KR101539381B1 - 엔도솜 분해능을 갖는 뉴클레오타이드 및 이의 용도 - Google Patents

엔도솜 분해능을 갖는 뉴클레오타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴클레오타이드 및 비바이러스성 약물전달체를 포함하는 비바이러스성 약물전달체 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 수소이온 완충화(proton buffering) 활성 또는 용혈(hemolysis) 활성을 가지고 있어서, 엔도좀 분해(endosomolysis)를 통한 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 비바이러스성 약물전달체 조성물은 뉴클레오타이드의 수소이온 완충 활성 또는 용혈 활성으로 인해 전달된 약물을 엔도솜에서 세포 내 다른 소기관으로 탈출시킬 수 있는 효과적인 약물전달체에 대한 것이다.

Description

엔도솜 분해능을 갖는 뉴클레오타이드 및 이의 용도{Nucleotide having endosomolysis activity and uses thereof}
본 발명은 엔도솜 분해능을 갖는 뉴클레오타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
특정 장기, 조직, 세포, 세포질, 미토콘드리아, 핵 주위 부분(perinuclear regions) 및 세포핵 부위로 다양한 치료제(예를 들면, 저분자량의 화학적 약물 및 조영제 뿐만 아니라 고분자량의 펩타이드, 단백질 및 유전물질)를 전달하기 위한 효과적인 시스템 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 전통적인 제형과 다르게, 위치-특이적 나노치료제는 표적 부위에 전달된 치료제의 생물학적 이용가능성(bioavailability)이 최대화되도록 고안되었고, 낮은 부작용으로 질병을 치료하면서 치료 효과를 높일 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 약물전달 기술은 고부가가치 기술로서 전체 약물 개발 과정에서 갈수록 중요한 부문을 차지하고 있고, 환자들의 약물 순응도와 복용의 편리성을 제고시키는 방법으로 그 활용도가 증가하고 있다.
세포 내로 전달된 생물학적 제제의 엔도솜 격리(Endosomal sequestration)는 중요한 장애물인데, 이는 아민, 설폰아마이드 또는 카르복실산을 가진 고분자나 단량체에 의해 유도되는 엔도솜-막 불안정화 또는 파괴를 통해 극복될 수 있다. 이러한 고분자/단량체는 비바이러스성 유전자 전달 및 화학 약물의 세포질 전달에 있어서 개선된 결과를 가져온다. 엔도좀 pH에 있어서, 수소이온 완충화(proton buffering) 및 구조 전이(conformational transition) 특성은 지질막 불안정화 또는 엔도좀 파괴(endosomolysis)를 유도하는 것으로 알려져 있다.
한편, 한국특허출원 제10-2009-0134481호에서는 폴리락트산을 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물 및 그 제조방법에 대해 개시하고 있으나, 본원 발명에 기재된 뉴클레오타이드의 엔도솜 분해능을 통한 약물전달에 대한 언급은 없다.
따라서, 본 발명자들은 뉴클레오타이드가 수소이온 완충능력을 가지고 있고, 용혈 작용을 일으켜 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴하여, 전달된 약물을 엔도솜에서 세포 내 다른 소기관으로 탈출시킬 수 있는 생기능성(biofunctional)이 있다는 것을 확인하고 이를 이용한 약물전달체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 뉴클레오타이드 및 비바이러스성 약물전달체를 포함하는 비바이러스성 약물전달체 조성물을 제공하는데 있다. 다양한 특성의 약물을 포함하는 비바이러스성 약물전달체에서 약물의 효능 증진을 위해 상기 뉴클레오타이드가 엔도좀 막 불안정화 또는 파괴하는 역할을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뉴클레오타이드 및 비바이러스성 약물전달체를 포함하는 비바이러스성 약물전달체 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 뉴클레오타이드는 아데노신일인산(Adenosine monophosphate, AMP), 아데노신이인산(Adenosine diphosphate, ADP), 아데노신삼인산(Adenosine triphosphate, ATP), 구아노신일인산(Guanosine monophosphate, GMP), 구아노신이인산(Guanosine diphosphate, GDP), 구아노신삼인산(Guanosine triphosphate, GTP), 사이티딘일인산(Cytidine monophosphate, CMP), 사이티딘이인산(Cytidine diphosphate, CDP), 사이티딘삼인산(Cytidine triphosphate, CTP), 티미딘일인산(Thymidine monophosphate; TMP), 티미딘이인산(Thymidine diphosphate; TDP) 또는 티미딘삼인산(Thymidine triphosphate; TTP)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 조성물은 수소이온 완충화(proton buffering) 활성 또는 용혈(hemolysis) 활성을 가지고 있어서, 엔도좀 분해(endosomolysis)를 통한 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도하는 것을 특징으로 한다.
상세하게는, 상기 비바이러스성 약물전달체는 친수성 및 소수성 화학 약물, 단백질 약물, 펩타이드 약물, 유전자 약물, 진단용 약물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 약물을 포함하고, 폴리에틸렌이민(bPEI), 폴리리신(PLL), 폴리(아르기닌)(poly(arginine)), 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리(아미도 아민)(poly(amido amine)), 폴리(베타 아미노 에스테르)(poly(beta amino ester)), 키토산(chitosan), 프로타민(protamine), 히스톤(histone), 폴리(3차 아민 메타크릴레이트(poly(tertiary amine methacrylate)), 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트(poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)), 폴리(N-[N-(2-아미노에틸)-2-아미노에틸]아스팔트아미드(poly(N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide), 지질, 인지질, 고분자유래 나노구조체, 금속유래 나노구조체, 탄소유래 나노구조체, 칼슘포스페이트 나노구조체, 다공성 실리카 나노구조체 및 이들의 복합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 전달체를 포함하는 것을 특징으로 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 약물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 약물이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 “약물”은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, (1) 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에 대한 예방효과를 가지고, (2) 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, (3) 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 할 수 있다.
본 발명은 엔도솜 분해능을 갖는 뉴클레오타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 뉴클레오타이드의 수소이온 완충 활성 또는 용혈 작용으로 인해 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 비바이러스성 약물전달체에서 전달된 약물을 엔도솜에서 세포 내 다른 소기관으로 탈출시킬 수 있는 효과적인 생기능성 물질에 대한 것이다.
도 1은 뉴클레오타이드의 수소이온 완충능력(proton buffering capacity) 평가 결과이다.
도 2는 pH 환경하에서 ATP 및 GTP의 용혈현상 평가 결과이다.
도 3은 bPEI25kDa/ATP-pDNA 복합체 및 PLL/ATP-pDNA 복합체의 입자크기(도 3a) 및 표면전하(도 3b)를 나타낸다.
도 4는 HepG2 세포에서 bPEI25kDa/ATP-pDNA, bPEI25kDa/GTP-pDNA 복합체의 유전자 발현효율을 나타낸다.
도 5는 Chloroquine 또는 Bafilomycin A1 존재시, HepG2 세포에서 bPEI25kDa/ATP-pDNA, bPEI25kDa/GTP-pDNA 복합체의 유전자 발현효율을 나타낸다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 뉴클레오타이드의 수소이온 완충능력( proton buffering capacity) 평가
뉴클레오타이드를 1 mg/mL 농도로 150 mM 염화나트륨 수용액에 녹인 후, 소량의 1 M 수산화나트륨 수용액을 넣어 약 pH 11의 수용액을 준비하였다. 이 수용액에 0.1 M 염화수소를 넣어주면서 pH 변화를 측정하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 엔도솜의 pH 영역인 pH 4~7에서 염화나트륨 수용액은 수소이온 완충능력이 없는데, 아데노신삼인산(ATP)은 수소이온 완충능력을 갖고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 구아노신삼인산(GTP), 사이티딘삼인산(CTP), 티미딘삼인산(TTP)도 수소이온 완충능력을 가지고 있었다. 이러한 뉴클레오타이드의 엔도솜 내 pH 환경에서의 수소이온 완충능력은 잘 알려진 “수소이온스폰지 효과(proton sponge effect)” 처럼 삼투압 차이에 의한 충격으로 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴 시킬 수 있다.
< 실시예 2> 뉴클레오타이드의 용혈현상( Hemolysis ) 평가
뉴클레오타이드가 엔도솜의 막과 상호작용을 통해 엔도솜을 파괴함을 확인하기 위해 엔도솜 막과 비슷한 구조를 지닌 적혈구를 이용하여 뉴클레오타이드의 엔도솜 파괴 능력을 평가하였다. 쥐(Rat)에서 채취한 혈액으로부터 적혈구를 분리한다. 준비된 적혈구 1×108 개의 세포를 1mg/mL의 ATP와 GTP을 포함하는 pH가 다른 DPBS 용액 (pH 4 ~ 7.5)에 넣고 잘 섞는다. 이 용액을 섭씨 37도 항온조에서 1시간동안 방치한다. 다시 원심분리 후, 상층액을 96 well plate에 옮긴 뒤에 450nm에서 흡광도를 측정하여 용혈정도를 계산한다. 도 2에서 ATP를 넣어준 경우 pH 6 이하에서 용혈작용이 일어남을 확인하였고, GTP의 경우 용혈작용이 일어나지 않았다.
<실시예 1>과 <실시예 2>의 결과로부터 ATP는 수소이온 완충능력 뿐만 아니라, 엔도솜 막과 상호작용을 통해 엔도솜을 탈출하는 것을 알 수 있고, GTP는 수소이온 완충능력만을 이용해 엔도솜을 탈출하는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 3> 뉴클레오타이드가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체의 유전자 발현 효율
뉴클레오타이드를 잘 알려진 고분자/유전자 복합체 내에 봉입시키기 위해, 양전하성 고분자인 폴리에틸렌이민 (bPEI25kDa, 분자량 25kDa) 용액과 pDNA와 뉴클레오타이드를 함유한 음전하 용액을 각각 준비한 후, 두 용액을 섞어 bPEI25kDa/뉴클레오타이드-pDNA 복합체를 만들었다. N/P ratio 5로 준비하는데 이 때, 뉴클레오타이드의 포스페이트(phosphate)는 고려하지 않고, bPEI25kDa의 아민(amine)과 pDNA의 포스페이트(phosphate)로만 계산했다.
준비된 bPEI25kDa/뉴클레오타이드-pDNA 복합체를 뉴클레오타이드가 포함되지 않은 bPEI25kDa/DNA 복합체와 비교하여 봉입된 뉴클레오타이드의 유전자 발현 효율의 향상능력을 평가했다. 6 well plate의 한 well당 5×105개의 세포를 넣은 후 24시간 동안 배양하였다. 트랜스펙션 (transfection) 1시간 전에 혈청이 없는 트랜스펙션용 배지로 갈아 준 후, 준비된 bPEI25kDa/뉴클레오타이드-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/pDNA 복합체 용액을 세포에 트랜스펙션하였다. 4시간 동안 배양 후, 혈청이 있는 세포배지로 갈아 준 후 44시간 동안 더 배양 후 유전자 발현효율을 평가하였다.
예로, 도 3에서 보는 것처럼, bPEI25kDa/ATP-pDNA 복합체의 입자크기는 pDNA의 1 마이크로그램당 ATP의 0.5, 4, 8nmol까지 200nm 정도의 크기를 보였고, 표면전하는 2nmol까지는 양전하를 4nmol 이상에서는 음전하를 띠었다. 또한 PLL/ATP-pDNA 복합체의 입자크기는 pDNA의 1 마이크로그램당 ATP의 약 9nmol까지 200nm 정도의 크기를 보였고 표면전하는 약 18nmol까지는 양전하를 띠었다.
도 4에서 봉입된 ATP 및 GTP의 농도가 0일 때, 대조 복합체인 bPEI25kDa/pDNA 복합체를 형성하고, 이 복합체의 HepG2 세포에서의 유전자 발현효율을 상대적으로 비교하기 위해 각각 1로 정했다. bPEI25kDa/ATP-pDNA 복합체는 ATP농도가 4nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 약 80배, bPEI25kDa/GTP-pDNA 복합체는 GTP농도가 2nmol/μg pDNA 일 때 유전자 발현효율이 약 35배 증가하였다.
< 실시예 4> Bafilymycin A1 또는 Chloroquine 이 존재시 뉴클레오타이드가 포함된 고분자 유전자 약물 전달체의 유전자 발현 효율
일반적으로 고분자 유전자 약물전달체가 endocytosis를 통해 세포로 들어가는 경우, 엔도솜으로부터의 탈출이 유전자 발현효율을 결정하는 여러 중요한 요인들 중 하나이다. 고분자 유전자 약물전달체가 endocytosis를 이용해 세포로 유입되는지 평가하기 위해 bPEI25kDa/ATP-pDNA 복합체 트랜스펙션시 엔도솜을 파괴하는 시약(chloroquine; 25μM) 또는 엔도솜 파괴를 억제하는 시약(Bafilomycin A1; 20nM)을 배지에 같이 넣어준 뒤에 유전자 발현 효율을 평가하였다.
고분자 유전자 약물전달체가 endocytosis를 경유하여 세포로 유입되면, chloroquine과 Bafilomycin A1을 둘 다 넣지 않은 대조군(control) 실험의 고분자 유전자 전달체와 비교하여, chloroquine을 넣으면 고분자 약물전달체가 빨리 엔도솜으로부터 탈출되므로 유전자 발현효율이 높아지고, Bafilomycin A1을 넣으면 고분자 약물전달체가 엔도솜으로 탈출이 어렵기 때문에, 유전자 발현효율이 낮아지거나 영향이 없다. 이와 동일한 결과가 도 5에서 보이는 것처럼 bPEI25kDa/ATP-pDNA 복합체를 이용한 유전자 발현효율에서 보였다. 즉, 뉴클레오타이드를 포함하는 고분자 유전자 복합체가 endocytosis를 통해 세포 안에 들어가고, 뉴클레오타이드가 수소이온 완충에 의해 엔도솜 막을 파괴할 수 있음을 보여준다.

Claims (8)

  1. 아데노신일인산(Adenosine monophosphate, AMP), 아데노신이인산(Adenosine diphosphate, ADP), 아데노신삼인산(Adenosine triphosphate, ATP), 구아노신일인산(Guanosine monophosphate, GMP), 구아노신이인산(Guanosine diphosphate, GDP), 구아노신삼인산(Guanosine triphosphate, GTP), 사이티딘일인산(Cytidine monophosphate, CMP), 사이티딘이인산(Cytidine diphosphate, CDP), 사이티딘삼인산(Cytidine triphosphate, CTP), 티미딘일인산(Thymidine monophosphate; TMP), 티미딘이인산(Thymidine diphosphate; TDP) 및 티미딘삼인산(Thymidine triphosphate; TTP)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드; 및 폴리에틸렌이민(bPEI) 또는 폴리리신(PLL) 고분자로 형성된 약물전달 복합체를 포함하는 엔도솜 분해능을 갖는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엔도솜 분해능은 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴하여 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도하는 것을 특징으로 하는 엔도솜 분해능을 갖는 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 약물전달 복합체는 bPEI25kDa/ATP-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/GTP-pDNA 복합체인 것을 특징으로 하는 엔도솜 분해능을 갖는 조성물.
  5. 아데노신일인산(Adenosine monophosphate, AMP), 아데노신이인산(Adenosine diphosphate, ADP), 아데노신삼인산(Adenosine triphosphate, ATP), 구아노신일인산(Guanosine monophosphate, GMP), 구아노신이인산(Guanosine diphosphate, GDP), 구아노신삼인산(Guanosine triphosphate, GTP), 사이티딘일인산(Cytidine monophosphate, CMP), 사이티딘이인산(Cytidine diphosphate, CDP), 사이티딘삼인산(Cytidine triphosphate, CTP), 티미딘일인산(Thymidine monophosphate; TMP), 티미딘이인산(Thymidine diphosphate; TDP) 및 티미딘삼인산(Thymidine triphosphate; TTP)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드; 및 폴리에틸렌이민(bPEI) 또는 폴리리신(PLL) 고분자로 형성된 약물전달 복합체를 포함하는 비바이러스성 약물전달용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 수소이온 완충화(proton buffering) 활성 또는 용혈(hemolysis) 활성을 가지고 있어서, 엔도솜 분해(endosomolysis)를 통한 전달 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도하는 것을 특징으로 하는 비바이러스성 약물전달용 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 약물전달 복합체는 bPEI25kDa/ATP-pDNA 복합체 또는 bPEI25kDa/GTP-pDNA 복합체인 것을 특징으로 하는 비바이러스성 약물전달용 조성물.
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