WO2023204300A1 - 免疫関連遺伝子の転写抑制剤 - Google Patents

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WO2023204300A1
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pipa
irf
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sequence
transcription factor
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健 石井
英雄 根岸
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国立大学法人 東京大学
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    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule

Definitions

  • the present invention relates to means for suppressing transcription of immune-related genes. More specifically, the present invention relates to pyrrole imidazole polyamide (PIPA) that can specifically bind to the binding region of IRF family transcription factors on genomic DNA and function as a competitive pseudo-transcription factor.
  • PIPA pyrrole imidazole polyamide
  • the immune system has the ability to distinguish between self and non-self structures at the molecular level, identifies pathogens that have entered the body as non-self, and activates immune responses to destroy pathogens through various mechanisms. It has the function of eliminating. In other words, an immune response specific to non-self and of appropriate strength necessary for elimination is activated, and the immune response quickly terminates after elimination of the pathogen, thereby maintaining the homeostasis of the organism.
  • the immune response does not always work beneficially for the living body, and when its control is disrupted, it can lead to the onset or exacerbation of various diseases. First, activation of the immune response is accompanied by inflammation.
  • Inflammation itself is an important response that causes the accumulation and activation of immune cells, but excessive activation destroys tissues and triggers various diseases called inflammatory diseases. Furthermore, the immune response is activated against non-self molecules, but when this discrimination is disrupted, the immune response is activated against self molecules, causing autoimmune diseases. Furthermore, when eliminating pathogens that invade cells, such as viruses, it is inevitable to eliminate the virus and cells at the same time, but if this elimination response continues for a long time without converging, it will naturally be dangerous for the organism. situation is caused.
  • Immune responses are activated when immune cells directly encounter pathogens, and various responses and cell types are activated successively, resulting in an innate immune system that is less specific but can be activated quickly.
  • cells mount a protective response, followed by activation of highly specific responses by cells of the adaptive immune system.
  • Activation of the immune response and communication between cells are mainly carried out by humoral factors called cytokines, which play an important role in controlling the activation, directionality, and suppression of the immune response. . That is, it is known that immune cells that encounter a pathogen activate distant cells by producing various cytokines, and also activate a response appropriate for the pathogen depending on the type of cytokine.
  • cytokines are further produced by immune cells, which activates the immune response more strongly, resulting in a negative chain reaction that leads to a situation called a cytokine storm in which large amounts of cytokines are released. Put it away.
  • a cytokine storm causes fatal multi-organ failure due to the activation of an excessive immune response (inflammatory response), resulting in the death of the organism.
  • Type I IFN interferon
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • Non-Patent Document 3 it is known that when this control is disrupted, it causes a detrimental response in the body, leading to autoimmune and autoinflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and type I diabetes. , is an important cytokine deeply involved in the deterioration of disease conditions during viral infection, cytokine storm, inhibition of mRNA vaccine effects, etc. (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 4, and Non-Patent Document 9).
  • cytokines including type I IFN
  • PRRs pattern recognition receptors
  • PRRs receptors that recognize pathogen components
  • intracellular signaling pathways are activated, ultimately leading to activation of transcription factors.
  • the activated transcription factor translocates to the nucleus and binds to the promoter region of the target gene, opening that region and promoting the association of basic transcription factors, which triggers the production of mRNA using DNA as a template.
  • the production of most cytokines is controlled at the transcriptional level, and after cytokine mRNA is produced within cells, it is translated into protein, which is then secreted outside the cell to exert its function.
  • Cytokine transcription is usually controlled by multiple transcription factors, and three main transcription factors are known to function downstream of pattern recognition receptors: IFN regulatory factor (IRF) family transcription factors, NF- ⁇ B, and AP-1.
  • IRF IFN regulatory factor
  • NF- ⁇ B NF- ⁇ B
  • AP-1 AP-1
  • IRF transcription factor families from IRF1 to IRF9, have been reported, and are known as transcription factors that play an important role in the transcription of type I IFN (Non-patent Document 5 and Non-Patent Document 5). Reference 6).
  • the induction of type I IFN is known to be highly dependent on IRF transcription factors, and in cells and mice lacking IRF3 and IRF7, which are one of the IRF transcription factors, induction of type I IFN is markedly increased. known to be inhibited.
  • IRF-E IRF transcription factor binding sequence
  • the IRF transcription factor specifically binds to this sequence, the expression of the type I IFN gene is inhibited. activated (Non-Patent Document 7 and Non-Patent Document 8).
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Document 5
  • IRF transcription factors could be controlled, it would be possible to treat various diseases through the control of type I IFN responses and immune responses.
  • some of the nine IRF transcription factors work in a complementary manner, and it has also been reported that important IRF transcription factors differ depending on cells and genes. Therefore, a method for specifically and effectively controlling transcriptional activity by IRF transcription factors has not yet been developed, and this is one of the important issues to be solved in the field of immunology.
  • the present invention aims to provide a new means for controlling transcription of immune-related genes. More specifically, the present invention provides pyrrole-imidazole polyamide ( The present invention aims to provide pyrrole imidazole polyamide (PIPA), a method for producing the PIPA, and a cytokine transcription inhibitor containing the PIPA.
  • PIPA pyrrole imidazole polyamide
  • PIPA is a low-molecular-weight organic compound consisting of pyrrole and imidazole isolated from antibiotics, and can target and bind to specific genomic DNA sequences. Furthermore, it has the property of easily passing through cell membranes. Therefore, if it is possible to create PIPA that binds to important sequences on promoters with a certain binding strength, it will inhibit the binding of transcription factors to the promoter region and inhibit the expression of target proteins at the transcription stage. It is possible to control.
  • IRF family transcription factors are known to bind to specific sequence regions called IRF-E (IRF-responsive element) and ISRE (IFN-stimulated response element), but the identification of these sequence regions is the main focus. It is based on the analysis results of an artificial experimental system at the cellular level. Therefore, it has not been determined which sequences are physiologically important and which sequences are suitable as drug targets.
  • the present inventors conducted intensive research to narrow down the binding sequences of IRF family transcription factors predicted from this sequence information and to design PIPA that binds to the sequences with desired binding strength and specificity. Ta. Specifically, the present inventors narrowed down the sequences predicted to be most suitable for binding of IRF family transcription factors to four, created four PIPAs that bind to each sequence, and created a PIPA that binds to each sequence. When examining the effects, it was confirmed that all PIPAs suppressed IFN- ⁇ transcription.
  • PIPA produced by the present inventors has the property of binding to a sequence that specifically binds to an IRF family transcription factor; It can be said that it has a function as a "pseudo transcription factor” that inhibits transcription and/or activation thereof.
  • the term "pseudo transcription factor” is interpreted in a broad sense, and has the property of specifically binding a specific transcription factor, and the transcription that the transcription factor performs via its binding sequence, and/or or a substance that inhibits its activation.
  • the present inventors have discovered that PIPA according to the present embodiment, which can function as a pseudo-transcription factor, suppresses or inhibits the transcription of genes that are transcriptionally activated by IRF family transcription factors, and is used as a pharmaceutical agent for suppressing excessive immune responses.
  • the present invention includes the following (1) to (38).
  • PIPA Pyrrole Imidazole Polyamide
  • IRF IFN regulatory factor
  • the binding region is a region containing 5'-GAAAGTG-3' (SEQ ID NO: 1) or a modified sequence thereof, and the modified sequence is any one of 5'-GAAAGTG-3' (SEQ ID NO: 1)
  • PIPA according to (3) above which includes a sequence in which one base is deleted or mutated, or a sequence in which one base is added at any position of 5'-GAAAGTG-3' (SEQ ID NO: 1).
  • the binding region is a region containing 5'-GAAAG-3' (SEQ ID NO: 9) or a modified sequence thereof, and the modified sequence is any one of 5'-GAAAG-3' (SEQ ID NO: 9).
  • PIPA according to (3) above which contains a sequence in which one base is deleted or mutated, or a sequence in which one base is added at any position of 5'-GAAAG-3' (SEQ ID NO: 9).
  • the binding region is a region containing 5'-GAAAA-3' (SEQ ID NO: 15) or a modified sequence thereof, and the modified sequence is any one of 5'-GAAAA-3' (SEQ ID NO: 15).
  • the binding region is a region containing 5'-GAAAC-3' (SEQ ID NO: 21) or a modified sequence thereof, and the modified sequence is either 5'-GAAAC-3' (SEQ ID NO: 21) PIPA according to (3) above, which includes a sequence in which one base is deleted or mutated, or a sequence in which one base is added at any position of 5'-GAAAC-3' (SEQ ID NO: 21).
  • PIPA according to any one of (4) to (7) above, represented by the following formula (I), (II), (III) or (IV).
  • L represents a C2-6 alkyl linker
  • R 1 and R 2 are C1-C10 alkyl groups which may have a substituent.
  • PIPA according to the above (8), represented by the following formula (Ia), (IIa), (IIIa) or (IVa).
  • composition according to (10) above, wherein the PIPA is the PIPA according to any one of (2) to (7) above.
  • the IRF family transcription factor inhibitor according to (15) above, wherein the PIPA is the PIPA according to any one of (2) to (7) above.
  • a medicament or pharmaceutical composition for suppressing an excessive immune response which contains PIPA that specifically binds to the binding region of an IRF family transcription factor as an active ingredient.
  • (21) The medicament or pharmaceutical composition according to the above (19), wherein the PIPA is the PIPA according to the above (8).
  • An adjuvant containing PIPA that specifically binds to the binding region of an IRF family transcription factor (24) The adjuvant according to (23) above, wherein the PIPA is the PIPA according to any one of (2) to (7) above. (25) The adjuvant according to (23) above, wherein the PIPA is the PIPA according to (8) above. (26) The adjuvant according to (23) above, wherein the PIPA is the PIPA according to (9) above. (27) A method for producing an IRF family transcription factor inhibitor including PIPA, comprising: The method described above, comprising the steps of providing a binding region for an IRF family transcription factor and producing PIPA that specifically binds to the binding region.
  • the PIPA cofactor is a substance that enhances the function of PIPA, and is one or more substances selected from the group consisting of hydroxychloroquine, steroids, and FK506. body.
  • the present invention provides PIPA that specifically binds to the binding region of IRF family transcription factors and suppresses their transcriptional activity.
  • PIPA according to the present invention has the effect of suppressing the expression of various target genes including cytokines and chemokines whose transcription is activated by IRF family transcription factors, such as type I IFN, IL-6, and TNF- ⁇ . Demonstrate. Therefore, the medicine containing PIPA according to the present invention as an active ingredient is effective against excessive immune responses caused by target genes of IRF family transcription factors including these cytokines and diseases caused by such excessive immune responses. Effective for prevention and treatment.
  • FIG. 1 shows the results of examining the effect of PIPA according to the present embodiment on transcription of IFN- ⁇ .
  • Raw264.7 cells, a macrophage cell line were seeded in a 96 well-plate at 2 ⁇ 10 4 cells/well and allowed to adhere by culturing for 8 hours. Then, IRF-PIPA was added to final concentrations of 1, 3, and 10 ⁇ M. After 24 hours of culture, LPS was added at a final concentration of 20 ng/mL, and the supernatant was collected after 16 hours of culture. The supernatant was diluted 2-fold with 1% BSA-PBS, and the IFN- ⁇ concentration was measured by ELISA.
  • Figure 2 shows the results of examining the effects of IRF-PIPA3 on the transcription of IFN- ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ (1).
  • Peritoneal macrophages were collected from wild-type mice, seeded in a 96 well-plate at 2.5 ⁇ 10 5 cells/well, and cultured for 2 hours. Thereafter, cells were washed twice using PBS.
  • IRF-PIPA3 was suspended in 10% FBS-RPMI or D-MEM to a final concentration of 3.10 ⁇ M and added to the wells. After culturing for 24 hours, Poly(I:C) was added to a final concentration of 1 ⁇ g/mL, and culture was performed for 16 hours.
  • FIG. 3 shows the results of examining the effects of IRF-PIPA3 on the transcription of IFN- ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ (2).
  • Peritoneal macrophages were collected from mice using PBS, seeded at 2.5 ⁇ 10 5 cells/well in a 96 well-plate, and cultured for 2 hours. Thereafter, cells were washed twice with PBS, and IRF-PIPA3 was suspended and added to 10% FBS-RPMI or D-MEM medium to a final concentration of 6 ⁇ M.
  • FIG. 4 shows the results of examining the cytotoxic activity of IRF-PIPA3.
  • dsDNA concentration left in the figure
  • LDH concentration right in the figure
  • FIG. 5 shows the results of examining the binding specificity and affinity of IRF-PIPA3 to the target sequence.
  • Octet K2 was used to analyze the binding of IRF-PIPA3 at each concentration shown in the figure to the target DNA sequence. After mixing the PIPA solution and the target DNA, binding between the two was measured for 60 seconds, and the DNA sequence was then transferred to a solution without PIPA, and dissociation between the two was measured for an additional 60 seconds.
  • FIG. 6 shows the results of examining the effects of IRF-PIPA3 on the transcription of IFN- ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ in vivo.
  • IRF-PIPA3 was administered at 400 ⁇ g/mouse into the peritoneal cavity of wild-type mice, and 3 hours later, 250 ⁇ g/mouse of Poly(I:C) was also administered into the peritoneal cavity. Two hours after Poly(I:C) administration, peritoneal macrophages were collected, and the relative expression levels of Ifnb1 , Il6 , and Tnf genes were analyzed by qRT-PCR.
  • FIG. 7 shows the results of examining the effects of IRF-PIPA3 on the expression of IFN- ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ proteins in vivo.
  • IRF-PIPA3 was administered at 400 ⁇ g/mouse into the peritoneal cavity of wild-type mice, and 24 hours later, 250 ⁇ g/mouse of Poly(I:C) was also administered into the peritoneal cavity. Blood was collected 2 hours after administration of Poly(I:C), and the protein concentrations of IFN- ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ in the plasma were measured by ELISA.
  • Figure 8 shows the results of examining the effect of IRF-PIPA3 on the transcriptional activation of IFN- ⁇ by an mRNA vaccine (mRNA vaccine for SARS-CoV-2).
  • Peritoneal macrophages were collected from wild-type mice, seeded in a 96 well-plate at 2.5 ⁇ 10 5 cells/well, and cultured for 2 hours. Thereafter, cells were washed twice using PBS. Next, IRF-PIPA3 was suspended in 10% FBS-RPMI or D-MEM to a final concentration of 3.10 ⁇ M and added to the wells. After culturing for 24 hours, mRNA vaccine was added to the final concentration of 1 ⁇ g/mL, and culture was performed for 20 hours. Thereafter, RNA was prepared from the cells and the relative expression level of Ifnb1 gene (left) was measured by qRT-PCR, or the culture supernatant was collected and the concentration of IFN- ⁇ (right) was measured by ELISA.
  • FIG. 9 shows the results of examining the effect of IRF-PIPA3 on the induction of expression of IFN- ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ proteins by mRNA vaccines (mRNA encoding ovalbumin).
  • Peritoneal macrophages were collected from wild-type mice, seeded in a 96 well-plate at 2.5 ⁇ 10 5 cells/well, and cultured for 2 hours. Thereafter, cells were washed twice using PBS.
  • IRF-PIPA3 was suspended in 10% FBS-RPMI or D-MEM to a final concentration of 6 ⁇ M, and added to the wells. After 16 hours of culture, mRNA vaccine was added to a final concentration of 0.5 ⁇ g/mL, and culture was performed for 20 to 24 hours.
  • FIG. 10 shows results showing that IRF-PIPA can improve suppression of vaccine antigen expression by double-stranded RNA.
  • IRF-PIPA3 was administered at 400 ⁇ g/mouse into the muscle (i.m.) or peritoneal cavity (i.p.) of wild-type mice, and 24 hours later, 1 ⁇ g/mouse of Moderna's mRNA vaccine for SARS-CoV-2 was administered into the muscle, and at the same time Poly (I:C) 250 ⁇ g/mouse was administered into the abdominal cavity or muscle.
  • Poly (I:C) 250 ⁇ g/mouse was administered into the abdominal cavity or muscle.
  • blood was collected from the mice, and the concentration of RBD in plasma was measured using ELISA.
  • the first embodiment is Pyrrole Imidazole Polyamide (PIPA) that specifically binds to the binding region of IRF (IFN regulatory factor) family transcription factors (hereinafter also referred to as “PIPA according to this embodiment”).
  • PIPA Pyrrole Imidazole Polyamide
  • IRF IRF regulatory factor
  • PIPA imidazole
  • PIPA invades the minor groove of double-stranded DNA and reversibly binds to each base of the DNA through hydrogen bonds.
  • Py has the ability to bind to A, T, and C residues
  • Im has the ability to bind to G residues, and by appropriately setting the sequences of Py and Im, PIPA can be designed to bind to any DNA sequence. be able to.
  • PIPA is a minor group of double-stranded DNA that adopts a hairpin loop structure so that Py/Im pairs can target CG base pairs, and Py/Py pairs can target AT or TA base pairs. Although it is common (see the specific structure of PIPA shown below), whether it is a pair of two independent PIPAs that are not connected by a hairpin loop or a ring structure, Well, appropriate structures can be designed depending on the purpose.
  • PIPA in this embodiment is a polyamide in which pyrrole and imidazole are mainly connected by amide (carboxamide) bonds, but this amide chain may have aliphatic Amino acid residues such as glycine, ⁇ -alanine, ⁇ -aminobutyric acid, R2,4-diaminobutyric acid and 5-aminovaleric acid may also be included.
  • ⁇ -aminobutyric acid can be used to preserve the hairpin loop structure
  • ⁇ -alanine can be used to optimize hydrogen bonding between adjacent amino acid moieties and the nucleotide moiety of the DNA strand. be able to.
  • the binding region of the IRF family transcription factor to which PIPA according to this embodiment binds includes sequences 1 to 4 shown below or modified sequences thereof. Sequence 1 and its modified sequences 5'-GAAAGTG-3' (SEQ ID NO: 1) or A region containing a modified sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 1, where the modified sequence is a sequence in which any one base in 5'-GAAAGTG-3 (SEQ ID NO: 1)' is deleted or mutated, or 5 A sequence in which one base is added to any part of '-GAAAGTG-3' (SEQ ID NO: 1).
  • modified sequences include 5'-NAAAGTG-3' (SEQ ID NO: 2), 5'-GNAAGTG-3' (SEQ ID NO: 3), 5'-GANAGTG-3' (SEQ ID NO: 4), 5'- GAANGTG-3' (SEQ ID NO: 5), 5'-GAAANTG-3' (SEQ ID NO: 6), 5'-GAAAGNG-3' (SEQ ID NO: 7) or 5'-GAAAGTN-3' (SEQ ID NO: 8) (but , N is A, T, G or C).
  • modified sequences examples include 5'-NAAAG-3' (SEQ ID NO: 10), 5'-GNAAG-3' (SEQ ID NO: 11), 5'-GANAG-3' (SEQ ID NO: 12), 5'- Examples include GAANG-3' (SEQ ID NO: 13) or 5'-GAAAN-3' (SEQ ID NO: 14) (where N is A, T, G or C).
  • modified sequences examples include 5'-NAAAA-3' (SEQ ID NO: 16), 5'-GNAAA-3' (SEQ ID NO: 17), 5'-GANAA-3' (SEQ ID NO: 18), 5'- Examples include GAANA-3' (SEQ ID NO: 19) or 5'-GAAAN-3' (SEQ ID NO: 20) (where N is A, T, G or C).
  • modified sequences include 5'-NAAAC-3' (SEQ ID NO: 22), 5'-GNAAC-3' (SEQ ID NO: 23), 5'-GANAC-3' (SEQ ID NO: 24), 5'- Examples include GAANC-3' (SEQ ID NO: 25) or 5'-GAAAN-3' (SEQ ID NO: 26) (where N is A, T, G or C).
  • Examples of the PIPA according to the present embodiment include compounds represented by the following formulas (I), (II), (III), or (IV).
  • L represents a C2-6 alkyl linker, which may contain, but is not particularly limited to, a ⁇ -aminobutyric acid residue, etc. .
  • R 1 and R 2 are a C1 to C10 alkyl group which may have a substituent or a C1 to C10 alkyl group which may contain an amide bond and/or an amino group, and R 1 and R 2 are bonded together.
  • a C2-6 alkyl linker may be formed.
  • amino acid residues include ⁇ -alanine, glycine, ⁇ -aminobutyric acid, and 5-aminovaleric acid.
  • PIPA according to the present embodiment can bind to its binding region with good affinity, and when expressed as a dissociation constant (Kd value), the affinity is, for example, about 500, although not particularly limited. nM or less, about 400 nM or less, about 300 nM or less, about 200 nM or less, about 100 nM or less, about 90 nM or less, about 80 nM or less, about 70 nM or less, about 60 nM or less, about 50 nM or less, about 40 nM or less, about 30 nM or less, about 20 nM or less, more preferably about 10 nM or less.
  • Kd value dissociation constant
  • the second embodiment is a PIPA that specifically binds to the binding region of an IRF family transcription factor, the use of the PIPA, or a composition containing the PIPA, for inhibiting the function of an IRF family transcription factor.
  • the third embodiment is an IRF family transcription factor inhibitor (hereinafter also referred to as "IRF transcription factor inhibitor according to this embodiment") containing PIPA that specifically binds to the binding region of an IRF family transcription factor. be.
  • the PIPA in the second and third embodiments is the PIPA according to this embodiment.
  • PIPA according to this embodiment binds specifically and with good affinity to a binding sequence (for example, an IRF-E sequence or an ISRE sequence) present in the promoter region of a target gene that is transcriptionally activated by an IRF family transcription factor. It has the function of suppressing or inhibiting transcriptional activation of target genes by IRF family transcription factors.
  • a binding sequence for example, an IRF-E sequence or an ISRE sequence
  • IRF family transcription factors genes that have binding sequences for IRF family transcription factors in their promoter regions, include type I IFN (Interferon) (IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , In addition to the 13 types of cytokine genes (including IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , etc.), various other genes are known, such as the IL-6 gene and the TNF- ⁇ gene. Therefore, the IRF transcription factor inhibitor according to this embodiment can be effectively used to suppress or inhibit the transcription of genes whose transcriptional activation is controlled by the IRF family.
  • gene refers to a base sequence or nucleic acid that encodes genetic information.
  • This nucleic acid includes polynucleotides, RNA, DNA, etc., and is not necessarily only a nucleic acid that exists in a living body, but also a nucleic acid sequence (e.g., cDNA) that codes for any protein, and is artificially synthesized. This includes those that have been. Furthermore, the origin of the gene may be derived from any biological species.
  • the fourth embodiment contains the IRF family transcription factor inhibitor according to the third embodiment or the PIPA complex according to the eleventh embodiment as an active ingredient (i.e., the PIPA or PIPA complex according to the present embodiment). as an active ingredient) or a pharmaceutical composition (hereinafter referred to as "medicine according to this embodiment” or “pharmaceutical composition according to this embodiment", or collectively as “medicine etc. according to this embodiment”) ).
  • a fourth embodiment is the use of PIPA according to this embodiment in the manufacture of a medicament or a pharmaceutical composition. PIPA exists stably in vivo without being degraded by peptidases.
  • PIPA drug delivery system
  • cytokine genes such as type I IFN, IL-6 gene and TNF- ⁇ gene.
  • the medicine and the like according to this embodiment have the effect of suppressing excessive immune responses, and can be used prophylactically or therapeutically.
  • Diseases caused by excessive immune responses include, but are not limited to, type 1 diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), Goodpasture syndrome, Graves' disease, Hashimoto's disease, multiple sclerosis, and autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases such as hemolytic anemia
  • these include viral infections such as COVID19 and influenza virus infections that induce excessive immune responses, and infections caused by pathogens such as bacteria, fungi, and protozoa. , but not limited to these.
  • the medicine according to this embodiment may be administered with the active ingredient (PIPA according to this embodiment) itself, but generally, in addition to one or more substances as the active ingredient, one or more preparations are administered. It is desirable to administer the drug in the form of a pharmaceutical composition containing additives for use. Further, the medicine and the like according to this embodiment may contain other components effective for suppressing excessive immune responses.
  • the dosage form of the medicine according to this embodiment is not particularly limited, but includes liquid preparations such as injections and drips.
  • Liquid preparations may be dissolved or suspended in water or other suitable solvents before use.
  • liquid preparations are prepared by dissolving the active ingredient in water, but if necessary, they may be dissolved in physiological saline or glucose solution, and buffers and Preservatives may be added.
  • additives for formulations can appropriately select the types of additives for formulations, the ratio of additives for formulations to the active ingredient, and the method for manufacturing the pharmaceuticals, etc. used in the manufacture of the medicines, etc. according to the present embodiment, depending on the form thereof. It is. Inorganic or organic substances, solid or liquid substances can be used as additives for formulations, and they can generally be blended in an amount between 1% and 90% by weight based on the weight of the active ingredient. .
  • examples of pharmaceutical additives include lactose, glucose, mannitol, dextrin, cyclodextrin, starch, sucrose, magnesium aluminate metasilicate, synthetic aluminum silicate, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, and calcium carboxymethylcellulose.
  • ion exchange resin methylcellulose, gelatin, gum arabic, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, light silicic anhydride, magnesium stearate, talc, tragacanth, bentonite, vegum, titanium oxide, sorbitan fatty acid ester, Examples include sodium lauryl sulfate, glycerin, fatty acid glycerin ester, purified lanolin, glycerogelatin, polysorbate, macrogol, vegetable oil, wax, liquid paraffin, white petrolatum, fluorocarbon, nonionic surfactant, propylene glycol, water, and the like.
  • the active ingredients must be mixed with hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, pH adjusters such as sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, sodium chloride, glucose, etc. It can be dissolved in distilled water for injection along with a tonicity agent, filtered aseptically, and filled into ampoules, or further added with mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin, etc. and vacuum freeze-dried to make it a ready-to-dissolve injection. good. It is also possible to add lecithin, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc. to the active ingredient and emulsify it in water to prepare an emulsion for injection.
  • the dosage, number of administrations, and administration method of the medicine, etc. according to this embodiment are not particularly limited, and include the purpose of prevention or prevention of aggravation/progression of the disease to be treated and/or treatment, the type of disease, the weight and age of the patient, etc. Depending on the conditions, the doctor can make an appropriate selection. Generally, when used as an injection, a daily dose of 0.001 to 1000 mg (active ingredient weight) may be administered continuously or intermittently to adults.
  • the medicine according to this embodiment may be prepared as a sustained-release preparation such as an implantable tablet or a delivery system encapsulated in a microcapsule using a carrier that can prevent immediate removal from the body.
  • a carrier that can prevent immediate removal from the body.
  • biodegradable, biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and polylactic acid can be used. Such materials can be readily prepared by those skilled in the art.
  • Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers.
  • Liposomes are prepared as a lipid composition containing, but not limited to, phosphatidylcholine, cholesterol, and PEG-derived phosphatidylethanol (PEG-PE) through a filter of appropriate pore size to a size suitable for use, and by reverse-phase evaporation. It can be purified by
  • the medicine and the like according to this embodiment may be provided in the form of a kit together with instructions on how to administer and the like.
  • the drugs contained in the kit are packaged in containers made of materials that effectively maintain the activity of the components of the therapeutic drug for a long period of time, do not adsorb to the inside of the container, and do not alter the properties of the components. Supplied.
  • a sealed glass ampoule may contain a buffer sealed in the presence of a neutral, non-reactive gas such as nitrogen gas.
  • the kit may also be accompanied by instructions for use. Instructions for use of the kit may be printed on paper or the like, or may be stored on an electromagnetically readable medium such as a CD-ROM or DVD-ROM and provided to the user.
  • the fifth embodiment is an adjuvant containing PIPA according to this embodiment (hereinafter also referred to as "adjuvant according to this embodiment").
  • adjuvant according to this embodiment adjuvant according to this embodiment
  • type I IFN inhibits mRNA transcription and induces mRNA degradation, reducing the efficacy of mRNA vaccines (Linares-Fernandez et al., Trends Mol Med 26:311-323 doi: 10.1016/j .molmed.2019.10.002. 2020; De Beuckelaer et al., Mol Ther. 24:2012-2020 2016.).
  • PIPA according to this embodiment suppresses or inhibits the expression of type I IFN at the transcriptional level, it is expected to enhance the efficacy of the vaccine by incorporating it into an mRNA vaccine preparation. That is, PIPA according to the present embodiment is thought to suppress the expression of type I IFN and assist or enhance the action of mRNA (antigen expression in vivo), and therefore is also used as an adju
  • the adjuvant according to this embodiment may contain, for example, about 0.01 to 99.99% by weight of PIPA according to this embodiment. Further, the adjuvant according to this embodiment may contain a component other than PIPA according to this embodiment, which does not inhibit the function of PIPA as an adjuvant. Such ingredients can include, for example, stabilizers, pH adjusters, preservatives, preservatives, buffers, and the like. Furthermore, the adjuvant according to this embodiment does not contain any component other than PIPA according to this embodiment, which is included in adjuvants of existing mRNA vaccines and is known to have immunostimulatory activity. You can leave it there. The adjuvant according to this embodiment can be used against all organisms that have an immune system.
  • the sixth embodiment is a vaccine (hereinafter also referred to as "vaccine in this embodiment") containing the adjuvant and mRNA according to this embodiment.
  • the mRNA contained in the vaccine according to the sixth embodiment is not particularly limited as long as it expresses a protein that induces an immune response, and includes, for example, viruses, bacteria, parasites, fungi, rickettsia, chlamydia, prions, and Examples include mRNA that expresses proteins derived from cancer cells, normal cells, etc.
  • the seventh embodiment is a method for preventing or treating an excessive immune response, a disease caused by an excessive immune response, and/or an infectious disease, which includes administering the medicament or the like according to this embodiment to a patient.
  • Treatment means preventing or alleviating the progression and deterioration of the pathological condition caused in a mammal that has developed the disease to be treated.
  • prevention means preventing the onset of the disease in advance in mammals that are likely to develop the disease to be prevented.
  • the term "mammal” that is the target of prevention or treatment refers to any animal classified as a mammal, including, but not limited to, humans, dogs, cats, rabbits, ferrets, mice, hamsters, etc. This includes pet animals and domestic animals such as cows, pigs, sheep, and horses. A particularly preferred "mammal” is a human.
  • the eighth embodiment is a method for producing an IRF family transcription factor inhibitor including PIPA, comprising:
  • This method includes the steps of providing a binding region for an IRF family transcription factor, and producing PIPA that specifically binds to the binding region.
  • the step of creating PIPA that specifically binds to the binding region of IRF family transcription factors involves designing a pyrrole and/or imidazole polymer selected to correspond to the nucleotide sequence present in the binding region.
  • the process involves designing a polymer in which aliphatic amino acid residues such as ⁇ -alanine and ⁇ -aminobutyric acid are inserted into a pyrrole and/or imidazole polymer, as necessary, and actually synthesizing the polymer. You can leave it there.
  • the ninth embodiment is a PIPA that specifically binds to a binding region of an IRF family transcription factor for use as a pseudo transcription factor, or a PIPA that specifically binds to a binding region of an IRF family transcription factor for use as a pseudo transcription factor.
  • a composition comprising specifically binding PIPA.
  • PIPA according to this embodiment has the property of binding to the genomic DNA sequence to which the IRF family transcription factor specifically binds, and is capable of inducing transcription performed by the IRF family transcription factor via its binding sequence, and /or its activation can be inhibited.
  • PIPA according to the present embodiment functions as a substance that inhibits transcription and/or activation of IRF family transcription factors via their binding sequences, that is, a "pseudo transcription factor.” Therefore, PIPA according to this embodiment can also be used as a pseudo transcription factor. For PIPA, see the description in other embodiments.
  • the tenth embodiment is a method of using PIPA as a pseudo-transcription factor in a subject, comprising the step of applying to the subject an effective amount of PIPA that specifically binds to the binding region of an IRF family transcription factor. Said method.
  • the term "subject” refers to any animal classified as a mammal, including, but not limited to, humans, pet animals such as dogs, cats, rabbits, ferrets, mice, and hamsters, and cows. , domestic animals such as pigs, sheep, and horses. A particularly preferred "mammal” is a human. For PIPA, see the description in other embodiments.
  • the eleventh embodiment is a conjugate (hereinafter referred to as "a conjugate") comprising PIPA according to this embodiment (that is, PIPA that specifically binds to the binding region of an IRF family transcription factor) and a PIPA cofactor (hereinafter referred to as “a conjugate according to this embodiment”).
  • PIPA complex PIPA cofactor
  • the "PIPA cofactor” in this embodiment is a substance different from PIPA, and is a substance that enhances the function of PIPA according to this embodiment.
  • PIPA according to this embodiment has the function of suppressing excessive immune responses by suppressing the expression of genes whose transcription is activated by IRF family transcription factors. Therefore, the "PIPA cofactor” in this embodiment includes a substance that enhances the function of PIPA (eg, immune response suppressing function).
  • the "PIPA cofactor" in this embodiment includes substances that assist the action of PIPA, such as substances that improve the stability of PIPA in vivo, and substances that enhance the transport of PIPA to target organs or target cells. , substances that enhance the introduction of PIPA into cells, but are not limited to these.
  • any substance can be used as the PIPA cofactor in this embodiment as long as it does not bind to PIPA and inhibit intracellular delivery of PIPA.
  • a PIPA cofactor is preferably one with a low molecular weight (about 500 to about 2,000), and preferably has a molecular weight of a size that does not affect the efficiency of PIPA introduction into cells, for example, about 500 to about 1,000. preferable.
  • Such a PIPA cofactor forms a complex with the PIPA of this embodiment, thereby enhancing the function of the PIPA and/or assisting the action of the PIPA. Therefore, the PIPA cofactor according to the present embodiment exerts a preventive effect and/or a therapeutic effect against, for example, a disease or infectious disease caused by an excessive immune response.
  • Substances that enhance the function of PIPA include, but are not particularly limited to, immunosuppressive substances such as hydroxychloroquine and FK506, anti-inflammatory substances such as various steroids, and the like. Further, substances that assist the action of PIPA in this embodiment include, for example, vitamins (eg, vitamin E, vitamin A), lipids such as cholesterol, anisamide, and the like.
  • PIPA and the PIPA cofactor according to this embodiment may be directly bound to form a complex, or may be linked via a linker.
  • any linker can be used as long as it can exhibit the function of the PIPA complex according to the present embodiment, for example, the function as a drug delivery system (DDS).
  • DDS drug delivery system
  • Examples include, but are not limited to, alkyl linkers having 1 to 6 carbon atoms (C1 to C6).
  • the linker may contain a functional group for binding the PIPA and PIPA cofactor according to the present embodiment, such as a maleimide group, a thiol group, an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an azide group, etc. .
  • the site of PIPA to which the PIPA cofactor is bound is not particularly limited, but includes, for example, the terminal portion of PIPA (for example, R 1 or R 2 in formulas (I), (II), and (III)), etc. It may be.
  • Cells Cell line Raw264.7 cells were purchased from RIKEN Cell Bank and cultured using D-MEM (Nacalai Tesque) containing 10% FBS (SIGMA-ALDRICH) and Penicillin-Streptomycin mixed solution (Nacalai Tesque).
  • D-MEM Nacalai Tesque
  • FBS FBS
  • Penicillin-Streptomycin mixed solution Nacalai Tesque
  • Mouse peritoneal macrophages were collected from 6-week-old CL57B/6 mice (CLEA Japan) by peritoneal lavage using 7 mL of PBS (Nacalai Tesque), and after 2 hours of culture, the cells that adhered to the culture plate were used in experiments. Using.
  • cytokine concentration 2 ⁇ 104 Raw264.7 cells were seeded on plates, treated with IRF-PIPA1, IRF-PIPA2, IRF-PIPA3, or IRF-PIPA4 for 24 hours, and then treated with LPS (Lipopolysaccharide, SIGMA-ALDRICH). After stimulation for 16 hours, the culture supernatant was collected. Cytokine concentrations in the culture supernatant were measured using an ELISA kit (R&D SYSTEMS) according to standard protocols. Culture supernatants were diluted with 1% BSA-PBS as needed and analyzed.
  • Mouse peritoneal macrophages were plated at 2.5 ⁇ 10 cells , treated with IRF-PIPA3 for 16 or 24 hours, treated with Poly(I:C) (InvivoGen) for 16 hours, or with mRNA vaccine (Moderna) for 20-20 hours. After stimulation for 24 hours, the culture supernatant was collected. Cytokine concentrations in the culture supernatant were measured using an ELISA kit (R&D SYSTEMS), also following standard protocols.
  • the cytokine concentration in mouse plasma was determined by administering 400 ⁇ g/mouse of IRF-PIPA3 into the peritoneal cavity of wild-type mice, followed by administering 250 ⁇ g of Poly(I:C) 24 hours later into the peritoneal cavity, and then collecting blood 2 hours later. Then, the cytokine concentration in the plasma was measured using an ELISA kit (R&D SYSTEMS) according to a standard protocol.
  • RNA samples 2.5 ⁇ 10 5 peritoneal macrophages were plated, treated with IRF-PIPA3 for 24 hours, stimulated with Poly(I:C) (InvivoGen) for 2, 4, 6 hours, or with mRNA vaccine. Cells were collected 20 hours after stimulation with (Moderna), and RNA was extracted using TRIsure (Japan Genetics Co., Ltd.) and an RNA extraction kit (ZYMO RESEARCH) according to standard protocols. cDNA was created from the extracted RNA using 5 ⁇ PrimeScrip tRT Master Mix (Takara Bio Inc.), and qPCR was performed using Sybr green (BioLabs) and primers specific to each gene (FASMAC Inc.). .
  • Light Cycler 480 (Roche, Switzerland) was used for qPCR.
  • the primer sequences used were general sequences used in past literature (Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Nov 19;116(47):23653-23661. doi: 10.1073/pnas.1915326116).
  • 5'-GAAAGTG-3' SEQ ID NO: 1
  • 5'-GAAAG-3' SEQ ID NO: 9
  • 5'-GAAAA-3' SEQ ID NO: 15
  • 5'-GAAAC-3' SEQ ID NO: 21
  • PIPA represented by (Ia), formula (IIa), formula (IIIa), and formula (IVa) are also referred to as IRF-PIPA3, IRF-PIPA1, IRF-PIPA2, and IRF-PIPA4, respectively. Describe it.
  • IRF-PIPA1-4 After pre-treating macrophage cell line Raw264.7 cells with IRF-PIPA1-4, they were further stimulated with pathogen components that induce IFN- ⁇ production, and the concentration of IFN- ⁇ in the culture supernatant was measured by ELISA. The inhibitory effect of PIPA on IFN- ⁇ production was confirmed in all of PIPA1-4 (FIG. 1). Concentration dependence was not observed for IRF-PIPA1, IRF-PIPA2, and IRF-PIPA4, but concentration-dependent inhibition was confirmed for IRF-PIPA3, and the inhibitory effect was the strongest among the four PIPAs. . That is, since IRF-PIPA3 is the strongest and is thought to suppress IFN- ⁇ production through the assumed transcriptional inhibition mechanism, IRF-PIPA3 was used for verification in the following experiments.
  • IRF-PIPA3 broadly suppresses responses dependent on IRF transcription factors.
  • the target mRNA is expressed as a relative value to the mRNA expression level of a gene that does not normally fluctuate (in this example, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: GAPDH). Since the expression level of the target gene is calculated, the mRNA level of the target gene can be verified without being affected by cell death. Therefore, although the mRNA analysis results shown in Figure 3 strongly indicate that IRF-PIPA3 has suppressive ability, it is not possible to evaluate whether cell death occurs in addition to the suppressive effect.
  • GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • IRF-PIPA3 was administered into the peritoneal cavity of the mouse in advance, and 3 hours later, poly(I:C) as a pathogen component was also administered into the peritoneal cavity of the mouse. Two hours after the administration of poly(I:C), peritoneal macrophages were collected from the mice, and the relative expression levels of mRNA were analyzed using qRT-PCR ( Figure 6). The results showed that IRF-PIPA3 significantly suppressed the expression levels of Ifnb1 , Il6 and Tnf mRNA, consistent with the in vitro results. This result showed that IRF-PIPA3 has an inhibitory effect in vivo, at least locally.
  • IRF-PIPA3 was administered into the peritoneal cavity of the mouse in advance, and 24 hours, 1 day, 4 days, or 7 days later, poly(I:C) was also administered as a pathogen component into the peritoneal cavity of the mouse.
  • poly(I:C) was also administered as a pathogen component into the peritoneal cavity of the mouse.
  • FIG. 7A 24 hours after IRF-PIPA3 administration
  • FIG. 7B (1 day, 4 days, or 7 days after IRF-PIPA3 administration).
  • IRF-PIPA3 significantly suppressed the expression of IFN- ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ proteins.
  • the suppressive effect was highest 1 day after IRF-PIPA3 administration, and although the effect weakened thereafter, the effect persisted until 7 days after administration.
  • IRF-PIPA3 Verification of the effect of IRF-PIPA3 on the immune response caused by mRNA vaccines As mentioned above, it has been reported that type I IFN inhibits mRNA transcription and induces mRNA degradation, reducing the effectiveness of mRNA vaccines. Therefore, we verified whether IFR-PIPA3 could suppress the transcription of IFN- ⁇ after administration of Moderna's mRNA vaccine for SARS-CoV-2. Peritoneal macrophages were previously treated with IRF-PIPA3 (3 ⁇ M or 10 ⁇ M), then treated with mRNA vaccine (Moderna), and cultured for 20 hours.
  • double-stranded RNA is generated as a contaminant during the production process of LNP-mRNA (Linares-Fernandez et al., 2020 Mar Trends Mol Med 26:311-323 doi: 10.1016/j.molmed.2019.10 .002.). Since double-stranded RNA induces the expression of type I IFN, it is thought that it may reduce the effectiveness of vaccines. Therefore, we investigated whether PIPA could improve the decrease in effectiveness of mRNA vaccines due to the contamination of double-stranded RNA as a contaminant. IRF-PIPA3 was administered at 400 ⁇ g/mouse into the muscle (im) or peritoneal cavity (ip) of wild-type mice.
  • IRF-PIPA3 suppresses the transcription of IFN- ⁇ after mRNA vaccine administration, and suggest that IRF-PIPA3 has a function as an adjuvant that supports or enhances the efficacy of mRNA vaccines. are doing.
  • the present invention provides PIPA that suppresses the expression of cytokines (eg, type I IFN, IL-6, TNF- ⁇ , etc.) essential for activation of immune responses at the transcriptional stage. Therefore, the present invention is expected to find use in the pharmaceutical and medical fields.
  • cytokines eg, type I IFN, IL-6, TNF- ⁇ , etc.

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Abstract

本発明は、免疫応答の活性化に必須のサイトカイン、特にI型IFNの発現を転写の段階で抑制するピロールイミダゾールポリアミド（pyrrole imidazole polyamide；PIPA）の提供を課題とする。より具体的には、本発明は、IRF（IFN regulatory factor）ファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAである。具体的には、5'-GAAAGTG-3（配列番号１）もしくはその改変配列、5'-GAAAG-3' （配列番号９）もしくはその改変配列、5'-GAAAA-3' （配列番号１５）もしくはその改変配列、または5'-GAAAC-3' （配列番号２１）もしくはその改変配列に結合するPIPAである。

Description

免疫関連遺伝子の転写抑制剤
　本発明は、免疫関連遺伝子の転写を抑制するための手段に関する。より具体的には、本発明は、ゲノムDNA上のIRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合し、競合的な疑似転写因子として機能し得るピロールイミダゾールポリアミド（pyrrole imidazole polyamide；PIPA）に関する。
　免疫系は自己の構造と非自己の構造を分子レベルで識別する能力を有しており、体内に侵入した病原体を非自己として識別し、免疫応答を活性化することで様々な機構で病原体を排除する働きを有する。すなわち、非自己に対して特異的かつ、排除に必要な適切な強さの免疫応答が活性化され、病原体の排除後に速やかに免疫応答が終息することで生体の恒常性が維持されている。しかしながら、免疫応答が生体に常に有益に働くわけではなく、その制御が破綻した場合、様々な疾患の発症や増悪につながることも知られている。まず、免疫応答の活性化は炎症を伴う。炎症自体が免疫細胞の集積や活性化を引き起こす重要な応答であるが、過剰に活性化すれば組織を破壊し、炎症性疾患と呼ばれる様々な疾患の引き金になる。また、免疫応答は非自己に対して活性化されるが、この識別が破綻すると自己分子に向かって免疫応答が活性化してしまい、自己免疫疾患が引き起こされる。さらに、ウイルスのように細胞内に侵入する病原体を排除する場合は必然的にウイルスと細胞を同時に排除することになるが、このような排除応答が収束せずに長引けば、当然、生体にとって危機的な状況が引き起こされる。また、疾患以外の場面において、例えばmRNAワクチンの場合、mRNAワクチンが抗ウイルス応答を活性化し過ぎると、mRNAワクチン自体が免疫系に排除されてしまい、ワクチン効果を発揮できない。このように免疫応答には様々な不利益な側面があるため、その応答を適切なレベルに制御することができれば、多様な疾患の治療や予防、mRNAワクチン効果の増強などが可能になると考えられる。
　免疫応答は免疫細胞が病原体に直接遭遇することをきっかけとして活性化し、さらに様々な応答、細胞種が連続的に活性化することで、まず特異性が低い代わりに迅速に活性化できる自然免疫系の細胞が防御応答を行い、それに続いて適応免疫系の細胞による特異性の高い応答が活性化される。このような免疫応答の活性化や細胞間のコミュニケーションは主にサイトカインと呼ばれる液性因子によって担われており、免疫応答の活性化、方向性の決定、抑制などの制御に重要な役割を果たしている。すなわち、病原体に遭遇した免疫細胞は様々なサイトカインを産生することで、離れた細胞を活性するとともに、サイトカインの種類によって、病原体に適した応答を活性化することが知られている。そのため、サイトカインは病原体の排除が成功すると産生が減弱し、それに伴って免疫応答も終息する。一方で、病原体が排除しきれない場合はさらに免疫細胞によりサイトカインが産生され、より強く免疫応答が活性化するという一連の負の連鎖により、大量のサイトカインが放出されるサイトカインストームという状況に陥ってしまう。SARS-CoV-2でも知られるように、サイトカインストームは、過剰な免疫応答(炎症応答)の活性化により致死的な多臓器不全を引き起こし、生体を死に至らしめる。
　様々なサイトカインが免疫応答の制御に関わっているが、中でも、I型IFN（interferon）は、病原体成分の認識やウイルス感染によって誘導され、免疫応答の活性化に必須の役割を果たしている（非特許文献１）。I型IFNは、IFN-β、IFN-ε、 IFN-κ、IFN-ωに加えて、IFN-αなどを含む13のサブタイプからなるが、いずれも細胞に抗ウイルス状態を引き起こす作用を有しており、細胞レベルでのウイルスの増殖抑制に必須の役割を果たしている（非特許文献１および非特許文献２）。さらに様々な免疫細胞を活性化する作用があり、B細胞からの抗体産生の促進、T細胞への分化誘導、樹状細胞の成熟化など、多様な働きによって、免疫応答全体を活性化することで、生体防御に重要な役割を果たしている（非特許文献３）。一方で、上述の通り、その制御が破綻した場合には生体に不利益な応答を引き起こすことも知られており、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病などの自己免疫疾患や自己炎症性疾患、ウイルス感染時の病態悪化、サイトカインストーム、mRNAワクチン効果の阻害などに深く関わる重要なサイトカインである（非特許文献１、非特許文献４および非特許文献９）。
　I型IFNをはじめとしたサイトカインの産生は病原体や病原体成分に直接暴露された細胞が、パターン認識受容体（PRR）と呼ばれる受容体によって病原体成分を認識することで引き起こされる。パターン認識受容体が病原体成分を認識すると、細胞内のシグナル伝達経路が活性化し、最終的に転写因子の活性化が引き起こされる。活性化した転写因子は核へ移行し、標的遺伝子のプロモーター領域に結合することで、その領域を開放し、基本転写因子の会合を促すことで、DNAを鋳型としたmRNAの産生が引き起こされる。ほとんどのサイトカインの産生は転写レベルで制御されており、細胞内でサイトカインのmRNAが産生された後、タンパク質に翻訳され、さらに細胞外へと分泌されることでその機能が発揮される。サイトカインの転写は通常複数の転写因子によって制御され、パターン認識受容体の下流ではIFN regulatory factor (IRF)ファミリー転写因子、NF-κB、AP-1の3つが主な転写因子として機能することが知られている（非特許文献１および非特許文献５）。いずれもパターン認識受容体下流シグナルの活性化によって制御されており、活性化後に核に移行するが、遺伝子の種類によってそれぞれの転写因子への依存度が異なることが知られている。
　中でもIRF転写因子はIRF1からIRF9まで、9個の転写因子ファミリーが報告されているが、特にI型IFNの転写に重要な役割を果たす転写因子として知られている（非特許文献５および非特許文献６）。すなわち、I型IFNの誘導はIRF転写因子に非常に強く依存することが知られており、IRF転写因子の一つであるIRF3やIRF7を欠損した細胞やマウスではI型IFNの誘導が顕著に阻害されることが分かっている。I型IFN遺伝子のプロモーター領域にはいずれもIRF転写因子の結合配列(IRF-E)が存在しており、この配列に特異的にIRF転写因子が結合することで、I型IFN遺伝子の発現が活性化される（非特許文献７および非特許文献８）。
　さらに近年の報告によって、IRF転写因子の結合配列がIL-6やTNF-αといった他のサイトカインのプロモーター領域に存在することも明らかとなり、I型IFNのみならず様々なサイトカインの制御に重要な転写因子であることが解明されている（非特許文献５）。このようなIRF転写因子を制御することができれば、I型IFN応答や免疫応答の制御を介して、様々な疾患の治療が可能になると考えられる。しかしながら、9個あるIRF転写因子のうち、いくつかのIRF転写因子が相補的に働くことが知られており、さらに細胞や遺伝子ごとに重要なIRF転写因子が異なることも報告されている。そのため、IRF転写因子による転写活性を特異的かつ有効に制御する方法はまだ開発されておらず、免疫分野における重要な解決するべき課題の１つとなっている。
Fernandez-RuizおよびNiewold, J Invest Dermatol, doi:10.1016/j.jid.2021.11.031 (2022). Gibbertら, Br J Pharmacol 168, 1048-1058, doi:10.1111/bph.12010 (2013). Ivashkivら, Nat Rev Immunol 14, 36-49, doi:10.1038/nri3581 (2014). Jefferies, Front Immunol 10, 325, doi:10.3389/fimmu.2019.00325 (2019). Negishiら, Cold Spring Harb Perspect Biol. 10(11):a028423. (2018). Tamura ら, Annu Rev Immunol. 26:535-84. (2008) BragancaおよびCivas, Biochimie 80, 673-687, doi:10.1016/s0300-9084(99)80021-2 (1998). Hondaら, Int Immunol 17, 1367-1378, doi:10.1093/intimm/dxh318 (2005). Beuckelaerら, Mol Ther. 24(11): 2012-2020. (2016)
　上記事情に鑑み、本発明は、免疫関連遺伝子の転写を制御するための新たな手段の提供を課題とする。より具体的には、本発明は、ゲノムDNA上のIRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合する競合的な疑似転写因子として機能し、IRFファミリー転写因子の転写を抑制するピロールイミダゾールポリアミド（pyrrole imidazole polyamide；PIPA）の提供、当該PIPAの製造方法の提供および当該PIPAを含有するサイトカインの転写抑制剤の提供を課題とする。
　発明者らは、IRF転写因子が結合するゲノムDNAの配列に着目し、I型IFNの転写を抑制する手段としてPIPAを用いることを検討した。PIPAは抗生物質から単離されたピロールとイミダゾールからなる低分子有機化合物であり、特異的なゲノムDNA配列を標的として結合することができる。さらに、細胞膜を容易に通過する性質を有している。そのため、プロモーター上の重要な配列に対して、一定の結合力を持って結合するPIPAを作製することができれば、プロモーター領域への転写因子の結合を阻害し、標的タンパクの発現を転写の段階で制御することが可能である。任意のDNA配列に対して設計できるため、理論上はあらゆる遺伝子の発現を制御することが可能であり、また、これまでのsiRNAやアンチセンス核酸などの遺伝子制御の方法とくらべて、細胞導入効率が非常に高い。しかしながら、転写因子の結合に重要な配列を特定すること、およびPIPAの設計（例えば、ピロールとイミダゾールとの間隔の調整など）には高い専門的な知識等が必要であり、仮に結合配列が特定できたとしても、所望の結合力および特異性を有するPIPAを設計することは容易なことではない。現に、これまでに、I型IFN応答を含め、初期の免疫応答の活性化を効果的に制御できるPIPAは開発されていない。IRFファミリー転写因子は、IRF-E（IRF-responsive element）やISRE（IFN-stimulated response element）と称される特定の配列領域に結合することが知られているが、その配列領域の特定は主に細胞レベルの人工的な実験系の解析結果に基づいている。そのためそれらの中で、いかなる配列が生理的に重要であるか、薬剤標的としての適切な配列がいずれの配列であるか、までは絞り込まれていなかった。
　そこで、本発明者らは、これらの配列情報から予測されるIRFファミリー転写因子の結合配列の絞りこみ、およびその配列に所望の結合力および特異性で結合するPIPAの設計に関し、鋭意研究を行った。具体的には、本発明者らは、IRFファミリー転写因子の結合に最も適すると予想される配列を4つに絞り込み、各々の配列に結合する4つのPIPAを作製し、IFN-βの転写に対する影響を調べたところ、いずれのPIPAもIFN-βの転写を抑制することが確認された。
　上記事実を別の局面から捉えると、本発明者らによって作製されたPIPAは、IRFファミリー転写因子が特異的に結合する配列に結合する性質を有しており、IRFファミリー転写因子がその結合配列を介して行う転写、および／またはその活性化を阻害する、「疑似転写因子」としての機能を有していると言える。ここで、本明細書中において、「疑似転写因子」とは、広義に解釈され、特定の転写因子が特異的に結合する性質を持ち、転写因子がその結合配列を介して行う転写、および／またはその活性化を阻害する物質として定義される。
　本発明者らは、疑似転写因子として機能し得る本実施形態にかかるPIPAが、IRFファミリー転写因子によって転写活性化される遺伝子の転写を抑制または阻害し、過剰な免疫応答を抑制するための医薬およびmRNAワクチンのアジュバント等として使用できることを初めて明らかにし、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（３８）である。
（１）IRF（IFN regulatory factor）ファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミド（Pyrrole Imidazole Polyamide；PIPA）。
（２）疑似転写因子として機能する、上記（１）に記載のPIPA。
（３）前記結合領域に対して解離定数（Kd値）として約500 nM以下の結合親和性を有する、上記（１）に記載のPIPA。
（４）前記結合領域が、5’-GAAAGTG-3’（配列番号１）またはその改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAGTG-3’（配列番号１）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAGTG-3’ （配列番号１）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列を含む、上記（３）に記載のPIPA。
（５）前記結合領域が、5’-GAAAG-3’ （配列番号９）またはその改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAG-3’ （配列番号９）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAG-3’ （配列番号９）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列を含む、上記（３）に記載のPIPA。
（６）前記結合領域が、5’-GAAAA-3’ （配列番号１５）またはその改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAA-3’ （配列番号１５）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAA-3’ （配列番号１５）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列を含む、上記（３）に記載のPIPA。
（７）前記結合領域が、5’-GAAAC-3’ （配列番号２１）またはその改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAC-3’ （配列番号２１）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAC-3’ （配列番号２１）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列を含む、上記（３）に記載のPIPA。
（８）以下の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表される上記（４）から（７）までのいずれかに記載のPIPA。
（式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）中、LはC2～6のアルキルリンカーを表し、R1およびR2は置換基を有してもよいC1～C10のアルキル基もしくはC1～C10のアミド結合および／またはアミノ基を含んでもよいアルキル基であり、R1およびR2が結合してC2～6のアルキルリンカーを形成してもよく、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7およびX8は、同一もしくは独立して、結合もしくは脂肪族アミノ酸残基を表す）
（９）以下の式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）または（ＩＶａ）で表される上記（８）に記載のPIPA。
（１０）IRFファミリー転写因子の機能を阻害するための、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含む組成物。
（１１）前記PIPAが、上記（２）から（７）までのいずれかに記載のPIPAである、上記（１０）に記載の組成物。
（１２）前記PIPAが、上記（８）に記載のPIPAである、上記（１０）に記載の組成物。
（１３）前記PIPAが、上記（９）に記載のPIPAである、上記（１０）に記載の組成物。
（１４）疑似転写因子として使用するための、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含む組成物。
（１５）IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含む、IRFファミリー転写因子阻害剤。
（１６）前記PIPAが、上記（２）から（７）までのいずれかに記載のPIPAである、上記（１５）に記載のIRFファミリー転写因子阻害剤。
（１７）前記PIPAが、上記（８）に記載のPIPAである、上記（１５）に記載のIRFファミリー転写因子阻害剤。
（１８）前記PIPAが、上記（９）に記載のPIPAである、上記（１５）に記載のIRFファミリー転写因子阻害剤。
（１９）IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを有効成分として含む、過剰な免疫応答を抑制するための医薬または医薬組成物。
（２０）前記PIPAが、上記（２）から（７）までのいずれかに記載のPIPAである、上記（１９）に記載の医薬または医薬組成物。
（２１）前記PIPAが、上記（８）に記載のPIPAである、上記（１９）に記載の医薬または医薬組成物。
（２２）前記PIPAが、上記（９）に記載のPIPAである、上記（１９）に記載の医薬または医薬組成物。
（２３）IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含む、アジュバント。
（２４）前記PIPAが、上記（２）から（７）までのいずれかに記載のPIPAである、上記（２３）に記載のアジュバント。
（２５）前記PIPAが、上記（８）に記載のPIPAである、上記（２３）に記載のアジュバント。
（２６）前記PIPAが、上記（９）に記載のPIPAである、上記（２３）に記載のアジュバント。
（２７）PIPAを含むIRFファミリー転写因子阻害剤の製造方法であって、
IRFファミリー転写因子の結合領域を提供する工程および前記結合領域に特異的に結合するPIPAを作製する工程を含む、前記方法。
（２８）IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAとPIPA補助因子を含む複合体であって、当該PIPA補助因子は当該PIPAとは異なる物質であり、当該PIPA補助因子は当該PIPAの機能を増強する、および／またはPIPAの作用を補助することを特徴とする、前記複合体。
（２９）前記PIPAと前記PIPA補助因子とがC1～C6のリンカーで連結されている、上記（２８）に記載の複合体。
（３０）前記PIPA補助因子が、前記PIPAの機能を増強する物質であって、ヒドロキシクロロキン、ステロイド、FK506からなるグループから選択される１または複数の物質である、上記（２８）に記載の複合体。
（３１）前記PIPA補助因子が、前記PIPAの作用を補助する物質であって、ビタミン、コレステロール、アニサミドからなるグループから選択される１または複数の物質である、上記（２８）に記載の複合体。
（３２）前記PIPAが、上記（２）から（７）までのいずれかに記載のPIPAである、上記（２８）から（３１）までのいずれかに記載の複合体。
（３３）前記PIPAが、上記（８）に記載のPIPAである、上記（２８）から（３１）までのいずれかに記載の複合体。
（３４）前記PIPAが、上記（９）に記載のPIPAである、上記（２８）から（３１）までのいずれかに記載の複合体。
（３５）疑似転写因子として機能する、上記（２８）から（３１）までのいずれかに記載の複合体。
（３６）疑似転写因子として機能する、上記（３２）に記載の複合体。
（３７）疑似転写因子として機能する、上記（３３）に記載の複合体。
（３８）疑似転写因子として機能する、上記（３４）に記載の複合体。
　なお、本明細書において「～」の符号は、その左右の値を含む数値範囲を示す。
　本発明により、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合し、その転写活性を抑制するPIPAが提供される。本発明にかかるPIPAは、IRFファミリー転写因子が転写を活性化するサイトカイン、ケモカインをはじめとした様々な標的遺伝子、例えば、I型IFN、IL-6およびTNF-αなどの発現を抑制する作用を発揮する。従って、本発明にかかるPIPAを有効成分として含有する医薬等は、これらのサイトカインをはじめとしたIRFファミリー転写因子の標的遺伝子によって生じる過剰な免疫応答および当該過剰な免疫応答によって惹起される疾患等の予防および治療に効果を発揮する。
図１は、本実施形態にかかるPIPAがIFN-βの転写に対し及ぼす影響の検討結果を示す。マクロファージ系細胞株であるRaw264.7細胞を96 well-plateに2×104 cells/wellで播種し、8時間の培養で付着させた。その後、最終濃度が1、3、10μMになるようにIRF-PIPAを添加した。24時間の培養後、最終濃度20ng/mLのLPSを添加し、16時間の培養後に上清を回収した。上清を1％BSA-PBSで2倍希釈し、ELISAでIFN-β濃度を測定した。 図２は、IRF-PIPA3がIFN-β、IL-6およびTNF-αの転写に対し及ぼす影響の検討結果を示す（１）。野生型マウスから腹腔マクロファージを採取し、96 well-plateに2.5×105 細胞/wellで播種し、2時間の培養を行った。その後、PBSを用いて2回の細胞洗浄を行った。次に、IRF-PIPA3を10％FBS-RPMIまたはD-MEMに最終濃度が3、10μMになるように懸濁し、ウェルに添加した。24時間の培養後、Poly(I:C)を最終濃度1μg/mLになるように加え、16時間培養を行った。その後、上清を回収し、ELISAでIFN-β、IL-6、TNF-αの濃度の測定をした。 図３は、IRF-PIPA3がIFN-β、IL-6およびTNF-αの転写に対し及ぼす影響の検討結果を示す（２）。PBSを用いて、マウスから腹腔マクロファージを採取し、96 well-plateに2.5×105 細胞/well播種し、2時間の培養を行った。その後、PBSを用いて細胞洗浄を2回行い、最終濃度が6μMになるようにIRF-PIPA3を10％FBS-RPMIまたはD-MEM培地に懸濁し添加した。24時間の培養後、最終濃度1μg/mLになるようにPoly(I:C)を添加した。2、4、6時間培養を行なった後、細胞を回収し、TRIsureを用いて100μL/well懸濁、回収し、qRT-PCRによってIfnb1、Il6、Tnf遺伝子の相対発現量を測定した。 図４は、IRF-PIPA3による細胞障害活性の検討結果を示す。IRF-PIPA3の細胞障害活性の検証のため、培養上清中のdsDNA濃度（図中左）およびLDH 濃度（図中右） を測定した。図２と同様の実験を行い、培養上清を回収した。ポジティブコントロールは、2.5×105個の腹腔マクロファージに10％FBS-RPMIまたはD-MEM培地90μLとLysis Buffer 10μLを混合させ、細胞を破壊したライゼートを用いた。 図５は、IRF-PIPA3の標的配列に対する結合の特異性および親和性の検討結果を示す。Octet K2を使用し、図に示した各濃度IRF-PIPA3と標的DNA配列との結合を解析した。PIPA溶液と標的DNAを混合した後、両者の結合を60秒間測定し、さらにDNA配列を、PIPAを含まない溶液に移し、両者の解離をさらに60秒間測定した。各濃度の結合と解離の経時変化から、結合力を示す解離定数としてKD値を算出した。 図６は、インビボにおいてIRF-PIPA3がIFN-β、IL-6およびTNF-αの転写に対し及ぼす影響の検討結果を示す。野生型マウスの腹腔にIRF-PIPA3を400μg/mouse投与し、3時間後にPoly(I:C) 250μg/mouseを同じく腹腔に投与した。Poly(I:C)投与から2時間後に腹腔マクロファージを回収し、qRT-PCRによってIfnb1、Il6、Tnf遺伝子の相対発現量を解析した。 図７は、インビボにおいてIRF-PIPA3がIFN-β、IL-6およびTNF-αの各タンパク質発現に対し及ぼす影響の検討結果を示す。野生型マウスの腹腔にIRF-PIPA3を400μg/mouse投与し、24時間後にPoly(I:C) 250μg/mouseを同じく腹腔に投与した。Poly(I:C)投与から2時間後に血液を採取し、その血漿中のIFN-β、IL-6およびTNF-αの各タンパク質濃度をELISA法で測定した。 図８は、mRNAワクチン（SARS-CoV-2用mRNAワクチン）によるIFN-βの転写活性化に対して、IRF-PIPA3が及ぼす影響を検討した結果を示す。野生型マウスから腹腔マクロファージを採取し、96 well-plateに2.5×105 cells/wellで播種し、2時間の培養を行った。その後、PBSを用いて2回の細胞洗浄を行った。次に、IRF-PIPA3を10％FBS-RPMIまたはD-MEMに最終濃度が3、10μMになるように懸濁し、wellに添加した。24時間の培養後、mRNAワクチンを最終濃度1μg/mLになるように加え、20時間培養を行った。その後、細胞からRNAを調製しqRT-PCRで Ifnb1遺伝子の相対的発現量（左）を、または培養上清を回収し、ELISAでIFN-βの濃度（右）を測定した。 図９は、mRNAワクチン（オボアルブミンをコードするmRNA）によるIFN-β、IL-6およびTNF-αの各タンパク質の発現誘導に対して、IRF-PIPA3が及ぼす影響を検討した結果を示す。野生型マウスから腹腔マクロファージを採取し、96 well-plateに2.5×105 cells/wellで播種し、2時間の培養を行った。その後、PBSを用いて2回の細胞洗浄を行った。次に、IRF-PIPA3を10％FBS-RPMIまたはD-MEMに最終濃度が6μMになるように懸濁し、wellに添加した。16時間の培養後、mRNAワクチンを最終濃度0.5μg/mLになるように加え、20～24時間培養を行った。その後、培養上清を回収し、ELISAでIFN-β、IL-6またはTNF-αの各タンパク質濃度を測定した。 図１０は、二重鎖RNAによるワクチン抗原の発現抑制をIRF-PIPAが改善できることを示す結果である。野生型マウスの筋肉（i.m.）または腹腔（i.p.）にIRF-PIPA3を400μg/mouse投与し、24時間後にModerna社製のSARS-CoV-2用mRNAワクチン1μg/mouseを筋肉に投与し、同時にPoly(I:C)250μg/mouseを腹腔または筋肉に投与した。その1日後、マウスから採血を行い、血漿中のRBDの濃度をELISA法で測定した。
　以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、「本実施形態」と記す場合、特に断らない限り、本明細書に記載されている全ての実施形態を指すものとする。
　第１の実施形態は、IRF（IFN regulatory factor）ファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミド（Pyrrole Imidazole Polyamide；PIPA）である（以下「本実施形態にかかるPIPA」とも記載する）。
　本実施形態における「PIPA」とは、抗生物質から単離された、ピロール（Py）およびイミダゾール（Im）を主として含む低分子有機化合物であり、二本鎖DNAと配列特異的に結合することができる。PIPAは二本鎖DNAのマイナーグルーブに侵入して、DNAの各塩基との間で水素結合を介して可逆的に結合する。PyはA、T、C残基と、ImはG残基に結合する作用を有しており、PyとImの配列を適切に設定することで、任意のDNA配列に結合するPIPAを設計することができる。PIPAは、二本鎖DNAのマイナーグループにおいて、Py/Im対がC-G塩基対を標的とし、Py/Py対がA-T塩基対またはT-A塩基対を標的とし得るように、ヘアピンループ構造をとるのが一般的である（以下に示すPIPAの具体的な構造を参照のこと）が、ヘアピンループで接続されていない、独立した2つのPIPAのペアであっても、環構造をとるものであってもよく、目的に応じて適切な構造を設計することができる。
　本実施形態におけるPIPAは、主としてピロールとイミダゾールがアミド（カルボキサミド）結合で連結されたポリアミドであるが、このアミド鎖には、その長さまたは弯曲の程度などを調整するために、適宜、脂肪族アミノ酸残基、例えば、グリシン、β-アラニン、γ-アミノ酪酸、R2, 4-ジアミノ酪酸および5-アミノ吉草酸などが含まれていてもよい。ここで、γ-アミノ酪酸はヘアピンループ構造を保持するために使用することができ、β-アラニンは、隣接するアミノ酸部分と、DNA鎖のヌクレオチド部分との水素結合を最適化するために使用することができる。
　本実施形態にかかるPIPAが結合するIRFファミリー転写因子の結合領域には、以下に示す配列１～配列４またはそれらの改変配列が含まれている。
配列１およびその改変配列
5’-GAAAGTG-3’（配列番号１）または、
配列番号１で表される配列の改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAGTG-3（配列番号１）’におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAGTG-3’ （配列番号１）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列。
　上記改変配列としては、例えば、5’-NAAAGTG-3’（配列番号２）、5’-GNAAGTG-3’ （配列番号３）、5’-GANAGTG-3’ （配列番号４）、5’-GAANGTG-3’ （配列番号５）、5’-GAAANTG-3’ （配列番号６）、5’-GAAAGNG-3’ （配列番号７）または5’-GAAAGTN-3’ （配列番号８）（ただし、NはA、T、GまたはCである）などを挙げることができる。
配列２およびその改変配列
5’-GAAAG-3’（配列番号９）または、
配列番号９で表される配列の改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAG-3’ （配列番号９）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAG-3’ （配列番号９）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列。
　上記改変配列としては、例えば、5’-NAAAG-3’ （配列番号１０）、5’-GNAAG-3’（配列番号１１）、5’-GANAG-3’ （配列番号１２）、5’-GAANG-3’ （配列番号１３）または5’-GAAAN-3’ （配列番号１４）（ただし、NはA、T、GまたはCである）などを挙げることができる。
配列３およびその改変配列
5’-GAAAA-3’（配列番号１５）または、
配列番号１５で表される配列の改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAA-3’ （配列番号１５）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAA-3’ （配列番号１５）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列。
　上記改変配列としては、例えば、5’-NAAAA-3’ （配列番号１６）、5’-GNAAA-3’ （配列番号１７）、5’-GANAA-3’ （配列番号１８）、5’-GAANA-3’ （配列番号１９）または5’-GAAAN-3’ （配列番号２０）（ただし、NはA、T、GまたはCである）などを挙げることができる。
配列４およびその改変配列
5’-GAAAC-3’（配列番号２１）または、
配列番号２１で表される配列の改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAC-3’ （配列番号２１）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAC-3’ （配列番号２１）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列。
　上記改変配列としては、例えば、5’-NAAAC-3’ （配列番号２２）、5’-GNAAC-3’ （配列番号２３）、5’-GANAC-3’ （配列番号２４）、5’-GAANC-3’ （配列番号２５）または5’-GAAAN-3’ （配列番号２６）（ただし、NはA、T、GまたはCである）などを挙げることができる。
　本実施形態にかかるPIPAとして、以下の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表される化合物を例示することができる。
　上記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）中、LはC2～6のアルキルリンカーを表し、特に限定はしないが、γ-アミノ酪酸残基などが含まれていてもよい。
　R1およびR2は置換基を有してもよいC1～C10のアルキル基もしくはC1～C10のアミド結合および／またはアミノ基を含んでもよいアルキル基であり、R1およびR2が結合してC2～6のアルキルリンカーを形成してよい。
　X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7およびX8は、同一もしくは独立して、結合もしくは脂肪族アミノ酸残基を表し、特に限定はしないが、当該脂肪族アミノ酸残基として、β-アラニン、グリシン、γ-アミノ酪酸、5-アミノ吉草酸などを挙げることができる。
　さらに具体的に、本実施形態にかかるPIPAとして、以下の式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）または（ＩＶａ）で表される化合物を例示することができる。
　本実施形態にかかるPIPAは、その結合領域に対して、良好な親和性で結合することができ、その親和性を解離定数（Kd値）で表すと、特に限定はしないが、例えば、約500 nM以下、約400 nM以下、約300 nM以下、約200 nM以下、約100 nM以下、約90 nM以下、約80 nM以下、約70 nM以下、約60 nM以下、約50 nM以下、約40 nM以下、約30 nM以下、約20 nM以下、より好ましくは、約10 nM以下である。
　第２の実施形態は、IRFファミリー転写因子の機能を阻害するための、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAもしくは当該PIPAの使用、または、当該PIPAを含む組成物である。
　さらに、第３の実施形態は、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含むIRFファミリー転写因子阻害剤（以下「本実施形態にかかるIRF転写因子阻害剤」とも記載する）である。
　第２および第３の実施形態におけるPIPAは、本実施形態にかかるPIPAである。本実施形態にかかるPIPAは、IRFファミリー転写因子が転写活性化する標的遺伝子のプロモーター領域に存在する結合配列（例えば、IRF-E配列またはISRE配列）に特異的かつ良好な親和性で結合することにより、IRFファミリー転写因子による標的遺伝子の転写活性化を抑制または阻害する機能を有している。IRFファミリー転写因子が転写活性化する遺伝子、すなわち、そのプロモーター領域に、IRFファミリー転写因子の結合配列を有する遺伝子としては、I型IFN（Interferon）（IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ωなどを含む13種類のサイトカインの総称）遺伝子の他、IL-6遺伝子およびTNF-α遺伝子などの様々な遺伝子が知られている。従って、本実施形態にかかるIRF転写因子阻害剤は、IRFファミリーによって転写活性化が制御される遺伝子の転写を、抑制または阻害するために効果的に用いることができる。
　なお、本明細書において、「遺伝子」とは遺伝情報をコードする塩基配列または核酸のことである。この核酸には、ポリヌクレオチド、RNA、DNAなどが含まれ、必ずしも、生体内に存在する核酸のみではなく、任意のタンパク質をコードする核酸配列（例えば、cDNAなど）であって、人工的に合成されたものも含まれる。また、遺伝子の由来は、いずれの生物種由来のものであってもよい
　第４の実施形態は、第３の実施形態にかかるIRFファミリー転写因子阻害剤、または第１１の実施形態にかかるPIPA複合体を有効成分として含む（すなわち、本実施形態にかかるPIPAまたはPIPA複合体を有効成分として含む）医薬または医薬組成物（以下「本実施形態にかかる医薬」もしくは「本実施形態にかかる医薬組成物」、またはこれらをまとめて「本実施形態にかかる医薬等」とも記載する）である。あるいは、第４の実施形態は、医薬または医薬組成物の製造における、本実施形態にかかるPIPAの使用である。
　PIPAは、生体内においてペプチダーゼなどによる分解を受けず安定に存在する。また、細胞膜を容易に通過する性質を有しているため、DDS（drug delivery system）などの細胞内へ導入するための手段を用いる必要がないため、医薬等の有効成分として非常に優れた物質である。本実施形態にかかるPIPAは、IRFファミリー転写因子の活性を抑制または阻害することで、I型IFNの他、IL-6遺伝子やTNF-α遺伝子などの様々なサイトカイン遺伝子の発現を抑制することができる。従って、サイトカインの異常な発現による過剰な免疫応答を抑制するための医薬、あるいは、過剰な免疫応答によって惹起される疾患または感染症の予防または治療のための医薬として効果を発揮する。本実施形態にかかる医薬等は、過剰な免疫応答の抑制効果を有し、予防的または治療的な使用が可能である。過剰な免疫応答によって惹起される疾患としては、特に限定はしないが、1型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（SLE）、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、橋本病、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血などの自己免疫疾患の他、過剰な免疫応答を惹起するようなCOVID19、インフルエンザウイルス感染症をはじめとしたウイルス感染症、細菌、真菌、原虫などの病原体による感染症などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本実施形態にかかる医薬は、有効成分（本実施形態にかかるPIPA）自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である1または複数の物質の他、1または2以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。また、本実施形態にかかる医薬等には、過剰な免疫応答を抑制するために有効な他の成分が配合されていてもよい。
　本実施形態にかかる医薬等の剤形としては、特に限定はしないが、注射剤、点滴剤などの液体製剤が挙げられる。液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。液体製剤を注射剤または点滴剤として使用する場合には、有効成分を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
　本実施形態にかかる医薬等の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合および医薬等の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して1重量％から90重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
　注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのpH調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
　本実施形態にかかる医薬等の投与量および投与回数および投与方法は特に限定されず、予防または治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。
　一般的には、注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量0.001～1000 mg（有効成分重量）を連続投与または間欠投与してもよい
　本実施形態にかかる医薬等は、埋込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製してもよい。そのような担体として、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬学上許容される担体として使用することができる。リポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導ホスファチジルエタノール（PEG-PE）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製することができる。
　本実施形態にかかる医薬等は、投与方法等の説明書と共にキットの形態で提供してもよい。キット中に含まれる薬剤は、当該治療薬等の構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器により供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。
　また、キットには使用説明書が添付されてもよい。当該キットの使用説明は、紙などに印刷されたものであっても、CD-ROM、DVD-ROMなどの電磁的に読み取り可能な媒体に保存されて使用者に供給されてもよい。
　第５の実施形態は、本実施形態にかかるPIPAを含むアジュバント（以下「本実施形態にかかるアジュバント」とも記載する）である。
　最近、I型IFNがmRNAの転写の阻害およびmRNAの分解を誘導し、mRNAワクチンの効果を低下させることが報告された（Linares-Fernandezら, Trends Mol Med 26:311-323 doi: 10.1016/j.molmed.2019.10.002. 2020；De Beuckelaerら, Mol Ther. 24:2012-2020 2016.）。本実施形態にかかるPIPAは、I型IFNの発現を転写レベルで抑制または阻害するため、mRNAワクチン製剤に配合させることで、当該ワクチンの効果を増強することが期待される。すなわち、本実施形態にかかるPIPAは、I型IFNの発現を抑制し、mRNAの作用（生体内での抗原の発現）を補助または増強すると考えられるため、アジュバントまたはアジュバント様添加物としても使用することができる。
　本実施形態にかかるアジュバントは、本実施形態にかかるPIPAを、例えば、0.01～99.99重量%程度含んでいてもよい。また、本実施形態にかかるアジュバントは、本実施形態にかかるPIPA以外のものであって、PIPAのアジュバントとしての機能を阻害しない成分が含まれていてもよい。そのような成分としては、例えば、安定化剤、pH調整剤、保存剤、防腐剤および緩衝剤などを挙げることができる。また、本実施形態にかかるアジュバントには、本実施形態にかかるPIPA以外のものであって、既存のmRNAワクチンのアジュバントに含まれて免疫賦活化活性を有することが知られている成分が含まれていてもよい。
　本実施形態にかかるアジュバントは、免疫機構を有する全ての生物に対して使用することができる。
　第６の実施形態は、本実施形態にかかるアジュバントおよびmRNAを含むワクチン（以下「本実施形態におけるワクチン」とも記載する）である。
　第６の実施形態にかかるワクチンに含まれるmRNAは、免疫応答を惹起するタンパク質を発現するものであれば特に限定されず、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、リケッチア、クラミジア、プリオンおよびがん細胞、正常細胞などに由来するタンパク質などを発現するmRNAなどが挙げられる。
　第７の実施形態は、本実施形態にかかる医薬等を患者に投与することを含む、過剰な免疫応答、過剰な免疫応答によって惹起される疾患および／または感染症の予防または治療方法である。
　ここで「治療」とは、治療対象の疾患を発症したほ乳動物において引き起こされる病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味する。また、「予防」とは、予防対象の疾患を発症するおそれがあるほ乳動物について、その発症を予め阻止することを意味する。予防または治療の対象となる「ほ乳動物」は、ほ乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、マウス、ハムスターなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「ほ乳動物」は、ヒトである。
　第８の実施形態は、PIPAを含むIRFファミリー転写因子阻害剤の製造方法であって、
IRFファミリー転写因子の結合領域を提供する工程、および前記結合領域に特異的に結合するPIPAを作製する工程を含む方法である。
　ここで、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを作製する工程には、当該結合領域に存在するヌクレオチド配列に対応するように選択されたピロールおよび／またはイミダゾールのポリマーをデザインし、必要に応じて、ピロールおよび／またはイミダゾールのポリマーの中にβ-アラニンやγ-アミノ酪酸などの脂肪族アミノ酸残基を挿入したポリマーをデザインし、当該ポリマーを実際に合成する工程が含まれていてもよい。
　第９の実施形態は、疑似転写因子として使用するための、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPA、または、疑似転写因子として使用するための、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含む組成物である。
　前述の通り、本実施形態にかかるPIPAは、IRFファミリー転写因子が特異的に結合するゲノムDNA配列に結合する性質を有しており、IRFファミリー転写因子がその結合配列を介して行う転写、および／またはその活性化を阻害することができる。従って、本実施形態にかかるPIPAは、IRFファミリー転写因子がその結合配列を介して行う転写、および／またはその活性化を阻害する物質、すなわち「疑似転写因子」としての機能を有する。従って、本実施形態にかかるPIPAは、疑似転写因子として用いることもできる。PIPAについては、他の実施形態における説明を参照のこと。
　第１０の実施形態は、対象においてPIPAを疑似転写因子として使用する方法であって、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAの有効量を、前記対象に適用する工程を含む、前記方法。
　ここで、「対象」とは、ほ乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、マウス、ハムスターなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「ほ乳動物」は、ヒトである。PIPAについては、他の実施形態における説明を参照のこと。
　第１１の実施形態は、本実施形態にかかるPIPA（すなわち、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPA）とPIPA補助因子を含む複合体（conjugate）（以下「本実施形態にかかるPIPA複合体」とも記載する）である。本実施形態における「PIPA補助因子」は、PIPAとは異なる物質で、本実施形態にかかるPIPAの機能を増強させる物質のことである。本実施形態にかかるPIPAは、IRFファミリー転写因子が転写活性化を行う遺伝子の発現を抑制することを通じて過剰な免疫応答を抑制する機能を有している。従って、本実施形態における「PIPA補助因子」には、当該PIPAの機能（例えば、免疫応答抑制機能）を増強する物質が含まれる。さらに、本実施形態における「PIPA補助因子」には、PIPAの作用を補助する物質、例えば、生体内におけるPIPAの安定性を向上させる物質、PIPAの標的臓器または標的細胞への輸送を増強する物質、PIPAの細胞内への導入を増強する物質などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
　本実施形態におけるPIPA補助因子は、PIPAに結合し、PIPAの細胞内送達を阻害しない限り、いかなる物質であっても使用可能である。そのようなPIPA補助因子としては、例えば、低分子量（約500～約2,000）のものが好ましく、PIPAの細胞内への導入効率に影響しない大きさの分子量、例えば、約500～約1,000がさらに好ましい。このようなPIPA補助因子は、本実施形態にかかるPIPAと複合体を形成することにより、当該PIPAの機能を増強し、および／または当該PIPAの作用を補助する。従って、本実施形態にかかるPIPA補助因子は、例えば、過剰な免疫応答によって惹起される疾患または感染症の予防効果および／または治療効果を発揮する。
　本実施形態にかかるPIPAの機能を増強する物質としては、特に限定はしないが、例えば、ヒドロキシクロロキン、FK506などの免疫抑制物質、各種ステロイドなどの抗炎症物質などが含まれる。また、本実施形態におけるPIPAの作用を補助する物質としては、例えば、ビタミン類（例えば、ビタミンE、ビタミンA）やコレステロールなどの脂質、アニサミドなどが含まれる。
　　本実施形態にかかるPIPAとPIPA補助因子とは、直接結合して複合体を形成してもよく、またはリンカーを介して連結してもよい。このようなリンカーとしては、本実施形態にかかるPIPA複合体の機能、例えば、ドラッグデリバリーシステム（Drug Delivery System：DDS）としての機能を発揮することができる限り、任意のリンカーを利用することができ、特に限定はしないが、例えば、炭素数が1～6（C1～C6）のアルキルリンカーなどを挙げることができる。当該リンカーには、本実施形態にかかるPIPAとPIPA補助因子を結合するための官能基、例えば、マレイミド基、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アジド基などが含まれていてもよい。また、PIPA補助因子を結合させるPIPAの部位は、特に限定はしないが、例えば、PIPAの末端部（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、R1またはR2など）などであってもよい。
　本明細書が英語に翻訳されて、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものも含むものとする。また、本明細書において、「約」または「程度」とは±10%の数値範囲を意味する。
　以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
１．材料および方法
１－１．細胞
　細胞株Raw264.7細胞は、RIKEN Cell Bankから購入し、10％のFBS（SIGMA-ALDRICH）およびPenicillin-Streptomycin mixed solution（nacalai tesque）を含有するD-MEM（nacalai tesque）を用いて培養した。
　マウス腹腔マクロファージは、週齢6週のCL57B/6マウス（日本クレア）から7mLのPBS（nacalai tesque）を用いた腹腔洗浄によって採取し、2時間の培養によって、培養プレートに接着した細胞を実験に用いた。培養は、10%のFBS（SIGMA-ALDRICH）およびPenicillin-Streptomycin mixed solution（nacalai tesque）を含有するRPMIまたはD-MEM培地（nacalai tesque）を用いて行った。CL57B/6マウスは、SPF環境で飼育した。
１－２．IRF結合配列の決定およびPIPAの合成
　IRFファミリー転写因子は、5’-AANNGAAA-3’（配列番号２７）で表されるコンセンサス配列に結合する。そこで、このコンセンサス配列に基づいて、PIPAをデザインするための結合配列として、5’-GAAAGTG-3’（配列番号１）、5’-GAAAG-3’（配列番号９）、5’-GAAAA-3’（配列番号１５）および5’-GAAAC-3’（配列番号２１）を選択して、これらに結合するPIPAを株式会社ペプチド研究所に委託して合成を行った。
１－３．サイトカイン濃度の測定
　2×104個のRaw264.7細胞をプレートに播種し、IRF-PIPA1、IRF-PIPA2、IRF-PIPA3またはIRF-PIPA4で24時間処理後、LPS（Lipopolysaccharide、SIGMA-ALDRICH）で16時間刺激し、培養上清を回収した。培養上清中のサイトカイン濃度を、ELISAキット（R&D SYSTEMS）を用い、標準プロトコールに従って測定した。培養上清は、必要に応じて1％BSA-PBSで希釈して解析した。マウス腹腔マクロファージは、2.5×105個をプレートに播種し、IRF-PIPA3で16時間または24時間処理後、Poly(I:C)（InvivoGen）で16時間、またはmRNAワクチン（Moderna）で20～24時間刺激し、培養上清を回収した。培養上清中のサイトカイン濃度を、ELISAキット（R&D SYSTEMS）を用いて、同様に標準プロトコールに従って測定した。また、マウス血漿中のサイトカイン濃度は、野生型マウスの腹腔にIRF-PIPA3を400μg/mouse投与し、24時間後にPoly(I:C)250μgを同じく腹腔に投与し、さらに2時間後に血液を採取し、その血漿中のサイトカイン濃度を、ELISAキット（R&D SYSTEMS）を用い、標準プロトコールに従って測定した。
１－４．mRNAレベルの測定
　2.5×105個の腹腔マクロファージをプレートに播種し、IRF-PIPA3で24時間処理し、Poly(I:C) （InvivoGen）にて刺激後2、4、6時間、またはmRNAワクチン（Moderna）にて刺激後20時間で細胞を回収し、TRIsure（日本ジェネティックス株式会社）およびRNA抽出キット（ZYMO RESEARCH）を用いて標準プロトコールに従ってRNA抽出を行なった。抽出したRNAから5×PrimeScriptRT Master Mix（タカラバイオ株式会社）を用いてcDNAを作成し、Sybr green（BioLabs）および各遺伝子に特異的なプライマー（株式会社FASMAC）を用いて、qPCRを行なった。qPCRには Light Cycler480（Roche, Switzerland）を使用した。プライマー配列は過去の文献（Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Nov 19;116(47):23653-23661.  doi: 10.1073/pnas.1915326116）等で用いられている一般的な配列を用いた。
１－５．dsDNA濃度およびLDH 活性の測定
　培養上清中のdsDNA濃度測定は、Nano drop one（Thermo Fisher SCIENTIFIC）を用いて行なった。LDH assayは、Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（株式会社 同仁化学研究所）を用いて、標準プロトコールに従って測定した。ポジティブコントロールは2.5×105個の腹腔マクロファージに10%FBS-RPMIまたはD-MEM培地90μLとLysis Buffer 10μLを混合させ、細胞を破壊したライゼートを用いた。
１－６．SARS-CoV-2のスパイクタンパク質レセプター結合領域（Receptor Binding Domain：RBD ）濃度の測定
　野生型マウスの筋肉（i.m.）または腹腔（i.p.）にIRF-PIPA3を400μg/mouse投与した。その24時間後にModerna社製のSARS-CoV-2用mRNAワクチン1μg/mouseを筋肉に投与し、同時にPoly(I:C)250μg/mouseを腹腔または筋肉に投与した。その1日後、マウスから採血を行い、血漿中のRBD濃度をELISA法で測定した。
１－７．分子間相互作用の解析
　Octet K2（ForteBio）を使用し、標準プロトコールにしたがって解析を行なった。ストレプトアビジンを結合したセンサー（ForteBio）を使用し、ビオチンでラベルした標的配列（FASMAC）をセンサーに結合させた。さらに標準プロトコールに従い、10から320nMのIRF-PIPA3と標的配列との結合、および解離をそれぞれ60秒間解析した。これらの結果から、Data Analysis（ザルトリウス・ジャパン株式会社）を用いてKD値を算出した。
２．結果
２－１．I型IFNの誘導を抑制するPIPAの取得
　インビトロの解析によってIRF転写因子の結合配列は報告されているが、それらの配列の生理的重要性について、プロモーター領域のノックインマウスなどを用いて解析した報告はない。そのため、まずどのような配列を標的としたPIPAが強い抑制効果を示すか検討を行った。既報から予測されるIRF転写因子の結合配列を、5’-GAAAGTG-3’（配列番号１）、5’-GAAAG-3’（配列番号９）、5’-GAAAA-3’（配列番号１５）および5’-GAAAC-3’（配列番号２１）の4つに絞り、各々に結合するPIPAを作製し、IRF転写因子に依存して発現が誘導されるIFN-βの抑制を、マクロファージ系細胞株Raw264.7細胞を用いて検証した。5’-GAAAGTG-3’（配列番号１）、5’-GAAAG-3’（配列番号９）、5’-GAAAA-3’（配列番号１５）および5’-GAAAC-3’（配列番号２１）に結合するPIPAの構造を、各々、以下の式（Ｉａ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩＩａ）および式（ＩＶａ）として示す。なお、本明細書において、（Ｉａ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩＩａ）および式（ＩＶａ）で表されるPIPAを、各々、IRF-PIPA3、IRF-PIPA1、IRF-PIPA2およびIRF-PIPA4とも記載する。
　マクロファージ系細胞株Raw264.7細胞を予めIRF-PIPA1～4で処理後、IFN-β産生を誘導する病原体成分でさらに刺激し、ELISAで培養上清中のIFN-βの濃度を測定した結果、PIPA1～4のいずれにおいてもIFN-β産生に対するPIPAの抑制効果が確認できた（図１）。IRF-PIPA1、IRF-PIPA2およびIRF-PIPA4については濃度依存性が見られなかったが、IRF-PIPA3については濃度依存的な抑制が確認され、さらに4つのPIPAの中で最も抑制作用が強かった。すなわち、IRF-PIPA3が最も強く、想定した転写阻害機構でIFN-βの産生を抑制すると考えられことから、以下の実験においてはIRF-PIPA3を用いて検証を行った。
２－２．I型IFN誘導に対するIRF-PIPA3の抑制能の検証
　次に、マウスから腹腔マクロファージを採取し、IRF-PIPA3のIFN-β産生に対する抑制能を検証した。腹腔マクロファージを予めIRF-PIPA3で処理後、IFN-βの産生を誘導する病原体成分として二本鎖RNA(Poly(I:C))で刺激し、培養上清中のサイトカイン濃度をELISAで測定した（図２）。その結果、IRF-PIPA3は腹腔マクロファージにおいても、濃度依存的にIFN-βの産生を強く抑制することが確認された。さらに、IFN-βと同様にIRF転写因子に依存することが知られているサイトカインであるIL-6およびTNF-αについても、IFN-βよりも弱い抑制であるものの、抑制が確認された（図２）。この結果から、IRF-PIPA3がIRF転写因子に依存する応答を広く抑制することが示唆される。
　さらに、IRF-PIPA3が想定した機構でIFN-βの産生を抑制しているか検証するため、腹腔マクロファージを用いて上述と同様の実験を行い、転写への影響を評価するためにqRT-PCR法を用いて、mRNAの相対発現量を解析した（図３）。その結果、IRF-PIPA3は濃度依存的にIfnb1 mRNAの発現誘導を強く抑制した。さらにIl6およびTnf mRNAについて同様の抑制が確認された。これらの結果から、IRF-PIPA3がIRF転写因子に依存する転写を阻害していることが示唆される。
２－３．IRF-PIPA3の細胞障害性の検証
　mRNAの解析では、通常は変動しない遺伝子のmRNA発現レベル（本実施例においては、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ：GAPDH）に対する相対値として目的とするmRNAの発現レベルを算出するため、細胞死などの影響を受けずに目的遺伝子のmRNAレベルを検証できる。そのため、図３に示すmRNAの解析結果はIRF-PIPA3が抑制能を有することを強く示しているが、一方で、抑制効果に加えて細胞死が起きているかどうかは評価できない。そもそも転写因子は特定の配列を標的としながらも、無数に存在する重要でない領域に存在する標的配列にも結合するものであり、PIPAについても同じことが起きていると考えられる。すなわち、ゲノムに無数に存在する標的配列に結合し、IRF転写因子を阻害する背後では、多くの無意味な結合を繰り返していることが示唆される。このような観点から、PIPAのオンターゲットな副作用の検証は非常に重要であり、そのアウトプットとしての細胞障害性の検証は重要な意味を持つと考えられる。
　そのため、次に腹腔マクロファージを用いてIRF-PIPA3の細胞障害活性について検証を行った。図２と同様の実験を行い、細胞障害の指標として、死細胞からの培養上清へのDNA放出および乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）タンパクの放出を解析した。その結果、培養上清中のDNA量はPIPA処理によって全く増加しなかった（図４左）。さらに、LDHの放出を検証するため、培養上清中のLDH活性を測定したところ、同様にPIPA処理によってLDH活性は全く増加しなかった（図４右）。これらの結果から、少なくともIRF-PIPA3が強力な抑制作用を示す濃度範囲において、IRF-PIPA3は細胞障害活性を示さないと示唆される。
２－４．IRF-PIPA3と標的配列との結合の検証
　これまでの結果から、PIPA3はIRF転写因子の標的遺伝子のプロモーター上にある標的配列に結合し、転写を抑制していることが示唆される。さらに、実際にIRF-PIPA3が目的とするDNA配列に結合することを確認するため、PIPA3と標的DNA配列の結合をインビトロで検証した。検証には二分子間の相互作用を検証可能なOctet K2を使用し、センサー上に固定したDNA配列（GAAAGTG C GAAAGTG C GAAAGTG C：配列番号２８）に対するIRF-PIPA3の結合を検出した。その結果、IRF-PIPA3と標的配列との結合を示すシグナルが濃度依存的に検出され、そのから結合力の強さはKD値として2.27×10-8であることが分かった（図５）。この結果から、IRF-PIPA3は確かに想定した標的配列に結合する作用を有していることが示された。
２－５．生体レベルでのIRF-PIPA3の薬効検証
　インビボにおけるIRF-PIPA3の転写抑制効果を検証した。予め、IRF-PIPA3をマウスの腹腔に投与し、3時間後に病原体成分としてpoly(I:C)を同じくマウスの腹腔に投与した。poly(I:C)の投与からさらに2時間後、マウスから腹腔マクロファージ採取し、qRT-PCR法を用いてmRNAの相対発現量を解析した（図６）。その結果、インビトロの結果と一致し、IRF-PIPA3はIfnb1、Il6およびTnf mRNAの発現レベルを有意に抑制した。この結果から、IRF-PIPA3は少なくとも局所において、インビボでも抑制効果を有することが示された。
　次に、予め、IRF-PIPA3をマウスの腹腔に投与し、24時間後、1日後、4日後または7日後に病原体成分としてpoly(I:C)を同じくマウスの腹腔に投与した。poly(I:C)の投与からさらに2時間後、マウスから血液を採取し、その血漿中のIFN-β、IL-6およびTNF-αのタンパク質濃度をELISA法で測定した。結果を図７Ａ（IRF-PIPA3投与後24時間）および図７Ｂ（IRF-PIPA3投与から1日後、4日後または7日後）に示す。IRF-PIPA3はIFN-β、IL-6およびTNF-αの各タンパク質の発現を有意に抑制した。抑制効果が最も高かったのは、IRF-PIPA3投与から1日後であり、その後、効果は弱るものの投与から7日後までその効果が持続した。以上の結果から、IRF-PIPA3は、生体の全身において、IRFファミリータンパク質の発現を有効に抑制することが明らかとなった。
２－６．IRF-PIPA3のmRNAワクチンによる免疫応答に及ぼす影響の検証
　上述のとおり、I型IFNがmRNAの転写の阻害およびmRNAの分解を誘導し、mRNAワクチンの効果を低下させるとの報告がある。そこで、Moderna社製のSARS-CoV-2用mRNAワクチン投与後のIFN-βの転写をIFR-PIPA3が抑制できるかどうか検証した。腹腔マクロファージを予めIRF-PIPA3（3μMまたは10μM）で処理後、mRNAワクチン（Moderna）で処理し、20時間培養した。培養後、回収した細胞からTRIsureを用いてRNAを調製し、qRT-PCRにより、Ifnb1遺伝子の相対発現量を測定した（図８左）。また、培養後、培養上清中のサイトカイン濃度をELISAで測定した（図８右）。その結果、IRF-PIPA3は腹腔マクロファージにおいて、mRNAワクチン添加後のIFN-βの転写を濃度依存的に強く抑制することが確認された。
　次に、腹腔マクロファージを予めIRF-PIPA3（6μM）で処理後、Moderna社製のSARS-CoV-2用mRNAワクチンに替えて、OVA （Ovalbumin：OVA）をコードするmRNAをモデルナ社タイプのlipid nano particle（LNP）に包含したmRNAワクチン（LNP-mRNA）で処理し、20～24時間培養した。培養後、培養上清中のサイトカイン濃度をELISAで測定した（図９）。その結果、IRF-PIPA3は腹腔マクロファージにおいて、mRNAワクチン添加後のIFN-β、IL-6およびTNF-αの各タンパク質の発現を濃度依存的に強く抑制することが確認された。
　ところで、LNP-mRNAの製造過程において、夾雑物として二重鎖RNAが生じることが知られている（Linares-Fernandezら, 2020 Mar Trends Mol Med 26:311-323 doi: 10.1016/j.molmed.2019.10.002.）。二重鎖RNAは、I型IFNの発現を誘導することから、ワクチンの効果を低下させる可能性が考えられる。そこで、夾雑物としての二重鎖RNAの混入によるmRNAワクチンの効果の低下をPIPAが改善できるかどうか検討した。
　　野生型マウスの筋肉（i.m.）または腹腔（i.p.）にIRF-PIPA3を400μg/mouse投与した。その24時間後にModerna社製のSARS-CoV-2用mRNAワクチン1μg/mouseを筋肉に投与し、同時に夾雑物として二重鎖RNAであるPoly(I:C)250μg/mouseを腹腔または筋肉に投与した。その1日後、マウスから採血を行い、血漿中のRBD（Receptor Binding Domain；SARS-CoV-2のスパイクタンパク質レセプター結合領域）の濃度をELISA法で測定した。
　IRF-PIPA3非存在下において、mRNAワクチン投与の際に共雑物としてPoly(I:C)を加えると血中のRBDタンパク濃度が低下した。これに対し、IRF-PIPA3の存在下では、Poly(I:C)によるRBDタンパク濃度の低下を抑制した（図１０）。
　以上の結果は、IRF-PIPA3がmRNAワクチン投与後のIFN-βの転写を抑制することを示すもので、IRF-PIPA3がmRNAワクチンの効果を補助または増強するアジュバントとしての機能を有することを示唆している。
　本発明は、免疫応答の活性化に必須のサイトカイン（例えば、I型IFN、IL-6、TNF-αなど）の発現を転写の段階で抑制するPIPAを提供する。従って、本発明は、医薬および医療分野における利用が期待される。

Claims (38)

  1. 　IRF（IFN regulatory factor）ファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミド（Pyrrole Imidazole Polyamide；PIPA）。
  2. 　疑似転写因子として機能する、請求項１に記載のPIPA。
  3. 　前記結合領域に対して解離定数（Kd値）として約500 nM以下の結合親和性を有する、請求項１に記載のPIPA。
  4. 　前記結合領域が、5’-GAAAGTG-3’（配列番号１）またはその改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAGTG-3’（配列番号１）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAGTG-3’ （配列番号１）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列を含む、請求項３に記載のPIPA。
  5. 　前記結合領域が、5’-GAAAG-3’ （配列番号９）またはその改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAG-3’ （配列番号９）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAG-3’ （配列番号９）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列を含む、請求項３に記載のPIPA。
  6. 　前記結合領域が、5’-GAAAA-3’ （配列番号１５）またはその改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAA-3’ （配列番号１５）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAA-3’ （配列番号１５）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列を含む、請求項３に記載のPIPA。
  7. 　前記結合領域が、5’-GAAAC-3’ （配列番号２１）またはその改変配列を含む領域であって、当該改変配列が5’-GAAAC-3’ （配列番号２１）におけるいずれか1つの塩基が欠失もしくは変異した配列、または5’-GAAAC-3’ （配列番号２１）のいずれかの箇所に1塩基が付加した配列を含む、請求項３に記載のPIPA。
  8. 　以下の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表される請求項４から請求項７までのいずれか１項に記載のPIPA。
    （式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）中、LはC2～6のアルキルリンカーを表し、R1およびR2は置換基を有してもよいC1～C10のアルキル基もしくはC1～C10のアミド結合および／またはアミノ基を含んでもよいアルキル基であり、R1およびR2が結合してC2～6のアルキルリンカーを形成してもよく、X1、X2、X3、X4 、X5、X6、X7およびX8は、同一もしくは独立して、結合もしくは脂肪族アミノ酸残基を表す）
  9. 　以下の式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）または（ＩＶａ）で表される請求項８に記載のPIPA。
  10. 　IRFファミリー転写因子の機能を阻害するための、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含む組成物。
  11. 　前記PIPAが、請求項２から請求項７までのいずれか１項に記載のPIPAである、請求項１０に記載の組成物。
  12. 　前記PIPAが、請求項８に記載のPIPAである、請求項１０に記載の組成物。
  13. 　前記PIPAが、請求項９に記載のPIPAである、請求項１０に記載の組成物。
  14. 　疑似転写因子として使用するための、IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含む組成物。
  15. 　IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含む、IRFファミリー転写因子阻害剤。
  16. 　前記PIPAが、請求項２から請求項７までのいずれか１項に記載のPIPAである、請求項１５に記載のIRFファミリー転写因子阻害剤。
  17. 　前記PIPAが、請求項８に記載のPIPAである、請求項１５に記載のIRFファミリー転写因子阻害剤。
  18. 　前記PIPAが、請求項９に記載のPIPAである、請求項１５に記載のIRFファミリー転写因子阻害剤。
  19. 　IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを有効成分として含む、過剰な免疫応答を抑制するための医薬または医薬組成物。
  20. 　前記PIPAが、請求項２から請求項７までのいずれか１項に記載のPIPAである、請求項１９に記載の医薬または医薬組成物。
  21. 　前記PIPAが、請求項８に記載のPIPAである、請求項１９に記載の医薬または医薬組成物。
  22. 　前記PIPAが、請求項９に記載のPIPAである、請求項１９に記載の医薬または医薬組成物。
  23. 　IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAを含む、アジュバント。
  24. 　前記PIPAが、請求項２から請求項７までのいずれか１項に記載のPIPAである、請求項２３に記載のアジュバント。
  25. 　前記PIPAが、請求項８に記載のPIPAである、請求項２３に記載のアジュバント。
  26. 　前記PIPAが、請求項９に記載のPIPAである、請求項２３に記載のアジュバント。
  27. 　PIPAを含むIRFファミリー転写因子阻害剤の製造方法であって、
    IRFファミリー転写因子の結合領域を提供する工程および前記結合領域に特異的に結合するPIPAを作製する工程を含む、前記方法。
  28. 　IRFファミリー転写因子の結合領域に特異的に結合するPIPAとPIPA補助因子を含む複合体であって、当該PIPA補助因子は当該PIPAとは異なる物質であり、当該PIPA補助因子は当該PIPAの機能を増強する、および／またはPIPAの作用を補助することを特徴とする、前記複合体。
  29. 　前記PIPAと前記PIPA補助因子とがC1～C6のリンカーで連結されている、請求項２８に記載の複合体。
  30. 　前記PIPA補助因子が、前記PIPAの機能を増強する物質であって、ヒドロキシクロロキン、ステロイド、FK506からなるグループから選択される１または複数の物質である、請求項２８に記載の複合体。
  31. 　前記PIPA補助因子が、前記PIPAの作用を補助する物質であって、ビタミン、コレステロール、アニサミドからなるグループから選択される１または複数の物質である、請求項２８に記載の複合体。
  32. 　前記PIPAが、請求項２から請求項７までのいずれか１項に記載のPIPAである、請求項２８から請求項３１までのいずれか１項に記載の複合体。
  33. 　前記PIPAが、請求項８に記載のPIPAである、請求項２８から請求項３１までのいずれか１項に記載の複合体。
  34. 　前記PIPAが、請求項９に記載のPIPAである、請求項２８から請求項３１までのいずれか１項に記載の複合体。
  35. 　疑似転写因子として機能する、請求項２８から請求項３１までのいずれか１項に記載の複合体。
  36. 　疑似転写因子として機能する、請求項３２に記載の複合体。
  37. 　疑似転写因子として機能する、請求項３３に記載の複合体。
  38. 　疑似転写因子として機能する、請求項３４に記載の複合体。

     
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