KR100533247B1

KR100533247B1 - 이미다졸 링을 갖는 키토산 유도체를 이용한 유전자 전달체

Info

Publication number: KR100533247B1
Application number: KR10-2004-0022301A
Authority: KR
Inventors: 조종수; 김태희; 임종은
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2005-12-02
Also published as: KR20050097189A

Abstract

본 발명은 유전자 전달체로서, 이미다졸링을 갖는 우로카닌산으로 수식이 된 키토산 유도체(UAC)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 UAC는 키토산 자체보다 큰 표면 전하값을 가짐으로써 복합체의 입자크기를 작게하는 효과가 있으며, UAC/DNA 복합체는 독성이 없으며, 세포에의 도입효율이 높고, 키토산의 낮은 트렌스팩션 효율을 보완하여 유전자 발현률을 높이며, 생체 적합성이 우수하다.

Description

이미다졸 링을 갖는 키토산 유도체를 이용한 유전자 전달체{Gene Delivery system by Urocanic Acid-Modified Chitosan}

본 발명은 새로운 유전자 전달체로서 키토산 유도체에 관한 것이다.

유전자 치료란 DNA 재조합 방법을 이용하여 만든 새로운 유전자나 유전물질을 환자의 세포안으로 주입시켜 유전자 결함을 교정시키거나 세포에 새로운 기능을 추가시켜 인체 세포의 유전적 변형에 의한 암, 감염성 질병, 그리고 자가 면역 질환과 같은 모든 유전적 결함을 예방하거나 치료하는 방법을 말한다. 또한 최근에는 이와 같은 유전자 요법의 개념이 확장되어 자손에게 전달되는 선천성 유전병뿐만 아니라 인체면역결핍바이러스(HIV) 감염에 의한 후천성면역결핍증(AIDS)과 같은 후천성 질병의 치료에도 적용된다.

이러한 유전자 치료에는 단백질을 직접 주입하는 방법에서부터 몸 안에 있는 특정 유전자 발현을 도와주거나 억제하는 약물치료법, 그리고 유전정보를 가진 DNA를 몸 안에 주입하여 주입된 유전자가 발현하게 하는 방법 등이 있다. 그러나 단백질을 직접 주입하는 방법과 약물치료법은 외부 물질에 대한 면역반응을 일으킬 위험성이 있고, 지속적인 주입이 필요하다는 것과 생산비용이 비싼 단점이 있다. 이러한 단백질 약품의 문제점을 극복하기 위하여 생각해 낸 개념이 유전자를 이용하는 방법이다. DNA는 생체내에서 단백질을 만들어 낼 수 있는 능력을 가지고 있다. 따라서 기존의 단백질을 직접 주입하는 방법에서 DNA를 생체내에 주입하여, 주입된 DNA가 지속적으로 단백질을 만들어 내게 한다는 것이 유전자 치료의 기본적인 개념이다.

이와 같은 새로운 차원의 치료 방법이 많은 의료기관에서 일반적이고 효과적인 치료방법으로 사용되기에는 몇 가지 해결해야 할 일들이 있다. 일단 어떤 특정한 단백질을 만들어 낼 수 있는 유전 암호를 가진 유전자가 필요하다. 그 다음으로 그 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드(plasmid)라고 불리는 유전자 발현 체계가 있어야 한다. 마지막으로 특정 유전자가 포함된 발현체를 원하는 위치까지 안전하게 운반시킬 수 있는 전달체가 필요하다. DNA는 생체 중에서 가수분해를 받기 쉽고 또한 세포 내로 들어가는 효율이 낮은 문제점을 가지고 있기 때문에 이러한 문제점을 해결하여 유전자 치료법을 실용화하기 위하여 유전자 전달체 (gene delivery system)에 대한 많은 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근까지 임상 실험에는 유전자 전달체로 트랜스펙션(transfection) 효율이 높은 바이러스성 벡터(viral vector)가 사용되고 있다. 그러나, 이는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염가능성, 염증생성, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 DNA의 크기가 한정되어 있다는 문제로 사람에게 적용하기엔 한계가 많다. 따라서, 현재로는 비바이러스성 벡터(non-viral vector)가 바이러스성 벡터의 대용으로 각광을 받고 있다.

비바이러스성 벡터는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정세포로의 특이적 전달이 가능하며, 저장하는데 안정하고, 많은 양을 생산하기 쉽다는 장점을 가지고 있다. 현재 많이 사용되고 있는 것은 주로 양성의 리포좀(liposome)계로서 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드{N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA)}, 알킬암모늄(alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체(cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘(gramicidin) 등이 있으며 이들이 DNA와 결합하여 효율적으로 세포막으로 들어간다고 보고 되고 있으나, 복잡한 제조과정, 큰 분자량을 갖는 DNA의 낮은 내포율, 인비보(in vivo) 상에서의 혈청성분에 의한 트랜스펙션 활성 저하, 입자크기 등이 문제가 되고 있다. 또한 현재 가장 많이 이용되는 리포펙틴 (lipofectin)의 경우도 세포 독성이 크게 문제가 되고 있다.

최근 비바이러스성 벡터 중, 양이온성 고분자가 음전하를 띠는 DNA와 이온결합을 통한 복합체를 형성할 수 있기 때문에 많은 관심을 불러일으키고 있다. 여기에는 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리[N,N'-(디메틸아미노)에틸]메타크릴레이트(PDMAEMA) 등이 있으며, 이들은 DNA를 압축하여 나노입자를 형성하여, 효소분해로부터 DNA를 보호하고, 빠르게 세포안으로 침투하여 엔도좀에서 빠져나올 수 있도록 도와준다. 그러나, 대부분의 비바이러스성 유전자 전달체는 바이러스성 유전자 전달체에 비하여 면역거절반응과 세포독성이 낮은 편이지만 상대적으로 유전자 발현률이 매우 낮기 때문에, 독성은 낮추면서 발현률을 높이는 것이 비바이러스성 유전자 전달체를 개발하는데 가장 중요한 문제라 하겠다.

키토산(chitosan) 또한 생체적합성, 생분해성, 낮은 독성 그리고 높은 양이온성 때문에 비바이러스성 유전자 전달체로서 충분한 가능성을 보이는 물질이다. 그러나, 낮은 트랜스펙션 효율 때문에 실질적인 응용에 많은 어려움을 가지고 있다. 효율적인 유전자 발현을 위해서는 다음과 같은 몇 가지 과정들을 거쳐야 한다. 일단 세포로의 효과적인 침투를 위해 DNA와 결합하여 이룬 복합체가 150nm 크기 이하로 축합되어야 하고, 여러 효소로부터 DNA의 분해를 막을 수 있어야 하며, 세포내로 들어가서는 복합체가 엔도좀에서 잘 빠져나와야 하고, 세포핵 내로 들어가야 하고, 운반체로부터 DNA의 해리가 이루어져야 한다. (M. Koeping-Hoeggaerd et. al.(2001) "Chitosan as a nonviral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo" Gene Therapy 8: 1108-1121)

현재 국내외의 여러 연구 결과에 따르면, 고분자/DNA 복합체의 엔도좀으로부터의 낮은 방출률이 낮은 유전자 발현율을 야기시키는 가장 큰 이유라고 보고하고 있다. 이 문제를 해결하기 위해, 엔도좀 막의 불안정을 가져올 수 있는, 클로로퀴인(chloroquine)(E. Wagner(1998) "Effects of membrane-active agents in gene delivery" J. Control Rel. 53:155-158)이나 불활화시킨 아데노바이러스 (E. Wagner et. al. (1992) "Coupling of adenovirus to transferrin-polylysine/DNA complexes greatly enhances receptor-mediated gene delivery and expression of transfected genes" Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 6099-6103)를 함께 주입하거나, 엔도좀을 파괴하는 펩타이드인 갈라(GALA)나 칼라(KALA)를 첨가함으로 pH의 변화에 따른 엔도좀막의 불안정을 가져와 DNA 복합체가 빨리 빠져 나오게 하는 연구가 시도되고 있다. 하지만, 세포독성과, 면역원성 그리고 그 외에 부작용으로 인해 실제 임상에 적용하기엔 부적합하다고 하겠다. 또한 PEI는 양이온성 고분자 중 높은 유전자 발현을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 이는 엔도좀에서 PEI가 수소화되어 프로톤 스폰지(proton sponge) 효과를 나타내기 때문에 PEI/DNA 복합체가 엔도좀에서 빨리 방출되어 세포핵 안으로 들어간다고 알려져 있다 (W. T. Godbey et. al. (1999) "Polyethylenimine and its role in gene delivery" J. Control Rel. 60 (1999) 149-160. 하지만, PEI 역시 세포독성이 심하고, 생분해되지 않아 실질적으로 임상에 적용하기엔 적합하지 않다. 또한 최근에, 이미다졸링을 갖는 히스티딘(histidine)과 같은 고분자들이 PEI와 같은 프로톤 스폰지 역할을 하여 사이토플라즘(cytoplasm)으로의 방출을 돕는다는 사실이 알려져 이에 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다. 히스티딘의 이미다졸 링은 pKa 값이 6.15 정도로, 단백질을 구성하는 단위로 생체적합성이 우수한 것으로 알려져 있다 (D. W. Pack et. al. (2000) "Design of imidazole-containing endosomolytic biopolymers for gene delivery" Biotechnology and Bioengineering 67 217-223).

본 발명의 목적은, 독성이 없고 생체 적합성이 우수하지만 트랜스펙션 효율이 낮은 키토산의 단점을 보완하여, 엔도좀에서 빠르게 방출을 유도함으로써 유전자 발현율을 높일 수 있는 새로운 유전자 전달체를 제공하는데 있다.

본 발명은 유전자 전달체로서, 이미다졸링을 갖는 우로카닌산으로 수식이 된 키토산 유도체에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 하기 화학식1을 주반복단위로 포함하는 고분자 화합물에 관한 것이다.

(단,x>n이고, x는 1이상의 정수임)

바람직하게는, 상기 고분자 화합물은 분자량이 5K 이상이며, 1,000K정도 까지도 사용가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 화합물은 이미다졸 링을 갖는 우로카닌산을 키토산에 결합시킨 중합체(이하 본발명의 고분자화합물 또는 UAC라 지칭한다.)이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표현되는 키토산 유도체와 DNA와의 복합체에 관한 것이다. 상기 복합체는 키토산 유도체와 DNA의 이온결합 생성물이다.

이하에서, 본 발명의 전달체 및 복합체에 대해 보다 상세하게 설명하기로 한다.

상기 화학식 1의 본 발명 유전자 전달체는 천연고분자로서 독성이 없고 생체적합성이 우수한 양성의 다당물질인 키토산에, 엔도좀에서 사이토졸로 빨리 방출될 수 있도록 도와주는 이미다졸 링을 갖는 우로카닌산을 결합시킴으로서 트렌스팩션 효율을 높이기 위하여 제조된 양이온성 고분자 화합물이다. 이 반응은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 히드로클로라이드 (EDC)의 존재하에서 활성 에스테르 중간체를 경유하여 결합되었다.

이와 같은 본 발명의 UAC를 수용액 중에서 DNA와 혼합하게 되면, 양이온성 고분자인 본 발명의 UAC와 음이온성 고분자인 DNA와 정전기적으로 보완적인 사슬간의 협력적 결합, 즉 복합체를 형성하게 되는 것이다.

본 발명의 또다른 태양은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 유전질환 치료제이다. 유전자 치료의 응용으로는 암, 후천성면역결핍증, 아토피, 당뇨병, 골다공증, 그외 면역관련 질병 등을 들 수 있다. 또한 사이토카인 치료, DNA백신으로도 널리 사용가능하다.

이하에서, 실시예를 들어 본 발명에 대하여 상세하게 설명하기로 하되, 이는 본 발명의 예시에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1: 우로카닌산을 결합시킨 키토산 유도체 (UAC)의 제조>

50K의 수용성 키토산을 사용하였고, 우로카닌산 (UA) (mol%: 20, 50, 70)을 EDC[1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 히드로클로라이드]를 이용하여 키토산에 결합시켰다. UA의 카르복실기는 10ml의 2-모르포리노에탄술폰산(2-Morpholinoethanesulfonic acid : MES) 완충용액상에서 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide:NHS)/EDC에 의해 활성화되었고, 이렇게 활성화 된 UA가 녹아있는 용액을 키토산 0.5g을 녹인 용액에 부어 24시간동안 실온에서 반응시켰다. 그 이후, 하이드록실아민의 첨가로 반응을 종료시켰으며, NaOH의 첨가로 pH를 8 이상으로 맞추었다. 그리하여, 미반응 UA를 모두 제거하였고, 하얀 침전물을 얻었다. 이 생성물은 투석막 (Spectra/Por membrane; MWCO=12,000-14,000)을 통해 4일 동안 투석하였으며, 여러 번 물로 수세를 해주면서 원심분리를 하여 침전물을 동결건조 시켰고, 그 건조된 생성물은 다시 0.1M 초산에 용해되었다. 그리고 각각의 UAC 치환값은 닌히드린 검사(ninhydrin assay)를 통해 계산하였으며, 이는 NMR 측정으로 재확인되었다. 결합한 우로카닌산은 전체의 16, 27.7, 36.3 mol%를 차지하고 각각을 UAC20, UAC50, UAC70으로 명명한다. 그리고 도 1에 UAC70의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시하였다.

<실시예 2: UAC와 DNA와의 복합체 형성>

전하비율을 계산하기 위해서는 DNA는 330의 분자량 당 하나의 전하로 계산하였으며, UAC는 우로카닌산을 포함한 키토산의 반복단위당 두개의 전하로 계산하였다. DNA는 에티디움 브로마이드를 사용하여 형광을 나타내게 하였다. 실시 예 1에서 제조한 UAC와 DNA[녹색 형광 단백질 표지 유전자(plasmid Enhanced Green Fluorescent Protein : pEGFP](0.1㎍)를 10mM 인산 완충액 (PBS, pH 7.4)에서 다양한 전하비율로 30분간 자발적인 복합체를 형성한 후, 트리스-아세테이트 (TAE) 러닝 버퍼를 사용하여 1 % 아가로스 젤에서 100V, 40분 동안 전기영동함으로써 복합체의 형성을 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. UA의 치환값이 커질수록 좀 더 복합체를 잘 형성하는 것으로 보이고, 전하비율은 UAC(N)/DNA(P)가 5 이상일 때 완전한 복합체를 이루는 것으로 보인다.

<실험예 1: UAC/DNA 복합체의 디옥시리보뉴클레아제(DNase I)으로부터 DNA의 분해억제능>

실시예 2에서 형성된 복합체에 DNase I을 DNA 0.1g당 2 unit 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰고, 그 결과는 도 3에 나타내었다. UAC20에서도 복합체를 완전히 이룬 전하비율 3 에서부터 DNA가 분해되지 않고 남아있음을 확인하여, UAC가 효소로부터 DNA를 보호해주는 역할을 하고 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 2: UAC/DNA 복합체의 입자크기 및 입자크기 분포>

상기 제조방법과 같이 UAC/DNA를 다양한 전하비율로 제조하여, 전기영동광산란계 (ELS 8000, Otsuka Electronics, Ltd., Osaka, Japan)로 측정하였고, 그 결과는 표 1과 도 4에 도시하였다.

키토산 단독보다 UA로 치환한 키토산 유도체가 더 작은 입자크기를 보였으며, 크기는 대략 100nm 부근의 값을 가진다. 그리고 입자크기 분포도 하나의 샤프한 피크를 보임으로해서 고른 분포를 가진다. 세포내로의 빠른 유입을 위해서 입자의 크기가 150nm이하가 되어야 한다는 조건에 잘 부합한다.

또한 상기 제조방법과 같이 UAC/DNA 복합체를 전하비율 20에서 제조하여, 구리 격자(copper grid)에 떨어뜨리고 1%의 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 10초간 염색하여 투과 전자현미경(Transmission electron microscopy)으로 형태를 관찰하였다. 그 결과는 도 5에 나타나 있다. 도 5에 나타난 바와 같이 형태도 구형을 이루고 입자 크기도 표 1에서 나타난 값과 비슷하거나 조금 더 작게 나타났다.세포내로의 빠른 유입을 위해서 입자의 크기가 150nm이하가 되어야 한다는 조건에 잘 부합한다.

<실험예 3: UAC/DNA 복합체의 입자의 표면전하>

표면전하 역시 실험예 2에서 사용했던 같은 전기영동광산란계를 사용하였고, 그 결과는 도 6에 도시하였다. UAC/DNA 전하비율이 커질수록 좀 더 강한 양전하를 띠었고, UA의 치환값이 커질수록, 좀 더 강한 양전하를 띠는 것을 확인하였는데, 이는 키토산 자체의 pKa 값보다 좀 더 낮은 값을 갖는 UA 때문으로 추정되어진다. 또한 표면전하가 양전하를 띤다는 것은 음전하를 띠는 DNA가 완전히 복합체 안에 안전하게 쌓여져있다는 것을 의미하고, 이 결과는 실험예 1에서 나타난 결과와 같은 맥락이다. 또한 이렇게 약간의 양전하를 띠는 것은 세포내로의 유입을 쉽게 할 뿐만 아니라, 입자들끼리의 정전기적 반발력을 일으켜서 입자들끼리의 응집현상을 줄여주는 역할을 해줄 수 있는 장점이 있다.

<실험예 4: UAC의 세포독성실험>

HeLa와 293T 세포주를 각각 96 웰-플레이트(well-plate)에 웰(well) 당 2×10⁴개의 농도로 분주하였고, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Minimum essential medium)배지를 이용하여 24시간동안 키웠다. 키토산과 실시예 1에서 제조한 UAC를 농도별로 48시간동안 처리하여 셀타이터 96 ^?수성 일용액 세포분열 검사[CellTiter 96^?Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, Madison, USA)]를 이용해 세포 독성을 알아보았다. 293T에 대한 세포독성 결과는 도 7에 나타내었다. 키토산 자체보다 UAC가 좀 더 세포활성에 좋은 것으로 나타났고, UA 치환값이 증가할수록 세포활성이 더 좋은 것으로 나타났다. 이는 UA가 생체적합한 물질임을 증명하는 것이다.

<실험예 5: UAC/DNA 복합체의 트랜스펙션 효율>

293 T 세포를 24 웰-플레이트에 각 웰당 1 x 10⁵cell을 분주하여, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum:FBS)을 넣은 DMEM배지에서 24 시간 동안 37℃, 5 % 이산화탄소 하에서 키운다. 그 다음, 실시 예 2와 같은 방법으로 루시퍼라아제(luciferase) 표지 유전자(pGL3-Control)와 복합체를 형성시킨 후 각 웰에 FBS가 없는 배지와 함께 넣어준다. 6 시간 동안 37℃, 5 % 이산화탄소 하에서 인큐베이션 후, 배지를 제거해 주고 신선한 10 % FBS를 넣은 DMEM 배지를 넣고 48시간 동안 37 ℃, 5 % 이산화탄소 하에서 인큐베이션 시켜준다. 배지를 제거한 후, 세포 라이시스 완충용액(cell lysis buffer)를 100 ㎕씩 넣고 20℃에서 24 시간 둔다. 하루 지난 후 상온에서 녹인 다음 각 웰에서 이-튜브(e-tube)로 옮겨 담고 10000 rpm에서 15 분간 원심분리를 하여 상층액만 얻는다. 얻은 상층액을 루시페라제 분석 장치(luciferase assay kit)를 이용하여 그 활성을 측정하였다. (도면에서 RLU는 'relative light unit'의 약자임)그 결과는 도 8에 나타내었다. 여기서 알 수 있듯이, UA의 치환값이 증가할수록, 유전자 발현율이 크게 증가함을 알 수 있고, 키토산 자체와 비교했을 때, 크게는 1000배 이상의 효율 증가를 보였다.

<실험예 6: UAC/DNA 복합체의 공초점 레이저 주사현미경 관찰>

24 웰-플레이트에 지름 1 cm의 필름을 놓고 그 위에 293 T 세포를 웰당 3 x 10⁵ 개로 분주한 후, 실험예 4와 같은 방법으로 시료를 처리한다. 여기서는 녹색형광단백질 표지 유전자인 pEGFP N1을 가지고 UAC50과 복합체를 형성하였다. 시료 처리 후 6시간이 지나 새로운 10 % FBS가 있는 DMEM 배지로 교체해주었고, 24 시간 후 3.7% 포르말린으로 세포를 고정시키고, 프로피디움 아이오다이드(PI)로 핵을 염색시킨 후 슬라이스 글라스에 마운팅 시켜서 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었으며, 관찰 결과 초록색을 띠는 단백질이 발현하여 핵 주변으로 나타남을 알 수 있다. 이는 실험예 4에서 나타난 결과와 상응하는 것이다.

도1은 이미다졸 링을 갖는 키토산 유도체 (UAC)의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도2는 DNA 및 다양한 전하비율에 따른 UAC/DNA (pEGFP N1) 복합체들의 전기영동 사진이다.

도3은 UAC/DNA 복합체의 DNase I으로부터의 방어능력을 살핀 전기영동 사진이다.

도4는 전하비율 10에서의 UAC70/DNA 복합체의 입자크기 분포에 대한 그래프이다.

도5는 전하비율 20에서의 UAC50/DNA 복합체를 투과전자현미경으로 관찰한 사진이다.

도6은 다양한 전하비율에 따른 키토산과 UAC/DNA 복합체의 표면전하(zeta-potential)에 대한 그래프이다.

도7은 키토산, UAC와 폴리에틸렌이민(PEI)의 293 T 세포에 대한 세포독성에 대한 그래프이다.

도8은 다양한 전하비율에 따른 UAC/DNA (pGL3-Control)복합체의 293 T 세포에 대한 트렌스펙션 효율을 나타내는 그래프이다.

도9는 UAC50/DNA (pEGFP N1)(전하비율 20) 복합체의 293 T 세포의 공초점 레이저 주사현미경 사진이다.

Claims

하기 화학식을 주반복단위로 포함하는 고분자 화합물:

식중, x>n이고, x는 1이상의 정수이다.
제1항의 고분자 화합물을 포함하는 유전자 전달체.
제 1항의 고분자 화합물과 DNA와의 복합체
제3항의 복합체를 유효 성분으로 포함하는 유전질환 치료제.