전하 용액을 각각 준비한 후, 두 용액을 섞어 bPEI25kDa/폴리뉴클레오타이드-pDNA 복합체 또는 PLL/폴리뉴클레오타이드-pDNA 복합체 만들었다. N/P ratio 5로 준비하는데 이때, 폴리뉴클레오타이드의 포스페이트(phosphate)는 고려하지 않고, bPEI25kDa 또는 PLL의 아민(amine)과 pDNA의 포스페이트(phosphate)로만 계산했다.
준비된 bPEI25kDa/폴리뉴클레오타이드-pDNA 복합체 또는 PLL/폴리뉴클레오타이드-pDNA 복합체를 폴리뉴클레오타이드가 포함되지 않은 bPEI25kDa/pDNA 복합체 또는 PLL/pDNA 복합체와 비교하여 봉입된 폴리뉴클레오타이드의 유전자 발현 효율의 향상능력을 평가했다. 6 well plate의 한 well당 5×105개의 세포를 seeding 한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포를 트랜스펙션 (transfection) 1시간 전에 트랜스펙션 배지로 갈아 준 후, 준비된 bPEI25kDa/폴리뉴클레오타이드-pDNA 복합체, PLL/폴리뉴클레오타이드-pDNA 복합체, bPEI25kDa/pDNA 복합체 또는 PLL/pDNA 복합체 용액을 세포에 트랜스펙션하였다. 4시간 동안 배양 후 원래 혈청이 있는 세포배지로 갈아 준 후 44시간 동안 더 배양 후 유전자 발현효율을 평가하였다.
예로 PLL/폴리아데노신삼인산-pDNA 복합체의 입자크기는 pDNA의 1 마이크로그램당 ATP의 3 nmol까지 200nm이하의 크기를 보였고 표면전하는 양전하를 띠었다(도 4).
도 5에서 봉입된 ATP 및 GTP의 농도가 0 일 때, 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체 또는 PLL/pDNA 복합체을 형성하고, 이의 HepG2 세포에서의 유전자 발현효율을 상대적으로 비교하기 위해 각각 1로 정했다. 복합체 내에 봉인된 pATP 및 pGTP 양을 각각의 ATP 및 GTP 양으로 표현했을 때, bPEI25kDa/pATP-pDNA 복합체는 ATP농도가 1nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 약 80배, bPEI25kDa/pGTP-pDNA 복합체는 GTP농도가 1nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 약 4배, PLL/pATP-pDNA 복합체는 ATP농도가 3nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 약 3.6배, PLL/pGTP-pDNA 복합체는 GTP농도가 4nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 약 12배 증가하였다.

Claims (2)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 비환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 화합물; 및 폴리에틸렌이민(bPEI) 또는 폴리리신(PLL) 고분자로 형성된 약물전달 복합체를 포함하는 비바이러스성 약물전달용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112015070103089-pat00006

    상기 화학식 1에서,
    R은
    Figure 112015070103089-pat00007
    ,
    Figure 112015070103089-pat00008
    또는
    Figure 112015070103089-pat00009
    중 어느 하나이고,
    X는 0 내지 2의 정수이며, n은 4 내지 2000의 정수임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 수소이온 완충화(proton buffering) 활성을 가지고 있어, 엔도솜 분해(endosomolysis)를 통한 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도하는 것을 특징으로 하는 비바이러스성 약물전달용 조성물.
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